DE2742490C2

DE2742490C2 -

Info

Publication number: DE2742490C2
Application number: DE2742490A
Authority: DE
Inventors: Serge Jean Elie Bonfils; Juliette Paris Fr Dubrasquet; Pierre Versailles Fr Fromageot; Jean-Pierre Gif Sur Yvette Fr Girma; Miguel Asnieres Fr Lewin; Jean-Louis Paris Fr Morgat
Original assignee: Commissariat a lEnergie Atomique CEA; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Current assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Priority date: 1976-09-21
Filing date: 1977-09-21
Publication date: 1987-05-27
Also published as: FR2364659A1; BE858507A; US4164571A; GB1567537A; DE2742490A1; FR2364659B1; JPS5338632A

Description

Die Erfindung betrifft Arzneimittel auf der Grundlage von Polypeptid-amid-derivaten, die insbesondere als therapeutische Mittel und noch genauer als Antagonisten der Wirkung von Gastrin und verwandten Polypeptiden im Bereich ihrer spezifischen biologischen Rezeptoren wirken.

Es sei in Erinnerung gerufen, daß Gastrin ein natürlich vorkommendes Hormon ist, das insbesondere dafür bekannt ist, daß es für die Sekretion des Magensafts verantwortlich ist. Seine Wirkung auf die Organe des Verdauungstrakts ist wie die der meisten Hormone mit der Anwesenheit von Targetzellen bzw. Zielzellen in diesen Organen verbunden, deren Plasmamembranen spezifische biologischen Rezeptoren aufweisen, die dazu geeignet sind, die Hormonmoleküle zu binden und unter ihrem Einfluß eine Folge von biochemischen Reaktionen zu veranlassen, die zur Synthese und zur Bildung eines besonderen Produkts, wie des Magensafts, führen.

Der Ausdruck "verwandte Polypeptide" steht für eine Familie von Polypeptiden, die an ihrem Ende die C-endständige Folge von vier Aminosäuren, nämlich L-Tryptophanyl-L-methionyl-L-aspatyl-L-phenylamin-amid aufweisen, die für die biologische Wirkung des Gastrins charakteristisch ist, welche Polypeptide ebenfalls dazu geeignet sind, biologische Reaktionen zu verursachen, indem sie an spezifische Rezeptoren gebunden werden.

Es ist bekannt, daß eine hormonale Hypersekretion zu gewissen pathologischen Störungen führen kann, die z. B. für Gastrin in Zusammenhang mit dem Zollinger-Ellison-Syndrom bekannt sind, und von denen angenommen wird, daß sie für eine Vielzahl von anderen Krankheitszuständen verantwortlich sind.

Das Problem bei der Behandlung dieser pathologischen Erkrankungen besteht darin, daß derzeit kein Produkt bekannt ist, das die Wirkung dieser Hormone im Bereich der Targetzellen zu unterdrücken vermag.

Die Aufgabe der Erfindung besteht somit darin, ein Arzneimittel zu schaffen, das es ermöglicht, die Wirkung des Gastrins und der damit verwandten Polypeptide durch eine antagonistische Wirkung im Bereich ihrer biologischen Rezeptoren zu unterdrücken.

Gegenstand der Erfindung ist daher ein Arzneimittel, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es als Wirkstoff ein Polypeptidamid-derivat der folgenden allgemeinen Formel enthält, in der
R₁ ein Wasserstoffatom oder eine Acylgruppe und
R₂ eine gegebenenfalls substituierte Arylgruppe bedeuten.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung steht die Gruppe R₂ für eine Nitrophenylgruppe oder eine Dinitrophenylgruppe, wie die 2-Nitrophenylgruppe der folgenden Formel oder die 2,4-Dinitrophenylgruppe der folgenden Formel

Die pharmazeutischen Eigenschaften des durch die obige allgemeinen Formel definierten Polypeptid-amid-derivats sind überwiegend eine Folge der Anwesenheit der genannten Sequenz aus vier Aminosäuren, die für Gastrin und die damit verwandten Polypeptide charakteristisch ist und die Modifizierung dieser Sequenz durch eine Arylthiogruppe, wie die o-Nitrophenylthiogruppe oder die Dinitrophenylthiogruppe in der 2-Stellung des Indolkerns der Tryptophanylgruppe dieser Sequenz.

In der Tat besitzt das oben definierte Polypeptid-amid-derivat als Folge der Anwesenheit dieser modifizerten Aminosäuresequenz die Fähigkeit, die biologischen Rezeptoren des Gastrins und der damit verwandten Polypeptide zu erkennen und sich an diese zu binden, ohne daß gleichzeitig biochemische Reaktionen ausgelöst werden.

Obwohl die Gruppe R₁ der obigen allgemeinen Formel keine Einschränkung auf die Wirkung des Polypeptid-amid-derivats ausübt, versteht es sich, daß diese Gruppe die Fähigkeiten der L-Triptophanyl-L-methionyl-L-aspartyl-L-phenylalanyl-amid-gruppe, die biologischen Rezeptoren des Gastrins und der damit verwandten Polypeptide zu erkennen und sich daran zu binden nicht beeinträchtigen darf.

Erfindungsgemäß handelt es sich bei der Gruppe R₁ vorzugsweise um eine Gruppe, die von einer Aminosäuren oder einem Aminosäurederivat abgeleitet ist, wie die β-Alanylgruppe, die Glycylgruppe, die Pyroglutamylgruppe, die N-Benzoyl-glycylgruppe, die N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-glycylgruppe, die N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-alanylgruppe, die Lysylgruppe oder die N-Benzyloxycarbonyl-L-prolylgruppe oder um eine von einem Peptid oder einem Peptidderivat abgeleitete Gruppe, beispielsweise die L-pyroglutamyl-L-glycyl-L-prolyl-L-tryptophanyl*-L-leucyl-L-glutamyl--L-glutamyl-L-glutamyl-L-glutamyl-L-glutamyl-L-alanyl-L-tyrosyl-L-glycyl-gruppe, die im folgenden abgekürzt als R_GI bezeichnet wird,
die L-Pyroglutamyl-L-glycyl-L-prolyl-L-tryptophanyl*-L-leucyl- L-glutamyl-L-glutamyl-L-glutamyl-L-glutamyl-L-glutamyl-L-alanyl- L-tyrosyl (mit einer Oxysulfongruppe (oxysulfonique) in der 4-Stellung des Phenylkerns)-gruppe, die im folgenden als Gruppe R_GII bezeichnet wird.
die L-Pyroglutamyl-L-glutamyl-L-aspartyl-L-tyrosyl-L-threonyl- L-glycyl-gruppe, die im folgenden als Gruppe R_C bezeichnet wird,
die N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-arpartyl-L-tyrosyl-L-methionyl- L-glycyl-gruppe, die im folgenden als Gruppe R_CCK bezeichnet wird,
die L-Pyroglutamyl-L-leucyl-L-glycyl-L-prolyl-L-glutaminyl- L-glycyl-L-histidyl-L-prolyl-L-seryl-L-leucyl-L-valyl-L-alanyl- L-aspartyl-L-prolyl-L-seryl-L-lysyl-L-lysyl-L-glutaminyl-L- glycyl-L-prolyl-L-tryptophanyl*-leucyl-L-glutamyl-L-glutamyl- L-glutamyl-L-glutamyl-L-glutamyl-L-glutamyl-L-alanyl-L-tyrosyl- L-glycyl-gruppe, die im folgenden als Gruppe R_BGI bezeichnet wird,
die L-Leucyl-L-glutamyl-L-glutamyl-L-glutamyl-L-glutamyl-L-glutamyl- L-alanyl-L-tyrosyl-L-glycyl-gruppe, die im folgenden als Gruppe R_MGI bezeichnet wird,
die L-Leucyl-L-glutamyl-L-glutamyl-L-glutamyl-L-glutamyl-L- glutamyl-L-alanyl-L-tyrosyl (mit einer Oxysulfongruppe in der 4-Stellung des Phenylkerns)-glycyl-gruppe, die im folgenden als Gruppe R_MGII bezeichnet wird.

