MXPA01008073A - Peptidos artificiales que tienen actividad de superficie y el uso de los mismos en la preparacion de tensioactivo artificial - Google Patents
Peptidos artificiales que tienen actividad de superficie y el uso de los mismos en la preparacion de tensioactivo artificialInfo
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Abstract
La presente invención describe péptidos artificiales análogos de SP-C que tienen una actividad de superficie y a su uso para la preparación de tensioactivos artificiales empleados en el tratamiento del síndrome de angustia respiratoria (RDS) y otros padecimientos relacionados con la deficiencia o disfunción del tensioactivo.
Description
PEPTIDOS ARTIFICIALES QUE TIENEN ACTIVIDAD DE SUPERFICIE Y EL USO DE LOS MISMOS EN LA PREPARACIÓN DE TENSIOACTIVO
ARTIFICIAL
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona nuevos péptidos artificiales que tienen actividad de superficie. En particular, la invención proporciona análogos de SP-C los cuales, una vez combinados con lipidos adecuados, son efectivos particularmente en la reducción de la tensión de superficie en la interfase aire-liquido. Asi, los péptidos de la invención pueden ser usados en la combinación con lipidos, y opcionalmente en combinación con SP-B o un análogo activo del mismo o un substituto de SP-B, para la preparación de tensioactivos artificiales empleados en el tratamiento de síndrome de angustia respiratoria (RDS) , otras deficiencias o disfunciones de tensioactivos, relacionadas con padecimientos pulmonares tal como neumonía, bronquitis, asma, síndrome de la aspiración del meconio y también otros padecimientos tales como otitis media serosa (oido pegajoso) .
REF: 131898 Antecedentes de la Invención La tensión de superficie reduce el tensioactivo pulmonar en la interfase aire-liquido del revestimiento alveolar, previniendo a los pulmones de colapsarse en la expiración final. La deficiencia del tensioactivo es una alteración común en infantes prematuros y causa el síndrome de angustia respiratoria (RDS) , el cual puede ser tratado eficientemente con tensioactivos naturales extraídos de pulmones de animales (Fujiwara, T. y Robertson B. (1992) In : Robertson, B., van Golden, L.M.G. y Batenburg, B. (eds) Pulmonary Surfactant: From Molecular Biology to Clinical Practice Amsterdam, Elsevier, pp . 561-592) . Los constituyentes principales de estas preparaciones de tensioactivos son fosfolipidos tales como 1, 2-dipalmitoil-si-glicero-3-fosfocolina (DPPC) , fosfatidilglicerol (PG) y las proteínas B y C del tensioactivo hidrófobo (SP-B y SP-C) . Las proteínas SP-A y SP-B del tensioactivo hidrófilo, las cuales son lectinas colagenosas de tipo C (dependiente de Ca2+) y se piensa actúan principalmente en el sistema de defensa del hospedero, no están normalmente incluidas en las preparaciones de tensioactivos debido a los procedimientos de extracción de solvente orgánico empleados . Las SP-B y SP-C constituyen solamente aproximadamente 1-2% de la masa del tensioactivo, pero son todavía, capaces de ejercer mejoramientos dramáticos en la actividad de la superficie, comparadas con las preparaciones de lipidos puras. (Curstedt, T. et al (1987) Eur. J. Biochem. 1 68, 225-262; Takahashi, A., Nemoto, T. y Fuji ara, T. (1994) Acta Paedistr. Jap. 36, 613-618) . Se han determinado las estructuras primaria y secundaria de SP-B y SP-C y una estructura terciaria de SP-C en solución (véase 4) . La SP-B está compuesta de dos cadenas de polipéptidos idénticos de 79 aminoácidos, conectada con un puente de disulfuro de intercadena (Curstedt, T. et al. (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A.
87, 2985-2989; Jahansson, J. , Curstedt, T. y Jórnvall, H.
(1991) Biochemistry 30, 6917-6921) . Cada cadena monómerica tiene tres puentes de disulfuro de intercadena y al menos cuatro hélices anfipáticas que exhiben una superficie polar y una no polar a través de la cual la SP-C puede interactuar con dos bicapas lipidas y llevarlas en proximidad cercana (Andersson; M. et al. (1995) FEBS Lett. 362, 328-332). La SP-C es una lipoproteina compuesta de 35 residuos de aminoácidos con un domino a-helicoidal entre los residuos 9-34
(Johansson, J. et al. (1994) Biochemistry 33, 6015-6023) .
La hélice se compone principalmente de residuos de valilo y se sumerge en una bicapa lipida y orientada en paralelo con las cadenas de acilo lipidas (Vandenbussche, et al.
(1992) Eur. J. Biochem. 203, 201-209) . Dos grupos palmitoilo están ligados covalentemente a residuos de cisteina en las posiciones 5 y 6 en la parte N-terminal del péptido (Curstedt, T. et al. (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 87, 2985-2989). Los dos residuos conservados cargados positivamente, arginina y lisina, en las posiciones 11 y 12, interactúan posiblemente con los grupos principales cargados negativamente de la membrana lipida, asi incrementan su rigidez. La rigidez de la interacción lipido-péptido puede ser disminuida hacia el extremo C-terminal, ya que contiene solamente residuos hidrófobos o pequeños, haciendo esta parte potencialmente más movible en una bicapa fosfolipida. La SP-C se piensa, influencia en el grosor y fluidez de los lipidos circundantes vía la hélice poli-valilo extremadamente estable (Johansson, J. y Curstedt, T. (19*97) Eur. J. Biochem. 224, 675-293) .
