JP4348188B2

JP4348188B2 - アミンの存在下での高タンパク質濃度における組換えジスルフィド含有タンパク質の再生法。

Info

Publication number: JP4348188B2
Application number: JP2003545690A
Authority: JP
Inventors: ペテルス，イエルク; ミヌート，トルステン
Original assignee: Bayer Healthcare AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 2001-11-22
Filing date: 2002-11-12
Publication date: 2009-10-21
Anticipated expiration: 2022-11-12
Also published as: EP1314739A1; JP2005510217A; US7893210B2; EP1453858A1; ATE495191T1; US20050014933A1; DE60238938D1; AU2002340510A1; KR100944845B1; PT1453858E; KR20050058243A; CY1112209T1; DK1453858T3; ES2357888T3; WO2003044055A1; EP1453858B1

Description

発明の分野
本発明は、原核生物中での発現の後のジスルフィド結合を含有する組換え真核タンパク質の再生法に関する。

背景及び先行技術
例えばエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）のような異種発現系における組換えタンパク質の生産の場合、これらのタンパク質はしばしば不活性、不溶性凝集体（いわゆる「屈折体（ｒｅｆｒａｃｔｉｌｅｂｏｄｉｅｓ）」又は「封入体」）を形成する。さらにこれらの封入体は、宿主細胞タンパク質、核酸、内毒素及び低分子量汚染物のような宿主細胞成分により汚染される。これらの封入体の形成は、誘導及びタンパク質生合成の間の細胞における異種タンパク質の非常に高い局部的濃度の結果であると仮定される。しかしながら、問題の異種タンパク質の一次アミノ酸配列と、酸化的再生の間に共有ジスルフィド結合を形成するシステイン−残基の存在も非常に重要である。例えば治療目的のためにこれらの標的タンパク質を用いることができる前に、封入体を精製しなければならず、続いて三次元構造を再生させてタンパク質を生物学的に活性なコンフォーメーションに転換しなければならない。

通常適用されるプロセス段階の順序は、第１に高濃度のカオトロピック（ｃｈａｏｔｒｏｐｉｃ）変性剤（例えばグアニジニウムヒドロクロリド又はウレア）の添加による、あるいは例えばグリシン／リン酸混合物のような強力に酸性の薬剤の添加による、封入体の可溶化を含む。同時に、封入体中に存在する分子内ジスルフィド結合を化学的に還元するか又は亜硫酸塩及び酸化剤を含むいわゆる亜硫酸分解法により開裂させることができる。第２に可溶化されたタンパク質混合物を、両方とも当該技術分野における熟練者にとって周知の方法であるクロマトグラフィー手段又は濾過法によりさらに精製することができる。

続いて、生物学的に活性な形態の形成を可能にするために、高濃度のカオトロピック剤の存在下における線状化されたモノマータンパク質溶液を高度に希釈する。これは迅速に（大容積のリフォールディングバッファー（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇｂｕｆｆｅｒ）中への簡単な希釈により）又はリフォールディングバッファーに対するダイアフィルトレーションもしくは透析によりゆっくり行なうことができる。文献に記載されている他の方法は、標的タンパク質をクロマトグラフィー樹脂に吸着させ、続いてカオトロピック剤の濃度を低下させて再生を起こさせること又はタンパク質鎖を分離し、それにより凝集体を形成する傾向を妨げるためのサイズ排除クロマトグラフィーを含む。すべての場合に、カオトロピック塩の濃度を標的タンパク質に依存するある確定された限度未満に、例えば通常０．５Ｍ未満のグアニジニウムヒドロクロリドに低下させねばならない。

再生の間の主な副反応は不溶性凝集体の形成であり、それは折りたたみ中間体（ｆｏｌｄｉｎｇｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ）の局部的濃度に依存する。文献に、例えばシャペロンタンパク質、他の型のタンパク質（例えばウシ血清アルブミン）ならびに糖類及び環状糖類、例えばグリセロール、ペンタノール、ヘキサノールのような短鎖アルコール類、酵素基質、合成ポリマー、洗剤及びカオトロピック塩を含むいくつかの型の非タンパク質材料のような、この不溶性タンパク質凝集体の形成を有効に抑制する広範囲の折りたたみ助剤（ｆｏｌｄｉｎｇａｉｄｓ）が記載されている（非特許文献１及びその中の引用文献；非特許文献２及びその中の引用文献；１９９５年６月２日に申請された特許文献１）。近年種々の方法が公開され、その方法では疎水性折りたたみ中間体を溶液中に保つためにいわゆる人工のシャペロンが用いられる（１９９４年１０月３１日に申請された特許文献２）。第１段階に、疎水性折りたたみ中間体を洗剤ミセル中に捕獲し、タンパク質凝集の抑制に導く。捕獲された折りたたみ中間体は本来のコンフォーメーションに折りたたまれ得ない。第２段階に、例えば種々のシクロデキストリン又は線状デキストリンのような「ストリッピング剤」を有意なモル過剰において加え、洗剤を除去して再びタンパク質をその生物学的に活性なコンフォーメーションに再生させる。この方法には、１．大モル過剰の高価な「ストリッピング剤」、２．「ストリッピング」期の間に起こるタンパク質凝集、３．標的タンパク質に結合した残留洗剤の除去の困難性、４．シクロデキストリンのタンパク質容量（ｐｒｏｔｅｉｎｃａｐａｃｉｔｙ）及び溶解性における限界ならびに５．プロセス変動に関する人工のシャペロン系の感受性（限られた強健性（ｒｏｂｕｓｔｎｅｓｓ）のようないくつかの欠点がある。さらに、人工のシャペロン系は標的タンパク質、洗剤の型及び「ストリッピング剤」ならびに用いられる実験条件に関して特異的である。従って利用できる一般的な人工のシャペロン系はない（非特許文献３；非特許文献４）。

