ES2833533T3 - FSH recombinante que incluye sialilación alfa 2,3 y alfa 2,6 - Google Patents

Abstract

FSH recombinante (rFSH) que incluye sialilación α2,3 y α2,6, en la que de 10% a 20% de la sialilación total es sialilación α2,6.

Description

DESCRIPCIÓN

FSH recombinante que incluye sialilación a 2,3 y a 2,6

La presente invención se refiere a gonadotropinas para uso en el tratamiento de la infertilidad. En particular, se refiere a la hormona estimulante del folículo (FSH).

Las gonadotropinas son un grupo de hormonas glicoproteínicas heterodiméricas que regulan la función gonadal en el macho y la hembra. Incluyen la hormona estimulante del folículo (FSH), la hormona luteinizante (LH) y la gonadotropina coriónica (CG).

FSH es segregada de forma natural por la hipófisis anterior, y funciona para apoyar el desarrollo folicular y la ovulación. FSH comprende una subunidad alfa de 92 aminoácidos, también común a las otras hormonas glicoproteínicas LH y CG, y una subunidad beta de 111 aminoácidos, exclusiva de FSH, que confiere la especificidad biológica de la hormona (Pierce y Parsons, 1981). Cada subunidad se modifica postraduccionalmente mediante la adición de restos de hidratos de carbono complejos. Ambas subunidades portan 2 sitios para unión de glucano unido en N, la subunidad alfa en los aminoácidos 52 y 78 y la subunidad beta en los restos de aminoácidos 7 y 24 (Rathnam y Saxena, 1975, Saxena y Rathnam, 1976). De este modo, FSH está glicosilada hasta alrededor de 30 % en masa (Dias y Van Roey.

2001. Fox et al. 2001).

Durante muchos años, FSH purificada de orina humana posmenopáusica se ha usado en el tratamiento de la infertilidad; tanto para fomentar la ovulación en la reproducción natural como para proporcionar ovocitos para tecnologías de reproducción asistida. A mediados de la década de 1990 estuvieron disponibles dos versiones recombinantes de FSH, Gonal-F (Serano) y Puregon (Organon). Éstas se expresan en células de ovario de hámster chino (CHO) (Howles, 1996).

Hay considerable heterogeneidad asociada con las preparaciones de FSH, que se relaciona con diferencias en las cantidades de diversas isoformas presentes. Las isoformas individuales de FSH presentan secuencias de aminoácidos idénticas, pero se diferencian en el grado hasta el que están modificadas postraduccionalmente; las isoformas particulares se caracterizan por la heterogeneidad de las estructuras de las ramificaciones de los hidratos de carbono y las diferentes cantidades de incorporación de ácido siálico (un azúcar terminal), las cuales parecen influir la bioactividad de la isoforma específica.

La glicosilación de FSH natural es muy compleja. Los glucanos en la FSH hipofisaria de procedencia natural pueden contener una amplia gama de estructuras que pueden incluir combinaciones de glucanos bi-, tri- y tetraantenarios (Pierce y Parsons, 1981. Ryan et al., 1987. Baenziger y Green, 1988). Los glucanos pueden portar modificaciones adicionales: fucosilación del núcleo, glucosamina bisecante, cadenas extendidas con acetil lactosamina, sialilación parcial o completa, sialilación con enlaces a2,3 y a2,6, y galactosamina sulfatada sustituida por galactosa (Dalpathado et al., 2006). Además, hay diferencias entre las distribuciones de las estructuras de glucano en los sitios de glicosilación individuales. Se ha encontrado un nivel comparable de complejidad de glucanos en FSH procedente del suero de individuos y de la orina de mujeres posmenopáusicas (Wide et al., 2007).

La glicosilación de productos de FSH recombinante refleja la gama de glicosiltransferasas presentes en la línea celular hospedante. Los productos de rFSH existentes proceden de células de ovario de hámster chino (células CHO) manipuladas. La gama de modificaciones de glucano en rFSH procedente de CHO es más limitada que las encontradas en los productos naturales, procedentes de extractos hipofisarios o bien de orina. Los ejemplos de la reducida heterogeneidad de glucanos encontrada en rFSH procedente de CHO incluyen una falta de glucosamina bisecante y un contenido reducido de fucosilación del núcleo y extensiones de acetil-lactosamina (Hard et al., 1990). Además, las células CHO solo son capaces de añadir ácido siálico usando el enlace a2,3 (Kagawa et al., 1988, Takeuchi et al, 1988, Svensson et al., 1990). Esto es diferente de la FSH producida de forma natural, que contiene glucanos con una mezcla de ácido siálico enlazado a2,3 y a2,6.

Se ha demostrado que una preparación de FSH recombinante (Organon) se diferencia en las cantidades de FSH con un punto isoeléctrico (pl) por debajo de 4 (consideradas las isoformas ácidas) cuando se compara con FSH hipofisaria, sérica o de orina posmenopáusica (Ulloa-Aguirre et al., 1995). La cantidad de isoformas ácidas en las preparaciones urinarias fue mucho mayor en comparación con los productos recombinantes, Gonal-f (Serano) y Puregon (Organon) (Andersen et al., 2004). Esto ha de reflejar un contenido molar menor de ácido siálico en la rFSH, ya que el contenido de glucano cargado negativamente modificado con sulfato es bajo en FSH. El menor contenido de ácido siálico, comparado con la FSH natural, es una característica de ambos productos de FSH disponibles comercialmente, y por tanto ha de reflejar una limitación en el procedimiento de fabricación (Bassett y Driebergen, 2005).

Existe un gran volumen de trabajo científico que analiza e intenta explicar las variaciones en la glicosilación de FSH entre individuos y los cambios durante el transcurso de un ciclo de ovulación. Una de las discusiones principales se refiere a la observación de que tanto la concentración de FSH como el contenido de ácido siálico disminuyen durante la fase preovulatoria del ciclo. El menor contenido de ácido siálico da como resultado una FSH más básica, que tanto se depura más rápidamente como, al menos in vitro, es más potente en el receptor diana (Zambrano et al., 1996). La pregunta en cuanto a la importancia biológica de estos cambios y cómo pueden estar implicados en la selección del folículo dominante permanece sin resolver (revisado por Ulloa-Aguirre, 2003).

Se ha documentado el tiempo de vida circulatoria de la FSH para materiales de una variedad de fuentes. Algunos de estos materiales se han fraccionado basándose en la carga molecular total, según se caracterizan por su pl, en los que más ácido equivale a mayor carga negativa. Como se ha afirmado previamente, el principal contribuyente a la carga molecular global es el contenido total de ácido siálico de cada molécula de FSH. Por ejemplo, rFSH (Organon) tiene un contenido de ácido siálico de alrededor de 8 mol/mol, mientras que la FSH procedente de orina tiene un contenido mayor de ácido siálico (de Leeuw et al., 1996). Las velocidades de eliminación plasmática correspondientes en la rata son 0,34 y 0,14 ml/min (Ulloa-Aguirre et al., 2003). En otro ejemplo en el que una muestra de FSH recombinante se separó en fracciones de alto y bajo pl, la potencia in vivo de la fracción de pl alto (menor contenido de ácido siálico) disminuyó, y tuvo una semivida plasmática más corta (D'Antonio et al., 1999). También se ha dado a conocer que la FSH más básica que circula durante los últimos estadios del ciclo de ovulación se debe a la disminución de la a2,3 sialiltransferasa en la hipófisis anterior que se produce por el aumento de los niveles de estradiol (Damian-Matsumara et al. 1999. Ulloa-Aguirre et al. 2001). No se han dado a conocer resultados para la a2,6 sialiltransferasa.

