PT1453858E - Processo de renaturação de proteínas recombinantes que contêm dissulfureto a elevadas concentrações proteicas, na presença de aminas - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

"PROCESSO DE RENATURAÇÃO DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES QUE CONTÊM DISSULFURETO A ELEVADAS CONCENTRAÇÕES PROTEICAS, NA PRESENÇA DE AMINAS" Âmbito da invenção A presente invenção refere-se a um processo de renaturação de proteínas eucariotas recombinantes, contendo ligações dissulfureto após expressão em procariotas.

Antecedentes e técnica anterior

No caso da produção de proteínas recombinantes em sistemas de expressão heterólogos, como por exemplo Escherichia coli, estas proteínas formam frequentemente agregados inactivos e insolúveis (designados "corpos retrácteis" ou corpos de inclusão"). Adicionalmente, estes corpos de inclusão estão contaminados pelos componentes da célula hospedeira, tais como proteínas da célula hospedeira, ácidos nucleicos, endotoxinas e contaminantes de baixo peso molecular. Parte-se do princípio que a formação destes corpos de inclusão é um resultado de uma concentração local muito elevada da proteína heteróloga na célula durante a indução e biossíntese da proteína. No entanto, a sequência de aminoácidos principal da proteína heteróloga em questão tem também grande importância, bem como a presença de resíduos cisteína que formam ligações dissulfureto covalentes durante o reenrolamento oxidativo. Antes de se poder utilizar estas proteínas-alvo, por exemplo para fins terapêuticos, os corpos de inclusão têm 2 de ser purificados e, subsequentemente, a estrutura tridimensional tem de ser renaturada para converter a proteína na conformação biologicamente activa.

Uma sequência de fases do processo, vulgarmente aplicada, envolve primeiro a solubilização dos corpos de inclusão mediante a adição de elevadas concentrações de agentes caotrópicos, desnaturantes (por exemplo, cloridrato de guanidínio ou ureia) ou mediante a adição de agentes muito ácidos como por exemplo misturas de glicina/ácido fosfórico. Simultaneamente, as ligações dissulfureto intramoleculares presentes nos corpos de inclusão tanto podem ser reduzidas quimicamente ou clivadas pelo procedimento designado sulfitólise, envolvendo sulfito e um agente oxidante. Em segundo lugar, a mistura proteica solubilizada pode ser ainda purificada por meios cromatográficos ou métodos de filtração, os quais são ambos procedimentos bem conhecidos dos peritos na técnica.

Seguidamente, a solução proteica monomérica linearizada, em presença de grandes concentrações de agente caotrópico, é muito diluída a fim de permitir a formação da forma biologicamente activa. Esta operação pode ser executada tanto rapidamente (por meio de simples diluição num grande volume de tampão de reenrolamento) ou lentamente por meio de diafiltração ou por meio de diálise contra o tampão de reenrolamento. Outras técnicas descritas na literatura envolvem a adsorção da proteína alvo numa resina de cromatografia e, seguidamente, diminuir a concentração de agente caotrópico permitindo a ocorrência do reenrolamento, ou cromatografia por exclusão de tamanho a fim de separar as cadeias de proteína, contornando a tendência para formar agregados. Em todos os casos, a 3 concentração do sal caotrópico tem de ser diminuída abaixo de um determinado limite, o que depende da proteína alvo, por exemplo normalmente abaixo de 0,5 M de cloridrato de guanidínio. A D2 apresenta um método de purificação da interleuquina-4 humana, expressa em E. coli compreendendo a fase de reenrolamento da proteína desnaturada mediante diluição da respectiva solução num tampão TRIS que inclui ainda glutationa. A principal reacção secundária durante o reenrolamento consiste na formação de agregados insolúveis, os quais dependem da concentração local de intermediários de enrolamento. Na literatura são descritos numerosos adjuvantes do enrolamento, que suprimem efectivamente esta formação de agregados de proteínas insolúveis, como por exemplo proteínas chaperon, outros tipos de proteínas (por exemplo albumina de soro de bovino) e vários tipos de materiais não-proteicos, incluindo açúcares e açúcares cíclicos, álcoois de cadeia curta, como por exemplo glicerol pentanol, hexanol, substratos enzimáticos, polímeros sintéticos, detergentes e sais caotrópicos (de Bernardez Clark, E (1998): Curr. Opinion Biotechnol. 9: 157-163 e citações incluídas; Lilie H, Schwarz E, Rudolph R (1998): Curr. Opinion Biotechnol. 9:947-501 e citações incluídas; Sharma A, Karuppiah N (1998): patente norte-americana 5, 728, 804 depositada a 2 de Junho de 1995). Foi recentemente publicada uma diferente abordagem em que os ditos chaperons artificiais são utilizados para manter intermediários de enrolamento hidrofóbicos em solução (Gellman S, Rozema DB (1996): patente norte-americana 5,563,057 depositada a 31 de Outubro de 1994). Numa 4 primeira fase, os intermediários de enrolamento hidrofóbicos encontram-se retidos em micélios de detergente, conduzindo à supressão da agregação de proteínas. Os intermediários de enrolamento retidos não podem enrolar-se na conformação nativa. Numa segunda fase, é adicionado um "agente de dessorção", como por exemplo diferentes ciclodextrinas ou dextrinas lineares, num excesso molar considerável para remover novamente o detergente, permitindo que a proteína se reenrole na sua conformação biologicamente activa. Existem várias desvantagens nesta abordagem, como Io. 0 grande excesso molar do dispendioso "agente de dessorção"; 2o. A ocorrência da agregação proteica durante as fases de "stripping" (ou dessorção); 3o. Dificuldade em remover o detergente residual ligado à proteína alvo; 4o. Limitações da capacidade proteica e solubilidade das ciclodextrinas e 5o. Sensibilidade do sistema chaperon artificial no que respeita às variações do processo (robustez limitada). Além disso, os sistemas chaperon artificiais são específicos no que respeita à proteína alvo, o tipo de detergente e o "agente de dessorção" e as condições experimentais empregues. Assim, não existe um sistema chaperon artificial genérico (Daugherty dl, Rozema D, Hanson PE, Gellman SH (1998): J. Biol. Chem. 273: 33961-33971; Rozema D, Gellman SH (1996): J. Biol. Chem. 271: 3478-3487). A maioria dos supressores da agregação mencionados anteriormente funciona apenas com um número limitado de proteínas. Uma excepção consiste no aminoácido L-arginina, o qual já se demonstrou que é aplicável em geral a uma vasta gama de diferentes proteínas como, por exemplo, t-PA, fragmentos Fab, lisozima e outras enzimas (Rudolph R, 5

Fischer S, Mattes R (1997) : Process for the activating of gene-technologically produced, heterologous, disulfide bridge-containing eukaryotic proteins after expression in prokaryotes. patente norte-americana 5,593,865; Rudolph R, Fischer S, Mattes R (1995) : Process for the activation of T-PA or ING after genetic expression in prokaryotes. patente norte-americana 5,453,363; de Bernardez Clark, E (1998): Curr. Opinion Biotechnol. 9: 157-163 e citações inclusas).

