CN1449406A - 对化学合成多肽进行折叠的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于折叠化学合成多肽的方法，包括在一种预先设定了pH和温度的折叠缓冲液中利用还原剂处理含有两个或多个衍生半胱氨酸残基的多肽和/或蛋白质，其中所述衍生半胱氨酸残基相当于S－丁基－硫代－半胱氨酸残基而且所述还原剂是半胱氨酸。

Description

对化学合成多肽进行折叠的方法

技术领域

本发明涉及一种对化学合成多肽进行折叠的方法。另外，本发明还涉及一种生产生物活性蛋白质的方法。

背景技术

自从成功地对全活性HIV-蛋白酶进行了化学合成后，近几十年，对合成蛋白质的需求在逐步增加，所述HIV-蛋白酶是通过高度优化的固相肽合成(SPPS)的方法制备的一种由99个残基组成的酶，该方法以标准的Boc/Bzl方法为基础。

1994年对晶状遍在蛋白质的合成进一步表明高纯度蛋白质可通过基于Fomc/t-Bu方案的SPPS方法来合成，该方法在操作上比Boc/Bzl方法简单而且在化学方面没Boc/Bzl方法复杂，其中所述晶状遍在蛋白质是一种由76个残基组成的小分子蛋白质。

到2000年为止，大量的实验证据表明借助肽合成仪通过化学合成可快速、可靠和经济地生产含有60至100个氨基酸残基的单结构域蛋白质，生产量足以进行结构和功能的研究。

通过化学合成制备的含二硫键的蛋白质一旦进行了折叠，就具有与天然和基因工程形式的蛋白质相同的特性。蛋白质的二硫键可形成单个或多个链内和/或链间的环状结构，该环状结构给予分子大量的构象限制，因此对稳定生物活性构象起着决定性的作用。

结构已知的单结构域折叠蛋白可通过半胱氨酸残基的区域选择性配对来制备。已经对适合于常用保护方案的多种组合形式的半胱氨酸保护基团进行了研究从而使得半胱氨酸残基以分步和成对的方式进行完全选择性的去保护和/或共氧化。

然而，最近对一种胰岛素样肽，即人松弛素进行的合成表明在含有多个半胱氨酸残基的蛋白质中进行的半胱氨酸残基的区域选择性配对所涉及的化学过程是多么的复杂。利用SPPS方法、Fmoc/t-Bu方法和对-烷氧基苯甲醇基的树脂来合成A链前体，同时利用PAM树脂(与聚苯乙烯基的树脂连接的4-羧基酰氨基甲基苄基酯)按照Boc/Bzl方法来合成B链前体。将A链前体的四个半胱氨酸残基中的两个半胱氨酸残基以S-Trt(S-三苯基甲基)衍生物的形式保护起来，同时将另外两个半胱氨酸残基分别以S-Acm(S-乙酰氨基甲基)和S-Meb(S-对-甲基苄基)的形式保护起来。B链前体中的两个半胱氨酸被S-Acm和S-Meb保护基团保护起来。首先通过在AcOH中进行碘氧化来形成A链的分子内的S-S键。然后，通过以下两个步骤来形成两个连接A和B链的分子间二硫键：在第一个步骤中，通过对A链前体中的S-Meb保护基团进行HF去保护而获得的游离巯基与B链中的被活化的Cys(Npys)(S-3-硝基-2-吡啶亚磺酰基)残基进行反应(目的在于形成分子间的异源二硫键)，以及在第二个步骤中，通过与碘发生共氧化反应来去除S-Acm基团从而获得其余的S-S键。

SPPS方法为化学合成制备各种含有用相同保护基团保护的半胱氨酸残基的多肽提供了可能性。一旦利用多种氧化试剂去除了保护基团，就能直接形成二硫键。通过对溶剂、pH和反应时间进行精心调控从而将对氧化反应敏感的Tyr、Met和Trp发生改变的程度降到最低以及避免半胱氨酸的巯基被过氧化成相应的磺酸，在这种条件下利用碘、N-碘代琥珀酰亚胺和碘化氰进行处理，结果含有被S-Trt或S-Acm保护的半胱氨酸的多肽和/或蛋白质都能进行有效的折叠。

有时三氟乙酸铊(III)可替代上述氧化剂从而得到较高产率的二硫键。该试剂的主要缺陷在于它的毒性、从靶多肽中去除铊的难度以及需要对Met和Trp残基进行保护以避免被氧化。

含有亚砜/甲硅烷基化合物与三氟乙酸的混合物的氧化试剂已被成功地用来将含有S-Acm、S-But、S-Met和S-Mob(S-对-甲氧基苄基)半胱氨酸残基的多肽前体直接氧化形成二硫键。然而，为了避免在氧化条件下的氯化作用需要利用甲酰基对Trp的吲哚环进行保护，这一点严重制约了该混合物的应用。