Bei den oben angegebenen Gruppen R₁ bedeutet das im Anschluß an eine L-Tryptophanylgruppe angegebene Sternchen (*), daß die entsprechende Tryptophanylgruppe gegebenenfalls in der 2-Stellung ihres Indol-rings durch eine 2-Nitrophenylthiogruppe substituiert ist.

Die Gruppe R₁ kann ferner ein Wasserstoffatom oder eine Alkylcarbonylgruppe, eine Arylcarbonylgruppe, eine Aralkylcarbonylgruppe, eine Alkoxycarbonylgruppe, eine Aryloxycarbonylgruppe oder eine Aralkoxycarbonylgruppe sein.

Beispiele für erfindungsgemäß geeignete Polypeptid-amid-derivate sind die folgenden Derivate:
o-nitrophenylsulfenyliertes Gastrin I, das im folgenden als Gastrin I-NPS bezeichnet wird, und das der obigen allgemeinen Formel entspricht, in der R₁ für die Gruppe R_GI und R₂ für die 2-Nitrophenylgruppe stehen,
o-nitrophenylsulfenyliertes Gastrin II, das im folgenden als Gastrin II-NPS bzeichnet wird und der obigen allgemeinen Formel entspricht, in der R₁ für die Gruppe R_GII und R₂ für die 2-Nitrophenylgruppe stehen,
o-nitrophenylsulfenyliertes BIG-Gastrin, das der obigen allgemeinen Formel entspricht, in der R₁ für die Gruppe R_BGI und R₂ für die 2-Nitrophenylgruppe stehen,
o-nitrophenylsulfenyliertes Mini-gastrin I oder II, das der obigen allgemeinen Formel entspricht, in der R₁ für die Gruppe R_MGI oder R_MGII und R₂ für die 2-Nitrophenylgruppe stehen, o-nitrophenylsulfenyliertes Caerulein, das der obigen allgemeinen Formel entspricht, in der R₁ für die Gruppe R_C und R₂ für die 2-Nitrophenylgruppe stehen,
o-nitrophenylsulfenyliertes Cholecystokinin, das der obigen allgemeinen Formel entspricht, in der R₁ für die Gruppe R_CCK und R₂ für die 2-Nitrophenylgruppe stehen und
o-nitrophenylsulfenyliertes Pentagastrin, das im folgenden als Pentagastrin NPS bezeichnet wird und das der obigen allgemeinen Formel entspricht, in der R₁ für die N-tert.-Butyloxycarbonylglycylgruppe und R₂ für die 2-Nitrophenylgruppe stehen.

Diese Polypeptid-amid-derivate können ohne weiteres aus den entsprechenden Polypeptid-amiden der folgend allgemeinen Formel in der R₁ die oben angegebenen Bedeutungen besitzt, hergestellt werden, indem man dieses Polypeptid-amid mit einem Chlorid der allgemeinen Formel R₂SCl umsetzt, in der R₂ die oben angegebenen Bedeutungen besitzt. Beispielsweise kann man diese Derivate dadurch herstellen, daß man eine äquimolare Mischung aus diesem Polypeptid-amid und 2-Nitrophenylsulfenylchlorid oder 2,4-Dinitrophenylsulfenylchlorid der folgenden Formeln oder bei Raumtemperatur in Eisessig und unter Lichtabschluß umsetzt.

Während der Reaktion bewegt man die Mischung und überwacht ihren Ablauf durch Messen der optischen Dichte der Mischung bei 280 oder 365 nm. Die Stabilisierung der optischen Dichte bzw. die Tatsache, daß sie sich nicht mehr ändert, weist darauf hin, daß die Reaktion beendet ist.

Beispielsweise wurden nach diesem Verfahren die folgenden Polypeptid-amid-derivate hergestellt: o-nitrophenylsulfenyliertes Gastrin I, o-nitrophenylsulfenyliertes Caerulein, o-nitrophenyliertes Cholecyctokinin und o-nitrosphenylsulfenyliertes Pentagastrin.

Diese Derivate werden nach Ablauf der Reaktion durch ihre charakteristischen Spektraleigenschaften indentifiziert, die sich erheblich von denen der Ausgangsmaterialien unterscheiden. Insbesondere zeigen die an ihrer Tryptophanylgruppe o-nitrophenylsulfenylierten Polypeptid-amid-derivate im sichbaren Bereich des Lichts ein Maximum mit einem Zentrum zwischen 362 und 365 nm (bei einem molaren Extinktionswert ε von 3750 bis 4450) und ein Minimum bei 317 nm und besitzen im ultravioletten Bereich des Lichts eine einzige sehr intensive Bande bei 280 bis 281 nm (mit einem molaren Extinktionswert e von 16 000 bis 17 000) und ein Minimum bei etwa 257 nm.

Weiterhin beweist die dünnschichtchromatographische Analyse der erhaltenen Produkte in mehreren Lösungsmittelsystemen, daß die nach Ablauf der Reaktion erhaltene Mischung nur einen einzigen Bestandteil enthält.

In der folgenden Tabelle I sind die charakteristischen R_F-Werte der erhaltenen Produkte angegeben, die dünnschichtchromatographisch unter Verwendung von Kieselgel als Adsorptionsmittel und verschiedenen Lösungsmittelsystemen (Spalten I bis IX) oder unter Verwendung von Zellulose als Adsorptionsmittel und einem Lösungsmittelsystem, das aus 75 Teilen n-Butanol, 10 Teilen Essigsäure und 25 Teilen Wasser besteht (Spalte X) ermittelt wurden.

In der folgenden Tabelle sind ferner die charakteristischen R_F-Werte der als Ausgangsmaterialien eingesetztes Polypeptidamide und von o-Nitrophenylsulfenylchlorid (das als NPS-Cl bezeichnet wird) angegeben.

Weiterhin zeigt eine zusätzliche Untersuchung des ausgehend von Gastrin I erhaltenen Produkts, daß die Reaktion zwischen Gastrin I und o-Nitrophenylsulfenylchlorid im wesentlichen zu dem Derivat führt, das an der Tryptophanylgruppe o-nitorphenylsulfenyliert ist, die in der Sequenz der vier Aminosäuren vorhanden ist, die für die biologische Wirkung des Gastrins verantwortlich ist.

