CN116178480A - 一种硒代半胱氨酸介导的环肽合成方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种硒代半胱氨酸介导的环肽的合成方法及应用。本发明通过固相多肽合成法合成底物多肽，其C端以酰肼形式存在，N末端为硒代半胱氨酸。环化方法通过向底物多肽中加入抗坏血酸盐、高浓度的磷酸三(2‑氯乙基)酯(TCEP)以及乙酰丙酮，在室温下震荡反应，得到相应的目标环肽。本发明有助于拓展首尾成环的环肽的合成方法，实现其高效合成。

Description

一种硒代半胱氨酸介导的环肽合成方法及其应用
技术领域
本发明涉及多肽/蛋白质合成制备技术领域，具体涉及一种硒代半胱氨酸介导的环肽合成方法及其应用。
技术背景
随着越来越多的天然存在的具有不同生物活性的环肽被发现，环肽引起了越来越多的关注，特别是在药物研究领域。环肽的化学合成对研究其结构与活性关系具有重要意义。传统的直接偶联肽环化方法具有一定的局限性，如C端对异构化的敏感性，完全保护的肽前体溶解度差，以及低聚化引起的收率低。[1]因此，化学选择性连接介导的环化方法已成为环肽合成的有效策略。
在自然界中发现的环肽其形成通常涉及两个反应性基团，这两个反应性基团通过反应以得到环肽的环状结构，这些反应包括内酰胺化、内酯化、硫代内酯化以及形成二硫桥。[2-3]基于两个反应性基团在多肽中的位置，多肽环化方式通常可分为四类：头尾连接、头与侧链连接、侧链与尾连接和侧链与侧链连接。对于首尾连接的环肽，其环化是通过线性前体两端的氨基和羧酸盐基团内酰胺化实现的。除了两个末端，Lys的侧链氨基，Asp的侧链羧基，Glu、Ser和Thr的侧链羟基以及Cys的侧链巯基也是常见的参与成环的官能团，从而可得到其他三类环肽。除了利用存在于肽末端和侧链的功能团进行肽环化外，还可能涉及安装在主链N-α原子上的官能团。这种非经典的N-backbone肽环化依赖于功能化N-烷基化氨基酸的使用。[4-5]
目前，首尾连接的环肽主要是通过自然化学连接(Native Chemical Ligation,NCL)介导的环化进行合成。该反应具体过程为线性多肽N末端的半胱氨酸侧链巯基会进攻自身C端硫酯的羰基碳，经硫酯转移作用形成由硫酯键连接的中间体。随后经S→N重排以获得天然肽键。[6-7]但该方法具有以下局限性：反应浓度过低时无法进行连接，据报道，反应浓度只能低至毫摩级别，对于更低浓度的反应难以观测到环肽的形成；且对于连接位阻较大的位点如His、Pro等，反应速度缓慢；另外，如何高效率地获取C端多肽硫酯也仍有待探究。因此，人们对更多的连接方法进行了研究。
硒代半胱氨酸(Sec)介导的NCL通过用Sec替换N末端Cys并对反应条件进行调整，制备了含有硒代半胱氨酸的环状肽。[8]随后可以对其进行脱硒以得到天然的Ala或Ser残基。
Sec介导的NCL具有更好的反应效率，因此引起了人们的广泛研究。
参考文献：
1.Kemp,D.S.；Rebek,J.Peptide Racemization Mechanism.Kinetic IsotopeEffect as a Means of Distinguishing Enolization fromOxazoloneFormation.J.Am.Chem.Soc.1970,92,5792-5793.
2.White,C.J.；Yudin,A.K.Contemporary Strategies for PeptideMacrocyclization.Nat.Chem.2011,3,509-524.
3.Davies,J.S.The Cyclization of Peptides andDepsipeptides.J.Pept.Sci.2003,9,471-501.
4.Rubin,S.J.S.；Qvit,N.Backbone-Cyclized Peptides:A CriticalReview.Curr.Top.Med.Chem.2018,18,526-555.
5.Gilon,C.；Halle,D.；Chorev,M.；Selincer,Z.；Byk,G.BackboneCyclization:ANew Method for Conferring ConformationalConstraint onPeptides.Biopolymers.1991,31,745-750.
6.Zhang,L.；Tam,J.P.Synthesis and Application ofUnprotected CyclicPeptides as BuildingBlocks for PeptideDendrimers.J.Am.Chem.Soc.1997,119,2363-2370.