El contenido total de ácido siálico de la FSH y rFSH no es directamente comparable, ya que los ácidos siálicos se unen comúnmente de dos maneras. La FSH hipofisaria/sérica/urinaria contiene ácido siálico enlazado tanto a2,3 como a2,6, con un predominio del primero. Sin embargo, los recombinantes procedentes de células CHO solo contienen a2,3 (Kagawa et al, 1988, Takeuchi et al, 1988, Svensson et al., 1990). Esta es otra diferencia entre los productos naturales y los recombinantes actuales, además del menor contenido total de ácido siálico de los últimos.

Las células CHO se usan comúnmente para la producción de proteínas recombinantes humanas farmacéuticas. Un análisis estructural ha identificado que el ácido siálico está unido exclusivamente por un enlace a2,3 (Kagawa et al, 1988, Takeuchi et al, 1988, Svensson et al., 1990). Muchas glicoproteínas humanas contienen una mezcla de enlaces tanto a2,3 como a2,6. Por lo tanto, las proteínas recombinantes expresadas usando el sistema de CHO se diferenciarán de sus homologas naturales en su tipo de enlaces de ácido siálico terminales. Ésta es una consideración importante en la producción de productos biológicos para uso farmacéutico, ya que los restos de hidrato de carbono pueden contribuir a los atributos farmacológicos de la molécula.

Es deseable tener un producto de rFSH que replique o mimetice más estrechamente el perfil fisicoquímico y farmacocinético del producto producido a partir de orina humana. Es deseable tener un producto de rFSH que tenga propiedad o propiedades farmacocinéticas mejoradas en comparación con el producto recombinante conocido.

Según la presente invención, se proporciona FSH recombinante (“rFSH” o “recFSH”) que incluye sialilación a2,3 y sialilación a2,6, en la que 10% a 20% de la sialilación total es sialilación a2,6. La rFSH (o preparación de rFSH) de la invención puede tener 5% o menos de la sialilación total que es sialilación a2,8, por ejemplo, 0,1-4% de la sialilación total puede ser sialilación a2,8. La rFSH (o preparación de rFSH) según la invención puede tener un contenido de ácido siálico [expresado en términos de una relación de moles de ácido siálico a moles de proteína] de 6 mol/mol o mayor, por ejemplo de entre 6 mol/mol y 15 mol/mol.

Los solicitantes han encontrado que el tipo de enlace de ácido siálico, a2,3 o a2,6, puede tener una influencia drástica en la eliminación biológica de FSH. Las líneas celulares humanas, en contraposición a las líneas celulares de CHO, pueden expresar FSH recombinante con ácidos siálicos unidos por enlaces tanto a2,3 como a2,6. En el Ejemplo 4 se obtuvo una línea celular de FSH recombinante que expresaba FSH que contenía glucanos con bajos niveles de ácido siálico unidos tanto a2,3 como a2,6 (Figura 6). Este material básico, con contenido limitado de ácido siálico (Figura 4) se aclaró de forma muy rápida de la circulación en rata como sería predecible (Figura 7). La línea celular se sometió entonces a una segunda etapa de modificación con la adición del gen que codifica la a2,6-sialiltransferasa (Ejemplo 5). La rFSH resultante estaba altamente sialilada, mostrando un contenido de ácido siálico y distribución de pl comparables con la FSH urinaria (Figura 5). Sin embargo, el material se aclaró muy rápidamente de la circulación de ratas, a una velocidad comparable al material original que tenía bajo contenido de ácido siálico (Figura 8). Esto fue una observación inesperada, ya que se sabe que una proporción de ácido siálico en la FSH natural y biológicamente activa está enlazado a2,6. Se encontró que la eliminación de rFSH sialilada a2,6 estaba mediada por el receptor de asialoglicoproteína (ASGP) que se encuentra en el hígado (Ejemplo 9). Esto se demostró por el bloqueo transitorio de los receptores de ASGP usando un exceso de otro sustrato para el receptor. Con el receptor bloqueado por asialofetuína, se restableció la eliminación esperada para el material altamente sialilado (Figura 9). Esto se mantuvo durante varias horas hasta que se terminó el bloqueo, y la rFSH altamente sialilada enlazada a2,6 reanudó su rápida eliminación.

La FSH recombinante, con una mezcla de ácido siálico enlazado tanto a2,3 como a2,6, se obtuvo modificando por ingeniería una línea celular humana para que exprese tanto rFSH como a2,3-sialiltransferasa (Ejemplos 4 y 5). El producto expresado es muy ácido, y porta una mezcla de ácidos siálicos enlazados tanto a2,3 como a2,6; este último proporcionado por la actividad de sialiltransferasa endógena (Figura 6). Esto tiene dos ventajas con respecto a rFSH expresada en células CHO convencionales: en primer lugar, el material está más altamente sialilado debido a las actividades combinadas de las dos sialiltransferasas; y en segundo lugar, el material se parece más estrechamente a la FSH natural. Es probable que esto sea biológicamente más apropiado en comparación con los productos recombinantes procedentes de células CHO que producen solo ácido siálico enlazado a2,3 (Kagawa et al, 1988, Takeuchi et al, 1988, Svensson et al., 1990) y tienen menor contenido de ácido siálico (Ulloa-Aguirre et al., 1995, Andersen et al., 2004).

Los solicitantes han encontrado sorprendentemente que la rFSH de la invención puede replicar o mimetizar más estrechamente el perfil fisicoquímico y farmacocinético del producto urinario humano natural que otros productos recombinantes. En otras palabras, la rFSH de la invención puede ser más cercana a la FSH “natural”. Esto puede tener ventajas significativas con respecto a la dosificación, etc. Además, un producto más “natural” o más “humano” puede ser más deseable para el paciente, que puede desear que la terapia, aunque en un sentido artificial, sea tan “natural” como sea posible. Puede haber otras ventajas (por ejemplo, ventajas farmacocinéticas) en un producto recombinante que tiene estructura de hidrato de carbono (por ejemplo, glucano) que es más cercana a la FSH natural (por ejemplo, urinaria humana) que otros productos recombinantes.

De este modo, la invención es una versión recombinante de FSH que porta una mezcla de ácido siálico a2,3 y a2,6, y por tanto se parece más estrechamente a la FSH natural. Se espera que el uso de este compuesto para la estimulación ovárica controlada, en técnicas de FIV, y la inducción de la ovulación dé como resultado una estimulación más natural del ovario en comparación con productos recombinantes existentes.

Según la presente invención, se proporciona FSH recombinante (“rFSH” o “recFSH”) (y/o una preparación de FSH recombinante) que incluye sialilación a2,3 y a2,6, en la que de 10% a 20% de la sialilación total es sialilación a2,6. La rFSH o preparación de rFSH puede incluir opcionalmente además sialilación a2,8.

Aquí, la expresión “preparación de FSH recombinante” incluye una preparación para, por ejemplo, uso farmacéutico, que incluye FSH recombinante. En realizaciones de la invención, la rFSH puede estar presente como una única isoforma o como una mezcla de isoformas.

La rFSH (o preparación de rFSH) según la invención puede tener un contenido de ácido siálico [expresado en términos de una relación de moles de ácido siálico a moles de proteína] de 6 mol/mol o mayor (Ejemplo 8), por ejemplo entre 6 mol/mol y 15 mol/mol, por ejemplo entre 8 mol/mol y 14 mol/mol, por ejemplo entre 10 mol/mol y 14 mol/mol, por ejemplo entre 11 mol/mol y 14 mol/mol, por ejemplo entre 12 mol/mol y 14 mol/mol, por ejemplo entre 12 mol/mol y 13 mol/mol. La rFSH de la invención puede producirse o expresarse en una línea celular humana.

