ES2357888T3

ES2357888T3 - Procedimiento para renaturaliación de proteínas recombinantes que contienen disulfuro a altas concentraciones proteicas en prresencia de aminas.

Info

Publication number: ES2357888T3
Application number: ES02774777T
Authority: ES
Inventors: Jörg Peters; Torsten Minuth
Original assignee: Bayer Schering Pharma AG
Current assignee: Bayer Pharma AG
Priority date: 2001-11-22
Filing date: 2002-11-12
Publication date: 2011-05-03
Anticipated expiration: 2022-11-12
Also published as: PT1453858E; KR100944845B1; US20050014933A1; ATE495191T1; JP4348188B2; KR20050058243A; WO2003044055A1; EP1453858A1; EP1314739A1; JP2005510217A; AU2002340510A1; US7893210B2; DK1453858T3; CY1112209T1; DE60238938D1; EP1453858B1

Abstract

Un procedimiento para renaturalización de Interleucina 4 o una muteína de interleucina 4 a concentraciones proteicas de 250 a 1000 [mg/l] que comprende añadir a una solución de proteínas desnaturalizadas, químicamente modificadas o reducidas un tampón que contenga L-Cisteína y Tris-(hidroximetil)-aminometano/H2SO4 en una concentración de 1 a 3 mol/I o trietanolamina/H2 SO4 en una concentración de 0,5 a 2 moles/I.

Description

Campo de la invención

La invención se refiere a un procedimiento para la renaturalización de proteínas eucarióticas, recombinantes, que contienen enlaces disulfuro después de expresión en procariotas.

Antecedentes y técnica anterior

En el caso de la producción de proteínas recombinantes en sistemas de expresión heterólogos como por ejemplo Escherichia coli, estas proteínas a menudo forman agregados insolubles, inactivos (denominados "cuerpos retractiles" o "cuerpos de inclusión"). Adicionalmente, estos cuerpos de inclusión están contaminados por componentes de las células huésped como proteínas, ácidos nucleicos, endotoxinas y contaminantes de peso molecular bajo de las células huésped. Se asume que la formación de estos cuerpos de inclusión es un resultado de la concentración local muy alta de la proteína heteróloga en la célula durante la inducción y biosíntesis de proteínas. Sin embargo, la secuencia de aminoácidos primaria de la proteína heteróloga en cuestión es también de gran importancia así como la presencia de residuos de cisteína que forman enlaces disulfuro covalentes durante el replegamiento oxidativo. Antes de que estas proteínas objetivo se puedan usar, por ejemplo, para propósitos terapéuticos, los cuerpos de inclusión han de purificarse y, posteriormente, la estructura tridimensional tiene que estar renaturalizada para convertir la proteína a la conformación biológicamente activa.

Una secuencia comúnmente aplicada de etapas de procedimiento implica, primero, la solubilización de los cuerpos de inclusión mediante la adición de altas concentraciones de agentes desnaturalizantes caotrópicos (por ejemplo clorhidrato de guanidinio o urea), o mediante la adición de agentes fuertemente ácidos como, por ejemplo, mezclas de glicina/ácido fosfórico. De forma concurrente, los enlaces disulfuro intramoleculares presentes en los cuerpos de inclusión puede bien reducirse químicamente o bien escindirse mediante el así llamado procedimiento de sulfitolisis que involucra sulfito y un agente oxidante. En segundo lugar, la mezcla de proteína solubilizada puede purificarse adicionalmente bien por medios cromatográficos o bien por procedimientos de filtración, ambos de los cuales son procedimientos bien conocidos para aquellos expertos en la técnica.

Subsiguientemente, la solución de proteína monomérica linealizada en presencia de altas concentraciones de agente caotrópico se dliluye altamente con el fin de tener en cuenta la formación de la forma biológicamente activa. Esto se puede llevar a cabo bien rápidamente (mediante dilución simple en un gran volumen de tampón de replegamiento) o bien lentamente por diafiItration o por diálisis frente al tampón de replegamiento. Otras técnicas descritas en la bibliografía implican la adsorción de la proteína objetivo en una resina cromatográfica y posteriormente, implican disminuir la concentración de agente caotrópico permitiendo que el replegamiento tenga lugar, o que tenga lugar cromatografía de exclusión por tamaño con el fin de separar las cadenas de la proteína eludiendo de este modo la tendencia a formar agregados. En cada caso, la concentración de la sal caotrópica tiene que disminuirse por debajo de un cierto límite, que es dependiente de la proteína objetivo, por ejemplo usualmente por debajo de clorhidrato de guanidinio 0,5 M.

D2 describe un procedimiento para la purificación de interleucina-4 humana expresada en E. coli que comprende la etapa de replegar la proteína desnaturalizada diluyendo su solución en un tampón de TRIS que comprende adicionalmente glutation.

La reacción secundaria principal durante el replegamiento es la formación de agregados insolubles, que es dependiente de la concentración local de intermedios de plegamiento. En la bibliografía, se describe un amplio intervalo de coadyuvantes de plegamiento, que suprimen de forma efectiva esta formación de agregados de proteínas insolubles, como por ejemplo proteínas chaperonas, otros tipos de proteínas (por ejemplo seroalbúmina bovina), y varios tipos de materiales no proteicos, incluyendo azúcares y azúcares cíclicos, alcoholes de cadena corta como por ejemplo glicerol, pentanol, hexanol, sustratos enzimáticos, polímeros sintéticos, detergentes y sales caotrópicas (de Bemárdez Clark, E (1998): Curr. Opinion Biotechnol. 9: 157-163 y citas en el mismo; Li Lie H, Schwarz E, Rudolph R (1998): Curr. Opinion Biotechnol. 9:947-501 y citas en el mismo; Sharma A, Karuppiah N (1998): patente de los Estados Unidos 5,728,804 presentada el 2 de junio de 1995). Aún otra aproximación se ha publicado recientemente donde los así llamados chaperones artificiales se usan para mantener intermedios de plegamiento hidrófobo en solución (Gellman S, Rozema DB (1996): patente de los Estados Unidos 5,563,057 presentada el 31 de octubre de 1994). En una primera etapa, los intermedios de plegamientos hidrófobos están atrapados en micelas detergentes conduciendo a una supresión de agregación de proteínas. Los intermedios de plegamiento atrapados no pueden a veces plegarse a la conformación nativa. En una segunda etapa, un "agente retirador", como por ejemplo diferentes ciclodextrinas o dextrinas lineales, se añaden en exceso molar considerable al eliminar el detergente dejando que la proteína se repliegue en su conformación biológicamente activa. Existen varias desventajas para este enfoque como 1. Gran exceso molar del caro "agente retirador", 2. Agregación proteica que tiene lugar durante la fase "retiradora", 3. Dificultad para eliminar detergente residual unido a la proteína diana, 4. Limitaciones en capacidad proteica y solubilidad de ciclodextrinas y 5. Sensibilidad del sistema de chaperonas artificial con respecto a variaciones en el procedimiento (solidez limitada). Además, los sistemas de chaperonas artificiales son específicos con respecto a la proteína objetivo, el tipo de detergente y el "agente retirador" y las condiciones experimentales empleadas. Por lo tanto, no hay sistema de chaperonas artificial genérico disponible (Daugherty DL, Rozema D, Hanson PE, Gellman SH (1998): J. Biol. Chem. 273: 33961-33971; Rozema D, Gellman SH (1996): J. Biol. Chem. 271: 3478-3487).

