RU2682270C2 - Рекомбинантный фолликулостимулирующий гормон (ФСГ), включающий альфа-2,3- и альфа-2,6-сиалирование - Google Patents
Рекомбинантный фолликулостимулирующий гормон (ФСГ), включающий альфа-2,3- и альфа-2,6-сиалирование Download PDFInfo
- Publication number
- RU2682270C2 RU2682270C2 RU2014141994A RU2014141994A RU2682270C2 RU 2682270 C2 RU2682270 C2 RU 2682270C2 RU 2014141994 A RU2014141994 A RU 2014141994A RU 2014141994 A RU2014141994 A RU 2014141994A RU 2682270 C2 RU2682270 C2 RU 2682270C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- fsh
- rfsh
- sialylation
- per
- sialyltransferase
- Prior art date
Links
- 102000012673 Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 title claims abstract description 154
- 108010079345 Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 title claims abstract description 153
- 229940028334 follicle stimulating hormone Drugs 0.000 title claims abstract description 150
- 102000003838 Sialyltransferases Human genes 0.000 claims abstract description 16
- 108090000141 Sialyltransferases Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 12
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 6
- 230000009450 sialylation Effects 0.000 abstract description 59
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 26
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 21
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 abstract description 12
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 abstract description 4
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 abstract description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 63
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 60
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 57
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 26
- 239000000047 product Substances 0.000 description 21
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 20
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 19
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 18
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 18
- 125000005629 sialic acid group Chemical group 0.000 description 18
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 17
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 17
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 15
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 12
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 12
- 229940057854 gonal f Drugs 0.000 description 12
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 12
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 11
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 11
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 11
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 11
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 10
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 10
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 9
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 8
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 8
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 8
- 102000005427 Asialoglycoprotein Receptor Human genes 0.000 description 7
- 102100031974 CMP-N-acetylneuraminate-beta-galactosamide-alpha-2,3-sialyltransferase 4 Human genes 0.000 description 7
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 7
- 108010006523 asialoglycoprotein receptor Proteins 0.000 description 7
- 102000035824 beta Subunit Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 description 7
- 108010081485 beta Subunit Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 7
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 7
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 7
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- 101000863864 Homo sapiens Beta-galactoside alpha-2,6-sialyltransferase 1 Proteins 0.000 description 6
- 206010058823 Ovarian mass Diseases 0.000 description 6
- 108010000732 alpha Subunit Glycoprotein Hormones Proteins 0.000 description 6
- 108010044715 asialofetuin Proteins 0.000 description 6
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 6
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 6
- 102100029945 Beta-galactoside alpha-2,6-sialyltransferase 1 Human genes 0.000 description 5
- 101000703754 Homo sapiens CMP-N-acetylneuraminate-beta-galactosamide-alpha-2,3-sialyltransferase 4 Proteins 0.000 description 5
- 102000002287 alpha Subunit Glycoprotein Hormones Human genes 0.000 description 5
- 125000000837 carbohydrate group Chemical group 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 5
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 238000004305 normal phase HPLC Methods 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- 101710186708 Agglutinin Proteins 0.000 description 4
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 4
- 101710146024 Horcolin Proteins 0.000 description 4
- 101710189395 Lectin Proteins 0.000 description 4
- 241001521394 Maackia amurensis Species 0.000 description 4
- 101710179758 Mannose-specific lectin Proteins 0.000 description 4
- 101710150763 Mannose-specific lectin 1 Proteins 0.000 description 4
- 101710150745 Mannose-specific lectin 2 Proteins 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 102000000447 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Human genes 0.000 description 4
- 108010055817 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Proteins 0.000 description 4
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical compound CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 240000006028 Sambucus nigra Species 0.000 description 4
- 235000003142 Sambucus nigra Nutrition 0.000 description 4
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 4
- 239000000910 agglutinin Substances 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 235000008995 european elder Nutrition 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 4
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 4
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 4
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 4
- 231100000535 infertility Toxicity 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 230000016087 ovulation Effects 0.000 description 4
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 4
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 3
- 101710083574 CMP-N-acetylneuraminate-beta-galactosamide-alpha-2,3-sialyltransferase 4 Proteins 0.000 description 3
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 3
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 3
- 108010008699 Mucin-4 Proteins 0.000 description 3
- 102100022693 Mucin-4 Human genes 0.000 description 3
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 3
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 3
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 3
- 101100539927 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) NAN1 gene Proteins 0.000 description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 3
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 3
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 3
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactosamine Natural products NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 3
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 3
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 3
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 3
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 3
- 230000000624 ovulatory effect Effects 0.000 description 3
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 3
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 3
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 3
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-L (5-bromo-4-chloro-1h-indol-3-yl) phosphate Chemical compound C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OP([O-])(=O)[O-])=CNC2=C1 QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- MSWZFWKMSRAUBD-GASJEMHNSA-N 2-amino-2-deoxy-D-galactopyranose Chemical group N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 2-amino-2-deoxy-D-glucopyranose Chemical compound N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 102000011022 Chorionic Gonadotropin Human genes 0.000 description 2
- 108010062540 Chorionic Gonadotropin Proteins 0.000 description 2
- IVOMOUWHDPKRLL-KQYNXXCUSA-N Cyclic adenosine monophosphate Chemical compound C([C@H]1O2)OP(O)(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H]2N1C(N=CN=C2N)=C2N=C1 IVOMOUWHDPKRLL-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 2
- 102000008175 FSH Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010060374 FSH Receptors Proteins 0.000 description 2
- 101150030274 FSHB gene Proteins 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100040796 Glycoprotein hormones alpha chain Human genes 0.000 description 2
- 102000006771 Gonadotropins Human genes 0.000 description 2
- 108010086677 Gonadotropins Proteins 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 2
- 102000009151 Luteinizing Hormone Human genes 0.000 description 2
- 108010073521 Luteinizing Hormone Proteins 0.000 description 2
- SQVRNKJHWKZAKO-PFQGKNLYSA-N N-acetyl-beta-neuraminic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-PFQGKNLYSA-N 0.000 description 2
- FDJKUWYYUZCUJX-PGIATKPXSA-N N-glycoloylneuraminic acid Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1OC(O)(C(O)=O)C[C@H](O)[C@H]1NC(=O)CO FDJKUWYYUZCUJX-PGIATKPXSA-N 0.000 description 2
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-L NADH(2-) Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-L 0.000 description 2
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 229920002988 biodegradable polymer Polymers 0.000 description 2
- 239000004621 biodegradable polymer Substances 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N chlorobutanol Chemical compound CC(C)(O)C(Cl)(Cl)Cl OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 108010081934 follitropin beta Proteins 0.000 description 2
- 230000033581 fucosylation Effects 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 229960002442 glucosamine Drugs 0.000 description 2
- 210000004368 gonadotroph Anatomy 0.000 description 2
- 239000002622 gonadotropin Substances 0.000 description 2
- 229940094892 gonadotropins Drugs 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000009027 insemination Effects 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 2
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 2
- JPXMTWWFLBLUCD-UHFFFAOYSA-N nitro blue tetrazolium(2+) Chemical compound COC1=CC(C=2C=C(OC)C(=CC=2)[N+]=2N(N=C(N=2)C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC(=CC=2)[N+]([O-])=O)=CC=C1[N+]1=NC(C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 JPXMTWWFLBLUCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 229940107700 pyruvic acid Drugs 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 2
- 230000006269 (delayed) early viral mRNA transcription Effects 0.000 description 1
- 101150084750 1 gene Proteins 0.000 description 1
- VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 17β-estradiol Chemical compound OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 0.000 description 1
- JVIPLYCGEZUBIO-UHFFFAOYSA-N 2-(4-fluorophenyl)-1,3-dioxoisoindole-5-carboxylic acid Chemical compound O=C1C2=CC(C(=O)O)=CC=C2C(=O)N1C1=CC=C(F)C=C1 JVIPLYCGEZUBIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxybenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 description 1
- 229920001425 Diethylaminoethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N Digoxigenin Natural products C1CC(C2C(C3(C)CCC(O)CC3CC2)CC2O)(O)C2(C)C1C1=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N Elaidinsaeure-aethylester Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N Fucose Natural products C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 1
- AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N Glycolic acid Polymers OCC(O)=O AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700023372 Glycosyltransferases Proteins 0.000 description 1
- 101000863891 Homo sapiens Beta-galactoside alpha-2,6-sialyltransferase 2 Proteins 0.000 description 1
- 108010082302 Human Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 description 1
- 102000003864 Human Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 description 1
- 206010062767 Hypophysitis Diseases 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N L-fucopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N 0.000 description 1
- 102000003855 L-lactate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-RTRLPJTCSA-N N-acetyl-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-RTRLPJTCSA-N 0.000 description 1
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 1
- 102000048245 N-acetylneuraminate lyases Human genes 0.000 description 1
- 108700023220 N-acetylneuraminate lyases Proteins 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-LUWBGTNYSA-N N-acetylneuraminic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)CC(O)(C(O)=O)O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-LUWBGTNYSA-N 0.000 description 1
- SUHQNCLNRUAGOO-UHFFFAOYSA-N N-glycoloyl-neuraminic acid Natural products OCC(O)C(O)C(O)C(NC(=O)CO)C(O)CC(=O)C(O)=O SUHQNCLNRUAGOO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FDJKUWYYUZCUJX-UHFFFAOYSA-N N-glycolyl-beta-neuraminic acid Natural products OCC(O)C(O)C1OC(O)(C(O)=O)CC(O)C1NC(=O)CO FDJKUWYYUZCUJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FDJKUWYYUZCUJX-KVNVFURPSA-N N-glycolylneuraminic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O[C@](O)(C(O)=O)C[C@H](O)[C@H]1NC(=O)CO FDJKUWYYUZCUJX-KVNVFURPSA-N 0.000 description 1
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N NAD zwitterion Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 1
- 241001524178 Paenarthrobacter ureafaciens Species 0.000 description 1
- 229920002732 Polyanhydride Polymers 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 229920000954 Polyglycolide Polymers 0.000 description 1
- 229920001710 Polyorthoester Polymers 0.000 description 1
- 102000048176 Prostaglandin-D synthases Human genes 0.000 description 1
- 108030003866 Prostaglandin-D synthases Proteins 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000011923 Thyrotropin Human genes 0.000 description 1
- 108010061174 Thyrotropin Proteins 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 210000004198 anterior pituitary gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 238000003236 bicinchoninic acid assay Methods 0.000 description 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 1
- 239000003124 biologic agent Substances 0.000 description 1
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 229960004926 chlorobutanol Drugs 0.000 description 1
- 229940015047 chorionic gonadotropin Drugs 0.000 description 1
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 1
- 238000011260 co-administration Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N digitoxigenin Natural products CC12CCC(C3(CCC(O)CC3CC3)C)C3C11OC1CC2C1=CC(=O)OC1 QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N digoxigenin Chemical compound C1([C@@H]2[C@@]3([C@@](CC2)(O)[C@H]2[C@@H]([C@@]4(C)CC[C@H](O)C[C@H]4CC2)C[C@H]3O)C)=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N 0.000 description 1
- 238000012850 discrimination method Methods 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 239000006196 drop Substances 0.000 description 1
- 239000008151 electrolyte solution Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 229960005309 estradiol Drugs 0.000 description 1
- 229930182833 estradiol Natural products 0.000 description 1
- BEFDCLMNVWHSGT-UHFFFAOYSA-N ethenylcyclopentane Chemical compound C=CC1CCCC1 BEFDCLMNVWHSGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N ethyl oleate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N 0.000 description 1
- 229940093471 ethyl oleate Drugs 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 1
- 108060002885 fetuin Proteins 0.000 description 1
- 102000013361 fetuin Human genes 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 108010006578 follitropin alfa Proteins 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 150000002302 glucosamines Chemical class 0.000 description 1
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 102000045442 glycosyltransferase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108700014210 glycosyltransferase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000002149 gonad Anatomy 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 102000048059 human St6Gal2 Human genes 0.000 description 1
- 229940084986 human chorionic gonadotropin Drugs 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000006303 immediate early viral mRNA transcription Effects 0.000 description 1
- 238000005462 in vivo assay Methods 0.000 description 1
- 239000007972 injectable composition Substances 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000006194 liquid suspension Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 229940040129 luteinizing hormone Drugs 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 239000004530 micro-emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007922 nasal spray Substances 0.000 description 1
- 229940097496 nasal spray Drugs 0.000 description 1
- 229940060155 neuac Drugs 0.000 description 1
- CERZMXAJYMMUDR-UHFFFAOYSA-N neuraminic acid Natural products NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO CERZMXAJYMMUDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 235000008390 olive oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000004006 olive oil Substances 0.000 description 1
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 1
- 150000002895 organic esters Chemical class 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 239000001814 pectin Substances 0.000 description 1
- 229920001277 pectin Polymers 0.000 description 1
- 235000010987 pectin Nutrition 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 239000008024 pharmaceutical diluent Substances 0.000 description 1
- 239000008063 pharmaceutical solvent Substances 0.000 description 1
- 229960003742 phenol Drugs 0.000 description 1
- 210000003635 pituitary gland Anatomy 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 229940071643 prefilled syringe Drugs 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000013587 production medium Substances 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 1
- 238000013361 sialic acid assay kit Methods 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000008247 solid mixture Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 235000010199 sorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004334 sorbic acid Substances 0.000 description 1
- 229940075582 sorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 239000003206 sterilizing agent Substances 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 229960000874 thyrotropin Drugs 0.000 description 1
- 230000001748 thyrotropin Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- -1 without limitation Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/59—Follicle-stimulating hormone [FSH]; Chorionic gonadotropins, e.g.hCG [human chorionic gonadotropin]; Luteinising hormone [LH]; Thyroid-stimulating hormone [TSH]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/22—Hormones
- A61K38/24—Follicle-stimulating hormone [FSH]; Chorionic gonadotropins, e.g. HCG; Luteinising hormone [LH]; Thyroid-stimulating hormone [TSH]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
- A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/06—Drugs for disorders of the endocrine system of the anterior pituitary hormones, e.g. TSH, ACTH, FSH, LH, PRL, GH
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/10—Drugs for disorders of the endocrine system of the posterior pituitary hormones, e.g. oxytocin, ADH
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
- C12Y204/99—Glycosyltransferases (2.4) transferring other glycosyl groups (2.4.99)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
- C12Y204/99—Glycosyltransferases (2.4) transferring other glycosyl groups (2.4.99)
- C12Y204/99006—N-Acetyllactosaminide alpha-2,3-sialyltransferase (2.4.99.6)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Toxicology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pregnancy & Childbirth (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для получения рекомбинантного альфа-2,3- и альфа-2,6-сиалированного фолликулостимулирующего гормона (ФСГ). Способ включает стадию продуцирования рекомбинантного ФСГ в клеточной линии Per.С6 с эндогенной активностью сиалилтрансферазы, где клеточная линия Per.С6 трансфицирована плазмидой, экспрессирующей α- и β-субъединицы ФСГ, и плазмидой, экспрессирующей α-2,3-сиалилтрансферазу. Изобретение позволяет получить рекомбинантный ФСГ, близкий по профилю сиалирования к естественному ФСГ человека. 13 ил., 11 пр.