Gastrin I ist ein Heptadekapeptid, das 17 Aminosäurereste aufweist. Seine chemische Struktur kann durch die folgende Formel wiedergegeben werden, in der die üblicherweise angewandten Abkürzungen zur Bezeichnung der Aminosäurereste verwendet wird:

Es ist festzustellen, daß diese Formel zwei Tryptophanylgruppen (Trp) aufweist, die in der 4-Stellung N-ständig (N-terminal) und in der 14-Stellung C-ständig (C-terminal) auftreten.

Um festzustellen, ob die Reaktion überwiegend an der Tryptophanylgruppe in der 14-Stellung erfolgt ist, führt man diese Reaktion ausgehend von Gastrin I, das an dem Tyrosinylrest mit Tritium aktiviert ist und im folgenden als (³H)Tyr bezeichnet wird und o-Nitrophenylsulfenylchlorid in einem Molverhältnis von 1 : 1 durch.

Das nach Ablauf der Reaktion erhaltene Produkt wird anschließend enzymatisch mit Protease hydrolysiert, die aus Staphylococus aureaus (staphylocoque dor´) extrahiert worden ist. Diese vollständige Hydrolyse des Gastrins mit der Protease stellt eine Spaltung des Polypeptid-amid-derivats zwischen der Glutamyl-gruppe in der 10-Stellung und der Alanyl-gruppe in der 11-Stellung sicher. Man erhält in dieser Weise vier gegebenenfalls sulfenylierte Polypeptide, die man über ihre Absorption im ultravioletten und sichtbaren Bereich des Lichts und durch Dünnschichtchromatographie, wozu man Kieselgel als Adsorptionsmittel und verschiedene Lösungsmittelsysteme verwendet, identifiziert. Die erhaltenen Polypeptide sind

PCA-Gly-Pro-Trp-Leu-Glu
PCA-Gly-Pro-Trp (NPS)-Leu-Glu
Ala-Tyr(³H)-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH₂
Ala-Tyr(³H)-Gly-Trp (NPS)-Met-Asp-Phe-NH₂.

Die charakteristischen R_F-Werte dieser Polypeptide sind in der folgenden Tabelle II zusammengestellt.

Tabelle II

Weiterhin bestimmt man die Radioaktivität jedes der erhaltenen Produkte. Die Ergebnisse dieser Messungen sind ebenfalls in der Tabelle II angegeben und zeigen, daß 15% der Radioaktivität in dem Peptid der Formel

Ala-(³H)Tyr-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH₂
und 85% der Radioaktivität in dem Peptid

Ala-(³H)Tyr-Gly-Trp(NPS)-Met-Asp-Phe-NH₂

vorliegen.

In dieser Weise zeigt sich, daß das Herstellungsverfahren im wesentlichen zu dem Derivat führt, das an der Tryptophenylgruppe o-nitrophenylsulfenyliert ist, die in der 14-Stellung C-ständig steht.

Die erfindungsgemäßen Arzneimittel besitzen eine bemerkenswerte Stabilität. In der Tat können die erhaltenen Polypeptidamid-derivate, die gegebenenfalls chromatographisch gereinigt und in Mengen von 5 bis 10 µg des Produkts pro 10 µl Eisessig in Gefrierröhrchen verteilt sind, während mehrerer Monate in flüssigem Stickstoff (bei -196°C) gelagert werden, ohne daß sie sich verändern. Ihre Spektraleigenschaften im ultravioletten und im sichtbaren Bereich des Lichts bleiben unverändert und ihre dünnschichtchromatographisch bestimmten R_F-Werte bleiben identisch mit den anfänglich erhaltenen Werten.

Die erfindungsgemäßen Arzneimittel sind in der Therapie zur Behandlung von pathologischen Zuständen, wie dem Zollinger-Ellison-Syndrom, dem Magen-Zwölffingerdarm-Geschwür in seinen typischen und atypischen Formen, der durch Eingeweideresektionen verursachten Magenhypersekretion und Blutungen des Verdauungstrakts kapillaren Ursprungs, geeignet.

Weiterhin kann die Wirkung des erfindungsgemäßen Arzneimittels sich auch erstrecken auf den Transport oder die Sekretion von Wasser und Elektrolyten in folgenden Organen: Bauchspeicheldrüse, Leber, Dünndarm und Brunner-Drüsen,
die enzymatische Sekretion (Magen, Bauchspeicheldrüse, Dünndarm,
die Absorption von Glucose, von Elektrolyten und Wasser im Bereich des Dünndarms,
die glatte Muskulatur, beispielsweise bei durch Gastrin stimulierten Organen, wie dem unteren Schließmuskel der Speiseröhre, dem Magen, dem Dünndarm, dem Dickdarm und der Blase, oder von Organen, die durch Gastrin inhibiert werden, wie dem Pylorusschließmuskel, dem Dünndarm-Blinddarm-Schließmuskel und dem Oddi-Schließmuskel,
auf Hormone, die durch Gastrin freigesetzt werden, wie Insulin und Calcitonin,
auf die Blutzirkulation von Verdauungsorganen, wie dem Magen, dem Dünndarm und der Bauchspeicheldrüse, und
auf die trophische Wirkung des Gastrins gegenüber gewissen Schleimhäuten oder Organen, wie der Magenschleimhaut, der Dünndarmschleimhaut und der Bauchspeicheldrüse.

Die erfindungsgemäßen Arzneimittel können in Form von injizierbaren Lösungen auf intravenösem Wege in einer Dosis verabreicht werden, die im allgemeinen zwischen 5 und 20 µg pro Kilogramm liegt.

Im folgenden seien Untersuchungen erläutert, die dazu dienen, die pharmakologischen Eigenschaften der erfindungsgemäßen Arzneimittel als Antagonisten der Wirkung von Gastrin und von verwandten Polypeptiden im Bereich von Targetorganen zu verdeutlichen.

Bei der Beschreibung dieser Untersuchungen wird auf die Zeichnung Bezug genommen. In den Zeichnungen zeigt:

Fig. 1 eine Scatchard-Darstellung der Bindung zwischen Tritiumgastrin I und seinen biologischen Rezeptoren.

Fig. 2 eine graphische Darstellung, die den Gehalt des an die biologischen Rezeptoren gebundenen Tritium-gastrins I in Abhängigkeit von der Zeit wiedergibt.

Fig. 3 eine graphische Darstellung, die die Menge des an den biologischen Rezeptoren gebundenen Tritium-gastrins I in Abhängigkeit von dem Anfangsgehalt an Tritium-gastrin I in einer Mischung aus Tritium-gastrin I und Gastrin I-NPS wiedergibt.

Fig. 4 eine doppelt reziproke Darstellung der abgeschiedenen Magensäuremenge in Abhängigkeit von der injizierten Dosis des Gastrins in mg,

Fig. 5a die Abhängigkeit zwischen der Magensäuresekretion in Abhängigkeit von der Zeit und den injizierten Produkten (Gastrin I und Gastrin I-NPS) und

Fig. 5b die Abhängigkeit der Magensäuresekretion von der Zeit bei der Injektion von lediglich Gastrin I.

