PT1340506E - Composições que incluem surfactantes pulmonares e uma polimixina que melhoram as propriedades da superfície - Google Patents

Description

TW cr*T3 T Ρ L·/ ϋι Ο w£VX "COMPOSIÇÕES QUE INCLUEM SURFACTANTES PULMONARES E UMA POLIMIXINA QUE MELHORAM AS PROPRIEDADES DA SUPERFÍCIE" A presente invenção refere-se às composições que incluem surfactantes pulmonares e polimíxína que melhoram a tensão da superfície baixando-lhe as propriedades. A invenção também se refere à utilização da polimixina para melhorar as propriedades dos surfactantes naturais modificados ou dos surfactantes reconstituídos/artificiais,

Mais concretamente, a presente invenção refere-se à utilização das polimixinas para aumentar a resistência para a inactivação dos surfactantes naturais modificados ou dos surfactantes artificiais e/ou aumentando a sua actividade.

Os surfactantes naturais modificados ou surfactantes sintéticos combinados com as polimixinas podem ser vantajosos no tratamento das várias doenças dos pulmões como os síndromas de perturbações respiratórias neonatais e de adultos, síndrome de aspiração do mecónío, pneumonia e doença crónica dos pulmões.

Antecedentes da invenção

As lesões pulmonares são um grande problema clínico que inclui doenças como a síndrome de distúrbios respiratórios agudos nos adultos (ARDS), a síndrome de distúrbios respiratórios neonatais (RDS), a síndrome de aspiração do -9- mecónio (MAS). Vários tipos de pneumonia e displasia de broncopneumonia (BDP).

Um evento subjacente comum de todas as doenças referidas parece ser a deficiência do surfactante pulmonar e/ou disfunção.

Um surfactante pulmonar é uma mistura de lípido-proteínas que revestem o interior dos alvéolos. A presença dos lipidos como um mono camada no interface ar-líquido nos alvéolos reduz as superfície de tensão, diminuindo assim a tendência de colapso dos alvéolos durante a expiração e, talvez reduzindo a transudação de fluídos nos espaço de ar. 0 surfactante pulmonar endógeno contém cerca de 80% de fosfolípidos, 101 de peso de lipidos naturais e 10% de peso de proteínas. Quatro surfactantes de proteínas (SP) foram caracterizados, nomeadamente SP-A, SP-B, SP-C e SP-D (Johansson J et al. Eur J Biochem 1997, 244, 675-693) A deficiência surfactante pulmonar e/ou disfunção pode ser tanto primária como no caso do RDS ou secundária como no caso do ARDS, MAS e BPD (Robertson B Monaldi Arch Chest Dis 1986, 53, 64-69)

No ARDS e no MAS, a insuficiência do surfactante ou a inactivação do surfactante segue, nomeadamente, perda de proteínas, por exemplo, albumina ou outros inibidores de surfactantes nos alvéolos.

Também a resistência contra a pneumonia que é uma importante causa das falhas respiratórias, fica bastante reduzida pela falta de surfactante, da mesma forma que o surfactante desempenha um papel importante na defesa dos pulmões contra as infecções (Walther FJ em Surfactant Therapy for Lung Disease, Robertson & Taeusch, Eds,; Dekker, 1995, pp. 461— 476)

Substituir a terapia com uma variedade de surfactantes pulmonares exógenos provou ser benéfico tanto nos estudos experimentais e clínicos.

De acordo com Wilson (Especialista em Opin Pharmacother 2001, 2, 1479-1493) os surfactantes exógenos podem ser classificados em quatro tipos diferentes: i) Os surfactantes naturais que são recuperados intactos nos pulmões ou no liquido amniótico sem extracção e tem os lípidos e as proteínas da composição ds surfactantes naturais endógenos. Estes têm um risco potencial de infecção porque não podem ser esterilizados, uma vez que o calor desnatura as proteínas SP-Ά e SP-D. Estes surfactantes não estão disponíveis comercialmente; ii) os surfactantes "naturais modificados" que são extractos de lípidos de pulmão de mamífero cortado ou lavagem dos pulmões. Devido ao processo de extracção dos lípidos utilizado no processo de manufactura, as proteínas hidrófilas SP-A e SP-D são perdidas. Estas preparações têm quantidades variáveis de Sp-B e SP-C e, dependendo do método de extracção, podem conter não-surfactantes de lípidos, proteínas ou outros componentes. Alguns dos surfactantes naturais modificados presentes no mercado, como a Survanta (vide ultra) são misturadas com compostos sintéticos como a tripalmitina, dipalmitoilfosfatidilcolina e ácido palmítico. iii) Os surfactantes "artificiais" que simplesmente são misturas de compostos sintéticos, primeiro fosfolípidos e outros lípidos que são formulados para imitar a composição dos lípidos e comportamento dos surfactantes naturais. São desprovidos das apoproteínas dos surfactantes; iv) os surfactantes "reconstituídos" que são surfactantes artificiais e que foram adicionados a surfactantes de proteínas/péptidos isolados de animais, proteínas/péptidos fabricados através de tecnologia recombinada ou surfactantes sintéticos de proteínas análogos.