7.Dawson,P.E.；Muir,T.W.；Clark-Lewis,I.；Kent,S.B.Synthesis of Proteinsby NativeChemical Ligation.Science.1994,266,776-779.
8.Quaderer,R.；Hilvert,D.Selenocysteine-Mediated BackboneCyclizationof UnprotectedPeptides Followed by Alkylation,Oxidative Elimination orReduction of the Selenol.Chem.Commun.2002,0,2620-2621.
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有方法的缺点与不足，提供一种硒代半胱氨酸介导的环肽合成方法。
本发明的另一目的在于提供上述硒代半胱氨酸介导的环肽合成方法的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种硒代半胱氨酸介导的环肽合成方法，是通过多肽固相合成得到的含硒代半胱氨酸的多肽酰肼，向其中依次加入抗坏血酸盐、还原剂以及乙酰丙酮，在室温下震荡反应，随后进行脱硒，即可得到相应的目标环肽；具体操作优选包括如下步骤：
(1)将N末端为硒代半胱氨酸的多肽酰肼溶于缓冲液A中，加入抗坏血酸盐，溶解；随后加入二硒键还原剂，溶解，反应，得到多肽反应液B；该步骤中，二硒键还原剂会还原二硒键，从而得到游离的硒醇基团参与反应；
(2)向步骤(1)得到的多肽反应液B中加入乙酰丙酮，反应，得到多肽反应液C；该步骤中，乙酰丙酮会活化C端酰肼基团得到吡唑中间体，该中间体容易被亲核进攻，进而发生环化反应；
(3)在步骤(2)得到的多肽反应液C中加入谷胱甘肽(GSH)和磷酸三(2-氯乙基)酯(TCEP)，调节pH，反应；反应液纯化，得到目标产物；该步骤中，在还原剂和谷胱甘肽的作用下，环肽进行原位脱硒以得到自然的Ala残基。
步骤(1)中所述的N末端为硒代半胱氨酸的多肽酰肼优选通过使用2-氯三苯甲基氯树脂，对其进行酰肼化后，采用Fmoc固相多肽合成法，从C端到N端依次缩合Fmoc保护氨基酸得到。
步骤(1)中所述的缓冲液A的组成优选如下：5～7mol/L GdmCl，0.1～0.3mol/LNa2HPO4，pH＝2.9～3.1；更优选如下：6mol/L GdmCl，0.2mol/L Na2HPO4，pH＝3.0，其中，所述GdmCl为盐酸胍，CAS号：50-01-1。
步骤(1)中所述的缓冲液A的用量，优选按N末端为硒代半胱氨酸的多肽酰肼在体系中的浓度为0.5～2mmol/L计；更优选按1mmol/L计。
步骤(1)中所述的抗坏血酸盐的用量，优选按其在体系中的浓度为0.1～0.3mmol/L计；更优选按0.2mmol/L计。
步骤(1)中所述的二硒键还原剂优选为磷酸三(2-氯乙基)酯(TCEP)。
步骤(1)中所述的二硒键还原剂的用量，优选按N末端为硒代半胱氨酸的多肽酰肼180～220倍当量的量计；更优选按200倍当量的量计。
步骤(1)中所述的加入二硒键还原剂后的反应的条件，优选为室温下震荡反应4～6min；更优选为室温下震荡反应5min。本发明中所述室温是指20℃～30℃。
步骤(2)中所述的乙酰丙酮的用量，优选按N末端为硒代半胱氨酸的多肽酰肼2～3倍当量的量计；更优选按2.5倍当量的量计。
步骤(2)中所述的加入乙酰丙酮后的反应的条件，优选为室温下震荡反应30～90min；更优选为室温下震荡反应60min。
步骤(3)中所述的谷胱甘肽的用量，优选按其在体系中的浓度为50～70mmol/L计；更优选按60mmol/L计。
步骤(3)中所述的磷酸三(2-氯乙基)酯的用量，优选按其在体系中的浓度为50～70mmol/L计；更优选按60mmol/L计。
步骤(3)中所述的pH优选按6.3～6.7计；更优选按6.5计。
步骤(3)中所述的纯化均优选通过反向液相色谱(HPLC)实现；所述的反向液相色谱的流动相为含0.1％三氟乙酸的乙腈/水混合液。