Die erste Untersuchung dient dem Nachweis der kompetitiven Wirkung zwischen Humangastrin und dem erfindungsgemäßen Arzneimittel bei der Besetzung der biologischen Rezeptorenstellen des Gastrins für die Untersuchung der Bindung zwischen dem Gastrin und den Plasmamembranen des Ratten-Fundus.

In einer ersten Stufe präpariert man Plasmamembranen von weißen männlichen Ratten des Stammes Wistar CF mit einem Gewicht von 250 + 50 g, die zuvor während eines Monats in der Zuchtanstalt unter Verwendung eines Standardfutters aus sterilisierten Biskuits (biscuits autoclav´s 113 UAR) stabilisiert worden sind. Die Ratte, die vor dem Töten nicht nüchtern gehalten wird, wird zwischen 9 und 10 Uhr am Morgen durch einen Schlag auf den Nacken betäubt, worauf die Bauchwand eröffnet wird. Der Magen wird entnommen, längs der großen Krümmung geöffnet und einem Medium, das 0,25 Mol pro Liter Saccharose und 30 mMol pro Liter eines Trihydroxymethylaminomethan/Chlorwasserstoffsäure-Puffers - mit einem pH-Wert von 7,4 enthält, bei einer Temperatur von 0 bis 4°C gewaschen. Die Gesamtheit der Magenschleimhaut (von der Cardia bis zum Antrum-Verbindung) wird in einer Kühlkammer mit einer Glasklinge abgekratzt und in ein Medium eingebracht, das 0,25 Mol pro Liter Saccharose und 3 mMol pro Liter des Trihydroxymethylaminomethan/Chlorwasserstoffsäure-Puffers mit einem pH-Wert von 7,4 enthält und eine Temperatur von 0 bis 4°C aufweist, wobei das Medium in einer Menge von etwa 10 ml pro Gramm des Gewebes verwendet wird. Das Gewebe wird mit Hilfe von Messern zerkleinert und in einer Drehhomogenisiereinrichtung (Potter-Elvejhem Nr. C), die bei 2000 min^-1 betrieben wird, homogenisiert, wobei der Kolben viermal auf und niederbewegt wird.

Das erhaltene zerkleinerte oder homogenisierte Gewebe wird in einer Kühlzentrifuge (Internationale PR2 (mit dem Rotor Nr. 269)) während 6 Minuten bei einer Temperatur von 4°C und einer Geschwindigkeit von 1000 min^-1, d. h. mit einer Zentrifugalkraft von 1200 g × min. zentrifugiert. Der Zentrifugenrückstand wird zweimal bei einer Temperatur von 0 bis 4°C mit einem Medium gespült, das 0,25 Mol pro Liter Saccharose und 3 mMol pro Liter Trihydroxymethylaminomethan/Chlorwasserstoffsäure-Puffer mit einem pH-Wert von 7,4 enthält. Die überstehenden Flüssigkeiten werden vereinigt und in einer gekühlten Ultrazentrifuge (Spinco L Beckman mit dem Rotor 50 Ti) während 3 Minuten bei 4°C mit einer Geschwindigkeit von 12 500 min^-1 (28 800 g × min) zentrifugiert. Der Zentrifugenrückstand wird zweimal bei einer Temperatur von 0 bis 4°C mit einem Medium gewaschen, das 0,25 Mol pro Liter Saccharose und 3 mMol pro Liter des Trihydroxymethylaminomethan/Chlorwasserstoffsäure-Puffers mit einem pH-Wert von 7,4 enthält. Die überstehenden Flüssigkeiten werden vereinigt und in einer Ultrazentrifuge (Spinco L Beckman mit dem Rotor 50 Ti) während 30 Minuten bei 39 000 min^-1 (2 770 000 g× min) zentrifugiert. Der erhaltene Zentrifugenrückstand umfaßt die gesamten Mikrosomen.

Die abzentrifugierten Mikrosomen werden mit 50 ml eines Mediums, das 0,25 Mol pro Liter Saccharose und 3 mMol pro Liter des Trihydroxymethylaminomethan/Chlorwasserstoffsäure-Puffers mit einem pH-Wert von 7,4 enthält und eine Temperatur von 0 bis 4°C aufweist, verdünnt und dann in einer gekühlten Ultrazentrifuge (Spinco 50 L Beckman mit dem Rotor Ti 14) zonenmäßig in einem geradlinigen Saccharosegradienten von 7% (1,04 g/cm³) bis 60% (1,30 g/cm³) bis zum isopyknischen Gleichgewicht zentrifugiert, d. h. 15 Stunden bei 20 000 min^-1 und 4°C. Nach dem Äquilibrieren wird der Gradient in 25-ml-Fraktionen zugeführt, wobei die Dichten refraktometrisch bestimmt werden. Die Fraktion, deren Dichte zwischen 1,12 und 1,14 g/cm³ liegt, stellt die Fraktion dar, die den Plasmamembranen entspricht. Sie macht etwa 15 bis 20% des Mikrosomenzentrifugenrückstands aus und wird am gleichen Tage ihrer Herstellung verwendet.

Im Verlaufe der Herstellung der Plasmamembranen führt man mehrere Bestimmungen des nach dem Zerkleinern des Gewebes und dem Homogenisieren in der Potter-Homogenisiervorrichtung erhaltenen Homogenisats bezüglich der Gesamtmikrosomen und der Endfraktion der Plasmamembranen durch. Diese Bestimmungen sind die folgenden:
Proteinbestimmung nach der Methode von Lowry (O. M. Lowry, N. J. Rosenbrorgh, A. L. Farr, J. R. Randall, J. Biol. Chem. (1951) 193 bis 265), wozu als Vergleichsstandard Rinderserumalbumin verwendet wird;
Ribonucleinsäurebestimmung nach der Methode von Schneider (W. C. Schneider "Method in Enzymology", herausgegeben von Collowick und Kaplan, Academic Press, New York (1957) 680). Das Material (das 5 mg Membranprotein entspricht) wird mit kalter Trichloressigsäure (mit einer Endkonzentration von 7%) gefällt und dann bei 1000 g × min zentrifugiert, dreimal mit 5 ml 10%iger Trichloressigsäure und dann dreimal mit 5 ml 95%igem Äthanol gewaschen. Der Zentrifugenrückstand wird während 30 Minuten bei einer Temperatur von 90°C in 2,5 ml 5%iger Trichloressigsäure hydrolysiert. Das Hydrolysat wird bei 1000 g × min zentrifugiert, worauf die überstehende Flüssigkeit mit Orcin gefärbt und die Absorption bei 660 nm gemessen werden;
Phosphatasebestimmung nach der Methode von Fiske et Subbarow (C. H. Fiske und Y. Subbarow, J. Biol. Chem. 56 (1925) 375). Man titriert 5′-Adenosin-monophosphatase mit Hilfe der folgenden Reagentien: 2 mMol pro Liter 5′-Adenosin-monophosphat, 100 mMol pro Liter Trihydroxymethylaminomethan/Chlorwasserstoffsäure-Puffer mit einem pH-Wert von 7,5 und 0,6 mMol pro Liter Manganchlorid, wobei man die Untersuchung während 50 Minuten bei 37°C durchführt. Die Adenosin-triphosphatase wird mit Hilfe der folgenden Reagentien bestimmt: Natriumadenosin-triphosphat (2 mMol pro Liter), Imidazol/Chlorwasserstoffsäure-Puffer mit einem pH-Wert von 8 (100 mMol pro Liter) und Magnesiumchlorid (2 mMol pro Liter). Die Untersuchung erfolgt während 10 Minuten bei 37°C;
Bestimmung der Monoaminoxidase nach der Methode von H. Weissbach, T. E. Smith, J. W. Daly, B. Witkop und S. Undenfriend (J. Biol. Chem. 235 (1960) 1160), wozu die folgenden Reagentien verwendet werden: Kynuramin (100 mMol pro Liter), Kaliumphosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,4 (50 mMol pro Liter). Die Absorption wird dann bei 360 nm gemessen; und
Bestimmung von Cytochrom c-Oxidase nach der Methode von S. J. Cooperstein und A. Lazarow (J. Biol. Chem. 189 (1951) 665), wozu die folgenden Reagentien verwendet werden: reduziertes Cytochrom c (40 µMol pro Liter), Kaliumphosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,4 (30 mMol pro Liter) und Äthylendiamintetraacetat (1 mMol pro Liter), wobei die Bestimmung bei 25°C durchgeführt wird.