对合成的线性多巯基前体(多肽的还原形式)进行氧化折叠的方法比较普遍而且使用的频率最高。通过该最简单的方法，可在有空气或一些其它温和氧化剂存在的条件下自然形成合适的二硫键。而且，在有被还原形式的(RSH)和被氧化形式的(R-S-S-R)低分子量的巯基化合物同时存在的条件下完成折叠和半胱氨酸的配对。

对于由单结构域组成的合成多肽和小分子蛋白质来说，由于H-键合、离子配对和疏水性作用的联合效应而造成折叠所需的热力学推动力显然足以在随机变性氧化反应过程中自然产生天然的异构体。

通过对含有多个半胱氨酸的小分子蛋白质如酶、抑制剂、毒素或激素进行氧化折叠研究，获得了有关特定结构基元如被半胱氨酸稳定的β-转角、被半胱氨酸稳定的聚(Pro)-II螺旋折叠和被半胱氨酸稳定的β-β-结构折叠的有用信息，其中所述特定结构基元的稳定作用是形成正确二硫键的主要推动力，即使在较小的肽分子中也如此。如果注意选择对二级结构基元起稳定作用的缓冲液、温度和添加剂，那么即使在体外也能对部分折叠的或不规则的(错折叠的)蛋白质进行完全正确的折叠。

为了将分子内半胱氨酸的错误配对减到最少以及尽可能地避免分子间二硫键的随机形成，已经设计了多种适用于多巯基多肽种类的折叠方案，所述分子内半胱氨酸的错误配对导致错折叠的非天然异构体的产生，所述分子间二硫键的随机形成促使发生聚集和沉淀。

因此，一般是在中性或弱碱性条件下对高稀释度(1mg/ml或低于1mg/ml)的多巯基形式的前体进行空气氧化。在反应过程中通常需要持续很长时间而且还产生一种无害的副产物，即水。然而，由于痕量金属离子对空气氧化速率影响很大，所以很难对空气氧化进行控制。更重要的是，折叠过程中在或接近它们的碱性或中性等电点时，碱性和疏水性前体分子容易发生聚集作用并从溶液中沉淀出来。而且，由于Met发生氧化而产生的副产物在折叠过程中蓄积。尽管将折叠多巯基前体所需的化学操作步骤减至最少，但是在许多情况下由空气的分子氧促进的二硫键的形成产率非常低，有时根本就不能形成二硫键。

DMSO和铁氰化钾也已被用作氧化剂。然而，铁氰化钾必须在暗处使用并且，如果多肽链中含有Met和Trp，那么在折叠过程中积累氧化副产物。由于在酸性条件下能有效进行氧化折叠同时在反应中不生成有害的产物，所以使用DMSO通常能够获得较好的结果。由于进行氧化的碱性和疏水性多肽前体在酸性缓冲液中具有较高的溶解特性，所以该方法特别适用于碱性和疏水性多肽前体的折叠。然而，常常有这样的报道，即从终产物中去除DMSO存在着难度以及对二硫键形成的选择性很低。而且，即使对实验条件进行精心的调控，也总是不能避免形成无规则二硫键，该无规则二硫键导致错折叠的异构体的产生和低聚反应的发生。

通过利用氧化还原缓冲液如被氧化的(GSSG)和被还原的(GSH)谷胱甘肽和胱氨酸/半胱氨酸(Cys/Cys)大都能够以较高的产率获得小分子蛋白质的多巯基前体中的半胱氨酸的正确配对和折叠。

因此，在由GSSG/GSH或Cys/Cys诱导的核糖核酸酶A(R.R.Hantgan等，生物化学(Biochemistry)13，613，1974)，水蛭素的49个氨基酸核心结构域(B.Chatrenet和J.Y.Chang，生物化学杂志(J.Biol.Chem).267，3038，1992)和牛胰蛋白酶抑制剂(BPTI)(T.E.Creighton，酶学方法(Methods Enzymol).131，83，1986)的氧化折叠过程中，形成游离巯基和二硫基并且在整个折叠过程中不断地进行改构。由于通过硫醇盐中间体进行的巯基/二硫基交换反应可促进非天然二硫键向天然二硫键的改组，所以总的速率和产率通常高于在空气中进行氧化折叠的速率和产率。对于在空气中进行氧化折叠的情况，为了避免聚集和低聚物和聚合物的形成以及最大限度地提高靶蛋白的产率，高稀释度的多巯基前体是必需的。