上記で挙げた凝集抑制剤のほとんどは、限られた数のタンパク質の場合に働くのみである。１つの例外はアミノ酸Ｌ−アルギニンであり、それは例えばｔ−ＰＡ、Ｆａｂフラグメント、リゾチーム及び他の酵素のような広範囲の異なるタンパク質に一般的に適用可能であることが示された（特許文献３；特許文献４；非特許文献１及びその中の引用文献）。

Ｌ−アルギニンは、再生するべきタンパク質のモル濃度に関して高いモル過剰においてのみ有効であることが複数のタンパク質の場合に示された。Ｌ−アルギニンがタンパク質凝集体の形成を抑制する機構は未知である（非特許文献５）。さらに、Ｌ−アルギニンは高価なキラルファインケミカルである。

従って、通常の方法を用いるタンパク質再生のための戦略の開発がまだ求められている。当該技術分野の現状からは、最高で０．５〜１ｇ／ｌの高濃度におけるタンパク質の商業的に魅力的な再生法において適用され得る一般的に使用可能、化学的に単純且つ安価な凝集抑制剤は未知である。
ｄｅＢｅｒｎａｒｄｅｚＣｌａｒｋ，Ｅ著，Ｃｕｒｒ．ＯｐｉｎｉｏｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９，１９９８年，１５７−１６３ＬｉｌｉｅＨ，ＳｃｈｗａｒｚＥ，ＲｕｄｏｌｐｈＲ著，Ｃｕｒｒ．ＯｐｉｎｉｏｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９，１９９８年，９４７−５０１米国特許第５，７２８，８０４号明細書，ＳｈａｒｍａＡ，ＫａｒｕｐｐｉａｈＮ（１９９８年）米国特許第５，５６３，０５７号明細書，ＧｅｌｌｍａｎＳ，ＲｏｚｅｍａＤＢ（１９９６年）ＤａｕｇｈｅｒｔｙＤＬ，ＲｏｚｅｍａＤ，ＨａｎｓｏｎＰＥ，ＧｅｌｌｍａｎＳＨ著，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２７３，１９９８年，３３９６１−３３９７１ＲｏｚｅｍａＤ，ＧｅｌｌｍａｎＳＨ著，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，１９９６年，３４７８−３４８７米国特許第５，５９３，８６５号明細書，ＲｕｄｏｌｐｈＲ，ＦｉｓｃｈｅｒＳ，ＭａｔｔｅｓＲ（１９９７年）：Ｐｒｏｃｅｓｓｆｏｒｔｈｅａｃｔｉｖａｔｉｎｇｏｆｇｅｎｅ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌｌｙｐｒｏｄｕｃｅｄ，ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ，ｄｉｓｕｌｆｉｄｅｂｒｉｇｄｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｐｒｏｔｅｉｎｓａｆｔｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ．米国特許第５，４５３，３６３号明細書，ＲｕｄｏｌｐｈＲ，ＦｉｓｃｈｅｒＳ，ＭａｔｔｅｓＲ（１９９５年）：ＰｒｏｃｅｓｓｆｏｒｔｈｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆＴ−ＰＡｏｒＩＮＧａｆｔｅｒｇｅｎｅｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ．ＬｉｌｉｅＨｅｔａｌ．著，Ｃｕｒｒ．ＯｐｉｎｉｏｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９，１９９８年，４９７−５０１

発明の概略
本発明に課せられた仕事は、エシェリキア・コリ中における過剰発現により得られる不溶性タンパク質凝集体（いわゆる封入体）から出発して、適した化学的に単純且つ容易に利用できる凝集抑制剤を用いる、例えば高いたんぱく質濃度におけるインターロイキン−４及びその誘導体のようなタンパク質の再生のための商業的に魅力的な経路を利用可能にすることである。本発明において記載される単数もしくは複数の凝集抑制剤は、その非特異性のために、広範囲の異なるタンパク質に適用され得る。

本明細書に記載される方法は、変性し、化学的に修飾された又は還元されたタンパク質の溶液を、置換基Ｒ_１、Ｒ_２及びＲ_３を有する式

を有する第１級、より好ましくは第２級又は第３級アミンを含有するリフォールディングバッファー中に加えることを含んで成り、式中、Ｒ_１及びＲ_２はリガンドＨ、Ｏ＝Ｃ−ＮＨ_２、（ＣＨ_２）_４−ＮＨ_２、（ＣＨ_２）_３−ＣＯＯＨ、（ＣＨ_２）_２−ＣＨＯＨ−ＣＨ_３、ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＯＨ、ＣＨ_２−ＣＨ_３、ＣＨ_３、ＮＨ_２のいずれかの組み合わせであることができる。残基Ｒ_３はＣ（ＮＨ_２）＝ＮＨ、Ｃ（ＣＨ_２ＯＨ）_３、ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＯＨ又はＨであることができる。