Die Kinetik der Oxidation wird nach der Zugabe der mit einer 1 mMol pro Liter Äthylendiamintetraacetat, 1 mMol pro Liter Natriumcarbonat und 0,01% Triton X100 enthaltenden Lösung verdünnten Membranen bei 550 nm verfolgt. Die Ergebnisse dieser Bestimmungen sind in der folgenden Tabelle III zusammengestellt.

Tabelle III

Die in der obigen Tabelle angegebenen Zahlenwerte stehen für die spezifischen Aktivitäten der folgenden Enzyme: 5′-Adenosinmonophosphatase (5′-AMPase), Adenosin-triphosphatase (ATPase), Monoaminoxidase (MAO) und Cytochrom c-Oxidase sowie den Ribonucleinsäuregehalt.

Anhand dieser Ergebnisse ist festzustellen, daß die letztendlich erhaltene Fraktion sehr gut den Plasmamembranen entspricht. In der Tat ist diese Fraktion in bezug auf das Homogenisat an folgenden Enzymen stark angereichert: 5′-Adenosin-monophosphatase und Adenosin-triphosphatase. Andererseits ist diese Fraktion an Cytochrom c-Oxidase, an Monoaminoxidase und an Ribonucleinsäure verarmt, d. h. an Produkten, die von Mytochondrienmembranen oder Mikrosomen, die Ribosomen tragen, abgeleitet sind.

Die Untersuchung der letztendlich erhaltenen Fraktion mit dem Elektronenmikroskop bestätigt weiterhin die Tatsache, daß diese Fraktion an Plasmamembranen angereichert ist.

Die angewandte Methode ist die folgende: Man bindet die Membranen während 30 Minuten bei einer Temperatur von 0 bis 4°C unter Rühren an 4%igen Glutaraldehyd und zentrifugiert während 1 Stunde in einer Ultrazentrifuge (Spinco Beckmann mit dem Rotor 50 Ti) bei einer Geschwindigkeit von 39 000 min^-1. Der Zentrifugenrückstand wird zweimal mit einer 50 mMol pro Liter Kakodylatpufferlösung mit einem pH-Wert von 7,4 gewaschen, mit Alkohol entwässert und dann in eine Epoxidharzmischung (Epon) eingebracht. Man beobachtet im Elektronenmikroskop Bläschen mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 0,2 µm und Fragmente von glatten Membranen, ohne daß Mitochondrien oder Mitochondrienfragmente oder ribosomentragende Mikrosomen festzustellen sind.

Weiterhin bestimmt man die Adenylat-cyclaseaktivität der Membranen nach der Methode von Rosselin und Freychet (G. Rosselin und P. Freychet, BBA 304 (1973) 541 bis 551) mit Hilfe der folgenden Reagentien: Adenosin-triphosphat (0,8 mMol pro Liter), Creatinphosphat (20 mMol pro Liter), Creatinphosphokinase (0,5 mg/ml), Magnesiumchlorid (5 mMol pro Liter), Theophyllin (10 mMol/pro Liter), Äthylendiamintetraacetat (1 mMol pro Liter) und Trihydroxyäthylaminomethyl/Chlorwasserstoffsäure-Puffer mit einem pH-Wert von 7,4 (20 mMol pro Liter), wobei man in Gegenwart der folgenden Verbindungen arbeitet: Tritiumgastrin I, Gastrin I oder Gastrin I-NPS in einer Menge von 10^-8 Mol pro Untersuchungsprobe und 100 bis 200 µg Membranproteine. Die Reaktion erfolgt während 10 Minuten bei einer Temperatur von 25°C. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle IV zusammengestellt.

Tabelle IV

Zu Vergleichszwecken sind in der obigen Tabelle auch die Ergebnisse angegeben, die man bei einer entsprechenden Bestimmung von Fraktionen erhält, die einerseits dem Gewebehomogensiat und andererseits den Gesamtmikrosmen entsprechen. Aus den Ergebnissen ist zu ersehen, daß die Stimulierung der Adenylat-cyclase-aktivität durch gegebenenfalls mit Tritium radioaktiv markiertem Gastrin I in der Plasmamembranfraktion wesentlich größer ist als in dem Homogenisat oder den Gesamtmikrosomen.

Es ist andererseits zu beobachten, daß wenn man diese Bestimmung in Gegenwart von Gastrin I-NPS durchführt man keinerlei Stimulierung der Adenylat-cyclase-aktivität feststellt. Hierdurch wird bestätigt, daß die spezifischen Rezeptoren des Gastrins in den erhaltenen Plasmamembranen vorhanden sind und daß die Enzyme dieser Rezeptoren durch das erfindungsgemäße Arzneimittel, d. h. Gastrin I-NPS nicht aktiviert werden.

Anschließend bestimmt man die Mengen des Tritium-gastrins I, die von den Plasmamembranen gebunden werden können, indem man entweder Tritium-gastrin I oder eine Mischung aus Tritiumgastrin I und nicht mit Tritium radioaktiv markierten Gastrin I oder schließlich eine Mischung aus Tritium-gastrin I und Gastrin I-NPS verwendet.

