ES2297028T3 - Produccion de virus, aislados virales y vacunas. - Google Patents

Abstract

Método para producir una partícula viral, comprendiendo dicho método las etapas de: - poner en contacto una célula con una partícula viral en un medio de cultivo en condiciones propicias para la infección de dicha célula por dicha partícula viral; y - cultivar dicha célula en condiciones propicias para la propagación de dicha partícula viral, en el que dicha célula sobreexpresa, mediante manipulación genética, un ácido nucleico que codifica una alfa-2,6-sialiltransferasa.

Description

Producción de virus, aislados virales y vacunas.

Campo de la invención

La invención se refiere al campo de la medicina. La invención se refiere además a vacunas que proporcionan protección frente a la infección por el virus Influenza y a métodos y medios de obtención de éstas.

Antecedentes de la invención

Los virus Influenza son los agentes etiológicos de la gripe, una enfermedad respiratoria sumamente contagiosa que ha azotado a los seres humanos desde la antigüedad. El virus se identificó por primera vez en 1933, pero a lo largo de los siglos se han notificado numerosas epidemias atribuibles casi con seguridad al virus Influenza (Potter 1998). Han existido tres casos graves de brotes del virus Influenza en el siglo pasado. La denominada "gripe española" de 1918 fue particularmente grave. Dio como resultado la muerte de 20 a 40 millones de personas aproximadamente por todo el mundo, el brote más grave registrado de enfermedad humana conocido en la historia. En 1957 la "gripe asiática" mató a 1 millón de personas aproximadamente, y en 1968 la "gripe de Hong Kong" fue mortal para más de 700.000 individuos. A pesar de los esfuerzos de la comunidad científica, las infecciones producidas por los virus Influenza continúan asegurando cada año un gran índice en cuanto a casos de enfermedad y muerte así como consecuencias económicas. El trabajo reciente ha ayudado a explicar la virulencia inusual de algunas cepas del virus Influenza que produjeron pandemias graves en el pasado (Gibbs et al. 2001; Hatta et al. 2001). Sin embargo, el entendimiento de los mecanis-
mos patogénicos subyacentes está incompleto, limitando así la prevención y el tratamiento eficaces de la enfermedad.

Según estimaciones que incluyen grupos de todas las edades, en los EE.UU. solo 48 millones de personas padecen gripe cada año. Estos resultados epidémicos dan como resultado aproximadamente 20.000 muertes por año además de los aproximadamente 4 millones de individuos que necesitan tratamiento en un hospital (estadísticas del CDC (Centros de Control y Prevención de Enfermedades de los Estados Unidos)). Los bebés, niños y ancianos son particularmente propensos a padecer infección por el virus Influenza. Sin embargo, la aparición de una nueva variante del virus con alta capacidad patogénica e infecciosa sigue siendo una seria amenaza para todos los individuos. Este resultó ser el caso de 1997, cuando un virus identificado en Hong Kong provocó la muerte de un tercio de los 18 casos diagnosticados clínicamente. (Claas et al. 1998; Subbarao et al. 1998).

Las aves representan la principal reserva del virus Influenza. En particular, todos los subtipos conocidos del virus Influenza A (junto con el subtipo B la causa más común de gripe en seres humanos) se han aislados de aves salvajes así como domésticas. Sin embargo, un virus Influenza A aviar normalmente no se transmite directamente de aves a seres humanos. A este respecto, la única excepción registrada hasta el momento ha sido el virus de Hong Kong de 1997 mencionado anteriormente. Se cree que varias proteínas virales desempeñan un papel en la concesión de especificidad al huésped, pero el factor más importante es la proteína de membrana hemaglutinina (HA).

El gen de HA fue uno de los primeros genes del virus Influenza que se identificaron y se secuenciaron. Codifica una proteína transmembrana implicada directamente en la unión a y la penetración en la célula huésped. La HA inicia la infección mediante la unión a determinantes del receptor de sialil-oligosacárido terminal presentes en glicoproteínas y gangliósidos presentes en la superficie de la célula huésped. Se sabe que los residuos de ácido siálico terminales de las sialil-glicoproteínas y gangliósidos naturales son los determinantes mínimos de la unión. Sin embargo, la unión depende también del tipo de enlace de ácido siálico con la penúltima galactosa y de la estructura de partes más distantes del sialil-glicoconjugado.