好ましい態様において、リフォールディングバッファーは例えば追加のイオン、例えばクロリド又はより好ましくはサルフェートイオンのようなさらなる溶解性増強剤を含有し、それはタンパク質凝集体の形成の抑制を相乗的に助ける。

先行技術から多数のタンパク質に関し、再生のためには、タンパク質濃度のある制限値が超えられてはならないことが知られている。これらの濃度限界のレベルは再生するべきタンパク質の性質に依存する。今回、上記で挙げた単数もしくは複数のアミン又は上記で挙げたアミンの組み合わせ及び別の溶解性増強剤の過剰に高い可溶化能力の故に、比較的多量の変性タンパク質が、より多量の再生タンパク質を達成するためにより多量の溶液体積を必要としないことが認識される。

従って本発明の目的は：
ａ）不活性タンパク質を本来のコンフォーメーションに再生させ、それにより再生収率及び可溶性タンパク質の回収率の損失を引き起こすタンパク質凝集体の形成を有効に抑制するための上記の種類の方法；
ｂ）高いタンパク質濃度における再生を可能にする上記の種類の方法；ならびに
ｃ）安価な非キラル日用化学品を用いて使用され得る上記の種類の方法
の提供を含む。

本発明のこれらの及びさらに別の目的及び利点は、下記の記述から明らかになるであろう。下記は単に好ましい態様の記述であり、すべての可能な態様の記述のつもりではないことが理解されるべきである。請求項は本発明の範囲全体を決定するとみなされるべきである。
定義
本明細書で用いられる場合、「インターロイキン−４誘導体」という用語は、Ｓｅｂａｌｄ，Ｗ（１９９２）：米国特許第５，７２３，１１８号明細書及び１９９２年１１月１３日の日付の欧州特許第６１３４９９Ｂ１号明細書ならびにＤｏｍｉｎｇｕｅｓｅｔａｌ．（１９９９）：ＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／１Ｂ００／００７６９号明細書に従う、ポリペプチド鎖の種々の部位において交換されたアミノ酸残基を有するヒトインターロイキン−４の突然変異タンパク質を指す。

本明細書で用いられる場合、ＢＰＴＩという用語は、ウシ膵臓トリプシン阻害剤（アプロチニンとも呼ばれる）を指す。

本明細書で用いられる場合、「正しく折りたたまれたタンパク質」は、本来のジスルフィド結合を示すその本来の構造における標的タンパク質を指す。

本明細書で用いられる場合、「再生収率」は、再生混合物中における正しく折りたたまれた非修飾標的タンパク質の濃度（例えば［ｍｇ／Ｌ］）として定義される。

本明細書で用いられる場合、「全体的再生収率」は、再生混合物中における合計タンパク質の量で割られた正しく折りたたまれた非修飾標的タンパク質の濃度（例えば［ｍｇ／Ｌ］）として定義される。全体的再生収率は［％］で表される。

本明細書で用いられる場合、「タンパク質回収率」又は「可溶性タンパク質の回収率」という用語は、再生の後に回収される可溶性タンパク質対初期の合計タンパク質の比を指す。タンパク質回収率は［％］で表される。

本明細書で用いられる場合、「純度」（［％］）という用語は、標的タンパク質の再生収率及びＲＰ−ＨＰＬＣにより決定される再生混合物中の可溶性タンパク質の濃度に基づいて計算される（実施例１を参照されたい）。

本明細書で用いられる場合、ＴＲＩＳという用語は、塩基性緩衝物質であるトリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタンを指す。本明細書で用いられる場合、ＴＥＡという用語は、塩基性緩衝物質であるトリエタノールアミンを指す。本明細書で用いられる場合、ＧｎｄＨＣｌという用語は、カオトロピック塩であるグアニジニウムヒドロクロリドを指す。

好ましい態様の詳細な記述
本発明の主題は、不溶性封入体を生ずる原核生物中における異種発現の後に組換えジスルフィド架橋タンパク質を再活性化するための方法であり、それはこれらのタンパク質の凝集体の精製に続き、高濃度の適したカオトロピック塩中で変性し、化学的に修飾され（タンパク質−ＳＨ基及び適したメルカプタンの間の混合ジスルフィドの形成又はＳ−ＳＯ_３基の形成のためのタンパク質−ＳＨ基中へのサルファイト基の導入）、そして置換基Ｒ_１、Ｒ_２及びＲ_３を有する高濃度の第１級、より好ましくは第２級もしくは第３級アミンを用いてリフォールディングバッファー中で再生し、ここでＲ_１及びＲ_２はリガンドＨ、Ｏ＝Ｃ−ＮＨ_２、（ＣＨ_２）_４−ＮＨ_２、（ＣＨ_２）_３−ＣＯＯＨ、（ＣＨ_２）_２−ＣＨＯＨ−ＣＨ_３、ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＯＨ、ＣＨ_２−ＣＨ_３、ＣＨ_３、ＮＨ_２のいずれかの組み合わせであることができる。残基Ｒ_３はＣ（ＮＨ_２）＝ＮＨ、Ｃ（ＣＨ_２ＯＨ）_３、ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＯＨ又はＨであることができる。さらに、例えばクロリド又はより好ましくはサルフェートイオンのような他の溶解性増強剤の組み合わせがタンパク質凝集を妨げるために有効である。

