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Hintergrund
der Erfindung Gebiet der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung betrifft
eine neue Zusammensetzung für
die nasale Insufflation, die ein Mittel für die Verabreichung des extrazellulären Anteils
des interzellulären
Adhäsionsmoleküls (sICAM-1)
bereitstellt.
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Stand der
Technik
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Das sICAM-1-Molekül und seine antiviralen Wirkungen
werden in EP-A-391088 beschrieben. ICAM-1 wird in
US 5 284 931 beschrieben. Dieser Arzneistoff
ist aktiv als ein kompetitiver Antagonist der Rhinovirus-Bindung.
Die intranasale Verabreichung von sICAM-1 wird in EP-A-391 088 erwähnt; das
Konzept der Formulierung von sICAM-1 als ein Insufflat für die nasale
Verabreichung wird jedoch nicht beschrieben. Verschiedene Verdünnungsmittel.
werden für
die Vervendung bei der Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen
von sICAM-1 mit kontrollierter Freisetzung erwähnt, und zwar unter Einschluss
von Carboxymethylcellulose; es gibt jedoch keine Beschreibung der
Verwendung irgendeiner Konzentration an Carboxymethylcellulose-Natriumsalz
oder des Konzepts der Formulierung eines langwirkenden nasalen Insufflats.
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Die normale nasale Verweilzeit für die meisten
Arzneistoffe, die in die Nasengänge
gebracht werden, beträgt
5 bis 20 Minuten. Der Rest jeglichen Arzneistoffs, der nicht systemisch
durch die Nasalmembranen resorbiert wird, gelangt zum hinteren Abschnitt
des Nasopharynx und wird vom Patienten geschluckt. Das relativ große Molekulargewicht
von sICAM-1 (82000 Dalton) verhindert die systemische Resorption
einer nennenswerten Menge des Arzneistoffs aus den Nasengängen.
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Insufflate werden allgemein als fein
verteilte Pulver angesehen; die direkt in eine Körperhöhle mittels eines Insufflators
oder Pulverblasgerätes
eingeführt
werden, um eine lokale oder systemische Wirkung zu erzielen. Insufflate
können
auch aus einem unter Druck stehenden Aerosol verabreicht werden,
das für
eine genaue Steuerung der Dosis sorgt, die von einem Aerosoldosierventil
abgegeben wird. Um durch Insufflation einen Arzneistoff zu verabreichen,
der eine lokale Wirkung im Nasopharynx haben soll, ist es erforderlich,
den Arzneistoff in einem festen Verdünnungsmittel zu formulieren,
das pharmazeutisch annehmbar ist und das die Verteilung des Arzneistoffs
nicht stört,
das die Adhäsion
des Arzneistoffs an den Schleimhäuten
nicht stört,
das keine ungünstige
Wirkung auf die Haltbarkeit des Arzneistoffs hat und das nicht übermäßig hygroskopisch
ist, so dass es zur Bildung großer
Partikel in der Zusammensetzung während der Lagerung unter Umgebungsbedingungen
kommt. Aus diesen Gründen
ist es günstig,
eine stabile therapeutische sICAM-1-Zusammensetzung bereitzustellen,
die die Retention des Proteins in den Nasengängen verstärkt.
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Zusammenfassende
Darstellung der Erfindung
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Der Anmelden hat eine neue Zusammensetzung
für die
intranasale Verabreichung von sICAM-1 aufgefunden, die auf der Verwendung
eines Trägersystems
basiert, das Carboxymethylcellulose-Natrium als ein festes Verdünnungsmittel
für sICAM-1
umfasst.
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Dementsprechend besteht eine Hauptaufgabe
der vorliegenden Erfindung darin, eine trockene Zusammensetzung
von sICAM-1 bereitzustellen, die geeignet für die Verabreichung durch Insufflation
ist.
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Es ist auch eine Aufgabe der vorliegenden
Erfindung, eine trockene Zusammensetzung von sICAM-1 bereitzustellen,
die die Verteilung des Arzneistoffs nicht stört.
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Es ist auch eine Aufgabe der Erfindung,
eine trockene Zusammensetzung von sICAM-1 bereitzustellen, die die
Adhäsion
des Arzneistoffs an den Schleimhäuten
fördert.