La mayoría de los supresores de agregación mencionados sólo trabajan con un número limitado de proteínas. Una ex cepción es el aminoácido L-arginina, que se muestra para ser generalmente aplicable a un amplio intervalo de proteínas diferentes como por ejemplo t-PA, fragmentos Fab, lisozima y otras enzimas (Rudolph R, Fischer S, Mattes R (1997): Process for the activating of gene-technologically produced, heterologous, disulfide bridge-containing eukaryotic proteins after expression in prokaryotes. Patente de los Estados Unidos 5,593,865; Rudolph R, Fischer S, Mattes R (1995): Process for the activation of T-PA or ING after genetic expression in prokaryotes. Patente de los Estados Unidos 5,453,363; de Bernárdez Clark, E (1998): Curr. Opinion Biotechnol. 9: 157-163 y citas en éstas).

L-arginina estuvo mostrando ser efectiva para un número de proteínas sólo en alto exceso molar con respecto a la molaridad de la proteína a replegarse. El mecanismo por el que L-arginina suprime la formación de agregados de proteína aún es desconocido (Lilie H y col.(1998): Curr. Opinion Biotechnol. 9: 497-501). Además, L-arginina es un producto químico bueno quiral, caro.

Así, existe todavía una necesidad de desarrollar estrategias para replegamiento de proteínas usando técnicas convencionales. A partir del estado de la técnica, no se conoce ningún supresor de agregación químicamente simple y barato generalmente utilizable, que se pueda aplicar en un procedimiento de replegamiento de proteínas comercialmente atractivo a concentraciones altas de hasta 0,5-1 g/l.

Sumario de la invención

Comenzando a partir de agregados de proteína insoluble (denominados cuerpos de inclusión) según se obtienen por sobreexpresión en Escherichia coli, es la tarea de la presente invención hacer disponible una vía comercialmente atractiva para la renaturalización de proteínas, es decir lnterleucina-4 y sus derivados, a altas concentraciones proteicas empleando un supresor de agregación adecuado, químicamente simple y fácilmente disponible.Debido a su inespecificidad, el/los supresor(es) de agregación como se describen en la presente invención se pueden aplicar a un amplio intervalo de proteínas diferentes.

El procedimiento descrito en el presente documento comprende añadir una solución de proteínas desnaturalizadas, modificadas químicamente o de proteínas reducidas, en un tampón de replegamiento que contiene L-Cisteína y TRIS/H2SO 4 o trietanolamina/H2SO4.

En una realización preferida, el tampón de replegamiento contiene otro potenciador como, por ejemplo iones adicionales, como por ejemplo cloruro, que ayudan en suprimir la formación de agregados de proteína sinérgicamente.

Se sabe para un gran número de proteínas de la técnica anterior que, para renaturalización, ciertos valores limitantes de concentración de proteína no deben excederse. El nivel de estos límites de concentración es dependiente de la naturaleza de la proteína a volver a plegar. Ahora está el reconocimiento de que cantidades comparativamente grandes de proteínas desnaturalizadas no requieren cantidades más grandes de volumen en solución con el fin de lograr cantidades más grandes de proteína replegada debido a la capacidad de solubilización excesivamente alta capacidad de la(s) amina(s) anteriormente mencionada(s) o una combinación de las aminas anteriormente mencionadas y otro potenciador de solubilidad.

El objetivo de la presente invención por lo tanto incluye proporcionar:

a) un procedimiento del tipo anterior según se define en la reivindicación 1 adjunta para replegar la proteína inactiva dentro de una conformación nativa suprimiendo de forma efectiva por lo tanto la formación de agregados de proteína causando pérdida de rendimiento de replegamiento y recuperación de proteína soluble;

b) un procedimiento del tipo anterior según se define en la reivindicación 1 adjunta que permite el replegamiento a altas concentraciones de proteínas; y

c) un procedimiento del tipo anterior según se define en la reivindicación 1 que se puede usar con productos químicos de materias primas no quirales baratos.

Definiciones

Como se usa en el presente documento, el término "derivado de interleucina-4" se refiere a muteínas de lnterleucina-4 humana con residuos de aminoácidos intercambiados en sitios diferentes en la cadena polipeptídica de acuerdo con Sebald, W (1992):Patente de los Estados Unidos 5,723,118 y Patente EP 613499B1 fechada el 13 de noviembre de 1992 y Domingues y col. (1999): solicitud de patente de PCT/IB00/00769.

Como se usa en el presente documento, el término BPTI se refiere a inhibidor de tripsina pancreática bovina (también llamada aprotinina).

Como se usa en el presente documento, "proteína plegada correctamente" se refiere a la proteína objetivo en su estructura nativa exhibiendo el enlace disulfuro nativo.

El "rendimiento de replegado", como se usa en el presente documento, se define como la concentración de proteína plegada correctamente, proteína objetivo no modificada (por ejemplo, [mg/l]) en la mezcla de renaturalización.

El "rendimiento de replegamiento general", como se usa en el presente documento, se define como la concentración de proteína objetivo no modificada plegada correctamente (por ejemplo, [mg/l]) dividida por la cantidad de la proteína total en la mezcla de renaturalización. El rendimiento de replegamiento general se expresa en [%].