Surfactantes naturais modificados marcados, incluem:

Surfactante TA, Surfactante™ disponibilizado por Tokyo Tanabe, Japão

Survanta™, disponibilizado por Abbott Laboratories, Illinois, EUA

Infasurf™, disponibilizado por Forrest Laboratories, Missouru, EUA

Alveofactm, disponibilizado por Thomae GmbH, Alemanha

Curosurf™, disponibilizado por Chiesi Farmaceutici SpA, Itália

Tendo em conta os avanços na terapia com os surfactantes, as morte neonatais devido a RDS e as várias doenças dos pulmões .relacionadas com a deficiência do surfactante, as incidências diminuíram substancialmente, agora e no passado.

Contudo, percentagens significativas dos casos falham ao responder adequadamente à terapia do surfactante, Para este facto tem sido apresentadas numerosas explicações, a maior invoca que a inactivaçâo do surfactante in si tu uma ou mais substâncias que normalmente estão ausentes nos espaços alveolares. As substâncias que se suspeita que provoquem a inactivaçâo do surfactante endógeno em algumas doenças já referidas, por exemplo ARDS e que incluem as proteínas do sangue como a albumina, hemoglobina (hb) e tipos específicos de fibrinogénio e monómero de fibrina, lípidos, mecónio (Fuchimukai T et al Appl Physiol 1987, 62, 429-437; Cockshutt AM et al Biochemistry 1990, 36, 8424-8429; Holm BA et al JAppl Physiol 1987, 63, 1434-1442) A resistência à inibição é considerada uma característica desejada para a terapia com surfactante exógeno nos distúrbios clínicos, incluindo a RDS neonatal e dos adultos.

Em alguns casos, a inactivaçâo dos surfactantes pode ser parcialmente prevenida ao aumentar-se a quantidade de surfactante relativa à substância inactiva. Contudo, isto não desejável porque é dispendioso e porque o sucesso do tratamento de algumas doenças como ARDS já envolvem a utilização de doses grandes e frequentes. Aumentar ainda mais a dose pode ter um efeito negativo na gestão clínica do doente. A inibição do surfactante tem sido estudada atentamente mas as descobertas não são conclusivas e os mecanismos subjacentes não foram provados. -6-

Coiti referência a Holm et al (Chem Phys Lipids 1990, 52:243-50) os surfactantes são mais sensíveis à inibição através das proteínas do plasma são aqueles que têm falta de proteínas de Surfactantes.

Hall et al (AM Rev respir Dis 1992, 145, 24-30) descobriu-se que a adição de SP-B e SP-C a um surfactante artificial desprovido de proteínas, Exosurf, aumenta de alguma forma a resistência à inactivação com albumina in vitro e in vivo.

Seeger et al. (Eur Respir J 1993, 6, 971-997) referiu que vários extractos de surfactantes naturais e uma mistura de surfactante sintético reconstituído contendo-proteína são marcados de forma diferente no que refere à sensibilidade à inibição pelas proteínas do plasma.

De acordo com os autores, vários aspectos pode estar na base das diferenças marcadas na sensibilidade à inibição entre as preparações dos vários surfactantes. Primeiro, as variações nas composições de lípidos. Segundo, as variações nas composições de proteínas. Os surfactantes naturais modificados que contém uma maior percentagem de proteínas relacionadas com os fosfolípidos que os surfactantes reconstituídos são normalmente mais resistentes à inibição. Os surfactantes reconstituídos que contém uma recombinante de SP-C e fosfolípidos sintéticos mostram uma sensibilidade mais baixa ao fibrinogénio. De modo interessante, contudo, esta característica contrasta com uma maior sensibilidade ao material sintético em relação à capacidade inibidora da hemoglobina, o que sugere a interferência de mecanismos -7- subjacentes diferentes com a função surfactante para o fibrinogénio e a hemoglobina.

Terceiro, na presença de materiais contaminados, A presença de substância inibidoras derivadas dos tecidos pulmonares pode de facto explicar a maior sensibilidade dos surfactantes naturais modificados, através da extracção de tecidos dos pulmões cortados.

Num outro estudo (Walther et al Respir Crit Care Med 1997, 156, 855-861) descobriu-se que complementar Survanta com SP-B e SP-C adicionais melhorou significativamente a sua função na presença, das proteínas inactivadoras do plasma.