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Es ist auch eine Aufgabe der Erfindung,
eine trockene Zusammensetzung von sICAM-1 bereitzustellen, die keine
ungünstige
Wirkung auf die Haltbarkeit des Arzneistoffs hat.
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Es ist auch eine Aufgabe der Erfindung,
eine trockene Zusammensetzung von sICAM-1 bereitzustellen, die nicht übermäßig hygroskopisch
ist, so dass sie die Bildung von Agglomeraten in der Zusammensetzung
während
der Lagerung unter Umgebungsbedingungen hervorruft.
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Es ist auch eine Aufgabe der Erfindung,
eine trockene Zusammensetzung von sICAM-1 bereitzustellen, die verträglich mit
einer Hartgelatinekapsel ist.
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Diese und weitere Aufgaben der Erfindung
sind bei der Durchsicht der beigefügten Beschreibung ersichtlich.
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Ausführliche
Darstellung der Erfindung
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Die Erfindung stellt eine feinteilige;
trocken pulverisierte pharmazeutische Zusammensetzung bereit, angepasst
für die
Verabreichung als Insufflationspräparat, wobei die trocken pulverisierte
pharmazeutische Zusammensetzung umfasst:
- (a)
eine therapeutisch wirksame Menge an sICAM-1;
- (b) eine Menge Carboxymethylcellulose, die wirksam ist, sICAM-1
auf den intranasalen Membranen zurückzuhalten;
- (c) eine Menge an Füllstoff,
um ein pharmazeutisch elegantes Produkt zu bilden, die wirksam ist,
um das Kollabieren der Carboxymethylcellulose und des sICAM-1 während der
Lyophilisierung zu verhindern.
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Die Formulierung wird so hergestellt,
dass eine abgegebene Dosis von 0,1 bis 1,0 mg und vorzugsweise von
0,05 bis 0,75 mg an sICAM-1 den intranasalen Passagen durch Einführung einer
einzelnen Inhalation des Insufflats zur Verfügung gestellt wird.
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sICAM-1 ist eine gentechnisch hergestellte
Form des extrazellulären
Anteils des sICAM-1-Rezeptors und wirkt als ein kompetitiver Antagonist
der Rhinovirus-Bindung
bei Wirtszellen. Dieses Material ist auch bekannt als BIRR 4, und
es handelt sich um ein einkettiges rekombinantes lösliches
Glycoprotein, das gentechnisch aus einem natürlich auftretenden Transmembranglycoprotein
sICAM-1 abgeleitet ist. BIRR 4 ist eine verkürzte Form des interzellulären Adhäsionsmoleküls 1 (ICAM-1),
die die Aminosäuren
enthält,
die die extrazelluläre
Domäne
des Moleküls
umfassen. Auf der Basis einer DNA-Sequenzanalyse wird vorhergesagt,
dass BIRR 4 fünf
immunglobulinartige Domänen
enthält;
die durch Intraketten-Disulfidbindungen
stabilisiert sind.
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Die Voraussetzung der Verwendung
von sICAM-1 bei der Prävention
und/oder frühen
Behandlung der Erkältung
basiert auf der Tatsache, dass die sICAM-1-Verbindung die Anheftung des Rhinovirus
an die Schleimhaut der Nase verhindert. Um die Nasalmembranen vor
dem Rhinovirus zu schützen,
ist es günstig, die
nasalen Schleimhäute
im Wesentlichen vollständig
mit dem sICAM-1-Molekül
in Kontakt zu bringen, so dass das sICAM-1-Molekül über die Schleimhautoberfläche verteilt
wird, wo es in Wechselwirkung mit jeglichen Rhinovirus-Partikeln
tritt, die in den Nasengängen
vorhanden sein mögen,
und das klinische Fortschreiten jeglicher Infektion verhindert oder
abschwächt.
Die beabsichtigten Wirte für
die Behandlung mit dem erfindungsgemäßen Produkte umfassen Primaten,
wie Menschen, die behandelt werden können, um die Symptome einer
Rhinovirus-Infektion zu verringern, oder zur Prophylaxe einer Rhinovirus-Infektion.