Las expresiones "recuperación de proteína" o "recuperación de proteína soluble", como se usan en el presente documento, se refieren a la proporción de proteína soluble recuperada después de replegamiento y a la proteína total inicial. La recuperación de proteína se expresa en [%].

El término "pureza" ([%]), tal como se usa en el presente documento, se calcula sobre la base del rendimiento de replegamiento de la proteína objetivo y de la concentración de proteína soluble en la mezcla de renaturalización como se determina por RP-HPLC (véase el ejemplo 1).

El término TRIS, como se usa en el presente documento, se refiere a la sustancia tamponadora básica tris(hidroximetil)-aminometano. El término TEA, como se usa en el presente documento, se refiere a la sustancia tamponadora básica trietanolamina. El término GndHCI, como se usa en el presente documento, se refiere a la sal caotrópica clorhidrato de guanidinio.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas

El sujeto de la presente invención es un procedimiento para la reactivación de proteínas con puentes disulfuro recombinantes, después de expresión heteróloga en procariotas que conduce a cuerpos de inclusión insolubles, que son, después de purificación de estos agregados de proteínas, desnaturalizadas en altas concentraciones de una sal caotrópica adecuada, modificadas químicamente (formación de un disulfuro mixto entre grupos proteína-SH y un mercaptano adecuado o introducción de un grupo sulfito dentro de los grupos proteína-SH para formar grupos S-SO3 ), y renaturalizadas en el tampón de renaturalización, como por ejemplo cloruro, eficaces en evitar agregación de proteínas.

La producción de derivado de lnterleucina-4 recombinante que emplea organismo huésped Escherichia eolias ya se ha descrito en detalle (Apeler H, Wehlmann H (1999) Plasmids, their construction and their use in the manufacture of lnterleukin-4 and lnterleukin-4 muteins.Documento EP 10 22 339, 26-7-2000).

Procedimientos para recogida celular, ruptura celular, purificación de cuerpos de inclusión, solubilización y modificación de grupos químicos SH-se conocen bien por aquellas personas expertas en la técnica (Creighton TE (ed.) (1989): Protein Structure - A Practical Approach. IRL Press, Oxford, Nueva York, Tokio).

De la técnica anterior se conoce bien que los agentes químicos de bajo peso molecular pueden suprimir la formación de agregados durante el replegamiento. Por lo tanto, se rastreó un amplio intervalo de productos químicos con el fin de encontrar un supresor de agregación adecuado para emplearse en el procedimiento de replegamiento de derivado de lnterleucina-4, pero también otras proteínas como, por ejemplo, BPTI.

Como se indica en el ejemplo 1 (Tabla 1), un número de productos químicos ayuda de forma efectiva en la solubilización de intermedios de plegamiento que dan como resultado un incremento significativo de la recuperación de la proteína soluble. Sin embargo, esto no significa necesariamente que estos compuestos provoquen también un incremento significativo en rendimiento de isoformas de disulfuro biológicamente activas plegadas correctamente (véase columna "rendimiento de replegamiento relativo" en la Tabla 1). Por ejemplo, el detergente cloruro de trietilamonio cetílico (CTAC) solubiliza de forma efectiva intermedios de plegamiento, conduciendo a un incremento en el rendimiento de proteínas del 735% comparado con el control fosfato. Sin embargo, CTAC falla en incrementar el rendimiento de isoformas disulfuro plegadas correctamente dando como resultado un rendimiento de replegamiento bajo y una pureza baja. Varios agentes enumerados en la Tabla 1 se conocen bien de la técnica anterior por su capacidad para ayudar como supresores de agregación durante el replegamiento, como por ejemplo L-Arginina, Urea, clorhidrato de guanidio, poli(etileno)glicoles, acetamida y alcoholes de cadena corta. Sin embargo, la mayoría de estos fallaron en caso de derivado de Interleucina 4 con la excepción de L-arginina y, en un menor grado, clorhidrato de guanidinio.

El clorhidrato de guanidio solubiliza de forma eficaz intermedios de plegado de manera efectiva a concentraciones óptimas de 750 mm. Los derivados N-metilado o N-etilado y bis(-1-aminoguanidinio)-sulfato son intermedios de plegamiento más eficazmente solubilizantes a concentraciones más bajas (200-600 mM) en comparación con clorhidrato de guanidinio. Sin embargo, la pureza de la proteína replegada (18,4 a 27,1%) es mucho más baja en comparación con el fosfato control.

Sorprendentemente, el agente tampón Tris (hidroximetil)-aminometano (TRIS) en la combinación con ácido sulfúrico a altas concentraciones afectó positivamente la solubilización de intermedios de plegamiento (850%) y el rendimiento de replegamiento (677%) mientras que la pureza comparada con el control fosfato disminuye moderadamente. TRIS se usa ampliamente a concentraciones muy bajas (< 0,1 M) como una sustancia tamponante en mezclas de replegamiento, pero no a altas concentraciones como supresor de agregación. Etanolamina, que está relacionada estructuralmente con TRIS, también afectó positivamente la solubilización de intermedios de plegamiento (pHvaloración con HCl), dando como resultado replegamientos comparables y rendimientos de proteínas y purezas de proteínas comparables. La comparación de TRIS con ácido sulfúrico tritiado frente a ácido clorhídrico muestra el efecto adicional positivo de iones de sulfato en el rendimiento de proteínas, el rendimiento de replegamiento y la pureza. Sin embargo, la etanolamina valorada con ácido sulfúrico no dio como resultado efectos sinérgicos en el replegamiento y en el rendimiento de las proteínas.

Por ejemplo, derivado de lnterleucina-4 y BPTI, como se muestra en los ejemplos 4 y 6, se pueden replegar de forma efectiva en un sistema de tamponación combinado constituido por TRIS e iones de sulfato (valoración de ácido sulfúrico).En caso de derivado de lnterleucina-4, se puede emplear concentraciones proteicas de preferentemente 250 a 1000 [mg/l], más preferentemente de 400 a 700 [mg/l] e, incluso más preferentemente, 450 a 550 [mg/l]. L-cisteína debería estar incluida en la mezcla de replegamiento con el fin de permitir la formación de enlaces disulfuro estabilizadores, preferentemente a 1 a 4 [mM], más preferentemente al 2,5 a 3,5 [mM]. TRIS/H 2SO4 debería estar presente preferentemente a 1 a 3 [M], más preferentemente a 1,4 a 2,4 [M]. El pH del tampón se ajusta a aproximadamente 7-9, más preferentemente 7 a 8, y lo más preferentemente 7,5.

