ES2261509T3 - Procedimiento para plegar polipeptidos sintetizados quimicamente. - Google Patents
Procedimiento para plegar polipeptidos sintetizados quimicamente.Info
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Abstract
Un procedimiento para plegar polipéptidos sintetizados químicamente, caracterizado porque comprende tratar a un polipéptido y/o proteína que comprende dos o más residuos de cisteína derivada con un agente reductor en un regulador de pH para plegamiento que tiene un pH y temperatura predeterminados.
Description
Procedimiento para plegar polipéptidos
sintetizados químicamente.
La presente invención se refiere un
procedimiento para plegar polipéptido sintetizados químicamente.
Además, la invención se refiere a un procedimiento para producir
proteínas activas biológicamente.
Durante última década ha habido un aumento en la
demanda de proteínas sintéticas después de la síntesis química
exitosa de la proteasa de VIH completamente activa, una enzima de 99
residuos preparada por métodos altamente optimizados de síntesis de
péptido en fase sólida (SPPS) basada en el método estándar
Boc/Bzl.
La síntesis en 1994 de la ubiquitina cristalina,
una proteína pequeña que consiste de 76 residuos, ha demostrado
adicionalmente que proteínas altamente puras pueden sintetizarse
mediante SPPS basándose en el protocolo Fmoc/t-Bu,
un método opcionalmente más simple y químicamente menos complejo que
el procedimiento Boc/Bzl.
En el año 2000, hay una amplia evidencia
experimental de que las proteínas con un solo dominio que contienen
entre 60 y 100 residuos de aminoácidos pueden producirse
rápidamente, de manera confiable y económica mediante la síntesis
química, con la asistencia de un sintetizador de péptido, en
cantidades que son suficientes para estudios estructurales y
funcionales.
Las proteínas que contienen puentes disulfuro
preparados mediante síntesis química, una vez que se pliegan, tienen
las mismas propiedades que las formas naturales y que las formas
diseñadas genéticamente. Los puentes disulfuro de las proteínas a
partir de estructuras cíclicas sencillas o múltiples intra- y/o
intercadena las cuales imparten limitaciones conformacionales
considerables a las moléculas, contribuyen así de manera decisiva a
la estabilización de la conformación bioactiva.
Las proteínas con un solo dominio plegado de
estructura conocida pueden prepararse mediante la formación de pares
de los residuos de cisteína en regiones selectivas. Se desarrollaron
varias combinaciones de grupos protectores de cisteína compatibles
con los esquemas de protección comúnmente utilizados que permiten la
desprotección y/o co-oxidación paso a paso y par por
par de los residuos de cisteína con selectividad completa.
Sin embargo, una demostración de qué tan
demandante es la química implicada en la formación de pares de los
residuos de cisteína en regiones selectivas en proteínas que
contienen múltiples residuos de cisteína es la síntesis reciente de
un péptido semejante a insulina, relaxina de humano. La síntesis del
precursor de la cadena A se lleva a cabo al utilizar los métodos
SPPS, el método Fmoc/t-Bu y una resina basada en
alcohol p-alcoxibencílico, mientras que el precursor
de la cadena B se prepara al utilizar resina PAM (éster de
4-carboxiamidometilbencilo unido a resina basada en
poliestireno) al seguir el método Boc/Bzl. De los cuatro residuos de
cisteína del precursor de la cadena A, dos estuvieron protegidos
como los derivados S-Trt
(S-trifenilmetilo), mientras que los otros tuvieron
protección S-Acm (S-acetamidometilo)
y S-Meb
(S-p-metilbencilo), respectivamente.
Las dos cisteínas del precursor de la cadena B estuvieron protegidas
por los grupos protectores S-Acm y
S-Meb. El puente intramolecular S-S
de la cadena A se obtuvo primero mediante oxidación de yodo en AcOH.
Luego, los dos puentes disulfuro intermoleculares que conectan a las
cadenas A y B se obtuvieron en dos pasos: en el primer paso, el tiol
libre del precursor de la cadena A, obtenido mediante desbloqueo HF
del grupo protector S-Meb, se hizo reaccionar con el
residuo Cys (Npys)
(S-3-nitro-2-piridin
sulfenilo) activado del cadena B (formación dirigida del
heterodisulfuro intermolecular), y en el segundo paso, el puente
S-S remanente se obtuvo mediante remoción
cooxidativa de los grupos S-Acm con
yodo.
yodo.
Los protocolos SPPS ofrecen la posibilidad de
preparar una variedad de polipéptidos mediante síntesis química, que
contienen residuos de cisteína protegidos con el mismo grupo
bloqueador (protector). Una vez que los grupos protectores se
remueven mediante varios reactivos oxidantes los enlaces disulfuro
se forman directamente. Los polipéptidos y/o proteínas que contienen
cisteínas protegidas S-Trt o S-Acm
pueden plegarse realmente de manera eficiente después del
tratamiento con yodo, N-iodosuccinimida y yoduro de
cianógeno bajo condiciones de solvente, pH y tiempo de reacción
cuidadosamente controladas que minimizarán la modificación de Tyr,
Met, y Trp sensible a la oxidación y evitará la sobreoxidación de
los tioles de cisteína a los ácidos sulfónicos correspondientes.
El trifluoroacetato de talio (III) puede
reemplazar a los agentes oxidantes anteriormente mencionados que
algunas veces dan mejores rendimientos de los enlaces disulfuro. Las
limitaciones principales de este reactivo son su toxicidad, la
dificultad para remover talio a partir del polipéptido blanco y la
necesidad para proteger a los residuos Met y Trp de la
oxidación.
Los reactivos de oxidación que contienen una
mezcla de compuestos de sulfóxido/sililo y ácido trifluoroacético
han sido aplicados exitosamente para la oxidación directa a enlaces
disulfuro de precursores de polipéptido que contienen residuos de
cisteína S-Acm, S-But,
S-Meb y S-Mob
(S-p-metoxibencilo). La necesidad
para proteger al anillo indol del Trp con formilo para evitar la
clorinación bajo condiciones oxidantes es, no obstante, la principal
limitación de esta mezcla.