Demonstrou-se que a L-arginina só é eficaz para várias proteínas apenas em elevado excesso molar relativamente à molaridade da proteína que se pretende reenrolar. 0 mecanismo de supressão dos agregados proteicos pela L-arginina é ainda desconhecido (Lilie H et al. (1998): Curr. Opinion Biotechnol. 9: 497-501). Além disso, a L-arginina é um produto químico quiral dispendioso.

Assim, existe ainda uma necessidade de desenvolvimento de estratégias para reenrolamento de proteínas com técnicas convencionais. No actual estado da técnica não é conhecido qualquer supressor da agregação de uso geral, quimicamente simples e barato, que possa ser aplicado num processo de reenrolamento, comercialmente atractivo, de proteínas a elevadas concentrações até 0,5 a 1 g/L.

Resumo da invenção a elevadas A começar com agregados de proteínas insolúveis (chamadas corpos de inclusão), como obtidos por sobre--expressão em Escherichia coli, a tarefa da presente invenção consiste em disponibilizar uma via comercialmente atractiva de renaturação de proteínas, isto é interleuquina-4 e respectivos derivados, 6 concentrações de proteína, empregando um supressor da agregação adequado, quimicamente simples e facilmente obtido. Devido a esta falta de especificidade, o(s) supressor (es) de agregação, como descrito na presente invenção pode ser aplicado a uma vasta gama de diferentes proteínas. 0 método presentemente descrito compreende a adição a uma solução de proteína desnaturada, quimicamente modificada ou reduzida, num tampão de reenrolamento contendo L-cisteína e TRIS/H2SO4 ou trietanolamina/H2S04.

Numa forma de realização preferida, o tampão de reenrolamento contém ainda um intensificador de solubilidade como, por exemplo iões adicionais, como por exemplo cloreto, que ajudam na supressão da formação de agregados de proteínas por sinergia. É sabido que no caso de um grande número de proteínas da técnica anterior, para renaturação, não podem ser ultrapassados determinados valores limite de concentração proteica. 0 nível destes limites de concentração depende da natureza da proteína que se pretende reenrolar. Reconhece-se agora que quantidades comparativamente elevadas da proteína desnaturada não implicam quantidades maiores de volume da solução para se conseguir grandes quantidades de proteína reenrolada devido à excessivamente elevada capacidade de solubilização da(s) amina(s) referida anteriormente ou uma combinação das aminas mencionadas e outro intensificador da solubilidade. 0 objecto da presente invenção inclui, assim, a apresentação: 7 a) um método do tipo anteriormente referido, tal como definido na reivindicação 1 anexa, para reenrolar a proteina inactiva numa conformação nativa, suprimindo efectivamente a formação de agregados proteicos, provocando perda de rendimento de reenrolamento e recuperação da proteína solúvel; b) um método do tipo anteriormente referido, tal como definido na reivindicação 1 anexa, que permite o reenrolamento a elevadas concentrações de proteína e c) um método do tipo anteriormente referido, tal como definido na reivindicação 1 anexa, que pode ser utilizado com produtos químicos comerciais não-quirais, baratos.

Definições

Tal como presentemente utilizado, o termo "derivado de interleuquina-4" refere-se a muteínas de interleuquina-4 humanas com resíduos de aminoácidos alterados em diferentes locais da cadeia de polipeptídeos, de acordo com Sebald, W (1992): patente norte-americana 5,723,118 e patente EP 613499B1 com data de 13 de Nov. de 1992 e Domingues et al. (1999): pedido de patente PCT PCT/IB00/00769.

Tal como presentemente utilizado, o termo BPTI refere-se a um inibidor da tripsina pancreática de bovino (também designada aprotinina).

Tal como presentemente utilizado, "proteína correctamente reenrolada" refere-se à proteína alvo na sua estrutura nativa, exibindo a ligação dissulfureto nativa. 0 "rendimento de reenrolamento", tal como presentemente utilizado, é definido como a concentração de proteína alvo, 8 não-modifiçada, correctamente enrolada (por exemplo [mg/1]) na mistura de renaturação. 0 "rendimento de reenrolamento geral", tal como presentemente utilizado, é definido como a concentração de proteína alvo, não-modifiçada, correctamente enrolada (por exemplo [mg/1]) dividida pela quantidade total de proteína na mistura de renaturação. 0 rendimento de reenrolamento geral é expresso em [%].

Os termos "recuperação de proteína" ou "recuperação de proteína solúvel", tal como presentemente utilizado, refere-se à proporção de proteína solúvel recuperada após reenrolamento e a proteína total inicial. A recuperação de proteína é expresso em [%]. 0 termo "pureza" ([%]), tal como presentemente utilizado, é calculado com base no rendimento de reenrolamento da proteína alvo e na concentração de proteína solúvel na mistura de renaturação, como determinado por RP-hplc. 0 termo TRIS, tal como presentemente utilizado, refere-se à substância tampão básica tris-(hidroximetil)--aminometano. 0 termo TEA, tal como presentemente utilizado, refere-se à substância tampão básica trietanolamina. 0 termo GndHCl, tal como presentemente utilizado, refere-se ao sal caotrópico cloridrato de guanidínio.

Descrição pormenorizada das formas de realização preferidas 0 assunto da presente invenção consiste num processo de reactivação de proteínas recombinantes com ponte 9 dissulfureto após expressão heteróloga em procariotas, conduzindo a corpos de inclusão insolúveis que são, depois da purificação destes agregados proteicos, desnaturados a elevadas concentrações de um sal caotrópico adequado, quimicamente modificados (formação de um dissulfureto misto entre grupos proteina-SH e um mercaptanos adequado ou introdução de um grupo dissulfureto nos grupos proteina SH para formar grupos S-SO3) e renaturado no tampão de reenrolamento. Outras combinações com outros intensificadores da solubilidade, como por exemplo cloreto, são eficazes na prevenção da agregação das proteínas. A produção de derivados de interleuquina-4 recombinantes, empregando Escherichia coli como organismo hospedeiro já foi descrita detalhadamente (Apeler H, Wehlmann H (1999) Plasmids, their construction and their use in the manufacture of lnterleukin-4 and lnterleukin-4 muteins. EP 10 22 339, 2000-07-26). Métodos de colheita de células, disrupção de células, purificação dos corpos de inclusão, solubilização e modificação química de grupos SH são procedimentos bem conhecidos dos peritos na técnica (Creighton TE (ed.) (1989) : Protein structure - A Praticai Approach. IRL Press, Oxford, ova Iorque, Tóquio).

