MXPA04011369A - Mezclas lipidicas sinteticas mejoradas para la preparacion de un tensioactivo reconstituido. - Google Patents

Abstract

La invencion se relaciona con tensioactivos reconstituidos que consisten de fosfolipidos y peptidos artificiales capaces de hacer disminuir la tension superficial aire-liquido, de manera mas particular con tensioactivos reconstituidos, que comprenden mezclas fosfolipidicas especiales y peptidos artificiales los cuales son analogos de la proteina SP-C tensoactiva natural para el tratamiento del sindrome de distension respiratoria (RDS) y otras enfermedades relacionadas con disfunciones tensoactivas pulmonares.

Description

MEZCLAS LIPIDICAS SINTETICAS MEJORADAS PARA LA PREPARACION DE UN TENSIOACTIVO RECONSTITUIDO CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se relaciona con tensioactivos reconstituidos que consisten de fosfolípidos y péptidos artificiales capaces de hacer disminuir la tensión superficial en la interfase aire-líquido. En particular, la invención se relaciona con tensioactivos reconstituidos que comprenden mezclas fosfolipídicas particulares y péptidos artificiales análogos de la proteína SP-C tensoactiva natural para el tratamiento del síndrome de distensión respiratoria (RDS) y otras enfermedades relacionadas con disfunciones tensoactivas pulmonares.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Los tensioactivos pulmonares hacen disminuir la tensión superficial que surge en la interfaz aire-líquido de la pared alveolar interna, previniendo de este modo que los pulmones se colapsen al final de la expiración. La deficiencia de tensioactivo es una disfunción la cual comúnmente afecta a los infantes pretérmino y causa RDS, una enfermedad la cual puede ser tratada efectivamente con tensioactivos naturales extraídos de pulmones de animales. Los constituyentes principales de esas preparaciones REF: 160062 tensoactivas son fosfolípidos , como la 1 , 2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina comúnmente conocida como di-palmitoil -fosfatidil-colina (DPPC) , fosfatidilglicerol (PG) y proteínas hidrofóbicas tensoactivas B y C (SP-B y SP-C) . Las proteínas tensoactivas hidrofílicas SP-A y SP-D, las cuales son lecitinas colagenosas del tipo C (dependientes de Ca2+) y que se piensa actúan principalmente en el sistema de defensa del anfitrión, normalmente no son incluidas en preparaciones tensoactivas debido a los procedimientos de extracción con solventes orgánicos empleados. Las preparaciones tensoactivas naturales modificadas obtenidas de tejidos de animales son usadas en la práctica terapéutica actual. Esas preparaciones usualmente consisten de los componentes mencionados anteriormente con la excepción de proteínas hidrofílicas , las cuales son removidas tras la extracción con solventes orgánicos . Debido a las desventajas de las preparaciones tensoactivas de tejidos animales, como la complejidad de los procesos de elaboración y esterilización y la posible inducción de reacciones inmunes, se han hecho intentos por preparar tensioactivos artificiales. En el sentido estricto de la palabra, los tensioactivos artificiales son mezclas de fosfolípidos únicamente o mezclas de fosfolípidos y otros lípidos sintéticos. Los tensioactivos reconstituidos son tensioactivos artificiales agregados con proteínas hidrofóbicas que son aisladas de tejidos de animales u obtenidas a través de técnicas recombinantes- o derivados peptídicos sintéticos de esas proteínas. Las propiedades y la actividad de los tensioactivos reconstituidos dependen en gran medida no solo de los componentes de proteína/péptido, sino también de la composición de la mezcla fosfolipídica .