Los métodos para el plegamiento oxidativo de
precursores politiol lineales, sintéticos (formas polipeptídicas
reducidas) son más populares y más frecuentemente aplicados. En el
método más simple, los enlaces disulfuro apropiados pueden formarse
espontáneamente en la presencia de aire o de algunos otros agentes
oxidantes moderados. Además, el plegamiento y la formación de pares
de cisteína se obtienen tanto en la presencia de las formas
reducidas (RSH) como oxidadas
(R-S-S-R) de un
compuesto sulfhidrilo de bajo peso molecular.
En los polipéptidos sintéticos y proteínas
pequeñas que consisten de un solo dominio, la fuerza de dirección
termodinámica para el plegamiento que resulta a partir una
combinación de enlaces de H, formación de pares iónicos y efectos
hidrófobos por lo visto es suficientemente substancial para producir
espontáneamente los isómeros nativos en oxidación renaturalizante
aleatoria.
A partir de estudios del plegamiento oxidativo
de múltiples proteínas pequeñas que contienen cisteína, semejantes a
inhibidores de enzimas, toxinas u hormonas, se han derivado
informaciones útiles acerca de los motivos estructurales
particulares por ejemplo cisteína estabilizada por
giro-\beta, cisteína estabilizada por plegamiento
de la hélice poli(Pro)-II y cisteína
estabilizada por plegamiento estructural á-\beta, cuya
estabilización es la fuerza de dirección principal para la formación
correcta de puentes disulfuro incluso en moléculas peptídicas
relativamente pequeñas. Si se presta atención a la elección de
reguladores de pH, temperatura y aditivos que estabilizarán los
motivos estructurales secundarios, entonces incluso se puede obtener
in vitro plegamiento correcto completo de proteínas
parcialmente plegadas o mezcladas (plegadas de manera errónea).
Se han diseñado varios protocolos de plegamiento
para las especies polipeptídicas politiol para minimizar la
formación incorrecta de pares de cisteína intramolecular que lleva a
isómeros no nativos, plegados de manera errónea y a evitar tanto
como sea posible la formación aleatoria de enlace disulfuro
intermolecular que promueve la agregación y precipitación.
Así, la oxidación por aire generalmente se lleva
a cabo a una dilución elevada de la forma politiol precursora (1
mg/ml o por debajo de esta) bajo condiciones neutras o ligeramente
alcalinas. Esta usualmente requiere una larga duración y produce un
subproducto no dañino tal como agua en la reacción. Las oxidaciones
por aire son, no obstante, difíciles de controlar debido a
cantidades traza de iones metálicos que influyen fuertemente sus
velocidades. De manera más importante, las moléculas precursoras
básicas e hidrófobas tienden a agregarse y a precipitarse fuera de
la solución en o cerca de sus puntos isoeléctricos básicos o neutros
durante el procedimiento de plegamiento. Además, los productos
laterales debidos a la oxidación de Met se acumulan durante el
plegamiento. Aunque el número de operaciones químicas necesarias
para plegar precursores de politiol se reduce a un mínimo, la
formación de puentes disulfuro promovida por el oxígeno molecular
del aire da en muchos casos rendimientos bajos, y en algunas
ocasiones no ocurre del todo.
DMSO y ferricianuro de potasio también han sido
utilizados como oxidantes. El ferricianuro de potasio debe, no
obstante, ser utilizado en la oscuridad y, si Met o Trp están
presentes en la cadena polipeptídica, los productos laterales de
oxidación se acumulan durante el plegamiento. El uso de DMSO
frecuentemente da mejores resultados debido al hecho de que los
plegamientos oxidativos pueden ser conducidos bajo condiciones
ácidas a una velocidad eficiente sin productos dañinos en la
reacción. El método es particularmente adecuado para plegamiento de
precursores de polipéptidos básicos e hidrófobos debido a las
características de mayor solubilidad de las especies que se someten
a oxidación en reguladores de pH ácidos. Sin embargo, frecuentemente
han sido reportados los problemas para remover el DMSO a partir del
producto final y la reducción en la selectividad de la formación de
puentes disulfuro. Además, la mezcla de los puentes disulfuro que
lleva a isómeros plegados de manera errónea y la oligomerización no
pueden evitarse siempre incluso con un control cuidadoso de las
condiciones experimentales.
Los mayores rendimientos de formación de pares
de cisteína y plegamiento correctos en precursores de politiol de
proteína pequeña se obtienen más frecuentemente mediante el uso de
reguladores de pH redox tales como glutationa oxidada (GSSG) y
reducida (GSH) y cisteína/cisteína (Cys/Cys).
Así, durante los plegamientos oxidativos de la
Ribonucleasa A (R.R. Hantgan et al. Biochemistry 13, 613,
1974), el dominio nuclear de 49 aminoácidos de hirudina (B.
Chatrenet y J.Y. Chang J. Biol. Chem. 267, 3038, 1992) y el
Inhibidor de la Tripsina Pancreática de Bovino (BPTI) (T.E.
Creighton Methods Enzymol. 131, 83, 1986) inducidos por GSSG/GSH o
Cys/Cys, se forman y se reforman constantemente sulfhidrilos libres
y grupos disulfuro durante todo el procedimiento de plegamiento. Las
velocidades y rendimientos generales usualmente son mejores que el
plegamiento oxidativo en el aire debido a que el intercambio de
tiol/disulfuro ocurre a través de intermediarios de tiolato que
facilitan el recambio del disulfuro no nativo por los naturales. En
cuanto al plegamiento oxidativo en aire, la elevada dilución del
precursor de politiol es necesaria para evitar la agregación,
formación de oligómeros y polímeros y para maximizar los
rendimientos de las especies de proteína blanco.
Durante la primera etapa del plegamiento de
huridina1-49 in vitro, el plegamiento procede
de manera secuencial e irreversible a partir de la forma no plegada,
reducida (politiol) hacia isómeros equilibrados que contienen uno y
dos puentes disulfuro y hacia especies equilibradas que contienen
tres enlaces disulfuro (isómeros mezclados) (J. Y. Chang Biochem. J.
