ES2468318T3 - FSH recombinante que incluye sialilaci�n en alfa 2,3- y alfa 2,6 - Google Patents

Abstract

FSH recombinante (rFSH) que incluye sialilación en α2,3 y α2,6 en donde el 60% o más de la sialilación total es sialilación en α2,3 y desde el 5 al 40% de la sialilación total es sialilación en α2,6; en donde la FSH recombinante tiene un contenido en ácido siálico [expresado en términos de una proporción de moles de ácido siálico respecto a moles de proteína] de 10 mol/mol a 15 mol/mol.

Description

FSH recombinante que incluye sialilaci�n en alfa 2,3-y alfa 2,6

5 La presente invención se refiere a gonadotropinas para su uso en el tratamiento de la infertilidad. En particular se refiere a la hormona foliculoestimulante (FSH).

Las gonadotropinas son un grupo de hormonas glicoprote�nas heterodim�ricas que regulan la función gon�dica en el macho y la hembra. Incluyen la hormona foliculoestimulante (FSH), la hormona luteinizante (LH) y la gonadotropina cori�nica (CG).

FSH es secretada de forma natural por la hip�fisis anterior y funciona para apoyar el desarrollo folicular y la ovulaci�n. FSH comprende una subunidad alfa de 92 amino�cidos, también común a otras hormonas glicoprote�nas LH y CG, y una subunidad beta de 111 amino�cidos única a FSH que confiere la especificidad biológica de la

15 hormona (Pierce y Parsons, 1981). Cada subunidad se modifica postraduccionalmente mediante la adición de residuos gluc�dicos complejos. Ambas subunidad tienen 2 sitios para unión de glicano unido en N, la subunidad alfa en los amino�cidos 52 y 78 y la subunidad beta en los residuos de amino�cidos 7 y 24 (Rathnam y Saxena, 1975, Saxena y Rathnam, 1976). Por tanto, FSH est� glicosilada hasta aproximadamente el 30% en masa (Dias y Van Roey. 2001. Fox et al. 2001).

Se ha usado FSH purificada de orina humana posmenop�usica durante muchos años en el tratamiento de la infertilidad; tanto para fomentar la ovulaci�n en la reproducción natural como para proporcionar ovocitos para tecnologías de reproducción asistida. Dos versiones recombinantes de FSH, Gonal-F (Serono) y Puregon (Organon) estuvieron disponibles a mediados de los años 90. Estas se expresan ambas en células de ovario de h�mster chino

25 (CHO) (Howles, 1996).

Hay considerable heterogeneidad asociada con las preparaciones de FSH que se relaciona con diferencias en las cantidades de varias isoformas presentes. Las isoformas individuales de FSH muestran secuencias de amino�cidos idénticas pero se diferencian en el grado al que est�n modificadas postraduccionalmente; las isoformas particulares se caracterizan por la heterogeneidad de las estructuras de las ramificaciones de hidratos de carbono y cantidades diferentes de la incorporación de ácido si�lico (un azúcar terminal), ambas de las cuales parecen influir la bioactividad de la isoforma específica.

La glicosilaci�n de FSH natural es muy compleja. Los glicanos en la FSH hipofisaria derivada de forma natural

35 pueden contener una amplia gama de estructuras que pueden incluir combinaciones de glicanos bi-, tri-y tetraantenarios (Pierce y Parsons, 1981. Ryan at al., 1987. Baenziger y Green, 1988). Los glicanos pueden tener modificaciones adicionales: fucosilaci�n del núcleo, glucosamina bisectante, cadenas extendidas con acetillactosamina, sialilaci�n parcial o completa, sialilaci�n con enlaces α2,3 y α2,6 y galactosamina sulfatada sustituida por galactosa (Dalpathado et al., 2006). Además, hay diferencias entre la distribución de las estructuras de glicano en los sitios de glicosilaci�n individuales. Se ha encontrado un nivel comparable de complejidad de glicanos en FSH derivada del suero de individuos y de la orina de mujeres posmenop�usicas (Wide et al., 2007).

La glicosilaci�n de productos de FSH recombinante refleja la gama de glicosiltransferasas presentes en la línea celular huésped. Los productos de rFSH existentes derivan de células de ovario de h�mster chino (células CHO)

45 manipuladas. La gama de modificaciones de glicano en rFSH derivada de CHO est� más limitada que las encontradas en los productos naturales, derivados de extractos hipofisarios u orina. Los ejemplos de la heterogeneidad de glicanos reducida encontrada en rFSH derivada de CHO incluyen una falta de glucosamina bisectante y un contenido reducido de fucosilaci�n del núcleo y extensiones de acetil-lactosamina (Hard et al., 1990). Además, las células CHO solo pueden añadir ácido si�lico usando el enlace α2,3 (Kagawa et al., 1988, Takeuchi et al, 1988, Svensson et al., 1990). Esto es diferente de la FSH producida de forma natural que contiene glicanos con una mezcla de ácido si�lico unido en α2,3 y α2,6.

Se ha demostrado que una preparación de FSH recombinante (Organon) se diferencia en las cantidades de FSH con un punto isoel�ctrico (pI) por debajo de 4 (consideradas las isoformas ácidas) cuando se comparan con FSH

55 hipofisaria, s�rica o de orina posmenop�usica (Ulloa-Aguirre et al., 1995). La cantidad de isoformas ácidas en las preparaciones urinarias era mucho mayor comparada con los productos recombinantes, Gonal-f (Serono) y Puregon (Organon) (Andersen et al., 2004). Esto debe reflejar un contenido molar menor de ácido si�lico en la rFSH ya que el contenido de glicano cargado negativamente modificado con sulfato es bajo en FSH. El menor contenido en ácido si�lico, comparado con la FSH natural, es una característica de ambos productos de FSH comercialmente disponibles y por tanto debe reflejar una limitación en el proceso de fabricación (Bassett y Driebergen, 2005).

Existe un gran cuerpo de trabajo científico que analiza e intenta explicar las variaciones en la glicosilaci�n de FSH entre individuos y cambios durante el curso de un ciclo de ovulaci�n. Una de las discusiones principales se refiere a la observación de que la concentración de FSH y el contenido de ácido si�lico disminuyen ambos durante la fase 65 preovulatoria del ciclo. El contenido disminuido en ácido si�lico produce una FSH más básica que tanto se depura más rápidamente como, al menos in vitro, es más potente en el receptor diana (Zambrano et al., 1996). La pregunta

respecto a la relevancia biológica de estos cambios y cómo pueden estar implicados en la selección del fol�culo dominante permanece sin resolver (revisado por Ulloa-Aguirre, 2003).

Se ha documentado el tiempo de vida circulatoria de la FSH para materiales de una variedad de fuentes. Algunos de estos materiales se han fraccionado basándose en la carga molecular total, caracterizados por su pI, en los que más ácido equivale a mayor carga negativa. Como se ha indicado previamente el principal contribuidor a la carga molecular global es el contenido total en ácido si�lico de cada molécula de FSH. Por ejemplo, rFSH (Organon) tiene un contenido de ácido si�lico de aproximadamente 8 mol/mol, mientras que la FSH derivada de orina tiene un contenido mayor de ácido si�lico (de Leeuw et al., 1996). Las velocidades de depuración en plasma correspondientes en rata son 0,34 y 0,14 ml/min (Ulloa-Aguirre et al., 2003). En otro ejemplo donde una muestra de FSH recombinante se separ� en fracciones de alto y bajo pI, la potencia in vivo de la fracción de pI alto (menor contenido en ácido si�lico) disminuyó y tenía una semivida en plasma más corta (D’Antonio et al., 1999). También se ha descrito que la FSH más básica que circula durante los estadios tardíos del ciclo de ovulaci�n es debido a la disminución de la α2,3 sialiltransferasa en la hip�fisis anterior que se produce al aumentar los niveles de estradiol (Damian-Matsumara et al. 1999. Ulloa-Aguirre et al. 2001). No se han descrito resultados para la α2,6 sialiltransferasa.

El contenido total en ácido si�lico de la FSH y rFSH no es directamente comparable ya que los ácidos si�licos comúnmente se unen de dos maneras. La FSH hipofisaria/s�rica/urinaria contiene ácido si�lico unido tanto en α2,3 como α2,6, con una predominancia del primero. Sin embargo los recombinantes derivados de células CHO solo contienen α2,3 (Kagawa et al, 1988, Takeuchi et al, 1988, Svensson et al., 1990). Esta es otra diferencia entre los productos naturales y recombinantes actuales además del menor contenido total en ácido si�lico del último.

Las células CHO se usan comúnmente para la producción de proteínas recombinantes humanas farmacéuticas. Un análisis estructural ha identificado que el ácido si�lico est� exclusivamente unido por un enlace α2,3 (Kagawa et al, 1988, Takeuchi et al, 1988, Svensson et al., 1990). Muchas glicoprote�nas humanas contienen una mezcla de enlaces tanto α2,3 como α2,6. Por tanto, las proteínas recombinantes expresadas usando el sistema de CHO se diferenciarán de sus homólogos naturales en su tipo de enlaces de ácido si�lico terminal. Esta es una consideración importante en la producción de productos biológicos para uso farmacéutico ya que las fracciones gluc�dicas pueden contribuir a los atributos farmacol�gicos de la molécula.