在水蛭素^1-49进行体外折叠的第一阶段中，未折叠的还原形式(多巯基)循序而且不可逆地进行折叠，形成含有一个和两个二硫键的平衡异构体并且还形成含有三个二硫键的平衡异构体(无规则异构体)(J.Y.Chang，生物化学杂志(Biochem.J).300，643，1994)。已经鉴定出包括天然种类在内的几乎全部75个可能的蛋白质种类：15个具有一个S-S键的异构体、45个具有两个S-S键的异构体和15个具有三个S-S键的异构体。在折叠的第二个阶段中，无规则种类通过改组非天然二硫键进行改构而获得天然蛋白质种类。主要通过利用被氧化的谷胱甘肽或胱氨酸来加快二硫键的形成，而二硫键的改组需要一种巯基催化剂如被还原的谷胱甘肽或半胱氨酸或巯基乙醇。

巯基试剂促进改组的有效性显然与它们的氧化还原电势有关并且每种催化剂都具有一个最佳浓度。在无规则水蛭素积累的过程中，胱氨酸/半胱氨酸的效力约比GSSG/GSH高10倍。这一差异已经通过GSSG/GSH(-0.24V)与Cys-Cys/Cys(-0.22V)系统之间的相对氧化还原电势而得到解释。通过选择一组最适条件(温度、缓冲液、盐和氧化还原混合物)，将水蛭素^1-49的折叠过程加快到15分钟内就能完成的程度。

一般来说，含有数个二硫键的合成蛋白质的天然构象在最适于多巯基形式进行折叠的条件下应该自然形成。然而，在许多情况下，即使在最适条件下由上述氧化还原缓冲液介导氧化折叠，也产生大量的副产物和错配形式。这种情况尤其涉及那些仅在特定膜表面或在特定陪伴分子的协助下易于形成天然构象的蛋白质(S.Sakakibara生物聚合物，肽科学(Biopolymers，Peptide Science)51，279，1999)。

而且，尽管已经广泛使用，但是正如合成趋化因子和趋化因子类似物的折叠实验所表明的，由空气或GSSG/GSH和胱氨酸/半胱氨酸氧化还原对促进的多巯基前体的氧化折叠反应大都进行过反复试验。事实上，尽管天然趋化因子及其多种类似物容易折叠，所产生的折叠结构由两个或三个二硫键来稳定，在与相应的天然分子产生部分折叠形式的条件相同的条件下有几种类似物还是不能完全折叠。这些观察资料有力地表明多巯基前体的一级结构的改变可能会对在待折叠多肽链中局部进行正确折叠(β-转角、聚脯氨酸螺旋基元等)产生不利的影响。因此，许多巯基前体的折叠倾向主要在于多肽链的内在特性而不在于作用于该分子的特定氧化系统的功能。

通过向低离子强度的缓冲液中添加醇类、乙腈和DMSO来增强二硫键的选择性配对也已经得到报道。该方案包括将介质中的静电因子调节成有利于带相反电荷氨基酸的并置，该氨基酸邻接被选半胱氨酸残基，从而增进特定二硫键的形成。

酶如肽基二硫键异构酶(PDI)和脯氨酰基异构酶(PPI)也已被用作催化和调节二硫键转化的添加物。如果将PDI加到重折叠缓冲液中，那么体外折叠水蛭素所需要的时间就能被缩短到10小时至30秒钟。在这种情况下，体外折叠效率与体内折叠效率的差别不大。

当半胱氨酸残基被对酸不稳定的基团如Trt所保护时，通过对多肽-树脂进行酸解裂解来直接得到多巯基多肽前体。或者优选地，首先通过对多肽-树脂进行酸解裂解将其中全部半胱氨酸都被耐酸基团如乙酰氨基甲基基团(Acm)所保护的多肽以S-半胱氨酸衍生物的形式分离出来，然后在乙酸中采用Hg(AcO)₂进行处理来去掉Acm基团，接着在有大大过量巯基乙醇存在的条件下通过凝胶过滤来去除Hg离子。

然而，在两种情况下，已经有关于半胱氨酸和色氨酸残基发生数种副反应的报道。色氨酸中的吲哚环可以通过巯基乙醇进行衍生化并且半胱氨酸会产生多种副反应，最重要的是在通过酸解使多肽链脱离树脂的过程中利用叔丁基阳离子进行的氧化反应和烷基化反应。

因此，由于现有方法中存在着不足，所以需要更有效和更简单的折叠化学合成多肽和通过化学合成制备生物活性蛋白质的方法。

发明内容

因此本发明的目的在于提供一种简单有效和快速折叠多肽和/或蛋白质的方法，其中特别是含有错配二硫键的异构体的生成被减到最少，而且可以省去使用昂贵的二硫键-改组试剂如谷胱甘肽或酶，并且该方法具有可重复性、稳定性和规模性。这些以及其它目的对于本技术领域的普通技术人员来说是显而易见的。