300, 643, 1994). Casi todas las 75 especies de proteínas posibles,
que incluyen a la proteína nativa, han sido identificadas: 15
isómeros con un puente S-S, 45 isómeros con dos
puentes S-S y 15 isómeros con tres puentes
S-S. Durante la segunda etapa del plegamiento, las
especies mezcladas se reorganizan mediante recambio de los
disulfuros no nativos para conseguir las especies de proteína
nativa. La formación del disulfuro se promueve principalmente
mediante la glutationa oxidada o cisteína, mientras que el recambio
del disulfuro requiere un catalizador tiol por ejemplo glutationa
reducida o cisteína o mercaptoetanol.
La efectividad de los reactivos tiol para
promover el recambio evidentemente está relacionada con su potencial
redox y cada catalizador exhibe una concentración óptima.
Cisteína/cisteína es aproximadamente 10 veces más potente que
GSSG/GSH en el procesamiento de la acumulación de Hirudinas
mezcladas. Esta diferencia ha sido explicada mediante el potencial
redox relativo de los sistemas GSSG/GSH (-0.24 V) y
Cys-Cys/Cys (-0.22 V). Mediante la selección de una
combinación de condiciones óptimas (temperatura, regulador de pH,
sales y mezcla redox) el procesamiento de plegamiento de
Huridina1-49 se acelera hasta el grado que alcanza
su término en 15 minutos.
En general, la conformación nativa de una
proteína sintética que contiene varios enlaces disulfuro debe
formarse espontáneamente bajo condiciones óptimas para plegamiento
de formas politiol. En muchos casos, sin embargo, incluso en
condiciones optimizadas los plegamientos oxidativo mediados por los
reguladores de pH redox anteriormente mencionados se produce una
cantidad considerable de subproductos y formas mal emparejadas. Este
es particularmente el caso en las proteínas que tienen a formar la
conformación nativa solamente en la superficie de membranas
específicas o bajo asistencia de un chaperón molecular específico
(S. Sakakibara Biopolymers, Peptide Science 51, 279, 1999).
Además, a pesar de su amplio uso, la mayoría de
los plegamientos oxidativos de los precursores politiol promovidos
por aire o los pares redox GSSG/GSH y Cisteína/cisteína han sido
conducidos en una manera de ensayo y error, como se demuestra
claramente por los experimentos de plegamiento de quimiocina
sintética y análogos de quimiocina. De hecho, mientras que las
quimiocinas nativas y varios de sus análogos se pliegan fácilmente,
la estructura plegada se estabiliza por dos o tres puentes
disulfuro, varios análogos no se pliegan bien bajo las mismas
condiciones que las moléculas nativas correspondientes lo que
resulta en formas parcialmente plegadas. Estas observaciones
representan una fuerte indicación de que los cambios en la
estructura primaria de los precursores politiol pueden afectar de
manera adversa la inducción de los pliegues locales correctos
(giros-\hat{a}, motivos helicoidales poliprolina,
etc.) en las cadenas polipeptídicas a ser plegadas. Por lo tanto, la
propensión a plegarse de muchos precursores tiol es principalmente
una propiedad intrínseca de la cadena polipeptídica más que una
función del sistema de oxidación específico que actúa sobre las
moléculas.
También ha sido reportado el mejoramiento de la
formación de pares disulfuro seleccionados mediante la adición de
alcoholes, acetonitrilo y DMSO a reguladores de pH a baja fuerza
iónica. Esta estrategia implica el mejoramiento de la formación de
enlaces disulfuro específicos mediante el ajuste de factores
electrostáticos en el medio para favorecer la yuxtaposición de
aminoácidos cargados de manera opuesta que limitan los residuos de
cisteína seleccionados. Las enzimas tales como peptidil disulfuro
isomerasa (PDI) y prolil isomerasa (PPI) también han sido empleadas
como aditivos para catalizar y modular el intercambio de disulfuro.
El tiempo requerido para plegar Huridina in vitro puede
acortarse de 10 h a 30 seg si se añade PDI al regulador de pH para
replegamiento. En este caso, la eficiencia del plegamiento in
vitro no difiere significativamente de la observada in
vivo.
Los precursores polipéptido politiol se obtienen
directamente mediante escisión acidolítica de
polipéptido-resina cuando los residuos de cisteína
están protegidos por grupos de ácido lábil, por ejemplo Trt.
Alternativamente y de manera preferible, los polipéptidos en los que
todas las cisteínas están protegidas por un grupo resistente a
ácido, por ejemplo el grupo acetamidometilo (Acm), se aíslan primero
como derivados de S-cisteína mediante escisión
acidolítica de péptido-resina y luego el grupo Acm
se elimina mediante tratamiento con Hg (AcO)2 en ácido
acético, seguido por la remoción de iones Hg mediante filtración en
gel en la presencia de un gran exceso de mercaptoetanol.
En ambos casos, sin embargo, se ha reportado que
ocurren varias reacciones laterales en los residuos de cisteína y de
triptofano. El anillo indol de triptofano puede derivarse mediante
mercaptoetanol y cisteína que da varias reacciones laterales, la más
importante es la oxidación y alquilatación por cationes
t-butilo durante la remoción acidolítica de la
cadena polipeptídica a partir de la resina.
Así, debido a los inconvenientes de las
metodologías existentes existe una necesidad para procedimientos más
eficientes y más simples para plegar polipéptidos sintetizados
químicamente, y preparar proteínas activas biológicamente mediante
síntesis química.
El objetivo de la presente invención es por lo
tanto el proveer un procedimiento efectivo, simple y rápido para
plegamiento de polipéptidos y/o proteínas, en donde se minimiza
entre otros la formación de isómeros que contienen puentes
disulfuro mal emparejados, y se puede omitir el uso de reactivos
costosos para recambio de disulfuro tales como glutationa o enzimas,
y cuyo método es repetible, sólido y capaz de ser escalable. Estos y
otros objetivos serán evidentes a los expertos en la técnica.
Este objetivo se logra por la invención mediante
la provisión de un procedimiento para plegar polipéptidos
sintetizados químicamente, que comprenden tratar a un polipéptido
que comprende dos o más residuos de cisteína derivados con un agente
reductor en un regulador de pH para plegamiento que tiene un pH y
temperatura predeterminados.