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Die Anmelder haben aufgefunden, dass
die Verwendung von Carboxymethylcellulose-Natrium als ein Träger für sICAM-1
ein Insufflat bereitstellt, das die Wirkung von sICAM-1 in den Nasengängen im
Vergleich mit Zusammensetzungen, die auf wässrigen Lösungen von sICAM-1 basieren
oder bei denen es sich um Insufflate von sICAM-1 handelt, die auf
der Venwendung von Hydroxypropylcellulose oder Hydroxyethylcellulose basieren,
ausdehnt. Weiter hat der Anmelder aufgefunden, dass die Zugabe eines
Füllstoffs,
bei dem es sich um einen Zuckeralkohol, wie Sorbitol, Mannitol oder
Galactitol, oder eine Aminosäure,
wie Glycin, oder ein Polymer, wie ein Polymer auf Kohlenhydratbasis,
bei dem es sich um Dextran oder Cyclodextrin handeln kann, handeln
kann, zu der sICAM-1-Kombination mit Carboxy methylcellulose-Natrium
für eine
Füllwirkung
sorgt, ohne eine signifikante Wirkung auf die Retention des sICAM-1
auf den Nasengängen
auszuüben.
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Das spezielle Carboxymethylcellulose-Natrium,
das erfindungsgemäß verwendet
wird, hat eine pharmazeutische Qualität, die eine minimale Reinheit
von 99,5% aufweist. Im Allgemeinen weist das bevorzugte Carboxymethylcellulose-Natrium
eine Viskosität
in Wasser von 150 bis 250 cps bei Messung bei einer Temperatur von
25°C und
einer Konzentration von 1 Gew.-% auf. Falls gewünscht, können Carboxymethylcellulosen mit
anderen Molekulargewichten zugemischt werden, um ein Produkt mit
einer gewünschten
Viskosität
zu erhalten.
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Die endungsgemäße Zusammensetzung umfasst
auch ein anorganisches Salz, das für einen gepufterten pH-Wert
von 6,0 sorgt. Im Allgemeinen wird ein Alkalimetallchlorid, wie
Natrium- oder Kaliumchlorid, mit einbasischem Natriumphosphat kombiniert,
und der pN-Wert wird mit einem Alkalimetallhydroxid, wie Natriumhydroxid
oder Kaliumhydroxid, eingestellt.
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Das Insufflat wird vorzugsweise durch
Lösen der
Komponenten in Wasser und Entfernen des Wassers durch Lyophilisieren
und Durchleiten des Produkts der Lyophylisierung durch ein geeignet
bemessenes Sieb, um ein rieselfähiges.
Pulver bereitzustellen, das feinteilig und geeignet für die Verabreichung
unter Verwendung eines geeigneten Inhalationsgeräts ist, hergestellt.
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Das Verfahren, gemäß dem die
Pulverkomponenten unter Bildung der lyophilisierbaren Zusammensetzung
kombiniert werden, ist wichtig, da für den Fall, dass die Pulver
nicht nach dem nachstehenden Verfahren kombiniert werden, die biologische
Wirkung des sICAM-1 ungünstig
beeinflusst sein kann. Es ist bevorzugt, eine Lösung des sICAM-1 in dem Phosphatpuffer
durch Dialyse des sICAM-1 aus der Lösung, in der sICAM-1 hergestellt
wird, in die Phosphatpufterlösung
unter Verwendung einer Polysulfon-Diafiltrationsmembran herzustellen.
Eine Lösung
des Carboxymethylcellulose-Natriums und des Füllstoffs wird getrennt hergestellt
durch trockenes Mischen der pulverisierten Komponenten vor dem Dispergieren
der gemischten Komponenten in Wasser bei 45 bis 55°C und vorzugsweise
bei etwa 50°C.
Das trockene Mischen des Füllstoffs
und des Carboxymethylcellulose-Natriums erleichtert die Benetzung
des Carboxymethylcellulose-Natriums und minimiert die Aggregation
des Polymers bei Dispersion in Wasser. Nach Kombination der Pulver
mit Wasser ist es bevorzugt, eine Mischvorrichtung mit hoher Scherwirkung
einzusetzen, wie einen Waring-Blender, und zwar für 2 bis
10 Minuten, um die Pulver in Wasser zu dispergieren. Das dispergierte
Gemisch wird dann durch einen geeigneten Filter z. B. von 5 bis
50 um filtriert, und man lässt
es auf Raumtemperatur abkühlen.
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Nach Abkühlen des Polymers auf Raumtemperatur
werden gleiche Gewichtsanteile der Polymerlösung und der sICAM-1-Lösung gemischt
und in Lyophilisierungsfläschchen
gegeben. Die Fläschchen
werden in eine Lyophilisierungsvorrichtung geladen und gefriergetrocknet.