Estado de la Técnica A partir de que las preparaciones de tensioactivos obtenidas de tejido de animales presentan algunas desventajas, como su disponibilidad en cantidades limitadas y las posibilidades de contener agentes infecciosos e inducir reacciones inmunológicas, se han hecho intentos por crear tensioactivos artificiales (Johansson, J. Y Curstedt, T. (1997) Eur. J. Biochem. 244, 675-693; Johansson, J. Et al. (1996) Acta Paediatr. 85 642-646), usualmente de lipidos sintéticos y proteínas hidrófobas. Trabajos previos han demostrado que la SP-C sintética no puede ser enlazada como el péptido nativo en una conformación a-helicoidal necesaria para una actividad de superficie óptima (Johansson, J. Et al. (1995) Biochem. J. 307, 535-541), y por lo tanto no interactúan apropiadamente con los lipidos del tensioactivo. Consecuentemente, los análogos SP-C sintéticos no se enlazan como el péptido nativo y no interactúan apropiadamente con los lipidos tensioactivos. Para evitar este problema, se han hecho varios intentos para modificar la secuencia, por ejemplo, reemplazando todos los residuos Val helicoidales en la SP-C nativa con Leu, lo cual favorece fuertemente la conformación a-helicoidal. El análogo transmembranoso correspondiente, la SP-C (Leu) muestra buena expansión en una interfase aire-liquido cuando se combina con DPPC:PG:PA (68:22:29) (p/p/p) . Sin embargo, el valor de la tensión de superficie máxima durante la compresión de superficie cíclica (?max-) fue significativamente más alta que aquélLa del tensioactivo nativo. Además no fue posible preparar mezclas lípido-péptido de concentraciones más altas de aproximadamente 20 mg/ml, probablemente debido a la formación de oligómeros peptídicos (Nilsson, G. et al. (1998) Eur. J. Biochem. 255, 116-124) . Otros han sintetizado análogos SP-C de polileucina bioactiva de diferentes longitudes (Takei, T. et al. (1996) Biol.
Pharm. Bull. 19, 1550-1555) . En los últimos estudios no se reportaron ninguna auto-oligomerización ni problemas en la producción de muestras de concentración alta de lípido . Publicaciones diferentes se proporcionan con el problema de proporcionar análogos peptídicos de péptidos tensioactivos naturales, dando un número de soluciones diferentes. Entre estas publicaciones, 093 21225, EP 733 645, 096 17872, a nombre de Tokio Tanabe, describen análogos de péptido de la SP-C natural, los cuáles en general, difieren del péptido nativo con respecto a la secuencia de la parte N-terminal. " Las solicitudes de patente de Scripps Research Institute W089 06657 y W092 22315, describen los análogos de SP-B que tienen residuos de aminoácidos hidrófobos e hidrófilos alternativos. Entre otros, se reivindican residuos de lisina y leucina alternativos del péptido (KL4) . Clercx A. et al., Eur. J. Biochem 229, 465-72, 1995, describe péptidos de diferentes longitudes correspondientes al N-terminal de la SP-C de porcino y péptidos híbridos derivados de la SP-C de porcino y bacteriorhodospina . Johansson J. et al., Biochem. J. 307, 535:41, 1995, describe péptidos sintéticos difieren de la SP-C porcina nativa por la substitución de algunos aminoácidos . O89/04326 a nombre de California Biotechnology - Byk Gulden, y WO91/18015 a nombre de California Biotechnology - Scios Nova, describen análogos de la SP-C que contiene una secuencia N-terminal inicial en la cual los dos Cys de la SP-C natural son reemplazados por dos Ser.
Descripción de la Invención Se ha encontrado ahora que los péptidos análogos de la SP-C, los cuales combinan las siguientes características: i) substitución de residuos Val con otros residuos hidrófobos y neutrales; ii) substitución de residuos Cys con residuos Ser; iii) reemplazo de algunos de los residuos de aminoácido neutral con residuos polares o voluminosos, muestran propiedades particularmente favorables por la reducción de la tensión de superficie. En particular se ha encontrado que la última característica, en virtud de las cargas positivas conferido por los residuos polares o la obstrucción estérica conferida por los substituyentes voluminosos, permite evitar la auto-oligomerización . Como sigue, de acuerdo a un primer aspecto, la invención proporciona análogos SP-C que tienen la siguiente fórmula general (I), usando el código de aminoácido de una letra:
FeGfIPZZPVHLKR (XaB) n (XbB) „ (XCB) mXdGALLMGL (I) en donde : X es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de V, I, L, Nle (norleucina) ; B es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de Ornitina, K, I, , F, Y, Q, N; Z es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de S, C, F donde los residuos Ser o Cys están opcionalmente ligados vía enlaces de éster o tioéster con grupos acilo que contienen 12-22 átomos de carbono ligados . a es un entero de 1 a 19 b es un entero de 1 a 19 c es un entero de 1 a 21 d es un entero de 0 a 20 e es 0 o 1 f es 0 o 1 n es 0 o 1 m es 0 o 1 con las condiciones n + m > 0, f > e;
(XaB) n (XbB) n (XCB) mXd es una secuencia que tiene un máximo de 22 aminoácidos, preferiblemente de 10 a 22. Los péptidos preferidos de Fórmula (I) tienen las siguientes secuencias:
(la) FGIPSSPVHLKRX4BX4BX4BXGALLMG (Ib) FGIPSSPVHLK X5BX5BX4GALLMGL : (le) FGIPSSPVHLKRX4BX11GALLMGL (Id) FGIPSSPVHLKRX8BX7GALLMGL . (Ie)FGIPSSPVH KRX11BX4GALLMGL
