DE19927764A1 - Surfactant Protein C Ester - Google Patents

Abstract

Es werden neue Surfactant Protein C Ester beschrieben, die sich zur Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen für die Behandlung des Atemnotsyndroms von Frühgeborenen und von Erwachsenen eignen.

Description

Technisches Gebiet

Die Erfindung bezieht sich auf lungensurfactant-aktive Polypeptide (Surfactant-Proteine), Verfahren zu deren Herstellung und diese enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen.

Stand der Technik

Die Lunge aller Wirbeltiere enthält ein Substanzgemisch, das als "Lungensurfactant" bezeichnet wird. Es zeigt oberflächenaktive Eigenschaften und setzt die Oberflächenspannung im Alveolarbereich der Lungen so weit herab, daß ein Kollaps der finalen Atemwegsbereiche bei der Ausatmung vermieden wird. Dieses Substanzgemisch reguliert die Oberflächenspannung in einer dynamischen Art und Wei­ se, so daß der nach dem Laplaceschen Gesetz zu erwartende Kollaps der kleinen Alveolen zugunsten der größeren durch entsprechende Anpassung der Oberflächenspannung vermieden wird. Als Ergeb­ nis entsteht so eine wohl ausbalancierte, histologisch und physiologisch stabile Struktur der Lunge.

Lungensurfactant wird von den alveolären Pneumozyten vom Typ II in Form lamellarer Körperchen (lamellar bodies) sezerniert. Dieses sind kompakte Einheiten aus Phospholipid-Doppelschichten (bi­ layern) mit einem hohen Anteil an Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC) und Phosphatidylglycerin (PG). Als weitere essentielle Komponenten sind im Lungensurfactant Proteine enthalten, die mit SP-A, SP-B, SP-C und SP-D bezeichnet werden (Possmayer, F.: A Proposed Nomenclature for Pulmonary Surfactant-associated Proteins. Am. Rev. Respir. Dis. 1988, 138, 990-998). SP-A ist ein hochmolekula­ res Glycoprotein, das bei der Regulation der Sekretion eine entscheidende Rolle spielt.

Die Proteine SP-C und, in geringerem Maße, SP-B übernehmen bei der Ausbildung des monomoleku­ laren Oberflächenfilms (dem Surfactant im engeren Sinne) die Rolle "thermodynamischer Katalysato­ ren". Durch die Anwesenheit dieser Proteine wird die Spreitungskinetik enorm beschleunigt. Erst da­ durch ist die verzögerungsfreie Anpassung des Surfactant an die jeweiligen Oberflächenspannungs­ erfordernisse möglich. Diese Eigenschaften spiegeln sich in dem extrem hydrophoben Charakter der Proteine, insbesondere des SP-C, wieder.

Durch Extraktion von Lungengewebe oder Spülung von Tierlungen konnten Surfactant-Präparationen gewonnen werden, die sowohl in physikochemischen Meßapparaturen, in Tiermodellen als auch bei klinischer Anwendung die Fähigkeit zeigen, einen Surfactant-Mangel auszugleichen und damit z. B. zur Therapie des kindlichen Atemnotsyndroms (IRDS) geeignet sind. Diesen Tierpräparaten sind jedoch gravierende Schwächen zu eigen:

Die Zusammensetzung der Phospholipide ist stark von Tierart, Gesundheit und Ernährungszustand des Tieres abhängig und kann nur begrenzt durch Zumischung definierter Komponenten ausgeglichen werden. Der Gehalt an Surfactant-Proteinen sowie das Verhältnis SP-BISP-C ist den gleichen Unsi­ cherheiten unterworfen. Hinzu kommt, daß eventuelle proteolytische Abbauprodukte der Proteine oder modifizierte Abkömmlinge (z. B. durch Oxidation am Methionin) ebenfalls in der therapeutisch einge­ setzten Mischung enthalten sind. Bei einer längerfristigen Anwendung oder der Applikation großer Mengen an Surfactant, wie sie z. B. beim adulten Atemnotsyndrom (Schocklunge, ARDS) oder bei anderen Anwendungsfeldern, wie z. B. der Benutzung von Surfactant als "Schlepper" für andere Sub­ stanzen bei einer pulmonalen Applikation, nötig werden könnte, ist die Frage des Substanznachschu­ bes offen.

Es bietet sich daher an, diese Probleme durch Herstellung der Proteine auf gentechnischem Wege zu lösen. Da rekombinante Proteine, insbesondere unter Verwendung bakterieller Expressionssysteme, in praktisch unbegrenzten Mengen herstellbar sind, und die Anwendung moderner Analysemethoden und Qualitätskontrollen möglich ist, kann unter Verwendung synthetischer Phospholipide ein Surfactant mit genau definierter Zusammensetzung hergestellt werden. Dieser kann an die therapeutischen Erforder­ nisse optimal angepaßt werden.