Herting et al (PaediatricResearch, 50(1) 44-49, 2001) comparou os efeitos inibitórios do mecónio humano nas várias preparações de surfactantes: Curosurf, Alveofact, Survanta, Exosurf, surfactante natural da lavagem brônquio-pulmonar de coelho e, dois surfactantes reconstituídos contendo um recombinante de surfactante proteína-c (rSP-C) ou leucina/lisina polipeptido (KL^) . O mecónio mistura complexa contendo proteínas, restos de células, ácidos da bílis, Hb e metabolitos de bilirrubina. Todos estes componentes são individualmente capazes de inibir a função do surfactante. A aspiração do mecónio pode ter como resultado graves falhas respiratórias nos neonatais. Acredita-se que a inactivação do surfactante tem um papel chave na fisiopatologia do MAS (Síndroma de Aspiração de Mecónio), e inibição da superfície de tensão-baixando a actividade do surfactante através de mecónio como foi demonstrado in vitro. -8-

Neste estudo, as diferenças entre os surfactantes naturais modificados Curosurf, Alveofact ou Survanta, , que estão actualmente a serem utilizados clinicamente para o tratamento da RDS neonatal, quando moderado. Os surfactantes rSP-C reconstituído e o KL^ eram mais resistentes à inibição que os surfactantes naturais modificados. Surfactante natural contendo SP-A era ainda mais resistente à inactivação. A importância do SP-A na resistência aos inibidores dos surfactantes também foi demonstrada nos estudos anteriores. Contudo, as proteínas como a SP-A, SP~B e SP-C não estão disponíveis, uma vez que estas devem ser isoladas tanto dos surfactantes naturais ou sintetizados pelo recombinante ou técnicas orgânicas de síntese.

Recentemente, alguns autores referiram que a co-administração de algumas substâncias são capazes de reduzir ou prevenir a inactivação dos surfactantes.

Na WO00/105550, Taeusch et al relataram a habilidade dos polímeros não-iónicos e carboidratos de reverterem a inactivação dos surfactantes,

Dextranos, polietileno glicol ou polivinilpirrolidonios em 1-10% (p/v), por exemplo 10-lOOmg/ml nas suspensões, descobriu-se serem capazes de restaurar a habilidade do Survanta para diminuir a superfície mínima de tensão na presença do mecónio, sérum ou lisofosfatidilcholina (Taeusch w et al Pediatric Res 1999, 45, 319& 322 A; Taeusch W et al Am J Respír Crít Cate Med 1999, 159, 1391-1395). A capacidade de 0.5-1.0% (p/v) dextrano, por exemplo 5-10 mg/ml nas suspensões, para restaurar a actividade da albumina •9- (sérum) - ou mecónio-inibido os surfactantes naturais modificados de suíno for relatados (Konsaki T et al Proceeding of the 35tb Scientific Meeting of Japonese Medicai Society for Biological Interface, October 9th, 1999, Kobayashi et al J. Appl Physiol 1999, 86, 1778-1784 ; Tasbiro K et al Acta Paediatr 200, 89, 1439-1445}

Tollofsrud et al {Paediatric Res 2000, 47, 378 A) sugeriu que o sérum de albumina de bovinos (BSA) poderia ser utilizado para bloquear os ácidos gordos livres (FFA) que por sua vez parecem ser responsáveis pelas lesões pulmonares na MAS. BSA, demonstrando ser mais eficaz num raio de FFA/BSA de 1:1.

No entanto, existem preocupações relativas à utilização dos polímeros hidrófilos como o dextrano, uma vez que estes podem promover o edema pulmonar ao aumentarem a pressão colóide osmótica nas passagens de ar. No que diz respeito à BSA, até agora foi considerado como um dos factores responsáveis pela inactivação dos surfactantes, desta forma a sua utilização para restaurar a actividade necessita de uma investigação mais aprofundada.

As polímixinas são uma família de antibióticos que derivam de B. Polimixina. (B aerosporus}.

Mais especificamente a polimixinas B (PxB) está altamente carregada com anfifílícas cíclicas de peptidolípidos da fórmula representada abaixo, que acabou por ser bastante útil para. combater várias infecções de fungos, especialmente aquelas que aparecem em indivíduos imuno-comprometídos. -10-

Aoyl-DAB-Thr-DAB-pAB-DAB-D-Pl^e -daeT^ .Leu

Thr-DAB DAB=(L) cqy-ácido diaminobutirico

Polimixina B é uma mistura de Polimixina Bx e Polimixina B2.

Aci.1 é { + ) -6-methiloctano.i.l na Polimixina Bi e 6-methiloctanoil na Polimixina B2.

Os mecanismos de acção da Polimixina B, enquanto o antibiótico depende em parte, da neutralização da endotoxina, conseguida através da ligação do lípido A região da molécula. As endotoxinas ou lipopolissacaridos são componentes estruturais das paredes da célula da bactéria Gram-negativa. Foi relatado que PxB é capaz de passar através das ligações das vesículas fosfolípidos pelas interacções iónicas e que promove a transferência intervesícula dos lípidos (Cajal et al Bíochem Biophys Res Comsnun 995, 210, 74 6-752; Cajal et al Biochemistry 1996, 35, 5684-5695), Sugeriu-se que esta propriedade fosse envolvida com actividade antíbacteriana.