Es deseable tener un producto de rFSH que replique o mimetice más estrechamente el perfil fisioqu�mico y farmacocin�tico del producto producido de orina humana. Es deseable tener un producto de rFSH que tenga propiedad o propiedades farmacocin�tica(s) mejorada(s) comprado con el producto recombinante conocido.

Seg�n la presente invención se proporciona FSH recombinante (“rFSH” o “recFSH”) que incluye sialilaci�n en α2,3 y sialilaci�n en α2,6 en donde el 60% o más de la sialilaci�n total es sialilaci�n en α2,3 y del 5 al 40% de la sialilaci�n total es sialilaci�n en α2,6; en donde la FSH recombinante tiene un contenido en ácido si�lico [expresado en términos de una proporción de moles de ácido si�lico respecto a moles de proteína] de 10 mol/mol a 15 mol/mol. La rFSH (o preparación de rFSH) de la invención puede tener el 5% o menos de la sialilaci�n total que es sialilaci�n en α2,8, por ejemplo, del 0,1-4% de la sialilaci�n total puede ser sialilaci�n en α2,8.

Los solicitantes han encontrado que el tipo de enlace de ácido si�lico, α2,3 o α2,6, puede tener una influencia drástica en la depuración biológica de FSH. Las líneas celulares humanas, en oposición a las líneas de células CHO, pueden expresar FSH recombinante con ácidos si�licos unidos por enlaces tanto α2,3 como α2,6. En el ejemplo 4 se hizo una línea celular con FSH recombinante que expresaba FSH que contenía glicanos con bajos niveles de ácido si�lico unidos tanto en α2,3 como en α2,6 (figura 6). Este material básico, con contenido limitado en ácido si�lico (figura 4) se depuraba de forma muy rápida de la circulación en rata como se predeciría (figura 7). La línea celular se sometió después a un segundo paso de manipulación con la adición del gen que codifica la α2,6-sialiltransferasa (ejemplo 5). La rFSH resultante estaba altamente sialilada mostrando un contenido en ácido si�lico y distribución de pI comparable con la FSH urinaria (figura 5). Sin embargo, el material se depuraba muy rápidamente de la circulación de ratas a una velocidad comparable al material original que tenía bajo contenido en ácido si�lico (figura 8). Esta era una observación inesperada ya que se sabe que una proporción de ácido si�lico en la FSH natural y biol�gicamente activa est� unido en α2,6. Se encontr� que la depuración de rFSH sialilada en α2,6 estaba mediada por el receptor de asialoglicoprote�na (ASGP) encontrado en el hígado (ejemplo 9). Esto se demostr� por el bloqueo transitorio de los receptores de ASGP usando un exceso de otro sustrato para el receptor. Con el receptor bloqueado por asialofetu�na, la depuración esperada por el material altamente sialilado se restableci� (figura 9). Esto se mantuvo durante varias horas hasta que el bloqueo se super� y la rFSH altamente sialilada unida en α2,6 reanud� su rápida depuración.

Se hizo FSH recombinante con una mezcla de ácido si�lico unido tanto en α2,3 como α2,6 manipulando una línea celular humana para que exprese tanto rFSH como α2,3-sialiltransferasa (ejemplo 4 y 5). El producto expresado es muy ácido y tiene una mezcla de ácidos si�licos unidos tanto en α2,3 como α2,6; el último proporcionado por la actividad sialiltransferasa end�gena (figura 6). Esto tiene dos ventajas sobre rFSH expresada en células CHO convencionales: primero el material est� más altamente sialilado debido a las actividades combinadas de las dos sialiltransferasas; y en segundo lugar el material se parece más estrechamente a la FSH natural. Esto es probable que sea más biol�gicamente apropiado comparado con los productos recombinantes derivados de células CHO que producen solo ácido si�lico unido en α2,3 (Kagawa et al, 1988, Takeuchi et al, 1988, Svensson et al., 1990) y tienen contenido disminuido en ácido si�lico (Ulloa-Aguirre et al., 1995, Andersen et al., 2004).

5 Los solicitantes han encontrado sorprendentemente que la rFSH de la invención puede replicar o mimetizar más estrechamente el perfil fisioqu�mico y farmacocin�tico del producto urinario humano natural que otros productos recombinantes. En otras palabras, la rFSH de la invención puede ser más cercana a la FSH “natural”. Esto puede tener ventajas significativas respecto a la dosificación, etc. Además, un producto más “natural” o más “humano” puede ser más deseable para el paciente, que puede desear que la terapia, aunque en un sentido artificial, sea tan “natural” como sea posible. Puede haber otras ventajas (por ejemplo, ventajas farmacocin�ticas) en un producto recombinante que tiene estructura gluc�dica (por ejemplo, glicano) que es más cercana a la FSH natural (por ejemplo, urinaria humana) que otros productos recombinantes.

Por tanto, la invención es una versión recombinante de FSH que tiene una mezcla de ácido si�lico en α2,3 y α2,6 y

15 por tanto se parece más estrechamente a la FSH natural. Se espera que el uso de este compuesto para la estimulaci�n ovárica controlada, en técnicas de FIV, e inducción de la ovulaci�n produzca una estimulaci�n más natural del ovario comparado con productos recombinantes existentes.

Seg�n la presente invención se proporciona FSH recombinante (“rFSH” o “recFSH”) que incluye sialilaci�n en α2,3 y α2,6 en donde el 60% o más de la sialilaci�n total es sialilaci�n en α2,3 y desde el 5 al 40% de la sialilaci�n total es sialilaci�n en α2,6; en donde la FSH recombinante tiene un contenido en ácido si�lico [expresado en términos de una proporción de moles de ácido si�lico respecto a moles de proteína] de 10 mol/mol a 15 mol/mol. La rFSH o preparación de rFSH pueden opcionalmente incluir además sialilaci�n en α2,8.

25 En formas de realización de la invención, la rFSH puede estar presente como un única isoforma o como una mezcla de isoformas.

La rFSH según la invención tiene un contenido en ácido si�lico [expresado en términos de una proporción de moles de ácido si�lico respecto a moles de proteína] de entre 10 mol/mol y 15 mol/mol, por ejemplo entre 10 mol/mol y 14 mol/mol, por ejemplo, entre 11 mol/mol y 14 mol/mol, por ejemplo, entre 12 mol/mol y 14 mol/mol, por ejemplo, entre 12 mol/mol y 13 mol/mol. La rFSH de la invención se puede producir o expresar en una línea celular humana.

La rFSH (o preparación de rFSH) según la invención tiene el 60% o más de la sialilaci�n total que es sialilaci�n en α2,3. Por ejemplo, el 70, 80 o 90% o más de la sialilaci�n total puede ser sialilaci�n en α2,3. La rFSH puede incluir 35 sialilaci�n en α2,3 en una cantidad que es desde el 65 al 85% de la sialilaci�n total, por ejemplo del 70 al 80% de la sialilaci�n total, del 71 al 79% de la sialilaci�n total. La rFSH de la invención puede tener desde el 5 al 40% de la sialilaci�n total que es sialilaci�n en α2,6. La rFSH puede incluir sialilaci�n en α2,6 que es desde el 15 al 35% de la sialilaci�n total, por ejemplo desde el 20 al 30% de la sialilaci�n total, por ejemplo desde el 21 al 29% de la sialilaci�n total. La rFSH de la invención puede tener el 5% o menos de la sialilaci�n total que es sialilaci�n en α2,8. Por ejemplo el 2,5% o menos de la sialilaci�n total puede ser sialilaci�n en α2,8. La rFSH puede incluir sialilaci�n en α2,8 en una cantidad que es desde el 0,1 al 4% de la sialilaci�n total, por ejemplo desde el 0,5 al 3% de la sialilaci�n total, por ejemplo, desde el 0,5 al 2,5% de la sialilaci�n total. Mediante sialilaci�n se quiere decir la cantidad de residuos si�licos presentes en las estructuras gluc�dicas de la FSH. La sialilaci�n en α2,3 significa sialilaci�n en la posición 2,3 (como se sabe bien en la técnica) y sialilaci�n en α2,6 en la posición 2,6 (como se sabe bien en la técnica). Por

45 tanto, el “% de la sialilaci�n total puede ser sialilaci�n en α2,3” se refiere al % del número total de residuos de ácido si�lico presentes en la FSH que est�n sialilados en la posición 2,3. El término “% de sialilaci�n total que es sialilaci�n en α2,6” se refiere al % del número total de residuos de ácido si�lico presentes en la FSH que est�n sialilados en la posición 2,6.

La FSH recombinante expresada en células de ovario de h�mster chino (CHO) incluye exclusivamente sialilaci�n en α2,3 (Kagawa et al, 1988, Takeuchi et al, 1988, Svensson et al., 1990).