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Im Allgemeinen enthalten die Zusammensetzungen,
die für
die Lyophilisierung bevorzugt sind:
| | Konzentration
(Gew.-%) |
| sICAM-1 | 0,1
bis 1% |
| Füllstoff | 2
bis 10% |
| Carboxymethylcellulose,
Na | 1
bis 3% |
| Alkalimetallchlorid | 0,1
bis 0,6% |
| Natriumphosphat,
monobasisch | 0,1
bis 0,6% |
| Natriumhydroxid | qs
auf pH 6,0 |
| Wasser | s |
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Die trocken pulverisierte pharmazeutische
Zusammensetzung enthält
in Gew.-%:
| sICAM-1 | 0,07
bis 7% |
| Füllstoff | 70
bis 90% |
| Carboxymethylcellulose,
Na | 14
bis 45%. |
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Vorzugsweise enthält die trocken pulverisierte
pharmazeutische Zusammensetzung in Gew.-%:
| sICAM-1 | 1
bis 5% |
| Füllstoff | 80
bis 90% |
| Carboxymethylcellulose,
Na | 14
bis 21%. |
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Im Allgemeinen ist es bevorzugt,
eine einzelne therapeutische Dosis des Pulvers in zweiteilige Hartgelatinekapseln
zu packen, die unmittelbar vor der Verwendung geöffnet werden können. Jede
Kapsel kann 5 bis 20 mg der Zusammensetzung mit 0,01 bis 1,0 mg
sICAM-1 enthalten. Das Pulver wird direkt in ein Inhalationsgerät gegeben,
oder eine intakte Kapsel wird in ein Inhalationsgerät gegeben,
das so ausgelegt ist, dass die Kapsel geöffnet und der Pulverinhalt
der Kapsel in einer Form ausgestoßen wird, in der er mit Luft
gemischt und direkt in die Nase des Patienten eingeführt werden
kann.
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Für
die Verwendung dieser Art von Inhalationsvorrichtung sollte die
Gelatinekapsel halbkugelförmige Enden
aufweisen, die mit dem Inhalationsgerät in Wechselwirkung treten,
so dass für
die richtige Abgabe des Pulvers gesorgt wird. Ein Beispiel für eine geeignete
Vorrichtung für
die Ausführung
der Erfindung wird in
US 4 889
114 beschrieben. Die Vorrichtung kann mit einer Nasalspitze
versehen werden, wie DeVilbiss Nasal Tip, Modell 40-TR.
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Das nachstehende Beispiel wird vorgelegt,
um eine bevorzugte Ausführungsform
der Erfindung zu erläutern
und soll keine beschränkende
Beschreibung der Erfindung sein.
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Beispiel
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Die Herstellung von ICAM-1 wird in
US 5 284 931 beschrieben.
Um ein verkürztes
lösliches
Derivat von ICAM-1 herzustellen, dem die cytoplasmatische Domäne fehlt,
wird ein Stopp-Codon im Raster (zwischen Dcyt und D5) unter Anwendung
der Oligonucleotidmutagenese auf der Basis des Verfahrens von Kunkel,
Proc. Natl. Acad. Sci USA 82: 488–492 (1985), wie modifiziert
von Peterson et al., Cell 53: 65–72 (1988), erzeugt. Die Oligonucleotidmutagenese
führt zur
Bildung eines mutierten ICAM-1-Gens, bezeichnet als Y452 E/F TAG, das
bei Expression zur Bildung einer verkürzten sezernierten Form in
ICAM-1 (sICAM-1) führt.
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Ein Expressionsvektor, bestehend
aus dem Hamster-DHFR-Gen und der codierenden Region des vorstehend
beschriebenen mutierten ICAM-1, gesteuert von einem Promotor, Splice-Signalen
und einem Polyadenylierungssignal aus der frühen Region von SV40, wurde
konstruiert. Das Hamster-DHFR-Gen wurde aus dem Plasmid pBR322DHFR
(R. Mulligan et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 78 : 2072 : 20766
(1981)) durch Verdauung mit Fspl und HindIII, gefolgt von stumpfendiger
Ligation in pSV2gpt (Mitchell et al., Mol. Cell. Biol., 6: 425–4490 (1986)),
geschnitten mit BamHI/HindIII, isoliert. Die mutierte sICAM-1 (lösliches
ICAM-1)-cDNA wurde durch Verdauung mit Notl isoliert. Die Enden
wurden dann unter Verwendung von Klenow aufgefüllt, und die Moleküle wurden
anschließend
mit HindIII verdaut. Die Moleküle
wurden dann mit pBR322DHFR-Expressionsvektor (hergestellt durch
Verdauung mit ApaI, Enden dann aufgefüllt mit Klenow und verdaut
mit HindIII zur Entfernung des gpt-Gens) ligiert. Auf diese Weise
wurde das sICAM-1 physikalisch mit dem Hamster-Gen in einem SV40-Expressionsvektor
verknüpft.