Também foi observado que PxB exibe uma retenção prolongada no pulmão, após a administração pulmonar que pode estar relacionada com as interacções hidrófugas e electrostáticas entre os polipéptidos e os fosfolípidos do pulmão (Mc Allíster et al. Adv Drug Deliv Pev 1996, 19, 89-110) .

Zaltashet {Biochim Biophys Acta 2000, 146, 173-186), após a observação das caraclzerísticas estruturais da SP-B que suportam a função na reticulação das membranas de lípidos, descobriu-se que um surfactante reconstituído misturado com PxB (que passa as reticulações das vesículas de lípidos mas está estruturalmente não-relacionado com SP-B) exibida in vitro numa actividade na superfície comparável à de uma mistura análoga contendo SP-B, no lugar de PxB. O surfactante reconstituído foi produzido a partir de uma mistura artificial de fosfolípidos a que foi acrescentado um análogo peptídico de SP-C. A WO 00/47623 reivindica que a utilização dos análogos peptidicos de SP-C na preparação de um surfactante reconstituído, é bastante útil no tratamento de síndromas de distúrbios respiratórios (RDS), e outras deficiências de surfactantes ou disfunções bem como a utilização de polimixinas, especialmente PxB como um substituto de SP-B.

Descrição da invenção A presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica tal como é definido na revindicação 1.

Actualmente descobriu-se, que o objecto da presente invenção que as polimixinas aumentam a resistência dos surfactantes pulmonares contra a inactivação bem como, melhoram a suas propriedades de superfície.

De facto, foi demonstrado que polimixina B que é capaz de restaurar a superfície de actividade de inibidor-albumina -12-

Cirosurf ou surfactante reconstituído indicando que pela administração do referido aditivo, é possível reduzir ou eliminar a ínactivação dos surfactantes exógenos terapêuticos pulmonares.

Descobríu~se que pela análise da bolha pulsatória e da microbolha que a adição de PxB de 2,5mg/ml Curosurf tem um efeito marcado na resistência para inibição pela albumina. Em particular, descobriu-se que a adição de 2% de polimixina relativa à massa do surfactante, por exemplo, 0.05 mg/ml PxB na solução, aumenta a resistência para ínactivação do Curosurf com albumina.

De acrescentar que se descobriu através das experiências com a bolha pulsatória que ao adicionar as polimixinas, especificamente a polimixina B é possível melhorar as propriedades da superfície do Curosurf em concentrações baixas de fosfolípidos. A concentração mais baixa em que é possível diluir o Curosurf sem perder as suas propriedades optimizadas, nos termos de superfície mínima e máxima de tensão (ymin e ^x) pode ser diminuída em cerca 2.5 vezes ao adicionar-se o PxB.

De acrescentar ainda que nas experiências in vivo efectuadas nos coelhos recém-nascidos imaturos provaram que a adição de 2% de polimixina B, relativa à massa do surfactante no Curosurf, a dose do surfactante pode ser diminuída mais significativamente sem perder os efeitos benéficos do surfactante e que a incidência do pneumotórax pode ser reduzida durante a ventilação mecânica prolongada.

Com uma extensão a estas descobertas, as polimixinas pode ser útil para preparar os surfactantes naturais modificados ou surfactantes artificiais reconstituídos para utilização clínica nos estados em que a inibição do surfactante é esperada. Em particular, a adição de polimixinas pode permitir a .reduzir da dose de surfactante requerida. No caso da ARDS em que uma gestão com sucesso, de acordo com os estudos clínicos actuais, necessita de doses grandes e frequentes será altamente vantajosa para reduzir a dose do surfactante sem afectar a eficácia.

Possivelmente, os surfactantes naturais modificados ou reconstituídos fortalecidos com polimixinas também poder ser útil para o tratamento de BPD como foi relatado nos doentes sujeitos a uma grande incidência de pneumotórax. E ainda como um acréscimo as estas descobertas, os surfactantes naturais modificados ou surfactantes reconstituídos/artificiais são fortalecidos com polimixinas podem ser bastante úteis para o tratamento de síndromas pulmonares como a MAS, em que o excessivo ou elevada concentração de mecónio ou outra segregações com afectação para um tratamento, para a saúde e a segurança de fetos e recém-nascidos.

Em termos gerais, uma composição que contem como ingrediente activo tanto um surfactante pulmonar que é efectivo para o tratamento de distúrbios pulmonares relacionados com a falta e/ou disfunção do surfactante endógeno e uma polimixina pode ser um agente terapêutico eficaz para o tratamento de vários distúrbios pulmonares, um efeito maior do que é alcançado com a administração unicamente do surfactante.

Exemplos destes distúrbios incluem síndromas de distúrbios neonatais e nos adultos, síndroma de aspiração do mecónio e qualquer tipo de pneumonia e possivelmente a displasia brônquio-pulmonar.