La rFSH (o preparación de rFSH) según la invención puede tener 80% o más de la sialilación total que es sialilación a2,3. La rFSH (o preparación de rFSH) de la invención puede tener 5% o menos de la sialilación total que es sialilación a2,8. Por ejemplo, 2,5% o menos de la sialilación total puede ser sialilación a2,8. La rFSH (o preparación de rFSH) puede incluir sialilación a2,8 en una cantidad que es de 0,1 a 4% de la sialilación total, por ejemplo de 0,5 a 3% de la sialilación total, por ejemplo de 0,5 a 2,5% de la sialilación total. Por sialilación se entiende la cantidad de restos siálicos presentes en las estructuras de hidratos de carbono de FSH. Sialilación a2,3 significa sialilación en la posición 2,3 (como es bien conocido en la técnica), y sialilación a2,6, en la posición 2,6 (también bien conocido en la técnica). De este modo, “% de la sialilación total puede ser sialilación a 2,3” se refiere al % del número total de restos de ácido siálico presentes en la FSH que están sialilados en la posición 2,3. La expresión “% de la sialilación total que es sialilación a2,6” se refiere al % del número total de restos de ácido siálico presentes en la FSH que están sialilados en la posición 2,6.

La rFSH (o preparación de rFSH) según la invención puede tener un contenido de ácido siálico (cantidad de sialilación por molécula de FSH) de (basado en la masa de proteína, en lugar de en la masa de proteína más hidrato de carbono) 6% o mayor (por ejemplo, entre 6% y 15%, por ejemplo entre 7% y 13%, por ejemplo entre 8% y 12%, por ejemplo entre 11% y 15%, por ejemplo entre 12% y 14%) en masa.

La FSH recombinante expresada en células de ovario de hámster chino (CHO) incluye exclusivamente sialilación a2,3 (Kagawa et al, 1988, Takeuchi et al, 1988, Svensson et al., 1990).

La rFSH de la invención se puede producir o expresar en una línea celular humana. Esto puede simplificar (y hacer más eficaz) el método de producción, debido a que la manipulación y el control de, por ejemplo, el medio de crecimiento celular para retener la sialilación puede ser menos crítico que con procedimientos conocidos. El método también puede ser más eficaz porque hay poca rFSH básica producida con respecto la producción de productos de rFSH conocidos; se produce rFSH más ácida, y la separación/eliminación de FSH básica es menos problemática. La rFSH se puede producir o expresar en una línea celular Per.C6, una línea celular procedente de Per.C6, o una línea celular Per.C6 modificada. La línea celular se puede modificar usando a2,3-sialiltransferasa. La línea celular se puede modificar usando a2,6-sialiltransferasa. Como alternativa o adicionalmente, la rFSH puede incluir ácidos siálicos enlazados a2,6 (sialilación a2,6) proporcionados por la actividad de sialiltransferasa endógena [de la línea celular].

La rFSH se puede producir usando a2,3- y/o a2,6-sialiltransferasa. La rFSH se puede producir usando a2,3-sialiltransferasa. La rFSH puede incluir ácidos siálicos enlazados a2,6 (sialilación a2,6) proporcionados por la actividad de sialiltransferasa endógena.

La estructura de rFSH contiene restos de glucanos. La ramificación puede ocurrir con el resultado de que el glucano puede tener 1, 2, 3, 4 o más restos terminales de azúcar o “antenas”, como es bien conocido en la técnica. La rFSH de la invención puede tener glucanos con presencia de sialilación en estructuras monoantenarias y/o diantenarias y/o triantenarias y/o tetraantenarias. La rFSH puede incluir preferiblemente estructuras de glucano monosialiladas, disialiladas, trisialiladas y tetrasialiladas, con cantidades relativas según lo siguiente: 9-15% monosialiladas; 27-30% disialiladas; 30-36% tri-sialiladas, y 25-29% tetrasialiladas (por ejemplo, como se muestra mediante análisis WAX de glucanos cargados, como se expone en el Ejemplo 8 c).

Según la presente invención, en un aspecto adicional, se proporciona una composición farmacéutica que comprende rFSH que incluye sialilación a2,3 y sialilación a2,6 como se expone anteriormente. La composición farmacéutica puede comprender además hCG y/o LH.

hCG se puede obtener por cualquier medio conocido en la técnica. hCG, tal como se usa aquí, incluye hCG humana y recombinante. hCG humana se puede purificar a partir de cualquier fuente apropiada (por ejemplo, orina y placenta) mediante cualquier método conocido en la técnica. Los métodos para expresar y purificar hCG recombinante se conocen bien en la técnica.

LH se puede obtener por cualquier medio conocido en la técnica. LH, como se usa aquí, incluye LH humana y recombinante. LH humana se puede purificar a partir de cualquier fuente apropiada (por ejemplo, orina) mediante cualquier método conocido en la técnica. Los métodos para expresar y purificar LH recombinante son bien conocidos en la técnica.

La composición farmacéutica puede ser para el tratamiento de infertilidad, por ejemplo, para uso en, por ejemplo, tecnologías de reproducción asistida (TRA), inducción de la ovulación, o inseminación intrauterina (IUI). La composición farmacéutica se puede usar, por ejemplo, en indicaciones médicas en las que se usan preparaciones de FSH conocidas. La presente invención también proporciona el uso de rFSH y/o una preparación de rFSH descrita aquí (según aspectos de la invención) para el tratamiento de la infertilidad. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden formular en composiciones bien conocidas para cualquier vía de administración de fármacos, por ejemplo, oral, rectal, parenteral, transdérmica (por ejemplo, tecnología de parches), intravenosa, intramuscular, subcutánea, intrasubesternal, intravaginal, intraperitoneal, local (polvos, pomadas o gotas), o como un aerosol bucal o nasal. Una composición típica comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como una disolución acuosa, excipientes no tóxicos, incluyendo sales y conservantes, amortiguadores y similares, como se describe en Remington's Pharmaceutical Sciences, decimoquinta edición (Matt Publishing Company, 1975), en las páginas 1405 a 1412 y 1461-87, y el Formulario Nacional XIV decimocuarta edición (American Pharmaceutical Association, 1975), entre otros.

Los ejemplos de portadores, diluyentes, disolventes o vehículos farmacéuticos acuosos y no acuosos adecuados incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol, y similares), carboximetilcelulosa y mezclas adecuadas de la misma, aceites vegetales (tales como aceite de oliva), y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo.

Las composiciones de la presente invención también pueden contener aditivos, tales como, pero sin limitarse a, conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes, y agentes dispersantes. También pueden estar incluidos agentes antibacterianos y antifúngicos para prevenir el crecimiento de microbios, e incluyen, por ejemplo, parabeno, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, y similares. Además, puede ser deseable incluir agentes isotónicos, tales como azúcares, cloruro de sodio, y similares.

En algunos casos, para ejercer una acción prolongada, es deseable ralentizar la absorción de FSH (y otros ingredientes activos, si están presentes) de la inyección subcutánea o intramuscular. Esto se puede lograr mediante el uso de una suspensión líquida de material cristalino o amorfo con mala solubilidad en agua. La velocidad de absorción de FSH depende entonces de su velocidad de disolución, que, a su vez, puede depender del tamaño de los cristales y la forma cristalina. Como alternativa, la absorción retrasada de una forma de combinación de FSH administrada por vía parenteral se logra disolviendo o suspendiendo la combinación de FSH en un vehículo oleoso. Las formas inyectables de depósito se pueden obtener formando matrices microencapsuladas de FSH (y otros agentes, si están presentes) en polímeros biodegradables, tales como polilactida-poliglicolida. Dependiendo de la relación de FSH a polímero, y de la naturaleza del polímero particular empleado, se puede controlar la velocidad de liberación de FSH. Los ejemplos de otros polímeros biodegradables incluyen polivinilpirrolidona, poli(ortoésteres), poli(anhídridos), etc. Las formulaciones inyectables de depósito también se preparan atrapando la FSH en liposomas o microemulsiones que son compatibles con tejidos corporales.