In allen Fällen geht man wie folgt vor:

Zu 1,2 ml Plasmamembran, die 0,4 bis 1 mg Proteine pro ml enthalten, gibt man 1,5 bis 20 µl Tritium-gastrin I (10^-6 Mol/l) und gegebenenfalls entweder 15 bis 150 µl Gastrin I (10^-6 Mol/l) oder 15 bis 150 µl Gastrin I-NPS (10^-6 Mol/l), worauf man die Mischung mit einer Trihydroxyäthylaminomethan/Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7,4 (200 mMol/l) bis zu einem Gesamtvolumen von 1,5 ml versetzt. Man hält diese Mischung, die das Inkubationsmedium darstellt, bei einer Temperatur von 20 ± 2°C und entnimmt während der ersten halben Stunde alle Minute Proben von jeweils 50 µl. Diese Proben werden sofort mit 500 µl einer bei 0 bis 4°C gehaltenen Stopplösung verdünnt, bei der es sich um eine Trihydroxyäthylaminomethan/Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7,4 (20 mMol/l) handelt. Anschließend filtriert man die verdünnte Probe im Vakuum bis zur vollständigen Trockenheit des Filters und überführt den Filter in ein Fläschchen zur Flüssigkeitsszintillationsmessung, das 15 ml einer Szintillatormischung (PCS) enthält. Vor der Einführung in den Szintillationszähler wird dieses Fläschchen bei Raumtemperatur bewegt, bis sich die Proteine gelöst haben, was sich in einem durchscheinenden Aussehen der Membran manifestiert.

Zuvor bestimmt man die gesamte spezifische Radioaktivität des Inkubationsmediums, indem man 10 µl dieses Mediums entnimmt und direkt ohne Filtration in das Zählfläschchen überführt.

Andererseits bestimmt man die Absorption des Filter/Plasmamembran-Systems, indem man unter den gleichen Bedingungen in Abwesenheit von Plasmamembran eine Inkubation durchführt und die letzteren nach dem Verdünnen der Probe mit 500 µl der Stopplösung zugibt. Die in dieser Weise durchgeführten Radioaktivitätsmessungen ermöglichen die Bestimmung der Menge des Tritium-gastrins, die an den Plasmamembranen gebunden ist und der Menge des freien Tritium-gastrins in den Inkubationsmedium.

Bei einer ersten Untersuchung enthält das Inkubationsmedium nur Tritium-gastrin I. Die Bestimmung der Radioaktivität an nacheinander alle Minute entnommenen Proben zeigen, daß sich das Tritium-gastrin I in Form einer Sättigungskurve mit einer Assoziationskonstante k₁ von 4 × 10^-7 Mol^-1 × min^-1 an den Plasmamembranen bindet.

Es ist festzustellen, daß diese Fixierung oder Bindung reversibel ist, wenn man das Inkubationsmedium nach 15 Minuten um den Faktor 10 verdünnt. Nach diesem Verdünnen entnimmt man aufeinanderfolgende Proben mit einem Volumen von jeweils 500 µl, die ohne zuvor mit der Stopplösung verdünnt zu werden, sofort filtriert werden. Es ist festzustellen, daß die an die Plasmamembran gebundene Radioaktivität mit der Zeit abnimmt, was darauf hinweist, daß die Bindung von Tritium-gastrin I an den Plasmamembranen reversibel ist mit einer Dissoziationskonstante K ^-1 von 0,35 min^-1.

Die Scatchard-Darstellung der Bindung ist in der Fig. 1 dargestellt und zeigt eine gerade Linie. Die maximale Bindungskapazität und die Gleichgewichtskonstante betragen N = 42 × 10^-14 Mol/mg der Membranproteine bzw. K = 1,7 × 10⁸ Mol^-1.

Bei einer zweiten Untersuchung enthält das Inkubationsmedium Tritium-gastrin I und nicht mit Tritium radioaktiv markiertes Gastrin I. Die an aufeinanderfolgenden Proben durchgeführte Bestimmung der Radioaktivität zeigt, daß bei einem gleichen Anfangsgehalt von Tritium-gastrin I die Menge des an die Plasmamembranen gebundenen Tritium-gastrins I weniger groß ist, wenn das Inkubationsmedium auch nicht mit Tritium radioaktiv markiertes Gastrin I enthält. Es ist somit festzustellen, daß das Gastrin I bei der Belegung der Rezeptoren mit Tritiumgastrin I in Wettstreit tritt.

In der folgenden Tabelle V sind die Mengen, in denen Tritiumgastrin I im Gleichgewicht an Plasmamembranen gebunden wird, wenn das Inkubationsmedium 0,7 mg Plasmamembranen pro ml und entweder lediglich Tritium-gastrin I oder Tritium-gastrin I und nicht mit Tritium radioaktiv markiertes Gastrin I enthält.

Tabelle V

Bei einer dritten Untersuchung enthält das Inkubationsemdium Tritium-gastrin I und Gastrin I-NPS. Die Konzentration des Tritium-gastrins I beträgt 10^-8 Mol pro Liter, während die Konzentration des Gastrins I-NPS 2 × 10^-8 Mol pro Liter beträgt. Die Bestimmung der Radioaktivität von alle Minute nacheinander entnommenen Proben zeigt, daß die an die Plasmamembranen gebundene Menge des Tritium-gastrins I in Gegenwart von Gastrin I-NPS geringer ist.

In der Fig. 2 sind die Ergebnisse bezüglich der Werte der an die Plasmamembranen gebundenen Radioaktivität in Abhängigkeit von der Zeit dargestellt, und zwar für den Fall, daß das Medium entweder nur Tritium-gastrin I (Kurve 1) oder Tritiumgastrin I und Gastrin I-NPS (Kurve 2) enthält. Es ist zu bemerken, daß bei der Kurve 2 das Gleichgewichtsplateau einen wesentlich geringeren Wert besitzt als das in der Kurve 1, wobei dieser Wert um etwa 70% geringer ist als der der Kurve 1. Es ist somit festzustellen, daß die in Gegenwart von Gastrin I-NPS gebundene Menge des Gastrins I proportional ist dem Gehalt an Gastrin I in der Mischung aus Gastrin I und Gastrin I-NPS.

Bei einer vierten Untersuchung wird die in Gleichgewichtszustand gebundene Radioaktivitätsmenge bei Tritium-gastrin I-Konzentrationen von 2 × 10^-9 Mol pro Liter bis 2 × 10^-8 Mol pro Liter entweder in Abwesenheit von Gastrin I-NPS oder in Gegenwart von Gastrin I-NPS in einer Konzentration von 2 × 10^-8 oder 10^-8 Mol pro Liter bestimmt.

Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Fig. 3 dargestellt, in der die Kurven der im Gleichgewichtszustand gebundenen Radioaktivität in Abhängigkeit von der Konzentration des Tritium-gastrins I aufgetragen sind. Die Kurve 1 wurde lediglich mit Gastrin I erzielt, während die Kurve 2 für die Bestimmung von Gastrin I in Gegenwart von Gastrin I-NPS in einer Konzentration von 10^-8 Mol pro Liter und die Kurve 3 für die Bestimmung von Gastrin I in Gegenwart von Gastrin I-NPS in einer Konzentration von 2 × 10^-8 Mol pro Liter stehen.

Der Vergleich dieser Kurven zeigt wiederum, daß die Verminderung der im Gleichgewichtszustand gebundenen Radioaktivität proportional ist der Verminderung der Konzentration an Gastrin I in der Mischung aus Gastrin I und Gastrin I-NPS.