宿主生物としてエシェリキア・コリを用いる組換えインターロイキン−４誘導体の生産はすでに詳細に記載されている（ＡｌｐｅｒＨ，ＷｅｈｌｍａｎｎＨ（１９９９）Ｐｌａｓｍｉｄｓ，ｔｈｅｉｒｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎａｎｄｔｈｅｉｒｕｓｅｉｎｔｈｅｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｏｆＩｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−４ａｎｄＩｎｔｅｒｌｅｕｆｉｎ−４ｍｕｔｅｉｎｓ．欧州特許第１０２２３３９号明細書．２０００−０７−２６）。

細胞収穫、細胞破壊、封入体精製、可溶化及びＳＨ基の化学的修飾の方法は当該技術分野における熟練者に周知の方法である（ＣｒｅｉｇｈｔｏｎＴＥ（ｅｄ．）（１９８９）：Ｐｒｏｔｅｉｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ．ＩＲＬＰｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＮｅｗＹｏｒｋ，Ｔｏｋｙｏ）。

低分子量の化学的薬剤が再生の間の凝集体の形成を抑制できることは、先行技術から周知である。従って、インターロイキン−４誘導体の、しかしまた例えばＢＰＴＩのような他のタンパク質の再生プロセスにおいて用いられるべき適した凝集抑制剤の発見のために、広範囲の化学品がスクリーニングされた。

実施例１に示す通り（表１）、複数の化学品が折りたたみ中間体の可溶化を有効に助け、可溶性タンパク質の回収率を有意に増加させる。しかしながら、これは必ずしもこれらの化合物が正しく折りたたまれた生物学的に活性なジスルフィドアイソフォームの収率の有意な増加にも導くことを意味するわけではない（表１中の「相対的再生収率」の欄を参照されたい）。例えば洗剤であるセチルトリエチルアンモニウムクロリド（ＣＴＡＣ）は折りたたみ中間体を有効に可溶化し、ホスフェート標準に比べて７３５％のタンパク質収率の増加に導く。しかしながらＣＴＡＣは正しく折りたたまれたジスルフィドアイソフォームの収率を増加させることはできず、低い再生収率及び低い純度を生ずる。表１に挙げるいくつかの薬剤は、例えばＬ−アルギニン、ウレア、グアニジニウムヒドロクロリド、ポリ（エチレン）グリコール、アセトアミド及び短鎖アルコールのように、再生の間に凝集抑制剤として助けるそれらの能力に関して先行技術から周知である。しかしながらＬ−アルギニン及びより低い程度にグアニジニウムヒドロクロドを除いて、これらのほとんどはインターロイキン−４誘導体の場合に失敗した。

グアニジニウムヒドロクロリドは７５０ｍＭの最適濃度において折りたたみ中間体を有効に可溶化する。Ｎ−メチル化又はＮ−エチル化誘導体及びビス（−１−アミノグアニジニウム）−サルフェートは、グアニジニウムヒドロクロリドと比べてもっと低い濃度（２００〜６００ｍＭ）においてより有効に折りたたみ中間体を可溶化する。しかしながら再生タンパク質の純度（１８．４〜２７．１％）は、ホスフェート標準と比べてずっとそれより低い。

驚くべきことに、高濃度において硫酸と組み合わされた緩衝剤トリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン（ＴＲＩＳ）は、ホスフェート標準と比べて折りたたみ中間体の可溶化（８５０％）及び再生収率（６７７％）に明確に影響したが、純度をやや低下させた。ＴＲＩＳは非常に低い濃度（＜０．１Ｍ）において再生混合物中で緩衝物質として広く用いられるが、高濃度で凝集抑制剤としては用いられない。構造的にＴＲＩＳに関連するエタノールアミンも折りたたみ中間体の可溶化に明確に影響し（ＨＣｌを用いるｐＨ−滴定）、同等の再生及びタンパク質収率ならびに純度を生ずる。硫酸で滴定されたＴＲＩＳ対塩酸で滴定されたＴＲＩＳの比較は、タンパク質収率、再生収率及び純度へのサルフェートイオンの明確な追加の効果を示す。しかしながら、硫酸で滴定されたエタノールアミンは再生及びタンパク質収率への相乗的効果を生じなかった。

例えば実施例４及び６に示す通り、インターロイキン−４誘導体及びＢＰＴＩは、ＴＲＩＳ及びサルフェートイオンより成る組み合わせ緩衝系（硫酸滴定）において有効に再生することができる。インターロイキン−４誘導体の場合、好ましくは２５０〜１０００［ｍｇ／Ｌ］、より好ましくは４００〜７００［ｍｇ／Ｌ］そしてさらにもっと好ましくは４５０〜５５０［ｍｇ／Ｌ］のタンパク質濃度を用いることができる。安定化ジスルフィド結合の形成を可能にするために、Ｌ−システインが好ましくは１〜４［ｍＭ］において、より好ましくは２．５〜３．５［ｍＭ］において再生混合物中に含まれねばならない。ＴＲＩＳ／Ｈ_２ＳＯ_４は好ましくは１〜３［Ｍ］において、より好ましくは１．４〜２．４［Ｍ］において存在しなければならない。バッファーのｐＨは約７〜９、より好ましくは７〜８そして最も好ましくは７．５に調整される。