本发明通过提供一种折叠化学合成多肽的方法来实现该目的，所述方法包括在一种预先设定了pH和温度的折叠缓冲液中利用还原剂处理含有两个或多个衍生半胱氨酸残基的多肽。

还提供一种制备生物活性蛋白质的方法，该方法包括

(a)化学合成一种含有两个或多个衍生半胱氨酸残基的多肽；

(b)在一种预先设定了pH和温度的折叠缓冲液中利用还原剂处理所述多肽；和

(c)纯化所获得的折叠蛋白质。

优选地，所述衍生半胱氨酸残基相当于一种S-丁基-硫代-半胱氨酸(S-t-Bu)残基。因此，根据本发明，出乎意料地发现S-t-Bu-衍生半胱氨酸可以被去保护，即去掉S-t-Bu部分，当在一种温度和pH合适的适当折叠缓冲液中进行温育时与其它半胱氨酸形成二硫键。

根据本发明，所述还原剂优选地是游离半胱氨酸。可以将过量的半胱氨酸加到所述缓冲液中(如实施例1-5所示)或者可以从多肽中衍生得到半胱氨酸(如实施例6所示)。

在本发明方法的一个优选的实施方案中，所述折叠缓冲液含有一种或多种离液序列高的盐，从而使得所述肽处于能够发生自然折叠的平衡状态。这一点例如可以通过将所述多肽和/或蛋白质置于完全变性的条件下来实现，例如通过利用高浓度的离液序列高的盐，然后将离液序列高的盐稀释到适于进行折叠的较低浓度来实现。所述离液序列高的盐优选地选自盐酸胍和尿素，在折叠过程中，优选地以0.1-1M的浓度存在。

优选地，折叠缓冲液的温度介于25℃和40℃之间，更优选地在27℃和38℃之间，以便当相当于自然体温时，使肽降解的变化程度减弱。最优选地是在折叠过程中所述温度约为37℃。

根据本发明方法的另一个优选的实施方案，所述折叠缓冲液具有弱碱性pH。优选地，所述pH介于7和9之间，更优选地是，介于7和8.5之间以便促进折叠过程。从以上可以清楚地看到，蛋白质的折叠取决于一组复杂的相互作用。例如在酸性pH下不与半胱氨酸发生反应，而且较高的pH值会增加多肽发生降解的风险。

折叠后，靶蛋白可以通过本技术领域中的已知方法进行纯化，所述方法包括阴离子和阳离子交换色谱、疏水相互作用色谱、反相色谱、亲和色谱、亲水相互作用/阳离子交换色谱(HILIC/CEC)、顶替色谱(DC)和样品顶替色谱(SDM)。最优选地是利用洗脱法的(反相)高效色谱以及顶替色谱。

在生产生物活性蛋白质方法的一个优选的实施方案中，所述方法包括以下步骤：

(a)通过分步链延伸的方法将S-叔-丁基-硫代半胱氨酸多肽装配到一种不溶性聚合载体上；

(b)通过酸解将所述S-叔-丁基-硫代半胱氨酸多肽链从所述载体上裂解下来；

(c)纯化所获得的S-叔-丁基-硫代半胱氨酸多肽；

(d)在含有离液序列高的盐，优选地是盐酸胍，碱性pH和约37℃的折叠缓冲液中利用摩尔过量的半胱氨酸处理所述多肽从而使被纯化的S-叔-丁基-硫代半胱氨酸多肽进行折叠；和

(e)利用反相高效液相色谱来纯化所获得的折叠蛋白质。

在本发明方法的一个有利的实施方案中，聚合载体是一种被对酸不稳定的羟甲基苯氧基乙酸连接物所官能化的聚酰胺或聚苯乙烯基的树脂，因为这些载体能够适用于全自动肽合成仪，而且通常能够合成出长多肽链。

如上所释，本发明基于S-叔-丁基-硫代半胱氨酸多肽的分步固相装配和以下发现：通过在有还原剂，优选地是半胱氨酸存在、在弱碱性pH以及约37℃的条件下对所述多肽进行折叠能够产生大量的天然生物活性蛋白质。

令人惊奇地发现在除掉S-叔-丁基保护基团从而形成二硫键的过程中利用高度摩尔过量的半胱氨酸可以产生生物活性蛋白质。这一操作方法比现有技术中描述的用于折叠含半胱氨酸多肽的操作方法更简单更有效，其中所述含半胱氨酸多肽是通过化学合成得到的。因此S-叔-丁基的去除是在与多肽折叠相同的步骤中完成的。