Da técnica anterior sabe-se que os agentes químicos de baixo peso molecular podem suprimir a formação de agregados durante o reenrolamento. Por conseguinte, analisou-se um largo espectro de produtos químicos a fim de encontrar um supressor de agregação adequado para empregar no processo de reenrolamento do derivado de interleuquina-4, mas também de outras proteínas como, por exemplo BPTI. 10

Como indicado no exemplo 1 (quadro 1), vários produtos químicos auxiliam efectivamente na solubilização de intermediários de enrolamento, resultando num aumento significativo da recuperação da proteína solúvel. No entanto, este facto não significa necessariamente que estes compostos conduzam também a um significativo aumento do rendimento da isoforma dissulfureto biologicamente activa correctamente enrolada (ver coluna "rendimento de reenrolamento relativo" no quadro 1). Por exemplo, o detergente cloreto de cetil trietanolamónio (CTAC) solubiliza efectivamente os intermediários de enrolamento, conduzindo a um aumento do rendimento proteico de 735 %, em comparação com o controlo com fosfato. No entanto, o CTAC é incapaz de aumentar o rendimento da isoforma dissulfureto correctamente enrolada, resultando num baixo rendimento de reenrolamento e fraco grau de pureza. Vários agentes enumerados no quadro 1 são bem conhecidos da técnica anterior quanto à sua capacidade para ajudar como supressor de agregação durante o reenrolamento, como por exemplo L-arginina, ureia, cloridrato de guanidínio, poli(etileno)glicóis, acetamida e álcoois de cadeia curta. No entanto, a maioria destes falhou no caos do derivado de interleuquina-4, com excepção da L-arginina e, em menor escala, cloridrato de guanidínio. O cloridrato de guanidínio solubiliza eficazmente os intermediários de enrolamento a concentrações ideais de 750 mM. Os derivados N-metilados ou N-etilados e sulfato de bis(-1-aminoguanidínio) são mais eficazes a solubilizar intermediário de enrolamento a baixas concentrações (200— 600 mM) em comparação com cloridrato de guanidínio. No 11 entanto, a pureza da proteína reenrolada (18,4 a 27,1 %) é muito menor em comparação com o controlo com fosfato.

Surpreendentemente, o agente tampão Tris(hidroximetil)-aminometano (TRIS), em combinação com ácido sulfúrico a altas concentrações afectou positivamente a solubilização dos intermediários de enrolamento (850 %) e rendimento de enrolamento (677 %), diminuindo moderadamente a pureza em comparação com o controlo com fosfato. O TRIS é amplamente utilizado em concentrações muito baixas (<0,1 M) como substância tampão em misturas de reenrolamento, mas não a altas concentrações como supressor de agregação. A etanolamina, que se encontra estruturalmente relacionada com o tris, afectou também positivamente a solubilização dos intermediários de enrolamento (titulação do pH com HC1) , resultando em enrolamento e rendimentos proteicos e graus de pureza comparáveis. A comparação de Tris titulado com ácido sulfúrico em comparação com ácido clorídrico revela o efeito positivo adicional dos iões sulfato no rendimento proteico, rendimento de reenrolamento e grau de pureza. No entanto, a etanolamina titulada com ácido sulfúrico não teve como resultado efeitos sinergéticos no reenrolamento e rendimento proteico.

Por exemplo, o derivado de interleuquina-4 e BPTI, como se demonstra nos exemplos 4 e 6, pode ser reenrolado eficazmente num sistema tampão combinado, constituído por TRIS e iões sulfato (titulação de ácido sulfúrico). No caso do derivado de interleuquina-4, podem ser empregues concentrações de proteína de preferencialmente 250 a 1000 [mg/L], mais preferencialmente 400 a 700 [mg/L] e, ainda mais preferencialmente, 450 e 550 [mg/L]. A L-cisteína deve ser incluída na mistura de reenrolamento, a fim de permitir 12 a formação de ligações dissulfureto estabilizantes, de preferência a 1 a 4 [mM], mais preferencialmente a 2,5 e 3,5 [mM]. TRIS/H2S04 deve encontrar-se presente preferencialmente entre 1 e 3 [M], mais preferencialmente entre 1,4 e 2,4 [M]. 0 pH do tampão é ajustado a cerca de 7-9, mais preferencialmente 7 a 8 e com maior preferência 7,5.

No caso de BPTI, podem ser empregues concentrações de proteína preferencialmente de 500 a 1000 [mg/L], mais preferencialmente 600 a 800 [mg/L] e ainda mais preferencialmente 700 a 800 [mg/L], L-cisteína deve ser incluída na mistura de reenrolamento a fim de permitir a formação de ligações dissulfureto estabilizantes, de preferência 2,5 a 4 [mM] , mais preferivelmente 3,0 a 3,5 [mM] , o TRIS/H2SO4 deve encontrar-se presente de preferência a 0,2 a 1,4 [M], mais preferencialmente 0,3 a 1,0 [M] . O pH do tampão é ajustado a cerca de 7-9, mais preferivelmente 7 a 8 e com maior preferência 7,5.

Ainda mais surpreendentemente, a trietanolamina solubiliza efectivamente os intermediários de enrolamento (800 %) , não afecta a pureza da proteína reenrolada (44,1 %, o que é comparável ao controlo com fosfato), resultando no melhor rendimento de reenrolamento (1.039 % em comparação com o controlo com fosfato).

Por exemplo, o derivado de interleuquina-4, como apresentado no exemplo 5, pode ser reenrolado eficazmente num sistema tampão combinado, constituído por TEA e iões sulfato (titulação de ácido sulfúrico). Podem ser empregues concentrações de proteína preferencialmente de 250 a 1000 13 [mg/L], mais preferencialmente 400 a 700 [mg/L] e, ainda mais preferencialmente, 450 e 550 [mg/L]. A L-cisteina deve ser incluída na mistura de reenrolamento, a fim de permitir a formação de ligações dissulfureto estabilizantes, de preferência a 0,4 a 4 [mM], mais preferencialmente a 0,8 e 2 [mM] . TEA/H2S04 deve encontrar-se presente preferencialmente entre 0,5 e 2 [M], mais preferencialmente entre 0,8 e 1,5 [M]. O pH do tampão é ajustado a cerca de 7-9, mais preferencialmente 7 a 8 e com maior preferência 7,5.

Reunindo os dados indicados no quadro 1, pode-se deduzir uma relação estrutura-função reveladora de um principio químico geral: Os supressores da agregação mais eficazes são aminas primárias, mais preferencialmente aminas secundárias ou terciárias com substituições R4, R2 e R3, em que R4 e R2 podem ser qualquer combinação dos ligandos H, 0=C-NH2, (CH2)4-NH2, (CH2)3-COOH, (CH2)2-CHOH- CH3, CH2-CH2-OH, CH2-CH3, CH3, NH2. O resíduo R3 pode ser C(NH2)=NH, C(CH2OH)3, CH2-CH2-OH or H. O papel central da função amina ficou demonstrado com sulfato de canavanina, em que o grupo amina central é trocado por um grupo oxigénio, resultando numa perda completa da recuperação de proteína solúvel (igual ao controlo sem a adição de qualquer supressor de agregação) e a perda do derivado de interleuquina-4 correctamente enrolada. Os dados indicados no quadro 1 revelam também que o contra-ião pode também desempenhar um papel significativo. Os iões sulfato são superiores aos iões cloreto relativamente ao rendimento de reenrolamento e inibição da agregação proteica. Por conseguinte, uma 14 combinação de uma amina, tal como anteriormente descrita, e um sal sulfato de ácido sulfúrico inibem muito eficazmente a formação de agregados proteicos e permite que a proteína se reenrole na sua conformação nativa.