DESCRIPCION DE LA INVENCION Ahora se ha encontrado que la dipalmitoil fosfatidilcolina (DPPC) en mezcla con fosfolípidos de palmitoilo oleilo específicos es un vehículo ideal para los péptidos artificiales comúnmente usados en tensioactivos reconstituidos como análogos de las proteínas tensoactivas naturales SP-C y/o SP-B. En particular, se ha encontrado que los tensioactivos reconstituidos que comprenden los análogos de SP-C descritos en la WO 00/47623 en combinación con DPPC y un fosfolípido de palmitoil oleilo - preferiblemente seleccionado de palmitoil oleil fosfatidilglicerol (POPG) o una mezcla de POPG con palmitoil oleil fosfatidilcolina (POPO - en relaciones en peso que van de 80:20 a 60:40 disminuyen la tensión superficial y la viscosidad de las preparaciones obtenidas de los mismos. Contrario a lo que es reportado en la literatura, también se ha encontrado, de manera sorprendente que la adición de ácido palmítico (PA) es menos útil y, lo que es más, en algunos casos puede disminuir la actividad tensoactiva in vivo. En consecuencia, la presente invención se relaciona con mezclas que comprenden tensioactivos reconstituidos que consisten esencialmente de dipalmitoil fosfatidilcolina (DPPC) y palmitoil oleil fosfatidilglicerol (POPG) o una mezcla de los mismos con palmitoil oleil fosfatidilcolina (POPC) en relaciones en peso que van de 80:20 a 60:40 y análogos peptídicos artificiales de las proteínas tensoactivas naturales SP-C y /o SP-B. El tensioactivo de la invención está libre de ácido palmítico. La relación en peso entre la DPPC y el POPG fluctúa preferiblemente de 75:25 a 65:35, y es, de manera más preferible de 68:31. En el caso de mezclas de DPPC : POPG : POPC, los fosfolípidos son usados preferiblemente en relaciones en peso de 60:20:20 ó 68:15:16. Cualquier análogo peptídico artificial de las proteínas tensoactivas naturales SP-C y/o SP-B puede ser usado, de manera ventajosa, como aquellos descritos en las WO 89/0665.7, WO 92/22315 y WO 95/32992. Se prefiere el uso de análogos de SP-C que tengan la siguiente fórmula general (I) , siendo los aminoácidos representados con el código de una letra, FeGfIPZZPVHLKR (XaB) (XbB) n (XCB) mXdGALLQGL (I) donde : X es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de I, L, nL (norleucina) ; B es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de K, W, F, Y, ornitina; Z es S opcionalmente sustituido con grupos acilo que contienen 12-22 átomos de carbono ligados a la cadena lateral vía un enlace éster o tioéster, respectivamente; O es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de M, I, L, nL; a es un entero de 1 a 19, b es un entero de 1 a 19, c es un entero de 1 a 21, d es un entero de 0 a 20, e es 0 ó 1; f es 0 ó lj n es 0 ó 1; m es 0 ó 1; con las siguientes condiciones: - n+m>0; - f>e, - (XaB)„(XbB)n(XcB)mXd es una secuencia que tiene un máximo de 22 aminoácidos, preferiblemente de 10 a 22. De manera aún más preferida es el uso de péptidos de fórmula (II) IPSSPVHLKRLKLLLLLLLLILLLILGALLQGL (II) en donde : O es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de M, I, L, nL y donde la serina puede estar opcionalmente acilada, por ejemplo con palmitoilo. El péptido aquí reportado posteriormente (SP-C33), en la forma no acilada, es el más preferido de la invención, IPSSPVHLKRLKLLLLLLLLILLLILGALLMGL (SP-C33 ) Los péptidos de fórmula (I) pueden ser preparados por medio de la síntesis peptídica convencional o técnicas recombinantes como se describe en la WO 00/47623. Los péptidos acilados son sintetizados preferiblemente haciendo reaccionar los péptidos con un cloruro de acilo en ácido trifluoroacético puro durante 10 horas a temperatura ambiente, seguido por enfriamiento con etanol acuoso al 80%. La actividad de los tensioactivos reconstituidos de la invención en la reducción de la tensión superficial ha sido evaluada tanto in vi tro como in vivo. En particular, los resultados in vivo muestran claramente que los tensioactivos reconstituidos de la presente invención son capaces de incrementar el volumen tidal - el cual a su vez es un índice de la capacidad de expansión pulmonar - en un grado significativamente mayor que en tensioactivos obtenidos con las mezclas de DPPC, PG y PA comúnmente usadas en la técnica anterior . Los tensioactivos reconstituidos de la invención pueden comprender SP-B o polimixinas, en particular polimixina B, como los análogos de SP-B. El tensioactivo puede ser preparado mezclando soluciones o suspensiones de péptidos y fosfolípidos y secando posteriormente la mezcla. Si es necesario, la mezcla seca puede ser resuspendida, dispersada o administrada, a tales objetos que requieren un tratamiento por deficiencia de tensioactivo. En el caso de la administración en aerosol, será necesario combinar partículas tensoactivas pequeñas con un propelente inerte adecuado. Otras formas de administración, como la evaporación o nebulización de soluciones/suspensiones tensoactivas estables, también están dentro del alcance de la presente invención. Los siguientes ejemplos ilustran la invención con mayor detalle.