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Der vollständige Vektor wurde dann in
Eierstockzellen aus chinesischem Hamster (CHO) K1 DUS-B11 unter
Anwendung des Calciumphosphat-Copräzipitationsverfahrens (Graham
et al., Virology, 52: 456–467 (1973))
transfiziert. Nach zwei Tagen Wachstum in nicht-selektivem Medium
wurden die Zellen in selektives Medium mit einem Gehalt an 0,05
bis 2 μM
Methotrexat, jedoch ohne Hypoxanthin und Thymidin, übertragen. Klone
wurden isoliert, subkloniert und durch ELISA auf sICAM-1-Bildung
untersucht. Kolonien, die die größten Mengen
an sICAM-1 sezer nierten, wurden dann zwei weiteren Runden der Genamplifikation
unterzogen, und eine stabile Zeltlinie, bezeichnet als CH0118A,
wurde abgeleitet. Diese Zeltlinie, die eine bevorzugte Quelle von
sICAM-1 ist, sezernierte sICAM-1 in den Kulturüberstand bei ungefähr 1 μg/ml.
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Das sICAM-1 wurde aus Überständen von
CH0118A-Zellen durch Immunoaffinitätschromatographie mit anti-ICAM-1-monoklonalem
Antikörper
R6.5 gereinigt. Zu diesem Zweck wurde R6.5 kovalent mit CNBr-aktivierter
Sepharose 4BTM (Pharmacia LkB, Uppsala, Schweden) gekoppelt, und
zwar bis zu einer Endkonzentration von 5 mg pro ml des gepackten
Harzes, entsprechend den Anleitungen des Herstellers. Alle chromatographischen
Stufen erfolgten bei 4°C,
und alle Puffer enthielten 0,2 U/ml Aprotinin und 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid.
1 Liter des filtrierten Überstands
mit einem Gehalt an ungefähr
1 mg sICAM-1 wurde auf eine Säule von
R6.5-Sepharose bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 1 ml/Minute
geladen. Die Säule
wurde dann mit 200 ml 10 mM Tris/0,15 M NaCl bei einer Durchflussgeschwindigkeit
von 2,5 ml/Minute zur Entfernung von ungebundenem Material gewaschen.
Das gebundene sICAM-1 wurde mit 50 mM Triethylamin/0,15 M NaCl/
pH 11,0 bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 1 ml/Minute eluiert.
Fraktionen wurden aufgefangen und unmittelbar anschließend durch
Zugabe von 1 M Tris, pH-Wert 6,0, bis zu einer Endkonzentration
von 20 mM neutralisiert.
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Fraktionen, die das eluierte sICAM-1
enthielten, wurden durch SDS-PAGE auf 10–15% Polyacrylamidgradientengelen,
gefolgt von Silberanfärbung,
identifiziert. Elektrophorese und Anfärbung erfolgte unter Verwendung
eines Pharmacia Phastgel-SystemsTM (Pharmacia)
und eines Silberanfärbungskits
entsprechend den Anleitungen des Herstellers. Die Fraktionen, die
sICAM enthielten, wurden vereinigt und ungefähr 10-fach unter Verwendung
von Centricon-30 MikrokonzentrationsvorrichtungenTM (Amicon,
Danvers, MA; USA) konzentriert.
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Der Proteingehalt des Ansatzes an
gereinigtem sICAM-1 wurde unter Verwendung eines Bio-Rad-Proteinassays
entsprechend den Anleitungen des Herstellers (Bio-Rad Laboratories,
Richmond, CA, USA) bestimmt, und dieses Material wurde in Anteilen
zur Verwendung als Referenzstandard eingefroren.