Por este motivo, a invenção também se refere às referidas composições i com uma nova forma de tratamento, redução ou prevenção dos distúrbios já referidos,

Descrição detalhada da invenção

Os aditivos utilizados na presente invenção são polimixinas ou qualquer sal destas. As polimixinas úteis são tanto sintéticas ou derivados de B. Polirnixina {B. aeroporus). Uma polirnixina preferida é a polirnixina B.

Os surfactantes pulmonares utilizados na prática da presente invenção sâo surfactantes naturais modificados pulmonares ou surfactante artificial como é definido da reivindicação 1; eles são eficazes no tratamento de distúrbios pulmonares. Os surfactantes incluem substâncias biológicas que sâo obtidas de fontes animais, preferencialmente pulmões de mamíferos e, depois tratados com suplementação, extracção ou purificação, Exemplos típicos incluem o Surfactante ΤΔ, Survanta, Infasurf, Alveofact. 0 surfactante preferido é o Curosurf. -15-

Os surfactantes incluem ainda surfactantes artificiais, sensíveis à inibição pelas proteínas do plasma ou outros agentes ínibidores. A proporção de polimixina relativa ao surfactante pode variar. Geralmente os melhores resultados são alcançados com uma percentagem de polimixina de cerca de 01 e 10% relativa ao peso do surfactante (p/p>, preferencialmente entre 0.5 e 5%, mais preferencialmente entre 1 e 3%. O aditivo pode ser administrado tanto antes como durante ou depois da administração do surfactante e, em qualquer caso, ambos são administrados directa ou indirectamente nos pulmões dos doentes.

Num método particular conveniente, a polimixina e o surfactante são combinados numa única formulação de líquido aquoso que é então administrado ao doente. Num método ainda mais conveniente, a polimixina e o surfactante são administrados como uma suspensão salina fisiológica tamponada. Métodos adequados para a administrado são os mesmos que os geralmente considerados adequados e eficaz para a terapia do surfactante. O método mais directo e eficaz é a instilação da composição nos pulmões através da traqueia. Outro método adequado de administração é na forma de aerossol, especialmente através da nebulização. As quantidades dos componentes serão baseadas na dosagem do surfactante de acordo com as dosagens actualmente utilizadas na terapia com surfactante. Os surfactantes naturais modificados são -Ιό- tipicamente fornecidos corno frascos de vidro com suspensões de utilização única. A concentração (expressada como conteúdo fosfolípidos) na variação de 20 até 100 mg de surfactante por ml, preferencialmente 25 e 80 mg/ml.

De acordo com as explicações da presente invenção, as polimixinas como aditivos são úteis como suplemento e melhoram a terapia do surfactante para uma variedade de distúrbios pulmonares, condições anormais e doenças provocadas ou causadas por uma deficiência ou disfunção do surfactante pulmonar. São exemplos a doença da membrana hialina, síndromas de distúrbios respiratórios neonatais e de adultos, lesões agudas dos pulmões (como resultado da inalação de ozono, inalação de fumo ou quase afogamento), condições de inactivação do surfactante despoletadas pelo volutrauma e barotrauma, síndroma de aspiração de mecónio, síndroma de falha capilar, pneumonia bacteriológica e virai, e displasia brônquio-pulmonar.

PARTE EXPERIMENTAL

Preparação do surfactante O Curosurf (fracçâo de 80 mg/ml fosfolípído de pulmão de suíno, o equivalente a cerca de 74mg/ml do total de fosfolípidos e cerca de 1 mg de proteínas) foi diluído em 0.9% de NaCl para as concentrações de fosfolípidos de 0.1, 1, 1,5, 2, 2.5,3.5, e 5 mg/ml. Para algumas preparações 1%, 2% ou 3% de polimixina B (Sulfato de Polimixina B, Sigma) -17- relativa a quantidade de surfactante de fosfolípidos que foi adicionada.

Exposição ao surfactante inibidor

Resistência à inibição da albumina foi testada pela adição de sérum de albumina humana (Albumina humana, Sigma) 0.1, 0.4, 0.5, 1.6,2.5,10 ou 40 mg/ml para as diferentes preparações de surfactantes. Todas as preparações de surfactantes foram mantidas a 31° durante uma hora antes da medição da superfície de tensão.

Medição da superfície de tensão

As propriedades de superfície foram determinadas pelo sistema de bolha pulsatória (Surfactometer International, Toronto, Canadá). 0 recipiente de plástico foi cheio com fluido de teste (aproximadamente 20 pl) e foi criada uma bolha. A bolha foi mantida em condições estática durante 1 minuto e então pulsada com 50¾ de compressão cíclica da superfície da bolha durante 5 minutos a 31° com um ritmo de 40 pulsações por minuto. A pressão nas paredes da bolha foi registada durante o 5o ciclo e, após 1, 2 e 5 minutos de pulsação. Os valores para a superfície de tensão no diâmetro máximo e mínimo da bolha foram calculados de acordo com a equação LaPlace: P=2y/r, onde P é a pressão medida do gradiente através da parede da bolha, r o radio e y a superfície de tensão. Os valores foram obtidos de 5-7 observações para cada exemplo. -18-

Análise da microbolha

As preparações dos surfactantes foram analisadas com O.lmg/ml após terem sido vigorosamente agitadas durante 30 segundos, e o número e percentagem de microbolhas, o número e a percentagem das microbolhas (diâmetro <20 pm) geradas na suspensão foi determinada pela análise computorizada da imagem, essencialmente tal como descrito pelo Berggren et al (Bio Neonate, 1992, 61 8suppl 1), 15-20).