或者，还可以通过联合使用S-叔-丁基-硫代半胱氨酸和被适当对酸不稳定的基团保护的半胱氨酸来获得相同的折叠物质，所述对酸不稳定的基团是对多肽链上的选定位点进行保护的从而不需要向折叠缓冲液中另外加入还原剂就能形成适当的二硫键。在这种情况下，当在酸性pH下将肽从树脂上裂解下来的同时除掉对酸不稳定的基团。因此产生了游离的半胱氨酸，该游离的半胱氨酸又被作为能够除掉S-叔-丁基和形成二硫键的分子内“还原剂”(如实施例6所示)。

本发明的本质在于：

-将S-硫代-叔-丁基化多肽链快速装配到聚合载体上；

-在弱碱性条件下半胱氨酸催化所述衍生物进行巯基-二硫键的交换反应，结果产生半胱氨酰化的多肽，该多肽是典型的氧化还原胱氨酸/半胱氨酸对的氧化的大分子形式(蛋白质-S-S-半胱氨酸；多肽-S-S半胱氨酸)；

-在整个折叠过程中，氧化的大分子形式的浓度始终被保持在很低的水平以便将分子间的二硫键交换反应降低到最低程度；和

由于优先和迅速地形成具有正确的半胱氨酸配对的形式(天然结构)而不发生错折叠的中间体的聚集。

按照本发明的用于折叠多肽的方法，例如，第一步，在室温下将10mg的S-叔-丁基衍生物溶解在1ml的缓冲液中，将得到的溶液在室温下保留约20分钟，所述缓冲液的pH为8.0并且含有6M的盐酸胍、10mM Tris和0.1M的Na₂HPO₄。第二步，先用水将所述溶液稀释10倍以便达到pH7.2，(0.6M盐酸胍，1.0mM Tris，10mMNa₂HPO₄以及多肽衍生物的最终浓度为1mg/ml)，然后在搅拌条件下加入强烈摩尔过量的半胱氨酸(高出多肽或蛋白质衍生物的浓度约100倍)。为了使所述多肽发生折叠，逐渐将温度升高到37℃并且维持约24小时恒定不变。

本发明的折叠方法能够产生高度均质的产物而且只需要进行很小改动就能适用于由固相化学合成法生产的任何多肽如半胱氨酸硫代-叔丁基衍生物。另外，与现有技术的方法相比，本发明采用多巯基前体形式的方法还具有许多其它的优势，诸如

-链上的半胱氨酸残基在酸解裂解多肽-树脂的过程中不被烷基化；

-不发生半胱氨酸转化为磺酸的过氧化反应，也不发生导致分子间二硫键形成的氧化反应；

-避免了Trp的吲哚环被巯基乙醇衍生化的危险性，所述巯基乙醇是去除污染物Hg离子所必需的，该污染物Hg离子是利用Hg(AcO)₂进行Acm去保护时产生的。实际上，在本发明的折叠混合物中的半胱氨酸硫醇盐一点也不改变Trp；

-对氧化敏感的Met，Trp和Tyr残基在折叠过程中不发生改变；

-最终折叠产物的生产成本一般比利用多巯基多肽和氧化还原缓冲液的生产成本低。

本技术领域的技术人员很清楚，尽管靶蛋白通常是利用本发明的方法以高产率制备的，但在某些情况下，例如对于具有多个二硫键的复杂蛋白质来说，未完全转化为天然结构的特定种类的中间体形式(错折叠种类)以平衡状态保留在溶液中。利用RP-HPLC可将错折叠种类从正确折叠种类中方便地分离出来并且在本发明的所述条件下再次进行折叠以便增加所述方法的总产率。

根据本发明，术语多肽是指通过酰胺键连接在一起的氨基酸聚合物。术语蛋白质是指具有三维结构的多肽种类，如存在于活生物体的细胞和生物流体中的蛋白质。蛋白质例如可由单个折叠的多肽链组成或可以是由多个折叠的多肽链组成的复杂结构。