Entre las secuencias (la) - (le), se prefieren aquellas que tienen B = Lys o Phe y X = Leu, lie o Nle. De acuerdo a las modalidades preferidas, los péptidos de fórmula (la) - (If) tienen las secuencias siguientes, respectivamente:
FGIPSSPVHLKRLLILKLLL KILLLKLGALLMGL [SP-C (LKS)] FGIPSSPVHLKRLLILLKLL LIKLLILGALLMGL [SP-C (LKS) ?J FGIPSSPVHLKRLLILKLLLLLILLLILGALLMGL [SP-C (LKS)2] FGIPSSPVH KR LILLLLL LI LLILGALLMG [SP-C (LKS) 3] FGIPSSPVHLKRLLILLLLLLLIKLLILGALLMGL [SP-C (LKS)4] FGIPSSPVHLKRLLILFLLLLFILLLFLGALLMGL [SP-C (LFS)] En una modalidad más preferida de la invención, los residuos Ser están covalentemente ligados con grupos acilo que contienen 12 - 22 átomos de carbono. Los péptidos de la fórmula (I) pueden ser preparados por métodos sintéticos o técnicas recombinantes . Se describen métodos sintéticos convencionales, por ejemplo, en Schroeder et al., "The peptides", vol. 1, Academic Press, 1965; Bodanszky et al., "Peptide síntesis", Intersciences Publisher, 1996; Baramy & Merrifield, "The peptides; Análisis, Síntesis, Biology", vol. 2, capitulo 1, Academic Press, 1980. Dichas técnicas incluyen síntesis de péptidos en fase sólida, en solución, métodos sintéticos de química orgánica o cualquier combinación de estos . Los péptidos S- u O- acilados, se sintetizan preferiblemente por tratamiento de los péptidos no acilados con cloruro de acilo en ácido trifluoroacético puro como se describe en Yousefi-Salakdeh et al. Biochem J 1999, 343, 557-562. Después de la síntesis y purificación, los péptidos sintéticos se caracterizan bioquímicamente y biofísicamente, como se reporta en la siguiente sección "Ejemplos".
La actividad de los péptidos de la invención en la reducción de tensión de superficie se ha evaluado en combinación con lípidos y fosfolípidos, SP-B, análogos de SP-B o substituyentes de SP-B. En particular, los péptídos se han combinados con DPPC ( 1 , 2-dipalmitoil-sn-glicerol-3-fosfocolina) /PG ( fosfatidilglicerol ) /PA (ácido palmítíco) con o sin SP-B, un análogo activo del mismo y polimixinas . Los resultados de pruebas de la actividad de superficie de burbuja de pulsación, muestran claramente que los péptidos sintéticos de acuerdo a la presente invención, disminuyen fuertemente la tensión de superficie mínima y máxima durante la compresión de superficie cíclica (?m?n y Ymax) a valores comparables con aquellos obtenidos usando tensioactivos de fuentes naturales . La adición de SP-B o análogos activos del mismo a las mezclas de péptidos/lípidos-fosfolípidos da resultados particularmente favorables. Además, se ha encontrado de manera sorprendente, que las polimixinas, en particular la polimixina B, actúan como substituyentes de SP-B y su adición da resultados comparables a aquellos alcanzados con SP-B.
De acuerdo a un segundo aspecto, la invención proporciona un tensioactivo sintético que comprende uno o más péptidos de fórmula (I), en mezcla con lípidos y/o fosfolípidos y opcionalmente SP-B, un derivado activo del mismo o polimixinas. Los lípidos/fosfolipidos adecuados pueden ser seleccionados del grupo que consiste de fosfatidilcolinas (preferiblemente DPPC) , PG, PA, triacilgliceroles, esfingomielina . En una modalidad aún más preferida de la invención, las mezclas de tensioactivos que contiene el péptido en el cual las cadenas de palmitoilo están 0-covalentemente ligadas a los residuos Ser deben ser usadas. Se ha encontrado que las mezclas de tensioactivos que contienen una forma dipalmitoilada del péptido de referencia (SP-C (Leu)), exhiben una estabilidad superior de película de superficie y tamaño incrementado del depósito lípido asociado con la superficie, comparado con mezclas que contienen el correspondiente péptído no palmitoilado, como el medido por el sistema de burbuja cautiva. En las muestras que contienen 5% de péptido dipalmitoilado, la ?min fue inferior, que 1.5 mN/m y las películas muy estables, como la superficie de tensión se incrementa menos que 0.5 mN/m dentro de 10 minutos a un volumen de burbuja constante. Por el contrario, la ?min para el péptido no palmitoilado fue de aproximadamente 5 mN/m y las películas fueron menos estables como las observadas por el frecuente tañido de burbuja en las tensiones de superficie inferiores. Sin embargo, después de la reducción de la subíase por las muestras que contienen péptidos no palmitoilados, la habilidad para alcanzar la tensión de superficie estable casi a cero se perdió después de unos cuantos pasos de adsorción, mientras que con el péptido dipalmitoilado la calidad de la película no se deteriora aún más, después que 10 pasos de expansión y la incorporación del material de depósito equivalente a más de dos monocapas . La actividad de superficie mejorada de péptidos dipalmitoilados también se demostró por el surfactómetro de burbuja de pulsación. Además, se encontró que la presencia de grupos acilo reduce además, la tendencia a formar oligómeros. Este hallazgo es muy importante, como durante la preparación de tensioactivos artificiales, la oligomerización de péptido se ha encontrado que obstaculiza la preparación de mezclas a concentraciones más altas de 20 mg/ml (Nilsson et al. Eur J Biochem 1998, 255, 116.-124).