Die zweite Untersuchung umfaßt zwei Untersuchungsreihen, die dazu dienen, zu zeigen, daß die erfindungsgemäßen Arzneimittel eine inhibierende Wirkung auf die Stimulation der Magensaftsekretion ausüben.

Eine erste Untersuchungsreihe erfolgt an männlichen Ratten des Typs Wistar mit einem Gewicht von 300 bis 325 g. Die angewandte Technik ist die von Ghosh und Schild, die von Lai überarbeitet wurde. Man hält die Ratten während 18 Stunden vor der Untersuchung nüchtern. Am Untersuchungstag betäubt man die Ratten durch intraperitoneale Verabreichung von 1,2 g Urethan pro kg Körpergewicht. Die Rektaltemperatur wird mit Hilfe einer Analsonde, die mit einem Thermometer verbunden ist, das auf elektronischem Wege die Beleuchtung mit Hilfe einer 100 W-Lampe regelt, die oberhalb jeder Ratte angeordnet ist, bei 34 ± 1°C gehalten. Dann wird eine Speiseröhrensonde (Polyäthylenkatheter) bis zur Verbindungsstelle der Speiseröhre mit dem Magen (Panzen) der Ratte geschoben, während ein weiterer Katheter über den Zwölffingerdarm in die Pylorusöffnung eingeführt wird. Man perfundiert den Magen mit einer physiologischen Serumlösung, die über die Speiseröhrensonde mit einer konstanten Geschwindigkeit von 1 ml pro Minute eingeführt wird und nimmt alle 10 Minuten über die Pylorus-Zwölffingerdarm-Sonde Proben ab.

Die in dieser Weise vorbereiteten Ratten werden während einer Zeitdauer von mindestens 45 Minuten ruhiggelassen. Dann bestimmt man das alle 10 Minuten entnommene perfundierte Material mit Hilfe einer 0,01 n Natriumhydroxidlösung, d. h. bei einem pH-Wert von 8,45, was dem Umschlagpunkt von Phenolphthalein entspricht, oder bei einem pH-Wert von 7,5 mit Hilfe einer automatischen Titriervorrichtung, die bei einem konstanten pH-Wert arbeitet.

Nach der Bestimmung der Basalsekretion der Magensaftsäure an mindestens vier aufeinanderfolgenden Entnahme verabreicht man den Ratten auf intravenösem Wege über die Penisvene eine Dosis von Gastrin und bestimmt anschließend das Ansprechen auf diese Reizung bis die Sekretion während einer Periode von mindestens zweimal 10 Minuten wieder auf den Grundwert zurückgekehrt ist. Man wiederholt diese Injektionen in Intervallen von mindestens 90 Minuten bei unterschiedlichen Dosierungen von Gastrin I oder von Gastrin I in Kombination mit dem erfindungsgemäßen Arzneimittel, d. h. in diesem Fall Gastrin I-NPS. Das Ansprechen der Sekretion wird bei jeder Injektion aufgezeichnet. Die Dosierungen betragen bei Gastrin I 50, 100, 200, 400 bzw. 800 mg pro Ratte und für Gastrin I-NPS 50, 100 bzw. 200 mg pro Ratte in Kombination mit der entsprechenden Dosis Gastrin I. Die Tiere werden in Gruppen von 4 bis 6 Ratten aufgeteilt. Die Ergebnisse sind als Mikroäquivalente Chlorwasserstoffsäure pro 40 Minuten angegeben, die wie folgt errechnet werden: Entweder über die Anzahl der nach der Reizung abgeschiedenen Mikroäquivalente abzüglich der Anzahl der abgeschiedenen Mikroäquivalente während 40 Minuten vor der Injektion der Dosis des Wirkstoffs oder über den Säurewert, d. h. über den Mittelwert von zwei aufeinanderfolgenden Maximalreaktionen pro Dosis abzüglich des Mittelwertes der beiden Grundwerte oder Basalwerte vor der Injektion.

Über die Mittelwerte der Sekretion, die man für jede Dosis von Gastrin I und für jede Dosis von Gastrin I in Kombination mit einer Dosis von Gastrin I-NPS ermittelt hat, wird es möglich, Dosis-Reaktions-Kurven bezüglich der Magensektretion in Abhängigkeit von den injizierten Produkten zu erstellen. Die doppelt reziproke Transformation läßt in Analogie zu enzymatischen Reaktionen erkennen, ob die Inhibierung eine Folge einer kompetitiven Reaktion ist oder nicht.

In der Fig. 4 sind die erhaltenen Ergebnisse zusammengefaßt.

In dieser Kurve sind auf der Abszisse die reziproken Werte der Gastrindosis in ng und auf der Ordinate die reziproken Werte der Reaktion auf die Stimulierung aufgetragen, die in µ-äquivalenten Chlorwasserstoffsäure angegeben ist. Die Gerade 1 steht für die Reaktion, die man bei der Verabreichung von verschiedenen Dosierungen von lediglich Gastrin I erzielt. Die Gerade 2 verdeutlicht die Reaktionen, die man erzielt, wenn man verschiedene Dosierungen Gastrin I zusammen mit 100 ng Gastrin I-NPS verabreicht, während die Gerade 3 die Reaktion verdeutlicht, die man erzielt, wenn man zusammen mit jeder Dosis Gastrin I 200 ng Gastrin I-NPS verabreicht. Die drei Geraden laufen an dem gleichen Punkt zusammen, was darauf hinweist, daß die Inhibierung kompetitiv ist. Es ist andererseits festzuhalten, daß die erzielten Reaktionen um so geringer sind, je höher die Konzentration des Gastrins I-NPS ist.

In der folgenden Tabelle VI sind weiterhin die relativen Ergebnisse bezüglich des Prozentsatzes der Inhibierung angegeben, die man erzielt, wenn man eine Dosis von 50 ng Gastrin I-NPS zusammen mit 50, 100, 150 bzw. 200 ng Gastrin I verabreicht, d. h. in Dosierungen mit einem Verhältnis von 1/1, 1/2, 1/3 und 1/4.

Tabelle VI

Wenn man die gleiche Untersuchung mit Pentagastrin-NPS in Kombination mit Pentagastrin durchführt, so ist ebenfalls festzustellen, daß Pentagastrin-NPS die Wirkung von Pentagastrin inhibiert. In der folgenden Tabelle VII sind die Ergebnisse über den Prozentsatz der Inhibierung angegeben, die man erzielt, wenn man eine Dosis von 50 ng Pentagastrin-NPS zusammen mit 50, 100, 150 bzw. 200 ng Pentagastrin verabreicht, d. h. bei Dosierungsverhältnissen von 1/1, 1/2, 1/3 und 1/4 arbeitet.

Tabelle VII

Bei einer zweiten Untersuchungsreihe verabreicht man den in der oben angegebenen Weise vorbereiteten Ratten nach der von LAI modifizierten Technik von Ghosh und Schild über eine intravenöse Perfusion eine isotonische, 0,9%ige Natriumchloridlösung in einer Menge von 2,4 ml pro Stunde, wobei dieser Perfusion über die Penisvene erfolgt.