提供下列实施例和附图旨在对本发明进行说明而非限制，本发明被限制在权利要求的保护范围内。

附图说明

图1表示去除S-叔-丁基以及折叠hu-I-309之前的HPLC曲线图(实施例4)。

图2表示图1产物的质量测定结果。

图3表示被去保护的折叠hu-I-309的HPLC曲线图(实施例4)，表明保留时间较短。

图4表示图3产物的质量测定结果。

图5表示利用NEM处理后，图3所示产物的质量测定结果。与图4相比，观察不到质量的变化，表明不存在游离的-SH基团。

图6是重组I-309的生物活性与本发明合成的折叠I-309的生物活性进行比较的曲线图。生物学活性通过¹²⁵I标记的趋化因子与人淋巴细胞之间的结合来评定。

图7表示实施例5的蛋白质折叠以后的分析型HPLC曲线图。

图8表示折叠的实施例5的蛋白质的制备型HPLC曲线图。

图9表示实施例5的纯化产物的质量测定结果，表明具有预期的分子量。

图10表示实施例6的多肽在去除S-叔-丁基和折叠之前的HPLC曲线图。

图11表示图10所示多肽的质量测定结果(M＝H)。

图12表示实施例6的蛋白质在折叠之后的HPLC曲线图，表明具有较短的保留时间。

图13表示图12所示蛋白质的质量测定结果(M＝H)，表明具有预期的分子量。

实施例

实施例1Cys ^{10，11，34，50} (S-t-Bu)-hu-TARC(胸腺和活化调节的趋化因子)的合成和 折叠

利用Fmoc/t-Bu化学方法和聚苯乙烯基的树脂将具有71个氨基酸残基的趋化因子衍生物装配到433A肽合成仪(Perkin Elmer/ABI)上，其中所述树脂被对酸不稳定的羟甲基苯氧基乙酸连接物所官能化(Wang树脂)，Fmoc-Ser(t-Bu)通过由DMAP(4-二甲基氨基吡啶)催化的酯化反应被连接到所述的树脂上。取代度是0.57mmole/g。所述合成反应是以0.27mmole的规模通过利用五倍过量的Fmoc-氨基酸和DCI(N，N’-二异丙基碳化二亚胺)/HOBt(1-羟苯并三唑)活化试剂在DMF中进行的。在利用分光光度法对Fmoc去保护进行监测的条件下，偶联反应的时间大约为60分钟。

用S-叔-丁基基团对四个半胱氨酸巯基进行保护并且将最大保护方案用于所有其它侧链：Ser(t-Bu)，Thr(t-Bu)，Tyr(t-Bu)，Asp(O-t-bu)，Glu(O-t-Bu)，Lys(Boc)，Trp(Boc)，Asn(Trt)，Gln(Trt)和Arg(Pmc)。每次偶联后，在DMF中利用乙酸酐和DIEA进行加帽反应。

在室温下利用新制备的TFA/水/TIS(三异丙基硅烷)/苯酚(78∶5∶12∶5，v/v/v/w，10ml/g树脂)混合物将产生的多肽-树脂处理2.5-3.0小时。通过将裂解混合物直接过滤到冷却甲基-叔-丁基醚(MTBE)中来将所述的裂解多肽衍生物沉淀出来，并通过离心分离出沉淀，用乙醚冲洗两遍并在空气中进行干燥。

然后将粗产物溶解在被稀释的乙酸中，冻干，再溶解在50％的乙酸中，然后被加载到以50％乙酸作为流动相的Sephadex G-50色谱柱(70×25cm)上。利用MALDI-TOF质谱测定法对收集的级分进行分析并将含有所需多肽衍生物的那些级分(MW8，436.9Da)合并起来，用水稀释后进行冻干。

将被合并的级分再次溶解到50％的乙酸中并加载到250×10mm的半制备型Vydac C₄色谱柱上进一步进行纯化。在60分钟内利用线性梯度为20-80％的B以3ml/分钟的流速对样品进行洗脱，其中B是0.1％的TFA乙腈溶液而A是0.1％的TFA水溶液。在280nm下进行检测，只合并含有靶多肽的级分并在折叠之前进行冻干。

通过RP-HPLC纯化的趋化因子衍生物的折叠反应按照以下步骤进行：首先在pH＝8.0和室温下将10mg的产物溶解在1mg的6MGnHCl、0.1M Na₂HPO₄和10mM Tris中。20分钟后，通过加入10ml的水将溶液稀释到最终浓度为0.6M GnHCl、10mM Na₂HPO₄、1mM Tris，pH＝7.2以及肽浓度为1mg/m1。通过以约20mM(相对肽浓度约100倍的摩尔过量)的浓度加入半胱氨酸来启动折叠反应并将温度逐步升高到37℃。

通过利用Waters2690分离组件对25微升的溶液等分样品进行RP-HPLC分析来监控在37℃的恒定温度下于空气当中进行的折叠反应，其中利用乙酸对所述等分样品进行了酸骤冷，所述组件配备了Waters996光电二极管阵列检测器，所述RP-HPLC分析采用了Vydac C₄分析柱以及以在0.1％TFA/水中的20-60％乙腈梯度和1.0ml/分钟的流速进行了40分钟的洗脱。收集1微升每种HPLC峰值洗出液(对应于巯基-二硫键交换反应的折叠中间体)，然后与芥子酸溶解在1∶2乙腈/1％TFA的水溶液中的1微升饱和溶液进行混合，真空干燥后利用Voyager-DE分光计(Perseptive Biosystem，Framingham，MA)通过MALDI-TOF质谱测定法进行分析，所述分光计配备了氮气激光器。24小时后形成了78％的折叠多肽。通过与N-乙基马来酰亚胺(NEM)进行反应来进一步检验其分子量相当于折叠产物分子量的峰从而检测游离巯基(对于每个SH来说是+125Da)的存在。