ＢＰＴＩの場合、好ましくは５００〜１０００［ｍｇ／Ｌ］、より好ましくは６００〜８００［ｍｇ／Ｌ］そしてさらにもっと好ましくは７００〜８００［ｍｇ／Ｌ］のタンパク質濃度を用いることができる。安定化ジスルフィド結合の形成を可能にするために、Ｌ−システインが好ましくは２．５〜４［ｍＭ］において、より好ましくは３．０〜３．５［ｍＭ］において再生混合物中に含まれねばならない。ＴＲＩＳ／Ｈ_２ＳＯ_４は好ましくは０．２〜１．４［Ｍ］において、より好ましくは０．３〜１．０［Ｍ］において存在しなければならない。バッファーのｐＨは約７〜９、より好ましくは７〜８そして最も好ましくは７．５に調整される。

さらにもっと驚くべきことに、トリエタノールアミンは折りたたみ中間体を有効に可溶化し（８００％）、再生タンパク質の純度に影響せず（ホスフェート標準と同等の４４．１％）、最高の再生収率（ホスフェート標準に比べて１０３９％）を生ずる。

例えば実施例５に示す通り、インターロイキン−４誘導体は、ＴＥＡ及びサルフェートイオンより成る組み合わせ緩衝系（硫酸滴定）において有効に再生することができる。好ましくは２５０〜１０００［ｍｇ／Ｌ］、より好ましくは４００〜７００［ｍｇ／Ｌ］そしてさらにもっと好ましくは４５０〜５５０［ｍｇ／Ｌ］のタンパク質濃度を用いることができる。安定化ジスルフィド結合の形成を可能にするために、Ｌ−システインが好ましくは０．４〜４［ｍＭ］において、より好ましくは０．８〜２［ｍＭ］において再生混合物中に含まれねばならない。ＴＥＡ／Ｈ₂ＳＯ₄は好ましくは０．５〜２［Ｍ］において、より好ましくは０．８〜１．５［Ｍ］において存在しなければならない。バッファーのｐＨは約７〜９、より好ましくは７〜８そして最も好ましくは７．５に調整される。

表１に挙げられるデータを一緒にし、一般的化学的原理を明らかにする構造−機能の関連性を推論することができる：最も有効な凝集抑制剤は、置換基Ｒ_１、Ｒ_２及びＲ_３を有する第１級、より好ましくは第２級又は第３級アミンであり、式中、Ｒ_１及びＲ_２はリガンドＨ、Ｏ＝Ｃ−ＮＨ_２、（ＣＨ_２）_４−ＮＨ_２、（ＣＨ_２）_３−ＣＯＯＨ、（ＣＨ_２）_２−ＣＨＯＨ−ＣＨ_３、ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＯＨ、ＣＨ_２−ＣＨ_３、ＣＨ_３、ＮＨ_２のいずれかの組み合わせであることができる。残基Ｒ_３はＣ（ＮＨ_２）＝ＮＨ、Ｃ（ＣＨ_２ＯＨ）_３、ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＯＨ又はＨであることができる。

アミン官能基の中心的役割は、中心アミン基が酸素基に取り替えられており、可溶性タンパク質の回収率の完全な喪失（凝集抑制剤が加えられない標準と等しい）及び正しく折りたたまれたインターロイキン−４誘導体の喪失を生ずるカナバニン−サルフェートを用いて示された。表１に挙げられているデータは、対イオンも有意な役割を果たし得ることも示している。サルフェートイオンは再生収率及びタンパク質凝集の妨害に関してクロリドイオンより優れている。従って上記のようなアミン及び硫酸のサルフェート塩の組み合わせがタンパク質凝集体の形成を最も有効に妨害し、タンパク質をその本来のコンフォーメーションに再生させる。

分析法
分析的ＲＰ−ＨＰＬＣはＹＭＣＣ４カラム（５μ，２００Å，４．６ｘ２５０ｍｍ）上で、１．０ｍｌ／分の流量で行なわれる。検出は２１０ｎｍにおいて行なわれる。任意的なプレカラム（２０ｍｍｘ４ｍｍ）にはＳｏｕｒｃｅ１５ＲＰＣ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｓｗｅｄｅｎ）が充填される。バッファーＡは０．１％ＴＦＡであり、バッファーＢは７０％のアセトニトリルを含む０．１％ＴＦＡである。勾配は以下の通りに行なわれる：０−２分，４０％Ｂ；２−１９．５分，４０％−８５％Ｂ；１９．５−２０分，８５％−１００％Ｂ；２０−２１分，１００％Ｂ，２１−２２分，１００％−４０％Ｂ，２２−２５分，４０％Ｂ（再平衡化）。正しく折りたたまれたインターロイキン−４は、Ｈｅｗｌｅｔｔ−ＰａｃｋａｒｄＬＣ１１００システムを用いて１６分の保持時間で溶離する。正しく折りたたまれたＢＰＴＩは１２．８分の保持時間で溶離する。再生混合物の試料は分析前に滅菌濾過される（０．２２μカット−オフ）。