El tensioactivo sintético puede ser preparado por soluciones mezcladas o suspensiones de péptidos y lípidos y por secado subsecuentemente de la mezcla. En tal caso, la mezcla seca puede ser suspendida, dispersada o administrada a dicho sujeto en necesidad del tratamiento por deficiencia de tensioactivo . El tensioactivo sintético podrá ser administrado preferiblemente endotraquealmente o vía aerosol. La última forma de administración requerirá la combinación de partículas pequeñas de tensioactivo con un propulsor inerte adecuado. Otras formas de administración, como nebulización o atomización de soluciones/suspensiones estables del tensioactivo, están también incluidas dentro del ámbito de la invención. De acuerdo a un aspecto adicional, la invención proporciona el uso de péptidos descritos para la preparación de un agente tensioactivo para ser usado en todos los casos de deficiencia o disfunción de tensioactivo de adultos o neonatos, padecimientos pulmonares relacionados tales como neumonía, bronquitis, asma, síndrome de aspiración del meconio y también otros padecimientos tales como otitis media cerosa (oído pegaj oso) . Típicamente, el agente tensioactivo se usará, preferiblemente después de la administración endotraqueal, en el tratamiento del síndrome de angustia respiratoria el cual afecta frecuentemente a infantes prematuros . Los siguientes ejemplos ilustran la invención en más detalle.
Ejemplo 1 Síntesis y purificación del péptido ün análogo de SP-C, SP-C (LKS) (Fig. 1) se sintetizó mediante el uso de tecnología de fase sólida gradual y la química de terc-butoxicarbonilo (Kent, S.B.H. (1988) Annu. Rev. Biochem. 57, 957-989) en un instrumento 430A de Applied Biosystems. El desdoblamiento del enlace resina-péptido y la desprotección de las cadenas laterales, se llevó a cabo en fluoruro de hidrógeno anhidro/metoxibenceno/dimetilsulfuro, 10:1:1 (v/v/v) por 1.5 horas a 0°C. Los grupos protectores y depuradores son removidos por extracción repetida con éter dietílico y el péptido se extrajo subsecuentemente a partir de la resina mediante diclorometano/ácido trifluoroacético (TFA) 3:1 (v/v) seguida por evaporación rotatoria. El extracto crudo del péptido se redisolvió a una concentración de 100 mg/ml en cloroformo/metanol 1:1 (v/v) que contiene H20 al 5%. Una alícuota de 10 mg se aplicó en una columna Sephadex LH-60 (40 X 1 cm) en el mismo solvente (Curstedt, T. et al. (1987) Eur. J. Biochem. 168, 255-262) . Se colectaron fracciones de 2.5 ml y se midieron las absorbencias a 214 y 280 nm. La identificación y cuantificación se realizó mediante análisis de aminoácido. Para acilación, el péptido purificado (típicamente aproximadamente 5 mg) se seca, disuelve en TFA destilada (100 µl) y se agrega cloruro de acilo (10-20 equivalentes comparados con el péptido) . Después de 10 minutos, la reacción se enfría rápidamente con etanol acuoso al 80% (1.9 ml ) . La purificación de los péptidos de acilo se realiza usando cromatografía sobre Lipidex 5000 en cloruro de etileno/metanol 1:4 (v/v), seguida por HPLC de fase inversa sobre una columna C18 usando un gradiente lineal de 2-pronanol/TFA al 0.1% que corre en metanol (acuoso) al 60%/TFA al 0.1% o etanol' (acuoso) al 75%/TFA al 0.1%.
Ejemplo 2 Caracterización bioquímica La pureza del péptido se verificó por electrofóresis en gel de poliacrilamida (PAGE) de dodecilsulfato de sodio (SDS) (Phast-system, Pharmacia, Suiza), y por cromatografía líquida de alta resolución de fase inversa (HPLC) , usando una columna Ci8 y un gradiente lineal de metanol acuoso al 60%/TFA al 0.1% e isopropanol/TFA al 0.1 % (Gustafsson, M. et al. (1997) Biochem. J. 326, 799-806) . Las masas moleculares se determinaron por la espectrometría de masas de ionización de tiempo de trayectoria de la desorpción de matriz asistida por láser (MALDI-TOF) (Lasermat 2000, Finnigan MAT) , calibrada con un péptido intestinal vasoactivo (Mr 3326.8). La estructura secundaria del péptido se investigó usando la espectroscopia de dicroismo circular (CD) (Jasco-720 Jasco, Japón) . Después de la solubilización con trifluoroetanol (TFE) , se registró el espectro de 260 a 184 nm con una velocidad de exploración de 20 nm/min y una resolución de 2 puntos de dato/nm. La forma elíptica molar residual se calculó y expresó en kdeg x cm2/dmol. Las formas elípticas molares a 208 y 222 nm se utilizaron para estimar el contenido de la estructura helicoidal (Barro , C.J. et al. (1992) J. Mol. Biol. 225, 1075-1093) . Las investigaciones de la estructura secundaria de SP-C (LKS) usando espectroscopia DC mostraron un espectro típico para péptidos a-helicoidales y un contenido a-helicoidal de aproximadamente 75% se estimó de 208 nm y 22 nm mínimo. La estructura secundaria permaneció estable después de la dilución en forma de pasos con H20 hasta el TFE al 12% con la condición de que el péptido se solubilize en TFE puro. La SDS-PAGE de SP-C (LKS) mostró una banda única similar a la SP-C nativa, mientras que SP-C (Leu) la cual carece de Lys en la parte helicoidal forma oligómeros. En contraste con nuestra experiencia con mezclas SP-C (Lue)_/lípidos , los cuales se dificulta solubilizar en concentraciones superiores de 20 mg/ml (Nilsson, G. et al. (1998) Eur. J. Biochem. 255, 116-124), fue posible hacer una mezcla SP-C (LKS ) /lípido con una concentración lípida de 80 mg/ml y una relación de polipéptido/lípido de 0.03.