Las formulaciones inyectables se pueden esterilizar, por ejemplo, mediante filtración a través de un filtro que retiene bacterias, o incorporando agentes esterilizadores en forma de composiciones estériles sólidas que se pueden disolver o dispersar en agua estéril u otro medio inyectable estéril justo antes de su uso. Las formulaciones inyectables se pueden suministrar en cualquier envase adecuado, por ejemplo, vial, jeringa precargada, cartuchos de inyección, y similares.

Las formulaciones inyectables se pueden suministrar como un producto que tiene composiciones farmacéuticas que contienen FSH (opcionalmente con hCG, LH, etc.). Si hay más de un ingrediente activo (es decir, FSH y, por ejemplo, hCG o LH), estos pueden ser adecuados para su administración por separado o juntos. Si se administran por separado, la administración puede ser secuencial. El producto se puede suministrar en cualquier envase adecuado. Por ejemplo, un producto puede contener un número de jeringas precargadas que contienen FSH, hCG o una combinación tanto de FSH como de hCG, las jeringas se envasan en un envase de blíster u otro medio para mantener la esterilidad. Un producto puede contener opcionalmente instrucciones para usar las formulaciones de FSH y hCG.

El pH y la concentración exacta de los diversos componentes de la composición farmacéutica se ajustan según la práctica rutinaria en este campo. Véase GOODMAN y GILMAN's Th e PHARMACOLOGICAL BASIS FOR THERAPEUTICES, 7a ed. En una realización preferida, las composiciones de la invención se suministran como composiciones para la administración parenteral. Los métodos generales para la preparación de las formulaciones parenterales se conocen en la técnica, y se describen en REMINGTON; THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY, citado anteriormente, en las páginas 780-820. Las composiciones parenterales se pueden suministrar en formulación líquida o como un sólido que se mezclará con un medio inyectable estéril justo antes de la administración. En una realización especialmente preferida, las composiciones parenterales se suministran en forma de unidad de dosificación para la facilidad de la administración y uniformidad de la dosificación.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se describirá ahora con más detalle con referencia a los siguientes Ejemplos y a los dibujos adjuntos, en los que:

la Figura 1 muestra un mapa plasmídico del vector de expresión pFSHalfa/beta;

la Figura 2 muestra el vector de expresión de a2,3-sialiltransferasa (ST3GAL4);

la Figura 3 muestra el vector de expresión de a2,6-sialiltransferasa (ST6GAL1);

la figura 4 muestra el isoelectroenfoque de FSH recombinante producida por células Per.C6 que expresan FSH de forma estable;

la Figura 5 muestra un ejemplo de clones analizados por isoelectroenfoque de FSH recombinante producida por células Per.C6 que expresan FSH de forma estable después de modificarlas por ingeniería con a2,3- o a2,6-sialiltransferasa;

la Figura 6 muestra el análisis de los enlaces de ácido siálico de FSHde Per.C6;

la Figura 7 muestra las velocidades de eliminación metabólica (MCRs) de muestras de FSH de Per.C6;

la Figura 8 muestra las MRCs de muestras de FSH de Per.C6 modificadas por ingeniería con a2,6-sialiltransferasa; la Figura 9 muestra las MRCs de muestras de FSH de Per.C6 modificadas por ingeniería con a2,6-sialiltransferasa; la Figura 10 muestra las MRCs de muestras de FSH de Per.C6 modificadas por ingeniería con a2,3-sialiltransferasa la Figura 11 muestra el aumento del peso ovárico por clones de rFSH de Per.C6 de rFSH de Per.C6 parental, según el método de Steelman y Pohley (1953);

la Figura 12 muestra el aumento de peso ovárico por clones de rFSH de Per.C6 de rFSH de Per.C6 modificada por ingeniaría (a2,6-sialiltransferasa); y

la Figura 13 muestra el aumento de peso ovárico por clones de rFSH de Per.C6 de rFSH de Per.C6 modificada por ingeniería (a2,3-sialiltransferasa).

Selección de secuencias

FSH humana

La región codificante del gen para el polipéptido alfa de FSH Se usó según Fiddes y Goodman (1981). La secuencia está depositada como AH007338, y en el momento de construcción no había otras variantes de esta secuencia de proteína. La secuencia se denomina aquí SEQ ID 1.

La región codificante del gen para el polipéptido beta de FSH se usó según Keene et al (1989). La secuencia está depositada como NM_000510, y en el momento de construcción no había otras variantes de esta secuencia de proteína. La secuencia se denomina aquí SEQ ID 2.

Sialiltransferasa

a2,3-sialiltransferasa - La región codificante del gen para la beta-galactósido alfa-2,3-sialiltransferasa 4 (a2,3-sialiltransferasa, ST3GAL4) se usó según Kitagawa y Paulson (1994). La secuencia está depositada como L23767, y se denomina aquí SEQ ID 3.

a2,6-Sialiltransferasa - La región codificante del gen para la beta-galactosamida alfa-2,6-sialiltransferasa 1 (a2,6-sialiltransferasa, ST6GAL1) se usó según Grundman et al. (1990). La secuencia está depositada como NM_003032, y se denomina aquí SEQ ID 4.

EJEMPLOS

Ejemplo 1. Construcción del vector de expresión de FSH

Las secuencias codificantes del polipéptido alfa de FSH (AH007338, SEQ ID 1) y del polipéptido beta de FSH (NM_003032, SEQ ID 2) se amplificaron mediante PCR usando las combinaciones de cebadores FSHa-fw y FSHarev y FSHb-fw y FSHb-rec respectivamente.

FSHa-fw 5'-CCAGGATCCGCCACCATGGATTACTACAGAAAAATATGC-3'

FSHa-rev 5 '-GGAT GGCT AGCTTAAGATTT GT GATAATAAC-3'

FSHb-fw 5'-CCAGGCGCGCCACCATGAAGACACTCCAGTTTTTC-3'

FSHb-rev 5'-CCGGGTT AACTT ATTATTCTTTCATTTCACCAAAGG-3'

El ADN de FSH beta amplificado resultante se digirió con las enzimas de restricción Ascl y Hpal, y se insertó en los sitios de Ascl y Hpal en el vector de expresión de mamífero dirigido por CMV que porta un marcador de selección de neomicina. De forma similar, el ADN de FSH alfa se digirió con BamHI y Nhel, y se insertó en los sitios BamHI y Nhel en el vector de expresión que ya contiene el ADN del polipéptido beta de FSH.

Se usó el ADN del vector para transformar la cepa DH5a de E. coli. Se recogieron sesenta colonias para amplificación, y cincuenta y siete contenían el vector que contenía tanto FSH alfa como beta. Se seleccionaron veinte de estas para secuenciación, y todas contenían las secuencias correctas según las SEQ ID 1 y SEQ ID 2. Se seleccionó el plásmido pFSH A+B#17 para la transfección (Figura 1).