非変性形態の保持時間で溶離するピークを積分し、［ｍｇ／Ｌ］単位で表される再生収率を得、正しく折りたたまれたタンパク質の濃度に対応させる（外部標準曲線に基づいて計算）。面積の総計（ｔｏｔａｌａｒｅａｃｏｕｎｔｓ）は、［ｍｇ／Ｌ］単位で現される再生混合物中に存在する可溶性たんぱく質の濃度に相当する。これらの２つの値の比は［％］単位で表される再生たんぱく質の純度を与える。

合計タンパク質濃度はトリクロロ酢酸沈殿の後に決定され、それは商業的に入手可能なＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ，ＵＳＡ）及びキャリブレーション標準としてウシ血清アルブミン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用い、生化学的標準法に従って行なわれた。

再生実験のための出発材料の調製
８Ｍのグアニジニウムヒドロクロリドを含有する０．２ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ９の存在下でタンパク質を可溶化し、１０［ｇ／Ｌ］の最終的タンパク質濃度を得た。次いで３０［ｇ／Ｌ］の亜硫酸ナトリウム及び６０［ｇ／Ｌ］のテトラチオン酸カリウムの添加によりＳＨ基を亜硫酸分解した。亜硫酸塩の添加の後、亜硫酸塩と可溶化されたタンパク質中に存在するジスルフィドの反応を完全に行なわせるために、溶液を室温で３０分間攪拌した。続いてテトラチオン酸塩を加え、ＳＨ基のジスルフィドへの転換及びＳ−サルファイト基への開裂を完了させるために、溶液をさらに９０分間攪拌する。最後に１．２μ−カットオフ深度のフィルター（例えばＳａｒｔｏｐｕｒｅＰＰ２，１．２μ，ＳａｒｔｏｒｉｕｓＡＧ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を介して溶液を濾過した。次いで限外濾過膜（カット−オフ１０．０００ＭＷ，例えばＨｙｄｒｏｓａｒｔ１０ｋＤ，ＳａｒｔｏｒｉｕｓＡＧ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用い、４Ｍのグアニジニウムヒドロクロリドを含有する０．２ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ９より成る５体積のダイアフィルトレーションバッファーに対して溶液をダイアフィルトレーションした。限外濾過装置から収穫される保持物質は約１０［ｇ／Ｌ］の最終的タンパク質濃度を含有し、２〜８℃で最高２週間保存された。

変性し、亜硫酸分解されたタンパク質を含有する実施例２からのタンパク質溶液をリフォールディングバッファー中に希釈し、ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ，ＵＳＡ）により決定される２５０［ｍｇ／Ｌ］の最終的タンパク質濃度を得た。リフォールディングバッファーは以下の成分から成った：
◆５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー，ｐＨ７．５
◆１ｍＭエチレンジアミン四酢酸，四ナトリウム塩（ＥＤＴＡ）
◆０．８ｍＭＬ−システイン
◆ある量の表１に示される凝集抑制剤。

再生溶液の合計の最終的体積は５０ｍＬであった（ガラス瓶，Ｓｃｈｏｔｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。ガラス瓶にパラフィルムで蓋をした。磁気棒攪拌機上で攪拌して（１００〜２００ｒｐｍ）２４〜３６時間内に再生を完了させた。時々試料を採取し、ＲＰ−ＨＰＬＣにより分析した（実施例１を参照されたい）。

ＴＲＩＳ−硫酸に基づく系を用いるインターロイキン−４誘導体の再生の多因子最適化（ｍｕｌｔｉｆａｃｔｏｒｉａｌｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ）
魅力的な凝集抑制剤の組み合わせはＴＲＩＳ−塩基／Ｈ_２ＳＯ_４−系である。従って多因子分析を用いるさらなる最適化のためにこの系を選んだ。

変性し、亜硫酸分解されたタンパク質を含有する実施例２からのタンパク質溶液をリフォールディングバッファー中に希釈し、表３に示す最終的タンパク質濃度を得た。リフォールディングバッファー組成の以下の側面を調べた：ＴＲＩＳ−塩基の濃度（０．５〜３［Ｍ］）、Ｈ_２ＳＯ_４の濃度（ＴＲＩＳ−濃度に依存して；０．４〜１．４［Ｍ］）、残留グアニジニウムヒドロクロリド濃度（８０〜４００ｍＭ）、Ｌ−システイン濃度（０．４〜４［ｍＭ］）及び初期タンパク質濃度（５０〜１０００［ｍｇ／Ｌ］）。リフォールディングバッファーのｐＨを７．５に調整した。すべての再生混合物は１ｍＭのＥＤＴＡを含有した。

この実施例に記載される実験は、すべての単一の因子及びすべての２因子相互作用の重要性を評価するために正しく折りたたまれたインターロイキン−４誘導体収率データの多因子統計的分析を可能にするために設計された。部分的三次実験設計（ｐａｒｔｉｏｌｃｕｂｉｃｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｄｅｓｉｇｎ）を作り、得られるデータをやはり部分的三次モデルを用いて分析した。部分的三次モデルの多項の係数（ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓｏｆｔｈｅｐｏｌｙｎｏｍｓ）を表２に示す。

