PT1506234E - Misturas de lípidos sintéticos melhoradas para a preparação de um surfactante reconstituído. - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO «MISTURAS DE LÍPIDOS SINTÉTICOS MELHORADAS PARA A PREPARAÇÃO DE UM SURFACTANTE RECONSTITUÍDO» A presente invenção diz respeito a surfactantes reconstituídos que consistem em fosfolípidos e péptidos artificiais capazes de reduzir a tensão superficial na interface ar-líquido. A invenção diz respeito, em particular, a surfactantes reconstituídos que consistem de misturas particulares de fosfolípidos e de análogos de péptidos artificiais da proteína surfactante natural SP-C para o tratamento da síndroma de dificuldade respiratória (SDR) e de outras doenças relacionadas com disfunções do surfactante pulmonar.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 0 surfactante pulmonar reduz a tensão superficial do interface ar-líquido da parede alveolar interna, evitando assim que os pulmões colapsem no final da expiração. A deficiência de surfactante é uma disfunção que afecta normalmente crianças prematuras e que causa SDR, uma doença que pode ser tratada eficazmente com surfactantes naturais extraídos de pulmões de animais. Os principais constituintes destas preparações de surfactantes são fosfolípidos como a 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina conhecida habitualmente por dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), fosfatidilglicerol (PG) e as proteínas surfactantes hidrofóbicas B e C (SP-B e SP-C). As proteínas surfactantes hidrofílicas SP-A e SP- 2 D, que são lectinas colagenosas do tipo C (dependentes de Ca2+) e que se pensa actuarem principalmente no sistema de defesa do hospedeiro, não são normalmente incluídas nas preparações de surfactante devido aos procedimentos de extracção do solvente orgânico. Na prática terapêutica actual, são utilizadas preparações de surfactante natural obtidas a partir de tecidos animais. Estas preparações consistem normalmente nos componentes mencionados previamente com a excepção das proteínas hidrofílicas que são removidas depois da extracção com solventes orgânicos.

Devido às desvantagens das preparações de surfactante de tecidos animais, como a complexidade dos processos de fabrico e de esterilização e à possível indução de reacções imunes, têm sido feitas tentativas para preparar surfactantes artificiais.

No sentido estrito da palavra, os surfactantes artificiais são misturas de apenas fosfolípidos ou misturas de fosfolípidos e de outros lípidos sintéticos. Os surfactantes reconstituídos são surfactantes artificiais aos quais foram adicionados proteínas hidrofóbicas isoladas a partir de tecidos animais ou obtidas através de técnicas recombinantes ou derivados peptídicos sintéticos dessas proteínas.

As propriedades e a actividade dos surfactantes reconstituídos dependem em larga medida não só dos componentes proteicos/peptídicos, mas também da composição da mistura de fosfolípidos. 3

Yu et al., Biochimica and Biophysica Acta, 1992, 1126, 26-34, dão conta de um estudo sobre a acção tensioactiva de misturas binárias de fosfolipidos que contêm DPPC e fosfolípidos ácidos insaturados como o PG de ovo, POPG ou o ácido fosfatidico de ovo na presença da proteina natural SP-B. Descreve-se ainda um surfactante que consiste em 1% de SP-B em combinação com DPPC: POPG 7:3 p/p, contendo adicionalmente cloreto de cálcio. Mencionam-se como componentes importantes no surfactante natural pulmonar outras proteínas surfactantes naturais como a SP-A e a SP-C.