En caso de BPTI, se pueden emplear preferentemente las concentraciones proteicas de 500 a 1000 [mg/l], más preferentemente 600 a 800 [mg/l] e, incluso más preferentemente, 700 a 800 [mg/l], L-cisteína debería estar incluida en la mezcla de replegamiento con el fin de tener en cuenta la formación de enlaces disulfuro estabilizadores, preferentemente a 2,5 a 4 [mM], más preferentemente al 3,0 a 3,5 [mM], TRIS/H2 SO4 debería haber preferentemente al 0,2 a 1,4 [M], más preferentemente al 0,3 a 1,0 [M]. El pH del tampón se ajusta a aproximadamente 7-9, más preferentemente 7 a 8, y lo más preferentemente 7,5.

Incluso más sorprendente, la trietanolamina solubiliza de forma efectiva intermedios plegados eficazmente (800%), no afecta la pureza del proteína replegada (44,1% que es comparable al control de fosfato), dando como resultado el mejor rendimiento de replegado (1039% en comparación con el control fosfato).

Por ejemplo, derivado de lnterleucina-4, como se muestra en el ejemplo 5,se puede volver a plegar en un sistema de tamponamiento combinado de TEA e iones sulfato (valoración de ácido sulfúrico). Se pueden emplear concentraciones proteicas de preferentemente 250 a 1000 [mg/l] , más preferentemente 400 a 700 [mg/l] e incluso más preferentemente, 450 a 550 [mg/l]. L-cisteína debería estar incluida en la mezcla de replegamiento para permitir la formación de enlaces disulfuro estabilizadores, preferentemente a 0,4 a 4 [mM], más preferentemente a 0,8 a 2 [mM]. TEA/H2SO4 debería estar presentar presente preferentemente a 0,5 a 2 [M], más preferentemente al 0,8 a 1,5 [M+h]. El pH del tampón se ajusta a aproximadamente 7-9, más preferentemente 7 a 8, y lo más preferentemente 7,5.

Tomando los datos enumerados en la Tabla 1 conjuntamente, se puede deducir una relación de estructura-función, revelando un principio de química general: La agregación más eficaz son supresores primarios, más preferentemente aminas secundarias o terciarias con sustituciones R1, R2, y R3 , donde R1 y R2 puede ser cualquier combinación de los ligandos H, O = C-NH2 , (CH2)4 -NH2 , (CH2)3 -COOH, (CH2 )2 -CHOH-CH3 , CH2 -CH2 -OH, CH2 -CH3 , CH3 , NH2. El residuo R 3puede ser C(NH2)=NH, C(CH2OH)3, CH2-CH2-OH o H.

El papel central de la función amina se demostró con canavanina-sulfato, donde el grupo amino central se intercambia por un grupo oxígeno, dando como resultado una pérdida completa de recuperación de proteína soluble (igual al control sin la adición de cualquier supresor) y a la pérdida de derivado de Interleucina-4 replegado correctamente. Los datos enumerados en la Tabla 1 también muestran que el contraión puede jugar también un papel significativo. Los iones de sulfato son superiores a iones de cloro con respecto al rendimiento de replegado y a la inhibición de agregación proteica. Por lo tanto, una combinación de una amina como se describe anteriormente y una sal de sulfato de ácido sulfúrico inhiben más eficazmente la formación de agregados de proteína y permiten a la proteína replegarse en su conformación nativa.

Ejemplo 1

Procedimientos analíticos

La RP-HPLC analítica se lleva a cabo en una columna YMC C4 (5 μl, 200A, 4,6 x 250 mm) a un caudal de 1,0 ml/min. La detección se lleva a cabo a 210 nm. La columna pre-opcional (20 mm x 4 mm) se empaqueta con una RPC Source 15 (Pharmacia, Suecia). El Tampón A es TFA al 0,1%, el tampón B es TFA al 0,1% con acetonitrilo al 70%. El gradiente se lleva a cabo como sigue: 0-2 min, B al 40%; 2-19,5 min, B al 40%-85%; 19,5-20 min, B al 85%-100%; 20-21 min, B al 100%, 21-22 min, B al 100%-40%B, 22-25 min, B al 40% (reequilibrado). Interleucina-4 plegada correctamente eluye a un tiempo de retención de 16 minutos empleando un sistema Hewlett-Packard CL 1100. El BPTI plegado correctamente eluye a un tiempo de retención de 12,8 min. Las muestras de replegamiento se filtran de forma estéril (punto de corte 0,22 μm) antes del análisis.

El pico que eluye al tiempo de retención de la forma nativa se integra dando el rendimiento de replegado expresado en 30 unidades [mg/l] y corresponde a la concentración de proteínas plegadas correctamente (calculada en base a las curvas estándar externas).Las cuentas del área total corresponden a la concentración de proteína soluble presente en la mezcla de replegamiento expresada en unidades [mg/l]. La proporción de estos dos valores da la pureza de la proteína replegada expresada en unidades [%].

La concentración de proteína total se determinó después de precipitación con ácido trifluoroacético, que se llevó a cabo de acuerdo con procedimientos estándar de bioquímica, usando el ensayo de BCA comercialmente disponible (Pierce, 5 EE.UU.) y seroalbúmina bovina (Boehringer-Mannheim, Alemania) como estándar de calibración.

Ejemplo 2

Preparación de materiales de partida para experimentos de replegamiento

Se solubilizaron proteínas en presencia de Tris 0,2 M-HCl, pH 9 conteniendo clorhidrato de guanidinio 8 M dando una concentración final de proteína de 10 [g/l]. Los grupos SH se sulfitolizaron después mediante la adición de 30 [g/l] de 10 sulfito de sodio y 60 [g/l] de tetrationato de potasio. Después de la adición de sulfito, la solución se agitó a temperatura ambiente durante 30 min con el fin de permitir la finalización de la reacción de sulfito con cualesquiera disulfuros presentes en las proteínas solubilizadas. Posteriormente, se añadió tetrationato y la solución se agitó durante 90 minutos con el fin de permitir la conversión de grupos SH a disulfuros y la escisión a grupos S-sulfito haciendo funcionar la reacción hasta completar la reacción. Finalmente, la solución se filtró a través de un filtro en profundidad de punto de

15 corte 1,2 μm (por ejemplo Sartopure PP2,1,2 μm, Sartorius AG, Alemania). La solución se diafiltró después frente a 5 volúmenes de tampón de diafiltración constituido por Tris-HCl 0,2 M, pH 9 conteniendo clorhidrato de guanidio 4 M empleando una membrana de ultrafiltración por destilación (punto de corte 10.000 PM, por ejemplo Hydrosart 10 kD, Sartorius AG, Alemania). El retentato recogido del aparato de ultrafiltración contenía una concentración de proteína final de aproximadamente 10 [g/l] y se almacenó a 2-8°C durante hasta 2 semanas.