La rFSH de la invención se puede producir o expresar en una línea celular humana. Esto puede simplificar (y hacer más eficaz) el método de producción porque la manipulación y control de, por ejemplo, el medio de crecimiento

55 celular para retener la sialilaci�n puede ser menos crítico que con procesos conocidos. El método también puede ser más eficaz porque hay poca rFSH básica producida que en la producción de productos de rFSH conocidos; se produce rFSH más ácida y la separación/eliminación de FSH básica es menos problem�tica. La rFSH se puede producir o expresar en una línea de células Per.C6, una línea celular derivada de Per.C6 o una línea de células Per.C6 modificada. La línea celular se puede modificar usando α2,3-sialiltransferasa. La línea celular se puede modificar usando α2,6-sialiltransferasa. Alternativa o adicionalmente, la rFSH puede incluir ácidos si�licos unidos en α2,6 (sialilaci�n en α2,6) proporcionados por la actividad sialiltransferasa end�gena [de la línea celular].

La rFSH se puede producir usando α2,3-y/o α2,6-sialiltransferasa. La rFSH se puede producir usando α2,3sialiltransferasa. La rFSH puede incluir ácidos si�licos unidos en α2,6 (sialilaci�n en α2,6) proporcionados por la

65 actividad sialiltransferasa end�gena.

Seg�n la presente invención en un aspecto adicional se proporciona un método de producción de rFSH como se describe en el presente documento (según aspectos de la invención) que comprende el paso de producir o expresar la rFSH en una línea celular humana, por ejemplo una línea celular Per.C6, una línea celular derivada de Per.C6 o una línea celular Per.C6 modificada, por ejemplo una línea celular que se ha modificado usando α2,3

5 sialiltransferasa.

La estructura de rFSH contiene fracciones de glicano. Se pueden producir ramificaciones con el resultado que el glicano puede tener 1, 2, 3, 4 o más residuos de azúcares terminales o “antenas”, como se sabe bien en la técnica. La rFSH de la invención puede tener glicanos con presencia de sialilaci�n en estructuras monoantenarias y/o

10 diantenarias y/o triantenarias y/o tetrantenarias. La rFSH puede incluir preferiblemente estructuras de glicano monosialilado, disialilado, trisialilado y tetrasialilado con cantidades relativas como sigue: 9-15% monosialilado, 2730% disialilado, 30-36% trisialilado y 25-29% tetrasialilado (por ejemplo, como se muestra por análisis WAX de glicanos cargados, como se explica en el ejemplo 8 c).

15 Según la presente invención en un aspecto adicional se proporciona una composición farmacéutica que comprende rFSH que incluye sialilaci�n en α2,3 y sialilaci�n en α2,6 en donde el 60% o más de la sialilaci�n total es sialilaci�n en α2,3 y desde el 5 al 40% de la sialilaci�n total es sialilaci�n en α2,6; y que tiene un contenido en ácido si�lico [expresado en términos de una proporción de moles de ácido si�lico respecto a moles de proteína] de 10 mol/mol a 15 mol/mol.

20 La composición farmacéutica puede comprender además hCG y/o LH.

Se puede obtener hCG por cualquier medio conocido en la técnica. hCG, como se usa en el presente documento, incluye hCG humana y recombinante. Se puede purificar hCG humana de cualquier fuente apropiada (por ejemplo,

25 orina y placenta) por cualquier método conocido en la técnica. Los métodos de expresar y purificar hCG recombinante se conocen bien en la técnica.

Se puede obtener LH por cualquier medio conocido en la técnica. LH, como se usa en el presente documento, incluye LH humana y recombinante. Se puede purificar LH humana de cualquier fuente apropiada (por ejemplo,

30 orina) por cualquier método conocido en la técnica. Los métodos de expresar y purificar LH recombinante se conocen bien en la técnica.

La composición farmacéutica puede ser para el tratamiento de infertilidad, por ejemplo, para uso en, por ejemplo, tecnologías de reproducción asistida (TRA), inducción de la ovulaci�n o inseminaci�n intrauterina (IIU). La

35 composición farmacéutica se puede usar, por ejemplo, en indicaciones m�dicas donde se usan preparaciones de FSH conocidas. La presente invención también proporciona el uso de rFSH descrita en el presente documento (según aspectos de la invención) para, o en la fabricación de un medicamente para, el tratamiento de infertilidad.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden formular en composiciones bien conocidas

40 para cualquier vía de administración de fármacos, por ejemplo, oral, rectal, parenteral, transd�rmica (por ejemplo, tecnología de parches), intravenosa, intramuscular, subcutánea, intrasusternal, intravaginal, intraperitoneal, local (polvos, pomadas o gotas) o como un aerosol yugal o nasal Una composición típica comprende un soporte farmac�uticamente aceptable, tal como una solución acuosa, excipientes no tóxicos, incluyendo sales y conservantes, tampones y similares, como se describe en Remington's Pharmaceutical Sciences decimoquinta

45 edición (Matt Publishing Company, 1975), en las páginas 1405 a 1412 y 1481 --87, y el formulario nacional XIV decimocuarta edición (American Pharmaceutical Association, 1975) entre otros.

Los ejemplos de soportes, diluyentes, solventes o vehículos farmacéuticos acuosos y no acuosos adecuados incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol, y similares), carboximetilcelulosa y

50 mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales (tal como aceite de oliva) y ésteres orgánicos inyectables tal como oleato de etilo.

Las composiciones de la presente invención también pueden contener aditivos tales como, pero no limitados a, conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes. También pueden estar

55 incluidos agentes antibacterianos y antif�ngicos para prevenir el crecimiento de microbios e incluyen, por ejemplo, parabeno, clorobutanol, fenol, ácido s�rbico, y similares. Además, puede ser deseable incluir agentes isot�nicos tal como azúcares, cloruro de sodio, y similares.

En algunos casos, para realizar una acción prolongada es deseable ralentizar la absorción de FSH (y otros principios

60 activos, si est�n presentes) de la inyección subcutánea o intramuscular. Esto se puede lograr mediante el uso de una suspensión líquida de material cristalino o amorfo con mala solubilidad en agua. La velocidad de absorción de FSH depende entonces de su velocidad de disolución que, a su vez, puede depender del tamaño de los cristales y la forma cristalina. Alternativamente, la absorción retrasada de una forma de combinación de FSH administrada por vía parenteral se logra disolviendo o resuspendiendo la combinación de FSH en un vehículo oleaginoso.

Las formas en depósito inyectables se pueden hacer formando matrices microencapsuladas de FSH (y otros agentes, si est�n presentes) en pol�meros biodegradables tal como polilactida-poliglicolida. Dependiendo de la proporción de FSH respecto al pol�mero y de la naturaleza del pol�mero particular empleado, se puede controlar la velocidad de liberación de FSH. Los ejemplos de otros pol�meros biodegradables incluyen polivinilpirrolidona, poli(orto�steres), poli(anh�dridos) etc. Las formulaciones inyectables en depósito también se preparan atrapando la FSH en liposomas o microemulsiones que son compatibles con tejidos corporales.

Las formulaciones se pueden esterilizar, por ejemplo, mediante filtración a través de filtro que retine bacterias, o incorporando agentes de esterilización en forma de composiciones estériles sólidas que se pueden disolver o dispersar en agua estéril u otro medio inyectable estéril justo antes de su uso. Las formulaciones inyectables se pueden suministrar en cualquier envase adecuado, por ejemplo, vial, jeringuilla ya rellena, cartuchos de inyección, y similares.

Las formulaciones inyectables se pueden suministrar como un producto que tiene composiciones farmacéuticas que contienen FSH (opcionalmente con hCG, LH, etc.). Si hay más de un principio activo (es decir, FSH y por ejemplo, hCG o LH) estos pueden ser adecuados para la administración por separado o juntos. Si se administran por separado, la administración puede ser secuencial. El producto se puede suministrar en cualquier envase adecuado. Por ejemplo, un producto puede contener un número de jeringas ya rellenas que contienen bien FSH, hCG o una combinación de tanto FSH como hCG, las jeringas embaladas en un bl�ster u otro medio para mantener la esterilidad. Un producto puede contener opcionalmente instrucciones para usar las formulaciones de FSH y hCG.

El pH y la concentración exacta de los varios componentes de la composición farmacéutica se ajustan según práctica de rutina en este campo. Véase, GOODMAN y GILMAN's THE PHARMACOLOGICAL BASIS FOR THERAPEUTICES, 7� ed. En una forma de realización preferida, las composiciones de la invención se suministran como composiciones para la administración parenteral. Los métodos generales para la preparación de las formulaciones parenterales se conocen en la técnica y se describen en REMINGTON; THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY, anteriormente, en las páginas 780-820. Las composiciones parenterales se pueden suministrar en formulación líquida o como un sólido que se mezclar� con un medio inyectable estéril justo antes de la administración. En una forma de realización especialmente preferida, las composiciones parenterales se suministran en formas farmacéuticas unitarias para la facilidad de administración y uniformidad de dosis.