通过本发明的方法获得的hu-TARC的生物学活性按照Imai方法(T.Imai等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，271，21514，1996)来测定。

评定人T细胞系，即Hut78，Hut102和Jurkat，以及新鲜的单核细胞，嗜中性白细胞和淋巴细胞响应TARC而迁移过聚碳酸酯滤纸的情况。无论是通过化学合成制备的TARC还是通过重组的TARC在单核细胞或嗜中性白细胞中都没有引发趋化反应。在T细胞系Hut78和Hut102中，由合成的TARC以及重组的TARC诱导的迁移呈现一种典型的钟形曲线，在100ng/ml时的诱导作用最强。

实施例2Cys ^10，34，50 (S-t-Bu)-hu-TARC和Cys ^11，34，50 (S-t-Bu)-hu-TARC的合成 和折叠

进行Cys^10，34，50(S-t-Bu)hu-TARC和Cys^11，34，50(S-t-Bu)-hu-TARC衍生物的合成、纯化和折叠所采用的条件与Cys^{10，11，34，50}(S-t-Bu)hu-TARC(实施例1)所采用的条件相同，唯一的区别在于分别对Cys¹⁰和Cys¹¹进行了Trt保护，该保护基团在将多肽前体从树脂上裂解下来的同时被去除。最终的折叠趋化因子的产率分别是80％和79％。

实施例3CVs ^34，50 (S-Bu)-hu-TARC的合成和折叠

除了利用Trt对Cys¹⁰和Cys¹¹进行了保护之外，进行Cys^34，50(S-Bu)-hu-TARC衍生物的合成、纯化和折叠所采用的条件与实施例1和实施例2的衍生物所采用的条件相同，所述Trt在利用TFA进行最终树脂裂解的过程中被除去。折叠产物的产率约为75％。

实施例4Cys ^{10，11，26，34，50，68} (S-t-Bu)-hu-I-309的合成和折叠

在与实施例1相同的条件下利用Fmoc-Lys(Boc)Wang树脂(0.61mmol/g的取代度)以0.12mmole的规模合成含有6个被(S-t-Bu)保护的半胱氨酸的hu-I-309。将产生的多肽-树脂按照实施例1中所述的方法进行处理，然后通过将G50纯化的物质加载到250×10mmVydac C₁₈柱上来进一步进行纯化(如图1和图2所示)。

通过将65mg的产物溶解于pH8.0的60ml的0.6M GuHCl，10mM NaHPO₄和1mM Tris中并以相对所述肽是100倍摩尔过量的浓度加入半胱氨酸来对经RP-HPLC纯化的趋化因子衍生物进行折叠。所述多肽溶液在37℃下保持4天。用TFA酸化后，利用250×10mmVydac C₁₈柱通过RP-HPLC来分离所述的折叠物质(如图3和图4所示)。与N-乙基马来酰亚胺(NEM)发生反应后利用质谱测定法检验完全的半胱氨酸配对。没有发现分子量增大，这表明不存在游离的巯基基团(如图5所示)。折叠的最终趋化因子的产率接近25％。合成的折叠hu-I-309具有等同于重组蛋白质的生物学活性(图6)。

按照以下条件进行分析型色谱：色谱柱：  C₁₈250×4.6mm(Vydac#238TP54)流动相：  A＝100％H₂O0.1％TFA

      B＝100％CH₃CN0.1％TFA梯度：    B的％组成显示在色谱图上。检测器：214nm

实施例5间日疟原虫(Plasmodium vivax)C-末端片段的合成和折叠

在与实施例1相同的条件下合成和纯化含有4个被(S-t-Bu)保护的半胱氨酸的间日疟原虫环子孢子蛋白(PvCS)303-372。

通过将27mg的所述肽加到2.7ml的6M GuHCl的0.1M Tris缓冲液(pH8.5)中来进行折叠。将该溶液搅拌10分钟。然后加入以0.2M Tris缓冲液将pH缓冲在8.8的13.5ml的1mM EDTA，0.2M NaCl。最后，加入以0.2M Tris缓冲液将pH缓冲在8.8的10.8ml的35mM半胱氨酸/1mM EDTA，0.2M NaCl。将所述反应混合物升温到37℃。然后通过反相HPLC来进行折叠反应(3-6小时)(图7A)并且通过在4℃下冷却5分钟来终止反应，然后通过加入4℃的10％TFA来达到1％TFA的最终浓度(3ml的10％TFA)。接着通过反相HPLC来纯化产物(图8)并确定终产物的质量(图9)。被氧化的最终产物的产率是70-80％。