Exemplo 1 Métodos analíticos RP-HPLC analítico foi executado numa coluna YMC C4 (5 μ, 200Â, 4,6 x 250 mm) com um caudal de 1,0 ml/min.

Detecção executada a 210 nm. A pré-coluna opcional (20 mm x 4 mm) é carregada com Source 15 RPC (Pharmacia, Suécia). Tampão A é 0,1 % de TFA, tampão B é 0,1 % de TFE com 70 % de acetonitrilo. O gradiente é executado da seguinte forma: 0-2 min, 40 % B; 2-19,5 min, 40 %-85 % B; 19,5-20 min, 85 %—100 % B; 20-21 min, 100 % B, 21-22 min, 100 %-40 % B, 22-25 min, 40 % B (reequilíbrio). A interleuquina-4 correctamente enrolada elui a uma velocidade de retenção de 16 min, com um sistema Hewlett-Packard LC 1100 BPTI correctamente enrolado elui a uma velocidade de retenção de 12,8 min. As amostras das misturas de reenrolamento são esterilizadas por filtração (limiar 0,22 μ) antes da análise. O pico que elui no tempo de retenção da forma nativa encontra-se integrado, proporcionando o rendimento de reenrolamento expresso em unidades [mg/L] e corresponde à concentração da proteína correctamente enrolada (calculado com base nas curvas padrão externas). As contagens da área total correspondem à concentração da proteína solúvel presente na mistura de reenrolamento expressa em unidades [mg/L]. A proporção destes dois valores indica a pureza da proteína reenrolada expressa em unidades [%]. 15 A concentração total de proteína foi determinada após precipitação de ácido tricloroacético, a qual foi executada de acordo com os métodos padrão bioquímicos, utilizando a análise BCA disponível comercialmente (Pierce, EUA) e albumina de soro de bovino (Boehringer-Mannheim, Alemanha) como padrão de calibração.

Exemplo 2

Preparação dos materiais de partida para experiências de reenrolamento

As proteínas foram solubilizadas na presença de 0,2 M de Tris-HCl, pH 9 contendo 8 M de cloridrato de guanidínio para produzir uma concentração proteica final de 10 [g/L]. Os grupos SH foram depois sulfitolizados mediante adição de 30 [g/L] de sulfito de sódio e 60 [g/L] de tetrationato de potássio. Depois da adição de sulfureto, a solução foi agitada à temperatura ambiente durante 30 min a fim de permitir a reacção completa do sulfito com quaisquer dissulfuretos presentes nas proteínas solubilizadas. Posteriormente, foi adicionado o tetrationato e a solução foi agitada durante mais 90 min a fim de permitir a conversão de grupos SH em dissulfuretos e a clivagem em grupos S-sulfito ficar completa. Finalmente, a solução foi filtrada através de um filtro de 1,2 μ de limiar (por exemplo Sartopure PP2,1.2 μ, Sartorius AG, Alemanha). A solução foi sujeita a diafiltração contra 5 volumes de tampão de diafiltração consistindo em 0,2 M de Tris-HCl, pH 9 contendo 4 M de cloridrato de guanidínio, empregando uma membrana de ultrafiltração (limiar de 10,000 mW, por exemplo Hydrosart 10 kD, Sartorius AG, Alemanha). O retido colhido do aparelho de ultrafiltração continha uma 16 concentração final de proteína de aproximadamente 10 [g/L] e este foi guardado entre 2-8° C até 2 semanas.

Exemplo 3

Efeitos de diferentes produtos químicos no reenrolamento do derivado de interleuquina-4 A solução de proteínas do exemplo 2, contendo proteína sulfitolizada, desnaturada, é diluída no tampão de reenrolamento para produzir uma concentração final de proteínas de 250 [mg/L] como determinado pela análise BCA (Pierce, EUA). O tampão de reenrolamento é constituído pelos seguintes ingredientes: ♦50 mM de tampão de fosfato de sódio, pH 7,5 ♦ 1 mM de sal tetrassódico de ácido etilenodiaminotetraacético (edta) ♦0,8 mM de L-cisteína ♦Uma determinada quantidade de supressor de agregação como indicado no quadro 1. O volume final total da solução de reenrolamento foi 50 mL (frascos de vidro, Schott, Alemanha). Os frascos de vidro foram tapados com parafilm. Deixou-se decorrer o reenrolamento até estar completo, no espaço de 24-36 horas com agitação num agitador de barras magnético (100-200 rpm). A intervalos, foram colhidas amostras e analisadas por RP-HPLC (ver Exemplo 1).

Quadro 1 Resultados do rastreio de supressores da agregação 17

Grupo Composto Intervalo de concentração [mM] Concentração ideal [mM] Rendimento de reenrolamento relativo [%] do controlo com fosfato Solubilidade relativa da proteína [%] do controlo com fosfato Pureza [*] Controlo Fosfato 50 0 100 100 44,7 Aminoácidos L-Lisina 0-1500 400 386 315 32,8 L-Asparagina 0-200 200 107 93 37,8 L-Glutamina 0-150 75 99 89 37,4 D,L-Norleucina 0-100 50-100 106 93 37,2 L-Arginina 0-1200 600 873 845 32,5 Derivados de arginina ácido χ-guanidino-butírico 0-250 250 283 472 20,0 4-Guanidino-butano- 2-ol 0-1000 600 299 740 13,8 Sulfato de 4- Guanidino- butilamina 0-1000 200 177 456 20, 6 Sulfato de canavanína 0-1200 600 0 100 0 Agentes caotrópicos Ureia 0-1500 1500 285 209 37, 6 GuHCl 0-1000 750 609 915 18,4 sulfato de N-metilguanidinio 0-1000 600 720 1063 19,9 sulfato de N,N-dimetilguanidínio 0-1000 200 645 700 27,1 sulfato de N,N-dietilguanidínio 0-1000 400 691 963 21,1 18

Grupo Composto Intervalo de concentração [mM] Concentração ideal [mM] Rendimento de reenrolamento relativo [%] do controlo com fosfato Solubilidade relativa da proteína [%] do controlo com fosfato Pureza [*] sulfato de bis-(l-aminoguanidínio) 0-1000 400 798 1037 22,7 Detergentes Tween 80 0,1-100 100 169 221 21,1 Detergente zwiteriónico 3-14 0,01-10 0,01 85 76 30,3 Detergente zwiteriónico 3-12 0,1-100 0,1 110 168 18,3 CHAPS 0,5-500 5 120 167 28, 9 Triton X-100 0,1-100 1 140 570 6, 8 CTAC 0,1-100 100 57 735 1,2 Solventes Etanol 1-100 50 104 112 37,1 1-Propanol 1-100 10 96 103 37, 6 1-Butanol 1-100 5 102 107 38,5 1-Hexanol 1-100 1 88 80 44,1 Sais NaCl 0-1000 800-1000 495 575 41,4 NH4C1 0-1000 800-1000 504 635 37,2 N3-2 ΞΟ4 0-1000 ,200 456 505 41,2 (NH4) 2so4 0-1000 400 540 600 41 Tampões Fosfato 0-1000 200 182 175 41,5 TRIS-HC1 0-1000 1000 489 505 24, 6 tris-h2so4 0-1000 1000 677 850 37,8 19