Description
Настоящее изобретение относится к гонадотропинам для применения в лечении бесплодия. В частности, оно относится к фолликулостимулирующему гормону (ФСГ, FSH).
Гонадотропины представляют собой группу гетеродимерных гликопротеиновых гормонов, регулирующих функции гонад в мужском и женском организмах. Они включают фолликулостимулирующий гормон (ФСГ, FSH), лютеинизирующий гормон (ЛГ, LH) и хорионический гонадотропин (ХГ, CG).
Естественная секреция ФСГ происходит в передней доле гипофиза, и функция ФСГ включает поддержание развития фолликула и овуляции. ФСГ содержит альфа-субъединицу из 92 аминокислот, также характерную для других гликопротеиновых гормонов ЛГ и ХГ, и бета-субъединицу из 111 аминокислот, уникальную для ФСГ, обеспечивающую биологическую специфичность гормона (Pierce and Parsons, 1981). Каждая субъединица проходит посттрансляционную модификацию с присоединением сложных углеводных остатков. Обе субъединицы имеют 2 сайта для присоединения N-связанного гликана, альфа-субъединица - по аминокислотам 52 и 78, и бета субъединица - по аминокислотным остаткам 7 и 24 (Rathnam and Saxena, 1975, Saxena and Rathnam, 1976). Таким образом, ФСГ гликозилирован приблизительно на 30% по массе (Dias and Van Roey. 2001. Fox et al. 2001).
ФСГ, очищенный из мочи людей в постменопаузе, в течение многих лет использовали для лечения бесплодия, как для стимуляции овуляции при естественном воспроизведении, так и для обеспечения ооцитов для вспомогательных репродуктивных технологий. В середине 1990-х гг.стали доступны два рекомбинантных варианта ФСГ, Gonal-F (Serono) и Puregon (Organon). Оба эти варианта экспрессируют в клетках яичника китайского хомячка (СНО) (Howles, 1996).
Препараты ФСГ в значительной степени гетерогенны, что связано с различиями в количестве разных изоформ, присутствующих в препарате. Отдельные изоформы ФСГ демонстрируют идентичные аминокислотные последовательности, но различаются по степени их посттрансляционной модификации; конкретные изоформы отличаются гетерогенностью разветвленных углеводных структур и разными количествами присоединенной сиаловой кислоты (концевого сахара), при этом оба параметра, по-видимому, влияют на специфическую биологическую активность изоформы.
Гликозилирование природного ФСГ очень сложно. Гликаны в гипофизарном ФСГ естественного происхождения могут содержать широкий спектр структур, которые могут включать комбинации би-, три- и тетра-разветвленных гликанов (Pierce and Parsons, 1981. Ryan et al., 1987. Baenziger and Green, 1988). Гликаны могут иметь другие модификации: центральное фукозилирование, разделенный пополам глюкозамин, цепи, расширенные ацетиллактозамином, частичное или полное сиалирование, сиалирование с α2,3- и α2,6-связями и замещение галактозы сульфатированным галактозамином (Dalpathado et al., 2006). Кроме того, существуют различия между распределениями гликановых структур в отдельных сайтах гликозилирования. Сопоставимая степень сложности гликановых структур была обнаружена у ФСГ, имеющего происхождение из сыворотки индивидов и из мочи женщин в постменопаузе (Wide et al., 2007).
Гликозилирование продуктов рекомбинантного ФСГ отражает спектр гликозилтрансфераз, представленных в линии клеток-хозяев. Существующие продукты рекомбинантного ФСГ (рФСГ, rFSH) имеют происхождение из сконструированных клеток яичника китайского хомячка (клеток СНО). Спектр гликановых модификаций в рФСГ, имеющем происхождение из клеток СНО, уже спектра, обнаруживаемого у естественных продуктов, имеющих происхождение либо из экстрактов гипофиза, либо из мочи. Примеры меньшей гетерогенности гликанов, обнаруживаемой в рФСГ, имеющем происхождение из клеток СНО, включают отсутствие разделенных пополам глюкозаминов и меньший процент центрального фукозилирования и ацетиллактозаминовых расширений (Hard et al., 1990). В дополнение, в клетках СНО присоединение сиаловой кислоты возможно только через α2,3-связь (Kagawa et al, 1988, Takeuchi et al, 1988, Svensson et al., 1990). Это отличается от продуцируемого естественным образом ФСГ, содержащего гликаны со смесью сиаловых кислот, связанных α2,3- и α2,6-связями.
Было продемонстрировано, что препарат рекомбинантного ФСГ (Organon) отличается по количествам ФСГ с изоэлектрической точкой (pI) ниже 4 (рассматриваемого как кислые изоформы) при сравнении с ФСГ гипофиза, сыворотки или мочи при постменопаузе (Ulloa-Aguirre et al. 1995). Количество кислых изоформ в препаратах, полученных из мочи, было намного больше по сравнению с рекомбинантными продуктами Gonal-f (Serono) и Puregon (Organon) (Andersen et al. 2004). Это, должно быть, отражает меньшее молярное содержание сиаловой кислоты в рФСГ, поскольку содержание отрицательно заряженного гликана, модифицированного сульфатом, в ФСГ невелико. Меньшее содержание сиаловой кислоты по сравнению с природным ФСГ характерно для обоих имеющихся в продаже продуктов ФСГ и, следовательно, должно отражать ограничение технологического процесса (Bassett and Driebergen, 2005).
Существует множество научных работ, в которых предпринят анализ и попытка объяснения отличий гликозилирования ФСГ у разных индивидов и его изменений в течение овуляторного цикла. Одна из основных дискуссий относится к тому наблюдению, что как концентрация ФСГ, так и содержание сиаловой кислоты, снижаются в предовуляторной фазе цикла. Сниженное содержание сиаловой кислоты приводит к образованию более основного ФСГ, как подверженного более быстрому клиренсу, так и более активного в отношении рецептора мишени по меньшей мере in vitro (Zambrano et al. 1996). Вопрос о биологическом значении этих изменений и о том, как они могут быть вовлечены в селекцию доминантного фолликула, остается нерешенным (обзор Ulloa-Aguirre, 2003).
Продолжительность нахождения ФСГ в кровообращении была документирована для веществ из множества источников. Некоторые из этих веществ были фракционированы на основании общего заряда молекулы, что отражено в их pI, где большая кислотность соответствует большему отрицательному заряду. Как определено выше, основной вклад в общий заряд молекулы вносит общее содержание сиаловой кислоты в каждой молекуле ФСГ. Например, рФСГ (Organon) имеет содержание сиаловой кислоты приблизительно 8 моль/моль, в то время как ФСГ, имеющий происхождение из мочи, имеет более высокое содержание сиаловой кислоты (de Leeuw et al. 1996). Соответствующие скорости клиренса из плазмы у крыс составляют 0,34 и 0,14 мл/мин (Ulloa-Aguirre et al. 2003). В другом примере, где образец рекомбинантного ФСГ разделяли на фракции с высокой и низкой pI, активность фракции с высокой pI (с меньшим содержанием сиаловой кислоты) in vivo была снижена, и эта фракция имела более короткий период полувыведения из плазмы (DʹAntonio et al. 1999). Также было сообщено, что более основной ФСГ, циркулирующий на поздних стадиях овуляторного цикла, обусловлен понижающей регуляцией α2,3-сиалилтрансферазы в аденогипофизе, что вызвано повышенными уровнями эстрадиола (Damian-Matsumara et al. 1999. Ulloa-Aguirre et al. 2001). О результатах для α2,6-сиалилтрансферазы сообщено не было.
Непосредственное сравнение общего содержания сиаловой кислоты в ФСГ и рФСГ невозможно, поскольку связывание сиаловых кислот обычно происходит двумя путями. ФСГ гипофиза/сыворотки/мочи обычно содержит сиаловую кислоту, связанную как α2,3-, так и α2,6-связями, с преобладанием первых. Однако, рекомбинантные формы, имеющие происхождение из клеток СНО, содержат только α2,3-связи (Kagawa et al, 1988, Takeuchi et al, 1988, Svensson et al., 1990). Это еще одно отличие между природными и современными рекомбинантными продуктами, в дополнение к меньшему общему содержанию сиаловой кислоты в последних.
Для получения фармацевтических человеческих рекомбинантных белков обычно используют клетки СНО. При структурном анализе выявлено, что присоединение сиаловой кислоты происходит исключительно через α2,3-связь. (Kagawa et al, 1988, Takeuchi et al, 1988, Svensson et al., 1990). Многие человеческие гликопротеины содержат как α2,3-, так и α2,6-связи. Таким образом, рекомбинантные белки, экспрессированные с использованием системы СНО, будут отличаться от их природных аналогов по их типу связей с концевыми сиаловыми кислотами. Это является важным соображением при получении биологических агентов для фармацевтического применения, поскольку углеводные группировки могут влиять на фармакологические свойства молекулы.
Желательно иметь продукт рФСГ, более точно повторяющий или имитирующий физиохимический и фармакокинетический профиль продукта, полученного из человеческой мочи. Желательно иметь продукт рФСГ, имеющий улучшенное фармакокинетическое свойство или свойства по сравнению с известным рекомбинантным продуктом.
Согласно настоящему изобретению предложен рекомбинантный ФСГ («рФСГ», «rFSH» или «рекФСГ», «recFSH»), включающий α2,3-сиалирование и α2,6-сиалирование, и, возможно, α2,8-сиалирование. В рФСГ (или препарате рФСГ) по изобретению 10% или более общего сиалирования может представлять собой α2,3-сиалирование, например, 65-85% общего сиалирования может представлять собой α2,3-сиалирование. В рФСГ (или препарате рФСГ) по изобретению 50% или менее общего сиалирования может представлять собой α2,6-сиалирование, например, 15-35% общего сиалирования может представлять собой α2,6-сиалирование. В рФСГ (или препарате рФСГ) по изобретению 5% или менее общего сиалирования может представлять собой α2,8-сиалирование, например, 0,1-4% общего сиалирования может представлять собой α2,8-сиалирование. рФСГ (или препарат рФСГ) по изобретению может иметь содержание сиаловой кислоты (выраженное как отношение молей сиаловой кислоты к молям белка) 6 моль/моль или более, например, от 6 моль/моль до 15 моль/моль.
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что тип связи с сиаловой кислотой, α2,3- или α2,6-, может оказывать сильное влияние на биологический клиренс ФСГ. В человеческих клеточных линиях, в отличие от клеточных линий СНО, возможна экспрессия рекомбинантного ФСГ с сиаловыми кислотами, присоединенными как α2,3-, так и α2,6-связями. В Примере 4 была получена клеточная линия, образующая рекомбинантный ФСГ, которая экспрессировала ФСГ, содержащий гликаны с низкими уровнями как сиаловой кислоты, связанной α2,3-связями, так и сиаловой кислоты, связанной α2,6-связями (Фиг. 6). Как и можно было предполагать, это основное вещество с ограниченным содержанием сиаловой кислоты (Фиг. 4) было подвержено очень быстрому клиренсу из кровообращения у крыс (Фиг. 7). Клеточную линию затем подвергали второй стадии конструирования с добавлением гена, кодирующего α2,6-сиалилтрансферазу (Пример 5). Полученный рФСГ был сильно сиалирован и демонстрировал содержание сиаловой кислоты и распределение pI, сопоставимые с ФСГ мочи (Фиг. 5). Однако, это вещество было подвержено очень быстрому клиренсу из кровообращения у крыс со скоростью, сопоставимой с исходным веществом, имевшим низкое содержание сиаловой кислоты (Фиг. 8). Это наблюдение было неожиданным, поскольку известно, что часть сиаловой кислоты в природном и биологически активном ФСГ связана α2,6-связями. Было обнаружено, что клиренс α2,6-сиалированного рФСГ опосредован асиалогликопротеиновым рецептором (ASGP-рецептором), обнаруженным в печени (Пример 9). Это было продемонстрировано временной блокадой ASGP-рецепторов с использованием избытка другого субстрата этого рецептора. При блокаде этого рецептора асиалофетуином ожидаемый клиренс высоко сиалированного вещества был восстановлен (Фиг. 9). Это продолжалось в течение нескольких часов, пока блокада не была преодолена и не был восстановлен быстрый клиренс высоко сиалированного рФСГ с α2,6-связями.