A WO 01/76619 ('619) diz respeito à utilização de preparações de surfactantes pulmonares, especialmente aquelas que contêm proteínas surfactantes recombinantes para a profilaxia ou o tratamento precoce de doenças pulmonares agudas. As composições contêm fosfolípidos e podem conter ainda a proteína de surfactante pulmonar. De acordo com a WO '619, as preparações de surfactante pulmonares podem conter ácidos gordos como o ácido palmítico e electrólitos como sais de cálcio, de magnésio e/ou de sódio. As preparações preferidas contêm 80 a 95% do peso em fosfolípidos, 0,5 a 3,0% do peso em proteínas surfactantes pulmonares, 3 a 15% do peso em ácido gordo, preferencialmente o ácido palmítico, e 0 a 3% do peso em cloreto de cálcio. Os exemplos 1, 3 e 4 dizem respeito a preparações surfactantes que contêm a proteína natural SP-C recombinante, DPPC, POPG, ácido palmítico e cloreto de cálcio, enquanto no exemplo 5 é descrita uma preparação que contém 0,5 g do péptido sintético KL4, 7,125 g de DPPC 4 e 2,4 3 g de POPG (DPPC:POPG numa relação de peso de 7:2,5) . A WO 00/47623 descreve análogos de péptidos artificiais da proteína SP-C associada ao surfactante pulmonar natural. Também descreve surfactantes sintéticos (reconstituídos) que compreendem os ditos péptidos em combinação com lípidos ou fosfolípidos seleccionados de entre o grupo que consiste de fosfatidilcolinas, preferencialmente DPPC, PG (fosfatidilglicerol), PA (ácido palmítico), triacilgliceróis e esfingomielina.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

Descobriu-se recentemente que a dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) misturada com fosfolípidos de palmitoiloleoilo específicos é um excipiente ideal para os péptidos artificiais habitualmente utilizados em surfactantes reconstituídos como análogos das proteínas surfactantes naturais SP-C e SP-B. Descobriu-se, em especial, que os surfactantes reconstituídos que compreendem os análogos de SP-C descritos na WO 00/47623 em combinação com DPPC e um fosfolípido de palmitoiloleoilo - preferencialmente seleccionado de entre palmitoiloleoilfosfatidilglicerol (POPG) ou uma mistura de POPG com palmitoiloleoilfosfatidilcolina (POPC) - com relações de peso entre 80:20 e 60:40 baixam a tensão superficial e a viscosidade das preparações derivadas obtidas. Ao contrário do que tem sido descrito na literatura, descobriu-se surpreendentemente que a adição de ácido 5 palmítico (PA) é inútil e, além disso, em alguns casos pode reduzir a actividade do surfactante in vivo.

Assim, a presente invenção diz respeito a surfactantes reconstituídos que consistem de um mistura de fosfolipidos de dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) e um fosfolipido de palmitoiloleoilo seleccionado de entre palmitoiloleoilfosfatidilglicerol (POPG) ou uma mistura derivada com palmitoiloleoilfosfatidilcolina (POPC), com relações de peso entre 80:20 e 60:40 e análogos de péptidos artificiais da proteína surfactante natural SP-C. O surfactante da invenção não tem ácido palmítico. A relação de peso entre a DPPC e o POPG é preferencialmente entre 75:25 e 65:35 e, mais preferencialmente , 68:31. No caso das misturas DPPC:POPG:POPC, os fosfolipidos são preferencialmente utilizados com relações de peso de 60:20:20 ou de 68:15:16.

Os análogos de SP-C têm a seguinte fórmula geral (I), sendo os aminoácidos representados com o código de uma letra,

FeGf IP Z Z PVHLKR (XaB) n (XbB) n (XCB) mXdGALLQGL (I) em que: X é um aminoácido seleccionado de entre o grupo que consiste de I, L, nL (norleucina); 6 B é um aminoácido seleccionado de entre o grupo que consiste de K, W, F, Y, ornitina; Z éS opcionalmente substituído com grupos acilo que contêm 12 a 22 átomos de carbono, respectivamente, ligados à cadeia lateral através de uma ligação éster; Ω é um aminoácido seleccionado de entre o grupo que consiste de Μ, I, L, nl ç a é um número inteiro de 1 a 19; b é um número inteiro de 1 a 19; c é um número inteiro de 1 a 21; d é um número inteiro de 0 a 20; e é 0 ou 1; f é 0 ou 1; n é 0 ou 1; m é 0 ou 1; com as seguintes condições: n + m > 0; f>e; (XaB) n (XbB) n (XCB) mXd é uma sequência que tem um máximo de 22 aminoácidos, preferencialmente 10 a 22.