Srupo Composto Intervalo de concentração [mM] Concentração ideal [mM] Rendimento de reenrolamento relativo [ %] do controlo com fosfato Solubilidade relativa da proteína [%] do controlo com fosfato Pureza [%] Etanolamina-HCl 0-1000 400 431 760 25, 8 Etanolamína-H2S04 200-600 400 61 81 25,7 Trietanolamina-H2SOi 0-2000 1500 1039 800 44,1 Outros Acetamida 0-2000 800-1500 136 126 34, 9 PEG 200 0-1 0,5-1,0 102 89 38, 5 PEG 400 0-1 1,0 111 93 41,2 PEG 600 0-1 0,05-0,25 111 114 33,1 PEG 1000 0-1 0,25 101 89 38, 8 PEG 2000 0-1 O »—1 1 LO O 132 122 35,2 PEG 3000 0-1 0,1-0,5 122 104 35 PEG 4000 0-1 0,1 153 133 37, 6 Controlo: Condições de reenrolamento: 50 mM de tampão de fosfato de sódio, ,pH 7,5, 1 mM de EDTA, 0,4 mM de L-cisteina, 250 mg/L concentração total de proteína Rendimento de reenrolamento: 8 mg/L de interleuquina-4 correctamente enrolada R121L Y124D (~3 % da proteína total), 23,5 mg/L recuperação de proteína solúvel (~9 % da proteína total).

Exenqplo 4

Optimização multifactorial do reenrolamento do derivado de interleuquina-4 empregando o sistema à base de TRIS-ácido sulfúrico

Uma combinação atractiva de supressores da agregação consiste no sistema TRlS-base/H2S04. Por conseguinte, este 20 sistema foi eleito para aprofundar a optimização empregando análise multifactorial. O volume final total da solução de reenrolamento foi 50 mL (frascos de vidro, Schott, Alemanha). Os frascos de vidro foram tapados com parafilm. Deixou-se decorrer o reenrolamento até estar completo, no espaço de 24-36 horas com agitação num agitador de barras magnético (100-200 rpm) . A intervalos, foram colhidas amostras e analisadas por RP-HPLC (ver Exemplo 1). A solução de proteínas do exemplo 2, contendo proteína sulfitolizada, desnaturada, é diluída no tampão de reenrolamento para produzir uma concentração final de proteína de indicada no quadro 3. Foram investigados os seguintes aspectos da composição de tampão de reenrolamento. Concentração de TRlS-base (0,5 a 3 [M], H2S04 (dependendo da concentração TRIS; 0,4 a 1,4 [M]), concentração de cloridrato de guanidínio (80-400 mM), concentração de L-cisteína (0,4 a 4 [mM]) e concentração inicial de proteína (50 a 1000 [mg/L]) . O pH do tampão de reenrolamento foi ajustado a 7,5. Todas as misturas de reenrolamento continham 1 mM de EDTA.

As experiências descritas neste exemplo foram concebidas para permitir uma análise estatística multifactorial dos dados do rendimento de derivados de interleuquina-4 correctamente enrolada, a fim de avaliar a importância de todos os factores individuais e todas as interacções bifactoriais. Uma concepção experimental cúbica parcial foi gerada e os dados resultantes foram também analisados empregando um modelo cúbico parcial. Os 21 coeficientes dos polinómios do modelo cúbico parcial encontram-se indicados no quadro 2.

Termo TRIS CYS Proteína Termo 0 0 o 0 CONSTANTE > I 1 0 0 TRIS-H2S04JM3 1 2 0 1 0 •Cisteí na_ [mM] i 3 0 δ 1 'Proteína [mg/L] • ^ 4 1 1 0 TRIS-H2S04_[M3*,Cisteína m y 5 I 0 1 TRÍS*H2S04_[AÍ3*:Proteína_[mg/L] 6 0 1 1 Cisteína_ [mM] *Jproteína_ [mg/L] 1 2 0 0 TRIS-H2S04^JM]A2 8 0 2 '0 * Cisteína_[mM]Λ2 9 0 0 2 Proteína [mg/L]Λ2 ^ \ 10 Ϊ 2 0 TRlS“H2S04_[M]*'Cisteína [mM] Λ2 11 2 1 0 IlUS-mSm^^Cisteína [mM] ' 12 1 0 2 í TmS~H2S04J>fl*Í ™ la I n'J 1 uiq / 111 Λ2 13 2 o 1 TRIS-H2S04JM3A2*:Proteína_ [mg/L^ 14 0 1 2 Cisteína_[mM]~2*troteína_[mg/L]Λ2 15 0 2 1 Cisteína_[mM]Λ *2*Proteína_[mg/L]

Termos lineares

Termos interacção ^ β· —γ~- f;5tiSÍe2·^ .Termos j» quadráticos ^ χ\\£άΛϊ.,·ς,Άν gassaa 'Termos cúbicos parciais

Quadro 2 Modelo cúbico parcial empregue para a concepção experimental da optimização de reenrolamento da interleuquina-4 R121D Y124D

Quadro 3 Efeito das condições de solução (sistema TRIS-H2S04) no rendimento de reenrolamento da interleuquina-4 R121D Y124D, recuperação da proteína solúvel, rendimento de reenrolamento geral e grau de pureza 22

Experiência ne Base TRIS Cisteína Proteína Rendimento Ref. Recuperação de proteína Rendimento de reenrolamen to geral Srau de pureza [mg/L] [%] [%] [%] 1 3 4 50 9 81,3 18,00 22,1 2 3 0,4 1000 2, 92 10, 65 0,29 2,7 ' 3 0,5 4 525 90, 45 48, 55 17,23 35, 5 4 0,5 2,2 1000 137,7 46, 34 13,77 29, 7 5 1, 75 4 1000 199,72 54, 77 19, 97 36, 5 6 1, 75 0,4 1000 25, 05 27, 23 2,50 9,2 7 3 2,2 50 11,3 60,79 22,60 37,2 8 0,5 4 50 10, 37 53, 54 20,73 38,7 9 3 0,4 525 68, 32 55, 36 13,01 23, 5 10 0,5 0,4 525 81, 82 36, 66 15,58 42,5 11 1, 75 0,4 50 13, 6 62, 08 27,21 43, 8 12 0,5 0,4 1000 15, 8 18,89 1,58 8,4 13 3 4 1000 176,31 43, 94 17,63 40,1 14 1, 75 4 525 131,19 68, 94 24,99 36, 2 15 1,3333 1,6 366,667 93, 63 68,21 25,54 37,4 16 2,1667 1,6 366,667 91, 95 69, 77 25,08 35, 9 17 3 2,8 683,333 134,38 55, 72 19, 67 35, 3 18 0,5 1,6 683,333 110,68 48, 94 16,20 33, 1 20 2,1667 2,8 50 12,49 71, 59 24,98 34,9 1 3 4 50 9, 38 52, 32 18,76 35, 9 23 2 3 0,4 1000 8,94 18,32 0,89 4,9 3 0,5 4 525 97,16 50,43 18,51 36,7 4 0,5 2,2 1000 140,29 45, 63 14,03 30,7 5 1,75 4 1000 197,53 56, 85 19,75 34,7 6 1,75 0,4 1000 19,75 27, 61 1,97 7,2 7 3 2,2 50 15, 08 72,5 30,15 41, 6

