JPH03101700A - 変性組換え融合蛋白質のバイオ触媒的な正確な鎖フオールデイングのための方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 蛋白質がその機能的活性状態にあるための蛋白質鎖の７
オールディングについての情報はすべて、その蛋白質の
アミノ酸配列の中に含まれている。この主張は、人工的
に７オールディングを解いてしまった蛋白質も再び正し
く折畳まれるという事実がｉｎ　ｖｉｔｒｏで明らかに
されていて（Ａｎｆｉｎｓｅｎ，　Ｃ．Ｂ．，　Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ．　１８１，　２２３〜２３０．１９７３）　
、特定の場合のみではあるが実験的に証明されている。

しかしながら、蛋白質の７オールディング過程の理解に
は、とくに複数のドメインまたは数個のサブユニットか
らなる複雑な蛋白質の場合、多くの空白部分があり（Ｊ
ａｎｉｃｋｅ，Ｒ．，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｓｔｒｕｃｔ．
Ｍｅｃｈ．　　８：　　２３１〜２５６．１９８２）　
、また、最近、この分野にはほとんどみるべき進歩はな
い。蛋白質は一般的に、生理的条件下にあっても、自発
的な自己集合過程によって折畳まれると考えられてきた
（Ｃｒｅ　ｉｇｈ　ｔｏｎ　，Ｔ．，　ｉｎ“Ｐｒｏｔ
ｅｉｎｓ　，　Ｆｒｅｅｍａｎ　＆　Ｃｏｍｐａｎｙ，
　ＮｅｗＹｏｒｋ．　１９８４）ことから、ｉｎ　ｖｉ
ｖｏＪ：おｌｔ　６　ｉ　白ｊｌｔの７オールディング
の研究は全く無視されてしまってきた。しかしながら、
この見解は誤っていると断言してもよいと思われる。ｉ
ｎ　　ｖｉｖｏで合成されたのちには秒単位から数分の
間にその機能的なコン７オメーションをとる多くの蛋白
質が、様々な変性条件下に７オールディングを解かれた
のちには，　ｉｎ　ｖｉＬｒｏでは再びフォールディン
グできないのである。蛋白質鎖のコン７オメーションは
特定の成分とくに熱ショック蛋白質によって生理的に影
響されるとする仮説を支持する所見が最近徐々に蓄積さ
れ始めている（Ｐｅｌｈａｍ，Ｈ．，Ｎａｔｕｒｅ，３
３２：　　７７８〜７７７，１９８８）．黙ショック蛋
白質は生体の細胞内に存在する蛋白質であり、多くは細
胞が特定の形のストレス、たとえば熱ストレスを受けた
場合に形成される。

フォールディングしていないあるいは新たに合成された
ポリペプチド鎖のｉｎ　ｖｉｖｏおよびｉｎｖｉｔｒｏ
での正しいフォールディングを触媒する１つの蛋白成分
がすでに確認され、その機能的性質が調べられている。

この戒分は、細菌およびミトコンドリア内に存在する熱
ショック蛋白質、ＧｒｏＥＬまたはＨｓｐ６０である。

大腸菌のＧｒｏＥＬとミトコンドリアのＨｓｐ６０のア
ミノ酸配列には６０％のホモロジーがある（　Ｈｅｍｍ
ｉｎｇｓｅｎ，　Ｓ．Ｍ．　，Ｗｏｏｌｆｏｒｄ，　Ｃ
．，　ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｈｅｎｄｒｉｘ，　Ｒ．Ｗ．　
＆Ｅｌｌｉｓ，　　Ｒ．Ｊ．，　　Ｎａｔｕｒｅ，　　
３３３−二　　３３０　〜３３４．　　　１９８８；Ｒ
ｅａｄｉｎｇ，　Ｄ．Ｓ．，　Ｈａｌｌｂｅｒｇ，　Ｒ
．Ｌ．．　Ｍｙｅｒｓ，　Ａ．Ｍ．，Ｎａｃｕｒｅ．　
３３７：　６５５〜６５９．　１９８９）。これらの成
分は、１４のサブユニットからなるほぼ同一のオリゴマ
ー複合体として存在し、分子量はそれぞれ約５８，００
０ダルトンである。人工的にフォールディングを解かれ
たかまたは生戊したばかりの蛋白質は、ＧｒｏＥＬまた
はＨｓｐ６０複合体の表面に結合する。この場合、細菌
またはミトコンドリア蛋白質についての特異性はない。