Das humane Protein SP-C (siehe nachfolgende Formel I, wobei A = abwesend ist oder Phe bedeutet, B = Cys und C = Met darstellen), das für die Spreitungskinetik besonders wichtig ist, besteht in seinem zentralen Teil ausschließlich aus aliphatischen, sehr hydrophoben Aminosäuren, wie Valin, Leucin und Isoleucin. Die Länge dieses zentralen Teils (Aminosäuren 12-34) erlaubt die Integration des Peptids in den monomolekularen Phospholipidfilm. In der Sequenz Pro-Cys-Cys-Pro (Position 3-6) sind die bei­ den Cys-Reste durch Palmitinsäure an den SH-Gruppen thioverestert. Die Palmitinsäure erhöht den hydrophoben Charakter des Gesamtproteins weiter und verschließt gleichzeitig die beiden SH- Gruppen der Cysteine und schützt sie vor Oxidation und Disulfidbrückenbildung. Die zentrale Region (Aminosäuren 13-34) bildet eine Transmembran-Helix aus. Diese Region wird am N-Terminus flankiert durch eine polare Sequenz, die positiv geladene Aminosäuren (Lys, 10; Arg, 11) enthält.

In der WO 89/04326 und der WO 91118015 wird die Herstellung von rekombinantem SP-C und von Mutanten des SP-C beschrieben. Es wird dort u. a. vorgeschlagen, die beiden Cysteine in Position 4 und 5 durch zwei Serine zu ersetzen. Dies hat bei der Herstellung den Vorteil, daß die nach der Isolie­ rung des sehr hydrophoben Proteins technisch aufwendige Palmitoylierung der beiden Cysteine ent­ fällt.

In der WO 95/32992 werden SP-C-Mutanten beschrieben, die sich von humanem SP-C durch Ersatz der beiden Cysteine in den Positionen 4 und 5 durch Phenylalanin oder Tryptophan und Ersatz des Methionins in Position 32 durch Isoleucin, Leucin oder Serin unterscheiden.

US 5,876,970 beschreibt unter anderem die Analyse von Surfactant Protein C, das aus unterschiedli­ chen natürlichen Quellen isoliert wurde, durch Massenspektrometrie. Es wird erwähnt, daß sich bei der Aufarbeitung von SP-C-Proben für die Massenspektrometrie ein Methyl- bzw. Isopropylester gebildet haben könnte.

Beschreibung der Erfindung

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung weiterer Surfactant-Proteine, die sich zur Herstellung von pharmazeutischen Lungensurfactant-Zubereitungen eignen. Es wurde nun überra­ schenderweise gefunden, daß SP-C-Polypeptide, die am Carboxyterminus mit Alkoholen mit 1-4 Koh­ lenstoffatomen verestert sind, einerseits vorteilhafte Eigenschaften im Hinblick auf ihre Lungensurfac­ tant Aktivität aufweisen und andererseits vorteilhafte Eigenschaften im Hinblick auf ihre Stabilität zei­ gen. Die erfindungsgemäßen SP-C-Ester sind insbesondere gekennzeichnet durch eine geringe Ag­ gregationsneigung und damit verbesserte Stabilität in Lösung.

In einem Aspekt betrifft die Erfindung daher SP-C-Polypeptide, bei denen die Aminosäure am Car­ boxyterminus des Polypeptids mit einem Alkohol mit 1-4 Kohlenstoffatomen verestert ist und Salze davon.

Im Zusammenhang mit der Erfindung wird unter der Bezeichnung SP-C, in Analogie zu der von Poss­ mayer (Possmayer, F.: A Proposed Nomenclature for Pulmonary Surfactant-associated Proteins. Am. Rev. Respir. Dis. 1988, 138, 990-998) vorgeschlagenen Nomenklatur, die in natürlichem Lungensur­ factant oder Amnionflüssigkeit von Säugetieren vorkommende und als SP-C bezeichnete "Familie" von Surfactant-Proteinen verstanden. Bevorzugt wird unter SP-C das in humanem Lungensurfactant oder in humaner Amnionflüssigkeit vorkommende Surfactant-Protein SP-C verstanden.

Weiterhin umfaßt die Bezeichnung SP-C auch chemisch synthetisch oder rekombinant hergestelltes SP-C sowie Modifikationen von SP-C, beispielsweise solche Modifikationen, bei denen eine oder meh­ rere Aminosäuren fehlen oder durch andere Aminosäuren ersetzt wurden. Chemisch synthetisch oder rekombinant hergestelltes SP-C sowie Modifikationen von SP-C sind beispielsweise beschrieben in WO89104326, WO91/00871, WO91/18015, WO93/21225 oder auch in WO95132992.

In einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung wird unter SP-C ein aus der WO95/32992 bekanntes Surfactant-Protein mit der Aminosäuresequenz der Formel I verstanden:

worin A abwesend ist oder Phe bedeutet, B für Phe oder Trp und C für Ile, Leu oder Ser stehen.

Bevorzugt sind solche Surfactant-Proteine der Formel I, worin A abwesend ist oder Phe bedeutet, B für Phe und C für Ile stehen. Besonders bevorzugt ist ein Surfactant-Protein der Formel I, worin A abwe­ send ist, B für Phe und C für Ile stehen [nachfolgend auch als SP-C (FF/I) oder rSP-C (FF/I) bezeich­ net].

Die Aminosäuresequenzen sind in der üblichen nomenklaturgerechten Kurzschreibweise (dreibuchsta­ big) mit der Aminosäure, die die freie Aminogruppe trägt, am linken Ende (Aminoterminus; Aminosäure mit der Nummer 0 bzw. 1 in der Formel I) und der Aminosäure, die die freie Carboxylgruppe trägt, am rechten Ende (Carboxyterminus; Aminosäure mit der Nummer 34 in der Formel I) dargestellt.