これらの成分の選ばれた組み合わせを用いて得られる収率を表３に示す。これらの結果の検分は、用いられた実験条件下で以下の傾向が明らかであったことを示す：（１）最高の再生収率は高いたんぱく質濃度において得られる（７５０〜１０００［ｍｇ／Ｌ］）；（２）最高の全体的再生収率は２５０〜６５０［ｍｇ／Ｌ］の合計タンパク質濃度において得られる；（３）最適Ｌ−システイン濃度範囲は２．５〜４［ｍＭ］である；（４）最適Ｔｒｉｓ−Ｈ_２ＳＯ_４−濃度範囲は１．４〜２．４［Ｍ］である；（５）最高のタンパク質回収率は低いタンパク質濃度（５０〜２５０［ｍｇ／Ｌ］）、高いＴｒｉｓ−Ｈ_２ＳＯ_４−濃度（２〜３［Ｍ］）及び２〜３．５［ｍＭ］のＬ−システインにおいて得られる；（６）最高の純度は高いタンパク質濃度（４００〜１０００［ｍｇ／Ｌ］）、高いＬ−システイン濃度（２．５〜４［ｍＭ］）において得られる。純度はＴｒｉｓ−Ｈ_２ＳＯ_４濃度に無関係である。

最適再生収率、純度及びタンパク質回収率の間の妥協は、以下の設定を用いて同定された：５００ｍｇ／Ｌの合計タンパク質、３．３ｍＭのＬ−システイン、２ＭのＴｒｉｓ−Ｈ_２ＳＯ_４及び１ｍＭのＥＤＴＡ。

これらの最適条件を用いるチェックポイントは、予測及び測定応答値が理論的に十分に一致することを明らかにし、モデルが適切であることを示した。
全体的再生収率予測値：２４．９［％］（±１．８４標準誤差）
測定値：２５．４［％］（±０．３７標準誤差）
タンパク質回収率予測値：６５．９［％］（±６．５５標準誤差）
測定値：６２．９［％］（±０．６３標準誤差）
純度予測値：３８．６［％］（±３．６３標準誤差）
測定値：４０．４［％］（±０．４５標準誤差）
再生収率予測値：１２７［ｍｇ／Ｌ］（±１４．５標準誤差）
測定値：１２６．９［ｍｇ／Ｌ］（±１．８５標準誤差）

トリエタノールアミン−硫酸に基づく系を用いるインターロイキン−４誘導体の再生の多因子最適化
別の魅力的な凝集抑制剤の組み合わせはトリエタノールアミン（ＴＥＡ）／Ｈ_２ＳＯ_４−系である。従ってさらなる最適化及びタンパク質濃度のスケールアップのためにこの系を選んだ。

変性し、亜硫酸分解されたタンパク質を含有する実施例２からのタンパク質溶液をリフォールディングバッファー中に希釈し、表５に示す最終的タンパク質濃度を得た。リフォールディングバッファー組成の以下の側面を調べた：ＴＥＡの濃度（１〜２［Ｍ］）、Ｈ_２ＳＯ_４の濃度（ＴＥＡ−濃度に依存）、残留グアニジニウムヒドロクロリド濃度（８０〜４００ｍＭ）、Ｌ−システイン濃度（０．４〜４［ｍＭ］）及び初期タンパク質濃度（５０〜１０００［ｍｇ／Ｌ］）。リフォールディングバッファーのｐＨを７．５に調整した。すべての再生混合物は１ｍＭのＥＤＴＡを含有した。

この実施例に記載される実験は、すべての単一の因子及びすべての２因子相互作用の重要性を評価するために正しく折りたたまれたインターロイキン−４誘導体収率データの多因子統計的分析を可能にするために設計された。部分的三次実験設計を作り、得られるデータをやはり部分的三次モデルを用いて分析した。部分的三次モデルの多項の係数を表４に示す。

これらの成分の選ばれた組み合わせを用いて得られる収率を表５に示す。これらの結果の検分は、用いられた実験条件下で以下の傾向が明らかであったことを示す：（１）最高の再生収率は高いたんぱく質濃度において得られる（７５０〜１０００［ｍｇ／Ｌ］）；（２）最高の全体的再生収率は１００〜５５０［ｍｇ／Ｌ］の合計タンパク質濃度において得られる；（３）最適Ｌ−システイン濃度範囲は０．４〜４［ｍＭ］である；（４）最適ＴＥＡ−Ｈ_２ＳＯ_４−濃度範囲は１〜１．６［Ｍ］である；（５）最高のタンパク質回収率は低いタンパク質濃度（５０〜２５０［ｍｇ／Ｌ］）、高いＴＥＡ−Ｈ_２ＳＯ_４−濃度（１．５〜２［Ｍ］）及び４〜１０［ｍＭ］のＬ−システインにおいて得られる；（６）最高の純度は高いタンパク質濃度（６００〜１０００［ｍｇ／Ｌ］）、０．４〜４［ｍＭ］）の範囲のＬ−システイン濃度及び０．８〜１．５［Ｍ］の範囲のＴＥＡ−Ｈ_２ＳＯ_４濃度において得られる。