Рекомбинантный ФСГ со смесью как сиаловой кислоты, связанной α2,3-связями, так и сиаловой кислоты, связанной α2,6-связями, был получен конструированием человеческой клеточной линии для экспрессии как рФСГ, так и α2,3-сиалилтрансферазы (Пример 4 и 5). Экспрессируемый продукт является сильно кислым и имеет смесь как сиаловых кислот, связанных α2,3-связями, так и сиаловых кислот, связанных α2,6-связями; последние обусловлены активностью эндогенной сиалилтрансферазы (Фиг. 6). Это имеет два преимущества по сравнению с рФСГ, экспрессированным в обычных клетках СНО: во-первых, вещество более высоко сиалировано вследствие комбинированных активностей двух сиалилтрансфераз; и, во-вторых, вещество в большей степени напоминает природный ФСГ. Вероятно, оно является биологически более подходящим, чем рекомбинантные продукты, имеющие происхождение из клеток СНО, продуцирующие сиаловую кислоту, связанную только α2,3-связями (Kagawa et al, 1988, Takeuchi et al, 1988, Svensson et al., 1990), и имеющие сниженное содержание сиаловой кислоты (Ulloa-Aguirre et al. 1995., Andersen et al. 2004).
Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что рФСГ по изобретению может более точно, чем другие рекомбинантные продукты, повторять или имитировать физиохимический и фармакокинетический профиль естественного продукта, полученного из человеческой мочи. Иными словами, рФСГ по изобретению может быть более близким «естественному» ФСГ. Это может иметь существенные преимущества в отношении дозирования и тому подобного. Кроме того, более «естественный» или более «человеческий» продукт может быть более желательным для пациента, который может желать, чтобы терапия, пусть по сути дела искусственная, была по возможности «естественной». У рекомбинантного продукта, имеющего структуру углеводов (например, гликанов), более близкую к природному ФСГ (например, ФСГ мочи человека), чем другие рекомбинантные продукты, могут быть и другие преимущества (например, фармакокинетические преимущества).
Таким образом, согласно изобретению предложен рекомбинантный вариант ФСГ, имеющий смесь сиаловой кислоты, связанной α2,3-связями, и сиаловой кислоты, связанной α2,6-связями, и, следовательно, в большей степени напоминающий природный ФСГ. Ожидают, что применение этого соединения для контролируемой стимуляции яичников в методиках экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) и индукции овуляции будет приводить к более естественной стимуляции яичника по сравнению с существующими рекомбинантными продуктами.
Согласно настоящему изобретению предложен рекомбинантный ФСГ («рФСГ», «rFSH» или «рекФСГ», «recFSH») (и/или препарат рекомбинантного ФСГ), включающий α2,3-сиалирование и α2,6-сиалирование. рФСГ или препарат рФСГ может, возможно, дополнительно включать α2,8-сиалирование.
Здесь термин «препарат рекомбинантного ФСГ» включает препарат, для, например, фармацевтического применения, содержащий рекомбинантный ФСГ. В воплощениях данного изобретения рФСГ может присутствовать в виде одной изоформы или как смесь изоформ.
рФСГ (или препарат рФСГ) по изобретению может иметь содержание сиаловой кислоты (выраженное как отношение молей сиаловой кислоты к молям белка) 6 моль/моль или более (Пример 8), например, от 6 моль/моль до 15 моль/моль, например, от 8 моль/моль до 14 моль/моль, например, от 10 моль/моль до 14 моль/моль, например, от 11 моль/моль до 14 моль/моль, например, от 12 моль/моль до 14 моль/моль, например, от 12 моль/моль до 13 моль/моль. рФСГ по изобретению может быть получен или экспрессирован в человеческой клеточной линии.
В рФСГ (или препарате рФСГ) по изобретению 10% или более общего сиалирования может представлять собой а2,3-сиалирование. Например, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 или 90% или более общего сиалирования может представлять собой α2,3-сиалирование. рФСГ (или препарат рФСГ) может включать α2,3-сиалирование в количестве, составляющем от 65 до 85% общего сиалирования, например, от 70 до 80% общего сиалирования, например, от 71 до 79% общего сиалирования. В рФСГ (или препарате рФСГ) по изобретению 50% или менее общего сиалирования может представлять собой α2,6-сиалирование. Например, 40, 30, 20, 10 или 5% или менее общего сиалирования может представлять собой α2,6-сиалирование. рФСГ (или препарат рФСГ) может включать α2,6-сиалирование в количестве, составляющем от 15 до 35% общего сиалирования, например, от 20 до 30% общего сиалирования, например, от 21 до 29% общего сиалирования. В рФСГ (или препарате рФСГ) по изобретению 5% или менее общего сиалирования может представлять собой α2,8-сиалирование. Например, 2,5% или менее общего сиалирования может представлять собой α2,8-сиалирование. рФСГ (или препарат рФСГ) может включать α2,8-сиалирование в количестве, составляющем от 0,1 до 4% общего сиалирования, например, от 0,5 до 3% общего сиалирования, например, от 0,5 до 2,5% общего сиалирования. Под сиалированием понимают количество остатков сиаловой кислоты, присутствующих в углеводных структурах ФСГ. α2,3-Сиалирование означает сиалирование по 2,3-положению (как хорошо известно в данной области техники), и α2,6-сиалирование означает сиалирование по 2,6-положению (как хорошо известно в данной области техники). Таким образом, «% общего сиалирования, который может представлять собой α2,3-сиалирование» относится к % общего числа остатков сиаловой кислоты, присутствующих в ФСГ, сиалированных по 2,3-положению. Термин «% общего сиалирования, представляющий собой α2,6-сиалирование» относится к % общего числа остатков сиаловой кислоты, присутствующих в ФСГ, сиалированных по 2,6-положению.
рФСГ (или препарат рФСГ) по изобретению может иметь содержание сиаловой кислоты (количество сиалирования на молекулу ФСГ) (исходя из массы белка, а не массы белка с углеводом) 6% или более (например, от 6% до 15%, например, от 7% до 13%, например, от 8% до 12%, например, от 11% до 15%, например, от 12% до 14%) по массе.
Рекомбинантный ФСГ, экспрессированный в клетках яичника китайского хомячка (СНО), содержит исключительно α2,3-сиалирование (Kagawa et al, 1988, Takeuchi et al. 1988, Svensson et al. 1990).
рФСГ по изобретению может быть получен или экспрессирован в человеческой клеточной линии. Это может упростить (и сделать более эффективным) способ получения, поскольку манипулирование и контроль, например, питательной среды для клеток для сохранения сиалирования могут быть менее критичными, чем в известных способах. Способ может также быть более эффективным ввиду меньшего образования основного рФСГ по сравнению с получением известных продуктов рФСГ; происходит образование более кислого рФСГ, и отделение/удаление основного ФСГ менее проблематично. рФСГ может быть получен или экспрессирован в клеточной линии Per.С6, клеточной линии, имеющей происхождение из Per.С6, или модифицированной клеточной линии Per.С6. Клеточная линия может быть модифицирована с использованием α2,3-сиалилтрансферазы. Клеточная линия может быть модифицирована с использованием α2,6-сиалилтрансферазы. Альтернативно или дополнительно, рФСГ может содержать сиаловые кислоты, связанные α2,6-связями (α2,6-сиалирование), обеспеченные активностью эндогенной сиалилтрансферазы (клеточной линии).
рФСГ может быть получен с использованием α2,3- и/или α2,6-сиалилтрансферазы. рФСГ может быть получен с использованием α2,3-сиалилтрансферазы. рФСГ может содержать сиаловые кислоты, связанные α2,6-связями (α2,6-сиалирование), обеспеченные активностью эндогенной сиалилтрансферазы.
В другом аспекте согласно настоящему изобретению предложен способ получения рФСГ и/или препарата рФСГ, как описано здесь (согласно аспектам изобретения), включающий стадию продуцирования или экспрессии рФСГ в человеческой клеточной линии, например, клеточной линии Per.С6, клеточной линии, имеющей происхождение из Per.C6, или модифицированной клеточной линии Per.C6, например, клеточной линии, которая была модифицирована с использованием α2,3-сиалилтрансферазы.
Структура рФСГ содержит гликановые группировки. Возможны разветвления, приводящие к тому, что гликан имеет 1, 2, 3, 4 или более концевых сахарных остатков или «антенн», как хорошо известно в данной области техники. рФСГ по изобретению может содержать гликаны с сиалированием, присутствующим в структурах с одним концевым остатком, и/или с двумя концевыми остатками, и/или с тремя концевыми остатками, и/или с четырьмя концевыми остатками. рФСГ может предпочтительно включать моносиалированные, дисиалированные, трисиалированные и тетрасиалированные гликановые структуры со следующими относительными количествами: 9-15% моносиалированных, 27-30% дисиалированных, 30-36% трисиалированных и 25-29% тетрасиалированных (например, как показано анализом со слабыми анионообменниками (WAX-анализом) заряженных гликанов, как изложено в Примере 8в).
В другом аспекте согласно настоящему изобретению предложен рФСГ, полученный (например, экспрессированный) в человеческой клеточной линии. рФСГ может включать α2,3- и α2,6-сиалирование. рФСГ может быть получен или экспрессирован в клеточной линии Per.С6, клеточной линии, имеющей происхождение из Per.С6, или модифицированной клеточной линии Per.С6. Клеточная линия может быть модифицирована с использованием α2,3-сиалилтрансферазы. Клеточная линия может быть модифицирована с использованием α2,6-сиалилтрансферазы. Альтернативно или дополнительно рФСГ может содержать сиаловые кислоты, связанные α2,6-связями (α2,6-сиалирование), обеспеченные активностью эндогенной сиалилтрансферазы (клеточной линии). В рФСГ (или препарате рФСГ) 10% или более общего сиалирования может представлять собой α2,3-сиалирование, например, 65-85% общего сиалирования может представлять собой α2,3-сиалирование. В рФСГ (или препарате рФСГ) по изобретению 50% или менее общего сиалирования может представлять собой α2,6-сиалирование, например, 15-35% общего сиалирования может представлять собой α2,6-сиалирование. В рФСГ (или препарате рФСГ) по изобретению 5% или менее общего сиалирования может представлять собой а2,8-сиалирование, например, 0,5-4% общего сиалирования может представлять собой α2,8-сиалирование. рФСГ может иметь содержание сиаловой кислоты (выраженное как отношение молей сиаловой кислоты к молям белка) 6 моль/моль или более, например, от 6 моль/моль до 15 моль/моль.
В другом аспекте согласно настоящему изобретению предложена фармацевтическая композиция, содержащая рФСГ, включающий α2,3-сиалирование и α2,6-сиалирование (например, как изложено выше). Фармацевтическая композиция может дополнительно содержать хорионический гонадотропин человека (ХГЧ, hCG) и/или ЛГ.
ХГЧ может быть получен любым способом, известным в данной области техники. При использовании здесь ХГЧ включает ХГЧ, имеющий происхождение из человека, и рекомбинантный ХГЧ. ХГЧ, имеющий происхождение из человека, может быть очищен из любого подходящего источника (например, мочи и плаценты) любым способом, известным в данной области техники. Способы экспрессии и очистки рекомбинантного ХГЧ хорошо известны в данной области техники.
ЛГ может быть получен любым способом, известным в данной области техники. При использовании здесь ЛГ включает ЛГ, имеющий происхождение из человека, и рекомбинантный ЛГ. ЛГ, имеющий происхождение из человека, может быть очищен из любого подходящего источника (например, мочи) любым способом, известным в данной области техники. Способы экспрессии и очистки рекомбинантного ЛГ известны в данной области техники.
Фармацевтическая композиция может быть предназначена для лечения бесплодия, например, для применения, например, во вспомогательных репродуктивных технологиях (ВРТ), индукции овуляции или внутриматочном осеменении (ВО). Фармацевтическая композиция может быть использована, например, по медицинским показаниям, при которых используют известные препараты ФСГ. Согласно настоящему изобретению также предложено применение рФСГ и/или препарата рФСГ, описанного здесь (согласно аспектам изобретения), для изготовления или в изготовлении лекарственного средства для лечения бесплодия. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут быть изготовлены в форме хорошо известных композиций для любого пути введения лекарственного средства, например, перорального, ректального, парентерального, чрескожного (например, пластырная технология), внутривенного, внутримышечного, подкожного, внутригрудинного, интравагинального, внутрибрюшинного, местного (порошки, мази или капли) или в форме буккального или назального спрея. Типичная композиция содержит фармацевтически приемлемый носитель, такой как водный раствор, нетоксичные эксципиенты, включая соли и консерванты, буферы и тому подобное, как описано, среди прочего, в Remingtonʹs Pharmaceutical Sciences fifteenth edition (Matt Publishing Company, 1975), на стр. 1405-1412 и 1461-87, и Национальном фармацевтическом формуляре XIV, четырнадцатого издания (American Pharmaceutical Association, 1975).
Примеры подходящих водных и неводных фармацевтических носителей, разбавителей, растворителей или наполнителей включают воду, этанол, полиолы (такие как глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и тому подобное), карбоксиметилцеллюлозу и ее подходящие смеси, растительные масла (такие как оливковое масло) и органические сложные эфиры для инъекций, такие как этилолеат.
Композиции по настоящему изобретению также могут содержать добавки, такие как, без ограничения, консерванты, увлажняющие агенты, эмульгаторы и диспергирующие агенты. Для предотвращения роста микробов могут быть включены антибактериальные и противогрибковые агенты, и они включают, например, парабен, хлорбутанол, фенол, сорбиновую кислоту и тому подобное. Более того, может быть желательным включение изотонических агентов, таких как сахара, хлорид натрия и тому подобное.
В некоторых случаях для обеспечения длительного действия желательно замедлить всасывание ФСГ (и других активных ингредиентов, если они присутствуют) после подкожной или внутримышечной инъекции. Это может быть осуществлено с использованием жидкой суспензии кристаллического или аморфного вещества, плохо растворимого в воде. В этом случае скорость всасывания ФСГ зависит от скорости его растворения, которая, в свою очередь, может зависеть от размера кристаллов и кристаллической формы. Альтернативно, замедленного всасывания парентерально вводимой формы комбинированного ФСГ достигают растворением или суспендированием комбинированного ФСГ в масляном наполнителе.