Die erfindungsgemäßen SP-C-Ester zeigen im Gemisch mit Phospholipiden Lungensurfactantaktivität. Die Bestimmung der Lungensurfactantaktivität kann in einer dem Fachmann bekannten Weise erfol­ gen. Natürlicher Lungensurfactant hat oberflächenaktive Eigenschaften; er reduziert beispielsweise die Oberflächenspannung in den Lungenbläschen. Einen einfachen und schnellen in-vitro-Test, mit dem sich die Oberflächenaktivität von Lungensurfactant-Zubereitungen bestimmen läßt, stellt z. B. die soge­ nannte Wilhelmy Waage dar [Goerke, J. Biochim. Biophys. Acta, 344: 241-261 (1974), King R. J. and Clements J. A., Am. J. Physicol. 223: 715-726 (1972)]. Diese Methode gibt Hinweise auf die Lungen­ surfactant-Qualität, gemessen als Tätigkeit eines Lungensurfactants, eine Oberflächenspannung von nahe Null mN/m zu erreichen. Eine andere Meßvorrichtung, um die Oberflächenaktivität von Lungen­ surfactant zu bestimmen, ist der "Pulsating Bubble Surfactometer" [Possmayer F., Yu S. und Weber M., Prog. Resp. Res., Ed. v. Wichert, Vol. 18: 112-120 (1984)]. Die Aktivität einer Lungensurfactant- Zusammensetzung kann auch mittels in-vivo-Tests festgestellt werden. Durch die Messung von z. B. der Lungencompliance, des Blutgasaustausches bzw. der benötigten Beatmungsdrücke in Tiermodel­ len von ARDS und IRDS kann man Hinweise auf die Aktivität eines Lungensurfactants erhalten. Ein solches Modell wird beispielsweise von Häfner et al. beschrieben (D. Häfner et al.: Effects of rSP-C surfactant on oxygenation and histology in a rat lung lavage model of acute lung injury. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 1998, 158: 270-278).

Im Zusammenhang mit der Erfindung wird unter Alkohol mit 1-4 Kohlenstoffatomen insbesondere ali­ phatischer Alkohol mit 1-4 Kohlenstoffatomen verstanden. Genannt seien hier Methanol, Ethanol, 1-Propanol, 2-Propanol (Isopropanol), 1-Butanol und 2-Butanol, wobei Methanol und 2-Propanol be­ vorzugt sind.

Als Salze kommen für die erfindungsgemäßen SP-C-Ester insbesondere Säureadditionssalze mit Säu­ ren in Betracht. Besonders erwähnt seien die pharmakologisch verträglichen Salze der in der Galenik üblicherweise verwendeten starken Säuren. Als solche eignen sich zweckmäßigerweise Säureadditi­ onssalze mit Säuren wie beispielsweise Salzsäure, Bromwasserstoffsäure und Schwefelsäure, wobei die Säuren bei der Salzherstellung - je nachdem, ob es sich um eine ein- oder mehrbasige Säure han­ delt und je nachdem, welches Salz gewünscht wird - im äquimolaren oder einem davon abweichenden Mengenverhältnis eingesetzt werden.

Die Herstellung des SP-C-Esters kann ausgehend von dem entsprechenden Surfactant-Protein C mit der freien Carboxylgruppe am Carboxyterminus durch Umsetzung mit dem entsprechenden Alkohol unter geeigneten Veresterungsbedingungen erfolgen. Weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen SP-C-Ester durch Umsetzung des entsprechenden Surfactant-Protein C mit der freien Carboxylgruppe am Carboxyterminus durch Umsetzung mit einem gewünschten Alkohol unter geeigneten Veresterungsbedingungen. Bevorzugt wird der Alkohol in gro­ ßem Überschuß als Lösungsmittel eingesetzt und die Veresterung mit Hilfe einer Säure durchgeführt. Im Hinblick auf den hydrophoben Charakter der Surfactant-Proteine ist es vorteilhaft, den Alkohol im Gemisch mit anderen organischen Lösungsmitteln einzusetzen. Bevorzugt handelt es sich bei diesen anderen organischen Lösungsmitteln um halogenierte Kohlenwasserstoffe wie beispielsweise Chloro­ form und Dichlormethan. Geeignete Säuren sind insbesondere starke Säuren wie beispielsweise Salz­ säure, Schwefelsäure oder Bromwasserstoffsäure. Zur Vermeidung der Bildung von Zersetzungspro­ dukten wird die Veresterung bevorzugt bei Temperaturen im Bereich bis zur Raumtemperatur durch­ geführt. Nach erfolgter Veresterung werden die erhaltenen Ester auf übliche Weise isoliert und gege­ benenfalls noch einer Reinigung unterzogen, beispielsweise durch Säulenchromatographie mit einem geeigneten Lösungsmittel (z. B. wie in der WO95132992 oder der WO 92/00993 beschrieben). Die Iso­ lierung oder Herstellung beispielhafter Surfactant-Proteine C, die als Ausgangsprodukte für die Vere­ sterung eingesetzt werden können, ist beispielsweise beschrieben in WO89/04326, WO91/00871, WO91118015, WO93/21225 oder auch in WO95/32992. Die Herstellung von rSP-C (FF/I) ist in der WO95/32992 beschrieben. Beispielsweise können die dort nach der chromatographischen Reinigung des Proteins erhaltenen rSP-C (FF/I) Lösungen (s. WO95/32992, Seite 10, zweiter Absatz) direkt zu den entsprechenden rSP-C(FF/I)-Estern weiterverarbeitet werden.