EJEMPLOS Sección experimental Materiales Se utilizaron 1, 2-Dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC) , 1 , -palmitoil - 2 -oleoil - sn-glicero-3 -fosfocolina (POPC) , l-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoglicerol (POPG) , fosfatidilglicerol de huevo (PG) , ácido palmítico (PA) , y sulfato de polimixina B (PxB) para preparar las siguientes mezclas y relaciones en peso de lípido: DPPC/PG/PA, 68:22:9; DPPC/POPG/PA, 68:22:9; DPPC/POPC/POPG, 60:20:20; DPPC/POPG/POPC/PA, 57:19;19:5; DPPC/POPC/POPG, 68:16:15 y DPPC/POPG, 68:31. La SP-C33 se sintetizó y se purificó como se describe en la O 00/47623.

Preparación de tensioactivos sintéticos La SP-C33 y los lípidos en relaciones en peso de péptido/lípido de 0.02:1 fueron mezclados en cloroformo/metanol 98:2 (v/v) , los solventes fueron evaporados y las películas de péptido/lípido resultante fueron hidratadas posteriormente en NaCl 150 mM por sonicación repetida, a una concentración de lípido de 80 ó 35 mg/ml. Las muestras de tensioactivos usadas para los análisis en el tensiómetro de burbuja pulsátil fueron diluidas en solución salina a las concentraciones de trabajo (10 mg/ml de tensioactivo) . En algunos experimentos se agregó PxB hasta una concentración final del 2% (p/p) de la concentración de lípido. El tensioactivo que contenía SP-C33 en DPPC/PG/PA (68:22:9) proporcionó suspensiones muy viscosas a 80 mg/ml y fue difícil de administrar a animales de experimentación.

Se administraron dos tensioactivos naturales modificados bien conocidos, Curosurf (Chiesi Farmaceutici ) y Survanta (Abbott) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. El Curosurf fue suspendido a 80 mg/ml y se administró a 2.5 ml/kg de peso corporal; el Survanta fue suspendido a 25 mg/ml y fue administrado a 4 ml/kg de peso corporal .

Experimentos de burbuja pulsátil Las propiedades superficiales dinámicas de tensioactivos de SP-C33 con y sin 2% (p/p) de PxB fueron evaluadas por medio de un tensiómetro de burbuja pulsátil. Para esos experimentos, el tensioactivo fue suspendido en solución salina a una concentración de 10 mg/ml y analizada a 37°C. La sensibilidad hacia la inhibición fue probada agregando 40 mg/ml de albúmina a la suspensión tensoactiva. Se creó una burbuja que se comunica con el aire del ambiente en una cámara de prueba de plástico que contenía aproximadamente 20 µ? del fluido de muestra. El radio de la burbuja osciló a razón de 40 ciclos/min para un máxima de 0.55 a un mínimo de 0.40 rara, correspondiente a una compresión superficial cíclica del 50%. Los valores de tensión superficial a un tamaño de burbuja mínima y máxima (?p,??, Ymax) fueron registrados sobre impulsos de 5 min.

Experimentos in vivo Las mezclas tensoactivas fueron ensayadas en conejos recién nacido prematuros, obtenidos por histerectomía a la edad de gestación de 27 días (término: 31 días) . Los animales fueron traqueotomizados al nacimiento, mantenido en cajas de pletismografía a 37°C y ventilados en paralelo con oxígeno al 100% a una frecuencia de 40 respiraciones/min y un tiempo de inspiración del 50%. Los animales tratados recibieron 2.5 ml/kg y 4 ml/kg de la preparación tensoactiva anterior a través de una cánula traqueal . Las carnadas que no recibieron ninguna preparación tensoactiva fueron usadas como controles. Después de instilar el tensioactivo, la presión pico se elevó por primera vez a 35cm de H20 por un min, para facilitar la distribución de tensioactivo en los pulmones, entonces se disminuyó a 25 cm de H20. Los animales fueron ventilados entonces con una presión pico de 25 cm de H20 durante 15 min, posteriormente la presión se bajó primero a 20 cm de H20 durante 5 min, entonces a 15 cm de H20 durante 5 min y se elevó nuevamente a 25 cm de H20 durante 5 min. Los volúmenes tidales fueron medidos a intervalos de 5 min con un pneumotacográfo conectado a cada caja pletismográfica . Al final del periodo de ventilación establecido, los animales fueron sacrificados por inyección intracerebral de lidocaina. Su abdomen fue abierto y se inspeccionó la posición del diafragma por evidencias de pneumotorax.