Ejemplo 2. Construcción del vector de expresión de ST3

Se amplificó la secuencia codificante de beta-galactósido alfa-2,3-sialiltransferasa 4 (ST3, L23767, SEQ ID 3) mediante PCR usando la combinación de cebadores 2,3STfw y 2,3STrev

2,3STfw 5'-CCAGGATCCGCCACCATGTGTCCTGCAGGCTGGAAGC-3'

2,3STrev 5'-TTTTTTTCTTAAGTCAGAAGGACGTGAGGTTCTTG-3'

El ADN de ST3 amplificado resultante se digirió con las enzimas de restricción BamHI y Aflll, y se insertó en los sitios BamHI y Aflll en el vector de expresión de mamífero dirigido por CMV que porta un marcador de resistencia a higromicina. El vector se amplificó como se ha descrito anteriormente, y se secuenció. El clon pST3#1 (Figura 2) contenía la secuencia correcta según la SEQ ID 3, y se seleccionó para transfección.

Ejemplo 3. Construcción del vector de expresión de ST6

Se amplificó la secuencia codificante de beta-galactosamida alfa-2,6-sialiltransferasa 1 (ST6, NM_003032, SEQ ID 4) mediante PCR usando la combinación de cebadores 2,6STfw y 2,6STrev.

2,6STfw 5' -CCAGGAT CCGCCACCATGATTCACACCAACCT GAAG-3'

2,6STrev 5'-TTTTTTTCTTAAGTTAGCAGTGAATGGTCCGG-3'

El ADN de ST6 amplificado resultante se digirió con las enzimas de restricción BamHI y Aflll, y se insertó en los sitios BamHI y Aflll en el vector de expresión de mamífero dirigido por CMV que porta un marcador de resistencia a higromicina. El vector se amplificó como se ha descrito anteriormente, y se secuenció. El clon pST6#11 (Figura 3) contenía la secuencia correcta según SEQ ID 4, y se seleccionó para transfección.

Ejemplo 4. Expresión estable de pFSH A+B en células PER.C6. Transfección, aislamiento y cribado de clones.

Se generaron clones de Per.C6 que producen FSH expresando ambas cadenas polipeptídicas de FSH a partir de un único plásmido (véase el Ejemplo 1).

Para obtener clones estables, un agente de transfección basado en liposomas con el constructo construcción pFSH A+B. Se seleccionaron clones estables en VPRO suplementado con f Cs al 10% y que contiene G418. Tres semanas después de la transfección, los clones resistentes a G418 crecieron. Se seleccionaron un total de 250 clones para aislamiento. Los clones aislados se cultivaron en medio de selección hasta el 70-80% de confluencia. Se evaluó el contenido de proteína FSH de los sobrenadantes usando un ELISA selectivo de FSH, y la actividad farmacológica en el receptor de FSH en la línea celular clonada, usando un ensayo de acumulación de cAMP. Se continuó para la expansión en cultivo en 24 pocillos, 6 pocillos y matraces T80, con los clones (98) que expresaron proteína funcional. Se iniciaron estudios para determinar la productividad y calidad del material de siete clones en matraces T80 para generar material suficiente. Las células se cultivaron en medio suplementado como se ha descrito previamente durante 7 días, y se recogió el sobrenadante. Se determinó la productividad usando el ELISA selectivo de FSH. Se determinó el perfil isoeléctrico del material (Ejemplo 6). En la Figura 4 se muestran muestras representativas. La información del IEF se usó para seleccionar clones para análisis de velocidad de eliminación metabólica (Ejemplo 9). Se seleccionaron clones (005, 104, 179, 223, 144) con suficiente productividad y calidad para la modificación por ingeniería con sialiltransferasa.

Ejemplo 5. El nivel de sialilación aumenta en células que sobreexpresan a2,3- o a2,6-sialiltransferasa. Expresión estable de pST3 o pST6 en células PER.C6 que expresan FSH; transfección, aislamiento y cribado de clones.

Se generaron clones de Per.C6 que producían FSH altamente sialilada expresando a2,3-sialiltransferasa o a2,6-sialiltransferasa a partir de plásmidos separados (véanse los Ejemplos 2 y 3) en células Per.C6 que ya expresan ambas cadenas polipeptídicas de FSH (véase el Ejemplo 4). Se seleccionaron cuatro clones producidos a partir de células PER.C6® como se expone en el Ejemplo 4 para determinar sus características, incluyendo productividad, buen perfil de crecimiento, producción de proteína funcional, y FSH producida que incluía cierta sialilación.

Se generaron clones estables tal como se ha descrito previamente en el Ejemplo 4. Se aislaron, expandieron y ensayaron un total de 202 clones del programa de a2,3-sialiltransferasa y 210 clones del programa de a2,6-sialiltransferasa. El número final de clones para el estudio de a2,3 fue 12, y 30 para el estudio de a2,6.

Los clones de a2,3-sialiltransferasa se adaptaron a medio sin suero y condiciones en suspensión.

Como anteriormente, los clones se ensayaron usando un ELISA selectivo de FSH, la respuesta funcional en una línea celular con receptor de FSH, IEF (Ejemplo 6), velocidad de eliminación metabólica (Ejemplo 9) y análisis de Steelman Pohley (Ejemplo 10). Los resultados se compararon con una FSH recombinante disponible comercialmente (Gonal-f, Serono) y las líneas celulares de Per.C6 de FSH parentales. En la Figura 5 se muestran muestras representativas. Algunos clones no demostraron un aumento de la sialilación, pero se puede ver que la FSH producida por la mayoría de los clones tiene sialilación significativamente mejorada (es decir, de media más isoformas de FSH con números altos de ácidos siálicos) en comparación con FSH expresada sin a2,3- o a2,6-sialiltransferasa.

En conclusión, la expresión de FSH junto con sialiltransferasa en células Per.C6 da como resultado mayores niveles de FSH sialilada en comparación con células que expresan solo FSH.

Ejemplo 6. Análisis del pI de isoformas de FSH producidas por Per.C6 mediante isoelectroenfoque.

La electroforesis se define como el transporte de moléculas cargadas a través de un disolvente mediante un campo eléctrico. La movilidad de una molécula biológica a través de un campo eléctrico dependerá de la fuerza del campo, la carga neta en la molécula, el tamaño y la forma de la molécula, la fuerza iónica y las propiedades del medio a través del cual migran las moléculas.

El isoelectroenfoque (IEF) es una técnica electroforética para la separación de proteínas basada en su pI. El pI es el pH al cual una proteína no tiene carga neta y no migrará en un campo eléctrico. El contenido de ácido siálico de las isoformas de FSH altera ligeramente el punto de pI para cada isoforma, lo cual se puede aprovechar usando esta técnica para visualizar las isoformas de FSH de Per.C6 de cada clon.

Los puntos isoeléctricos de las isoformas de FSH producidas por Per.C6 en sobrenadantes de cultivo celular se analizaron usando isoelectroenfoque. El medio de cultivo celular de los clones de FSH de Per.C6 se produjo como se ha descrito en el Ejemplo 4 y 5.

Las muestras de FSH de Per.C6 se separaron en geles de IEF Novex® que contenían poliacrilamida al 5% en condiciones nativas en un gradiente de pH 3,0-7,0 en una disolución de anfolitos de pH 3,0-7,0.

Las proteínas se transfirieron sobre nitrocelulosa soportada, y se visualizaron usando un anticuerpo monoclonal primario anti-FSHa, un anticuerpo secundario anti-IgG de ratón conjugado con fosfatasa alcalina, y reactivo de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato (BCIP) y nitroazul de tetrazolio (NBT) para visualizar las bandas.

Tal como se indica en las Figuras 4 y 5, las bandas representan isoformas de FSH que contienen diferentes números de moléculas de ácido siálico.

Usando este método, se identificaron clones que producen isoformas de FSH con un número mayor de moléculas de ácido siálico. La modificación por ingeniería con a2,3- o a2,6-sialiltransferasa dio como resultado clones con más ácido siálico y un pI menor.