Die erfindungsgemäßen SP-C-Ester können einzeln oder in Kombination miteinander in pharmazeuti­ schen Zusammensetzungen zur Verfügung gestellt werden, die an die Erfordernisse der Atemwegsbe­ handlung angepaßt sind. Erwähnenswert ist die Kombination der erfindungsgemäßen SP-C-Ester mit mindestens einem weiteren lungensurfactant-aktiven Polypeptid aus der Gruppe SP-A, unverestertes SP-C und SP-B in pharmazeutischen Zusammensetzungen. Besonders erwähnenswert ist hier die Kombination mit unverestertem SP-C in den pharmazeutischen Zusammensetzungen. Bevorzugt sind dabei Kombinationen die (bezogen auf die Gesamtmenge an Surfactant-Protein in den Zusammenset­ zungen) bis zu 50 Gew.-% SP-C (unverestert) und als Rest einen oder mehrere erfindungsgemäße SP-C-Ester enthalten oder Kombinationen die bis zu 50 Gew.-% eines oder mehrerer der erfindungs­ gemäßen SP-C-Ester und als Rest SP-C (unverestert) enthalten. Besonders bevorzugt sind Kombina­ tionen die 5 bis 15 Gew.-% SP-C (unverestert) und als Rest einen oder mehrere der erfindungsgemä­ ßen SP-C-Ester enthalten oder Kombinationen die 0,5 bis 10 Gew.-% eines oder mehrerer der erfin­ dungsgemäßen SP-C-Ester und als Rest SP-C (unverestert) enthalten, insbesondere solche die 2 bis 5 Gew.-% SP-C-Ester und den Rest SP-C (unverestert) enthalten. Bevorzugt ist hier die Kombination aus rSP-C(FF/I)-Ester und rSP-C (FF/I) in unveresterter Form. Beispielhafte Kombinationen enthalten 1-6 Gew.-% rSP-C(FF/I)-Methylester und als Rest rSP-C (FF/I) in unveresterter Form. Solche Kombi­ nationen können beispielsweise direkt aus der Veresterungsreaktion des SP-C erhalten werden, wenn die Veresterungsreaktion vor einem vollständigen Umsatz abgebrochen wird oder durch Mischen der entsprechenden reinen Kombinationsbestandteile.

Die Zusammensetzungen enthalten neben dem Surfactant-Protein Phospholipide, vorzugsweise sol­ che Phospholipide, die in natürlichen Lungensurfactant-Zusammensetzungen enthalten sind, wie vor­ zugsweise Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC), Palmitoyloleylphosphatidylglycerol (POPG) und/oder Phosphatidylglycerol (PG). Als weitere Bestandteile, die in den erfindungsgemäßen Zusammensetzun­ gen enthalten sein können, seien Fettsäuren wie beispielsweise Palmitinsäure genannt. Zur Einstel­ lung einer günstigen Viskosität können die Zusammensetzungen Elektrolyte wie Calcium-, Magnesium- und/oder Natriumsalze enthalten (beispielsweise Calciumchlorid, Natriumchlorid und/oder Natriumhy­ drogencarbonat). Der Fachmann orientiert sich bei der Bemessung der Art und Menge der einzelnen Bestandteile der Zusammensetzungen zum einen an der bekannten Zusammensetzung natürlicher Lungensurfactants und zum anderen an den zahlreichen Vorschlägen nach dem Stand der Technik, wie z. B. EP-A 0119056 und EP-A 0406732.

Erfindungsgemäße Zubereitungen enthalten zweckmäßigerweise 80 bis 95 Gew.-% Phospholipide, 0,2 bis 5 Gew.-% Surfactant Protein, 2 bis 15 Gew.-% Fettsäuren und 0 bis 5 Gew.-% Elektrolyte (bezogen auf das Trockengewicht).

Vorzugsweise handelt es sich bei den Phospholipiden um Gemische aus Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC) und Palmitoyloleylphosphatidylglycerol (POPG), insbesondere im Verhältnis (Gewichtverhält­ nis) von 7 zu 3 bis 3 zu 7.

Bevorzugte erfindungsgemäße Zubereitungen enthalten 80 bis 95 Gew.-% Phospholipide, 0,5 bis 3,0 Gew.-% Surfactant-Protein, 3 bis 15 Gew.-% Fettsäure, vorzugsweise Palmitinsäure, und 0 bis 3 Gew.-% Calciumchlorid (bezogen auf das Trockengewicht).

Bevorzugte erfindungsgemäße Zusammensetzungen enthalten 80 bis 95 Gew.-% Phospholipide, 0,5 bis 3,0 Gew.-% Surfactant-Protein, 4 bis 7 Gew.-% Fettsäure, vorzugsweise Palmitinsäure, und 1 bis 3 Gew.-% Calciumchlorid.