20 Ejemplo 3

Efectos de diferentes productos químicos en el replegamiento de derivado de lnterleucina-4

La solución de la proteína del Ejemplo 2, que contiene proteína sulfitolizada, desnaturalizada, se diluye en tampón de replegamiento dando una concentración de proteína final de 250 [mg/l] tal como se determina mediante el ensayo de BCA (Pierce, EE.UU.). El tampón de replegado consistió en los siguientes ingredientes:

25  tampón de fosfato de sodio 50 mM, pH 7,5

 ácido etilendiaminatetracético 1 mM, sal tetrasódica (EDTA)

 L-cisteína 0,8 mM.

 Una cierta cantidad de supresor de agregación tal como se indica en la Tabla 1.

El volumen final total de la solución de replegamiento fue 50 ml (viales de vidrio, Schott, Alemania).Los viales de vidrio

30 se taparon con parafilm. El replegamiento se dejó funcionando para finalización en 24-36 horas con agitación en un agitador de barra magnética (100-200 rpm). A intervalos, se extrajeron las muestras y se analizaron por RP-HPLC (véase Ejemplo 1).

Tabla 1. Resultados del rastreo de los supresores de agregación

Grupo: Compuesto Intervalo de concentració n [mM] Concentración óptima [mM] Rendimiento de Replegamien to Relativo [%] de control fosfato Solubilidadd e Proteína Relativa [%] de control fosfato Pureza [en %]

Control: Fosfato 50 0 100 100 44,7

Aminoácidos: L-Lisina 0-1500 400 386 315 32,8

L-Asparragina: 0-200 200 107 93 37,8

L-Glutamina: 0-150 75 99 89 37,4

D,L-Norleucina: 0-100 50-100 106 93 37,2

L-Arginina: 0-1200 600 873 845 32,5

Derivados de arginina: %-ácido guanidino-butírico 0-250 250 283 472 20,0

4-guanidino-butano-2-ol: 0-1000 600 299 740 13,8

4-guanidino-butilamina-sulfato: 0-1000 200 177 456 20,6

Canavanina-sulfato: 0-1200 600 0 100 0

Agentes caotrópicos: Urea 0-1500 1500 285 209 37,6

GuHCI: 0-1000 750 609 915 18,4

N-metilguanidinio-sulfato: 0-1000 600 720 1063 19,9

N,N-dimetilguanidinio-sulfato: 0-1000 200 645 700 27,1

N,N-dietilguanidinio-sulfato: 0-1000 400 691 963 21,1

Bis-(1 Aminoguanidinio-sulfato: 0-1000 400 798 1037 22,7

Detergentes: Tween 80 0,1-100 100 169 221 21,1

Zwittergent 3-14: 0,01-10 0,01 85 76 30,3

Zwittergent 3-12: 0,1-100 0,1 110 168 18,3

CHAPS: 0,5-500 5 120 167 28,9

Tritón X-100: 0,1-100 1 140 570 6,8

CTAC: 0,1-100 100 57 735 1,2

Disolventes: Etanol 1-100 50 104 112 37,1

1-propanol: 1-100 10 96 103 37,6

1-butanol: 1-100 5 102 107 38,5

1-hexanol: 1-100 1 88 80 44,1

Sales: NaCl 0-1000 800-1000 495 575 41,4

NH4CI: 0-1000 800-1000 504 635 37,2

Na2SO4: 0-1000 0,200 456 505 41,2

(NH4 ) 2 SO4: 0-1000 400 540 600 41

Tampones: Fosfato 0-1000 200 182 175 41,5

TRIS-HCl: 0-1000 1000 489 505 24,6

TRIS-H2 SO4: 0-1000 1000 677 850 37,8

Etanolamina-HCl: 0-1000 400 431 760 25,8

Etanolamina-H2 SO4: 200-600 400 61 81 25,7

Trietanolamina-H2SO4: 0-2000 1500 1039 800 44,1

Otros: Acetamida 0-2000 800-1500 136 126 34,9

PEG 200: 0-1 0,5-1,0 102 89 38,5

PEG 400: 0-1 1,0 111 93 41,2

PEG 600: 0-1 0,05-0,25 111 114 33,1

PEG 1000: 0-1 0,25 101 89 38,8

PEG 2000: 0-1 0,5-1,0 132 122 35,2

PEG 3000: 0-1 0,1-0,5 122 104 35

PEG 4000: 0-1 0,1 153 133 37,6

Control: Condiciones de replegamiento: tampón de fosfato de sodio 50 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM, L-cisteína 0,4 mM, 250 mg/l de concentración total de proteínas, Rendimiento de replegamiento: 8 mg/l de Interleucina-4 plegada correctamente R121D Y124D (~3% de proteína total), 23,5 mg/l de recuperación de proteína soluble (-9% de la proteína total),

Ejemplo 4

Optimización multifactorial del replegamiento del derivado de Interleucina-4 empleando el sistema basado en TRIS-ácido sulfúrico

5 Una combinación atractiva de supresores de agregación es el sistema de base de TRIS/H2SO4. Por lo tanto, este sistema se eligió para optimización adicional empleando un análisis multifactorial.

El volumen final total de la solución de replegamiento fue 50 ml (viales de vidrio, Schott, Alemania). Los viales de vidrio se taparon con parafilm. El replegado se dejó funcionando hasta finalización dentro de 24-36 horas con agitación en un agitador de barra magnética (100-200 rpm). A intervalos, se extrajeron las muestras y se analizaron por RP-HPLC

10 (véase el Ejemplo 1).