Ejemplo 7. Análisis de los enlaces de ácido siálico de FSH de Per.C6

Se analizaron glicoconjugados usando un método de diferenciación de glucanos basado en lectina. Con este método se pueden caracterizar glicoproteínas y glicoconjugados unidos a nitrocelulosa. Las lectinas reconocen selectivamente un resto particular, por ejemplo, ácido siálico enlazado a2,3. Las lectinas aplicadas se conjugan con el hapteno esteroide digoxigenina, que permite la detección inmunológica de las lectinas unidas.

Se separó FSH de Per.C6 purificada a partir de un clon parental (sin sialiltransferasa adicional), un clon modificado por ingeniería con a2,3-sialiltransferasa y un clon modificado por ingeniería con a2,6-sialiltransferasa usando técnicas convencionales de SDS-PAGE. Como patrón, se usó una FSH recombinante disponible comercialmente (Gonal-f, Serono).

Se analizó el ácido siálico usando el kit DIG Glycan Differentiation (n° de catálogo 11210238001, Roche) según las instrucciones del fabricante. Las reacciones positivas con aglutinina de Sambucus nigra (SNA) indicaron ácido siálico enlazado terminalmente (2-6). Las reacciones positivas con aglutinina II de Maackia amurensis (MAA) indicaron ácido siálico enlazado terminalmente (a2-3).

En resumen, el clon parental 005 contenía niveles bajos de ácido siálico tanto a2,3 como a2,6. Los clones modificados por ingeniería con a2,3-sialiltransferasa contenían niveles altos de enlaces de ácido siálico a2,3 y niveles bajos de enlaces de ácido siálico a2,6. Los clones modificados por ingeniería con a2,6-sialiltransferasa contenían niveles altos de enlaces de ácido siálico a2,6 y niveles bajos de enlaces de ácido siálico a2,3. El control de patrón Gonal-f solo contiene enlaces de ácido siálico a2,3. Esto es consistente con lo que se sabe sobre las proteínas recombinantes producidas en células de ovario de hámster chino (CHO) (Kagawa et al, 1988, Takeuchi et al, 1988, Svensson et al., 1990).

En conclusión, la modificación por ingeniería de FSH de células Per.C6 con a2,3- o a2,6-sialiltransferasa aumentó con éxito el número de moléculas de ácido siálico conjugadas con la FSH en la muestra.

Ejemplo 8a. Cuantificación del ácido siálico total

El ácido siálico es un hidrato de carbono unido a proteína que se considera que es un monosacárido y aparece en combinación con otros monosacáridos como galactosa, manosa, glucosamina, galactosamina y fucosa.

El ácido siálico total en rFSH purificada (Ejemplo 11) se midió usando un kit de cuantificación enzimática de ácido siálico según el protocolo del fabricante (Sigma, Sialic-Q). Brevemente, la ácido N-acetilneuramínico aldolasa cataliza ácido siálico a N-acetilmanosamina y ácido pirúvico. El p-NADH y la láctico deshidrogenasa pueden reducir el ácido pirúvico a ácido láctico. La oxidación de B-NADH se puede medir de forma precisa espectrofotométricamente.

Se midió la concentración de proteína en placas de microtitulación usando un kit comercial de ensayo de ácido bicinconínico (BCA) (Sigma, B 9643) basado en el método de Lowry (Lowry et al, 1951).

Se midió el contenido total de ácido siálico de FSH de Per.C6, y se encontró que fue mayor que 6 mol/mol.

Ejemplo 8b. Cuantificación de cantidades relativas de ácido siálico a2,3, a2,6 y a2,8

Se midieron las cantidades en porcentaje relativo de ácido siálico a2,3, a2,6 y a2,8 en rFSH purificada (Ejemplo 11) usando técnicas conocidas.

Cada muestra de rFSH se inmovilizó (bloque de gel), se lavó, se redujo, se alquiló y se digirió con PNGasa F durante toda la noche. Después se extrajeron y se procesaron los N-glucanos. Los N-glucanos se marcaron con el fluoróforo 2AB para el análisis de NP-HPLC y WAX-HPLC tal como se detalla en Royle et al. Los N-glucanos se hicieron pasar en HPLC de fase normal (NP) en una columna TSK amida (tal como se detalla en Royle et al), con los tiempos de retención expresados en unidades de glucosa (UG).

Las muestras de los glucanos extraídos, agrupados (extraídos como anteriormente) se digirieron con diferentes sialidasas para determinar los enlaces. NAN 1 (sialidasa recombinante) libera ácidos siálicos terminales no reductores enlazados a2,3 (NeuNAc y NeuNGc), ABS (sialidasa de Arthrobacter ureafaciens) libera ácidos siálicos terminales no reductores enlazados a2,3, a2,6 y a2,8 (NeuNAc y NeuNGc). Las muestras se analizaron por NP-HPLC, para permitir la comparación de la muestra sin digerir con la digerida con NAN1 y la digerida con ABS. La comparación de las tres trazas de NP-HPLC (sin digerir, digerida con NAN1, digerida con ABS) muestra que la digestión con ABS y NAN1 da diferentes resultados. Esto indica que las muestras tienen ácidos siálicos con enlaces a2,3, a2,6 y a2,8. Se calcularon los porcentajes relativos a partir de estructuras presentes en el conjunto de glucanos sin digerir, y se encontró que estaban en los intervalos 65%-85% (por ejemplo, 77,75%) para sialilación a2,3; 15 a 35% (por ejemplo, 21,46%) para sialilación a2,6; y 0,1 a 3% para sialilación a2,8.

Ejemplo 8c. Cuantificación de las cantidades relativas de estructuras sialiladas mono, di, tri, y tetraantenarias

Se midieron las cantidades en porcentaje relativo de estructuras mono, di, tri, y tetrasialiladas en glucanos extraídos de rFSH purificada (Ejemplo 11) usando técnicas conocidas.

Cada muestra de rFSH se inmovilizó (bloque de gel), se lavó, se redujo, se alquiló y se digirió con PNGasa F durante toda la noche. Después se extrajeron y procesaron los N-glucanos. Los N-glucanos se marcaron con el fluoróforo 2AB para el análisis de NP-HPLC y Wa X-HPlC tal como se detalla en Royle et al.

Se llevó a cabo HPLC de intercambio aniónico débil (WAX) para separar los N-glucanos por carga (Ejemplo 8b) tal como se muestra en Royle et al, con un patrón de fetuína N-glucano como referencia. Los glucanos eluyeron según el número de ácidos siálicos que contenían. Todas las muestras incluyeron estructuras mono (1S), di (2S), tri (3S) y tetra (4S) sialiladas. Se encontró que las cantidades relativas de las estructuras sialiladas estaban en las siguientes proporciones (1S:2S:4S:4S): 9-15%: 27-30%: 30-36%: 25-29% (por ejemplo 10,24:28,65:35,49:25,62).

Ejemplo 9. Determinación de las velocidades de eliminación metabólica de rFSH

Para determinar la velocidad de eliminación metabólica (MCR) de muestras de FSH de Per.C6 se inyectó un bolo de rFSH a ratas hembras conscientes (3 animales por clon) en la vena caudal en el momento cero (1-10 pg/rata, basado en la cuantificación por ELISA de las muestras, DRG EIA 1288). Se tomaron muestras de sangre (400 pl) de la punta de la cola 1, 2, 4, 8, 12, 24 y 32 horas después de la inyección de la muestra de ensayo. El suero se recogió por centrifugación, y se ensayó el contenido de FSH por ELISA (DRG EIA 1288).