Ejemplo 3 Preparación de mezclas de péptidos/lipidos DPC, PG y PA se adquirieron todas de Sigma Chemical Co. (San Luis, MO) . Los lípidos se disolvieron en cloroformo/metanol 98:2) (v/v), se mezclaron en las proporciones DPPC:PG:PA 68:22:9 (p/p/p) o DPPC/PG 7:3 (p/p/) . Las preparaciones de tensioactivo se prepararon por la adición de SP-C (LKS) solo o SP-C (LKS) y SP-B a cada una de las mezclas de lípidos, a proporciones de peso de polipéptido/lípido total de 0—0.05. Las mezclas se evaporaron bajo nitrógeno y se resuspendieron en 150 mmol/NaCl 1 o en amortiguador 10 mmol/Hepes 1, pH 6.9, que contiene 140 mmol/NaCl 1 y 2.0 mmol/CaCl2 1, a concentraciones de lípidos de 10-80 mg/ml. El _ congelamiento repetido y la sonicación (50 W, 48 kHz) se realizó hasta que se lograron las suspensiones homogéneas. En algunos casos, las suspensiones finales se incubaron a 45°C por 1 hora. Las preparaciones de tensioactivo suspendidas en 150 mmol/NaCl 1 tienen un pH de 3.5-5.5. Los valores de pH inferiores 3.5-4.5 se observaron en las preparaciones que contienen SP-B. Puesto que el SP-B nativo se purificó usando solventes orgánicos acidificados (Curstedt, T. et al. (1987) Eur. J. Biochem. 168, 255-262), pequeñas cantidades de ácido permanecían en las preparaciones. Se obtuvo el pH casi fisiológico mediante la suspensión de la preparación del tensioactivo en amortiguador Hepes a pH 6.9, que contiene 140 mmol/NaCl 1 y 2 mmol/CaCl2 1 (Tabla 1) . Comparado con las preparaciones correspondientes en salina no amortiguada no hubo cambios de ?ma? o ?m?n cuando DPPC/PG 7:3 (p/p) se usó como la mezcla de lípido. Sin embargo, cuando PA se incluyó en la mezcla del lípido, tanto ?max como ?m?n se incrementaron al pH superior (Tablas 1 y 2) .
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Tabla 1. Propiedades de superficie de preparaciones de tensioactivo artificial en solución salina fisiológica Las mediciones se llevaron a cabo directamente después de la preparación de las muestras o después de la incubación por 1 hora a 45CC. La concentración de fosfolípidos fue de lO g/ l en NaCl 150 mmol/1. Los registros se obtuvieron a diferentes periodos de tiempo con un surfactómetro de burbuja de pulsación a 37°C, compresión de superficie al 50% y a una velocidad de 40 ciclos por minuto. Los valores son la media (desviación estándar) de 3-5 mediciones. Las abreviaciones se definen en el texto.
Preparación de Tensioactivo Tensión de Superficie (mN/m) SP-C SP-B Temperatura de 7.5 s 1 min 5 min (LKS) Fosfoiipidos Incubación (% P / P ) (%p / P ) Tmln Ymax Ymln Ymax Ymln Ytnut IV)
3 - DPPC/PG/ PA <1 41(1) <1 41(1) <1 41(0) 3 DPPC/PG/PA 45*C <1 41(1) < 1 41(1) < 1 41(1) 3 2 DPPC/PG/PA <1 33(2) < 1 33(2) < 1 33(2) 3 2 DPPC/PG/PA 45**C <1 34(1) <1 34(2) <1 25(2) 3 - DPPC/PG 12 39(5) 14(4) 42(4) 9(5) 42(2) 3 DPPC/PG 45*C 8(3) 35(5) 9(3) 39(5) 6(4) 42(3) 3 2 DPPC/PG 2(1) 31(1) 2(1) 31(3) 2(1) 33(1) 3 2 DPPC/PG 45'C 3(3) 29(3) 1(1) 33(2) 1(0) 36(1) 3 1 DPPC/PG <1 24(4) 1(2) 26(4) <1 31(1) 3 0.5 DPPC/PG 45*C 4(2) 29(1) 4(3) 29(2) 3(1) 34(2)
ro H o Lp o L?
Tabla 2: Propiedades de Tensioactivo de las preparaciones de tensioactivo artificial en solución de sal amortiguada Se llevaron a cabo mediciones en muestras que contienen fosfolípidos en la concentración de lOmg/ml en amortiguador Hepes (pH 6.9), a su vez que contienen 140 mmol/1 de NaCl y 2.0 mmol/1 de CaCl2. Los registros se obtuvieron a diferentes periodos de tiempo con un surfactómetro de burbuja de pulsación a 37°C, compresión de superficie al 50% y a una velocidad de 40 ciclos por minuto. Los valores son la media (desviación estándar) de 3-5 mediciones. Las abreviaciones se definen en el texto.
ro ? Preparación de tensioactivo Tensión de superficie (mN/m)
SP-C (LKS) SP-B Fosfoüpidos 7.5 á 1 min 5 min (% P / P) (% P / P) Ymln Yraax Ymin Ym-uc Ymin ?m«?
. 3 DPPC/PG/PA 4(1) 44(2) 5(2) 47(2) 7(2) 50(1) 3 2 DPPC/PG/PA 3(3) 38(3) 4(4) 40(2) 3(3) 44(2) 3 DPPC/PG 15(3) 16(2) 42(3) 13(3) 44(3) 3 2 DPPC/PG 39(4) 1(1) 29(3) < 1 35(1) 2(2) 26(3)
Ejemplo 4 Preparación de mezclas de fosfolípidos con SP-C (LKS) y polimixina B. DPPC, y PG se adquirieron todas de Sigma Chemical Co. (San Luis, MO) . Los fosfolípidos disueltos en cloroformo/metanol 98:2) (v/v), se mezclaron en las proporciones DPPC/PG 7:3 (p/p) 7:3. SP-C(LKS) se agregó a las mezclas de fosfolípidos, a una proporción de peso de polipéptido/fosfolípido total de 0.03. Las mezclas se evaporaron bajo nitrógeno y se resuspendieron a temperatura ambiente en amortiguador 10 mmol/Hepes 1, pH 6.9, que contiene 140 mmol/NaCl 1 y 2.0 mmol/CaCl2 1, o en el mismo amortiguador que contiene polimixina B (PxB) al 0.01% (Sigma Chemical Co . , St. Louis, MO) . El congelamiento repetido y la sonicación (50 , 48 kHz) se realizaron hasta que se lograron las suspensiones homogéneas. La concentración final de fosfolípidos para ambas preparaciones fue de 10 mg/ml. La adición de PxB disminuye tanto para ?m?n como para ?ma? y se obtiene la actividad de superficie óptima (Tabla 3) .