Preferem-se ainda mais a utilização dos péptidos da fórmula (II) IPSSPVHLKRLKLLLLLLLLILLLILGALLQGL (II) em que: 7 Ω é um aminoácido seleccionado de entre o grupo que consiste de Μ, I, L, nL e em que a serina pode ser opcionalmente acilada, por exemplo, com palmitoilo. 0 péptido (SP-C33) descrito, na sua forma não acilada, é o mais preferido da invenção, IPSSPVHLKRLKLLLLLLLLILLLILGALLMGL (SP-C33).

Os péptidos da fórmula (I) podem ser preparados através de sintese convencional de péptidos ou através de técnicas recombinantes como as descritas na WO 00/47623.

Os péptidos acilados são preferencialmente sintetizados, fazendo reagir os péptidos com um cloreto de acilo em ácido trifluoroacético puro durante 10 horas a temperatura ambiente, sendo seguidamente temperado com 80% de etanol aquoso. A actividade dos surfactantes reconstituídos da invenção foi avaliada quanto à redução da tensão superficial quer in vitro quer in vivo. Os resultados in vivo, em especial, demonstram claramente que os surfactantes reconstituídos da presente invenção são capazes de aumentar o volume corrente - que é por sua vez um índice da capacidade expansiva do pulmão - num grau significativamente superior ao dos surfactantes obtidos com as misturas de DPPC, PG e PA utilizados habitualmente na arte anterior. O surfactante pode ser preparado misturando soluções ou suspensões de péptidos e fosfolípidos e secando subsequentemente a mistura. Se necessário, a mistura seca 8 pode ser ressuspendida, dispersada ou administrada aos indivíduos que necessitem de um tratamento para a deficiência de surfactante.

No caso de administração de aerossol, será necessário combinar pequenas partículas de surfactante com um propulsor inerte adequado. Também estão no âmbito da presente invenção outras formas de administração como a vaporização ou nebulização de soluções/suspensões estáveis de surfactante.

Os seguintes exemplos ilustram a invenção em mais pormenor.

EXEMPLOS

Parte experimental

Materiais

Utilizaram-se 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC), l-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC), l-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoglicerol (POPG), fosfatidilglicerol de ovo (PG), ácido palmítico (PA) , e sulfato de polimixina B (PxB) para preparar as seguintes misturas de lípidos e relações de peso: DPPC/PG/PA, 68:22:9; DPPC/POPG/PA, 68:22:9; DPPC/POPC/POPG, 60:20:20; DPPC/POPG/POPC/PA, 57:19:19:5; DPPC/POPC/POPG, 68:16:15 e DPPC/POPG, 68:31. 9

Sintetizou-se e purificou-se o SP-C33 como está descrito na WO 00/47623.

Preparação de surfactantes sintéticos

Misturaram-se SP-C33 e lipidos numa razão de peso péptido/lipido de 0,02:1 em clorofórmio/metanol 98:2 (v/v), evaporaram-se os solventes, e as películas de péptido/lipido resultantes foram subsequentemente hidratadas em 150 mM de NaCl através de sonicação repetida, a uma concentração lipídica de 80 ou 35 mg/ml. As amostras de surfactante utilizadas para análise no surfactómetro pulsátil de bolhas foram diluídas em soro fisiológico até se ter soluções de trabalho (10 mg/ml de surfactante). Em algumas experiências, adicionou-se PxB até uma concentração final de 2% (p/p) da concentração lipídica. O surfactante que continha SP-C33 em DPPC/PG/PA (68:22:9) forneceu suspensões muito viscosas a 80 mg/ml e foi difícil de administrar aos animais da experiência.

Administraram-se dois surfactantes naturais modificados bem conhecidos - Curosurf (Chiesi Farmaceutici) e Survanta (Abbott) - de acordo com as instruções dos fabricantes. O Curosurf foi suspenso a 80 mg/ml e administraram-se 2,5 ml/kg de peso corporal. O Survanta foi suspenso a 25 mg/ml e administrou-se 4 ml/kg de peso corporal.