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Anschließend wurde die Konzentration
eines sICAM-1 in Proben in einem ELISA-Test vom „Sandwich"-Typ unter Verwendung der Referenzstandards
und von zwei anti-ICAM-1-monoklonalen Antikörpern, nämlich R6.5 und R6.1 (Rothlein
et al., J. Immunol., 141: 1665–1669
(1988)), die an nicht-überlappende
Epitope binden, bestimmt. R6.1 wurde an den Kunststoff in einer
Platte mit 96 Vertiefungen durch Inkubation von 10 μl einer 10 μg/ml-Lösung für 1 Stunde
bei 37°C
gebunden. Jede der nachstehenden Stufen erfolgte dann mit 100 μl Reagens,
inkubiert bei 37°C
für 20 Minuten,
gefolgt von Waschungen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung: (1)
Bindung von seriellen Verdünnungen
von Referenzstandard sICAM-1 oder unbekannter Probe; (2) Bindung
von biotinyliertem R6.5 (1 μg/ml);
und (3) Bindung von Meerrettichperoxidase-konjugiertem Streptavidin
(Zymed Laboratories, South San Francisco, CA, USA) bei den vom Hersteller
empfohlenen Konzentrationen. Nach der Zugabe des Substrats ABTSTM
(Zymed) und Inkubation für
20 Minuten bei Raumtemperatur wurde die Extinktion bei 410 nm in
einem Spektrophotometer bestimmt. Die Konzentration wurde durch
Vergleich mit einer Referenzeichkurve bestimmt.
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sICAM-1 wird wegen einem Phosphatpuffer
unter Verwendung einer Polysulfonmembran dialysiert, um eine Lösung von
sICAM-1 bereitzustellen, die eine Konzentration von 10 mg sICAM-1;
3,4 mg Natriumphosphat und 3,6 mg Natriumchlorid/1 ml Lösung enthält.
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Carboxymethylcellulose (CMC) (20
g) und Mannitol (100 g) werden trocken gemischt. Wasser (750 ml),
vorgeheizt auf 50°C,
wird in einem Waning-Blender, eingestellt auf niedrige Geschwindigkeit,
gerührt,
und das trockene Gemisch von CMC und Mannitol wird zum Umfang des
Vortex in dem Waring-Blender gegeben. Wie die Viskosität zunimmt,
wird langsam die Rührergeschwindigkeit
erhöht,
während
die Zugabe des Pulvergemisches fortgesetzt wird. Das Gemisch sollte
im Verlauf von ungefähr
zwei Minuten zugegeben werden. Wenn die Pulverzugabe abgeschlossen
ist, sollte das Volumen der Lösung
auf 1 Liter durch Zugabe von Wasser bei 50°C gebracht und das Mischen für 5 Minuten
fortgesetzt werden. Das warme Gemisch wird durch ein Filter mit
10 um filtriert, und man lässt
es auf Raumtemperatur abkühlen.
Wenn die Polymerlösung
auf Raumtemperatur abgekühlt
ist, werden gleiche Gewichtsanteile der Carboxymethylcellulose-Natrium/Mannitol-Lösung mit
der sICAM-1-Lösung
gemischt, und 1 g Lösung
wird in 5 ml Lyophilisierungsfläschchen
gegeben. Die Fläschchen
werden, in eine Lyophilisierungsvorrichtung geladen und gemäß folgendem
Fahrplan gefriergetrocknet:
- Stufe 1: Produkt
wird auf dem Einlegeboden der Lyophilisierungsvorrichtung angeordnet,
und der Kondensator wird auf –50°C eingestellt;
- Stufe 2: Wenn der Kondensator –50°C erreicht, wird das Vakuum
angelegt und bei 100 Millitorr gehalten;
- Stufe 3: Wenn die Produkttemperatur –50°C erreicht, wird die Einlegebodentemperatur
auf –28°C mit einer Geschwindigkeit
von 0,5°C/Minute
erhöht;
- Stufe 4: Halten der Temperatur bei –28°C für 15 Stunden;
- Stufe 5: Erhöhung
der Temperatur auf 25°C
mit einer Geschwindigkeit von 0,5°C/Minute;
- Stufe 6: Halten der Temperatur bei 25°C für 3,5 Stunden;
- Stufe 7: Verringerung der Temperatur auf 4°C bei 0,5°C/Minute;
- Stufe 8: Halten der Temperatur bei 4°C, bis die Fläschchen
unter Vakuum verschlossen sind; und
- Stufe 9: Entfernung des Produkts aus dem Lyophilisierungsgerät.