Los virus Influenza humanos se unen de manera preferente a receptores que contienen el enlace ácido siálico alfa-2,6-galactosa (SA-alfa-2,6-Gal), mientras que los virus aviares usan el enlace SA-alfa-2,3-Gal (revisado en Suzuki 1994). Esta especificad de unión determina también el tropismo celular del virus dentro del huésped. La infección por el virus Influenza humano (y la replicación) está limitada a las vías respiratorias, mientras que el virus Influenza aviar se encuentra principalmente en las células que revisten el tracto intestinal así como en los pulmones de las aves. Con el uso de lectinas específicas para el enlace ácido siálico-galactosa, se demostró que los residuos del ácido siálico enlazados a galactosa mediante el enlace alfa-2,6 pero no SA-alfa-2,3-Gal están presentes en las superficies de las células epiteliales de la traquea humana (Baum y Paulson 1990). Además, también la abundancia de los restos SA-alfa-2,3-Gal en las mucinas respiratorias contribuye a mantener el fenotipo específico para SA-alfa-2,6-Gal del virus Influenza humano de HA (Baum y Paulson 1990; Couceiro et al. 1993).

En la mayoría de los laboratorios todavía se lleva a cabo la propagación de aislados primarios en la bolsa corioalantoica de huevos embrionados de pollo. Esto se debe no sólo a motivos históricos, sino también a la falta de una medio de crecimiento alternativo apropiado. Éste es actualmente el sistema de elección para la producción de grandes cantidades de virus que van a usarse en preparaciones de vacunas. Sin embargo, los huevos embrionados tienen serias limitaciones como sistema huésped para la producción de vacunas. Por ejemplo, la falta de suministros fiables durante todo el año de huevos de alta calidad así como la disponibilidad limitada de huevos embrionados en general puede dificultar la producción de vacunas en caso del brote repentino de un nuevo subtipo del virus Influenza. Otras desventajas de este sistema de producción son la falta de flexibilidad, el riesgo de la presencia de toxinas y los riegos de virus adventicios, particularmente retrovirus, y posibles riesgos de esterilidad.

Además de estas limitaciones, el cultivo de virus en huevos tiene un problema adicional muy significativo, que es particularmente importante para fines de vacunas: existen ahora abundantes pruebas de que los cultivos en huevos conducen a la adaptación específica para el sustrato del virus. De hecho, son suficientes incluso pocos pases en la bolsa alantoica de los huevos para que un aislado humano primario se adapte al fenotipo de unión a SA-alfa-2,3-Gal (Rogers et al. 1985). Esto se debe a la presencia de residuos de SA-alfa-2,3-Gal pero no SA-alfa-2,6-Gal en las células que revisten la superficie de la membrana corioalantoica embrionaria de pollo. Las variantes de virus presentes en aislados primarios que pueden interaccionar específicamente con residuos de SA-alfa-2,3-Gal tienen una ventaja replicativa sobre las variantes de virus que interaccionan de manera más específica con los residuos de SA-alfa-2,6-Gal. Las variantes del virus específicas para SA-alfa-2,3-Gal se seleccionan así para huevos embrionados (Gambaryan et al. 1999; Gambaryan et al. 1997). La adaptación al huevo no sólo aumenta la afinidad por SA-alfa-2,3-Gal, sino que también da como resultado una disminución de la afinidad por SA-alfa-2,6-Gal. De hecho, HA no puede acomodar igualmente bien ambos tipos de análogos y se han identificado múltiples mutaciones que confieren esta especificad de unión alterada (Daniels et al. 1987; Gambaryan et al. 1999; Ito et al. 1997; Suzuki et al. 1989). Dada la importancia de HA para provocar una respuesta inmunitaria específica, estas mutaciones dan como resultado graves alteraciones de sus propiedades antigénicas (Ilobi et al. 1994; Robertson et al. 1994). En consecuencia, la inmunización con vacunas que contienen moléculas de HA que tienen mutaciones inducidas por el huevo induce menos anticuerpo neutralizante frente a cepas del virus Influenza de tipo natural a expensas del nivel de protección conseguido (Newman et al. 1993).