Os rendimentos obtidos com combinações seleccionadas destes componentes encontram-se no quadro 3. A inspecção destes resultados revela que, nas condições experimentais empregues, observaram-se as seguintes tendências: (1) são obtidos melhores rendimentos de reenrolamento a elevadas concentrações de proteínas (750-1000 [mg/L]); (2) são obtidos melhores rendimentos de reenrolamento gerais a uma concentração total de proteínas entre 250 e 650 [mg/1]; (3) o intervalo da concentração de L-cisteína óptimo é 2,5 a 4 [mM] ; (4) o intervalo da concentração de Tris/H2S04 é 1,4 a 2,4 [M] ; (5) melhor taxa de recuperação de proteínas é obtida a baixas concentrações de proteínas (50 a 250 [mg/L]), elevadas concentrações de Tris-H2S04 (2 a 3 [M]) e 2 a 3,5 [mM] de L-cisteína; (6) melhor grau de pureza é obtido a elevadas concentrações de proteínas (400-1000 [mg/L]), elevadas concentrações de L-cisteína (2,5 a -4 [mM]). O grau de pureza é independente da concentração de Tris-H2S04. identificou-se um compromisso entre o rendimento ideal de reenrolamento, grau de pureza e recuperação de proteínas empregando os seguintes parâmetros: 500 mg/L de proteína 24 total, 3,3 mM de L-cisteína, 2 M de Tris-H2S04 e 1 mM de EDTA.

Pontos de controlos com estas condições ideiais revelaram que os valores de resposta previstos e reais coincidiam razoavelmente, indicando que o modelo era adequado.

Rendimento de Previsto: 24,9 [%] (±1,84 reenrolamento Padrão) geral Medido: 25,4 [%] (±0,37 Erro Padrão) Recuperação de Previsto: 65,9 [%] (±6,55 Erro proteína Padrão) Medido: 62,9 [%] (±0,63 Erro Padrão) Grau de pureza Previsto: 38,6 [%] (±3,63 Erro Padrão) Medido: 40,4 [%] (±0,45 Erro Padrão) Rendimento de Previsto: 127 [%] (±14,5 Erro reenrolamento Padrão) Medido: 126,9 [% ] (±1,85 Erro Padrão)

Exemplo 5

Optimização multifactorial do reenrolamento do derivado de interleuquina-4 empregando o sistema à base de trietanolamina-ácido sulfúrico 25

Outra combinação atractiva de supressores da agregação consiste no sistema trietanolamina (TEA)/H2S04. Por conseguinte, este sistema foi eleito para aprofundar a optimização e ampliar a concentração de proteínas. 0 volume final total da solução de reenrolamento foi 50 mL (frascos de vidro, Schott, Alemanha). Os frascos de vidro foram tapados com parafilm. Deixou-se decorrer o reenrolamento até estar completo, no espaço de 24-36 horas com agitação num agitador de barras magnético (100-200 rpm). A intervalos, foram colhidas amostras e analisadas por RP-HPLC (ver Exemplo 1). A solução de proteínas do exemplo 2, contendo proteína sulfitolizada, desnaturada, é diluída no tampão de reenrolamento para produzir uma concentração final de proteína de indicada no quadro 5. Foram investigados os seguintes aspectos da composição de tampão de reenrolamento: Concentração de TEA (1 a 2 [M], H2SO4 (dependendo da concentração de TEA), concentração de cloridrato de guanidínio (80-400 mM), concentração de L-cisteína (0,4 a 10 [mM]) e concentração inicial de proteína (50 a 1000 [mg/L] ) . O pH do tampão de reenrolamento foi ajustado a 7,5. Todas as misturas de reenrolamento continham 1 mM de EDTA.

As experiências descritas neste exemplo foram concebidas para permitir uma análise estatística multifactorial dos dados do rendimento de derivados de interleuquina-4 correctamente enrolada, a fim de avaliar a importância de todos os factores individuais e todas as interacções bifactoriais. Uma concepção experimental cúbica parcial foi gerada e os dados resultantes foram também 26 analisados empregando um modelo cúbico parcial. Os coeficientes dos polinómios do modelo cúbico parcial encontram-se indicados no quadro 4. 26 Termo TRIS CYS Proteína Termo 0 0 0 0 CONSTANTE 1 1 0 0 TEA-H2S04_[M] 2 0 1 0 Cisteína_ [mM] 3 0 0 I 'Proteína_ [mg/L] 4. l 3 0 TEA-H2S04JM]*· [mM] 3 1 0 1 TEA-H2SQ4^|M3*]Proteína_ [mg/L] <5 0 1 1 Cisteina_[mM] *]Proteína_ [mg/L] 7 2 0 0 T£A-H2SQ4_|M3A2 8 0 2 0 'Cisteína_[mM] Λ2 9 0 0 2 Proteína_[mg/L]Λ2 10 1 2 0 TEA“H2SQ4_[MJ*ICisteí na_ [mM] Λ2 11 2 1 0 TEA-H2S04JM]A2’Cisteína-[mM] 12 1 0 2 TEA-H2SÍHJM3*Proteína-[mg/L] Λ2 13 2 0 1 TEA-H2S)4_[M]A2*iProteína [mg/1·] 14 0 1 •“1 Cisteína_[mM]*;proteína_[mg/L] Λ2 15 0 2 1 Cisteína_[mM]Λ2 *Proteína_[mg/L]

Termos interacçao i

Termos cúbicos parciais

Quadro 4 Modelo cúbico parcial empregue para a concepção experimental da optimização de reenrolamento da interleuquina-4 R121D Y124D

Quadro 5 Efeito das condições de solução (sistema Tea-H2S04) no rendimento de reenrolamento da interleuquina-4 R121D Y124D, recuperação da proteína solúvel, rendimento de reenrolamento geral e grau de pureza

Experiência IEA

Cisteína Proteína

Rendimento Ref.