Además, se provee un procedimiento para la
preparación de proteínas activas biológicamente, que comprende
(a) sintetizar químicamente un polipéptido que
comprende dos o más residuos de cisteína derivados;
(b) tratar a este polipéptido con un agente
reductor en un regulador de pH para plegamiento que tiene un pH y
temperatura predeterminados, y
(c) purificar las proteínas plegadas
obtenidas.
Preferiblemente el residuo de cisteína derivado
corresponde a un residuo
S-butil-tio-cisteína
(S-t-Bu). Así, de conformidad con
la invención, se ha encontrado, de manera inesperada, que las
cisteínas derivadas de S-t-Bu
pueden ser desprotegidas, es decir, al perder la porción
S-t-Bu, mientras que forman puentes
disulfuro con otras cisteínas cuando se incuban en un regulador de
pH para plegamiento apropiado a temperatura y pH adecuados.
De conformidad con la presente invención, el
agente reductor preferiblemente está libre de cisteína. Un exceso de
cisteína puede añadirse al regulador de pH (como por ejemplo se
ilustra en los ejemplos 1-5) o la cisteína puede ser
derivada a partir de dentro del polipéptido (como se ilustra en el
ejemplo 6).
En una modalidad preferida del procedimiento de
la invención el regulador de pH para plegamiento comprende una u
más sales caotrópicas, con el objeto de conducir al polipéptido en
condiciones de equilibrio que permiten que ocurra el plegamiento
natural. Esto puede lograrse, por ejemplo, al colocar al polipéptido
y/o proteína en condiciones completamente desnaturalizantes, por
ejemplo mediante una elevada concentración de las sales caotrópicas,
y luego al diluir la sal caotrópica a una concentración menor para
plegamiento. Las sales caotrópicas preferiblemente se eligen a
partir del grupo que consiste de cloruro de guanidinio y urea, y
preferiblemente están presentes en una concentración de
0.1-1 M durante el plegamiento.
Preferiblemente, la temperatura del regulador de
pH para plegamiento se encuentra entre 25º y 40ºC, más
preferiblemente entre 27º y 38ºC, con el objeto de disminuir los
cambios de degradación peptídica, a la vez que corresponde a las
temperaturas naturales del cuerpo. Más preferiblemente la
temperatura es de aproximadamente 37ºC durante el plegamiento.
De conformidad con otra modalidad preferida del
procedimiento de la invención el regulador de pH para plegamiento
tiene un pH ligeramente alcalino. Preferiblemente, el pH se
encuentra entre 7 y 9, más preferiblemente entre 7 y 8.5 con el
objeto de promover el procedimiento de plegamiento. Como puede estar
claro a partir de lo anteriormente expuesto, el plegamiento de
proteína es dependiente de una serie de interacciones complejas. La
reacción con cisteína, por ejemplo, no ocurre a un pH ácido y
elevados valores de pH incrementan el riesgo de degradación
del
polipéptido.
polipéptido.
Después del plegamiento, las proteínas blanco
pueden purificarse por métodos bien conocidos en la técnica que
incluyen la cromatografía de intercambio aniónico y catiónico,
cromatografía por interacción hidrófoba, cromatografía en fase
reversa, cromatografía por afinidad, cromatografía de interacción
hidrófila/intercambio catiónico (HILIC/CEC), cromatografía por
desplazamiento (DC) y cromatografía por desplazamiento de muestra
(SDM). Más preferiblemente, se emplean la cromatografía de alta
resolución (fase reversa) en elución así como la cromatografía por
desplazamiento.
En una modalidad preferida del procedimiento
para producir proteínas activas biológicamente, el procedimiento
comprende los pasos de
(a) ensamblar un polipéptido
S-t-butil-tio
cisteína sobre un soporte polimérico insoluble mediante elongación
de cadena paso a paso;
(b) escindir la cadena polipeptídica de
S-t-butil-tio
cisteína a partir del soporte mediante acidolisis;
(c) purificar el polipéptido
S-t-butil-tio
cisteína obtenido;
(d) plegar el polipéptido
S-t-butil-tio
cisteína purificado mediante el tratamiento de estos polipéptidos
con un exceso molar de cisteína en un regulador de pH para
plegamiento que comprende una sal caotrópica, preferiblemente
cloruro de guanidinio, y que tiene un pH alcalino y una temperatura
de aproximadamente 37ºC; y
(e) purificar las proteínas plegadas obtenidas
mediante cromatografía líquida de alta resolución en fase
reversa.
En una modalidad ventajosa del procedimiento de
la invención, el soporte polimérico es una poliamida o resina basada
en poliestireno funcionalizada con el aglutinante de ácido lábil
ácido hidroximetilfenoxiacético, puesto que estos soportes pueden
ser utilizados de manera adecuada para sintetizadores peptídicos
completamente automatizados, y generalmente permiten la síntesis de
cadenas polipeptídicas largas.
Como se explicó anteriormente, la presente
invención se basa en el ensamblaje en fase sólida paso a paso de
polipéptidos
S-t-butil-tio
cisteína y el hallazgo de que cantidades considerables de proteínas
nativas, activas biológicamente pueden producirse al someter a estos
polipéptidos a plegamiento en la presencia de un agente reductor,
preferiblemente cisteína, a un pH ligeramente por arriba de la
neutralidad y a una temperatura de aproximadamente 37ºC.
Se ha encontrado sorprendentemente que la
producción de proteínas activas biológicamente se logra con un
exceso molar elevado de cisteína en un procedimiento que remueve el
grupo protector S-t-butilo mientras
que se permite la formación de un puente disulfuro. Este
procedimiento es más simple y más eficiente que los procedimientos
descritos en la técnica precedente para el plegamiento de
polipéptidos que contienen cisteína los cuales se obtienen mediante
síntesis química. La remoción de
S-t-but ocurre así en el mismo paso
que el plegamiento del polipéptido.
Alternativamente, el mismo material plegado
también puede obtenerse mediante el uso de una combinación de
S-t-butil-tio
cisteína y cisteína protegida con grupos de ácido lábil adecuados en
posiciones seleccionadas de la cadena polipeptídica para forzar la
formación de los enlaces disulfuro apropiados sin la adición extra
de un agente reductor al regulador de pH para plegamiento. En este
caso los grupos de ácido lábil se remueven cuando el péptido se
escinde a partir de la resina a pH ácido. Las cisteínas libres se
generan así, las cuales a su vez actúan como un "agente
reductor" intramolecular para permitir la remoción de
S-t-butilo y la formación de
disulfuro (como se ilustra en el ejemplo 6).