Difusão das experiências

As experiências foram efectuadas a 37° utilizando uma balança alterada de Wilhelmy com uma área de superfície de 20 cm2. As quantidades padrão do Curosurf nas várias concentrações (10-80mg/ml) foram aplicadas numa hipofase de salina, aproximadamente 40 mm do prato de imersão. Em algumas experiências, CaCl2 (2mM) dextrano 830mg/ml) ou polimixina b (2% do total do peso fosfolípidos, por exemplo 0.4 mg/ml) foi adicionado à diluição do material surfactante 820 mg7ml)-Também investigamos o efeito da albumina numa concentração baixa (O.lmg/ml) adicionada à hipofase. A superfície de tensão, medida 1 segundo após a administração da amostra, foi utilizada como parâmetro combinando a difusão a formação de filme pela adsorção da hipofase.

Estatísticas

As informações foram expressas como +/- SD.O programa estatístico CRISP (Crunch Software, San Francisco CA) foi utilizado para a análise da informação. As diferenças foram avaliadas através de uma análise única da variação (ANOVA) seguida pelo teste de Student-Newman-Keuls. Um Valor-P <0.05 é visto estatisticamente como significativo.

Exemplo 1 - Efeito da poiimixina B na resistência do surfactante à inibição pela albumina nas diferentes concentrações O efeito do PxB, no Curosurf contra inibição pela albumina, nas diferentes concentrações, foi avaliado ao utilizar a bolha pulsatória do surfactimetro (ΡΒΞ) e pela análise da estabilidade da microbolha.

Experiências do Surfactometro da bolha pulsatória

Para as experiências PBS de albumina as concentrações até 40 mg/ml foi adicionado ao Curosurf com 2.5 mg/ml, ou Curosurf com 2.5 mg/ml contendo 2% (p/p) de PxB e, a superfície de tensão no raio máximo e mínimo da bolha (γΗάχ,γπύη) após 5 minutos de pulsação a 37° e 40 ciclos/min foram registados. Todas as experiências foram efectuadas em triplicado e os valores apresentados. A figura 1 ilustra que γιηίη permanece <5 mN/m para o PxB que contém a preparação também na presença de 40mg/ml de albumina, enquanto PxB^in aumenta dramaticamente nas concentrações de albumi.na> 0.1mg7ml. Da mesma forma que na ausência de PxB o YR,á* os valores aumentam significativamente nas concentrações de albumina> 0.1 mg7ml, enquanto na presença de PxBymáx permanece <40mN/m até 10 mg/ml de albumina (Figura 2). -20-

Experiências com a estabilidade da microbolha A análise da estabilidade da microbolha mostra um efeito proeminente da PxB, A Figura 3 mostra que na presença de PxB, os conteúdos das microbolhas permanecem altos até 1,6 mg/ml de albumina. Sem PxB, a adição de albumina provoca uma dose-dependência que diminui em percentagem as microbolhas na presença de 1.6 mg/ml de albumina, a preparação do surfactante contém apenas 40¾ de microbolhas.

Exemplo 2 - efeitos da polimixina B no Curosurf

Efeitos da polimixina B no Curosurf e sensibilidade â albumina 40 mg/ml

As diferentes concertações de Curosurf e Curosurf plus 2% de polimixina B foram testadas, de forma a descobrir a concentração mais baixa em que as preparações de surfactante possuem propriedade de superfície optimizadas sem adicionar albumina ou na presença de albumina. As propriedades de superfície optimizadas foram definidas como superfície mínima de tensão í-pnin) <5mN/m e superfície máxima de tensão iymáx) <35mN7m após 5 minutos de pulsação, na bolha de pulsação do surfactometro, As concentrações de surfactantes foram então diluídas até a ymin ser >15mN7m e >50mN/m.