Депо-формы для инъекций могут быть получены путем изготовления микроинкапсулированных матриц ФСГ (и других агентов, если они присутствуют) в биодеградируемых полимерах, таких как полилактид-полигликолид. В зависимости от соотношения ФСГ и полимера и природы конкретного используемого полимера можно регулировать скорость высвобождения ФСГ. Примеры других биодеградируемых полимеров включают поливинилпирролидон, поли(ортоэфиры), поли(ангидриды) и тому подобное. Депо-композиции для инъекций также изготавливают путем захвата ФСГ в липосомы или микроэмульсии, совместимые с тканями организма.
Композиции для инъекций можно стерилизовать, например, фильтрацией через фильтр, задерживающий бактерии, или включением стерилизующих агентов в форму стерильных твердых композиций, которые могут быть растворены или диспергированы в стерильной воде или другой стерильной среде для инъекций непосредственно перед применением. Возможна доставка композиций для инъекций в любом подходящем контейнере, например, флаконе, предварительно заполненном шприце, инъекционных картриджах и тому подобном.
Возможна доставка композиций для инъекций в виде продукта, включающего фармацевтические композиции, содержащие ФСГ (возможно с ХГЧ, ЛГ и тому подобным). При наличии более чем одного активного ингредиента (то есть, ФСГ и, например, ХГЧ или ЛГ), они могут быть подходящими для раздельного или совместного введения. При раздельном введении, оно может быть последовательным. Возможна доставка продукта в любой подходящей упаковке. Например, продукт может включать несколько предварительно заполненных шприцев, содержащих либо ФСГ или ХГЧ по отдельности, либо комбинацию ФСГ и ХГЧ, упакованных в блистерную упаковку или другое устройство для сохранения стерильности. Продукт может возможно включать инструкции по применению композиций ФСГ и ХГЧ.
рН и точная концентрация различных компонентов фармацевтической композиции корректируют в соответствии с обычной практикой в данной области техники. См. GOODMAN and GILMAN, THE PHARMACOLOGICAL BASIS FOR THERAPEUTICES, 7th ed. В предпочтительном воплощении композиции по изобретению доставляют как композиции для парентерального введения. Общие способы изготовления композиций для парентерального введения известны в данной области техники и описаны в REMINGTON; THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY, supra, на стр. 780-820. Возможна доставка композиций для парентерального введения в виде жидкой композиции или твердого вещества, которое будут смешивать со стерильной средой для инъекций непосредственно перед введением. В особо предпочтительном воплощении композиции для парентерального введения доставляют в стандартной лекарственной форме для простоты введения и единообразия дозирования.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение будет теперь описано более подробно со ссылкой на следующие Примеры и приложенные графические материалы, описанные ниже.
На Фиг. 1 показана плазмидная карта вектора экспрессии pFSHalpha/beta.
CMV обозначает цитомегаловирусный промотор, BGHp(A) обозначает последовательность полиаденилирования бычьего гормона роста, fl ori обозначает репликатор fl, SV40 обозначает промотор вируса обезьян 40, Neo обозначает маркер устойчивости к неомицину, Hyg обозначает маркер устойчивости к гигромицину, SV40 р(А) обозначает последовательность полиаденилирования вируса обезьян 40, FSH А обозначает альфа-полипептид фолликулостимулирующего гормона, FSH В обозначает бета-полипептид фолликулостимулирующего гормона, ColEI обозначает репликатор ColEI, Amp обозначает маркер устойчивости к ампициллину.
На Фиг. 2 показана плазмидная карта вектора экспрессии α2,3-сиалилтрансферазы pST3 (ST3GAL4). ST3GAL4 обозначает α2,3-сиалилтрансферазу.
На Фиг. 3 показана плазмидная карта вектора экспрессии α2,6-сиалилтрансферазы pST6 (ST6GAL1). ST6GAL1 обозначает α2,6-сиалилтрансферазу.
На Фиг. 4 показано изоэлектрическое фокусирование рекомбинантного ФСГ, продуцированного клетками Per.С6, стабильно экспрессирующими ФСГ.
Супернатанты клеточных культур разделяли в нативных условиях в градиенте рН 3,0-7,0. Клон 005 является типичным из пяти клонов, взятых далее для конструирования с использованием сиалилтрансферазы. Клоны, содержащие менее кислые изоформы, были забракованы.
На Фиг. 5 показан пример клонов, анализированных изоэлектрическим фокусированием рекомбинантного ФСГ, продуцированного клетками Per.С6, стабильно экспрессирующими ФСГ, после конструирования с использованием α2,3- или α2,6-сиалилтрансферазы.
Супернатанты клеточных культур разделяли в нативных условиях в градиенте рН 3,0-7,0. Клон 005 является исходной клеточной линией Per.С6, продуцирующей ФСГ. Работы с клонами, демонстрирующими основные или смешанные профили, были прекращены (*). Оставшиеся клоны демонстрируют успешное конструирование с использованием сиалилтрансферазы с увеличением числа молекул сиаловой кислоты на ФСГ.
На Фиг. 6 показан анализ связей сиаловых кислот ФСГ из Per.С6.
Очищенный ФСГ из Per.С6 разделяли посредством электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) на двух гелях, переносили на нитроцеллюлозу и визуализировали с использованием набора DIG Glycan Differentiation Kit (номер по каталогу 11210238001, Roche), следуя инструкциям изготовителя. Положительные реакции с агглютинином Sambucus nigra (SNA) указывали на наличие терминально связанной (2-6) сиаловой кислоты (А). Положительные реакции с агглютинином Maackia amurensis (МАА) указывали на наличие терминально связанной (2-3) сиаловой кислоты (Б). Дорожка I представляет собой контроль изготовителя, содержащий только α2,6-связи. Дорожка II представляет собой контроль изготовителя, содержащий α2,6- и α2,3-связи. Образец а представляет собой коммерческий рекомбинантный ФСГ, имеющий происхождение из клеток СНО (Gonal-f, Serono). Образец б представляет собой исходный рФСГ из Per.С6 без конструирования с использованием сиалилтрансферазы. Образец в представляет собой рФСГ из Per.С6 с конструированием с использованием α2,6-сиалилтрансферазы. Образец г представляет собой рФСГ из Per.С6 с конструированием с использованием α2,3-сиалилтрансферазы.
На Фиг. 7 показаны скорости метаболического клиренса (MCR) образцов ФСГ из Per.С6.
В момент времени «ноль» самкам крыс (3 животных на клон) производили болюсную инъекцию рФСГ (1-10 мкг на крысу) в хвостовую вену. Содержание ФСГ в образцах крови, полученных в определенные моменты времени, анализировали посредством твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA).
На Фиг. 8 показаны MCR образцов ФСГ из Per.С6, сконструированных с использованием α2,6-сиалилтрансферазы.
В момент времени «ноль» самкам крыс (3 животных на клон) производили болюсную инъекцию рФСГ (1-10 мкг на крысу) в хвостовую вену. Содержание ФСГ в образцах крови, полученных в определенные моменты времени, анализировали посредством ELISA.
На Фиг. 9 показаны скорости метаболического клиренса образцов ФСГ из Per.С6, сконструированных с использованием α2,6-сиалилтрансферазы, при одновременном введении 7500-кратного молярного избытка асиалофетуина для насыщения асиалогликопротеинового рецептора (ASGP-R) в течение 1-2 часов.
На Фиг. 10 показаны скорости метаболического клиренса образцов ФСГ из Per.С6, сконструированных с использованием а2,3-сиалилтрансферазы. Образцы были выбраны по содержанию в них сиаловой кислоты на основании их профиля изоэлектрического фокусирования (IEF-профиля).
На Фиг. 11 показано увеличение массы яичников клонами рФСГ из Per.С6 от исходных Per.С6, продуцирующих рФСГ, согласно способу Steelman и Pohley (1953).
рФСГ из Per.С6 и стандарты (рФСГ Gonal-f) исследовали в разных дозах (3 крысы на дозу).
На Фиг. 12 показано увеличение массы яичников клонами рФСГ из Per.C6 от сконструированных (α2,6-сиалилтрансфераза) Per.С6, продуцирующих рФСГ, согласно способу Steelman и Pohley (1953).
рФСГ из Per.С6, сконструированных с использованием α2,6-сиалилтрансферазы, и стандарты (рФСГ Gonal-f) исследовали в разных дозах (3 крысы на дозу).
На Фиг. 13 показано увеличение массы яичников клонами рФСГ из Per.С6 от сконструированных (α2,3-сиалилтрансфераза) Per.С6, продуцирующих рФСГ, согласно способу Steelman и Pohley (1953).
Исходный рФСГ из Per.С6, рФСГ из Per.С6, сконструированных с использованием α2,3-сиалилтрансферазы, и стандарты (рФСГ Gonal-f) исследовали в пяти разных дозах (3 крысы на дозу).
Выбор последовательностей
Человеческий ФСГ
Использовали кодирующую область гена альфа-полипептида ФСГ согласно Fiddes and Goodman (1981). Данную последовательность хранят под обозначением АН007338, и на момент конструирования у данной белковой последовательности не было других вариантов. Здесь эта последовательность названа SEQ ID NO: 1.
Использовали кодирующую область гена бета-полипептида ФСГ согласно Keene et al (1989). Данную последовательность хранят под обозначением NM_000510, и на момент конструирования у данной белковой последовательности не было других вариантов. Здесь эта последовательность названа SEQ ID NO: 2.
Сиалилтрансфераза
α2,3-Сиалилтрансфераза. Использовали кодирующую область гена бета-галактозид-альфа-2,3-сиалилтрансферазы 4 (α2,3-сиалилтрансферазы, ST3GAL4) согласно Kitagawa and Paulson (1994). Данную последовательность хранят под обозначением L23767, и здесь она названа SEQ ID NO: 3.
α2,6-Сиалилтрансфераза. Использовали кодирующую область гена бета-галактозамид-альфа-2,6-сиалилтрансферазы 1 (α2,6-сиалилтрансферазы, ST6GAL1) согласно Grundmann et al. (1990). Данную последовательность хранят под обозначением NM_003032, и здесь она названа SEQ ID NO: 4.
ПРИМЕРЫ
Пример 1. Конструирование вектора экспрессии ФСГ
Кодирующую последовательность альфа-полипептида ФСГ (АН007338, SEQ ID NO: 1) и бета-полипептида ФСГ (NM_003032, SEQ ID NO: 2) амплифицировали посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием комбинаций праймеров FSHa-прямой и FSHa-обратный, и FSHb-прямой и FSHb-обратный, соответственно.
Полученную амплифицированную ДНК ФСГ-бета расщепляли рестриктазами AscI и HpaI и вводили в сайты AscI и HpaI в векторе экспрессии млекопитающих под контролем CMV, несущем неомициновый селектируемый маркер. Сходным образом, ДНК ФСГ-альфа расщепляли BamHI и NheI и вводили в сайты BamHI и NheI в векторе экспрессии, уже содержащем ДНК бета-полипептида ФСГ.
Векторную ДНК использовали для трансформации штамма Е. coli DH5α. Для амплификации были отобраны шестьдесят колоний, и пятьдесят семь содержали вектор, содержащий как ФСГ-альфа, так и ФСГ-бета. Двадцать из них были выбраны для секвенирования, и все они содержали нужные последовательности согласно SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2. Для трансфекции была выбрана плазмида pFSH А+В#17 (Фиг. 1).
Пример 2. Конструирование вектора экспрессии ST3
Кодирующую последовательность бета-галактозид-альфа-2,3-сиалилтрансферазы 4 (ST3, L23767, SEQ ID NO: 3) амплифицировали посредством ПЦР с использованием комбинации праймеров 2,3ST-прямого и 2,3ST-обратного.
Полученную амплифицированную ДНК ST3 расщепляли рестриктазами BamHI и АflII и вводили в сайты BamНI и AflII в векторе экспрессии млекопитающих под контролем CMV, несущем маркер устойчивости к гигромицину. Вектор амплифицировали, как описано выше, и секвенировали. Клон pST3#1 (Фиг. 2) содержал нужную последовательность согласно SEQ ID NO: 3, и он был выбран для трансфекции.
Пример 3. Конструирование вектора экспрессии ST6
Кодирующую последовательность бета-галактозамид-альфа-2,6-сиалилтрансферазы 1 (ST6, NM_003032, SEQ ID NO: 4) амплифицировали посредством ПЦР с использованием комбинации праймеров 2,6ST-прямого и 2,6ST-обратного.
Полученную амплифицированную ДНК ST6 расщепляли рестриктазами BamHI и AflII и вводили в сайты BamHI и AflII в векторе экспрессии млекопитающих под контролем CMV, несущем маркер устойчивости к гигромицину. Вектор амплифицировали, как описано выше, и секвенировали. Клон pST6#11 (Фиг. 3) содержал нужную последовательность согласно SEQ ID NO: 4 и был выбран для трансфекции.
Пример 4. Стабильная экспрессия pFSH А+В в клетках PER.C6 Трансфекция, выделение и скрининг клонов
Клоны Per.С6, продуцирующие ФСГ, получали экспрессией обеих полипептидных цепей ФСГ с одной плазмиды (см. Пример 1).
Для получения стабильных клонов использовали агент для трансфекции на основе липосом совместно с конструкцией pFSH А+В. Стабильные клоны отбирали на среде VPRO, дополненной 10% фетальной телячьей сывороткой (FCS) и содержащей G418. Через три недели после трансфекции вырастали клоны, устойчивые к G418. Для выделения были отобраны в общей сложности 250 клонов. Выделенные клоны культивировали в селекционной среде до 70-80% конфлюэнтности. Супернатанты анализировали на предмет содержания белка ФСГ с применением ФСГ-селективного ELISA и на предмет фармакологичекой активности в отношении рецептора ФСГ в клонированной клеточной линии с применением анализа накопления циклического аденозинмонофосфата (цАМФ). Клоны (98), экспрессирующие функциональный белок, размножали в культурах далее в 24-луночных и 6-луночных планшетах и колбах Т80.