上述硒代半胱氨酸介导的环肽合成方法在多肽/蛋白质合成中的应用。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明通过乙酰丙酮活化C端酰肼基团，成酰基吡唑，利用硒代半胱氨酸硒醇基极强的亲核性，实现高效的环化反应，大大缩短了反应时间，并且该反应能在较低pH、较低浓度下进行，为难溶环肽的合成提供了新思路。
本发明无需多肽硫酯/硒酯中间体参与反应，酰肼基团活化成酰基吡唑后直接受硒醇基进攻成环，减少了反应步骤及操作过程。此外，由于该反应中加入了大量的还原剂，还避免了各种复杂的二聚结构的形成，反应产物单一，极大地简化了目标环肽的液相纯化。
附图说明
图1为模拟肽MPA的环化反应过程的HPLC及LC-MS示意图(1为线性模拟肽，2为目标环肽)。
图2为模拟肽MPL的环化反应过程的HPLC及LC-MS示意图(1为线性模拟肽，2为目标环肽，3为水解副产物。)。
图3为模拟肽MPG的环化反应过程的HPLC及LC-MS示意图(1为线性模拟肽，2为目标环肽)。
图4为模拟肽MPK的环化反应过程的HPLC及LC-MS示意图(1为线性模拟肽，2为目标环肽，3为水解副产物)。
图5为模拟肽MPH的环化反应完过程的HPLC及LC-MS示意图(1为线性模拟肽，2为目标环肽，3为水解副产物)。
图6为使用本发明方法制得环状肽Cyclonellin的HPLC及LC-MS示意图(1为线性模拟肽，2为目标环肽，4为环状肽Cyclonellin)。
图7为本发明方法的反应流程示意图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中使用的硒代半胱氨酸结构式如下：
Figure BDA0004092603660000041
下述实施例中HPLC使用的仪器为安捷伦1260，色谱柱为Phenomenex C18柱，流动相为水和乙腈(含0.1％TFA)。
下述实施例中用到的试剂名称及缩写：
DMSO：二甲基亚砜
TCEP：磷酸三(2-氯乙基)酯
GSH：谷胱甘肽
ACN：乙腈
TFA：三氟乙酸。
下述实施例中以模拟肽MPX作为底物多肽时，X表示其氨基酸序列中C末端的氨基酸，分别为丙氨酸(Ala)，亮氨酸(Leu)，甘氨酸(Gly)，赖氨酸(Lys)，组氨酸(His)。模拟肽均通过固相多肽合成方法获取，N末端氨基酸为硒代半胱氨酸，最终得到的多肽酰肼片段(分别命名为MPA，MPL，MPG，MPK，MPH)，其氨基酸序列为：UGYLKSLX-NH NH2；
下述实施例中以环状肽Cyclonellin作为底物多肽时，通过固相多肽合成方法获取，N末端氨基酸为硒代半胱氨酸(Sec)，最终得到的多肽酰肼片段，其氨基酸序列为：UNPRYPY T-NHNH2，其中硒代半胱氨酸残基在成环后可进行脱硒处理，得到原位丙氨酸残基。
实施例1：模拟肽环化反应的尝试
(1)多肽二聚体的还原处理
将合成的模拟肽MPX溶于溶于6mol/L GdmCl，0.2mol/L Na2HPO4，pH 3的缓冲液中，至模拟肽MPX在体系中的浓度为1mmol/L，加入0.2M的抗坏血酸盐，充分溶解后溶液呈浅黄色，然后加入磷酸三(2-氯乙基)酯(TCEP)，用量按多肽200倍当量的量计，在室温条件下反应5min，确保多肽内二硒键断开。可用反向HPLC监测，在方法20％-50％in 25min(ACN浓度从20％在25分钟内升至50％)中根据是否只出现目标分子峰判断反应是否完成，反应结束后使用制备型反向HPLC对产物进行纯化，方法同前。
模拟肽中，MPX分别为MPA，MPL，MPG，MPK，MPH。
(2)酰肼端活化及环化反应
向上述溶液中加入乙酰丙酮，用量按多肽2.5倍当量的量计，在室温下搅拌反应60min，使用反向HPLC与MALDI-TOF监测反应。
结果如图1～图5所示。当X为不同氨基酸时，模拟肽的反应时间有所不同，但在60min时均已显示反应完成。不同的模拟肽可能伴有少量水解副产物。
实施例2：环状肽Cyclonellin的合成
参照实施例1的方法，制备得到带硒醇基的环状肽Cyclonellin，随后进行如下操作：
(3)原位脱硒为丙氨酸
取上述反应液，加入终浓度为60mmol/L的谷胱甘肽(GSH)和60mmol/L的磷酸三(2-氯乙基)酯(TCEP)，使用0.5M NaOH将反应溶液pH调至6.5，在37℃条件下搅拌反应16h。使用反向HPLC与LC-MS监测反应。离心并过滤后使用制备型反向HPLC进行制备纯化，冷冻干燥，称重，在-20℃的环境下保存。