Como pode ser verificados nas figuras 4-7 as propriedade de superfície optimizadas foram registadas numa concentração de 5 mg/ml de Curosurf com um y„lin de 2.2 +/- 0.7mN/m e de 33.0+7- 1.1 mN/m. O Curosurf nesta concentração era -21- resistente à albumina, 40mg/ml. Com concentrações baixas ambas γιη.ΐη e Tmá:, aumentaram, especialmente na presença da albumina. A adição de 2% de polimixina B melhorou as propriedades de superfície do Curosurf, nas concentrações mais baixas doe fosfolípidos. Quando 2% de polimixina b foram adicionados ao Curosurf, 2 mg/ml, γπϋη, diminuiu de 16.8 + /-8.9 para 2.7 + /-0.8mN/m {P<0.05} {fig. 4) e de 54.8+/-5.9 para 35.0+/-l,0mN/m (Fig.5), Na presença da adição de 40 mg/ml de albumina de 2% de polimixina B conduziram a uma diminuição do ynún de 35.7 +/-13.2 para 3.0 + /-1.2mN/m(P<0.01) (Fig.6}e de 57.9+/-2.8 para 44.5+/-10,7 mN/m (P<0.05} (Fig.7). A adição de 2% de polimixina B melhorou assim nas propriedades da superfície do Curosurf nas concentrações baixas fosfolípidos e o aumento da resistência para a inactivação do Curosurf com albumina. Os resultados mostram que as concentrações mais baixas de Curosurf com as propriedades in vitro optimizadas, podem ser diminuídas cerca de 2.5 vezes pela adição de 2% polimixina 8.

Exemplo 3 - Efeitos das diferentes concentrações de

Polimixina B no Curosurf

As experiências da bolha pulsatõria foram utilizadas para avaliar a concentração optimizada da polimixina B para manter a actividade da superfície optimizada 2 mg/ml de Curosurf, tanto com ou sem a adição da albumina ou na presença da albumina 40mg/ml.Os resultados indicam que a -22- concentração optimizada da variação de polimixina B entre 1% e 3% relativas ao peso do surfactante e 2% é a configuração preferida.

Exemplo 4 - difusão das experiências

Com as concentrações elevadas/baixas dos volumes das amostras (80 mg/ml; 10 microl), a difusão é bastante eficaz e o valor da tensão de superfície com 1 segundo (28 mN/m) era apenas ligeiramente mais elevada que o equilíbrio da superfície de tensão (24mN/m) foi alcançado em 10 segundos. Com concentrações baixas/altas dos volumes de amostras contendo a mesma quantidade de Curosurf (10 mg7ml; 80 microl), a difusão foi retardada e caracteristicamente bifásíca, o valor da superfície de tensão com 1 segundo era significativamente mais elevada (60 mN/m), o equilíbrio da superfície de tensão <24mN/m não foi alcançado antes de terem passados 30 segundos. A difusão nas superfícies das amostras diluídas (20 mg/ml) foi ainda mais retardada pela adição da albumina à hipofase, mas acelerada pela elevada concentração de dextrano ou pela baixa quantidade de polimixina B, também na presença da albumina. A adição de CaCl2 não teve efeitos (Tabela 1).

Tabela 1 Taxas de difusão do Curosurf diluído em 20 mg/ml (Volume aplicado 10 microl), após a adição de vários agentes ao material surfactante ou à hipofase; os valores de referência do mínimo de 3 medidas. .23-

Material adicionado Superfície de tensão com 1 segundo (mN/m) CaCl2 (2mN/m) 52 52 Dextrano {30 mg/ml) 33 Polimixina B 2 8 (21,=0.4mg/ml) 70 Albumina (Q.lmg/ml) 70 Albumina* + CaClj 39 Albumina* r dextrano 45 Albumina* H- polimixina B * foi adicionada albumina à hipofase Δ informação mostra a difusão diluída do surfactante das amostras pode ser alargada in vitro pela adição de 0.4 mg/ml PxB (2IP/P), por exemplo as concentrações comparadas com o total dos fosfolípidos do surfactante, que é significativamente mais baixo do que as concentrações de dextrano (30mg/ml o equivalente 159% p/p) necessário para obter um efeito similar.

Petos de coelho antes do termo (Nova Zelândia Branco) foram nasceram no 27° dia de gestação por cesariana seccional (termo= 31 dias). No nascimento, os animais foram anestesiados com intraperitoneal sódio pentobarbital (O.lml; -24- 6 mg/ml} traqueomizados, paralisados com intraperitoneal pnacurium bromidia (0,1-0.15 ml; 0.2mg/ml) e mantidos com o sistema de pletismografia a 37°. Foram mecanicamente ventilados em paralelo com um Servo-Ventilator modificado (99QB, Siemens-Elema, Solna, Suécia) entregando 100% de oxigénio. Trabalha com a pressão de 55 cmH?G, A frequência foi de 10 por minuto, a inspiração: expiração raio de tempo 1:1 e o volume corrente foi ajustado entre 6-10 ml/kg peso de corpo. Não foi aplicada pressão expiatória positiva.

Os coelhos recém-nascidos imaturos receberam aleatoriamente ao nascimento, através da cânula traqueal, 2,5 ml/kg peso do corpo de Curosurf (32 ou 80 mg/ml) ou 2% polímixina B no Curosurf (32mg/ml). No controlo animal, não foi instalado qualquer material nas passagens de ar. Todos os animais foram ventilados durante 5 horas.