Исследования по определению продуктивности и качества вещества от семи клонов проводили в колбах Т80 для получения достаточного количества вещества. Клетки культивировали в обогащенных средах, как описано выше, в течение 7 суток и собирали супернатант. Продуктивность определяли с применением ФСГ-селективного ELISA. Определяли изоэлектрический профиль вещества (Пример 6). Типичные образцы показаны на Фиг. 4. Информация, полученная при IEF, была использована для выбора клонов для анализа скорости метаболического клиренса (Пример 9). Клоны (005, 104, 179, 223, 144) с достаточной продуктивностью и качеством были выбраны для конструирования с использованием сиалилтрансферазы.
Пример 5. Степень сиалирования повышена в клетках, сверхэкспрессирующих α2,3- или α2,6-сиалилтрансферазу. Стабильная экспрессия pST3 или pST6 в клетках PER.C6, экспрессирующих ФСГ; трансфекция, выделение и скрининг клонов
Клоны Per.С6, продуцирующие высоко сиалированный ФСГ, получали экспрессией α2,3-сиалилтрансферазы или α2,6-сиалилтрансферазы с отдельных плазмид (см. Примеры 2 и 3) в клетках Per.С6, уже экспрессирующих обе полипептидные цепи ФСГ (см. Пример 4). Четыре клона, полученные из клеток PER.C6®, как изложено в Примере 4, были выбраны на основании их характеристик, включая продуктивность, хорошие ростовые качества, продукцию функционального белка, и они продуцировали ФСГ, включавший некоторое сиалирование.
Стабильные клоны получали, как описано выше в Примере 4. Проводили выделение, размножение и анализ в общей сложности 202 клонов из программы с α2,3-сиалилтрансферазой и 210 клонов из программы с α2,6-сиалилтрансферазой. Конечное число клонов для исследования с α2,3-сиалилтрансферазой составило 12, а для исследования с α2,6-сиалилтрансферазой - 30.
Клоны с α2,3-сиалилтрансферазой адаптировали для свободных от сыворотки сред и суспензионных условий.
Как описано выше, клоны анализировали с применением ФСГ-селективного ELISA, функционального ответа в клеточной линии с рецептором ФСГ, IEF (Пример 6), скорости метаболического клиренса (Пример 9) и анализа Steelman-Pohley (Пример 10). Результаты сравнивали с имеющимся в продаже рекомбинантным ФСГ (Gonal-f, Serono) и исходным ФСГ из клеточных линий Per.С6. Типичные образцы показаны на Фиг. 5. Некоторые клоны не демонстрировали увеличение сиалирования, однако можно наблюдать, что ФСГ, продуцируемый большинством клонов, имеет значительно улучшенное сиалирование (то есть, в среднем больше изоформ ФСГ с большим количеством сиаловых кислот) по сравнению с ФСГ, экспрессированным без α2,3- или α2,6- сиалилтрансферазы.
В заключение, экспрессия ФСГ совместно с сиалилтрансферазой в клетках Per.С6 приводит к повышенным уровням сиалированного ФСГ по сравнению с клетками, экспрессирующими только ФСГ.
Пример 6. Анализ pI изоформ ФСГ, продуцированных Per.С6, изоэлектрическим фокусированием
Электрофорез определяют как транспорт заряженных молекул через растворитель в электрическом поле. Подвижность биологической молекулы в электрическом поле будет зависеть от напряженности поля, общего заряда молекулы, размера и формы молекулы, ионной силы и свойств среды, через которую движутся молекулы.
Изоэлектрическое фокусирование (IEF) является электрофоретической методикой разделения белков на основании их pl. pl представляет собой рН, при котором общий заряд белка равен нулю, и белок не будет двигаться в электрическом поле. Содержание сиаловой кислоты в изоформах ФСГ незначительно смещает точку pI для каждой изоформы, что можно использовать с применением данной методики для визуального отличия изоформ ФСГ из Per.С6 друг от друга.
Изоэлектрические точки изоформ ФСГ, продуцированных в Per.С6, анализировали в супернатантах клеточных культур с применением изоэлектрического фокусирования. Среды клеточных культур от клонов Per.С6, продуцирующих ФСГ, получали, как описано в Примере 4 и 5.
Образцы ФСГ из Per.С6 разделяли в гелях для изоэлектрического фокусирования Novex®, содержащих 5% полиакриламид, в нативных условиях с градиентом рН 3,0-7,0 в растворе амфотерного электролита, рН 3,0-7,0.
Белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану и визуализировали с применением первичного моноклонального антитела против ФСГα, вторичного антитела против мышиного IgG, конъюгированного с щелочной фосфатазой, и реагента из 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфата (BCIP) и нитросинего тетразолия (NBT) для визуализации полос.
Как указано на Фиг. 4 и 5, полосы отражают изоформы ФСГ, содержащие различные количества молекул сиаловой кислоты.
С применением данного способа были идентифицированы клоны, продуцирующие изоформы ФСГ с большим количеством молекул сиаловой кислоты. Конструирование с использованием α2,3- или α2,6-сиалилтрансферазы приводило к получению клонов с большим содержанием сиаловой кислоты и более низкой pI.
Пример 7. Анализ связей сиаловых кислот в ФСГ из Per.С6
Гликоконъюгаты анализировали с применением способа различения гликанов на основе лектина. Этот способ позволяет описывать гликопротеины и гликоконъюгаты, связанные с нитроцеллюлозой. Пектины селективно распознают определенную группировку, например, сиаловую кислоту, связанную через α2,3-связь. Используемые лектины конъюгированы со стероидным гаптеном дигоксигенином, что делает возможным иммунологическое выявление связанных лектинов.
Очищенный ФСГ из Per.С6 от исходного клона (без дополнительной сиалилтрансферазы), клона, сконструированного с использованием α2,3-сиалилтрансферазы, и клона, сконструированного с использованием α2,6-сиалилтрансферазы, разделяли с применением стандартных методик SDS-PAGE. Имеющийся в продаже рекомбинантный ФСГ (Gonal-f, Serono) использовали в качестве стандарта.
Сиаловую кислоту анализировали с использованием набора DIG Glycan Differentiation Kit (номер по каталогу 11210238001, Roche), следуя инструкциям изготовителя. Положительные реакции с агглютинином Sambucus nigra (SNA) указывали на наличие терминально связанной (2-6) сиаловой кислоты (А). Положительные реакции с агглютинином Maackia amurensis (МАА) указывали на наличие терминально связанной (α2-3) сиаловой кислоты (Б).
В заключение, исходный клон 005 содержал низкие уровни как α2,3-, так и α2,6-сиаловой кислоты. Клоны, сконструированные с использованием α2,3-сиалилтрансферазы, содержали высокие уровни α2,3-связей сиаловых кислот и низкие уровни α2,6-связей сиаловых кислот. Клоны, сконструированные с использованием α2,6-сиалилтрансферазы, содержали высокие уровни α2,6-связей сиаловых кислот и низкие уровни α2,3-связей сиаловых кислот. Стандартный контроль Gonal-f содержит только α2,3-связи сиаловых кислот. Это согласуется с тем, что известно о рекомбинантных белках, полученных в клетках яичника китайского хомячка (СНО) (Kagawa et al, 1988, Takeuchi et al, 1988, Svensson et al., 1990).
В заключение, конструирование клеток Per.С6, продуцирующих ФСГ, с использованием α2,3- или α2,6-сиалилтрансферазы успешно увеличивало число молекул сиаловой кислоты, конъюгированных с ФСГ, в образце.
Пример 8а. Количественное определение общей сиаловой кислоты
Сиаловая кислота представляет собой связанный с белками углевод, который считают моносахаридом, и она встречается в комбинации с другими моносахаридами, такими как галактоза, манноза, глюкозамин, галактозамин и фукоза.
Общую сиаловую кислоту в очищенном рФСГ (Пример 11) измеряли с использованием набора для ферментативного количественного определения сиаловой кислоты, следуя протоколу изготовителя (Sigma, Sialic-Q). Кратко, N-ацетилнейраминовая кислота-альдолаза катализирует превращение сиаловой кислоты в N-ацетилманнозин и пировиноградную кислоту. Пировиноградная кислота может быть восстановлена до молочной кислоты восстановленным β-никотинамидадениндинуклеотидом (β-NADH) и лактатдегидрогеназой. Окисление β-NADH может быть точно измерено спектрофотометрией.
Концентрацию белка измеряли в титрационных микропланшетах с использованием коммерческого набора для анализа с бицинхониновой кислотой (ВСА-анализа) (Sigma, В 9643) на основании способа Lowry (Lowry et al, 1951).
Было измерено общее содержание сиаловой кислоты в ФСГ из Per.С6, и было обнаружено, что оно превышало 6 моль/моль.
Пример 8б. Количественное определение относительных количеств α2,3-, α2,6- и α2,8-сиаловой кислоты
Относительные процентные количества α2,3-, α2,6- и α2,8-сиаловой кислоты в очищенном рФСГ (Пример 11) измеряли с применением известных методик.
Каждый образец рФСГ иммобилизовали (гелевый блок), промывали, восстанавливали, алкилировали и расщепляли пептид-N-гликаназой F (PNGase F) в течение ночи. N-гликаны затем экстрагировали и подвергали дальнейшей обработке. Проводили мечение N-гликанов флуорофором 2АВ для нормально-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (NP-HPLC) и высокоэффективной жидкостной хроматографии со слабыми анионообменниками (WAX-HPLC), как подробно описано Royle et al. N-гликаны анализировали нормально-фазовой (NP) HPLC на амидной колонке TSK (как подробно описано Royle et al) и время удерживания выражали в глюкозных единицах (GU).
Образцы экстрагированных объединенных гликанов (экстрагированных, как описано выше) расщепляли различными сиалидазами для определения связей. NAN 1 (рекомбинантная сиалидаза) высвобождает связанные α2,3-связями невосстанавливающие концевые сиаловые кислоты (N-ацетилнейраминовую кислоту (NeuNAc) и N-гликолилнейраминовую кислоту (NeuNGc)), ABS (сиалидаза Arthrobacter ureafaciens) высвобождает связанные α2,3-, α2,6- и α2,8-связями невосстанавливающие концевые сиаловые кислоты (NeuNAc и NeuNGc). Образцы анализировали посредством NP-HPLC для сравнения нерасщепленного образца с образцом, расщепленным NAN1, и образцом, расщепленным ABS. Сравнение трех записей NP-HPLC (нерасщепленный, расщепленный NAN1, расщепленный ABS) демонстрирует, что расщепление ABS и NAN1 дает разные результаты. Это указывает на то, что образцы содержат сиаловые кислоты с α2,3-, α2,6- и α2,8-связями. Для структур, присутствующих в пулах нерасщепленных гликанов, были вычислены относительные процентные количества, и было обнаружено, что они составляют 65%-85% (например, 77,75%) для α2,3-сиалирования, 15-35% (например, 21,46%) для α2,6-сиалирования и 0,1-3% для α2,8-сиалирования.
Пример 8в. Количественное определение относительных количеств моно-, ди-, три- и тетраразветвленных сиалированных структур
Относительные процентные количества моно-, ди-, три- и тетрасиалированных структур в гликанах, экстрагированных из очищенного рФСГ (Пример 11), измеряли с применением известных методик.
Каждый образец рФСГ иммобилизовали (гелевый блок), промывали, восстанавливали, алкилировали и расщепляли пептид-N-гликаназой F (PNGase F) в течение ночи. N-гликаны затем экстрагировали и подвергали дальнейшей обработке. Проводили мечение N-гликанов флуорофором 2АВ для NP-HPLC и WAX-HPLC, как подробно описано Royle et al.
HPLC со слабыми анионообменниками (WAX) для разделения N-гликанов по заряду (Пример 8б) проводили, как изложено в Royle et al, с фетуиновым N-гликановым стандартом в качестве контроля. Элюирование гликанов проводили согласно числу содержавшихся в них сиаловых кислот. Все образцы включали моно- (1S), ди- (2S), три- (3S) и тетра- (4S) сиалированные структуры. Было обнаружено, что относительные количества сиалированных структур были в пределах следующих соотношений (1S:2S:4S:4S):9-15%:27-30%:30-36%:25-29% (например, 10,24:28,65:35,49:25,62).
Пример 9. Определение скоростей метаболического клиренса рФСГ
Для определения скорости метаболического клиренса (MCR) образцов ФСГ из Per.С6 самкам крыс (3 животных на клон), находящимся в сознании, в момент времени «ноль» производили болюсную инъекцию рФСГ (1-10 мкг на крысу, на основании количественной оценки образцов посредством ELISA, DRG EIA 1288) в хвостовую вену. Образцы крови (400 мкл) отбирали из кончика хвоста на 1, 2, 4, 8, 12, 24 и 32 часы после инъекции исследуемого образца. Сыворотку собирали центрифугированием и анализировали в ней содержание ФСГ посредством ELISA (DRG EIA 1288).
Асиалогликопротеиновый рецептор (ASGP-R) распознает десиалированные гликопротеины (с концевой галактозой), такие как асиалофетуин (ASF). (Pricer and Ashwell, 1971. Van Lenten and Ashwell, 1972). Рецептор ASGP и связанный десиалированный гликопротеин поступают внутрь клетки, где происходят регенерация рецептора и деградация лиганда (Regoeczi et al, 1978, Steer and Ashwell, 1980).
Для исследования роли этого механизма в клиренсе вещества ФСГ из Per.С6 ASGP-R насыщали асиалофетуином. Скорость метаболического клиренса исходного вещества или вещества из клеток, сконструированных с использованием α2,6- или α2,3-сиалилтрансферазы, определяли, как описано, с одновременным введением по меньшей мере 7500-кратного молярного избытка асиалофетуина для насыщения ASGP-R в течение 1-2 часов.