O L? L?
Tabla 3. Propiedades de superficie de tensioactivo artificial con y sin polimixina B Se obtuvieron los registros a diferentes periodos de tiempo con un surfactómetro de burbuja de pulsación a 37°C, compresión de superficie al 50% y a una velocidad de 40 ciclos por minuto. Los valores son la media (SD) de 5-11 mediciones. Las abreviaciones se definen en el texto.
Lp
Ejemplo 5 Caracterización biofísica Se midieron los cinéticos de expansión de superficie a aproximadamente 34-37 °C con un balance de superficie Wilhelmy (Biegler, Viena, Austria) . La tensión de superficie se monitoreó por 10 minutos usando una placa de platino conectada a una galga de tensión e insertada 1 mm dentro de una biofase de 20 ml de 150 mmol/NaCl 1 en un conducto de teflón. Las suspensiones se agregaron como gotitas, totalmente 1 mg de lípidos en la hipofase 4cm de la placa de platino. Las mediciones de los cinéticos de SP-C (LKS) al 3% en peso en DPPC/PG, 7:3 (p/p), usando el balance Wilhelmy mostraron una rápida expansión con una tensión de superficie de 28 nN/m después de 3 s (Fig. 2) . La expansión fue un poco más lenta usando SPC-(LKS) al 1% en peso en la misma mezcla de lípido (datos no mostrados) . La adición de SP-B al 2% en peso no cambió significantemente la velocidad de expansión o equilibrio de la tensión de superficie (Fig. 2) . No se observaron mejoramientos después de la incubación de la mezcla por 1 hora a 45°C (datos no mostrados) . Se- obtuvieron resultados similares con DPPC:PG:PA, 68:22:9 (p/p/p) como la mezcla de lípido (dato no mostrado) . La tensión dinámica de superficie se registró usando un surfactómetro de burbuja de pulsación (Surfactometer International, Toronto, Canadá) a 37 °C durante una compresión cíclica al 50% de la superficie de burbuja y a una frecuencia de 40 ciclos por minuto. Todas las mediciones se realizaron por 5 minutos y a una concentración lípida de 10 mg/ml. Los gradientes de presión a través de la pared de la burbuja que se midieron a intervalos de tiempo específico se midieron y usaron para calcular las tensiones de superficie a tamaños de burbujas mínimos (?min) y máximos (?max) • En el surfactómetro de burbuja de pulsación SP-C(LKS) al 3% en peso en DPPC:PG:PA, 68:22:9 (p/p/p), produce una tensión de superficie de menos de 1 nN/m a un radio de burbuja mínimo (?mj.n) mientras se observó un ?min de 9-14 mN/m con SP-C (LKS) al 3% en peso en DPPC:PG, 7:3
(p/p) (Tabla 1). La tensión de superficie al radio de burbuja mínimo (?max) fue de aproximadamente 40 mN/m en ambos casos. La adición de SP-B al 2% en peso dio valores Ymax de 31-33 mN/m y ?min de 0-2 mN/m para ambas preparaciones lípidas. Estos valores son muy similares a aquellos obtenidos con las preparaciones de tensioactivos aislados a partir de fuentes naturales (Robertson, B. et al. (1990) Prog. Respir. Res. 25, 237-246) . La incubación de las preparaciones a 45°C por 1 hora no tuvo efecto significante en la actividad de la superficie (Tabla 1). Disminuyendo la cantidad de SP-B a 0.5% en peso en SP-C(LKS) al 3% en peso en DPPC:PG 7:3 (p/p) tiende a incrementar el ?min aunque los resultados no alcancen significancia estadística (Tabla 1). En contraste con SP-B, la adición de KL4 al 2% en peso (Cochrane, C.G. y Revak, S.D. (1991) Science 254, 566-568) a SP-C(LKS) al 3% en peso en DPPC:PG:PA 68:22:9 (p/p) no reduce el ?max, el cual permanece relativamente alto a 41-42 mN/m.
Ejemplo 6 Comparación entre mezclas que contienen péptidos de referencia dipamitoilados y no palmitoilados Las preparaciones de tensioactivos que se prepararon por la adición de SP-C (Leu) al 3% p/p o SP-C(Leu) dipalmitoilado a cada una de las mezclas de lípidos, se elaboraron de DPPC/PG/PA 68:22:9 p/p/p. Las mezclas se evaporaron bajo nitrógeno y se resuspendieron en 150 mmol/NaCl 1 a concentraciones lípidas de 10 mg/ml.
En las muestras en las cuales también se usó un substituyente SP-B, se agregó 1% en p/p de polimixina B. Las mezclas que contienen SP-C (Leu) dipalmitoilado, con o sin polimixina B_, presentaron un mejoramiento significante especialmente en la reducción
de ?ma? a 5 minutos y ?m?n a intervalos de tiempo más tempranos .
Tabla 4 : Propiedades de Superficie La tensión de superficie de las mezclas se obtuvo con un surfactómetro de burbuja de pulsación. Después de dos minutos de equilibrio, se obtuvieron los registros a diferentes periodos a 37°C, 50% de compresión de superficie y a una velocidad de 40 ciclos por minuto.