Die Herstellung der erfindungsgemäßen Zubereitungen erfolgt auf eine dem Fachmann vertraute Wei­ se beispielsweise durch Einbau des Surfactant-Proteins in eine Phospholipidmatrix wie in der WO95/32992 beschrieben. Erfindungsgemäß bevorzugt werden die Lungensurfactant-Zubereitungen in lyophilisierter und insbesondere in sprühgetrockneter Form bereitgestellt. Lyophilisierte Zubereitun­ gen sind beispielsweise bekannt aus WO 97/35882, WO95132992, WO 91/00871 und DE 32 29 179. Die WO 97/26863 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von pulverförmigen Lungensurfactant- Zubereitungen durch Sprühtrocknung. Erfindungsgemäß sind auf diese Weise hergestellte Zubereitun­ gen bevorzugt.

Beispiele 1. rSPC(FFh)-Ester rSPC(FF/l)-methylester

5 Fraktionen (1 l) der gemäß WO95/32992 nach HPLC-Chromatografie erhaltenen reinen rSPC(FF/l)- Lösungen wurden in einem Scheidetrichter mit 500 ml Chloroform und 300 ml 1 N Salzsäurelösung versetzt, gut durchmischt und dann nach Phasentrennung die wäßrige Phase abgetrennt. Die organi­ sche Phase wird mit Methanol auf 1 l verdünnt und nochmals mit 300 ml 1 N Salzsäurelösung gewa­ schen. Nach Phasentrennung wird die organische Phase wiederum mit Methanol auf 1 l verdünnt und der pH der Lösung mit konz. Salzsäurelösung auf ca. pH 1 eingestellt. Man läßt 2 Tage bei Raumtem­ peratur stehen und destilliert dann am Rotationsverdampfer ca. 300 ml Lösungsmittelgemisch ab. Nach weiteren 3 Tagen bei Raumtemperatur läßt sich mittels HPTLC (HPTLC-Fertigplatten Diol (Merck); Laufmittel; Chloroform: Methanol: Ammoniak (25%): H₂O = 13 : 6 : 0,4 : 0,8; Anfärbung: Comas­ sie-Blue) kein unverestertes rSPC(FF/l) mehr nachweisen. Die Lösung wird zweimal mit je 300 ml 0,1 N Salzsäurelösung ausgeschüttelt, wobei nach Phasentrennung die organische Phase jeweils mit 2- Propanol auf ca. 700 ml verdünnt wird. Der pH der Lösung wird mit gesättigter NaHCO₃-Lösung auf pH 3,5-4 eingestellt. Die Lösung wird insgesamt 4× am Rotavapor bei 20-25°C auf 250 ml eingeengt und jeweils wieder mit 2-Propanol auf 500 ml aufgefüllt. Nach Filtration erhält man schließlich eine Lösung von ca. 200 mg rSPC(FF/l)-methylester in 2-Propanol, die bei -20°C gelagert wird. Das Mas­ senspektrum (MALDI-TOF) zeigt den Molekülpeak MH⁺ bei 3634 Da.

rSPC(FF/I)-2-propylester

6 Fraktionen (1,2 l) der gemäß WO95/32992 nach HPLC-Chromatografie erhaltenen, reinen rSPC(FF/l)-Lösungen werden in einem Scheidetrichter mit 600 ml Chloroform und 400 ml 1 N Salzsäu­ relösung versetzt, gut durchmischt und nach Phasentrennung die wäßrige Phase abgetrennt. Die or­ ganische Phase wird mit 2-Propanol auf 1,2 l verdünnt, und dann wird mit konz. Salzsäure ein pH von 0,5-1 eingestellt. Nach 1 Tag Stehen bei Raumtemperatur werden am Rotationsverdampfer bei 20-­ 25°C ca. 300 ml Lösungsmittelgemisch abdestilliert und wieder durch 300 ml 2-Propanol ersetzt. Die­ se Prozedur wird nach 3, 6, 9 und 12 Tagen Stehen bei Raumtemperatur wiederholt. Dann kann mit­ tels HPTLC (siehe Beispiel 1) praktisch kein unverestertes rSPC(FF/l) mehr nachgewiesen werden. Der pH der Lösung wird mit ges. NaHCO₃-Lösung auf 3,5-4 eingestellt und dann die Lösung am Ro­ tationsverdampfer auf 500 ml eingeengt. Nach Filtration erhält man eine Lösung von ca. 250 mg rSPC(FF/l)-2-propylester in 2-Propanol, die bei -20°C gelagert wird. Das Massenspektrum (MALDI- TOF) zeigt den Molekülpeak MH⁺ bei 3662 Da.

2. Einbau von rSP-C(FF/I)-Ester in eine Phospholipid-Matrix

rSP-C(FF/l) Methyl- oder 2-Propylester wird in i-Propanollösung mit den Komponenten der Phospholi­ pidmatrix versetzt und durch Einsprühen in eine verdünnte Kochsalzlösung (0,065% w/w NaCl) bei Raumtemperatur in homogener Mischung mit den Komponenten der Phospholipidmatrix ausgefällt. Aus der Lungsurfactantsuspension wird der Lungensurfactant (LSF) mit einer Becherzentrifuge abge­ trennt, in Elektrolytlösung (NaCl, CaCl₂) resuspendiert und der pH-Wert mit 0,1 N NaOH auf pH 6,5 eingestellt. Diese wäßrige Suspension wird auf 20 ml Vials abgefüllt und lyophilisiert. Die im folgenden Herstellungsbeispiel gemachten Gewichts- und Volumenangaben beziehen sich auf die Herstellung von 10 g Lungensurfactant-Präparation:

7,00 g Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC), 3,08 g Palmitoyloleylphosphatidyl-glycerol-Ammonium­ salz (POPG × NH₄) und 0,25 g Palmitinsäure werden bei 40°C in 200 ml 90% i-Propanol gelöst und dann auf Raumtemperatur abgekühlt. Die erhaltene Phospholipidlösung wird mit 1 l einer Lösung ent­ haltend 200 mg SP-C(FF/I)-Methyl- oder 2-Propylester vereinigt. Die erhaltene "Sprühlösung" wird unter Rühren mit Bikarbonatlösung (ca. 5 ml 5% NaHC₀₃-Lösung) auf pH 4, 5 eingestellt.