Ejemplo 1. Actividad superficial in vitro de SP-C33 en diferentes mezclas de lípidos Se evaluaron las propiedades superficiales dinámicas de SP-C33 al 2% (p/p) en DPPC/PG/PA (68:22:9), DPPC/POPC/POPG (60:20:20), DPPC/POPC/POPG (68:16:15) y DPPC/POPG (68:31) con un tensiometro de burbuja pulsátil, el cual mostró mín < 2 mN/m después de un impulso de 5 min para todas las mezclas y ymax < 40 mN/m para todas las mezclas excepto para SP-C33 en DPPC/PG/PA (68:22:9), cuya max fue de 48 mN/m.

Ejemplo 2. Efecto óptimo in vivo sin PA Para evaluar la relevancia de la composición lipídica, comparamos los efectos in vivo de SP-C33 en las mezclas DPPC/PG/PA (68:22:9), DPPC/POPG/PA (68:22:9) y DPPC/POPG (68:31). La SP-C33 en DPPC/POPG (68:31) mostró un efecto mayor que las otras dos mezclas. Los datos mostraron un incremento notable en los volúmenes tidales después del tratamiento con SP-C33 en DPPC/POPG (68:31). Ellas también mostraron que, si el contenido de DPPC y lípido ácido es constante, la presencia de PA reduce el efecto de tratamiento. Un efecto negativo de la PA sobre la actividad in vivo del tensioactivo basado en SP-C33 se confirmó adicionalmente por el efecto (VT=12 a 15 min e VT= 14 a 25 min) de SP-C33 en DPPC/POPC/POPG/PA (57:19:19:5) el cual es ligeramente menor que el SP-C33 en DPPC/POPC/POPG (60:20:20). Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (10)

1. REIVINDICACIONES
2. Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones. 1. Un tensioactivo reconstituido, caracterizado porque consiste de un péptido artificial y fosfolípidos donde el péptido artificial es un análogo de SP-C de fórmula (I) FeGfIPZZPVHLKR(XaB) (XbB) „ (XCB) mXdGALLQGL (I) donde : X es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de I, L, nL (norleucina) ; B es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de K, W, F, Y, ornitina; z es S opcionalmente sustituido con grupos acilo que contienen 12-22 átomos de carbono ligados a la cadena lateral vía un enlace éster; O es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de M, I, L, nL; a es un entero de 1 a 19; b es un entero de 1 a 19; c es un entero de 1 a 21; d es un entero de 0 a 20; e es 0 ó 1 ; n es O ó 1; m es O ó 1; n+m>0; f>e, y (XaB) (XbB) n (XCB) mXa es una secuencia que tiene un máximo de 22 aminoácidos, preferiblemente de 10 a 22; en combinación con dipalmitoil fosfatidilcolina (DPPC) y un fosfolípido de palmitoil oleilo seleccionado de palmitoil oleil fosfatidil glicerol (POPG) o una mezcla de los mismos con palmitoil oleil fosfatidilcolina (POPC) en relaciones en peso que van de 80:20 a 60:40. 2. El tensioactivo reconstituido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el péptido artificial es un análogo de SP-C de fórmula (II) IPSSPVHLKRLKLLLLLLLLILLLILGALLQGL (II) en donde: O es un residuo seleccionado del grupo de M, I, y, nL .
3. 3. El tensioactivo reconstituido de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el péptido artificial es IPSSPVHLKRLKLLLLLLLLILLLILGALLMGL (SP-C33)
4. 4. El tensioactivo reconstituido de conformidad con las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque el péptido artificial está en combinación con DPPC y POPG en relaciones en peso que van de 75:25 a 65:35.
5. 5. El tensioactivo reconstituido de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el péptido artificial está en combinación con DPPC y POPG en una relación en peso de 68:31.
6. 6. El tensioactivo reconstituido de conformidad con las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque el péptido artificial está en combinación con DPPC, POPG y POPC en una relación en peso de 60:20:20 a 68:15:16.
7. 7. Un proceso para preparar un tensioactivo reconstituido de conformidad con las reivindicaciones 1-6, caracterizado porque comprende los pasos de: i) mezclar una suspensión o una solución del péptido y los fosfolípidos ; y ii) secar la mezcla.
8. 8. El tensioactivo reconstituido de conformidad con las reivindicaciones 1-6, caracterizado porque está en forma de solución, dispersión, suspensión o polvo seco.
9. 9. El uso de un tensioactivo reconstituido de conformidad con las reivindicaciones 1-6 para el tratamiento de enfermedades relacionadas con una disfunción tensoactiva pulmonar.
10. 10. El uso de conformidad con la reivindicación 9, donde la enfermedad es el síndrome de distensión respiratoria (RDS) .