La esencia de la presente invención se basa
en:
- ensamblaje rápido de las cadenas polipéptidas
S-tio-t-butiladas
sobre el soporte polimérico;
- intercambio de los derivados de
disulfuro-tiol catalizado por cisteína en
condiciones ligeramente alcalinas que conducen a los polipéptidos
cisteinilados que son las formas macromoleculares oxidadas
(proteína-S-S-cisteína;
polipéptido-S-S-cisteína)
del par redox clásico Cisteína/Cisteína;
- la concentración de la forma macromolecular
oxidada que permanece constantemente a una baja durante todo el
procedimiento de plegamiento de manera que se minimiza el
intercambio del disulfuro intermolecular; y
- ausencia de agregación de intermediarios
plegados de manera errónea debido a la formación preferencial y
rápida de formas con formación correcta de pares de cisteína
(estructura nativa).
De conformidad con el procedimiento para
plegamiento de polipéptidos de la presente invención, por ejemplo,
en el primer paso, 10 mg del derivado
S-t-butilo se disuelve a temperatura
ambiente en 1 ml de un regulador de pH, pH 8.0, que comprende 6M de
cloruro de guanidinio, 10 mM de Tris y 0.1 M de Na2HPO4 y la
solución resultante se mantiene a temperatura ambiente por
aproximadamente 20 minutos. En el segundo paso, la solución se
diluye inicialmente 10 veces con agua a un pH de 7.2, (0.6 M de
cloruro de guanidinio, 1.0 mM de Tris, 10 mM de Na2HPO4 y una
concentración final del derivado de polipéptido a 1 mg/ml) y luego
se añade un gran exceso molar de cisteína (aproximadamente 100 veces
sobre la concentración del polipéptido o derivado de proteína) bajo
agitación. La temperatura se incrementa gradualmente a 37ºC y se
mantiene constante por aproximadamente 24 h con el objeto de
permitir que ocurra el plegamiento del polipéptido.
El procedimiento de plegamiento de la presente
invención resulta en un producto altamente homogéneo y es aplicable,
solamente con modificaciones menores, a cualquier polipéptido que se
produce mediante síntesis química en fase sólida como el derivado de
cisteína tio-t-butilo. Además, el
procedimiento de conformidad con la invención tiene numerosas
ventajas adicionales sobre el procedimiento de la técnica
precedente, al emplear formas de politiol precursor, tales como
- los residuos de cisteína de la cadena no están
aquilatados durante la escisión acidolítica del
polipéptido-resina;
- tanto la sobreoxidación de la cisteína hacia
ácido sulfúrico como la oxidación lleva a que no ocurra la
formación de puente disulfuro intermolecular;
- se evita el riesgo de derivación del anillo
indol de Trp por mercaptoetanol, el cual es necesario para eliminar
los iones Hg contaminantes derivados a partir del desbloqueo de Acm
con Hg (AcO)2. De hecho el tiolato de cisteína en la mezcla
para plegamiento de la presente invención no modifica el Trp del
todo;
- los residuos Met, Trp y Tyr sensibles a
oxidación no se modifican durante el plegamiento;
- los costos de producción de los productos
finales de plegamiento generalmente son más bajos en comparación
con aquellos que emplean polipéptidos politioles y reguladores de pH
tipo redox.
Será evidente a aquellos expertos en la técnica
que, a pesar de que las proteínas blanco generalmente se preparan
con un elevado rendimiento al utilizar el procedimiento de la
presente invención, en algunos casos, por ejemplo en el caso de las
proteínas complejas con múltiples enlaces disulfuro, una cierta
población de formas intermediarias que no se ha desarrollado
completamente hacia la estructura nativa (especies plegadas de
manera errónea) puede permanecer en la solución en equilibrio. Las
especies plegadas de manera errónea pueden separarse fácilmente a
partir de las especies correctamente plegadas mediante
RP-HPLC y someterse de nuevo a las condiciones para
plegamiento de la presente invención para incrementar el rendimiento
general del procedimiento.
De conformidad con la invención, el término
polipéptido se refiere un polímero de aminoácidos que se unen
mediante enlaces amida. El término proteína se refiere a las
especies polipeptídicas en su forma tridimensional, como ocurren en
las células y fluidos biológicos de los organismos vivos. Las
proteínas pueden consistir por ejemplo de cadenas polipeptídicas con
un solo plegamiento o pueden ser estructuras complejas que consisten
de cadenas polipeptídicas con múltiples plegamientos.
Los siguientes ejemplos se proveen para ilustrar
la presente invención y no se pretende que limiten la invención más
allá de las limitaciones establecidas en las reivindicaciones.
La figura 1 muestra el perfil de HPLC antes de
la remoción de S-t-Butilo y del
plegamiento de hu-I-309 (ejemplo
4).
La figura 2 muestra el resultado de la
determinación de masa del producto de la figura 1.
La figura 3 muestra el perfil de HPLC de
hu-I-309 desprotegida, plegada
(ejemplo 4), que demuestra un tiempo de retención más corto.
La figura 4 muestra el resultado de la
determinación de masa del producto de la figura 3.
La figura 5 muestra el resultado de la
determinación de masa del producto ilustrado en la figura 3, después
del tratamiento con NEM. No se observó ningún cambio en la masa en
comparación con la figura 4, que indica la ausencia de grupos -SH
libres.
La figura 6 es una gráfica de la comparación
entre la actividad biológica de la I-309
recombinante y la I-309 sintética, plegada de la
presente invención. La actividad biológica se evaluó mediante la
unión de la quimiocina, marcada con 125I, a los linfocitos de
humano.
La figura 7 muestra el perfil analítico del HPLC
de la proteína del ejemplo 5 después del plegamiento.
La figura 8 muestra el perfil preparativo de
HPLC de la proteína plegada del ejemplo 5.
La figura 9 muestra el resultado de la
determinación de masa del producto purificado del ejemplo 5, que
demuestra el peso molecular esperado.