Os electrocardiogramas (ECG) foram registados através de eléctrodos subcutâneos. O ECG foi verificado nos mesmos intervalos que já foram indicados acima. Assim que ocorreram a arritmia, a bradicardia (batida do coração <60/min), ausência de complexos QRS ou pneumotórax, os animais foram sacrificados com uma injecção intracraniana de lidocaína (0.5ml; 20mg/ml). Todos os animais sobreviveram 5 horas e foram mortos com o mesmo método. 0 tempo de sobrevivência foi registado. O abdómen foi aberto e o diafragma inspeccionado para evidências do pneumotórax.

Medidas das funções dos pulmões O pico da pressão inspiratória (PIP) foi registado com um transdutor de pressão (EMT34) e ajustado individualmente para cada animal para obter o volume corrente (VT) 8-10 ml/kg peso do corpo. O volume corrente foi registado com um tudo-Fleisch, a pressão diferencial do transdutor (EMT34), um integrador (EMT32), um amplificador (EMT41) e um sistema de registo (Mingograf 81; tudo equipamento, Siemens-Elema). O sistema foi calibrado para cada indivíduo experimentado e a curva de calibração linear foi obtida para os volumes correntes entre 0.1 e 0.8ml. A medição do pulmão-tórax foi derivado das gravações do volume corrente e o pico da pressão inspiratório e expressada em ml/kg.cml^O.

Tabela 2 - Número de animais (n), peso do corpo, incidência do pneumotórax e o número de sobreviventes aos 180 mín.

Grupo N Peso do corpo íg) Pneumotórax (n) Sobreviventes aos 180 min (n) Controlo 17 29.2+/” 1.4 10 0 Curosurf 32 mg/ml polimixina B 2% 17 28.3+/-3,6 2 7 Curosurf 32 mg/ml 18 29,1+/-3.5 8 2 Curosurf 80 mg/ml 16 29.9+/- 4.4 5 6

Os valores apresentados sao meios +/- SD. -26-

Todos os três grupos dos animais tratados-surfactantes tiveram valores de medição elevados de controlo aos 15 min. Estas experiências provaram que adição de 25 de polimixina B ao Curosurf, a dose do surfactante pode ser significativamente diminuída sem perda dos efeitos benéficos dos surfactante e, a incidência do pneumotórax durante os mecanismos prolongados de ventilação, podem ser reduzidos.

Lisboa, 06.03.2007

Claims (11)

1. BEIVIUDICaCÕES 1. Uma composição farmacêutica que compreende: (a) um surfactante efectivo no tratamento de transtornos pulmonares, condições anormais e doenças devido à falta ou deficiência do surfactante endógeno; (b) uma polimixina Onde o surfactante é um surfactante pulmonar natural modificado que consiste num extracto de lípido de um pulmão de mamífero cortado ou lavagem de pulmão contendo as proteínas do surfactante SP-B e SP-C ou um surfactante artificial consistindo numa mistura de compostos sintéticos, inicialmente fosfolípidos e outros lípidos que foram formulados para imitar a composição dos lípidos e o comportamento do surfactante natural e que estão desprovidos de apoproteínas dos surfactantes.
2. 2, A composição de acordo com a reivindicação 1 onde o referido surfactante é um surfactante natural modificado (por exemplo, surfactante TA, Survanta®, Infasurf®, Alveofact® ou Curosurf®).
3. 3- Uma composição que de acordo com a reivindicação 1 onde o referido surfactante é um surfactante artificial.
4. 4. Uma composição que de acordo com as reivindicações 1 - 3 onde a referida polimixina é a polimixina B.
5. 5. Uma composição que de acordo com as reivindicações anteriores, a percentagem da referida polimixina está compreendida entre 0.1% e 10% no peso do surfactante. _Ί_
6. 6.. Uma composição de acordo com a reivindicação 5, onde a percentagem está compreendida entre 0.5% e 5%,
7. 7.. Uma composição que de acordo com a reivindicação 5, onde a percentagem está compreendida entre 1% e 3%.
8. 8. Uma composição que de acordo com as reivindicações 1 - 7 na forma de suspensão aquosa.
9. 9. Uma composição farmacêutica que de acordo com a reivindicação 8 que inclui um surfactante pulmonar natural modificado numa concentração, compreendida entre 20 mg/ml e 100 mg/ml
10. 10. Uma composição que de acordo com a reivindicação 9 onde a concentração que inclui um surfactante pulmonar natural modificado numa concentração compreendida entre 25 mg/ml e 80 mg/ml.
11. 11. Uma composição que de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 - 10 onde os referidos transtornos pulmonares, condições anormais e doenças inclui síndromas de distúrbios respiratórios em neonatais e nos adultos, síndroma de aspiração mecónio, pneumonia bacteriológica e virai, displasia brônquio-pulmonar. Lisboa, 06.03.2007