Breve descripción de las figuras

Figura 1. Representación esquemática de pAlpha2,6ST2000/Hygro.

Figura 2. Representación esquemática de (A) pAlpha2,6STcDNA2000/Neo y (B) pAlpha2,6STcDNA2000/Hygro.

Figura 3. Representación esquemática de (A) pAlpha2,3STcDNA2000/Neo y (B) pAlpha2,3STcDNA2000/Hygro.

Figura 4. Detección de (A) SA-alfa-2,6-Gal y (B) SA-alfa-2,3-Gal en PER.C6 y PER.C6/alpha2,6ST mediante análisis por FACS.

Figura 5. Propagación de un aislado de virus Influenza clínico primario y un lote del virus Influenza con pases en huevos (a partir del mismo aislado primario) en PER.C6 y PER.C6/alpha2,6ST, determinada mediante fluorescencia. La infecciosidad se expresa como el porcentaje de células positivas para la tinción inmunofluorescente de HA.

Figura 6. Propagación de un aislado de virus Influenza clínico primario y un lote del virus Influenza con pases en huevos (a partir del mismo aislado primario) en PER.C6 y PER.C6/alpha2,6ST, determinada mediante un ensayo en placa de lisis. La infecciosidad se expresa como las unidades formadoras de placa (ufp) por ml.

Figura 7. Representación esquemática del ensayo de titulación del virus Influenza. En primer lugar se infectan las células con partículas de virus, después se incuban las células con antisuero y posteriormente se usan en análisis por FACS en el que las células infectadas pueden separarse y efectuarse el recuento en toda la población de células.

Figura 8. Gráfico de la fracción de células infectadas (%) con el factor de dilución.

Sumario de la invención

La presente invención da a conocer métodos para producir y/o propagar partículas virales tales como partículas de virus Influenza que están presentes preferiblemente en un aislado viral obtenido a partir de un sujeto infectado, comprendiendo dicho método las etapas de: poner en contacto una célula con una partícula viral y cultivar dicha célula en condiciones propicias para la propagación de dicha partícula viral, en el que dicha célula sobreexpresa un ácido nucleico que codifica una alfa-2,6 o una alfa-2,3-sialiltransferasa. La invención también proporciona un método para la propagación selectiva de un conjunto de partículas virales tales como partículas de virus Influenza presentes en un aislado de virus Influenza, en el que dicho conjunto de partículas de virus tiene afinidad por receptores que comprenden un residuo de glicosilación específico, comprendiendo dicho método las etapas de: incubar una célula con dicho aislado; cultivar dicha célula en condiciones propicias para la propagación de dicha partícula viral; y recoger las partículas virales así producidas a partir de dicha célula y/o dicho medio de cultivo.

Las células que se usan en los métodos de la presente invención son preferiblemente humanas y se transforman por El de adenovirus, tales como las células PER.C6 o derivados de las mismas.