蛋白質のフォールディングはＡＴＰ（アデノシン三リン
酸）の加水分解に依存する反応中にＧｒｏＥＬまたはＨ
ｓｐ６０上で起こる。この過程に、ＧｒｏＥＬまたはＨ
ｓｐ６０複合体と会合したさらに他の分子が関与してい
る可能性は否定できない。ＡＴＰの不存在に、たとえば
マウスの酵素、ジヒドロ葉酸リダクターゼは、フォール
ディングしていない、プロテアーゼに対する感受性がき
わめて高いポリペブチド鎖の形でＨｓｐ６０に結合する
。ＡＴＰを加えると、ジヒドロ葉酸リダクターゼ活性の
上昇が起こる。初期にはなおＨｓｐ６０の表面に会合し
て存在するが、ついでこの酵素の遊離が起こり、その時
には酵素的に活性なコンフォーメーションを取っている
。この反応はミトコンドリアの内部において、蛋白質約
３０〜５０９／　ＩＯＯｍｆｆの濃度で起こる。しかし
ながら、この反応は原理的にはｉｎ　ｖｉｔｒｏにおい
て単離Ｈｓｐ６０によっても同様に可能である。

条件酵母変異株中でＨｓｐ６０機能を除去すると、ミト
コンドリア蛋白質の超分子複合体への集積は起こらない
（Ｃｈｅｎｇ，　　Ｍ．Ｙ．，　　ＨａｒＬ１，　　Ｆ
．−Ｕ．，Ｍａｒｔｉｎ，　Ｊ．，　Ｐｏｌｌｏｃｋ，
　Ｒ．Ａ．，　Ｋａｌｏｕｓｅｋ，　Ｆ．，Ｎｅｕｐｅ
ｒＬ，　Ｗ．，　Ｈａｌｌｂｅｒｇ，　Ｅ．Ｍ．，　Ｈ
ａｌｌｂｅｒｇ，Ｒ．Ｌ．，　＆　Ｈｏｒｖｉｃｈ，　
Ａ．Ｌ．，　Ｎａｔｕｒｅ．　３３７：　６２０−６２
５．　１９８９）。

ＧｒｏＥＬおよびＨｓｐ６０は可溶性で、非特異的プロ
テアーゼたとえばプロテアーゼＫに対する感受性は比較
的低く、大腸菌等からかなりの量を容易に単離できる。

ＧｒｏＥＬの単離方法は、たとえば（Ｈｅｎｄｒｉｘ，
　Ｒ．Ｗ．，　Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．，　１２９
：　３７５〜３９２（１９７９）に記載されていて、こ
の文献ではＧｒｏＥＬはｇｐ　ＧｒｏＥと呼ばれている
。

ミトコンドリアからＨｓｐ６０を単離する場合には、０
．３％ジギトニン、１００ｍＭ　ＮａＣＱ，　　３０ｍ
Ｍ　トリス〔トリ（ヒドロキシメチル）アミノメタン〕
中ｐＨ７．４で調製された抽出液が、良好な収率で蛋白
質Ｈｓｐ６０を与え、硫酸アンモニウム沈澱（３５〜５
０％飽和）およびＱ　−　”’Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロ
マトグラ７イーによる２精製工程で十分な純度が得られ
る。Ｑ　−　ＳｅｐｈａｒｏｓｅはＰｈａｒｍａｃｉａ
　ＬＫＢ　ＧｍｂＨ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ（西独）から市
販されているアガロースペースの塩基性イオン交換剤で
ある。

変性組換え融合蛋白質もまた、細菌ＧｒｏＥＬまたは均
等なミトコンドリアＨｓｐ６０の機能原理、すなわちこ
の場合はバイオ触媒としての熱ショック蛋白質の機能に
よって作用する熱ショック蛋白質の存在により、正しく
フォールディングできることが明らかにされた。