Вещество, полученное из исходных продуцирующих ФСГ клонов Per.С6, содержало некоторое количество вещества с небольшой MCR, но, большей частью, было подвержено быстрому клиренсу (Фиг. 7). Наиболее удачный клон 005, содержавший наиболее сиалированное вещество, конструировали с использованием α2,6- или α2,3-сиалилтрансферазы (Пример 5). Несмотря на то, что клоны, сконструированные с использованием α2,6-сиалилтрансферазы, демонстрировали повышенное сиалирование (Фиг. 5), MCR не была улучшена (Фиг. 7). Блокада ASGR приводила к восстановлению MCR α2,6-вещества до уровня стандарта, демонстрируя, что даже с увеличенными α2,6-связями вещество подвержено быстрому клиренсу (Фиг. 8). Конструирование с использованием α2,3-сиалилтрансферазы приводило к получению клонов с MCR, сопоставимой со стандартом (Фиг. 9), и изменение содержания сиаловой кислоты согласовалось с тем, что известно об изоформах ФСГ (Фиг. 10).
Пример 10. Анализ Steelman-Pohley in vivo
Для демонстрации того, что повышение содержания сиаловой кислоты в ФСГ приводит к увеличению биологического эффекта, исследовали увеличение массы яичников у крыс высоко сиалированным ФСГ, таким как полученный в Примере 5.
Увеличение массы яичников, обусловленное рФСГ, продуцированным клонами Pet.С6, анализировали согласно способу Steelman and Pohley (1953). рФСГ из Per.С6 из образцов фильтрованной клеточной среды количественно оценивали посредством ELISA (DRG, EIA-1288). Образцы (рФСГ из Per.С6) и стандарты (рФСГ Gonal-f) исследовали в пяти разных дозах (3 животных на дозу). Gonal-f вводили в дозах 50, 100, 200, 400 и 800 нг на крысу. Дозы образцов рассчитывали с использованием их значений площади под кривой (AUC) относительно Gonal-f, обычно 0,05-10 мкг на крысу.
В заключение, недостаточно сиалированное вещество, продуцированное исходными клонами Per.С6, продуцирующими ФСГ, (Фиг. 11) было менее активно в анализе увеличения массы яичников, чем имеющийся в продаже рФСГ. Конструирование с использованием сиалилтрансферазы с добавлением дополнительных α2,6-связей увеличивало содержание сиаловой кислоты, но не увеличивало активность в анализе in vivo (Фиг. 12). Однако, дополнительные α2,3-связи значительно увеличивали активность (Фиг. 13), и два препарата рекомбинантного ФСГ (имеющие происхождение из Per.С6 и СНО) демонстрируют очень похожие профили в данном анализе.
Пример 11. Контроль получения и очистки
Был разработан способ получения ФСГ в клетках PER.C6, культивируемых в суспензии в свободной от сыворотки среде. Этот способ описан ниже, и он был использован с некоторыми клеточными линиями PER.C6, продуцирующими ФСГ.
ФСГ от исходного клона 005, α2,3-клона 007 и α2,6-клона 059 получали с использованием модификации способа, описанного Lowry et al. (1976).
Для получения ФСГ из PER.C6 клеточные линии адаптировали к свободной от сыворотки среде, то есть, Excell 525 (JRH Biosciences). Сначала клетки культивировали до образования 70%-90% конфлюэнтного монослоя в культуральной колбе Т80. При пересеве клетки ресуспендировали в свободной от сыворотки среде Excell 525+4 мМ L-глутамина до концентрации клеток 0,3×106 клеток/мл. 25 мл суспензии клеток помещали в 250 мл колбу для шейкера и встряхивали при 100 об/мин при 37°C и 5% CO2. После достижения концентрации клеток более 1×106 клеток/мл, клетки субкультивировали до концентрации клеток 0,2 или 0,3×106 клеток/мл и культивировали далее в колбах для шейкера при 37°C, 5% СO2 и 100 об/мин.
Для получения ФСГ клетки переносили в свободную от сыворотки производственную питательную среду, то есть, VPRO (JRH Biosciences), обеспечивающую поддержание роста клеток PER.C6 до очень высоких концентраций клеток (обычно более 107 клеток/мл в культуре клеток, выращиваемой в замкнутом объеме). Сначала клетки культивировали до концентрации более 1×106 клеток/мл в Excell 525, затем осаждали центрифугированием в течение 5 минут при 1000 об/мин и затем суспендировали в среде VPRO + 6 мМ L-глутамина до концентрации 1×106 клеток/мл. Клетки затем культивировали в колбе для шейкера в течение 7-10 дней при 37°C, 5% СО2 и 100 об/мин. В течение этого периода клетки вырастали до концентрации более 107 клеток/мл. Культуральную среду собирали после начала снижения жизнеспособности клеток. Клетки осаждали центрифугированием в течение 5 минут при 1000 об/мин и супернатант использовали для количественной оценки и очистки ФСГ. Концентрацию ФСГ определяли с использованием ELISA (DRG EIA 1288).
Затем проводили очистку ФСГ с использованием модификации способа, описанного Lowry et al. (1976). Это осуществляли хроматографией на диэтиламиноэтилцеллюлозе (DEAE-целлюлозе), гель-фильтрацией на Sephadex G100, адсорбционной хроматографией на гидроксиапатите и препаративным электрофорезом в полиакриламидном геле.
Во всех хроматографических способах присутствие иммунореактивного ФСГ подтверждали радиоиммунным анализом (RIA) (DRG EIA 1288) и IEF (Пример 6).
Ссылки
Andersen CY, Westergaard LG, and van Wely M. (2004). FSH isoform composition of commercial gonadotrophin preparations: a neglected aspect? Reprod Biomed Online. 9(2), 231-236.
Arey BJ, Stevis PE, Deecher DC, Shen ES, Frail DE, Negro-Vilar A, and Lopez FJ. (1997) Induction of promiscuous G protein coupling of the follicle-stimulating hormone (FSH) receptor: a novel mechanism for transducing pleiotropic actions of FSH isoforms. Mol Endocrinol. 11(5), 517-526.
Baenziger JU and Green ED. (1988). Pituitary glycoprotein hormone oligosaccharides: structure, synthesis and function of the asparagine-linked oligosaccharides on lutropin, follitropin and thyrotropin. Biochim Biophys Acta. 947(2), 287-306.
Bassett RM, and Driebergen R. (2005). Continued improvements in the quality and consistency of follitropin alfa, recombinant human FSH. Reprod Biomed Online. 10(2), 169-177.
Damian-Matsumura P, Zaga V, Maldonado A, Sánchez-Hernández C, Timossi C, and Ulloa-Aguirre A. (1999). Oestrogens regulate pituitary alphα2,3-sialyltransferase messenger ribonucleic acid levels in the female rat. J Mol Endocrinol. 23(2), 153-165.
DʹAntonio M., Borrelli F., Datola Α., Bucci R., Mascia M., Polletta P., Piscitelli D., and Papoian R. (1999) Biological characterization of recombinant human follicle stimulating hormone isoforms. Human Reproduction 14, 1160-1167.
Dalpathado DS, Irungu J, Go EP, Butnev VY, Norton K, Bousfield GR, and Desaire H. (2006). Comparative glycomics of the glycoprotein follicle stimulating hormone: glycopeptide analysis of isolates from two mammalian species. Biochemistry. 45(28). 8665-8673. No copy
Dias JA, Van Roey P. (2001). Structural biology of human follitropin and its receptor. Arch Med Res. 32(6), 510-519.
Fiddes, J.C. and Goodman, Η.M. (1979) Isolation, cloning and sequence analysis of the cDNA for the alpha-subunit of human chorionic gonadotropin. Nature, 281, 351-356.
Flack, M.R., Bennet, A.P., Froehlich, J. Anasti, JN and Nisula, B. (1994). Increased biological activity due to basic isoforms in recombinant human follicle-stimulating hormone produced in a human cell line. J. Clin. Endocrinol. Metab., 79, 756-760.
Fox KM, Dias JA, and Van Roey P. (2001). Three-dimensional structure of human follicle-stimulating hormone. Mol Endocrinol. 15(3), 378-89.
Grabenhorst E, Hoffmann A, Nimtz M, Zettlmeissl G, and Conradt HS. (1995). Construction of stable BHK-21 cells coexpressing human secretory glycoproteins and human Gal(beta 1-4)GlcNAc-R alpha 2,6-sialyltransferase alpha 2,6-linked NeuAc is preferentially attached to the Gal(beta 1-4)GlcNAc(beta 1-2)Man(alpha 1-3)-branch of diantennary oligosaccharides from secreted recombinant beta-trace protein. Eur J Biochem. 232(3), 718-25.
Green ED and Baenziger JU. (1988). Asparagine-linked oligosaccharides on lutropin, follitropin, and thyrotropin. II. Distributions of sulfated and sialylated oligosaccharides on bovine, ovine, and human pituitary glycoprotein hormones. J Biol Chem. 263(1), 36-44.
Grundmann. U., Nerlich. C, Rein. T. and Zettlmeissl, G. (1990). Complete cDNA sequence encoding human beta-galactoside alpha-2,6-sialyltransferase. G Nucleic Acids Res. 18(3), 667.
Howles, СМ. (1996). Genetic engineering of human FSH (Gonal-F). Hum Reprod. Update, 2, 172-191.
Kagawa Y, Takasaki S, Utsumi J, Hosoi K, Shimizu H, Kochibe N, and Kobata A. (1988). Comparative study of the asparagine-linked sugar chains of natural human interferon-beta 1 and recombinant human interferon-beta 1 produced by three different mammalian cells. J Biol Chem. 263(33), 17508-17515.
Keene, J.L, Matzuk, M.M., Otani, Т., Fauser, B,C,J,M., Galway, A.B., Hsueh, A.J.W. and Boime, I. (1989). Expression of Biologically active Human Follitropin in Chinese Hamster Ovary Cells. The Journal of Biological Chemistry, 264(9), 4769-4775.
Kitagawa, H. and Paulson, J.С (1994) Cloning of a novel alpha 2,3-sialyltransferase that sialylates glycoprotein and glycolipid carbohydrate groups. J. Biol. Chem. 269(2), 1394-1401.
Lee EU, Roth J, and Paulson JC (1989) Alteration of terminal glycosylation sequences on N-linked oligosaccharides of Chinese hamster ovary cells by expression of beta-galactoside alpha 2,6-sialyltransferase. J Biol Chem. 264(23), 13848-13855.
de Leeuw, R., Mulders, J., Voortman, G. Rombout, F. Damm, J. and Kloosterboer, L. (1996) Structure-function relationship of recombinant follicle stimulating hormone (Puregon). Mol. Hum. Reprod., 2, 361-369.
Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ. (1951) Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem. 193(1), 265-75.
Lowry, PJ, McLean, C, Jones RL and Satgunasingam N. (1976) Purification of anterior pituitary and hypothalamic hormones Clin Pathol Suppl (Assoc Clin Pathol). 7, 16-21.
Pierce JG, and Parsons TF (1981) Glycoprotein hormones: structure and function Annu Rev Biochem. 50, 465-495.
Pricer WE Jr, and Ashwell G. (1971). The binding of desialylated glycoproteins by plasma membranes of rat liver. J Biol Chem. 246(15), 4825-33.
Rathnam P, and Saxena BB. (1975). Primary amino acid sequence of follicle-stimulating hormone from human pituitary glands. I. alpha subunit. J Biol Chem.; 250(17):6735-6746.
Regoeczi Ε, Debanne MT, Hatton MC, and Koj A. (1978) Elimination of asialofetuin and asialoorosomucoid by the intact rat. Quantitative aspects of the hepatic clearance mechanism. Biochim Biophys Acta. 541(3), 372-84.
Royle L, Radcliffe CM, Dwek RA and Rudd PM (2006) Methods in Molecular Biology, ed I Brockhausen-Schutzbach (Humana Press), 347: Glycobiology protocols, 125-144.
Ryan RJ, Keutmann HT, Charlesworth MC, McCormick DJ, Milius RP, Calvo FO and Vutyavanich T. (1987). Structure-function relationships of gonadotropins. Recent Prog Horm Res.; 43,:383-429.
Saxena BB and Rathnam P. (1976) Amino acid sequence of the beta subunit of follicle-stimulating hormone from human pituitary glands. J Biol Chem. 251(4), 993-1005.
Steelman SL, and Pohley FM. (1953) Assay of the follicle stimulating hormone based on the augmentation with human chorionic gonadotropin. Endocrinology. 53(6), 604-616.
Steer CJ, and Ashwell G. (1980) Studies on a mammalian hepatic binding protein specific for asialoglycoproteins. Evidence for receptor recycling in isolated rat hepatocytes. J Biol Chem. 255(7), 3008-13.
Svensson EC, Soreghan B, and Paulson JC. (1990) Organization of the beta-galactoside alpha 2,6-sialyltransferase gene. Evidence for the transcriptional regulation of terminal glycosylation. J Biol Chem. 265(34):20863-20868.
Takeuchi M, Takasaki S, Miyazaki H, Kato T, Hoshi S, Kochibe N, and Kobata A (1988). Comparative study of the asparagine-linked sugar chains of human erythropoietins purified from urine and the culture medium of recombinant Chinese hamster ovary cells. J Biol Chem. 263(8), 3657-3663.
Timossi CM, Barrios de Tomasi J, Zambrano E, González R, Ulloa-Aguirre A. (1998). A naturally occurring basically charged human follicle-stimulating hormone (FSH) variant inhibits FSH-induced androgen aromatization and tissue-type plasminogen activator enzyme activity in vitro. Neuroendocrinology. 67(3), 153-163.