Descripción detallada

La presente invención proporciona métodos para producir y/o propagar una partícula viral, comprendiendo dicho método las etapas de: poner en contacto una célula con una partícula viral en un medio de cultivo en condiciones propicias para la infección de dicha célula por dicha partícula viral; y cultivar dicha célula en condiciones propicias para la propagación de dicha partícula viral, en el que dicha célula sobreexpresa un ácido nucleico que codifica una alfa-2,6-sialiltransferasa. Dicho ácido nucleico puede codificar para una alfa-2,6-sialiltransferasa a partir de diferentes fuentes, tales como rata y ser humano. Preferiblemente dicha alfa-2,6-sialiltransferasa es alfa-2,6-sialiltransferasa humana. La invención proporciona además métodos para producir y/o propagar una partícula viral, comprendiendo dicho método las etapas de: poner en contacto una célula con una partícula viral en un medio de cultivo en condiciones propicias para la infección de dicha célula por dicha partícula viral; y cultivar dicha célula en condiciones propicias para la propagación de dicha partícula viral, en el que dicha célula sobreexpresa un ácido nucleico que codifica una alfa-2,3-sialiltransferasa. Dicho ácido nucleico puede codificar para una alfa-2,3-sialiltransferasa a partir de diferentes fuentes, tales como rata y ser humano. Preferiblemente dicha alfa-2,3-sialiltransferasa es alfa-2,3-sialiltransferasa humana. En una realización de la invención, dicha partícula viral es una partícula de virus Influenza. Otros ejemplos no limitativos de partículas virales que pueden producirse y/o propagarse mediante el uso de los métodos de la presente invención son virus Parainfluenza, virus adenoasociados (VAA) o poliomavirus. Cualquier virus que utiliza las estructuras de glicosilación que están inducidas por las alfa-2,3 y alfa-2,6-sialiltransferasas puede propagarse y/o producirse mediante el uso de métodos de la presente invención.

En una realización preferida, la invención proporciona métodos para propagar una partícula de virus Influenza, en los que dicha partícula de virus Influenza está presente en un aislado de virus Influenza. Son más preferidos los métodos en los que dicho aislado de virus Influenza se obtiene a partir de al menos un sujeto mamífero infectado por el virus Influenza. Son incluso más preferidos los métodos para propagar una partícula de virus Influenza, en los que dicho sujeto mamífero infectado por el virus Influenza es un ser humano o cerdo. En otra realización, la invención proporciona métodos para producir y/o propagar una partícula de virus Influenza, en los que dicho aislado de virus Influenza se obtiene a partir de al menos un ave infectada por el virus Influenza. Aislados tal como se usa en el presente documento se refiere a lotes de virus Influenza que se obtienen a partir de sujetos que están infectados con virus Influenza. Estos sujetos pueden ser de todas las especias susceptibles a los virus Influenza, tales como seres humanos, aves, cerdos y caballos. Los seres humanos pueden contagiarse con el virus Influenza de diferentes maneras: o bien directamente a partir de otros seres humanos o bien directamente a partir de sujetos animales tales como cerdos y aves. Los virus propagados que se utilizan para la fabricación de vacunas podrían derivarse originalmente de uno o más sujetos (uno o más individuos humanos, o uno o más aves, cerdos, etc.). En el caso en el que la transmisión del virus Influenza de un ave a un ser humano provoque la enfermedad directa en seres humanos, tal como fue el caso en Hong Kong en 1997 (véase anteriormente) podría ser útil poder producir y/o propagar las partículas de virus Influenza presentes en el aislado de ave directamente para la fabricación de vacunas. La presente invención proporciona métodos parar producir y/o propagar partículas de virus Influenza presentes en aislados que se obtienen a partir de especies tales como aves, cerdos, caballos y seres humanos mediante la sobreexpresión de las proteínas sialiltransferasas que están implicadas en la glicosilación de proteínas de la superficie celular y que generan los denominados enlaces SA-alfa-2,3-Gal y SA-alfa-2,6-Gal en las cadenas de oligosacáridos. Aislados tal como se usa en el presente documento se refiere preferiblemente a aislados clínicos (es decir, aislados obtenidos a partir de pacientes enfermos). Tales aislados clínicos también se refieren a aislados primarios. Los aislados primarios pueden ser aislados del virus Influenza obtenidos directamente a partir de por ejemplo la nariz, la mucosidad y/o las heces de seres humanos o animales que están infectadas con el/los virus Influenza. Sin embargo, los aislados que se han propagado en huevos o en células o en otros sistemas todavía pueden producirse y/o propagarse además mediante los métodos de la presente invención. Por tanto, las partículas virales que se producen y/o propagan usando la presente invención pueden estar presentes en lotes con pases, pero están presentes preferiblemente en lotes primarios, tales como los aislados clínicos.