したがって、本発明は、変性組換え融合蛋白質鎖を正し
くフォールディングさせるためのバイオ触媒的方法にお
いて、変性組換え融合蛋白質を、細菌ＧｒｏＥＬまたは
均等なミトコンドリアＨｓｐ６０の機能原理に従って作
用する熱ショック蛋白質、ならびにＡＴＰと接触させる
ことを特徴とする方法である。

融合蛋白質においては、キメラパートナーのアミノ酸配
列は、個々の成分の生の構造を与えるフォールディング
の相互誘導に対して何の情報ももっていないわけである
。したがって、微生物および真核細胞蛋白質から構威さ
れることが多い融合蛋白質が適当な熟ショック蛋白質に
より、異なるキメラバートナーがそれらの生の構造で共
有結合した蛋白質にフォールディングされうろことは、
全く驚くべきことである。次にこれから、実際に興味の
ある蛋白質残基を、特異的蛋白分解または、予め酸易切
断部位が導入されていれば酸加水分解によって遊離させ
ることができる。

この方法では、生物学的にまた医薬的に興味のある蛋白
質が、有利な比較的簡単な操作で、正しい、機能的に活
性なコン７オメーションで得られる。

組換え融合蛋白質は、遺伝子操作法によって製造される
。融合蛋白質は少なくとも１つのアミノ酸を含有しなけ
ればならない。融合蛋白質中のアミノ酸残基数の上限は
広い範囲で変動できるが、好ましくは約４００である。

細菌内にクローン化された遺伝子の発現（通常は、異種
配列たとえばβ一カラクトシダーゼへの融合型として）
による、ペブチドおよび蛋白質の遺伝子操作での製造に
際しては、相当する融合蛋白質は不溶性の機能的に不活
性な凝集体、いわゆる封入体の生成を起こすことが多い
。

（融合）蛋白質は通常、この状態から、変性条件によっ
てのみ可溶性の形に変換される。この場合、（融合）蛋
白質は、人工的手段によって完全にまたは少なくとも部
分的に７オールディングが解かれた状態になる。幾分か
もつと広い意味で、この関係における変性組換え融合蛋
白質とは、７オールディングされていないもしくは正し
くない７オールディングが行われた、または人工的手段
によって完全にもしくは部分的にフォールディングが解
かれた融合蛋白質と理解すべきである。

遺伝子操作によって得られる初期には不溶性で機能的に
不活性な組換え融合蛋白質の変性は、水性溶液中変性剤
たとえばトリスまたはグリシン緩衝液、ｐ｝１６〜９中
６〜８Ｍ尿素による慣用法で行われる。融合蛋白質がジ
スル７イド結合をもつ場合には、ＳＨ基を含有する試薬
たとえばメルカグトエタノールまたはジチオスレイトー
ルもフォールディングを解くために必要である。

すなわち、ジスルフィド結合１個あたり少なくとも約２
個のＳＨ基に相当する量が要求される。

変性混合物（然るべくフォールディングが解かれ、溶解
した融合蛋白質を含有）はついで通常、融合蛋白質濃度
が好ましくは約０．０１−０．５ｍｇ／　ＴＲｆｆ（Ｌ
ｏｖｒｙ法で測定）になるように希釈する。

場合によっては、もっと高い濃度（約１００ｍｇ／　ｍ
Ｑまで）も個々の特定の場合には適当であり、また使用
可能である。

本発明はしたがって、適当な熱ショック蛋白質とＡＴＰ
の添加によって始まる。

使用できる黙シタック蛋白質は、一般的には、細菌Ｇｒ
ｏＥＬまたは均等なミトコンドリアＨｓｐ５Ｑの機能原
理に従って作用するすべての熱ショック蛋白質であり、
ＧｒｏＥＬおよびＨｓｐ６０、とくにｌｓｐ６０が好ま
しい。もちろん、同時に２種以上の熱ショック蛋白質を
使用することも・可能であるが、一般的にはそれによっ
て何らかの利益がもたらされることはない。