La figura 10 muestra el perfil de HPLC del
polipéptido del ejemplo 6 antes de la remoción de
S-t-Butilo y del plegamiento.
La figura 11 muestra el resultado de la
determinación de masa del polipéptido de la figura 10 (M=H).
La figura 12 muestra el perfil de HPLC de la
proteína del ejemplo 6 después del plegamiento, que demuestra un
tiempo de retención más corto.
La figura 13 muestra el resultado de la
determinación de masa de la proteína de la figura 12 (M=H), que
demuestra el peso molecular esperado.
El derivado de quimiocina de 71 residuos de
aminoácidos se ensambla en un sintetizador peptídico 433 A (Perkin
Elmer/ABI) que utiliza química de Fmoc/t-Bu y una
resina basada en poliestireno funcionalizada con el enlazador ácido
lábil ácido hidroximetilfenoxiacético (resina de Wang) en la cual
Fmoc-Ser (t-Bu) se une mediante una
esterificación catalizada por DMAP
(4-dimetilaminopiridina). El grado de sustitución
fue de 0.57 mmoles/g. La síntesis se condujo a una escala de 0.27
mmoles que utiliza un exceso de cinco veces de
Fmoc-aminoácidos y reactivos activadores de DCI (N,
N'-diisopropilcarbodiimida)/HOBt
(1-hidroxibenzotriazol) en DMF. El tiempo de
acoplamiento fue de aproximadamente 60 minutos con un monitoreo
espectrofotométrico de desprotección de Fmoc.
Los cuatro tioles de cisteína se protegen con
grupos S-t-Butilo y se utiliza un
esquema de protección máximo para todas las otras cadenas
laterales: Ser (t-Bu), Thr (t-Bu),
Tyr (t-Bu), Asp
(O-t-bu), Glu
(O-t-Bu), Lys (Boc), Tro (Boc), Asn
(Trt), Gln (Trt) y Arg (Pmc). Después de cada acoplamiento, se lleva
a cabo el encasquetamiento con anhídrido acético y DIEA en DMF.
El polipéptido-resina resultante
se trata a temperatura ambiente con una mezcla preparada
recientemente de TFA/
agua/TIS (triisopropilsilano)/fenol (78:5:12:5), v/v/v/p, 10 ml/g de resina) por 2.5-3.0 h. El derivado polipeptídico escindido se precipita mediante filtración directa de la mezcla escindida en éter de metil-t-butilo frío (MTBE) y el precipitado se separa mediante centrifugación, se lava dos veces con éter y se seca en aire.
agua/TIS (triisopropilsilano)/fenol (78:5:12:5), v/v/v/p, 10 ml/g de resina) por 2.5-3.0 h. El derivado polipeptídico escindido se precipita mediante filtración directa de la mezcla escindida en éter de metil-t-butilo frío (MTBE) y el precipitado se separa mediante centrifugación, se lava dos veces con éter y se seca en aire.
El producto sin purificar se disuelve luego en
ácido acético diluido, se liofiliza, redisuelve en ácido acético al
50% y se aplica a una columna de Sephadex G-50
(70x25 cm) que utiliza ácido acético al 50% como la fase móvil. Las
fracciones colectadas se analizan mediante espectrometría de masa
MALDI-TOF y aquellas que contienen el derivado
polipeptídico deseado (PM 8,436.9 Da) se agrupan y liofilizan
después de su dilución con agua.
Las fracciones agrupadas se disuelven de nuevo
en ácido acético al 50% y se purifican adicionalmente mediante la
carga en una columna C4 Vydac semipreparativa de 250x10 mm. Las
muestras se eluyen a una velocidad de flujo de 3 ml/min con un
gradiente lineal de 20-80% de B en 60 minutos,
mientras que B fue TFA al 0.1% en acetonitrilo y A fue TFA al 0.1%
en agua. La detección se hace a 280 nm y solamente las fracciones
que contienen el polipéptido blanco se agrupan y se liofilizan antes
del plegamiento.
El plegamiento del derivado de quimiocina
purificado mediante RP-HPLC se lleva a cabo mediante
la disolución inicial de 10 mg del producto en 1 mg de GnHCl 6M,
Na2HPO4 0.1 M y Tris 10M a pH = 8.0 a temperatura ambiente. Después
de 20 minutos, la solución se diluye mediante la adición de 10 ml de
agua a la concentración final de GnHCl 0.6 M, Na2HPO4 10 mM, Tris 1
mM, pH = 7.2 y de una concentración del péptido de 1 mg/ml. El
plegamiento se inicia mediante la adición de cisteína a una
concentración de aproximadamente 20 mM (aproximadamente un exceso
molar de 100 veces con respecto a la concentración del péptido) y
gradualmente al incrementar la temperatura
a 37ºC.
a 37ºC.
La reacción para plegamiento, que ocurre a la
temperatura constante de 37ºC en aire, se monitorea mediante
análisis de RP-HPLC de alícuotas de 25 microlitros
de solución eliminatoria de ácido con ácido acético en un módulo de
separación Waters 2690 equipado con un detector en serie de
fotodiodo Waters 996, al utilizar una columna analítica C4 de Vydac
y un gradiente de acetonitrilo del 20-60% en TFA 0.1
%/agua en 40 minutos con una velocidad de flujo de 1.0 ml/min. Se
recolecta 1 microlitro de cada pico de HPLC (que corresponde a los
intermediarios de plegamiento de la reacción del intercambio tiol -
disulfuro), se mezcla con 1 microlitro de una solución saturada de
ácido sinapínico en acetonitrilo 1:2/ TFA al 1% en agua, se seca
bajo vacío y se analiza mediante espectrometría de masa
MALDI-TOF, que utiliza un espectrómetro
Voyager-DE (Perseptive Biosystems, Framingham, MA)
equipado con un láser de nitrógeno. 78% del polipéptido plegado se
formó después de 24 h. El pico cuyo PM corresponde al del producto
plegado se verifica adicionalmente mediante reacción con
N-etilmaleimida (NEM) para detectar la presencia de
grupos tiol líderes (+125 Da para cada SH).
La actividad biológica de
hu-TARC obtenida por la metodología de la presente
invención se lleva a cabo de conformidad con el método de Imai (T.
Imai et al., J. Biol. Chem., 271, 21514, 1996).