Die in dieser Weise vorbereiteten Ratten läßt man während mindestens 45 Minuten ruhen, worauf man in der oben beschriebenen Weise die Acidität des alle 10 Minuten entnommenen Magenperfundats bestimmt. Nach einer Stunde der Basalsekretion perfundiert man Gastrin I-NPS in der Weise, daß man kontinuierlich eine vorbestimmte Dosis des Arzneimittels während einer Periode von 3 Stunden perfundiert. Nach Ablauf der ersten Stunde versetzt man das perfundierte Material mit einer Dosis von Gastrin I. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Fig. 5a wiedergegeben, die die Änderungen der Magensekretion in Abhängigkeit von der Zeit erkennen lassen. Es ist festzustellen, daß das Perfundieren von Gastrin I-NPS in einer Dosis von 100 ng/h keine Sekretionsreaktion verursacht und daß die gleichzeitige Verabreichung von 200 bzw. 400 ng/h Gastrin I progressiv zu einem Plateau der stimulierten Sekretion führt.

In der Fig. 5b sind zu Vergleichszwecken die Ergebnisse aufgeführt, die man bei einer kontinuierlichen Perfundierung von 100 ng/h Gastrin I erzielt.

Der Vergleich der erhaltenen Kurven zeigt, daß das Plateau der stimulierten Sekretion, das bei Verabreichung von 100 ng/h Gastrin I-NPS zusammen mit 400 ng/h Gastrin I erreicht wird, das Niveau des mit 100 ng/h Gastrin I erreichten Plateaus 40 Minuten nach der Perfusion von Gastrin I erreicht. Wenn man 200 ng/h Gastrin I zusammen mit 100 ng/h Gastrin I-NPS verabreicht, so nimmt das Sättigungsplateau 30 Minuten nach dem Perfundieren des Gastrins I einen geringeren Wert an.

Diese Ergebnisse zeigen, daß sich ein Gleichgewicht der an die Rezeptoren gebundenen Mengen von Gastrin I und Gastrin I-NPS einstellt und daß das Gastrin I-NPS durch Gastrin I verdrängt werden kann.

Im folgenden seien die Ergebnisse der Untersuchung der akuten Toxizität des o-nitrophenylsulfenylierten Derivats von Pentagastrin (Pentagastrin NPS) aufgeführt, die an der Maus wie folgt ermittelt wurden:

Man injiziert männlichen Mäusen mit einem Gewicht von 30 g auf intraperitonealem Wege in einem Volumen von 1 bis 2 ml Pentagastrin NPS in Dosierungen von 160, 320, 640, 1280 und 2560 µg/kg, was dem 20-fachen bis 320-fachen der Dosis entspricht, bei der die maximale Säurereaktion bei der Ratte erfolgt (8 µg/kg). Jede Dosis wird an einer Gruppe von 10 Mäusen verabreicht und die Mortalität wird 1 Stunde, 2 Stunden, 6 Stunden, 12 Stunden, 24 Stunden und 48 Stunden nach der Injektion von Pentagastrin NPS bestimmt. Alle toten oder lebenden Tiere werden im Rahmen einer Autopsie untersucht, wobei der Magen und der Dünndarm auf Blutungen und Geschwüre unter sucht werden. Die hierbei erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle VIII zusammengestellt, in der die Anzahl der toten Tiere einer jeden untersuchten Gruppe aufgeführt ist.

Tabelle VIII

Die Verabreichung von Pentagastrin NPS in den oben angegebenen Dosierungen führt zu keinerlei Blutung in den Verdauungstrakt der Mäuse, wenngleich man einige Hautblutungen bei Mäusen feststellen kann, die eine Pentagastrin NPS-Dosis von 2560 µg/kg erhalten haben.

Zu Vergleichszwecken wurde die gleiche Untersuchung der akuten Toxizität von Pentagastrin unter Anwendung der gleichen Bedingungen durchgeführt. Die hierbei erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle IX zusammengestellt.

Tabelle IX

Es ist festzustellen, daß man Blutungen des Verdauungstrakts beobachtet, deren Intensität mit der Dosis zunimmt, wenn man Pentagastrin beginnend mit einer Dosis von 320 µg/kg verabreicht.

Somit ist festzustellen, daß die Verabreichung von Pentagastrin NPS in Dosierungen von weniger als 2,5 mg/kg zu keinerlei Veränderung (Hautblutungen) des Magens und des Darmtrakts führt, während Pentagastrin bereits bei Dosierungen von 320 µg/kg zu Blutungen des Verdauungstraks Anlaß gibt.

Weiterhin wurde der DL₅₀-Wert von Pentagastrin NPS mit Hilfe der folgenden Methode errechnet:

Da die beobachtete Letalität im Verlaufe von 24 Stunden 20% der Tiere nicht übersteigt, wurde zur Ermittlung des DL₅₀-Werts ein doppelt logarithmisches Papier verwendet, auf dem auf der Abszisse die verabreichten Dosierungen (als Logarithmus) und auf der Ordinate die ermittelten Werte der beobachteten Mortalität (Probits) aufgetragen sind. In dieser Weise zeigt sich, daß der DL₅₀-Wert von Pentagastrin NPS mehr als 3,2 mg/kg beträgt.

Wenn man unter den gleichen Bedingungen den DL₅₀-Wert von Pentagastrin berechnet, so zeigt sich ebenfalls, daß er oberhalb 3,2 mg/kg liegt.

Claims

1. Arzneimittel, dadurch gekennzeichnet, daß es als Wirkstoff ein Polypeptidamid-derivat der allgemeinen Formel enthält, in der
R₁ ein Wasserstoffatom oder eine Acylgruppe und
R₂ eine gegebenenfalls substituierte Arylgruppe bedeuten.

2. Arzneimittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R₂ für eine 2-Nitrophenylgruppe oder eine 2,4-Dinitrophenylgruppe steht.

3. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß R₁ für eine Acylgruppe steht, die von einer Aminosäure, einem Peptid oder einem Derivat dieser Verbindungen abgeleitet ist.

4. Arzneimittel nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß R₁ für eine N-tert.-Butyloxycarbonyl-β-alanyl-gruppe, eine N-tert.-Butyloxycarbonyl-glycyl-gruppe, eine β-Alanylgruppe oder eine Glycylgruppe steht.

5. Arzneimittel nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß es als Polypeptid-amid-derivat Gastrin enthält, das in der 2-Stellung des Indolrings seiner Tryptophanylgruppen o-nitrophenylsulfenyliert ist.

6. Arzneimittel nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß es als Polypeptid-amid-derivat Gastrin enthält, das in der 2-Stellung des Indolrings seiner an die Methionylgruppe gebundenen Tryptophanylgruppe o-nitrophenylsulfenyliert ist.

7. Arzneimittel nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß es als Polypeptid-amid-derivat Caerulein enthält, das in der 2-Stellung des Indolrings seiner Tryphtophanylgruppe o-nitrophenylsulfenyliert ist.

8. Arzneimittel nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß es als Polypeptid-amid-derivat Cholecystokinin enthält, das in der 2-Stellung des Indolrings seiner Tryptophanylgruppe o-nitrophenylsulfenyliert ist.