さらに、特定の黙ショック蛋白質を純粋な形で使用する
必要もない。逆に、濃縮抽出液の形で使用するのが適当
である。

７才一ルディングさせる融合蛋白質と正しい蛋白質鎖の
７オールディングのためのバイオ触媒（熱ショック蛋白
質のモル比は広い制限内で変動させることができるが、
約（１０〜１００）　　：　１の比が好ましい。

ＡＴＰ　（好ましくはＭｇ”ＡＴＰの形で使用するのが
好ましい）の濃度も同様に比較的広い制限内で変動させ
ることができる。約１〜５０ｍＭが好ましく、とくに約
２〜ｌｏｍＭが好ましい。

一方、本発明のバイオ触媒反応のためのｐＨ範囲はそれ
ほど広くない。約６〜８である。ｐＨは慣用法で、たと
えばトリスまたはグリシン緩衝液を約ｌＯ〜１５０ｍＭ
の濃度で用いて調整される。

約５０〜２００ｍＭのＮａＣＱまたはＫＣＱを共存させ
るのも有利である。

蛋白質鎖の正しいフォールディングのための温度は一般
に約１５〜３０００である。

変性反応からの変性剤の濃度が高すぎることがなければ
、ｔ；とえば尿素ならば約０．８Ｍまで、グアニジニウ
ム塩酸塩ならば約０．６Ｍまでであれば、一般的に正し
いフォールディングを妨害することはない。

ついでフォールディング混合物を慣用の方法で後処理し
、２種のキメラ成分が正しく７オールディングした融合
蛋白質を通常は蛋白分解または酸分解で切断して所望の
蛋白質を得る。

本発明を以下の実施例によりさらに詳細に説明する。

実施例 ａ）　ジヒドロ葉酸リダクターゼーＦｏ−ＡＴＰアーゼ
融合蛋白質 マウスジヒドロ葉酸リダクターゼと、ミトコンドリアＦ
ｏＦ＋−ＡＴＰアーゼのサブユニット９のアミノ末端配
列（残基１−６６）との間の組換え遺伝子操作で製造し
た融合蛋白質を６Ｍ尿素、３０ｍＭ　トリスーＨＣＱ，
　ｐＨ７．４中で変性する（蛋白質濃度０−３ｍｙ／ｙ
ｒａ）。

対照反応：この溶液１０ｕ（ｌを２９Ｑｔｔ（ｌの２　
ｍＭＡＴＰ，２　ｍＭ　ＭｇＣＱｘ，　　ｌｏＯｍＭ　
Ｎａ（４，　３０ｍＭ　｝リスーＨＣ（１、ｐＨ７．４
中に加え、２５°Ｃで２０分間インキユベートしても、
蛋白質のジヒドロ集酸リダクターゼ部分は不完全な７オ
ールディングのままで、酵素的に活性なコンフォメーシ
ョンは得られない。

同じ混合物に単離Ｈｓｐ６０を１０１＃／ｔｒ（ｌ添加
し、２５゜Ｃで５分間インキユベートすると、５０〜７
０％の収率で酵素的に活性なコン７才メーションのジヒ
ドロ葉酸リダクターゼが生戒する。収率は、反応後可溶
性七ノマーとして存在する融合蛋白質（”’Ｓｅｐｈａ
ｒｏｓｅ５すなわちＰｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢＧｍｂ
Ｈ．　Ｆｒｅｉｂｕｒｇ製の架橋アガロースのモルキュ
ラーシーブ上ゲルが過によって精製）の比活性によって
測定する。比活性は生のジヒドロ葉酸リダクターゼの９
２％である。異種配列をミトコンドリアの特異的なプロ
セッシングペプチダーゼで切断すると完全な比活性を示
すようになる（実施例ｂ参照）。

ｂ）標品ジヒドロ葉酸リダクターゼ（比較）：混合物（
ａ）と同様であるが基質として標品ジヒドロ葉酸リダク
ターゼを使用する。酵素的に活性なコン７オメーション
で存在する蛋白質（９８％の比活性を示す）の収率は６
０〜８０％である。異種配列をもたないジヒドロ葉酸リ
ダクターゼを組換え遺伝子操作で異種配列とカップリン
グさせると、自発的に再フォールディングする傾向がみ
られる。しかしながら、この対照混合物において正しく
フォールディングされた酵素は使用した実験条件下では
わずか３０％であった（ジヒドロ葉酸リダクターゼはＳ
−Ｓ結合を含まない）。