图6为反应过程的HPLC及LC-MS示意图，产率为52.28％。
上述脱硒反应也可以进行氧化脱硒，选择性脱硒后可得到对应位点为丝氨酸残基。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种硒代半胱氨酸介导的环肽合成方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)将N末端为硒代半胱氨酸的多肽酰肼溶于缓冲液A中，加入抗坏血酸盐，溶解；随后加入二硒键还原剂，溶解，反应，得到多肽反应液B；
(2)向步骤(1)得到的多肽反应液B中加入乙酰丙酮，反应，得到多肽反应液C；
(3)在步骤(2)得到的多肽反应液C中加入谷胱甘肽和磷酸三(2-氯乙基)酯，调节pH，反应；反应液纯化，得到目标产物。
2.根据权利要求1所述的硒代半胱氨酸介导的环肽合成方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的缓冲液A的组成如下：5～7mol/L GdmCl，0.1～0.3mol/L Na2HPO4，pH＝2.9～3.1；其中，所述GdmCl为盐酸胍，CAS号：50-01-1。
3.根据权利要求2所述的硒代半胱氨酸介导的环肽合成方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的缓冲液A的组成如下：6mol/L GdmCl，0.2mol/L Na2HPO4，pH＝3.0；
步骤(1)中所述的二硒键还原剂为磷酸三(2-氯乙基)酯。
4.根据权利要求1-3任一项所述的硒代半胱氨酸介导的环肽合成方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的缓冲液A的用量按N末端为硒代半胱氨酸的多肽酰肼在体系中的浓度为0.5～2mmol/L计；
步骤(1)中所述的抗坏血酸盐的用量按其在体系中的浓度为0.1～0.3mmol/L计；
步骤(1)中所述的二硒键还原剂的用量按N末端为硒代半胱氨酸的多肽酰肼180～220倍当量的量计。
5.根据权利要求1所述的硒代半胱氨酸介导的环肽合成方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的缓冲液A的用量按N末端为硒代半胱氨酸的多肽酰肼在体系中的浓度为1mmol/L计；
步骤(1)中所述的抗坏血酸盐的用量按其在体系中的浓度为0.2mmol/L计
步骤(1)中所述的二硒键还原剂的用量按N末端为硒代半胱氨酸的多肽酰肼200倍当量的量计。
6.根据权利要求1所述的硒代半胱氨酸介导的环肽合成方法，其特征在于：
步骤(2)中所述的乙酰丙酮的用量按N末端为硒代半胱氨酸的多肽酰肼2～3倍当量的量计；
步骤(3)中所述的谷胱甘肽的用量按其在体系中的浓度为50～70mmol/L计；
步骤(3)中所述的磷酸三(2-氯乙基)酯的用量按其在体系中的浓度为50～70mmol/L计；
步骤(3)中所述的pH按6.3～6.7计。
7.根据权利要求6所述的硒代半胱氨酸介导的环肽合成方法，其特征在于：
步骤(2)中所述的乙酰丙酮的用量按N末端为硒代半胱氨酸的多肽酰肼2.5倍当量的量计；
步骤(3)中所述的谷胱甘肽的用量按其在体系中的浓度为60mmol/L计；
步骤(3)中所述的磷酸三(2-氯乙基)酯的用量按其在体系中的浓度为60mmol/L计；
步骤(3)中所述的pH按6.5计。
8.根据权利要求1所述的一种硒代半胱氨酸介导的环肽合成方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的加入二硒键还原剂后的反应的条件为室温下震荡反应4～6min；
步骤(2)中所述的加入乙酰丙酮后的反应的条件为室温下震荡反应30～90min。
9.根据权利要求1所述的一种硒代半胱氨酸介导的环肽合成方法，其特征在于：
步骤(3)中所述的纯化通过反向液相色谱实现；所述的反向液相色谱的流动相为含0.1％三氟乙酸的乙腈/水混合液。
10.权利要求1～9任一项中所述的一种硒代半胱氨酸介导的环肽合成方法在多肽/蛋白质合成中的应用。
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