Descripci�n detallada de la invención

La presente invención se describir� ahora en más detalle con referencia a los siguientes ejemplos y a las figuras adjuntas en las que:

la figura 1 muestra un mapa plasm�dico del vector de expresión pFSHalfa/beta;

la figura 2 muestra el vector de expresión de α2,3-sialiltransferasa (ST3GAL4);

la figura 3 muestra el vector de expresión de α2,6-sialiltransferasa (ST6GAL1);

la figura 4 muestra el isoelectroenfoque de FSH recombinante producida por células Per.C6 que expresan establemente FSH;

la figura 5 muestra un ejemplo de clones analizados por isoelectroenfoque de FSH recombinante producida por células Per.C6 que expresan establemente FSH después de manipularlas con α2,3-o α2,6-sialiltransferasa;

la figura 6 muestra el análisis de los enlaces de ácido si�lico de Per.C6 FSH;

la figura 7 muestra los índices de depuración metabólica (MRC) de muestras de Per.C6 FSH;

la figura 8 muestra los MRC de muestras de Per.C6 FSH manipuladas con α2,6-sialiltransferasa;

la figura 9 muestra los MRC de muestras de Per.C6 FSH manipuladas con α2,6-sialiltransferasa;

la figura 10 muestra los MRC de muestras de Per.C6 FSH manipuladas con α2,3-sialiltransferasa;

la figura 11 muestra el aumento de peso ovárico por clones de Per.C6 rFSH de Per.C6 rFSH parentales, según el método de Steelman y Pohley (1953);

la figura 12 muestra el aumento de peso ovárico por clones de Per.C6 rFSH de Per.C6 rFSH manipuladas (α2,6sialiltransferasa); y

la figura 13 muestra el aumento de peso ovárico por clones de Per.C6 rFSH de Per.C6 rFSH manipuladas (α2,3sialiltransferasa).

Selecci�n de secuencias

FSH humana

5 Se us� la región codificante del gen para el polip�ptido alfa de FSH según Fiddes y Goodman (1981). La secuencia est� depositada como AH007338 y en el momento de construcción no había otras variantes de esta secuencia de proteína. La secuencia se denomina en el presente documento SEQ ID 1.

Se us� la región codificante del gen para el polip�ptido beta de FSH según Keene et al (1989). La secuencia est� depositada como NM_000510 y en el momento de construcción no había otras variantes de esta secuencia de proteína. La sescuncia se denomina en el presente documento SEQ ID 2.

Sialiltransferasa

15 α2,3-sialiltransferasa -Se us� la región codificante del gen para la beta-galact�sido alfa-2,3-sialiltransferasa 4 (α2,3sialiltransferasa, ST3GAL4) según Kitagawa y Paulson (1994). La secuencia est� depositada como L23767 y se denomina en el presente documento SEQ ID 3.

α2,6-sialiltransferasa -Se us� la región codificante del gen para la beta-galact�sido alfa-2,6-sialiltransferasa 1 (α2,6sialiltransferasa, ST6GAL1) según Grundman et al. (1990). La secuencia est� depositada como NM_003032 y se denomina en el presente documento SEQ ID 4.

Ejemplos

Ejemplo 1. Construcción del vector de expresión de FSH

La secuencia codificante del polip�ptido alfa de FSH (AH007338, SEQ ID 1) y del polip�ptido beta de FSH (NM_003032, SEQ ID 2) se amplificaron por PCR usando las combinaciones de cebadores FSHa-fw y FSHa-rev y FSHb-fw y FSHb-rec respectivamente.

FSHa-fw 5'-CCAGGATCCGCCACCATGGATTACTACAGAAAAATATGC-3' FSHa-rev 5'-GGATGGCTAGCTTAAGATTTGTGATAATAAC-3' FSHb-fw 5'-CCAGGCGCGCCACCATGAAGACACTCCAGTTTTTC-3'

35 FSHb-rev 5'-CCGGGTTAACTTATTATTCTTTCATTTCACCAAAGG-3'

El ADN de FSH beta amplificado resultante se digirió con las enzimas de restricción AscI y HpaI y se insert� en los sitios AscI y HpaI en el vector de expresión de mamíferos dirigido por CMV que tiene un marcador de selección de neomicina. Similarmente, el ADN de FSH alfa se digirió con BamHI y NheI y se insert� en los sitios BamHI y NheI en el vector de expresión que ya contiene el ADN del polip�ptido beta de FSH.

Se us� el ADN del vector para transformar la cepa DH5α de E. coli. Se cogieron sesenta colonias para amplificación y cincuenta y siete contenían el vector que contiene FSH tanto alfa como beta. Se seleccionaron veinte de estas para secuenciaci�n y todas contenían las secuencias correctas según SEQ ID 1 y SEQ ID 2. Se seleccion� el

45 pl�smido pFSH A+B#17 para transfecci�n (figura 1).

Ejemplo 2. Construcción del vector de expresión de ST3

Se amplificó la secuencia de beta-galact�sido alfa-2,3-sialiltransferasa 4 (ST3, L23767, SEQ ID 3) por PCR usando la combinación de cebadores 2,3STfw y 2,3STrev.

2,3STfw 5'-CCAGGATCCGCCACCATGTGTCCTGCAGGCTGGAAGC-3'

2,3STrev 5'-TTTTTTTCTTAAGTCAGAAGGACGTGAGGTTCTTG-3'

55 El ADN de ST3 amplificado resultante se digirió con las enzimas de restricción BamHI y AflII y se insert� en los sitios BamHI y AflII del vector de expresión de mamíferos dirigido por CMV que tiene un marcador de resistencia a higromicina. El vector se amplificó como se ha descrito previamente y se secuenci�. El clon pST3#1 (figura 2) contenía la secuencia correcta según SEQ ID 3 y se seleccion� para transfecci�n.

Ejemplo 3. Construcción del vector de expresión de ST6

Se amplificó la secuencia de beta-galact�sido alfa-2,6-sialiltransferasa 1 (ST6, NM_003032, SEQ ID 4) por PCR usando la combinación de cebadores 2,6STfw y 2,6STrev.

65 2,6STfw 5'-CCAGGATCCGCCACCATGATTCACACCAACCTGAAG-3' 2,6STrev 5'-TTTTTTTCTTAAGTTAGCAGTGAATGGTCCGG-3'

El ADN de ST6 amplificado resultante se digirió con las enzimas de restricción BamHI y AflII y se insert� en los sitios BamHI y AflII del vector de expresión de mamíferos dirigido por CMV que tiene un marcador de resistencia a higromicina. El vector se amplificó como se ha descrito previamente y se secuenci�. El clon pST6#11 (figura 3) contenía la secuencia correcta según SEQ ID 4 y se seleccion� para transfecci�n.

Ejemplo 4. Expresión estable de pFSH A+B en células PER.C6. Transfecci�n, aislamiento y cribado de clones

Se generaron clones de Per.C6 que producen FSH que expresan ambas cadenas polipept�dicas de FSH a partir de un único pl�smido (véase el ejemplo 1).

Para obtener clones estables un agente de transfecci�n basado en liposomas con la construcción pFSH A+B. Se seleccionaron clones estables en VPRO suplementado con STF al 10% y que contenía G418. Tres semanas después de la transfecci�n los clones resistentes a G418 crecieron. Se seleccionaron un total de 250 clones para aislamiento. Los clones aislados se cultivaron en medio de selección hasta el 70-80% de confluencia. Se ensay� el contenido de la proteína FSH de los sobrenadantes usando un ELISA selectivo de FSH y la actividad farmacol�gica en el receptor de FSH en la línea celular clonada, usando un ensayo de acumulación de AMPc. Se siguió adelante con los clones (98) que expresaban proteína funcional para expansión del cultivo a 24 pocillos, 6 pocillos y botellas T80.

Se iniciaron estudios para determinar la productividad y calidad del material de siete clones en botellas T80 para generar material suficiente. Las células se cultivaron en medio suplementado como se ha descrito previamente durante 7 días y el sobrenadante se recogió. Se determin� la productividad usando el ELISA selectivo para FSH. Se determin� el perfil isoel�ctrico del material (figura 6). Se muestran muestras representativas en la figura 4. La información del IEF se us� para seleccionar clones para análisis de índice de depuración metabólica (ejemplo 9). Se seleccionaron clones (005, 104, 179, 223, 144) con suficiente productividad y calidad para manipulación con sialiltransferasa.

Ejemplo 5. El nivel de sialilaci�n aumenta en células que sobreexpresan α2,3-o α2,6-sialiltransferasa. Expresión estable de pST3 o pST6 en células PER.C6 que expresan FSH; Transfecci�n, aislamiento y cribado de clones

Se generaron clones de Per.C6 que producían FSH altamente sialilada expresando α2,3-sialiltransferasa o α2,6sialiltransferasa de pl�smidos separados (véanse los ejemplos 2 y 3) en células Per.C6 que ya expresan ambas cadenas polipept�dicas de FSH (véase el ejemplo 4). Se seleccionaron cuatro clones producidos de células PER.C6� como se muestra en el ejemplo 4 por sus características incluyendo productividad, buen perfil de crecimiento, producción de proteína funcional y FSH producida que incluía algo de sialilaci�n.