Experiências de pulsáteis de bolhas

Avaliaram-se as propriedades de superfície dinâmicas dos surfactantes SP-C33 com e sem 2% de PxB (p/p) através de 10 um surfactómetro pulsátil de bolhas. Para estas experiências, suspendeu-se o surfactante em soro fisiológico numa concentração de 10 mg/ml e analisou-se a 37 °C. Testou-se a sensibilidade à inibição adicionando 40 mg/ml de albumina a suspensão de surfactante. Criou-se uma bolha que comunicava com o ar ambiente numa câmara de teste de plástico contendo aproximadamente 20 μΐ do fluido de amostra. O raio da bolha foi oscilado a uma velocidade de 40 ciclos/min. desde um máximo de 0,55 até um mínimo de 0,40 mm, correspondendo a uma compressão cíclica de superfície de 50%. Registaram-se os valores da tensão superficial nos tamanhos de bolha mínimos e máximos (Ymin, Ymax) ao longo de pulsações de 5 min.

Experiências in vivo

As misturas de surfactante foram testadas em coelhos recém-nascidos prematuros, obtidos através de histerectomia com a idade gestacional de 27 dias (termo: 31 dias) . Os animais foram traqueostomizados à nascença, mantidos em caixas de pletismógrafo a 37 °C e ventilados com oxigénio a 100% com uma frequência de 40 ventilações/min. e um tempo inspiratório de 50%. Os animais tratados receberam 2,5 ml/kg ou 4 ml/kg da preparação de surfactante acima referida através de uma cânula traqueal. Utilizaram-se como controlos coelhos da mesma ninhada que não receberam nenhuma preparação de surfactante. Após a instilação do surfactante, aumentou-se, em primeiro lugar, a pressão máxima até 35 cmH20 durante 1 min., para facilitar a distribuição do surfactante nos pulmões, e depois reduziu-se até 25 cmH20. 11

Ventilaram-se depois os animais com uma pressão máxima de 25 cmH20 durante 15 min., e em seguida reduziu-se a pressão até 20 cmH20 durante 5 min., depois até 15 cmH20 durante 5 min., e depois aumentou-se novamente até 25 cmH20 durante 5 min. Mediram-se os volumes correntes em intervalos de 5 min. com um pneumotacógrafo ligado a cada caixa de pletismógrafo.

No fim do período estabelecido de ventilação, sacrificaram-se os animais através da injecção intracerebral de lidocaína. Abriu-se o seu abdómen e inspeccionou-se a posição do diafragma para procurar indícios de pneumotórax.

Exemplo 1 - Actividade superficial in vitro de SP-C33 em diferentes misturas de lípidos

Avaliaram-se as propriedades de superfície dinâmicas de 2% de SP-C33 (p/p) em DPPC/PG/PA (68:22:9), DPPC/DOPC/POPG (60:20:20), DPPC/DOPC/POPG (68:16:15) e DPPC/POPG (68:31) com um surfactómetro pulsátil de bolhas que apresentava uma Ymin < 2 mN/m após pulsação de 5 min. para todas as misturas e uma Ymax < 40 mN/m para todas as misturas excepto para o SP-C33 em DPPC/PG/PA (68:22:9), cuja Ymax era de 48 mN/m.

Exemplo 2 - Efeito óptimo in vivo sem PA

Para avaliar a relevância da composição de lípidos, comparámos os efeitos in vivo do SP-C33 nas misturas de DPPC/PG/PA (68:22:9), DPPC/POPG/PA (68:22:9) e DPPC/POPG 12 (68:31). 0 SP-C33 em DPPC/POPG (68:31) demonstrou um efeito superior às outras duas misturas. Os dados apresentaram um aumento acentuado nos volumes correntes após o tratamento com SP-C33 em DPPC/POPG (68:31). Eles também demonstraram que, se o conteúdo em DPPC e lípidos ácidos for constante, a presença de PA reduz o efeito do tratamento. Confirma-se ainda um efeito negativo do PA sobre a actividade in vivo do surfactante baseado em SP-C33 através do efeito (Vc = 12 a 15 min. e Vc = 14 a 25 min.) de SP-C33 em DPPC/POPC/POPG/PA (57:19:19:5), que é ligeiramente mais baixo que o de SP-C33 em DPPC/POPC/POPG (60:20:20) .