La solución de la proteína del Ejemplo 2, que contiene proteínas desnaturalizadas, sulfitolizadas, se diluye en tampón de replegado dando una concentración final de proteína indicada en la Tabla 3. Se investigaron los siguientes aspectos de la composición tampón de replegado: concentración de base de TRIS-base (0,5 a 3 [M]), H2SO4 (dependiendo de concentración de TRIS; 0,4 hasta 1,4 [M]), concentración residual de clorhidrato de guanidinio (80-400 mM),

15 concentración de L-cisteína (0,4 a 4 [mM]), y concentración de proteína inicial (50 a 1000 [mg/l]). El pH del tampón de replegamiento se ajustó a 7,5. Todas las mezclas de replegamiento contenían EDTA 1 mM.

Los experimentos descritos en este ejemplo se diseñaron permitiendo un análisis estadístico multifactorial de los datos de rendimiento de derivado de la Interleucina-4 plegada correctamente con el fin de valorar la importancia de todos los factores individuales y de todas las interacciones de dos factores. Se generó un diseño experimental cúbico parcial y los datos resultantes también se analizaron empleando un modelo cúbico parcial. Los coeficientes de los polinomios del modelo cúbico parcial se dan en la Tabla 2.

imagen1

Tabla 2. Modelo cúbico parcial empleado para el diseño experimental de la optimización de replegamiento de Interleucina-4 R121D Y124D

Tabla 3. Efecto de condiciones de solución (sistema TRIS-H 2 SO4) en rendimiento de replegamiento de Interleucina-4 10 R121D Y124D, recuperación de proteína soluble, rendimiento de replegamiento general y pureza

N.º Ensayo: de TRIS-base Cisteína Proteína Rendimiento de Referencia Recuperación de proteína Rendimiento de replegamiento general Pureza

[mg/l]: [%1] [%1] [%1]

1: 3 4 50 9 81,3 18,00 22,1

2: 3 0,4 1000 2,92 10,65 0,29 2,7'

3: 0,5 4 525 90,45 48,55 17,23 35,5

4: 0,5 2,2 1000 137,7 46,34 13,77 29,7

5: 1,75 4 1000 199,72 54,77 19,97 36,5

6: 1,75 0,4 1000 25,05 27,23 2,50 9,2

7: 3 2,2 50 11,3 60,79 22,60 37,2

8: 0,5 4 50 10,37 53,54 20,73 38,7

9: 3 0,4 525 68,32 55,36 13,01 23,5

10: 0,5 0,4 525 81,82 36,66 15,58 42,5

11: 1,75 0,4 50 13,6 62,08 27,21 43,8

12: 0,5 0,4 1000 15,8 18,89 1,58 8,4

13: 3 4 1000 176,31 43,94 17,63 40,1

14: 1,75 4 525 131,19 68,94 24,99 36,2

15: 1,3333 1,6 366,667 93,63 68,21 25,54 37,4

16: 2,1667 1,6 366,667 91,95 69,77 25,08 35,9

17: 3 2,8 683,333 134,38 55,72 19,67 35,3

18: 0,5 1,6 683,333 110,68 48,94 16,20 33,1

20: 2,1667 2,8 50 12,49 71,59 24,98 34,9

1: 3 4 50 9,38 52,32 18,76 35,9

2: 3 0,4 1000 8,94 18,32 0,89 4,9

3: 0,5 4 525 97,16 50,43 18,51 36,7

4: 0,5 2,2 1000 140,29 45,63 14,03 30,7

5: 1,75 4 1000 197,53 56,85 19,75 34,7

6: 1,75 0,4 1000 19,75 27,61 1,97 7,2

7: 3 2,2 50 15,08 72,5 30,15 41,6

Los rendimientos obtenidos con combinaciones seleccionadas de estos componentes se muestran en la Tabla 3. La inspección de estos resultados muestra que, bajo las condiciones experimentales empleadas, las siguientes tendencias fueron patentes: (1) los mejores rendimientos de replegamiento se obtienen a concentraciones de proteína más altas 5 (750-1000 [mg/l]); (2) los mejores rendimientos de replegamiento generales se obtienen a 250 a 650 [mg/l] de concentración de proteína total; (3) el intervalo de concentración de L-cisteína óptimo es 2,5 a 4 [mM]; (4) el intervalo de concentración de Tris-H2SO4 óptimo es 1,4 a 2,4 [M]; (5) la mejor recuperación de proteína se obtiene a concentraciones de proteína bajas (50 a 250 [mg/l]), concentraciones altas de Tris-H2SO4 y (2-3 [M]) a 3,5 [mM] de Lcisteína; (6) la mejor pureza se obtiene a concentraciones de proteína altas (400-1000 [mg/l]), concentraciones de L

10 cisteína altas (2,5-4 [mM]). La pureza es independiente de la concentración de Tris-H2SO4.

Un compromiso entre el rendimiento óptimo de replegamiento, la pureza y la recuperación de proteínas se identificó empleando los siguientes ajustes: 500 mg/l de proteína total, L-cisteína 3,3 mM, Tris-H2SO42 M y EDTA 1 mM.

Los puntos de control empleando estas condiciones óptimas revelaron que la respuesta predecida y los valores de respuesta medidos se ajustan razonablemente bien, indicando que el modelo es adecuado.

Rendimiento de replegamiento

general

Predecido: 24,9 [%] (± 1,84 Error Estándar)

Recuperación de proteína Medida: 25,4 [%] (± 0,37 Error Estándar)

Predicha: 65,9 [%] (± 6,55 Error Estándar)

Pureza Medida: 62,9 [%] (± 0,63 Error Estándar)

Predicha: 38,6 [%] (± 3,63 Error Estándar)

Rendimiento de replegamiento Medida: 40,4 [%] (± 0,45 Error Estándar)

Predicha: 127 [mg/l] (± 14,5 Error Estándar)

Medida: 126,9 [mg/l] (± 1,85 Error Estándar)

15

Ejemplo 5

Optimización multifactorial de replegamiento de derivado de lnterleucina-4 empleando el sistema basado en Trietanolamina-ácido sulfúrico

Otra combinación atractiva de supresores de agregación es el sistema de Trietanolamina (TEA)/H2SO4. Por lo tanto, 5 este sistema se eligió para optimización adicional y de aumento en la escala de concentración de proteínas.

El volumen final total de la solución de replegamiento fue 50 ml (viales de vidrio, Schott, Alemania).Los viales de vidrio se taparon con parafilm. El replegamiento se dejó funcionar hasta finalización en 24-36 horas con agitación en un agitador de barra magnética (100-200 rpm). A intervalos, se extrajeron las muestras y se analizaron por RP-HPLC (véase el Ejemplo 1).