Se generaron clones estables como se ha descrito previamente en el ejemplo 4. Un total de 202 clones del programa de α2,3-sialiltransferasa y 210 clones del programa de α2,6-sialiltransferasa se aislaron, expandieron y ensayaron. El número final de clones para el estudio de α2,3 fue 12 y 30 para el estudio de α2,6.

Los clones de α2,3-sialiltransferasa se adaptaron a medio sin suero y condiciones en suspensión.

Como los clones anteriores se ensayaron usando un ELISA selectivo de FSH, respuesta funcional en un línea celular con receptor de FSH, IEF (Ejemplo 6), índice de depuración metabólica (ejemplo 9) y análisis de Steelman Pohley (ejemplo 10). Los resultados se compararon a una FSH recombinante comercialmente disponible (Gonal-f, Serono) y al líneas células Per.C6 con FSH parentales. Se muestran muestras representativas en la figura 5. Algunos clones no demostraron un aumento en sialilaci�n pero se puede ver que la FSH producida por la mayoría de los clones tiene sialilaci�n significativamente mejorada (es decir, de media más isoformas de FSH con números altos de ácidos si�licos) comparada con FSH expresada sin α2,3-o α2,6-sialiltransferasa.

En conclusión, la expresión de FSH junto con sialiltransferasa en células Per.C6 produce niveles aumentados de FSH sialilada comparada con células que expresan solo FSH.

Ejemplo 6. Análisis del pI de isoformas de FSH producidas en Per.C6 mediante isoelectroenfoque

La electroforesis se define como el transporte de moléculas cargadas a través de un solvente mediante un campo eléctrico. La movilidad de una molécula biológica a través de un campo eléctrico depender� de la fuerza del campo, la carga neta en la molécula, el tamaño y la forma de la molécula, la fuerza iónica y las propiedades del medio a través del cual migran las moléculas.

El isoelectroenfoque (IEF) es una técnica electrofor�tica para la separación de proteínas basada en su pI. El pI es el pH al que la proteína no tiene carga neta y no migrar� en un campo eléctrico. El contenido en ácido si�lico de las isoformas de FSH altera sutilmente el punto de pI para cada isoforma, lo que se puede explotar usando esta técnica para visualizar la isoformas de Per.C6 FSH de cada clon.

Se analizaron los puntos isoel�ctricos de las isoformas de FSH producidas en Per.C6 en sobrenadantes de cultivo celular usando isoelectroenfoque. Se produjo medio de cultivo celular de clones de Per.C6 FSH como se ha descrito en el ejemplo 4 y 5.

5 Las muestras de Per.C6 FSH se separaron en geles de IEF Novex� que contenían poliacrilamida al 5% en condiciones nativas en un gradiente de pH 3,0-7,0 en una solución de anfolitos de pH 3,0-7,0.

Las proteínas se transfirieron a nitrocelulosa apoyada y se visualizaron usando un anticuerpo monoclonal primario

10 anti-FSHα, un anticuerpo secundario anti-IgG de ratón conjugado con fosfatasa alcalina y reactivo fosfato de 5bromo-4-cloro-3-indolilo (BCIP) y nitroazul de tetrazolio (NBT) para visualizar las bandas.

Como se indica en las figuras 4 y 5, las bandas representan isoformas de FSH que contienen diferentes números de moléculas de ácido si�lico.

15 Usando este método se identificaron clones que producen isoformas de FSH con un número mayor de moléculas de ácido si�lico. La manipulación con α2,3-o α2,6-sialiltransferasa produjo clones con más ácido si�lico y un pI menor.

Ejemplo 7. Análisis de los enlaces de ácido si�lico en Per.C6 FSH

20 Se analizaron glicoconjugados usando un método de diferenciación de glicano basado en lectina. Con este método se pueden caracterizar glicoprote�nas y glicoconjugados unidos a nitrocelulosa. Las lectinas reconocen selectivamente una fracción particular, por ejemplo ácido si�lico unido en α2,3. Las lectinas aplicadas se conjugan con el hapteno esteroide digoxigenina que permite la detección inmunol�gica de las lectinas unidas.

25 Se separaron FSH de Per.C6 purificada de un clon parental (sin sialiltransferasa adicional), un clon manipulado con α2,3-sialiltransferasa y un clon manipulado con α2,6-sialiltransferasa usando técnicas de SDS-PAGE estándar. Una FSH recombinante comercialmente disponible (Gonal-f, Serono) se us� como patrón.

30 Se analizó el ácido si�lico usando el kit DIG Glycan Differentiation (No. de catálogo 11 210 238 001, Roche) según las instrucciones del fabricante. Las reacciones positivas con aglutinina de Sambucus nigra (SNA) indicaban ácido si�lico unido terminalmente en (2-6). Las reacciones positivas con aglutinina II de Maackia amurensis (MAA) indicaban ácido si�lico terminalmente unido en (α2-3).

35 En resumen el clon parental 005 contenía niveles bajos de ácido si�lico tanto en α2,3 como en α2,6. Los clones manipulados con α2,3-sialiltransferasa contenían niveles altos de enlaces de ácido si�lico α2,3 y niveles bajos de enlaces de ácido si�lico α2,6. Los clones manipulados con α2,6-sialiltransferasa contenían niveles altos de enlaces de ácido si�lico α2,6 y niveles bajos de enlaces de ácido si�lico α2,3. El control estándar Gonal-f solo contiene enlaces de ácido si�lico α2,3. Esto es consistente con lo que se sabe sobre las proteínas recombinantes producidas

40 en células de ovario de h�mster chino (CHO) (Kagawa et al, 1988, Takeuchi et al, 1988, Svensson et al., 1990).

En conclusión, la manipulación de células Per.C6 FSH con α2,3-o α2,6-sialiltransferasa aument� con éxito el número de moléculas de ácido si�lico conjugadas a la FSH en la muestra.

45 Ejemplo 8a. Cuantificación del ácido si�lico total

El ácido si�lico es un hidrato de carbono unido a proteína que se considera que es un monosac�rido y se produce en combinación con otros monosac�ridos como galactosa, manosa, glucosamina, galactosamina y fucosa.

50 El ácido si�lico total en rFSH purificada (ejemplo 11) se midió usando un kit de cuantificación enzim�tica de ácido si�lico según el protocolo del fabricante (Sigma, Sialic-Q). Brevemente, la ácido N-acetilneuram�nico aldolasa cataliza ácido si�lico a N-acetilmanoasina y ácido pir�vico. El ácido pir�vico se puede reducir a ácido l�ctico por β-NADH y l�ctico deshidrogenasa. La oxidación de B-NADH se puede medir de forma precisa espectrofotom�tricamente.

55 Se midió la concentración de proteína en placas de microtitulaci�n usando un kit comercial de ensayo del ácido bicincon�nico (BCA) (Sigma, B 9643) basado en el método de Lowry (Lowry et al, 1951).

El contenido total de ácido si�lico de Per.C6 FSH se midió y se encontr� que era mayor que 6 mol/mol. 60

Ejemplo 8b. Cuantificación de cantidades relativas de ácido si�lico en α2,3, α2,6 y α2,8

Se midieron las cantidades de porcentaje relativo de ácido si�lico en α2,3, α2,6 y α2,8 en rFSH purificada (ejemplo 11) usando técnicas conocidas.

Cada muestra de rFSH se inmoviliz� (bloque de gel), lav�, redujo, alquilo y digirió con PNGasa F durante la noche. Los N-glicanos se extrajeron y procesaron después. Se marcaron los N-glicanos para análisis de NP-HPLC y WAX-HPLC con el fluor�foro 2AB como se detalla en Royle et al. Los N-glicanos se corrieron en HPLC de fase normal (NP) en una columna TSK amida (como se detalla en Royle et al) con los tiempos de retención expresados en unidades de glucosa (UG).

Las muestras de los glicanos extraídos, juntados (extraídos como anteriormente) se digirieron con diferentes sialidasas para determinar los enlaces. NAN 1 (sialidasa recombinante) libera ácidos si�licos terminales no reductores unidos en α2,3 (NeuNAc y NeuNGc), ABS (sialidasa de Arthrobacter ureafaciens) libera ácidos si�licos terminales no reductores unidos en α2,3, α2,6 y α2,8 (NeuNAc y NeuNGc). Las muestras se analizaron por NP-HPLC, para permitir la comparación de la muestra sin digerir con la digerida con NAN1 y la digerida con ABS. La comparación de las tres trazas de NP-HPLC (sin digerir, digerida con NAN1, digerida con ABS) muestra que la digestión con ABS y NAN1 da diferentes resultados. Esto indica que las muestras tienen ácidos si�licos con enlaces α2,3, α2,6 y α2,8. Se calcularon los porcentajes relativos de estructuras presentes en el conjunto de glicanos sin digerir y se encontr� que estaban en los intervalos 65%-85% (por ejemplo, 77,75%) para sialilaci�n en α2,3; del 15 al 35% (por ejemplo, 21,46%) para sialilaci�n en α2,6; y del 0,1 al 3% para sialilaci�n en α2,8.