Las líneas de células T de humano, Hut78,
Hut102, y Jurkat, así como monocitos, neutrófilos y linfocitos
recién extraídos se evaluaron por su migración a través de un filtro
de policarbonato en respuesta a TARC. No se produjo ninguna
respuesta quimiotáctica en monocitos o neutrófilos, ni por TARC
preparada mediante síntesis química ni por TARC recombinante. En las
líneas de células T Hut78 y Hut102, la TARC sintética así como la
TARC recombinante induce migración con una curva típica en forma de
campana con un efecto máximo a 100 ng/ml.
La síntesis, purificación y plegamiento de
Cys10, 34, 50 (S-t-Bu)
hu-TARC y derivados de Cys11, 34, 50
(S-t-Bu)-hu-TARC
ha sido conducida en las mismas condiciones adoptadas para Cys10,
11, 34, 50 (S-t-Bu)
hu-TARC (ejemplo 1), la única diferencia es la
protección Trt en Cys10 y Cys11, respectivamente, la cual se remueve
de manera concomitante para escindir los precursores polipeptídicos
a partir de la resina. Los rendimientos de las quimiocinas finales
plegadas fueron del 80% y del 79%, respectivamente.
La síntesis, purificación y plegamiento del
derivado de Cys34, 50 (S-Bu) hu-TARC
se condujo en las mismas condiciones de los derivados de los
ejemplos 1 y 2, excepto que ambas Cys10 y Cys11 estuvieron
protegidas por Trt, el cual se remueve durante la escisión final de
la resina por TFA. El rendimiento del producto plegado fue de
aproximadamente 75%.
La síntesis de
hu-I-309 que contiene 6 cisteínas
protegidas (S-t-Bu) se conduce a una
escala de 0.12 mmoles en las mismas condiciones que en el ejemplo 1
que utiliza una resina de Wang Fmoc-Lys(Boc)
(grado de sustitución de 0.61 mmoles/g). El
polipéptido-resina resultante se trata como se
describe en el ejemplo 1 y el material purificado por G50 se
purifica adicionalmente mediante carga en una columna C18 de Vydac
de 250x10 mm (como se muestra en la figura 1 y 2).
\newpage
El plegamiento del derivado de quimiocina
purificado por RP-HPLC se lleva a cabo mediante la
disolución de 65 mg del producto en 60 ml de GuHCl 0.6 M, NaHPO4 10
mM y Tris 1 mM a pH 8.0 y al añadir cisteína a una concentración de
100 veces un exceso molar con respecto al péptido. La solución del
polipéptido se deja a 37ºC por 4 días. Después de la acidulación con
TFA el material plegado se aisla mediante RP-HPLC al
utilizar una columna C18 de Vydac de 250x10 mm (como se muestra en
la figura 3 y 4). La formación completa de pares de cisteína se
verifica mediante espectrometría de masas después de reacción con
N-etilmaleimida (NEM). No se observa ningún
incremento en el PM que indique ausencia de grupos tiol libres (como
se muestra en la figura 5). El rendimiento de la quimiocina plegada
final fue de casi el 25%. La
hu-I-309 sintética, plegada muestra
una actividad biológica equivalente a la proteína recombinante
(figura 6).
La cromatografía analítica se lleva a cabo al
utilizar las siguientes condiciones:
- Columna:
- C18 250 x 4.6 mm (Vydac# 238TP54)
- Fase móvil:
- A = H2O al 100% TFA al 0.1%
- \quad
- B = CH3CN al 100% TFA al 0.1%
- Gradiente:
- la composición % de B se reporta en el cromatograma
- Detector:
- 214 nm
\vskip1.000000\baselineskip
La síntesis y purificación de la proteína
303-372 del circumsporozoito Plasmodium vivax
(PvCS) que contiene 4 cisteínas protegidas
(S-t-Bu) se conduce en las mismas
condiciones como en el ejemplo 1.
El plegamiento se lleva a cabo mediante la
adición de 27 mg del péptido en 2.7 ml de GuHCl 6 M en regulador de
pH Tris 0.1 M, pH 8.5. La solución se mezcla por 10 minutos. Luego
se añaden 13.5 ml de EDTA 1 mM, NaCl 0.2 M regulado en su pH a pH
8.8 en regulador de pH de Tris 0.2 M. Finalmente, se añaden 10.8 ml
de cisteína 35 mM en EDTA 1 mM, NaCl 0.2 M regulado en su pH a pH
8.8 en regulador de pH de Tris 0.2 M. La mezcla de reacción se lleva
a 37ºC. La reacción de plegamiento se sigue en un HPLC de fase
reversa hasta su término (3-6 h) (figura 7A) y la
reacción se detiene mediante enfriamiento por 5 minutos a 4ºC
seguido por adición de TFA al 10% a 4ºC para alcanzar una
concentración final de TFA al 1% (3 ml de TFA al 10%). El producto
se purifica subsecuentemente mediante HPLC en fase reversa (figura
8) y se determina la masa del producto final (figura 9). El
rendimiento del producto oxidado final fue del
70-80%.
La cromatografía analítica se lleva a cabo al
utilizar las siguientes condiciones:
- Columna:
- C4 250 x 4.6 mm (Vydac# 214TP54)
- Fase móvil:
- A = H2O al 100% TFA al 0.1%
- \quad
- B = CH3CN al 100% TFA al 0.1%
- Gradiente:
- la composición % de B se reporta en el cromatograma
- Detector:
- 214 nm
\vskip1.000000\baselineskip
Una síntesis y purificación a gran escala de la
proteína del ciscimsporozoito Plasmodium falciparum (PfCS
282-383) que contiene solamente 2 de 4 cisteínas
protegidas (S-t-Bu) se conduce en
las mismas condiciones como en el ejemplo 1 (como se muestra en las
figuras 10 y 11) excepto por lo siguiente.
El plegamiento se lleva a cabo mediante la
disolución de 1.1 g del péptido parcialmente purificado en 1.0 L de
CH3COONH4 0.1 M, pH 8.0, sin adición de cisteína libre al regulador
de pH para plegamiento. La mezcla de reacción se mantiene a 32ºC
durante 18 h. El producto se purifica luego mediante HPLC en fase
reversa (figura 12 y 13). El rendimiento del producto oxidado final
fue de casi el 37%.