Recuperação Rendimento Grau de proteína de pureza reenrolamen de 27 to geral [-] [Μ] [mM] [mg/L] [mg/L] [%] [%] [%] 1 2 10 0,1 5, 91 138,09 5, 9 4,3 2 2 0,4 1 135,12 49,49 13, 5 27,3 3 0,5 10 0, 55 15, 23 16, 92 2,8 16, 4 4 0,5 5, 2 1 70,06 19,28 7 36, 3 5 1,25 10 1 49, 37 18,06 4,9 27,3 6 0,5 5, 2 0,1 9, 64 66,78 9, 6 14,4 7 1,25 0,4 1 167,96 42,5 16, 8 39, 5 8 2 5, 2 0,1 13, 66 103,17 13, 7 13, 2 9 0,5 10 0,1 3, 56 76, 7 3, 6 4,6 10 2 0,4 0, 55 45, 39 54,66 8,3 15, 1 11 0,5 0,4 0, 55 68,41 31,3 12,4 39, 7 12 1,25 0,4 0,1 30,09 77,34 30,1 38,9 13 0,5 0,4 1 90,11 21,55 9 41,8 14 2 10 1 63, 75 22,94 6,4 27,8 15 0,5 0,4 0,1 24,18 59,26 24,2 40,8 16 1,25 10 0, 55 43, 47 31,42 7,9 25, 2 17 1 3, 6 0,4 107,54 61,7 26, 9 43, 6 18 1,5 3, 6 0,4 118,95 70,26 29, 7 42,3 19 2 6, 8 0,7 115,96 45, 83 16, 6 36, 1 20 0,5 3, 6 0,7 97,81 32,69 14 42,7 21 1,5 6, 8 0,1 12,29 75,29 12,3 16, 3 28 1 2 10 0,1 6, 51 91,62 6,5 7,1 2 2 0,4 1 136,71 44,08 13, 7 31,0 3 0,5 10 0, 55 17,13 13, 98 3,1 22,3 4 0,5 5,2 1 68,29 17,34 6, 8 39, 4 5 1,25 10 1 53, 25 16, 96 53 31,4 6 0,5 5,2 0,1 10,75 44,69 10,8 24,1 7 1,25 0,4 1 170,11 39, 82 17 42,7 8 2 5,2 0,1 18,01 81,64 18 22,1 9 0,5 10 0,1 4, 92 43, 65 4,9 11,3

Os rendimentos obtidos com combinações seleccionadas destes componentes encontram-se no quadro 5. A inspecção destes resultados revela que, nas condições experimentais empregues, observaram-se as seguintes tendências: (1) são obtidos melhores rendimentos de reenrolamento a elevadas concentrações de proteínas (750-1000 [mg/L]); (2) são obtidos melhores rendimentos de reenrolamento gerais a uma concentração total de proteínas entre 100 e 550 [mg/1]; (3) o intervalo da concentração de L-cisteína óptimo é 0,4 a 4 [mM]; (4) o intervalo da concentração de tea/h2SC>4 é 1 a 1,6 [M]; (5) melhor taxa de recuperação de proteínas é obtida a baixas concentrações de proteínas (50 a 250 [mg/L]), elevadas concentrações de TEA-H2S04 (1,5 a 2 [M]) e 4 a 10 [mM] de L-cisteína; (6) melhor grau de pureza é obtido a elevadas concentrações de proteínas (600-1000 [mg/L]), elevadas concentrações de L-cisteína (0,4 a 4 [mM] ) e a às concentrações de TEA-H2S04 entre 0,8 e 1,5 [M]. Identificou-se um compromisso entre o rendimento ideal 29 de reenrolamento, grau de pureza e recuperação de proteínas empregando os seguintes parâmetros: 500 mg/L de proteína total, 0,8 mM de L-cisteína, 1,4 M de TEA-H2SO4 e 1 mM de EDTA. com estas condições ideiais de resposta previstos e reais indicando que o modelo era

Pontos de controlos revelaram que os valores coincidiam razoavelmente, adequado. 24,6 [%] Padrão) (±4,1 Erro 24,3 [%] Padrão) (±0,8 Erro 52,8 [%] Padrão) (±10, 5 Erro 58,2 [%] Padrão) (±4,5 Erro 43,2 [%] Padrão) (±5,3 Erro 41,8 [%] Padrão) (±3,9 Erro 106,8 [%] Padrão) (±16 ,9 Erro 121,6 [%] Padrão) (±2, 0 Erro

Rendimento de Previsto: reenrolamento geral

Medido:

Recuperação de Previsto: proteína

Medido:

Grau de pureza Previsto:

Medido:

Rendimento de Previsto: reenrolamento

Medido: 30

Exemplo 6 O reenrolamento do inlbidor da trlpsina pancreática de bovino (BPTI, aprotinina) empregando um sistema à base de TRIS-ácido sulfúrico A fim de demonstrar que o sistema TRIS/H2SO4 pode também ser empregue para o reenrolamento de outras proteínas diferentes dos derivados de interleuquina, o sistema TRIS/H2S04 foi também optimizado para BPTI. 0 volume final total da solução de reenrolamento foi 50 mL (frascos de vidro, Schott, Alemanha). Os frascos de vidro foram tapados com parafilm. Deixou-se decorrer o reenrolamento até estar completo, no espaço de 24-36 horas com agitação num agitador de barras magnético (100-200 rpm) . A intervalos, foram colhidas amostras e analisadas por RP-HPLC (ver Exemplo 1). A solução de proteínas do exemplo 2, contendo proteína sulfitolizada, desnaturada, é diluída no tampão de reenrolamento para produzir uma concentração final de proteína de indicada no quadro 7. Foram investigados os seguintes aspectos da composição de tampão de reenrolamento: Concentração de TRIS (0 a 2 [M], H2S04 (dependendo da concentração de TRIS-Base), concentração de cloridrato de guanidínio residual (80-400 mM), concentração de L-cisteína (0,1 a 4 [mM]) e concentração inicial de proteína (50 a 1000 [mg/L] ) . O pH do tampão de reenrolamento foi ajustado a 7,5. Todas as misturas de reenrolamento continham 1 mM de EDTA. 31

As experiências descritas neste exemplo foram concebidas para permitir uma análise estatística multifactorial dos dados do rendimento de derivados de BPTI correctamente enrolados, a fim de avaliar a importância de todos os factores individuais e todas as interacções bifactoriais. Uma concepção experimental cúbica parcial foi gerada e os dados resultantes foram também analisados empregando um modelo cúbico parcial. Os coeficientes dos polinómios do modelo cúbico parcial encontram-se indicados no quadro 6. 31 Termo TRIS CYS Proteína Termo CONSTANTE TRIS-H2SQ4w[M] 1 Cisteína_[mM] j Proteína_[mg/L] J TRIS-H2S04JMJ* Cisteína_[mM] TRIS-H2S04~[M3* Proteína_[mg/L] ; Cisteína_[mM] *]Proteína_ [mg/L] J XRI3-H2SQ4^[M3A2 ] Cisteína_[mM]Λ2 j Proteína_[mg/L]Λ2 * TRIS-H2S04JM3* 'Cisteína_[mM] Λ2 1 TRI3“H2S04_[M]A2* ^ ' o : [ TRI3-H2S04JM]*: Proteína_[mg/L] Λ2 j TlUS-H2S042|>í3A2*:Proteína_[mg/L] ! Cisteína_[mM] *]proteína_[mg/L] Λ2 Cisteína_[mM] Λ2 ^jProteína_[mg/L] 0 0 0 0 1 1 0 0 2 0 1 0 3 0 0 1 4 1 1 0 5 1 0 1 6 0 1 1 7 2 0 0 8 0 2 0 9 0 0 2 10 1 2 0 11 2 . 1 0 12 í 0 . 2 13 2 0 1 14 0 1 2 15 0 2 1 iTermos lineares g ilutr-iei# ssáix.\ uji ermos interacção |Termos quadráticos