10 La solución de la proteína del Ejemplo 2, que contiene proteína sulfitolizada, desnaturalizada, se diluye en tampón de replegamiento dando una proteína final indicada en la Tabla 5. Los siguientes aspectos de la composición de tampón de replegamiento se investigaron: concentración de TEA (1 a 2 [M]), H2SO4 (dependiendo de concentración de TEA), concentración de clorhidrato de guanidinio residual (80-400 mM), concentración de L-cisteína (0,4 a 10 [mM]), y concentración de proteína inicial (50 a 1000 [mg/l]). El pH del tampón de replegamiento se ajustó a 7,5. Todas las

15 mezclas de replegamiento contenían EDTA 1 mM.

Los experimentos descritos en este ejemplo se diseñaron permitiendo análisis estadístico multifactorial de los datos de rendimiento del derivado de Interleucina-4 correctamente plegado con el fin de valorar la importancia de todos los factores individuales y de todas las interacciones de dos factores. Se generó un diseño experimental cúbico parcial y los datos obtenidos también se analizaron empleando un modelo cúbico parcial. Los coeficientes de los polinomios del

20 modelo cúbico parcial se dan en la Tabla 4.

imagen1

Tabla 4. El modelo cúbico parcial empleado para el diseño experimental de la optimización del replegamiento de Interleucina-4 R121D Y124D

Tabla 5. Efecto de las condiciones de solución (sistema TEA-H2 SO4) en rendimiento de replegamiento de lnterleucina-4 25 R121D Y124D, recuperación de proteína soluble, rendimiento general de replegamiento y pureza.

N.º Ensayo: de TEA Cisteína Proteína Rendimient o de Ref. Recuper ación de proteína s Rendimiento de replegamiento general Pureza

[-]: [M] [mM] (mg/l) (mg/l) [%] [%] [%]

1: 2 10 0,1 5,91 138,09 5,9 4,3

2
2: 0,4 1 135,12 49,49 13,5 27,3

3: 0,5 10 0,55 15,23 16,92 2,8 16,4

4: 0,5 5,2 1 70,06 19,28 7 36,3

5: 1,25 10 1 49,37 18,06 4,9 27,3

6: 0,5 5,2 0,1 9,64 66,78 9,6 14,4

7: 1,25 0,4 1 167,96 42,5 16,8 39,5

8: 2 5,2 0,1 13,66 103,17 13,7 13,2

9: 0,5 10 0,1 3,56 76,7 3,6 4,6

10: 2 0,4 0,55 45,39 54,66 8,3 15,1

11: 0,5 0,4 0,55 68,41 31,3 12,4 39,7

12: 1,25 0,4 0,1 30,09 77,34 30,1 38,9

13: 0,5 0,4 1 90,11 21,55 9 41,8

14: 2 10 1 63,75 22,94 6,4 27,8

15: 0,5 0,4 0,1 24,18 59,26 24,2 40,8

16: 1,25 10 0,55 43,47 31,42 7,9 25,2

17: 1 3,6 0,4 107,54 61,7 26,9 43,6

18: 1,5 3,6 0,4 118,95 70,26 29,7 42,3

19: 2 6,8 0,7 115,96 45,83 16,6 36,1

20: 0,5 3,6 0,7 97,81 32,69 14 42,7

21: 1,5 6,8 0,1 12,29 75,29 12,3 16,3

1: 2 10 0,1 6,51 91,62 6,5 7,1

2
2: 0,4 1 136,71 44,08 13,7 31,0

3: 0,5 10 0,55 17,13 13,98 3,1 22,3

4: 0,5 5,2 1 68,29 17,34 6,8 39,4

5: 1,25 10 1 53,25 16,96 53 31,4

6: 0,5 5,2 0,1 10,75 44,69 10,8 24,1

7: 1,25 0,4 1 170,11 39,82 17 42,7

8: 2 5,2 0,1 18,01 81,64 18 22,1

9: 0,5 10 0,1 4,92 43,65 4,9 11,3

Los rendimientos obtenidos con combinación seleccionada de estos componentes se muestran en la Tabla 5. La inspección de estos resultados muestra que, bajo las condiciones experimentales empleadas, las siguientes tendencias son patentes: (1) los mejores rendimientos de replegamiento se obtienen a altas concentraciones proteicas (750-1000 5 [mg/l]); (2) los mejores rendimientos de replegamiento general se obtienen a concentración total de proteínas 100 a 550 [mg/l]; (3) el intervalo de concentración de L-cisteína óptima es 0,4 a 4 [mM]; (4) el intervalo de concentración de TEAH2SO4 es 1 a 1,6 [M]; (5) se obtiene mejor recuperación de proteínas a concentraciones proteicas bajas (50 a 250 [mg/l]), altas concentraciones de TEA-H2SO4 (1,5-2 [M]) y 4 a 10 [mM] de L-cisteína; (6) se obtiene mejor pureza a altas concentraciones proteicas (600-1000 [mg/l]), a las concentraciones de L-cisteína que varían entre 0,4 y 4 [mM] y a las

10 concentraciones de TEA-H2SO4 que varían entre 0,8 y 1,5 [M]. Un compromiso entre rendimiento de replegado óptimo, pureza y recuperación de proteínas se identificó empleando los siguientes ajustes: 500 mg/l de proteína total, L-cisteína 0,8 mM, TEA-H2SO41,4 M y EDTA 1 mM.

Los puntos de control empleando estas condiciones óptimas revelaron que los valores de la respuesta predichos y medidos se ajustan razonablemente bien, indicando que el modelo es adecuado.

Rendimiento de replegamiento general: Predicha: 24,6 [%] (±4.1 StdErr)

Medida:: 24,3[%] (±0.8 StdErr)

Recuperación de proteína: Predicha: 52,8[%] (±10.5 StdErr)

Medida:: 58,2[%] (±4.5 StdErr)

Pureza: Predicha: 43,2[%] (±5.3 StdErr)

Medida:: 41,8[%] (± 3.9 StdErr)

Rendimiento de replegamientol: Predicha: 106,8[%] (±16.9 StdErr)

Medida:: 121,6[%] (±2.0 StdErr)

Ejemplo 6

Replegamiento de inhibidor de tripsina pancreática bovina (BPTI, aprotinina) empleando el sistema basado en TRIS-ácido sulfúrico

5 Con el fin de demostrar que el sistema de TRIS/H2SO4 se puede emplear también para el replegamiento de otras proteínas que los derivados de Interleucina-4, el sistema de TRIS/H2SO4 se optimizó también para BPTI.