Ejemplo 8c. Cuantificación de las cantidades relativas de estructuras sialiladas mono, di, tri y tetra antenarias

Se midieron las cantidades de porcentaje relativo de estructuras mono, di, tri y tetra sialiladas en glicanos extraídos de rFSH purificada (ejemplo 11) usando técnicas conocidas.

Cada muestra de rFSH se inmoviliz� (bloque de gel), lav�, redujo, alquilo y digirió con PNGasa F durante la noche. Los N-glicanos se extrajeron y procesaron después. Se marcaron los N-glicanos para análisis de NP-HPLC y WAX-HPLC con el fluor�foro 2AB como se detalla en Royle et al.

Se llev� a cabo HPLC de intercambio ani�nico débil (WAX) para separar los N-glicanos por carga (ejemplo 8b) como se muestra en Royle et al, con un estándar de fetu�na N-glicano como referencia. Los glicanos eluyeron según el número de ácidos si�licos que contenían. Todas las muestras incluían estructuras mono (1S), di (2S), tri (3S) y tetra (4S) sialiladas. Se encontr� que las cantidades relativas de las estructuras sialiladas estaban los siguientes intervalos (1S:2S:4S:4S): 9-15%; 27-30%, 30-36%, 25-29% (por ejemplo, 10,24:28,65:35,49:25,62).

Ejemplo 9. Determinación de los índices de depuración metabólica de rFSH

Para determinar el índice de depuración metabólica (MCR) de muestras de Per.C6 FSH se inyectaron ratas hembras conscientes (3 animales por clon) en la vena de la cola en el tiempo cero con una inyección intravenosa rápida de rFSH (1-10 μg/rata, basado en la cuantificación por ELISA de las muestras, DRG EIA 1288). Se sacaron muestras de sangre (400 μl) de la punta de la cola 1, 2, 4, 8, 12, 24 y 32 horas después de la inyección de la muestra de prueba. El suero se recogió por centrifugaci�n y se evalúo el contenido de FSH por ELISA (DRG EIA 1288).

El receptor de asialoglicoprote�na (ASGP-R) reconoce glicoprote�nas desialiladas (terminadas en galactosa) tal como asialofetu�na (ASF) (Pricer y Ashwell, 1971, Van Lenten y Ashwell, 1972). El receptor de ASGP y la glicoprote�na desialilada unida se internalizan en la célula donde el receptor se recicla y el ligando se degrada (Regoeczi et al, 1978, Steer y Ashwell, 1980).

Para investigar si el material de Per.C6 FSH se depuraba a través de este mecanismo, el ASGP-R se satur� con asialofetu�na. El índice de depuración metabólica de material parental o manipulado con α2,6 o α2,3-sialiltransferasa se determin� como se ha descrito con la coadministraci�n de un mínimo de exceso molar de 7500 veces de asialofetu�na para saturar el ASPG-R durante 1-2 horas.

El material producido por los clones parentales de Per.C6 FSH contenía parte de material de MCR más prolongado pero un alto porcentaje se depur� rápidamente (figura 7). El clon cabeza de serie 005 que contenía el material más sialilado se manipul� usando α2,6 o α2,3-sialiltransferasa (ejemplo 5). Aunque los clones manipulados con α2,6sialiltransferasa demostraron sialilaci�n aumentada (figura 5) no había mejora en el MCR (figura 7). El bloqueo de ASGR restableci� el MCR del material α2,6 al del estándar lo que demuestra que incluso con enlaces α2,6 aumentados el material se depura rápidamente (figura 8). La manipulación con α2,3-sialiltransferasa produjo clones con MCR comparable al estándar (figura 9) y el contenido si�lico variable era consistente con lo que se sabe para las isoformas de FSH (figura 10).

Ejemplo 10. Ensayo in vivo de Steelman-Pohley

Para demostrar que el contenido creciente en ácido si�lico en FSH produce un efecto biológico aumentado, se examin� el aumento en los pesos ováricos en ratas por FSH altamente sialilada tal como la producida en el ejemplo

5.

El aumento en los pesos ováricos debido a los clones de Per.C6 rFSH se analizó según el método de Steelman y Pohley (1953). Se cuantific� rFSH de Per.C6 de muestras de medio celular filtrado por ELISA (DRG, EIA-1288). Las muestras (rFSH de Per.C6) y estándares (rFSH de Gonal-f) se probaron a cinco dosis diferentes (3 animales/dosis). Gonal-f se administr� a 50, 100, 200, 400 y 800 ng/rata. Las dosis de las muestras se calcularon usando sus valores de AUC relativos a Gonal-f, típicamente 0,005-10 μg/rata.

En conclusión, el material subsialilado producido por los clones Per.C6 FSH parentales (figura 11) no era tan potente en el ensayo de aumento del peso ovárico como la rFSH comercialmente disponible. La manipulación con sialiltransferasa para añadir enlaces α2,6 adicionales aument� el contenido de ácido si�lico pero no mejor� la potencia en el ensayo in vivo (figura 12).

Sin embargo, enlaces α2,3 adicionales mejoraron significativamente la potencia (figura 13) y las dos preparaciones de FSH recombinante (derivadas de Per.C6 y CHO) muestran perfiles muy similares en este ensayo.

Ejemplo 11. Visión de conjunto de la producción y purificación

Se desarroll� un procedimiento para producir FSH en células PER.C6 que se cultivaron en suspensión en medio sin suero. El procedimiento se describe a continuación y se aplicó a varias líneas celulares PER.C6 productoras de FSH.

Se prepar� FSH del clon parental 005, del clon de α2,3 007, y del clon de α2,6 059 usando una modificación del método descrito por Lowry et al. (1976).

Para la producción de PER.C6-FSH, las líneas celulares se adaptaron a un medio sin suero, es decir, Excell 525 (JRH, Biosciences). Las células se cultivaron primero para formar una monocapa confluente al 70%-90% en una botella de cultivo T80. Al pasarlas las células se resuspendieron en el medio sin suero, Excell 525 + L-glutamina 4 mM, a una densidad celular de 0,3x106 células/ml. Se puso una suspensión celular de 25 ml en una botella agitadora de 250 ml y se agit� a 100 rpm a 37�C en CO2 al 5%. Después de alcanzar una densidad celular de > 1x106 células/ml, las células se subcultivaron a una densidad celular de 0,2 o 0,3x106 células/ml y se cultivaron adicionalmente en botellas agitadoras a 37�C, CO2 al 5% y 100 rpm.

Para la producción de FSH, las células se transfirieron a un medio de producción sin suero, es decir, VPRO (JRH, Biosciences), que soporta el crecimiento de células PER.C6 a densidades celulares muy altas (habitualmente > 107 células/ml en un cultivo por lotes). Las células primero se cultivaron a > 1x106 células/ml en Excell 525, después se centrifugaron durante 5 minutos a 1000 rpm y posteriormente se resuspendieron en medio VPRO + L-glutamina 6 mM a una densidad de 1x106 células/ml. Las células se cultivaron después en una botella agitadora durante 7-10 días a 37�C, CO2 al 5% y 100 rpm. Durante este periodo, las células crecieron a una densidad > 107 células/ml. El medio de cultivo se recogió después de que la viabilidad celular empezara a decaer. Las células se centrifugaron durante 5 minutos a 100 rpm y el sobrenadante se us� para la cuantificación y purificación de FSH. La concentración de FSH se determin� usando ELISA (DRG EIA 1288).

Despu�s de ello, la purificación de FSH se llev� a cabo usando una modificación del método descrito por Lowry et al. (1976). Esto se logr� por cromatograf�a en DEAE celulosa, filtración en gel en Sephadex G100, cromatograf�a de adsorción en hidroxiapatita, y electroforesis en poliacrilamida preparativa.

Durante todos los procedimientos cromatogr�ficos, la presencia de FSH inmunorreactiva se confirm� por RIA (DRG EIA 1288) e IEF (ejemplo 6).

Referencias

Andersen CY, Westergaard LG, y van Wely M. (2004). FSH isoform composition of commercial gonadotrophin preparations: a neglected aspect? Reprod Biomed Online. 9(2), 231-236.

Arey BJ, Stevis PE, Deecher DC, Shen ES, Frail DE, Negro-Vilar A, y Lopez FJ. (1997) Induction of promiscuous G protein coupling of the follicle-stimulating hormone (FSH) receptor: a novel mechanism for transducing pleiotropic actions of FSH isoforms. Mol Endocrinol. 11(5), 517-526.

Baenziger JU y Green ED. (1988). Pituitary glycoprotein hormone oligosaccharides: structure, synthesis and function of the asparagine-linked oligosaccharides on lutropin, follitropin and thyrotropin. Biochim Biophys Acta. 947(2),287

306.

Bassett RM, y Driebergen R. (2005). Continued improvements in the quality and consistency of follitropin alfa, recombinant human FSH. Reprod Biomed Online. 10(2), 169-177.