Die "Sprühlösung" wird bei Raumtemperatur mit einer Einsprühgeschwindigkeit von 25 ml/min über eine Einstoffdüse in 9,6 l verdünnte NaCl-Lösung (0,065% w/w) unter intensivem Rühren eingebracht. Es bildet sich eine opaleszierende Lösung, aus der nach zweistündiger Lagerung bei 4°-8°C die Lun­ gensurfactant-Präparation durch Einsprühen einer Elektrolytlösung (3,0 g CaCl₂ × 2 H₂O und 61,3 g NaCl in 300 ml H₂O) ausgefällt wird. Die Lungsurfactant-Suspension (Gesamtvolumen 10,8-11,0 l) wird über Nacht bei 4°C gelagert und dann mit einer Sorvall-Becherzentrifuge (RC2-B) bei 16000 g in jeweils 30 Minuten abzentrifugiert. Der Zentrifugationskuchen wird jeweils zur Entfernung anhaftenden restlichen i-Propanols im halben Volumen 0,65%iger Kochsalzlösung resuspendiert und erneut zen­ trifugiert. Diese Prozedur wird insgesamt 3-4 mal wiederholt. Der Kuchen der letzten Zentrifugation wird in 400 ml 0,65%iger NaCl-Lösung aufgenommen, mit 0,1 N NaOH auf pH 6,5 eingestellt und in Portionen zu 6,2 g auf 20 ml Vials aufgeteilt. Der Inhalt der Vials wird wie folgt lyophilisiert: Einfrieren über 6 Stunden bei -45°C und Normaldruck, Gefriertrocknen für 54 Stunden bei 0,16 mbar und -20°C, danach zur weiteren Intensivtrocknung noch 5 Stunden bei -20°C und 0,02 mbar.

Man erhält 65-66 Vials, die jeweils 0,150 g Lungensurfactant (ber. ohne NaCl) enthalten.

Die trockenen Lungensurfactant-Proben werden im Kühlschrank bei 4°C gelagert und müssen vor dem Einsatz mit Wasser oder physiologischer Kochsalzlösung resuspendiert werden (Suspensionskonzen­ tration 25 mg/ml).

Pro Vial sind enthalten:
95,6 mg Dipalmitoylphosphatidylcholin
42,1 mg Palmitoyloleylphosphatidylglycerol (Ammoniumsalz)
2,7 mg rSP-C(FF/I) Methyl- oder 2-Propylester
6,8 mg Palmitinsäure
2,9 mg Calciumchlorid (wasserfrei)

3. Herstellung pulverförmiger Lungensurfactant-Zubereitungen

Die Herstellung pulverförmiger Lungensurfactant-Zubereitungen erfolgt nach dem in der WO 97/26863 beschriebenen Verfahren:

Beispiel A

10,95 g 1,2-Dipalmitoyl-3-sn-phosphatidylcholin, 4,6 g 1-Palmitoyl-2-oleoyl-3-sn-phosphatidylglycerol-am­ monium, 418 mg Calciumchloriddihydrat und 750 mg Palmitinsäure werden in 330 ml 2-Propanol/Wasser (85 : 15) bei 50°C gelöst und nach dem Abkühlen auf 3000 mit 620 ml einer Lösung von rSP-C (FF/I) 2-Propylester in Isopropanol/Wasser (95 : 5, c = 484 mg/l) gemischt. Die resultierende Lösung wird in einem Laborsprühtrockner Büchi B 191 sprühgetrocknet. Sprühbedingungen: Trocknungsgas Stickstoff, Eintritts­ temperatur 100°C, Austrittstemperatur 58-60°C. Man erhält ein farbloses Pulver.

Beispiel B

3,74 g (5,1 mmol) 1,2-Dipalmitoyl-3-sn-phosphatidylcholin, 2,81 g (3,7 mmol) 1-Palmitoyl-2-oleoyl-3-sn- phosphatidylcholin, 2,90 g (3,9 mmol) 1,2-Dipalmitoylphosphatidyl-3-sn-phosphatidylglycerol-natrium, 234 mg Palmitinsäure und 279 mg (1,9 mmol) Calciumchloriddihydrat werden in 160 ml 2-Propanol/Wasser (85 : 15) bei 5000 gelöst und nach dem Abkühlen auf 3000 mit 566 ml einer Lösung von rSP-C(FF/I)- Methylester in Isopropanol/Wasser (92 : 8, c = 330 mg/l) bei 3000 gemischt. Die resultierende Lösung wird in einem Laborsprühtrockner Büchi B 191 sprühgetrocknet. Sprühbedingungen: Trocknungsgas Stickstoff, Eintrittstemperatur 9000, Austrittstemperatur 58-60°C. Man erhält ein farbloses Pulver.