Termos cúbicos arciais

Quadro 6 Modelo cúbico parcial empregue para a concepção experimental da optimização de reenrolamento de

BPTI

Quadro 7 Efeito das condições de solução no rendimento de reenrolamento de BPTI, recuperação da proteína solúvel e rendimento de reenrolamento geral

Experiência Base TRIS

Cisteína Proteína

Rendimento Recuperação Ref. de proteína

Rendimento deGrau de reenrolamento pureza 32 geral [-] [Μ] [mM] [mg/L] [mg/L] [%] [%] [%] 1 2 4 50 20,43 85, 69 40,86 47,7 2 2 0,1 1000 0 0 0 0 3 0 4 525 159,29 61,05 30,34095 49, 7 4 0 2, 05 1000 275,45 70,84 27,545 38,9 5 1 4 1000 256, 9 71,75 25, 69 35, 8 6 0 2, 05 50 35, 67 136,48 71,34 52,3 7 1 0,1 1000 0 2, 59 0 0 8 2 2, 05 50 19, 45 80,85 38,9 48,1 9 0 4 50 8,51 39, 92 17,02 42,6 10 2 0,1 525 0 0 0 0 11 0 0,1 525 0 0,4 0 0 12 1 0,1 50 15, 71 69, 04 31,42 45, 5 13 0 0,1 1000 0 1, 05 0 0 14 2 4 1000 158,93 36, 23 15,893 43, 9 15 0 0,1 50 5, 03 14,13 10,06 71,2 16 1 4 525 18, 64 89, 48 3,550476 4 17 0,6667 1,4 366, 667 107,29 83, 34 29, 26088 35, 1 18 1,3333 1,4 366, 667 104,5 82, 6 28,49997 34,5 19 2 2,7 683,333 97,4 41, 66 14,25367 34,2 20 0 1,4 683,333 149,44 51,46 21,86928 42,5 21 1,3333 2,7 50 14,08 76, 21 28,16 36, 9 33 1 2 4 50 16,15 69,37 32,3 LO 2 2 0,1 1000 1,47 3,44 0,147 4,3 3 0 4 525 162,49 58,91 30,95048 52,5 4 0 2, 05 1000 273,77 68, 91 27,377 39, 7 5 1 4 1000 265, 9 78,2 26,59 34 6 0 2, 05 50 9, 73 39, 56 19,46 49, 2 7 1 0,1 1000 0 0, 94 0 0 8 2 2, 05 50 19, 18 77,88 38,36 49, 3

Os rendimentos obtidos com combinações seleccionadas destes componentes encontram-se no quadro 7. A inspecção destes resultados revela que, nas condições experimentais empregues, observaram-se as seguintes tendências: (1) são obtidos melhores rendimentos de reenrolamento a elevadas concentrações de proteínas (750-1000 [mg/L]); (2) são obtidos melhores rendimentos de reenrolamento gerais a uma concentração total de proteínas entre 500 e 1000 [mg/1]; (3) o intervalo da concentração de L-cisteína óptimo é 2,5 a 4 [mM]; (4) o intervalo da concentração de TRIS/H2SO4 é 0,2 a 1,0 [M]; (5) melhor taxa de recuperação de proteínas é obtida a baixas concentrações de proteínas (50 a 100 [mg/L]), concentrações moderadas de TRIS-H2S04 (0,9 a 1,4 [M]) e 1,8 a 3,3 [mM] de L-cisteína; (6) melhor grau de pureza é obtido a baixas concentrações de proteínas (50-100 [mg/L]), concentrações de L-cisteína 0,1 e 0,4 [mM]) e a às concentrações de TRIS-H2SO4 entre 0,1 e 0,5 [M].

Identificou-se um compromisso entre o rendimento ideal de reenrolamento, grau de pureza e recuperação de proteínas 34 empregando os seguintes parâmetros: 700 mg/L de proteína total, 3,3 mM de L-cisteína, 0,3 M de TRIS-H2SO4 e 1 mM de EDTA. 35

REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO

Esta lista das referências citadas pelo requerente serve apenas para conveniência do leitor. Esta lista não faz parte do documento da patente europeia. Apesar da compilação cuidadosa das referências, os erros ou as omissões não podem ser excluídos e o IEP rejeita toda a responsabilidade a este respeito.

Documentos de patente citados na descrição: • US 5728804 A [0006] • US 5563057 A [0006] • US 5593865 A [0007] • US 5453363 A [0007] • US 5723118 A, Sebald, W [0015] • EP 613499 Bl [0015] • WO 0000769 W, Domingues [0015] • EP 1022339 A [0024]

Literatura, não relacionada com patentes, citada na descrição: • de Bemardez Clark, E. Curro Opinion Biotechnol., 1998, vol. 9, 157-163 [0006] • Lilie H ; Schwarz E ; Rudolph R. Curro Opinion Biotechnol., 1998, vol. 9, 947-501 [0006] • Daugherty DL ; Rozema D ; Hanson PE ; Gellman SH. J. Bioi. Chem., 1998, vol. 273, 33961-33971 [0006] 16 • Rozema D ; Gellman SH. J. Bioi. Chem., 1996, vol. 271, 3478-3487 [0006] 36 • Bernardez Clark, E. Curro Opinion Biotechnol., 1998, vol. 9,157-163 [0007] • Lilie H et a!. Curro Opinion Biotechnol., 1998, vol. 9, 497-501 [0008] • Protein structure A Praticai Approach. IRL Press, 1989 [0025]

Claims (4)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Método de renaturação de interleuquina-4 ou de uma muteína de interleuquina-4 a uma concentração de proteínas entre 250 e 1000 [mg/L], compreendendo a adição a uma solução de proteínas quimicamente modificadas ou reduzidas de um tampão de reenrolamento contendo L-cisteína e Tris(hidroximetil)- aminometano/H2S04 a uma concentração entre 1 a 3 mol/1 ou trietanolamina/H2S04 a uma concentração entre 0,5 e 2 mol/1.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o tampão contém ainda um intensificador da solubilidade.

3. Método de acordo com a reivindicação 3, em que o intensificador de solubilidade é um ião.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, em que o intensificador de solubilidade é um cloreto.