Dami�n-Matsumura P, Zaga V, Maldonado A, Sánchez-Hernández C, Timossi C, y Ulloa-Aguirre A. (1999). Oestrogens regulate pituitary alpha2,3-sialyltransferase messenger ribonucleic acid levels in the female rat. J Mol Endocrinol. 23(2), 153-165.

5 D'Antonio M., Borrelli F. , Datola A., Bucci R. , Mascia M. , Polletta P., Piscitelli D., y Papoian R. (1999) Biological characterization of recombinant human follicle stimulating hormone isoforms. Human Reproduction 14, 1160-1167

Dalpathado DS, Irungu J, Go EP, Butnev VY, Norton K, Bousfield GR, y Desaire H. (2006). Comparative glycomics of the glycoprotein folliclestimulating hormone: glycopeptide analysis of isolates from two mammalian species. Biochemistry. 45(28), 8665-8673. Sin copia

Dias JA, Van Roey P. (2001). Structural biology of human follitropin and its receptor. Arch Med Res. 32(6), 510-519

Fiddes, J. C. y Goodman, H. M. (1979) Isolation, cloning and sequence analysis of the cDNA for the alpha-subunit of 15 human chorionic gonadotropin. Nature, 281, 351-356.

Flack, M.R., Bennet, A.P., Froehlich, J. Anasti, JN y Nisula, B. (1994). Increased biological activity due to basic isoforms in recombinant human follicle-stimulating hormone produced in a human cell line. J. Clin. Endocrinol. Metab., 79, 756-760

Fox KM, Dias JA, y Van Roey P. (2001). Three-dimensional structure of human follicle-stimulating hormone. Mol Endocrinol. 15(3), 378-89

Grabenhorst E, Hoffmann A, Nimtz M, Zettlmeissl G, y Conradt HS. (1995). Construction of stable BHK-21 cells

25 coexpressing human secretory glycoproteins and human Gal(beta 1-4)GIcNAc-R alpha 2,6-sialyltransferase alpha 2,6-linked NeuAc is preferentially attached to the Gal(beta 1-4)GIcNAc(beta 1-2)Man(alpha 1-3)-branch of diantennary oligosaccharides from secreted recombinant beta-trace protein. Eur J Biochem. 232(3), 718-25.

Green ED y Baenziger JU. (1988). Asparagine-linked oligosaccharides on lutropin, follitropin, and thyrotropin. II. Distributions of sulfated and sialylated oligosaccharides on bovine, ovine, and human pituitary glycoprotein hormones. J Biol Chem. 263(1), 36-44.

Grundmann,U., Nerlich,C., Rein,T. y Zettlmeissl, G. (1990). Complete cDNA sequence encoding human betagalactoside alpha-2,6-sialyltransferase. G Nucleic Acids Res. 18 (3), 667

35 Howles, C.M. (1996). Genetic engineering of human FSH (Gonal-F). Hum Reprod. Update, 2,172-191.

Kagawa Y, Takasaki S, Utsumi J, Hosoi K, Shimizu H, Kochibe N, y Kobata A. (1988). Comparative study of the asparagine-linked sugar chains of natural human interferon-beta 1 and recombinant human interferon-beta 1 produced by three different mammalian cells. J Biol Chem. 263(33), 17508-17515.

Keene, J.L., Matzuk, M.M., Otani, T., Fauser, B,C,J,M., Galway, A.B., Hsueh, A.J.W. y Boime, I. (1989). Expression of Biologically active Human Follitropin in Chinese Hamster Ovary Cells. The Journal of Biological Chemistry, 264(9), 4769-4775.

45 Kitagawa,H. y Paulson,J.C (1994) Cloning of a novel alpha 2,3-sialyltransferase that sialylates glycoprotein and glycolipid carbohydrate groups. J. Biol. Chem. 269(2), 1394-1401.

Lee EU, Roth J, y Paulson JC (1989) Alteration of terminal glycosylation sequences on N-linked oligosaccharides of Chinese hamster ovary cells by expression of beta-galactoside alpha 2,6-sialyltransferase. J Biol Chem. 264(23), 13848-13855.

de Leeuw, R., Mulders, J., Voortman, G. Rombout, F. Darnm, J. y Kloosterboer, L. (1996) Structure-function relationship of recombinant follicle stimulating hormone (Puregon). Mol. Hum. Reprod., 2, 361-369.

55 Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ. (1951) Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem. 193(1), 265-75.

Lowry, PJ, McLean, C, Jones RL y Satgunasingam N. (1976) Purification of anterior pituitary and hypothalamic hormones Clin Pathol Suppl (Assoc Clin Pathol). 7, 16-21.

Pierce JG, y Parsons TF (1981) Glycoprotein hormones: structure and function Annu Rev Biochem. 50, 465-495.

Pricer WE Jr, y Ashwell G. (1971). The binding of desialylated glycoproteins by plasma membranes of rat liver. J Biol 65 Chem. 246(15), 4825-33.

Rathnam P, y Saxena BB. (1975). Primary amino acid sequence of follicle-stimulating hormone from human pituitary glands. I. alpha subunit. J Biol Chem.;250(17):6735-6746.

Regoeczi E, Debanne MT, Hatton MC, y Koj A. (1978) Elimination of asialofetuin and asialoorosomucoid by the intact 5 rat. Quantitative aspects of the hepatic clearance mechanism. Biochim Biophys Acta. 541(3), 37284.

Royle L, Radcliffe CM, Dwek RA y Rudd PM (2006) Methods in Molecular Biology, ed I Brockhausen-Schutzbach (Humana Press), 347: Glycobiology protocols, 125-144.

Ryan RJ, Keutmann HT, Charlesworth MC, McCormick DJ, Milius RP, Calvo FO y Vutyavanich T. (1987). Structurefunction relationships of gonadotropins. Recent Prog Horm Res.;43,:383-429.

Saxena BB y Rathnam P. (1976) Amino acid sequence of the beta subunit of follicle-stimulating hormone from human pituitary glands. J Biol Chem. 251(4), 993-1005

15 Steelman SL, y Pohley FM. (1953) Assay of the follicle stimulating hormone based on the augmentation with human chorionic gonadotropin. Endocrinology. 53(6), 604-616.

Steer CJ, y Ashwell G. (1980) Studies on a mammalian hepatic binding protein specific for asialoglycoproteins. Evidence for receptor recycling in isolated rat hepatocytes. J Biol Chem. 255(7), 3008-13.

Svensson EC, Soreghan B, y Paulson JC. (1990) Organization of the beta-galactoside alpha 2,6-sialyltransferase gene. Evidence for the transcriptional regulation of terminal glycosylation. J Biol Chem. 265(34):20863-20868.

25 Takeuchi M, Takasaki S, Miyazaki H, Kato T, Hoshi S, Kochibe N, y Kobata A (1988). Comparative study of the asparagine-linked sugar chains of human erythropoietins purified from urine and the culture medium of recombinant Chinese hamster ovary cells. J Biol Chem. 263(8), 3657-3663.

Timossi CM, Barrios de Tomasi J, Zambrano E, González R, Ulloa-Aguirre A. (1998). A naturally occurring basically charged human follicle-stimulating hormone (FSH) variant inhibits FSH-induced androgen aromatization and tissuetype plasminogen activator enzyme activity in vitro. Neuroendocrinology. 67(3), 153-163.

Timossi CM, Barrios-de-Tomasi J, González-Su�rez R, Arranz MC, Padmanabhan V, Conn PM, y Ulloa-Aguirre A. (2000). Differential effects of the charge variants of human follicle-stimulating hormone. J Endocrinol. 165(2), 193

35 205.

Ulloa-Aguirre, A., Espinoza, R., Damian-Matsumura, P. y Chappel, S.C. (1988) Immunological and biological potencies of the different molecular species of gonadotrophins. Hum. Reprod. 3, 491-501.

Ulloa-Aguirre, A., Cravioto, A., Dami�n-Matsumura, P. Jimenez, M, Zambrano, E y Diaz-Sanchez, V. (1992) Biological characterization of the naturally occurring analogues of intrapituitary human follicle stimulating hormone. Hum. Reprod. 7, 23-30.

Ulloa-Aguirre A, Midgley AR Jr, Beitins IZ, y Padmanabhan V. (1995). Follicle-stimulating isohormones: 45 characterization and physiological relevance. Endocr Rev.16(6), 765-787.

Ulloa-Aguirre A, Maldonado A, Dami�n-Matsumura P, y Timossi C (2001). Endocrine regulation of gonadotropin glycosylation. Arch Med Res. 32(6), 520-532.

Ulloa-Aguirre A, Timossi C, Barrios-de-Tomasi J, Maldonado A, y Nayudu P. (2003). Impact of carbohydrate heterogeneity in function of follicle-stimulating hormone: studies derived from in vitro and in vivo models. Biol Reprod. 69(2), 379-389.