\newpage
La cromatografía analítica se lleva a cabo al
utilizar las siguientes condiciones:
- Columna:
- C18 250 x 4.6 mm (Vydac# 238TP54)
- Fase móvil:
- A = H2O al 100% TFA al 0.1%
- \quad
- B = CH3CN al 100% TFA al 0.1%
- Gradiente:
- la composición % de B se reporta en el cromatograma
- Detector:
- 214 nm
Se hace constar que con relación a esta fecha,
el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la
práctica la citada invención es el convencional para la manufactura
de los objetos o productos a que la misma se refiere.
Claims (27)
1. Un procedimiento para plegar polipéptidos
sintetizados químicamente, caracterizado porque comprende
tratar a un polipéptido y/o proteína que comprende dos o más
residuos de cisteína derivada con un agente reductor en un regulador
de pH para plegamiento que tiene un pH y temperatura
predeterminados.
2. El procedimiento de conformidad con la
reivindicación 1, caracterizado porque el residuo de cisteína
derivado corresponde a un residuo de
S-butil-tio-cisteína.
3. El procedimiento de conformidad con la
reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque el agente reductor
es cisteína.
4. El procedimiento de conformidad con la
reivindicación 1, 2 ó 3, caracterizado porque el regulador de
pH para plegamiento comprende una o más sales caotrópicas.
5. El procedimiento de conformidad con la
reivindicación 4, caracterizado porque las sales caotrópicas
se eligen a partir del grupo que consiste de cloruro de guanidinio y
urea.
6. El procedimiento de conformidad con la
reivindicación 4 ó 5, caracterizado porque las sales
caotrópicas en el regulador de pH para plegamiento están presentes
en una concentración de 0.1-1 M.
7. El procedimiento de conformidad con
cualesquiera de las reivindicaciones 1-6,
caracterizado porque el regulador de pH para plegamiento
tiene un pH alcalino.
8. El procedimiento de conformidad con la
reivindicación 7, caracterizado porque el pH se encuentra
entre 7 y 9.
9. El procedimiento de conformidad con la
reivindicación 7 u 8, caracterizado porque el pH se encuentra
entre 7 y 8.5.
10. El procedimiento de conformidad con
cualesquiera de las reivindicaciones 1-9,
caracterizado porque la temperatura del regulador de pH para
plegamiento se encuentra entre 25º y 40ºC.
11. El procedimiento de conformidad con la
reivindicación 10, caracterizado porque la temperatura se
encuentra entre 27º y 38ºC.
12. El procedimiento de conformidad con la
reivindicación 10 u 11, caracterizado porque la temperatura
es de aproximadamente 37ºC.
13. Un procedimiento para la preparación de
proteínas activas biológicamente, que comprende (a) sintetizar
químicamente un polipéptido que comprende dos o más residuos de
cisteína derivados; (b) tratar a este polipéptido con un agente
reductor en un regulador de pH para plegamiento que tiene un pH y
temperatura predeterminados, y (c) purificar los polipéptidos y/o
proteínas plegadas obtenidas.
14. El procedimiento de conformidad con la
reivindicación 13, caracterizado porque el residuo de
cisteína derivado corresponde a un residuo de
S-butil-tio-cisteína.
15. El procedimiento de conformidad con la
reivindicación 13 ó 14, caracterizado porque el agente
reductor es cisteína.
16. El procedimiento de conformidad con la
reivindicación 13, 14 ó 15, caracterizado porque el regulador
de pH para plegamiento comprende una o más sales caotrópicas.
17. El procedimiento de conformidad con la
reivindicación 16, caracterizado porque las sales caotrópicas
se eligen a partir del grupo que consiste de cloruro de guanidinio y
urea.
18. El procedimiento de conformidad con la
reivindicación 15 ó 16, caracterizado porque las sales
caotrópicas en el regulador de pH para plegamiento están presentes
en una concentración de 0.1-1 M.
19. El procedimiento de conformidad con
cualesquiera de las reivindicaciones 13-18,
caracterizado porque el regulador de pH para plegamiento
tiene un pH alcalino.
20. El procedimiento de conformidad con la
reivindicación 19, caracterizado porque el pH del regulador
de pH para plegamiento se encuentra entre 7 y 9.
21. El procedimiento de conformidad con la
reivindicación 20, caracterizado porque el pH se encuentra
entre 7 y 8.5.
22. El procedimiento de conformidad con
cualesquiera de las reivindicaciones 13-21,
caracterizado porque la temperatura del regulador de pH para
plegamiento se encuentra entre 25º y 40ºC.
23. El procedimiento de conformidad con la
reivindicación 22, caracterizado porque la temperatura se
encuentra entre 27º y 38ºC.
24. El procedimiento de conformidad con la
reivindicación 22 ó 23, caracterizado porque la temperatura
es de aproximadamente 37ºC.
25. El procedimiento de conformidad con
cualesquiera de las reivindicaciones 13-24,
caracterizado porque comprende los pasos de (a) ensamblar un
polipéptido
S-t-butil-tio
cisteína sobre un soporte polimérico insoluble mediante elongación
de cadena paso a paso; (b) escindir la cadena polipeptídica de
S-t-butil-tio
cisteína a partir del soporte mediante acidolisis; (c) purificar el
polipéptido
S-t-butil-tio
cisteína obtenido; (d) plegar el polipéptido
S-t-butil-tio
cisteína purificado mediante el tratamiento de estos derivados de
polipéptido con un exceso molar de cisteína en un regulador de pH
para plegamiento que comprende una sal caotrópica y que tiene un pH
alcalino y una temperatura de aproximadamente 37ºC; y (e) purificar
las proteínas plegadas obtenidas mediante cromatografía líquida de
alta resolución en fase reversa.
26. El procedimiento de conformidad con la
reivindicación 25, caracterizado porque la sal caotrópica es
cloruro de guanidinio.
27. El procedimiento de conformidad con la
reivindicación 25 o 26, caracterizado porque el soporte
polimérico es una resina basada en poliamida o poliestireno
funcionalizada con el aglutinante de ácido lábil ácido
hidroximetilfenoxiacético.
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