El receptor de asialoglicoproteína (ASGP-R) reconoce glicoproteínas desialiladas (terminadas en galactosa) tal como asialofetuína (ASF) (Pricer y Ashwell, 1971. Van Lenten y Ashwell, 1972). El receptor de ASGP y la glicoproteína desialilada unida se internalizan en la célula, en la que el receptor se recicla y el ligando se degrada (Regoeczi et al, 1978, Steer y Ashwell, 1980).

Para investigar si el material de FSH de Per.C6 se aclaró por medio de este mecanismo, el ASGP-R se saturó con asialofetuína. La velocidad de eliminación metabólica de material original o modificado por ingeniería con a2,6 o a2,3-sialiltransferasa se determinó tal como se ha descrito con la coadministración de un exceso molar mínimo de 7500 veces de asialofetuína para saturar el ASPG-R durante 1-2 horas.

El material producido por los clones de FSH de Per.C6 parentales contenía algún material de MCR más larga, pero un alto porcentaje se aclaró rápidamente (Figura 7). El clon principal 005 que contenía el material más sialilado se modificó por ingeniería usando a2,6 o a2,3-sialiltransferasa (Ejemplo 5). Aunque los clones modificados por ingeniería con a2,6-sialiltransferasa demostraron mayor sialilación (Figura 5), no hubo mejora en la MCR (Figura 7). El bloqueo del ASGR restableció la MCR del material a2,6 a la del patrón, demostrando que incluso con mayor número de enlaces a2,6 el material se elimina rápidamente (Figura 8). La modificación por ingeniería con a2,3-sialiltransferasa dio como resultado clones con MCR comparable al patrón (Figura 9), y el contenido siálico variable fue coincidente con lo que se conoce para las isoformas de FSH (Figura 10).

Ejemplo 10. Ensayo in vivo de Steelman-Pohley

Para demostrar que el contenido creciente en ácido siálico en la FSH da como resultado un mayor efecto biológico, se examinó el aumento en los pesos ováricos en ratas por FSH altamente sialilada, tal como la producida en el Ejemplo 5.

El aumento en los pesos ováricos debido a los clones de rFSH de Per.C6 se analizó según el método de Steelman y Pohley (1953). Se cuantificó por ELISA (DRG, EIA-1288) rFSH de Per.C6 de muestras de medio celular filtrado. Las muestras (rFSH de Per.C6) y patrones (rFSH de Gonal-f) se analizaron a cinco dosis diferentes (3 animales/dosis). Gonal-f se dosificó a 50, 100, 200, 400 y 800 ng/rata. Las dosis de las muestras se calcularon usando sus valores de AUC con respecto a Gonal-f, típicamente 0,05-10 pg/rata.

En conclusión, el material subsialilado producido por los clones de FSH de Per.C6 parentales (Figura 11) no fue tan potente en el ensayo de aumento del peso ovárico como la rFSH disponible comercialmente. La modificación por ingeniería con sialiltransferasa para añadir enlaces a2,6 adicionales aumentó el contenido de ácido siálico, pero no mejoró la potencia en el ensayo in vivo (Figura 12). Sin embargo, los enlaces a2,3 adicionales mejoraron significativamente la potencia (Figura 13), y las dos preparaciones de FSH recombinante (procedentes de Per.C6 y CHO) muestran perfiles muy similares en este ensayo.

Ejemplo 11. Resumen de la producción y purificación

Se desarrolló un procedimiento para producir FSH en células PER.C6 que se cultivaron en suspensión en medio sin suero. El procedimiento se describe a continuación, y se aplicó a varias líneas celulares PER.C6 productoras de FSH.

Se preparó FSH a partir del clon parental 005, del clon de a2,3 007 y del clon de a2,6 059 usando una modificación del método descrito por Lowry et al. (1976).

Para la producción de FSH de PER.C6, las líneas celulares se adaptaron a un medio sin suero, es decir, Excell 525 (JRH Biosciences). Las células se cultivaron primero para formar una monocapa confluente al 70%-90% en un matraz de cultivo T80. En la pasada, las células se resuspendieron en el medio sin suero, Excell 525 L-glutamina 4 mM, a una densidad celular de 0,3x106 células/ml. Se puso una suspensión celular de 25 ml en un matraz de agitación de 250 ml, y se agitó a 100 rpm a 37°C en CO2 al 5%. Después de alcanzar una densidad celular > 1x106 células/ml, las células se subcultivaron hasta una densidad celular de 0,2 o 0,3x106 células/ml, y se cultivaron adicionalmente en matraces de agitación a 37°C, CO2 al 5% y 100 rpm.

Para la producción de FSH, las células se transfirieron a un medio de producción sin suero, es decir, VPRO (JRH Biosciences), que soporta el crecimiento de células PER.C6 a densidades celulares muy altas (habitualmente > 107 células/ml en un cultivo por lotes). Las células se cultivaron primero hasta > 1x106 células/ml en Excell 525, después se centrifugaron durante 5 minutos a 1000 rpm, y posteriormente se suspendieron en medio VPRO L-glutamina 6 mM hasta una densidad de 1x106 células/ml. Las células se cultivaron después en un matraz de agitación durante 7­ 10 días a 37°C, CO2 al 5% y 1000 rpm. Durante este periodo, las células crecieron hasta una densidad > 107 células/ml. El medio de cultivo se recogió después de que la viabilidad celular empezara a decaer. Las células se centrifugaron durante 5 minutos a 100 rpm, y el sobrenadante se usó para la cuantificación y purificación de FSH. La concentración de FSH se determinó usando ELISA (DRG EIA 1288).

Después, la purificación de FSH se llevó a cabo usando una modificación del método descrito por Lowry et al. (1976). Esto se logró por cromatografía en DEAE celulosa, filtración en gel en Sephadex G100, cromatografía de adsorción en hidroxiapatita, y electroforesis en poliacrilamida preparatoria.

Durante todos los procedimientos cromatográficos, la presencia de FSH inmunorreactiva se confirmó por RIA (DRG EIA 1288) e IEF (Ejemplo 6).

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1425(3), 441-452.