Ｃ）インターロイキンー２−β−ガラクトシダーゼ融合
蛋白質： インターロイキンー２と大腸菌β−ガラクトシダーゼの
４００アミノ末端残基により大腸菌内で発現させた融合
蛋白質を封入体から、８Ｍ尿素／　５　０　ｍ　Ｍグリ
シン緩衝液、ｐ｝１７．２中に蛋白質濃度０．２ｍｇ／
ｍＱで溶解させる。ＳＨ基の数に応じて当モルのメルカ
ブトエタノールを加える。溶解した融合蛋白質（１００
μｇ）の各２０μ９部を、５０ｍＭグリシン緩衝液、ｐ
Ｈ７．２中５μｇ／ｍＱのＨｓｐ６０を含む混合で１０
倍に希釈する。２　ｍＭ　Ｍｇ”ＡＴＰを加えてフォー
ルディング反応を開始させ、２５°Ｃで１５分反応を行
う。次に、融合蛋白質を酸不安定結合（−アスパラギン
酸一プロリンー）で切断してインターロイキンー２を遊
離させ、プレパラティブＨＰＬＣ分離によって精製する
。ｉｎ　ｖｉｔｒｏで７オールディングさせた生或物の
保持時間は、標品のインターロイキンー２の場合と同じ
であった。７オールディング生戊物および標品のトリプ
シン蛋白分解後の断片パターンも互いによく一致した。

ＣＴＬＪＫ細胞ＣＪＫと命名された細胞障害性リンパ球
）についての細胞毒性試験で測定した比活性は蛋白質１
ｍｇあたり９８００　Ｕであった（標品はＩＯＯＯＯＵ
　／　１１＋９　；蛋白質はＬｏｗｒｙ法により測定）
。７オールディング反応の収率は５８％であった。Ｈｓ
ｐ６０を加えない対照反応からはインターロイキン−２
は遊離できなかった。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）変性組換え融合蛋白質鎖を正しくフォールディング
   させるためのバイオ触媒的方法において、変性組換え融
   合蛋白質を、細菌ＧｒｏＥＬまたは均等なミトコンドリ
   ア成分Ｈｓｐ６０の機能原理に従って働く熱ショック蛋
   白質ならびにＡＴＰ（アデノシン三リン酸）と、正常な
   フォールディング条件下に接触させることを特徴とする
   方法。 ２）初期融合蛋白質濃度は約０．０１〜０．５ｍｇ／ｍ
   ｌに調整する請求項１記載の方法。 ３）熱ショック蛋白質としてＧｒｏＥＬおよび／または
   Ｈｓｐ６０、とくにＨｓｐ６０単独を使用する請求項１
   または２記載の方法。 ４）熱ショック蛋白質は、濃縮抽出液の形で使用する請
   求項１〜３のいずれかに記載の方 法。 ５）融合蛋白質と熱ショック蛋白質のモル比は約（１０
   〜１００）：１に調整する請求項１〜４のいずれかに記
   載の方法。 ６）ＡＴＰは約１〜５０ｍＭ、好ましくは約２〜１０ｍ
   Ｍの濃度で使用する請求項１〜５のいずれかに記載の方
   法。 ７）蛋白質鎖の正しいフォールディングはｐＨ約６〜８
   で行われる請求項１〜６のいずれかに記載の方法。 ８）蛋白質鎖の正しいフォールディングは１５〜３０℃
   の範囲の温度で行われる請求項１〜７記載の方法。 ９）細菌ＧｒｏＥＬまたは均等なミトコンドリア成分Ｈ
   ｓｐ６０の機能原理に従って働く熱ショック蛋白質の、
   変性組換え融合蛋白質を正しくフォールディングさせる
   ためのバイオ触媒としての使用。 １０）熱ショック蛋白質はＧｒｏＥＬおよび／またはＨ
   ｓｐ６０、とくにＨｓｐ６０単独である請求項９記載の
   使用。