Timossi CM, Barrios-de-Tomasi J, González-Suárez R, Arranz MC, Padmanabhan V, Conn PM, and Ulloa-Aguirre A. (2000). Differential effects of the charge variants of human follicle-stimulating hormone. J Endocrinol. 165(2), 193-205.
Ulloa-Aguirre, Α., Espinoza, R., Damian-Matsumura, P. and Chappel, S.C. (1988) Immunological and biological potencies of the different molecular species of gonadotrophins. Hum. Reprod. 3, 491-501.
Ulloa-Aguirre, Α., Cravioto, Α., Damián-Matsumura, P. Jimenez, M, Zambrano, Ε and Diaz-Sanchez, V. (1992) Biological characterization of the naturally occurring analogues of intrapituitary human follicle stimulating hormone. Hum. Reprod. 7, 23-30.
Ulloa-Aguirre A, Midgley AR Jr, Beitins IZ, and Padmanabhan V. (1995). Follicle-stimulating isohormones: characterization and physiological relevance. Endocr Rev. 16(6), 765-787.
Ulloa-Aguirre A, Maldonado A, Damián-Matsumura P, and Timossi С (2001). Endocrine regulation of gonadotropin glycosylation. Arch Med Res. 32(6), 520-532.
Ulloa-Aguirre A, Timossi C, Barrios-de-Tomasi J, Maldonado A, and Nayudu P. (2003). Impact of carbohydrate heterogeneity in function of follicle-stimulating hormone: studies derived from in vitro and in vivo models. Biol Reprod. 69(2), 379-389.
Van Lenten L, and Ashwell G. (1972) The binding of desialylated glycoproteins by plasma membranes of rat liver. Development of a quantitative inhibition assay. J Biol Chem. 247(14), 4633-40.
Wide, L. and Albertsson-Wikland, K. (1990) Change in electrophoretic mobility of human follicle-stimulating hormone in serum after administration of gonadotropin-releasing hormone. J. Clin. Endocrinol. Metab. 70, 271-276.
Wide, L. and Bakos, O. (1993). More basic forms of both human follicle-stimulating hormone and luteinizing hormone in serum at midcycle compared with the follicular or luteal phase. J. Clin. Endocrinol. Metab., 76, 885-889.
Wide L, Naessén T, Sundström-Poromaa I, Eriksson K. (2007) Sulfonation and sialylation of gonadotropins in women during the menstrual cycle, after menopause, and with polycystic ovarian syndrome and in men. J Clin Endocrinol Metab.; 92(11), 4410-4417.
Zambrano E, Zarinán T, Olivares A, Barrios-de-Tomasi J, and Ulloa-Aguirre A. (1999). Receptor binding activity and in vitro biological activity of the human FSH charge isoforms as disclosed by heterologous and homologous assay systems: implications for the structure-function relationship of the FSH variants. Endocrine. 10(2), 113-121.
Zhang X, Lok SH, and Kon OL (1998) Stable expression of human alpha-2,6-sialyltransferase in Chinese hamster ovary cells: functional consequences for human erythropoietin expression and bioactivity. Biochim Biophys Acta. 1425(3), 441-452.
SEQ ID NO: 1
Альфа-полипептид фолликулостимулирующего гормона
Номер доступа АН007338
Нуклеотидная последовательность ФСГ-альфа
Белковая последовательность ФСГ-альфа
SEQ ID NO: 2
Бета-полипептид фолликулостимулирующего гормона
Номер доступа NM_000510
Нуклеотидная последовательность ФСГ-бета
Белковая последовательность ФСГ-бета
SEQ ID NO: 3
Бета-галактозид-альфа-2,3-сиалилтрансфераза 4
Номер доступа L23767
Нуклеотидная последовательность ST3GAL4
Белковая последовательность ST3GAL4
SEQ ID NO: 4
Бета-галактозамид-альфа-2,6-сиалилтрансфераза 1
Номер доступа NM_003032
Нуклеотидная последовательность ST6GAL1
Белковая последовательность ST6GAL1
Claims (1)
- Способ получения рекомбинантного ФСГ (фолликулостимулирующий гормон), включающего α-2,3- и α-2,6-сиалирование, включающий стадию продуцирования или экспрессии рекомбинантного ФСГ в клеточной линии Per.С6, где клеточная линия Per.С6 трансфицирована плазмидой, экспрессирующей α- и β-субъединицы ФСГ, и плазмидой, экспрессирующей α-2,3-сиалилтрансферазу, где α-2,6-сиалирование обеспечивается активностью эндогенной сиалилтрансферазы клеточной линии.
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US4542408P | 2008-04-16 | 2008-04-16 | |
US61/045,424 | 2008-04-16 | ||
EP08251528 | 2008-04-25 | ||
EP08251528.9 | 2008-04-25 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2010141908/10A Division RU2537268C2 (ru) | 2008-04-16 | 2009-04-16 | Рекомбинантный фолликулостимулирующий гормон (фсг), включающий альфа-2, 3- и альфа-2, 6-сиалирование |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2018139379A Division RU2745557C3 (ru) | 2008-04-16 | 2018-11-08 | Рекомбинантный фолликулостимулирующий гормон (ФСГ), включающий альфа-2,3- и альфа-2,6-сиалирование |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2014141994A RU2014141994A (ru) | 2016-05-10 |
RU2014141994A3 RU2014141994A3 (ru) | 2018-05-28 |
RU2682270C2 true RU2682270C2 (ru) | 2019-03-18 |
Family
ID=39717519
Family Applications (3)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2014141994A RU2682270C2 (ru) | 2008-04-16 | 2009-04-16 | Рекомбинантный фолликулостимулирующий гормон (ФСГ), включающий альфа-2,3- и альфа-2,6-сиалирование |
RU2010141908/10A RU2537268C2 (ru) | 2008-04-16 | 2009-04-16 | Рекомбинантный фолликулостимулирующий гормон (фсг), включающий альфа-2, 3- и альфа-2, 6-сиалирование |
RU2018139379A RU2745557C3 (ru) | 2008-04-16 | 2018-11-08 | Рекомбинантный фолликулостимулирующий гормон (ФСГ), включающий альфа-2,3- и альфа-2,6-сиалирование |
Family Applications After (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2010141908/10A RU2537268C2 (ru) | 2008-04-16 | 2009-04-16 | Рекомбинантный фолликулостимулирующий гормон (фсг), включающий альфа-2, 3- и альфа-2, 6-сиалирование |
RU2018139379A RU2745557C3 (ru) | 2008-04-16 | 2018-11-08 | Рекомбинантный фолликулостимулирующий гормон (ФСГ), включающий альфа-2,3- и альфа-2,6-сиалирование |
Country Status (29)
Country | Link |
---|---|
US (5) | US8951967B2 (ru) |
EP (7) | EP2808340B1 (ru) |
JP (7) | JP2011519359A (ru) |
KR (5) | KR20170110741A (ru) |
CN (3) | CN102066414A (ru) |
AR (1) | AR071479A1 (ru) |
AU (5) | AU2009237479B2 (ru) |
BR (1) | BRPI0910461B8 (ru) |
CA (1) | CA2725257A1 (ru) |
CY (1) | CY1115413T1 (ru) |
DK (4) | DK2808340T3 (ru) |
ES (3) | ES2610277T3 (ru) |
FR (1) | FR17C1020I2 (ru) |
HK (2) | HK1146284A1 (ru) |
HR (3) | HRP20140535T1 (ru) |
HU (5) | HUE030652T4 (ru) |
IL (2) | IL208538A (ru) |
LT (4) | LT2808340T (ru) |
MX (3) | MX2010011343A (ru) |
NO (2) | NO2017025I1 (ru) |
NZ (1) | NZ588381A (ru) |
PL (4) | PL2268666T3 (ru) |
PT (4) | PT3045471T (ru) |
RU (3) | RU2682270C2 (ru) |
SA (1) | SA109300228B1 (ru) |
SI (4) | SI2808340T1 (ru) |
TW (1) | TWI488640B (ru) |
WO (1) | WO2009127826A1 (ru) |
ZA (1) | ZA201007373B (ru) |
Families Citing this family (28)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
TWI488640B (zh) | 2008-04-16 | 2015-06-21 | Ferring Int Ct Sa | 藥學製劑 |
TWI532495B (zh) | 2009-10-05 | 2016-05-11 | 菲瑞茵國際中心股份有限公司 | 藥學製劑 |
EP2417982A1 (en) | 2010-07-30 | 2012-02-15 | Ferring B.V. | Stabilization of gonadotropins |
WO2012016576A1 (en) * | 2010-08-04 | 2012-02-09 | Glycotope Gmbh | Improved recombinant human follicle-stimulating hormone |
HRP20150968T4 (hr) | 2010-09-29 | 2023-11-10 | Ferring B.V. | Pripravak za uporabu za liječenje neplodnosti |
EP2628797B1 (en) | 2010-10-15 | 2016-07-13 | JCR Pharmaceuticals CO., LTD. | Method for producing glycoprotein having mannose residue as non-reducing end of sugar chain |
CN103619358B (zh) * | 2011-03-31 | 2017-02-15 | 辉凌公司 | 药物制剂 |
WO2012168680A1 (en) | 2011-06-06 | 2012-12-13 | Ferring B.V. | Pharmaceutical preparation comprising recombinant fsh |
JO3092B1 (ar) * | 2011-08-08 | 2017-03-15 | Ferring Bv | مركب لتحفيز مسيطر عليه للمبيض |
WO2013093760A2 (en) * | 2011-12-19 | 2013-06-27 | Grifols, S.A. | Compositions, methods, and kits for preparing sialylated recombinant proteins |
JP6279466B2 (ja) * | 2012-04-27 | 2018-02-14 | Jcrファーマ株式会社 | 新規な発現ベクター |
EP2824176A1 (en) * | 2013-07-11 | 2015-01-14 | Siamed'xpress | Methods for producing sialylated therapeutic proteins |
JP6652334B2 (ja) | 2014-05-31 | 2020-02-19 | Jcrファーマ株式会社 | ウリジンとn−アセチル−d−マンノサミンとを含有する培地 |
WO2016102436A1 (en) * | 2014-12-22 | 2016-06-30 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Cmp-dependent sialidase activity |
RU2704252C2 (ru) | 2015-04-17 | 2019-10-25 | Ферринг Б.В. | Композиция для лечения бесплодия |
WO2016207353A1 (en) | 2015-06-26 | 2016-12-29 | Ferring B.V. | Methods of purification and/or viral inactivation |
EP3205719A1 (en) * | 2016-02-15 | 2017-08-16 | CEVEC Pharmaceuticals GmbH | Cell lines for producing recombinant glycoproteins with di-antennary n-glycans, methods using the same, and recombinant glycoproteins |
GB201603280D0 (en) | 2016-02-24 | 2016-04-13 | Ferring Bv | Stable liquid gonadotropin formulation |
EP3382014A1 (en) | 2017-03-29 | 2018-10-03 | CEVEC Pharmaceuticals GmbH | Recombinant glycoproteins with reduced antennary fucosylation |
EP3441471A1 (en) | 2017-08-08 | 2019-02-13 | CEVEC Pharmaceuticals GmbH | Use of constitutively active variants of growth factor receptors as selection makers for the generation of stable producer cell lines |
EP3973982B1 (en) | 2017-09-01 | 2024-07-31 | Ferring B.V. | Composition for controlled ovarian stimulation |
US20210038694A1 (en) | 2018-04-30 | 2021-02-11 | Ferring B.V. | Composition for controlled ovarian stimulation |
CN112789053A (zh) | 2018-10-17 | 2021-05-11 | 辉凌公司 | 用于受控的卵巢刺激的组合物和方法 |
US20220380785A1 (en) * | 2019-11-01 | 2022-12-01 | The University Of British Columbia | Compositions and methods for sialylated mucin-type o-glycosylation of therapeutic proteins |
TW202237173A (zh) | 2020-12-09 | 2022-10-01 | 荷蘭商菲林公司 | 用於受控的卵巢刺激之組成物及方法 |
WO2023186331A1 (en) | 2022-04-01 | 2023-10-05 | Ferring B.V. | Mixed protocol for treatment of infertility |
WO2023227761A1 (en) | 2022-05-26 | 2023-11-30 | Ferring B.V. | Compositions and methods for treatment of infertility in males |
WO2024008971A1 (en) | 2022-07-08 | 2024-01-11 | Ferring B.V. | Compositions and methods for intrauterine insemination (iui) |
Family Cites Families (28)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
IT1206302B (it) | 1987-06-26 | 1989-04-14 | Serono Cesare Ist Ricerca | Ormone follicolo-stimolante urinario |
US5541083A (en) | 1989-10-24 | 1996-07-30 | The Regents Of The University Of California | Method for producing secretable glycosyltransferases and other golgi processing enzymes |
EP1445322B2 (en) | 1995-06-15 | 2012-06-06 | Crucell Holland B.V. | Packaging systems for human recombinant adenovirus to be used in gene therapy |
JP3559652B2 (ja) * | 1996-06-25 | 2004-09-02 | グローリー工業株式会社 | 売上精算システムの管理装置 |
TW518235B (en) * | 1997-01-15 | 2003-01-21 | Akzo Nobel Nv | A gonadotropin-containing pharmaceutical composition with improved stability on prolong storage |
NZ336780A (en) | 1997-01-16 | 2000-12-22 | Neose Technologies Inc | In vitro sialylation of glycoproteins |
JPH1111665A (ja) | 1997-06-28 | 1999-01-19 | Shibuya Kogyo Co Ltd | 無菌エア搬送コンベヤ装置 |