Lisboa, 14/05/2007

Claims (10)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um surfactante reconstituído que consiste de um péptido artificial e de uma mistura de fosfolípidos, em que o péptido artificial é um análogo de SP-C com a fórmula (I) FeGfIPZZPVHLKR(XaB)n (XbB)n (XcB)mXdGALLQGL (I) em que: X é um aminoácido seleccionado de entre o grupo que consiste de I, L, nL (norleucina); B é um aminoácido seleccionado de entre o grupo que consiste de K, W, F, Y, ornitina; Z éS opcionalmente substituído com grupos acilo que contêm 12 a 22 átomos de carbono, respectivamente, ligados à cadeia lateral através de uma ligação éster; Ω é um aminoácido seleccionado de entre o grupo que consiste de Μ, I, L, nl ‘r a é um número inteiro de 1 a 19; b é um número inteiro de 1 a 19; c é um número inteiro de 1 a 21; d é um número inteiro de 0 a 20; e é 0 ou 1; f é 0 ou 1 ; n é 0 ou 1; m é 0 ou 1; com as seguintes condições: 2 η + m > 0; f > e; (XaB) n (XbB) n (XCB) mXd é uma sequência que tem um máximo de 22 aminoácidos, preferencialmente 10 a 22; e em que a mistura de fosfolipidos consiste em dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) e de um fosfolipido de palmitoiloleoilo seleccionado de entre palmitoiloleoilfosfatidilglicerol (POPG) ou uma mistura derivada com palmitoiloleoilfosfatidilcolina (POPC), em relações de peso entre 80:20 e 60:40.

2. Um surfactante reconstituído de acordo com a reivindicação 1 em que o péptido artificial é um análogo de SP-C com a fórmula (II) IPSSPVHLKRLKLLLLLLLLILLLILGALLQGL (II) em que Ω é um resíduo seleccionado de entre o grupo de M, I e nL.

3. Um surfactante reconstituído de acordo com a reivindicação 2 em que o péptido artificial é IPSSPVHLKRLKLLLLLLLLILLLILGALLMGL (SP-C33).

4. Um surfactante reconstituído de acordo com as reivindicações 1 a 3 em que o péptido artificial está em combinação com uma mistura de fosfolipidos que consiste de DPPC e POPG com umas relações de peso entre 75:25 e 65:35. 3

5. Um surfactante reconstituído de acordo com a reivindicação 4 em que o péptido artificial está em combinação com uma mistura de fosfolípidos que consiste de DPPC e POPG com uma relação de peso de 68:31.

6. Um surfactante reconstituído de acordo com as reivindicações 1 a 3 em que o péptido artificial está em combinação com uma mistura de fosfolípidos que consiste de DPPC, POPG e POPC com uma relação de peso de entre 60:20:20 e 68:15:16.

7. Um procedimento para a preparação de um surfactante reconstituído das reivindicações 1 a 6 compreendendo os passos de: i) misturar uma solução ou uma suspensão do péptido e dos fosfolípidos; e ii) secar a mistura.

8. Um surfactante reconstituído de acordo com as reivindicações 1 a 6 na forma de uma solução, dispersão, suspensão ou pó seco.

9. A utilização de um surfactante reconstituído de acordo com as reivindicações 1 a 6 na produção de um medicamento para o tratamento de doenças relacionadas com uma disfunção de surfactante pulmonar.

10. A utilização de acordo com a reivindicação 9 em que a doença é a síndroma de dificuldade respiratória (SDR). Lisboa,14/05/2007