El volumen final total de la solución del replegamiento fue 50 ml (viales de vidrio, Schott, Alemania).Los viales de vidrio se taparon con parafilm. El replegamiento se dejó funcionando para finalización dentro de 24-36 horas con agitación en un agitador de barra magnética (100-200 rpm). A intervalos, se extrajeron las muestras y se analizaron por RP-HPLC

10 (véase el Ejemplo 1).

La solución de la proteína del Ejemplo 2, que contiene proteína sulfitolizada, desnaturalizada se diluye en tampón de replegamiento dando una concentración de proteína final indicada en la Tabla 7. Se investigaron los siguientes aspectos de la composición de tampón de replegamiento: concentración de TRIS (0 a 2 [M]), H2SO4(dependiendo de la concentración de base TRIS), concentración de clorhidrato de guanidinio residual (80-400 mM), concentración de L

15 cisteína (0,1 a 4 [mM]), y concentración de proteína inicial (intervalo de 50 a 1000 [mg/l]). El pH del tampón de replegamiento se ajustó a 7,5. Todas las mezclas de replegamiento contenían EDTA 1 mM.

Los experimentos descritos en este ejemplo se diseñaron permitiendo análisis estadístico multifactorial de los datos de rendimiento de la BPTI plegada correctamente con el fin de valorar la importancia de todos los factores individuales y todas las interacciones entre dos factores. Se generó un diseño experimental cúbico parcial y los datos resultantes se

20 analizaron también empleando un modelo cúbico parcial. Los coeficientes de los polinomios del modelo cúbico parcial se dan en la Tabla 6.

imagen1

Tabla 6. Modelo cúbico parcial empleado para el diseño experimental de la optimización del replegamiento de BPTI

Tabla 7. Efecto de condiciones de solución en rendimiento de replegamiento de BPTI, recuperación de proteína soluble y rendimiento de replegamiento general.

N.º de Ensayo: TRIS-base Cisteína Proteína Rendimient o de Referencia Recuperación de proteínas Rendimi ento Replegamiento general Pureza

[-]: [M] [mM] (mg/l) (mg/l) [%] [%] [%]

1: 2 4 50 20,43 85,69 40,86 47,7

2
2: 0,1 1000 0 0 0 0

3: 0 4 525 159,29 61,05 30,3409 5 49,7

4: 0 2,05 1000 275,45 70,84 27,545 38,9

5: 1 4 1000 256,9 71,75 25,69 35,8

6: 0 2,05 50 35,67 136,48 71,34 52,3

7: 1 0,1 1000 0 2,59 0 0

8: 2 2,05 50 19,45 80,85 38,9 48,1

9: 0 4 50 8,51 39,92 17,02 42,6

10: 2 0,1 525 0 0 0 0

11: 0 0,1 525 0 0,4 0 0

12: 1 0,1 50 15,71 69,04 31,42 45,5

13: 0 0,1 1000 0 1,05 0 0

14: 2 4 1000 158,93 36,23 15,893 43,9

15: 0 0,1 50 5,03 14,13 10,06 71,2

16: 1 4 525 18,64 89,48 3,55047 6 4

17: 0,6667 1,4 366,667 107,29 83,34 29,2608 8 35,1

18: 1,3333 1,4 366,667 104,5 82,6 28,4999 7 34,5

19: 2 2,7 683,333 97,4 41,66 14,2536 7 34,2

20: 0 1,4 683,333 149,44 51,46 21,8692 8 42,5

21: 1,3333 2,7 50 14,08 76,21 28,16 36,9

1: 2 4 50 16,15 69,37 32,3 46,5

2
2: 0,1 1000 1,47 3,44 0,147 4,3

3: 0 4 525 162,49 58,91 30,9504 8 52,5

4: 0 2,05 1000 273,77 68,91 27,377 39,7

5: 1 4 1000 265,9 78,2 26,59 34

6: 0 2,05 50 9,73 39,56 19,46 49,2

7: 1 0,1 1000 0 0,94 0 0

8: 2 2,05 50 19,18 77,88 38,36 49,3

Los rendimientos obtenidos con combinación seleccionada de estos componentes se muestran en la Tabla 7. La inspección de estos resultados muestra que, bajo las condiciones experimentales empleadas, son patentes las siguientes tendencias: (1) se obtienen los mejores rendimientos de replegamiento a altas concentraciones proteicas 5 (750-1000 [mg/l]); (2) se obtienen los mejores rendimientos de replegamiento general a concentración proteica total de 500 a 1000 [mg/l]; (3) el intervalo de concentración de L-cisteína óptimo es 2,5 a 4 [mM]; (4) el intervalo de concentración de TRIS-H2SO4 es 0,2 a 1,0 [M]; (5) se obtiene mejor pureza a concentraciones de proteínas más bajas (50 a 100 [mg/l]), concentraciones de TRIS-H2SO4 moderado (0,9-1,4 [M]) y L-cisteína de 1,8 a 3,3 [mM]; (6) se obtiene mejor pureza a concentraciones proteicas bajas (50-100 [mg/l]), concentraciones de L-cisteína que varían entre 0,1 y 0,4

10 [mM]) y a las concentraciones de TRIS-H 2 SO4 que varían entre 0,1 y 0,5 [M].

Un compromiso entre rendimiento de replegamiento óptimo, pureza y recuperación de proteína se identificó empleando los ajustes siguientes: 700 mg/l de proteína total, L-cisteína 3,3 mM, TRIS-H2SO4 0,3 M y EDTA 1 mM.

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Un procedimiento para renaturalización de Interleucina 4 o una muteína de interleucina 4 a concentraciones proteicas de 250 a 1000 [mg/l] que comprende añadir a una solución de proteínas desnaturalizadas, químicamente modificadas o reducidas un tampón que contenga L-Cisteína y Tris-(hidroximetil)-aminometano/H2SO4 en una concentración de 1 a 3 mol/I o trietanolamina/H2 SO4 en una concentración de 0,5 a 2 moles/I.
2.

El procedimiento de la reivindicación 1 en el que el tampón contiene adicionalmente un potenciador de solubilidad.
3.

El procedimiento de la reivindicación 3 en el que el potenciador de solubilidad es un ion.
4.

El procedimiento de la reivindicación 3 en el que el potenciador de solubilidad es cloruro.