Van Lenten L, y Ashwell G. (1972) The binding of desialylated glycoproteins by plasma membranes of rat liver. 55 Development of a quantitative inhibition assay. J Biol Chem. 247(14), 4633-40.

Wide, L. y Albertsson-Wikland, K. (1990) Change in electrophoretic mobility of human follicle-stimulating hormone in serum after administration of gonadotropin-releasing hormone. J. Clin. Endocrinol. Metab. 70, 271-276.

Wide, L. y Bakos, O. (1993). More basic forms of both human follicle-stimulating hormone and luteinizing hormone in serum at midcycle compared with the follicular or luteal phase. J. Clin. Endocrinol. Metab., 76, 885-889.

Wide L, Naess�n T, Sundstr�m-Poromaa I, Eriksson K. (2007) Sulfonation and sialylation of gonadotropins in women during the menstrual cycle, after menopause, and with polycystic ovarian syndrome and in men. J Clin Endocrinol

65 Metab.;92(11), 4410-4417.

Zambrano E, Zari��n T, Olivares A, Barrios-de-Tomasi J, y Ulloa-Aguirre A. (1999). Receptor binding activity and in vitro biological activity of the human FSH charge isoforms as disclosed by heterologous and homologous assay systems: implications for the structure-function relationship of the FSH variants. Endocrine. 10(2), 113-121.

5 Zhang X, Lok SH, y Kon OL (1998) Stable expression of human alpha2,6-sialyltransferase in Chinese hamster ovary cells: functional consequences for human erythropoietin expression and bioactivity. Biochim Biophys Acta. 1425(3), 441-452.

Listado de secuencias

10 SEQ ID 1

Polip�ptido alfa de la hormona foliculoestimulante

N�mero de acceso AH007338

15 Secuencia de nucleótidos de FSH alfa

20 Secuencia de proteína de FSH alfa

SEQ ID 2

Polip�ptido beta de la hormona foliculoestimulante Número de acceso NM_000510

30 Secuencia de nucleótidos de FSH beta

Secuencia de proteína de FSH beta

SEQ ID 3

Beta-galact�sido alfa-2,3-sialiltransferasa 4 Número de acceso L23767 Secuencia de nucleótidos de ST3GAL4

Secuencia de proteína de ST3GAL4

SEQ ID 4

Beta-galact�sido alfa-2,6-sialiltransferasa 1 Número de acceso NM_003032 Secuencia de nucleótidos de ST6GAL1

0p- Secuencia de proteína de ST6GAL1

Claims (5)

1. REIVINDICACIONES

   1. FSH recombinante (rFSH) que incluye sialilaci�n en α2,3 y α2,6 en donde el 60% o más de la sialilaci�n total es sialilaci�n en α2,3 y desde el 5 al 40% de la sialilaci�n total es sialilaci�n en α2,6; en donde la FSH

   5 recombinante tiene un contenido en ácido si�lico [expresado en términos de una proporción de moles de ácido si�lico respecto a moles de proteína] de 10 mol/mol a 15 mol/mol.
2. 2. FSH recombinante según la reivindicación 1 que incluye además sialilaci�n en α2,8.

   10 3. Una composición farmacéutica que comprende rFSH que incluye sialilaci�n en α2,3 y α2,6 en donde el 60% o más de la sialilaci�n total es sialilaci�n en α2,3 y desde el 5 al 40% de la sialilaci�n total es sialilaci�n en α2,6; y que tiene un contenido en ácido si�lico [expresado en términos de una proporción de moles de ácido si�lico respecto a moles de proteína] de 10 mol/mol a 15 mol/mol.

   15 4. Una composición farmacéutica que comprende rFSH según la reivindicación 2.

3. 5. Una composición farmacéutica según la reivindicación 3 o 4 que comprende además hCG y/o LH.
4. 6. Una composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5 para su uso en el tratamiento de 20 la infertilidad.
5. 7. Un método de producción de rFSH según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 que comprende el paso de producir o expresar la rFSH en una línea celular humana.

   Figuras 1, 2 y 3: Mapas plasm�dicos de los vectores de expresión pFSHalfa/beta, pST3 y pST6. CMV = promotor del citomegalovirus, BGHp(A) = secuencia de poliadenilaci�n de la hormona de crecimiento bovina, f1 ori = origen de replicaci�n f1, SV40 = promotor del virus simio 40, Neo = marcador de resistencia a neomicina, Hyg = marcador de resistencia a higromicina, SV40 p(A) = secuencia de poliadenilaci�n del virus simio 40, FSH A = polip�ptido alfa de la hormona foliculoestimulante, FSH B = polip�ptido beta de la hormona foliculoestimulante, ST3GAL4 = α2,3sialiltransferasa, ST6GAL1 = α2,6-sialiltransferasa, ColE1 = origen de replicaci�n ColE1, Amp = marcador de resistencia a ampicilina.

   Figura 1. Vector de expresión de FSH

   Figura 2. Vector de expresión de α2,3-sialiltransferasa (ST3GAL4)

   Figura 3. Vector de expresión de α2,6-sialiltransferasa (ST6GAL1)

   Figura 4. Isoelectroenfoque de FSH recombinante producida por células Per.C6 que expresan establemente FSH. Sobrenadantes de cultivos celulares separados en condiciones nativas en un gradiente de pH de 3,0-7,0. El clon 005 es representativo de los cinco clones con los que se avanza para la manipulación de sialiltransferasa. Los clones que contienen formas menos ácidas se desecharon.

   Figura 5. Ejemplo de clones analizados por isoelectroenfoque de FSH recombinante producida por células Per.C6 que expresan establemente FSH después de manipularlas con α2,3-o α2,6-sialiltransferasa. Sobrenadantes de cultivos celulares separados en condiciones nativas en un gradiente de pH de 3,0-7,0. El clon 005 es la línea Per.C6 FSH parental. Los clones que muestran perfiles básicos o mezcla se abandonaron (*). Los clones restantes demostraron manipulación exitosa con una sialiltransferasa para aumentar el número de moléculas de ácido si�lico en FSH.

   Figura 6. Análisis de los enlaces de ácido si�lico de FSH de Per.C6. FSH de Per.C6 se separ� por SDS PAGE en geles duplicados, se transfirió a nitrocelulosa y se visualizó usando el kit DIG Glycan Differentiation (No. de catálogo 11 210 238 001, Roche) según las instrucciones del fabricante. Las reacciones positivas con aglutinina de Sambucus nigra (SNA) indicaban ácido si�lico unido en (2-6) terminalmente (A). Las reacciones positivas con aglutinina de Maackia amurensis (MAA): indicaban ácido si�lico unido en (2-3) terminalmente (B). Carril I control del fabricante que contiene enlaces α2,6 solo. Carril II control del fabricante que contiene enlaces α2,6 y α2,3. Muestra a, FSH recombinante derivada de CHO comercial (Gonal-f, Serono). Muestra b, Per.C6 rFSH parental, sin manipulación de sialiltransferasa. Muestra c, Per.C6 rFSH con manipulación de α2,6-sialiltransferasa. Muestra d, Per.C6 rFSH con manipulación de α2,3-sialiltransferasa

   A

   B

   Figura 7. índices de depuración metabólica de muestras de Per.C6 FSH. Se inyectaron ratas hembra (3 animales por clon) en la vena de la cola en el tiempo cero con una inyección intravenosa rápida de rFSH (1-10 μg/rata). Se ensay� el contenido de FSH en las muestras de sangre recogidas a lo largo del tiempo mediante ELISA.

   Figura 8. índices de depuración metabólica de muestras de Per.C6 FSH manipuladas con α2,6-sialiltransferasa. Se inyectaron ratas hembra (3 animales por clon) en la vena de la cola en el tiempo cero con una inyección intravenosa rápida de rFSH (1-10 μg/rata). Se ensay� el contenido de FSH en las muestras de sangre recogidas a lo largo del tiempo mediante ELISA.

   Figura 9. índices de depuración metabólica de muestras de Per.C6 FSH manipuladas con α2,6-sialiltransferasa con coadministraci�n de un exceso molar de 7500 veces de asialofetu�na para saturar el ASGP-R durante 1-2 horas.

   Figura 10. índices de depuración metabólica de muestras de Per.C6 FSH manipuladas con α2,3-sialiltransferasa. Las muestras se eligieron por su contenido en ácido si�lico basado en su perfil IEF.

   Figura 11. Aumento de peso ovárico según el método de Steelman y Pohley (1953). Se probaron Per.C6 rFSH y estándares (rFSH Gonal-f) a diferentes dosis (3 ratas/dosis).

   Figura 12. Aumento de peso ovárico según el método de Steelman y Pohley (1953). Se probaron Per.C6 rFSH manipulada con α2,6-sialiltransferasa y estándares (rFSH Gonal-f) a diferentes dosis (3 ratas/dosis).

   Figura 13. Aumento de peso ovárico según el método de Steelman y Pohley (1953). Se probaron Per.C6 rFSH parental, Per.C6 rFSH manipulada con α2,3-sialiltransferasa y estándares (rFSH Gonal-f) a cinco diferentes dosis (3 ratas/dosis).