Gewerbliche Anwendbarkeit

Das Adult Respiratory Distress Syndrome (ARDS) ist ein beschreibender Ausdruck, der auf eine große Anzahl akuter, diffus infiltrativer Lungenläsionen unterschiedlicher Ätiologie angewendet wird, sofern sie mit einer schweren Gasaustauschstörung (insbesondere arterieller Hypoxämie) verbunden sind. Der Ausdruck ARDS wird wegen der zahlreichen klinischen und pathologischen Gemeinsamkeiten zum Infant Respiratory Distress Syndrome (IRDS) verwendet. Steht beim IRDS der durch die frühzeiti­ ge Geburt bedingte Lungensurfactant-Mangel im Vordergrund, so ist beim ARDS eine Lungensurfac­ tant-Fehlfunktion durch die auf unterschiedlichen Ätiologien basierende Erkrankung der Lunge hervor­ gerufen. Auslösende Ursachen für ein ALI (Acute Lung Injury) einschließlich ARDS können beispiels­ weise sein (zit. nach Harrison's Principles of Internal Medicine 10th Ed 1983 McGraw-Hill Int. Book Comp.) diffuse pulmonale Infektionen (z. B. durch Viren, Bakterien, Pilze), Aspiration von z. B. Magen­ saft oder bei Beinahe-Ertrinken, Inhalation von Toxinen oder Irritantien (z. B. Chlorgas, Stickoxide, Brandrauch), direktes oder indirektes Trauma (z. B. multiple Frakturen bzw. Lungenkontusion), sy­ stemische Reaktionen auf Entzündungen außerhalb der Lunge (z. B. hämorrhagische Pankreatitis, gram-negative Septikämie), Transfusionen hoher Blutvolumen oder auch nach kardiopulmonalem By­ pass.

Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen eignen sich nicht nur zur Behandlung oder Prophylaxe von IRDS bei Frühgeborenen und zur Behandlung oder Prophylaxe von ALI einschließlich ARDS bei Erwachsenen sondern auch zur Behandlung oder Prophylaxe von Pneumonien, Bronchitis, Meconium Aspiration Syndrome, COPD (chronic obstructive pulmonary disease), Asthma und cystischer Fibrose. Außerdem eignen sich die erfindungsgemäßen Surfactantproteine und die erfindungsgemäßen Zu­ sammensetzungen als Schlepper für die Verabreichung anderer Arzneistoffe.

Die Verabreichung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen erfolgt auf dem Fachmann bekannte Weise, vorzugsweise durch intratracheale Instillation (Infusion oder Bolus) oder in Form einer Verne­ belung. Bevorzugt werden die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen für die Verabreichung in ei­ nem geeigneten Lösungsmittel oder Resuspendiermedium gelöst bzw. suspendiert, insbesondere wenn die Zusammensetzungen in lyophilisierter oder sprühgetrockneter Form vorliegen. Vorzugsweise handelt es sich bei dem geeigneten Resuspendiermedium um physiologische Kochsalzlösung. Es erweist sich als vorteilhaft, Suspensionen bzw. Lösungen der erfindungsgemäßen Zusammensetzun­ gen zu verabreichen, die 12,5 bis 100 mg Phospholipide pro ml Suspension enthalten. Vorzugsweise werden die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen pro Applikation in einer solchen Menge verab­ reicht, daß die Menge an Phospholipiden zwischen 12,5 und 200 mg pro Kilogramm Körpergewicht beträgt. Die Verabreichung erfolgt in der Regel ein- bis dreimal täglich über einen Zeitraum von 1 bis 7 Tagen. Gewünschtenfalls kann vor der Verabreichung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen eine bronchoalveoläre Lavage, vorzugsweise mit verdünnter Lungensurfactant-Zusammensetzung durchgeführt werden. Eine solche Vorgehensweise ist beispielsweise beschrieben in Gommers et al. [Bronchoalveolar lavage with a diluted surfactant suspension prior to surfactant instillation improves the effectiveness of surfactant therapy in experimental acute respiratory distress syndrome (ARDS), Inten­ sive Care Med. 1998, 24 : 494-500] und in der WO98149191.

Weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher auch ein Verfahren zur Behandlung oder Prophylaxe von Pneumonien, Bronchitis, Meconium Aspiration Syndrome, COPD, Asthma, cystischer Fibrose, IRDS und/oder ALI (einschließlich ARDS) in Säugern, insbesondere Menschen, durch Verabreichung einer geeigneten Menge einer erfindungsgemäßen Lungensurfactant-Zusammensetzung.