Preparación de tensioactivo Tensión de superficie (mN/m) SP- SP-C (Leu) PxB 7. 5 s 1 min 5 min C(Leu) (% dipalm. (%en Ymir Ymax Ymm Ymax Ymir Yma? en peso) (% en peso) peso) 1 11 39 6.2 39 2 42 1 1 3 37 3 38 0 40 1 - 1 34 1 35 1 36 1 1 0 29 0 34 0 35 Ejemplo 7 Determinación In vivo El efecto de la terapia de tensioactivo en las propiedades mecánicas de los pulmones inmaduros se evaluó en 9 conejos recién nacidos a pretérmino con una edad gestacional de 27 días. Los animales se traqueotomizaron al nacimiento y cinco de ellos recibieron, vía la cánula traqueal, dos veces 2.5 ml/kg de tensioactivo artificial que contiene DPPC, PG, y SP-C (LKS), con o sin polimixina B, en las proporciones dadas arriba. La concentración total de fosfolípidos del material tensioactivo exógeno fue de 40 mg/ml. Dos animales que sirven como control negativo no recibieron material de control vía el tubo traqueal y los otros dos que sirvieron como controles positivos se trataron con la misma dosis de tensioactivo natural modificado (Curosurf, Chiesi Farmaceutici Spa, Parma, Italy) , diluido a 40 mg/ml. Un animal se trató con una mezcla de DPPC y PG en salina (mismas concentraciones como arriba) a una dosis de 2.5 ml/kg. Todos los animales se mantuvieron en cajas de pletismógrafo corporal a una temperatura de 37°C y se ventilaron en paralelo por 60 minutos con oxígeno al 100%, usando un Ventilador Servo 900B (Siemens-Elema, Solna, Suiza), colocados a una frecuencia de 40 minutos y un tiempo de inspiración al 50%. Los volúmenes totales de la respiración se midieron con un neumotaquígrafo conectados a cada caja pletismógrafa . Los animales se ventilaron con un volumen total de respiración estandarizado de 8-10 ml/kg y sin una presión espiratoria final positiva (PEEP) . Se definió la condescendencia al tórax-pulmón como la proporción entre el volumen total de la respiración y la presión inspiratoria pico, y se expresó como ml/cm H20 kg . En comparación con el animal de control no tratado, la condescendencia se mejoró significantemente en animales tratados con el tensioactivo artificial, especialmente en el animal que recibió tensioactivo que contiene polimixina B. Notablemente, el mejoramiento parece ser superior a aquel visto después del tratamiento con una dosis similar de tensioactivo natural modificado (Fig. 3) .
Breve Descripción de las Figuras Fig. 1 Secuencias de aminoácidos y presentaciones de giros helicoidales de SP-C y sus análogos La secuencia de SP-C humana se tomó de Johansson, J. et al. (1998) FEBS Lett. 232, 61-64, y aquella de SP-C(Leu) de Nilsson, G., et al. (1998) Eur. J. Biochem. 255, 116-124). SP-C(LKS) se basa en la estructura primaria de SP-C pero todos los residuos Val a las posiciones 16-28 con la excepción de la posición 17, se reemplazaron con los residuos Leu, los residuos Lys se han introducido en las posiciones 17, 22 y 27, y Cys palmitoilado en las posiciones 5 y 6 se reemplazaron con Ser.
Fig. 2 Expansión de superficie de las preparaciones de tensioactivos sintéticos Los cinéticos expandidos de SP-C (LKS) al 3% en peso (cuadrados llenos, línea sólida) y de SP-C (LKS) al 3% en peso con la adición de SP-B al 2% en peso (triángulos abiertos, líneas punteadas) . Todas las preparaciones se examinaron a una concentración de 10 mg/ml de DPPC/PG, 7:3 (p/p) en 150 mmol/NaCl 1. Se obtuvieron los registros con un balance Wilhelmy y cada punto de dato es la media de los tres diferentes registros .
Fig. 3. Resultados in vivo La condescendencia de pulmón-tórax en 5 conejos recién nacidos prematuros (edad gestacional de 27 días) se ventiló con un volumen total de respiración estandarizado de 8-10 ml/kg y sin una presión espiratoria final positiva (PEEP) . La condescendencia se mejoró significantemente en animales tratados. La adición de polimixina B (PxB) parece incrementar el efecto del tensioactivo artificial. La concentración de fosfolípidos es la misma en todas las preparaciones de tensioactivos, es decir, 40 mg/ml.
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro a partir de la presente descripción de la invención.