TWI235158B (en) * | 1997-09-01 | 2005-07-01 | Kirin Brewery | Human thrombopoietin produced by human established cell lines, processes foe preparing the same, and pharmaceutical composition comprising the same |
US7504248B2 (en) | 2001-12-07 | 2009-03-17 | Crucell Holland B.V. | Production of viruses viral isolates and vaccines |
PT1176976E (pt) | 1999-05-07 | 2006-11-30 | Applied Research Systems | Utilização de lh administrada na fase folicular média e tardia para o tratamento de mulheres anovulatórias. |
JP2002011665A (ja) | 2000-06-28 | 2002-01-15 | Sintokogio Ltd | ショットブラスト装置モニタシステム |
IL140110A0 (en) | 2000-12-05 | 2002-02-10 | Applied Research Systems | Improvement of homogeneity and secretion of recombinant proteins in mammalian systems |
CA2464368A1 (en) * | 2001-10-22 | 2003-05-01 | Applied Research Systems Ars Holding N.V. | Compositions of fsh with high sialylation degree and their use for the preparation of medicaments |
DK1440157T3 (da) | 2001-10-29 | 2012-05-07 | Crucell Holland Bv | Methods and means for producing proteins with predetermined post-translational modifications |
US20040248784A1 (en) | 2003-06-03 | 2004-12-09 | Marco Filicori | Unitary combinations of FSH and hCG |
US20080015142A1 (en) * | 2003-12-03 | 2008-01-17 | Defrees Shawn | Glycopegylated Follicle Stimulating Hormone |
US8431355B2 (en) | 2004-02-04 | 2013-04-30 | Universite De Provence Aix-Marseille 1 | Process for screening glycoform-specific antibodies |
CA2557725C (en) | 2004-02-13 | 2015-06-30 | Glycotope Gmbh | Highly active glycoproteins-process conditions and an efficient method for their production |
TWI488640B (zh) | 2008-04-16 | 2015-06-21 | Ferring Int Ct Sa | 藥學製劑 |
TWI532495B (zh) | 2009-10-05 | 2016-05-11 | 菲瑞茵國際中心股份有限公司 | 藥學製劑 |
EP2417982A1 (en) | 2010-07-30 | 2012-02-15 | Ferring B.V. | Stabilization of gonadotropins |
US8790322B2 (en) | 2010-08-03 | 2014-07-29 | King Saud University | Stoma coat |
WO2012016576A1 (en) * | 2010-08-04 | 2012-02-09 | Glycotope Gmbh | Improved recombinant human follicle-stimulating hormone |
HRP20150968T4 (hr) | 2010-09-29 | 2023-11-10 | Ferring B.V. | Pripravak za uporabu za liječenje neplodnosti |
CN103619358B (zh) | 2011-03-31 | 2017-02-15 | 辉凌公司 | 药物制剂 |
WO2012168680A1 (en) | 2011-06-06 | 2012-12-13 | Ferring B.V. | Pharmaceutical preparation comprising recombinant fsh |
JO3092B1 (ar) | 2011-08-08 | 2017-03-15 | Ferring Bv | مركب لتحفيز مسيطر عليه للمبيض |
KR20160144480A (ko) | 2014-04-18 | 2016-12-16 | 글리코토페 게엠베하 | 개선된 재조합 인간 난포-자극 호르몬을 이용한 조절된 난소 과다자극 |
-
2009
- 2009-04-15 TW TW098112483A patent/TWI488640B/zh active
- 2009-04-16 KR KR1020177026920A patent/KR20170110741A/ko not_active Application Discontinuation
- 2009-04-16 EP EP14178729.1A patent/EP2808340B1/en not_active Revoked
- 2009-04-16 SI SI200931547A patent/SI2808340T1/sl unknown
- 2009-04-16 PL PL09733497T patent/PL2268666T3/pl unknown
- 2009-04-16 EP EP09733497.3A patent/EP2268666B1/en not_active Revoked
- 2009-04-16 PT PT161581418T patent/PT3045471T/pt unknown
- 2009-04-16 US US12/988,218 patent/US8951967B2/en active Active
- 2009-04-16 KR KR1020107025581A patent/KR101622944B1/ko active IP Right Grant
- 2009-04-16 CN CN200980121391XA patent/CN102066414A/zh active Pending
- 2009-04-16 EP EP16194925.0A patent/EP3144318B1/en active Active
- 2009-04-16 SI SI200932094T patent/SI3144318T1/sl unknown
- 2009-04-16 MX MX2010011343A patent/MX2010011343A/es active IP Right Grant
- 2009-04-16 EP EP16158141.8A patent/EP3045471B1/en not_active Revoked
- 2009-04-16 HU HUE14178729A patent/HUE030652T4/en unknown
- 2009-04-16 ES ES14178729.1T patent/ES2610277T3/es active Active
- 2009-04-16 EP EP21212873.0A patent/EP4015527A1/en active Pending
- 2009-04-16 CA CA2725257A patent/CA2725257A1/en active Pending
- 2009-04-16 RU RU2014141994A patent/RU2682270C2/ru active
- 2009-04-16 JP JP2011504527A patent/JP2011519359A/ja active Pending
- 2009-04-16 PL PL14178729T patent/PL2808340T3/pl unknown
- 2009-04-16 KR KR1020167012148A patent/KR20160056960A/ko not_active Application Discontinuation
- 2009-04-16 ES ES09733497.3T patent/ES2468318T3/es active Active
- 2009-04-16 PT PT97334973T patent/PT2268666E/pt unknown
- 2009-04-16 MX MX2017007881A patent/MX355457B/es unknown
- 2009-04-16 BR BRPI0910461A patent/BRPI0910461B8/pt active IP Right Grant
- 2009-04-16 LT LTEP14178729.1T patent/LT2808340T/lt unknown
- 2009-04-16 DK DK14178729.1T patent/DK2808340T3/en active
- 2009-04-16 MX MX2014011348A patent/MX348622B/es unknown
- 2009-04-16 SI SI200930931T patent/SI2268666T1/sl unknown
- 2009-04-16 CN CN201510933782.9A patent/CN105906702A/zh active Pending
- 2009-04-16 PL PL16158141T patent/PL3045471T3/pl unknown
- 2009-04-16 LT LTEP16158141.8T patent/LT3045471T/lt unknown
- 2009-04-16 SI SI200931670A patent/SI3045471T1/sl unknown
- 2009-04-16 WO PCT/GB2009/000978 patent/WO2009127826A1/en active Application Filing
- 2009-04-16 DK DK16158141.8T patent/DK3045471T3/en active
- 2009-04-16 ES ES16158141.8T patent/ES2629392T3/es active Active
- 2009-04-16 CN CN201510933827.2A patent/CN105906703A/zh active Pending
- 2009-04-16 PL PL16194925T patent/PL3144318T3/pl unknown
- 2009-04-16 KR KR1020197022294A patent/KR102108377B1/ko active IP Right Grant
- 2009-04-16 DK DK16194925.0T patent/DK3144318T3/da active
- 2009-04-16 PT PT141787291T patent/PT2808340T/pt unknown
- 2009-04-16 AU AU2009237479A patent/AU2009237479B2/en active Active
- 2009-04-16 EP EP16179121.5A patent/EP3098234B1/en active Active
- 2009-04-16 DK DK09733497.3T patent/DK2268666T3/da active
- 2009-04-16 AR ARP090101333A patent/AR071479A1/es not_active Application Discontinuation
- 2009-04-16 EP EP13193214.7A patent/EP2722339A1/en active Pending
- 2009-04-16 RU RU2010141908/10A patent/RU2537268C2/ru active
- 2009-04-16 PT PT161949250T patent/PT3144318T/pt unknown
- 2009-04-16 NZ NZ588381A patent/NZ588381A/en unknown
- 2009-04-16 KR KR1020187023820A patent/KR20180095140A/ko active Application Filing
- 2009-04-16 HU HUE16158141A patent/HUE033830T2/en unknown
- 2009-04-18 SA SA109300228A patent/SA109300228B1/ar unknown
-
2010
- 2010-10-07 IL IL208538A patent/IL208538A/en active Protection Beyond IP Right Term
- 2010-10-14 ZA ZA2010/07373A patent/ZA201007373B/en unknown
-
2011
- 2011-01-17 HK HK11100441.2A patent/HK1146284A1/xx unknown
-
2014
- 2014-01-21 IL IL230571A patent/IL230571A/en active IP Right Grant
- 2014-06-06 CY CY20141100402T patent/CY1115413T1/el unknown
- 2014-06-09 HR HRP20140535AT patent/HRP20140535T1/hr unknown
- 2014-06-17 AU AU2014203277A patent/AU2014203277C1/en active Active
- 2014-11-14 US US14/541,852 patent/US9546204B2/en active Active
- 2014-12-10 HK HK14112411.0A patent/HK1199039A1/xx unknown
- 2014-12-25 JP JP2014262056A patent/JP2015120696A/ja active Pending
-
2016
- 2016-08-16 US US15/238,362 patent/US9771407B2/en active Active
- 2016-10-07 JP JP2016198588A patent/JP6486310B2/ja active Active
- 2016-11-16 HR HRP20161520TT patent/HRP20161520T1/hr unknown
-
2017
- 2017-05-30 HU HUS1700024C patent/HUS1700024I1/hu unknown
- 2017-05-31 HU HUS1700025C patent/HUS1700025I1/hu unknown
- 2017-06-05 LT LTPA2017018C patent/LTPA2017018I1/lt unknown
- 2017-06-06 NO NO2017025C patent/NO2017025I1/no unknown
- 2017-06-06 FR FR17C1020C patent/FR17C1020I2/fr active Active
- 2017-06-23 AU AU2017204259A patent/AU2017204259B2/en active Active
- 2017-06-23 AU AU2017204258A patent/AU2017204258B2/en active Active
- 2017-06-26 HR HRP20170958TT patent/HRP20170958T1/hr unknown
- 2017-08-01 JP JP2017148823A patent/JP6762916B2/ja active Active
- 2017-08-29 US US15/690,061 patent/US10995128B2/en active Active
- 2017-09-05 AU AU2017225020A patent/AU2017225020B2/en active Active
- 2017-09-27 LT LTPA2017029C patent/LTPA2017029I1/lt unknown
- 2017-09-27 HU HUS1700036C patent/HUS1700036I1/hu unknown
- 2017-09-28 NO NO2017050C patent/NO2017050I1/no unknown
-
2018
- 2018-11-08 RU RU2018139379A patent/RU2745557C3/ru active Protection Beyond IP Right Term
-
2019
- 2019-10-25 JP JP2019194476A patent/JP7316905B2/ja active Active
-
2021
- 2021-04-30 US US17/246,348 patent/US11952407B2/en active Active
- 2021-10-27 JP JP2021175403A patent/JP2022031652A/ja active Pending
-
2023
- 2023-12-21 JP JP2023215339A patent/JP2024038000A/ja active Pending
Non-Patent Citations (7)
Title |
---|
BOUSFIELD G. R. et al., Comparison of follicle-stimulating hormone glycosylation microheterogenity by quantitative negative mode nano-electrospray mass spectrometry of peptide-N glycanase-released oligosaccharides, Journal of glycomics & lipidomics, 2015, V. 5, N. 1. * |
FLACK M. R. et al., Increased biological activity due to basic isoforms in recombinant human follicle-stimulating hormone produced in a human cell line, The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, 1994, V. 79, N. 3, p.756-760. * |
FLACK M. R. et al., Increased biological activity due to basic isoforms in recombinant human follicle-stimulating hormone produced in a human cell line, The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, 1994, V. 79, N. 3, p.756-760. BOUSFIELD G. R. et al., Comparison of follicle-stimulating hormone glycosylation microheterogenity by quantitative negative mode nano-electrospray mass spectrometry of peptide-N glycanase-released oligosaccharides, Journal of glycomics & lipidomics, 2015, V. 5, N. 1. ШПАКОВ А. О. ГЛИКОЗИЛИРОВАНИЕ ГОНАДОТРОПИНОВ КАК ВАЖНЕЙШИЙ МЕХАНИЗМ РЕГУЛЯЦИИ ИХ АКТИВНОСТИ, Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова, 2017, т. 103, N. 9, с.1004-1021. ZAMBRANO E. et al., Receptor binding activity and in vitro biological activity of the human FSH charge isoforms as disclosed by heterologous and homologous assay systems, Endocrine, 1999, V. 10, N. 2, p.113-121. KRONMAN C. et al., Hierarchy of Post-translational Modifications Involved in the Circulatory Longevity of * |
KRONMAN C. et al., Hierarchy of Post-translational Modifications Involved in the Circulatory Longevity of Glycoproteins DEMONSTRATION OF CONCERTED CONTRIBUTIONS OF GLYCAN SIALYLATION AND SUBUNIT ASSEMBLY TO THE PHARMACOKINETIC BEHAVIOR OF BOVINE ACETYLCHOLINESTERASE, Journal of Biological Chemistry, 2000, V. 275, N. 38, p.29488-29502. * |
ZAMBRANO E. et al., Receptor binding activity and in vitro biological activity of the human FSH charge isoforms as disclosed by heterologous and homologous assay systems, Endocrine, 1999, V. 10, N. 2, p.113-121. * |
ШИЯН С. Д. и др. СИАЛИЛИРОВАНИЕ N-УГЛЕВОДНЫХ ЦЕПЕЙ ГЛИКОПРОТЕИНОВ С ПОМОЩЬЮ ИММОБИЛИЗОВАННОЙ ТРАНС-СИАЛИДАЗЫ Trypanosoma cruzi, Биоорганическая химия, 2004, т. 30, N. 4, с.400-408. * |
ШПАКОВ А. О. ГЛИКОЗИЛИРОВАНИЕ ГОНАДОТРОПИНОВ КАК ВАЖНЕЙШИЙ МЕХАНИЗМ РЕГУЛЯЦИИ ИХ АКТИВНОСТИ, Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова, 2017, т. 103, N. 9, с.1004-1021. * |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2745557C1 (ru) | Рекомбинантный фолликулостимулирующий гормон (ФСГ), включающий альфа-2,3- и альфа-2,6-сиалирование | |
ES2833533T3 (es) | FSH recombinante que incluye sialilación alfa 2,3 y alfa 2,6 |