Weiterer Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung der erfindungsgemäßen Surfactantpro­ teine zur Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen (Arzneimitteln) zur Behandlung oder Prophylaxe von Pneumonien, Bronchitis, Meconium Aspiration Syndrome, COPD, Asthma, cysti­ scher Fibrose, IRDS und/oder ALI (einschließlich ARDS) in Säugern, insbesondere Menschen.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Handelsprodukt, bestehend aus einem üblichen Sekun­ därpackmittel, einem eine pharmazeutische Zusammensetzung enthaltenden Primärpackmittel (bei­ spielsweise eine Ampulle) und gewünschtenfalls einem Beipackzettel, wobei die pharmazeutische Zubereitung geeignet ist zur Behandlung oder Prophylaxe von Pneumonien, Bronchitis, Meconium Aspiration Syndrome, COPD, Asthma, cystische Fibrose, IRDS und/oder ALI (einschließlich ARDS) und wobei auf dem Sekundärpackmittel oder auf dem Beipackzettel des Handelsprodukts auf die Eig­ nung der pharmazeutischen Zusammensetzung zur Prophylaxe oder Behandlung der genannten Krankheiten hingewiesen wird, und wobei die pharmazeutische Zusammensetzung mindestens einen erfindungsgemäßen SP-C-Ester zusammen mit geeigneten pharmazeutischen Hilfsstoffen umfaßt. Das Sekundärpackmittel, das die pharmazeutische Zusammensetzung enthaltende Primärpackmittel und der Beipackzettel entsprechen ansonsten dem, was der Fachmann als Standard für pharmazeutische Zusammensetzungen dieser Art ansehen würde.

Pharmakologische Untersuchungen

Eine erfindungsgemäße Zusammensetzung enthaltend rSP-C(FF/I)-Methylester (nachfolgend als Charge LLÜ139 bezeichnet) und eine erfindungsgemäße Zusammensetzung enthaltend eine Kombi­ nation aus rSP-C(FF/I)-Methylester und rSP-C (FF/I) (unverestert) im Gewichtsverhältnis (bezogen auf die Gesamtmenge an Surfactant-Protein in der Zusammensetzung) von 5 zu 95 (nachfolgend als Charge ERaß bezeichnet) wurden in einem von Häfner et al. beschriebenen Modell [D. Häfner, P.-G. Germann and D. Hauschke: Effects of rSP-C surfactant on oxygenation and histology in a rat lung lavage model of acute lung injury. Am. J. Resp. Crit Care Med. 158, 270-278 (1998)] untersucht. Die beiden Chargen wurden im RLL-Modell nach Spätbehandlung (Gabe 1 h nach der letzten Lavage) in den Do­ sierungen 12.5, 25, 50 und 100 mg Phospholipid pro kg Körpergewicht eingesetzt. Beide Chargen zeigen eine deutliche Verbesserung der Oxygenierung gegenüber Kontrollen, die nicht behandelt wur­ den. Die Effekte sind dosisabhängig. Die Werte liegen speziell bei Dosierungen von 50 und 100 mg Phospholipid pro kg Körpergewicht im Bereich der Ausgangswerte nicht-lavagierter Ratten.

Figurenbeschreibung

Fig. 1 zeigt graphisch den Einfluß einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung enthaltend rSP-C­ (FF/I)-Methylester (LLÜ139) und einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung enthaltend eine Kombi­ nation aus rSP-C(FF/I)-Methylester und rSP-C (FF/I) (unverestert) im Gewichtsverhältnis von 5 zu 95 (Eraß) für Dosierungen mit 12.5, 25, 50 und 100 mg Phospholipid pro kg Körpergewicht auf die Oxyge­ nierung in einem von Häfner et al. beschriebenen Modell [D. Häfner, P.-G. Germann and D. Hauschke: Effects of rSP-C surfactant on oxygenation and histology in a rat lung lavage model of acute lung injury. Am. J. Resp. Crit Care Med. 158, 270-278 (1998)]. Die Dosis 0 mg Phospholipid pro kg Körpergewicht gibt die Oxygenierung unbehandelter Kontrollen wieder.

Claims (10)

1. Surfactant-Protein C, wobei die Aminosäure am Carboxyterminus des Surfactant-Proteins mit ei­ nem Alkohol mit 1-4 Kohlenstoffatomen verestert ist und pharmakologisch verträgliche Salze da­ von.

2. Surfactant-Protein C nach Anspruch 1, wobei es sich um ein Surfactant-Protein mit der Aminosäu­ resequenz der Formel I handelt,
worin A abwesend ist oder Phe bedeutet, B für Phe oder Trp und C für Ile, Leu oder Ser stehen.

3. Surfactant-Protein C nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß A abwesend ist oder Phe bedeutet, B für Phe und C für Ile stehen.

4. Surfactant-Protein C nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß A abwesend ist, B für Phe und C für Ile stehen.

5. Surfactant-Protein C nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem Alkohol um Methanol oder 2- Propanol handelt.

6. Pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung oder Prophylaxe von Pneumonien, Bronchi­ tis, Meconium Aspiration Syndrome, COPD, Asthma, cystische Fibrose, IRDS und/oder ALI (ein­ schließlich ARDS) in Säugern, gekennzeichnet durch den Gehalt an einem Surfactant-Protein C- Ester nach einem der Ansprüche 1 bis 5.

7. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein weiteres Surfactant-Protein aus der Gruppe SP-A, unverestertes SP-C und SP-B enthalten ist.

8. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß rSP-C (FF/I) enthalten ist.

9. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß Phospholi­ pide, Fettsäuren und Elektrolyte enthalten sind.

10. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß bezogen auf das Trockengewicht der Zusammensetzung 80 bis 95 Gew.-% Phospholipide, 0,2 bis 5 Gew.-% Surfactant-Protein, 2 bis 15 Gew.-% Fettsäuren und 0 bis 5 Gew.-% Elektrolyte enthalten sind.