LISTADO DE SECUENCIA <110> Chiesi Fapnaceutlci apa
<120> Péptidos artificiales que tienen actividad de superficie y el uso de los mismos en la preparación de tensioactivo artificial
<130> chiesi
<140> <141>
<150> MI99A000275 <1S1> 1999-02-12
<160> 6 <170> Patentln Ver. 2.1
<210> 1 <211> 35 <212> PRT <213 > Secuencia Artificial
<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: péptidos sintéticos
<400> 1 Phe Gly He Pro Ser Ser Pro Val His Leu Lys Arg Leu Leu He Leu 1 5 10 15
Lys Leu Leu Leu Leu Lys He Leu Leu Leu Lys Leu Gly Ala Leu Leu 20 25 30
Met Gly Leu 35
<210> 2 <211> 35 <212» PRT <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: péptidos sintéticos <400> 2 Phe Gly íle Pro Ser Ser Pro Val' His Leu Lys Arg Leu Leu He Leu 1 S 10 15
Leu Lys Leu Leu Leu Leu He Lys Leu Leu He Leu Gly Ala Leu Leu 20 25 30
Met Gly Leu 35
<210> 3 <211> 35 <212> PRT <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: péptidos sintéticos
<400> 3 Phe Gly He Pro Ser Ser Pro Val His' Leu Lys Arg Leu Leu He Leu 1 5 10 15
Lys Leu Leu Leu Leu Leu He Leu Leu Leu He Leu Gly Ala Leu Leu 20 25 30
Met Gly Leu 35
<210> 4 <211> 35 <212> PRT <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: péptidos sintéticos
<400> 4 Phe Gly He Pro Ser Ser Pro Val His Leu Lyß Arg Leu Leu He Leu 1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Lya Leu He Leu Leu Leu He Leu Gly Ala Leu Leu 20 25 30 Met Gly Leu <210> 5 <211> 35 <212> PRT <213 > Secuencia Artificial
<220> «223 > Descripción de la Secuencia Artificial: péptidos sintéticos
<400> 5 Phe Gly He Pro Ser Ser- Pro Val His Leu Lys Arg' Leu Leu He Leu 1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Leu Leu He Lys Leu Leu He Leu* Gly Ala Leu Leu 20 25 30
Met Gly Leu 35
<210> 6 <211> 35 <212> PRT < 13> Secuencia Artificial
<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: péptidos sintéticos
<400> 6 Phe Gly He Pro Ser Ser Pro Val His" Leu Lys Arg Leu Leu He Leu 1 5 10 15
Phe Leu Leu Leu Leu Phe Il-e Leu Leu Leu Phe Leu Gly Alá Leu Leu 20 25 30
Met Gly Leu 35
Claims (16)
1. Análogos SP-C que tienen la fórmula general (I), de conformidad con un código de aminoácido de una letra : FeGfIPZZPVHLKR(XaB)n(XbB)n(XcB)mXdGALLMGL (I) caracterizados porque: X es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de I, L, Nle (norleucina); B es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de ornitina, K, W, F, Y, ornitina; Z es S y puede estar opcionalmente ligado vía enlaces éster o tioéster con un grupo acilo que contiene 12-22 átomos de carbono. a es un entero de 1 a 19 es un entero de 1 a 19 es un entero de 1 a 21 d es un entero de 0 a 20 es 0 o 1 ; es 0 o 1; n es 0 o 1 ; m es O o 1, con las siguientes condiciones: - n + m > 0, - f > e; - (XaB) n (XbB) n (XCB) mXd es una secuencia que tiene un máximo de 22 aminoácidos, preferiblemente de 10 a 22 aminoácidos .
2. Análogos SP-C de conformidad con la reivindicación 1, caracterizados porque tienen la fórmula (la) : (la) FGIPSSPVHLKRX4BX4BX4BXGALLMGL
3. Análogos SP-C de conformidad con la reivindicación 1, caracterizados porque tienen la fórmula (Ib) : (Ib) FGIPSSPVHLKRX5BX5BX4GALLMGL
4. Análogos SP-C de conformidad con la reivindicación 1, caracterizados porque tienen la fórmula (le) : (le) FGIPSSPVHLKRX4BXnGALLMGL
5. Análogos SP-C de conformidad con la reivindicación 1, caracterizados porque tienen la fórmula (Id): (Id) FGIPSSPVHLKRX8BX7GALLMGL
6. Análogos SP-C de conformidad con la reivindicación 1, caracterizados porque tienen la fórmula (le) : (le) FGIPSSPVHLKRXnBX4GALLMGL
7. Análogos SP-C de conformidad con las reivindicaciones 1-6, caracterizados porque los residuos Ser se someten a acilación preferiblemente con grupos palmitoilo .
8. Análogos SP-C de conformidad con las reivindicaciones 1-7, caracterizados porque B es Lisina o Fenilalanina y X es Leucina, Isoleucina o Norleucina.
9. Análogos SP-C de conformidad con la reivindicación 8, caracterizados porque se seleccionan del grupo que consiste de: FGIPSSPVHLKRLLILKLLLLKILLLKLGALLMGL [SP-C (LKS)] FGIPSSPVHLKRLLILLKLLLLIKLLILGALLMGL [SP-C (LKS)?) FGIPSSPVHLKRLLILKLLLLLILLLILGALLMGL [SP-C (LKS)2] FGIPSSPVHLKRLLILLLLLKLILLLILGALLMGL [SP-C (LKS)3] FGIPSSPVHLKRLLILLLLLLLIKLLILGALLMGL [SP-C (LKS)4] FGIPSSPVHLKRLLILFLLLLFILLLFLGALLMGL [SP-C (LFS)]
10. Un tensioactivo sintético, caracterizado porque comprende al menos un análogo SP-C de la fórmula (I) en mezcla con lípidos y fosfolípidos.
11. ün tensioactivo sintético de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la mezcla de lípidos/fosfolípidos comprende EEPG, PG, PA.
12. Un tensioactivo sintético de conformidad con las reivindicaciones 10-11, caracterizado porque además comprende SP-B o un derivado activo del mismo o una polimixina.
13. Un tensioactivo sintético de conformidad con las reivindicaciones 10-12, caracterizado porque está en la forma de solución, dispersión, suspensión, polvo seco .
14. Uso de los análogos SP-C de las reivindicaciones 1-7 para la preparación de un tensioactivo sintético para ser usado en todas las clases de deficiencias de tensioactivos.
15. Uso de una polimixina, preferiblemente polimixina B para la preparación de un tensioactivo artificial de conformidad con las reivindicaciones 10-13, para el tratamiento de todas las clases de deficiencias o disfunciones de tensioactivos, o de otitis media serosa (oído pegajoso) .
16. Uso de conformidad con las reivindicaciones 14 y 15, en la cual la deficiencia del tensioactivo es el síndrome de angustia respiratoria.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
MIMI99A000275 | 1999-02-12 |
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