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Das Produkt aus Stufe 9 wird anschließend durch
zwei US-Standard-Siebe (Nr. 18 und Nr. 35) geleitet, um ein feines
gleichmäßiges Pulver
zu erhalten. Anschließend
werden 15 mg des Produkts in eine zweistöckige Hartgelatinekapsel Nr.
3 gegeben.
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Die Wirksamkeit des Produkts wurde
in einem Tiermodell unter Verwendung von jungen Farmschweinen gezeigt.
Um die intranasale Retention des Produkts sichtbar zu machen, wurde
sICAM-1 mit 1231 unter Verwendung eines handelsüblichen Iodierungskits (Iodobeads
TM, Pierce, Milwaukee, WI, USA) radioaktiv
markiert und dann der CMC-Formulierung und den nachstehend aufgelisteten
Kontrollzusammensetzungen einverleibt. Kontrollzusammensetzungen
unter Verwendung einer phosphatgepufterten Kochsalzlösung mit
der Formel: 50 mM monobasisches Phosphat, 104 mM Natriumchlorid,
pH-Wert: 6; Hydroxypropylcellulose (HPC)-pulverbasierte Zusammensetzung
mit der Formel: 1% (Gew./Vol.) HPC, 5% (Gew./Vol.) Mannitol; und eine
Hydroxyethylcellulose (HEC)-pulverbasierte
Zusammensetzung mit der Formel: 1% (Gew./Vol.) NEC, 5 (Gew./Vol.)
Mannitol wurden auf analoge Weise, wie zuvor für die CMC-Formulierung beschrieben, hergestellt. Für das Pulver-CMC
und Kontrollzusammensetzungen wurden die lyophilisierten Materialien
zu einem feinen Pulver unter Verwendung eines Metallspatels zerkleinert,
und 30 bis 50 mg des Pulvers wurden in eine 1 ml-Wegwerfpipettenspitze
aus Kunststoff gefüllt.
Die Pipettenspitze, verbunden mit einer in der Hand. gehaltenen
Vollpipette, wurde 1 bis 1,5 cm in jedes Nasenloch eingeführt, und
die Pipette wurde gedrückt,
um einen ausreichenden Druck bereitzustellen, um die Pulver in die
Nase des Tiers abzugeben. Die phosphatgepufferte Kochsalzlösungsformulierung
wurde auf entsprechende Weise in Anteilen von 0,1 ml verabreicht.
Alle diese Clearance-Studien
verwendeten ungefähr
20 bis 50 μCurie
123|-s|CAM-1-Tracer. Nach der Dosierung wurde das
Tier vor eine äußere Gammaszintigraphiekamera
gebracht, und Daten wurden für
90 Minuten gesammelt. Rohe. Zähldaten
wurden um den Zerfall korrigiert und dann in die prozentuale Retention
umgewandelt, die auf die anfänglich
abgegebene Dosis an
123|-s|CAM-1 normiert
wurde. Die Ergebnisse waren wie folgt:
| Zusammensetzung | Prozent
zurückgehaltene
Dosis 90 Minuten nach Verabreichung |
| Lösungsformulierung | 30% |
| Carboxymethylcellulose-Natrium | 80% |
| Hydroxypropylcellulose | 50% |
| Hydroxyethylcellulose | 60% |
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Diese Tests zeigen, dass die Retentionszeit
auf der Nasalmembran für
die erfindungsgemäße Zusammensetzung überraschend
und unerwartet ist.
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Die Erfindung ist im Zusammenhang
mit speziellen Ausführungsformen
davon beschrieben worden, und es versteht sich, dass sie modifiziert
werden kann und dass diese Anmeldung jegliche Variationen, Verwendungen
und Anpassungen der Erfindung abdecken soll, die allgemein den Prinzipien
der Erfindung folgen, und dass sie solche Abweichungen von der vorliegenden
Offenbarung einschließen
soll, wie sie unter die bekannte oder übliche Praxis auf dem Gebiet,
zu dem die Erfindung gehört,
fallen und wie sie auf die wesentlichen Merkmale, die vorstehend
in den beigefügten
Ansprüchen
dargelegt sind, angewandt werden können.