SEQ ID 1

Polipéptido alfa de la hormona estimulante del folículo

Número de acceso AH007338

Secuencia nucleotídica de FSH alfa

1 ATGGATTACT ACAGAAAATA TGCAGCTATC TTTCTGGTCA CATTGTCGGT GTTTCTGCAT

61 GTTCTCCATT CCGCTCCTGA TGTGCAGGAT TGCCCAGAAT GCACGCTACA GGAAAAC CCA

121 TTCTTCTCCC AGCCGGGTGC CCCAATACTT CAGTGCATGG GCTGCTGCTT CTCTAGAGCA

181 TATCCCACTC CACTAAGGTC CAAGAAGACG ATGTTGGTCC AAAAGAAC GT CACCTCAGAG

241 TCCACTTGCT GTGTAGCTAA ATCATATAAC AGGGTCACAG TAATGGGGGG TTTCAAAGTG

301 GAGAACCACA CGGCGTGCCA CTGCAGTACT TGTTATTATC ACAAATCTTA A Secuencia de proteína de FSH alfa

1 MKTLQFFFLF CCWKAICCNS CELTNITIAI EKEECRFCIS INTTWCAGYC YTRDLVYKDP

61 ARPKIQKTCT FKELVYETVR VPGCAHHADS LYTYPVATQC HCGKCDSD3T DCTVRGLGPS

121 YCSFGEMKE

SEQ ID 2

Polipéptido beta de la hormona estimulante del folículo

Número de acceso NM 000510

Secuencia nucleotídica de FSH beta

1 ATGAAGACAC TCCAGTTTTT CTTCCTTTTC TGTTGCTGGA AAGCAATCTG CTGCAATAGC

61 TGTGAGCTGA CCAACATCAC CATTGCAATA GAGAAAGAAG AATGTCGTTT CTGCATAAGC

121 AT CAACAC CA CTTGGTGTGC TGGCTACTGC TACACCAGGG ATCTGGTGTA TAAGGACCCA

181 GCCAGGCCCA AAATCCAGAA AACATGTACC TTCAAGGAAC TGGTATATGA AACAG TGAGA

241 GTGCCCGGCT GTGCTCACCA TGCAGATTCC TTGTATACAT ACCCAGTGGC CACCCAGTGT

301 CACTGTGGCA AGTGTGACAG CGACAGCACT GATTGTACTG TGCGAGGCCT GGGGCCCAGC

361 TACTGCTCCT TTGGTGAAAT GAAAGAATAA

Secuencia de proteína de FSH beta

1 MKTLQFFFLF CCWKAICCNS CELTNITIAI EKEECRFCIS INTTWCAGYC YTRDLVYKDP

61 ARPKIQKTCT FKELVYETVR VPGCAHHADS LYTYPVATQC HCGKCDSDST DCTVRGLGPS

121 YCSFGEMKE

SEQ ID 3

Beta-galactósido alfa-2,3-sialiltransferasa 4

Número de acceso L23767

Secuencia nucleotídica de ST3GAL4

1 ATGTGTCCTG CAGGCTGGAA GCTCCTGGCC ATGTTGGCTC TGGTCCTGGT CGTCATGGTG

61 TGGTATTCCA TCTCCCGGGA AGACAGGTAC ATCGAGCTTT TTTATTTTCC CATCCCAGAG

121 AAGAAGGAGC CGTGCCTCCA GGGTGAGGCA GAGAGCAAGG CCTCTAAGCT CTTTGGCAAC

181 TACTCCCGGG ATCAGCCCAT CTTCCTGCGG CTTGAGGATT ATTTCTGGGT CAAGACGCCA

241 TCTGCTTACG AGCTGCCCTA TGGGACCAAG GGGAGTGAGG ATCTGCTCCT CCGGGTGCTA

301 GCCATCACCA GCTCCTCCAT CCCCAAGAAC ATCCAGAGCC TCAGGTGCCG CCGCTGTGTG

361 GTCGTGGGGA ACGGGCACCG GCTGCGGAAC AGCGCACTGG GAGATGCCAT CAACAAGTAC

421 GATGTGGTCA TCAGATTGAA CAATGCCCCA GTGGCTGGCT ATGAGGGTGA CGTGGGCTCC

481 AAGACCACCA TGCGTCTCTT CTACCCTGAA TCTGCCCACT TCGACCCCAA AGTAGAAAAC

541 AAC CCAGACA CACTCCTCGT CCTGGTAGCT TTCAAGGCAA TGGACTTCCA CTGGATTGAG

601 ACCATCCTGA GTGATAAGAA GCGGGTGCGA AAGGGTTTCT GGAAACAGCC TCCCCTCATC

661 TGGGATGTCA ATCCTAAACA GATTCGGATT CTCAACCCCT TCTTCATGGA GATTGCAGCT

721 GACAAACT GC TGAGCCTGCC AATGCAACAG CCACGGAAGA TTAAGCAGAA GCCCACCACG

781 GGCCTGTTGG CCATCACGCT GGCCCTCCAC CTCTGTGACT TGGTGCACAT TGCCGGCTTT

841 GGCTACCCAG ACGCCTACAA CAAGAAGCAG ACCATTCACT ACTATGAGCA GATCACGCTC

901 AAGTCCATGG CGGGGTCAGG CCATAATGTC TCCCAAGAGG CCCTGGCCAT TAAGCGGATG

961 CTGGAGATGG GAGCTATCAA GAACCTCACG TCCTTCTGA

Secuencia de proteína de ST3GAL4

1 MCPAGWKLLA MLALVLWMV WYSISREDRY IELFYFPIPE KKEPCLQGEA ESKASKLFGN

61 YSRDQPIFLR LEDYFWVKTP SAYELPYGTK GSEDLLLRVL AITSSSIPKN IQSLRCRRCV

121 WGNGHRLRN SSLGDAINKY DWIRLNNAP VAGYEGDVGS KTTMRLFYPE SAHFDPKVEN

181 NPDTLLVLVA FKAMDFHWIE TILSDKKRVR KGFWKQPPLI WDVNPKQIRI LNPFFMEIAA

241 DKLLSLPMQQ PRKIKQKPTT GLLAITLALH LCDLVHIAGF GYPDAYNKKQ TIHYYEQITL

301 KSMAGSGHNV SOEALAIKRM LEMGAIKNLT SF

SEQ ID 4

Beta-galactosamida alfa-2,6-sialiltransferasa 1

Número de acceso NM_003032

Secuencia nucleotídica de ST6GAL1

1 ATGATTCACA CCAACCTGAA GAAAAAGTTC AGCTGCCGCG CCCTGGTCTC

TCTTCTGTTT

61 GCAGTCATCT GTGTGTGGAA GGAAAAGAAG AAAGGGAGTT ACTATGATTC CTTTAAATTG

121 CAAACCAAGG AACTCCAGGT GTTAAAGAGT CTGGGGAAAT TGGCCATGGG GTCTGATTCC

181 CAGTCTGTAT CCTCAAGCAG CACCCAGGAC CCCCACAGGG GCCGCCAGAC CCTCGGCAGT

241 CTCAGAGGCC TAGCCAAGGC CAAAC CAGAG GCCTCCTTCC AGGTGTGGAA CAAGGACAGC

301 TCTTCCAAAA ACCTTATCCC TAGGCTGCAA AAGATCTGGA AGAAT TAC CT AAGCATGAAC

3 61 AAGTACAAAG TGTCCTACAA GGGGCCAGGA CCAGGCATCA AGTTCAGTGC AGAGGCCCTG

421 CGCTGCCACC TCCGGGACCA TGTGAATGTA TCCATGGTAG AGGTCACAGA TTTTCCCCTC

481 AATACCTCTG AACGGGAGGG TTATCTGCCC AAGGAGAGCA TTAGGAC CAA GGCTGGG'CCT

541 TGGGGCAGGT GTGCTGTTGT GTCGTCAGCG GGACCTCTGA AGTCCTCCCA ACTAGGCAGA

601 GAAATCGATG ATCATGACGC AGTCCTGAGG TTTAATGGGG CACCCACAGC CAACTTCCAA

661 CAAGATGTGG GCACAAAAAC TACCATTCGC CTGATGAACT CTCAGTTGGT TAC CACAGAG

721 AAGCGCTTCC TCAAAGACAG TTTGTACAAC GAAGGAATCC TAATTGTATG GGACCCATCT

7 81 GTATACCACT CAGATATCCC AAAGTGGTAC CAGAATCCGG ATTATAATTT CTTTAACAAC

841 TACAAGACTT ATCGTAAGCT GCACCCCAAT CAGCCCTTTT ACATCCTCAA GCCCCAGATG

901 CCTTGGGAGC TATGGGACAT TCTTCAAGAA ATCTCCCCAG AAGAGATTCA GCCAAACCCC

961 CCATCCTCTG GGATGCTTGG TATCATCATC ATGATGACGC TGTGTGACCA GGTGGATATT

Claims (4)

REIVINDICACIONES

1. FSH recombinante (rFSH) que incluye sialilación a2,3 y a2,6, en la que de 10% a 20% de la sialilación total es sialilación a2,6.

2. Una composición farmacéutica que comprende FSH recombinante según la reivindicación 1.

3. Una composición farmacéutica según la reivindicación 2, que comprende adicionalmente hCG y/o LH.

4. Una composición farmacéutica según la reivindicación 2 o reivindicación 3, para uso en el tratamiento de la infertilidad.