利用下列条件进行分析型色谱：色谱柱：  C₄250×4.6mm(Vydac#214TP54)流动相：  A＝100％H₂O0.1％TFA

      B＝100％CH₃CN0.1％TFA梯度：    B的％组成显示在色谱图上。检测器：  214nm

实施例6恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)C-末端片段的大规模合成和 折叠

除了下列条件以外，对仅含有4个中的2个被(S-t-Bu)保护的半胱氨酸的恶性疟原虫环子孢子蛋白(PfCS282-383)的大规模合成和纯化是在与实施例1相同的条件下进行的。

通过将1.1g的部分纯化的肽溶解在pH8.0的1.0L的0.1MCH₃COONH₄中来进行折叠，不需要向折叠缓冲液中加入游离半胱氨酸。所述反应混合物在32℃下维持18小时。然后通过反相HPLC来纯化所述产物(图12和图13)。被氧化的最终产物的产率接近37％。

利用下列条件进行分析型色谱：色谱柱：  C₁₈250×4.6mm(Vydac#238TP54)流动相：  A＝100％H₂O0.1％TFA

      B＝100％CH₃CN0.1％TFA梯度：    B的％组成显示在色谱图上。检测器：  214nm

Claims (27)

1.用于折叠化学合成多肽的方法，包括在一种预先设定了pH和温度的折叠缓冲液中利用还原剂处理含有两个或多个衍生半胱氨酸残基的多肽和/或蛋白质。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述衍生半胱氨酸残基相当于S-丁基-硫代-半胱氨酸残基。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述还原剂是半胱氨酸。

4.如权利要求1、2或3所述的方法，其中所述折叠缓冲液含有一种或多种离液序列高的盐。

5.如权利要求4所述的方法，其中所述离液序列高的盐选自盐酸胍和尿素。

6.如权利要求4或5所述的方法，其中所述折叠缓冲液中的离液序列高的盐以0.1-1M的浓度存在。

7.如权利要求1-6中任一权利要求所述的方法，其中所述折叠缓冲液具有碱性pH。

8.如权利要求7所述的方法，其中pH介于7和9之间。

9.如权利要求7或8所述的方法，其中pH介于7和8.5之间。

10.如权利要求1-9中任一权利要求所述的方法，其中所述折叠缓冲液的温度介于25℃和40℃之间。

11.如权利要求10所述的方法，其中所述温度介于27℃和38℃之间。

12.如权利要求10或11所述的方法，其中所述温度约为37℃。

13.用于制备生物活性蛋白质的方法，包括

(a)化学合成一种含有两个或多个衍生半胱氨酸残基的多肽；

(b)在一种预先设定了pH和温度的折叠缓冲液中利用还原剂处理所述多肽；和

(c)纯化所获得的折叠多肽和/或蛋白质。

14.如权利要求13所述的方法，其中所述衍生半胱氨酸残基相当于S-丁基-硫代-半胱氨酸残基。

15.如权利要求13或14所述的方法，其中所述还原剂是半胱氨酸。

16.如权利要求13、14或15所述的方法，其中所述折叠缓冲液含有一种或多种离液序列高的盐。

17.如权利要求16所述的方法，其中所述离液序列高的盐选自盐酸胍和尿素。

18.如权利要求15或16所述的方法，其中所述折叠缓冲液中的离液序列高的盐以0.1-1M的浓度存在。

19.如权利要求13-18中任一权利要求所述的方法，其中所述折叠缓冲液具有碱性pH。

20.如权利要求19所述的方法，其中pH介于7和9之间。

21.如权利要求20所述的方法，其中pH介于7和8.5之间。

22.如权利要求13-21中任一权利要求所述的方法，其中所述折叠缓冲液的温度介于25℃和40℃之间。

23.如权利要求22所述的方法，其中所述温度介于27℃和38℃之间。

24.如权利要求22或23所述的方法，其中所述温度约为37℃。

25.如权利要求13-24中任一权利要求所述的方法，包括步骤：

(a)通过分步链延伸的方法将S-叔-丁基-硫代半胱氨酸多肽装配到一种不溶性聚合载体上；

(b)通过酸解将所述S-叔-丁基-硫代半胱氨酸多肽链从所述载体上裂解下来；

(c)纯化所获得的S-叔-丁基-硫代半胱氨酸多肽；

(d)在含有离液序列高的盐和具有碱性pH以及约37℃的折叠缓冲液中利用摩尔过量的半胱氨酸处理所述多肽衍生物从而使被纯化的S-叔-丁基-硫代半胱氨酸多肽处理折叠；和

(e)利用反相高效液相色谱来纯化所获得的折叠蛋白质。

26.如权利要求25所述的方法，其中所述离液序列高的盐是盐酸胍。

27.如权利要求25或26所述的方法，其中所述聚合载体是一种被对酸不稳定的羟甲基苯氧基乙酸连接物所官能化的聚酰胺或聚苯乙烯基的树脂。

Images