最適再生収率、純度及びタンパク質回収率の間の妥協は、以下の設定を用いて同定された：５００ｍｇ／Ｌの合計タンパク質、０．８ｍＭのＬ−システイン、１．４ＭのＴＥＡ−Ｈ_２ＳＯ_４及び１ｍＭのＥＤＴＡ。

これらの最適条件を用いるチェックポイントは、予測及び測定応答値が理論的に十分に一致することを明らかにし、モデルが適切であることを示した。
全体的再生収率予測値：２４．６［％］（±４．１標準誤差）
測定値：２４．３［％］（±０．８標準誤差）
タンパク質回収率予測値：５２．８［％］（±１０．５標準誤差）
測定値：５８．２［％］（±４．５標準誤差）
純度予測値：４３．２［％］（±５．３標準誤差）
測定値：４１．８［％］（±３．９標準誤差）
再生収率予測値：１０６．８［ｍｇ／Ｌ］（±１６．９標準誤差）
測定値：１２１．６［ｍｇ／Ｌ］（±２．０標準誤差）

ＴＲＩＳ−硫酸に基づく系を用いるウシ膵臓トリプシン阻害剤（ＢＰＴＩ，アプロチニン）の再生
ＴＲＩＳ／Ｈ_２ＳＯ_４−系がインターロイキン−４誘導体以外の他のタンパク質の再生にも用いられ得ることを示すために、ＴＲＩＳ／Ｈ_２ＳＯ_４−系をＢＰＴＩに関しても最適化した。

変性し、亜硫酸分解されたタンパク質を含有する実施例２からのタンパク質溶液をリフォールディングバッファー中に希釈し、表７に示す最終的タンパク質濃度を得た。リフォールディングバッファー組成の以下の側面を調べた：ＴＲＩＳの濃度（０〜２［Ｍ］）、Ｈ_２ＳＯ_４の濃度（ＴＲＩＳ−濃度に依存）、残留グアニジニウムヒドロクロリド濃度（８０〜４００ｍＭ）、Ｌ−システイン濃度（０．１〜４［ｍＭ］）及び初期タンパク質濃度（５０〜１０００［ｍｇ／Ｌ］）。リフォールディングバッファーのｐＨを７．５に調整した。すべての再生混合物は１ｍＭのＥＤＴＡを含有した。

この実施例に記載される実験は、すべての単一の因子及びすべての２因子相互作用の重要性を評価するために正しく折りたたまれたＢＰＴＩ収率データの多因子統計的分析を可能にするために設計された。部分的三次実験設計を作り、得られるデータをやはり部分的三次モデルを用いて分析した。部分的三次モデルの多項の係数を表６に示す。

これらの成分の選ばれた組み合わせを用いて得られる収率を表７に示す。これらの結果の検分は、用いられた実験条件下で以下の傾向が明らかであったことを示す：（１）最高の再生収率は高いたんぱく質濃度において得られる（７５０〜１０００［ｍｇ／Ｌ］）；（２）最高の全体的再生収率は５００〜１０００［ｍｇ／Ｌ］の合計タンパク質濃度において得られる；（３）最適Ｌ−システイン濃度範囲は２．５〜４［ｍＭ］である；（４）最適Ｔｒｉｓ−Ｈ_２ＳＯ_４−濃度範囲は０．２〜１．０［Ｍ］である；（５）最高のタンパク質回収率は低いタンパク質濃度（５０〜１００［ｍｇ／Ｌ］）、中度のＴｒｉｓ−Ｈ_２ＳＯ_４−濃度（０．９〜１．４［Ｍ］）及び１．８〜３．３［ｍＭ］のＬ−システインにおいて得られる；（６）最高の純度は低いタンパク質濃度（５０〜１００［ｍｇ／Ｌ］）、０．１〜０．４［ｍＭ］の範囲のＬ−システイン濃度及び０．１〜０．５［Ｍ］の範囲のＴＲＩＳ−Ｈ_２ＳＯ_４濃度おいて得られる。

最適再生収率、純度及びタンパク質回収率の間の妥協は、以下の設定を用いて同定された：７００ｍｇ／Ｌの合計タンパク質、３．３ｍＭのＬ−システイン、０．３ＭのＴｒｉｓ−Ｈ_２ＳＯ_４及び１ｍＭのＥＤＴＡ。

Claims

タンパク質濃度２５０〜１０００ｍｇ／Ｌのインターロイキン４又はインターロイキン４の突然変異タンパク質の再生方法であって、変性し、化学的に修飾された又は還元されたタンパク質の溶液に、Ｌ−システインと１〜３ｍｏｌ／Ｌ濃度のトリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン／Ｈ ₂ ＳＯ ₄ 又は０．５〜２ｍｏｌ／Ｌ濃度のトリエタノールアミン／Ｈ ₂ ＳＯ ₄ とを含むリフォールディングバッファーを加える工程を含んでなる、上記方法。
バッファーがさらに溶解性増強剤を含有する請求項１記載の方法。
溶解増強剤がイオンである請求項２記載の方法。
溶解増強剤が塩素イオンである請求項３記載の方法。