En una realización preferida de la invención, la producción y/o propagación de partículas de virus Influenza se lleva a cabo mediante el uso de células en un medio de cultivo, en el que dicha célula se transforma con El de adenovirus. Más preferiblemente, dicha células es una célula humana. En un aspecto sumamente preferido, la invención proporciona métodos para propagar una partícula de virus Influenza según la invención, en los que dicha célula humana es PER.C6 o un derivado de la misma.

Se encuentra que las células PER.C6 son útiles para la propagación de diferentes clases de virus tales como rotavirus y virus Influenza (véase el documento WO 01/38362). Las células PER.C6 se generaron por primera vez mediante la transformación de células obtenidas a partir de una retina embrionaria con la región El del serotipo 5 de adenovirus. Se encontró que las proteínas tanto alfa-2,3 como alfa-2,6- sialiltransferasas están presentes y son activas en las células PER.C6 (Pau et al. 2001). Por tanto, las partículas virales que interaccionan específicamente con el enlace ácido siálico-galactosa del tipo 2,3 así como del tipo 2,6 (SA-alfa-2,3-Gal y SA-alfa-2,6-Gal respectivamente) podían crecer en células PER.C6. Es un aspecto importante de la invención que la sobreexpresión de cada una de estas proteínas sialiltransferasas conduzca a una propagación específica de conjuntos de virus Influenza que prefieren o bien el residuo SA-alfa-2,3-Gal o bien el residuo SA-alfa-2,6-Gal. Esto permite generar lotes de virus para la producción de vacunas que tienen el mejor contenido para la protección óptima. Este contenido puede diferir. Tal como se trató anteriormente, algunas transmisiones de los virus se producen principalmente a través del contacto ser humano-ser humano, mientras que en otras (tales como el caso de Hong Kong en 1997), fue suficiente un contacto directo ave-ser humano para llegar a un efecto dramático en seres humanos. Dependiendo de la virulencia y de los tipos de virus Influenza que desempeñan un papel en esto, puede realizarse una elección de qué conjunto de partículas virales en un aislado debe propagarse, con el que se produce la vacuna final.

La presente invención también proporciona métodos para producir y/o propagar una partícula de virus Influenza, en los que dicho ácido nucleico que codifica la sialiltransferasa es heterólogo con respecto a dicha célula. Preferiblemente, dicho ácido nucleico que codifica la sialiltransferasa está integrado en el genoma de dicha célula. Heterólogo tal como se usa en el presente documento significa que el ácido nucleico está manipulado de manera que el gen que codifica la sialiltransferasa expresa más de la proteína que sin dicha manipulación. Heterólogo también significa que el ácido nucleico puede ser de una especie que es diferente de las especies a partir de las que se deriva la célula, pero también puede ser de la misma especie. Se dice que una célula sobreexpresa la sialiltransferasa cuando la célula expresa más sialiltransferasa que lo habitual para esa célula. Una célula que sobreexpresa la sialiltransferasa también puede sobreexpresar la proteína mediante manipulación del genoma de dicha célula de manera que el gen presente en el genoma de dicha célula expresa más de la proteína que lo que lo hizo dicha célula antes de que se manipulase. La sobreexpresión puede inducirse por medios externos tales como la integración de un promotor diferente o más activo, mediante la eliminación o inhibición de supresores que limitan normalmente la expresión de la proteína, o por medios químicos. La sobreexpresión también puede seleccionarse. Si se seleccionan las células para obtener una sobreexpresión significativa de al menos una sialiltransferasa, pueden usarse para los métodos según la presente invención. Por tanto, el uso de tales células también es parte de la presente invención.

En otra realización, la presente invención proporciona métodos para preparar una vacuna, comprendiendo dicho método las etapas de: producir y/o propagar una partícula viral según los métodos de la invención; e inactivar las partículas virales así producidas. Preferiblemente, dichos métodos para preparar una vacuna comprenden además las etapas de: tratar dichas partículas virales así producidas para producir partes antigénicas; y obtener al menos una de dichas partes antigénicas, preferiblemente a través de medios de purificación y/o enriquecimiento de dicha al menos una parte. Preferiblemente una composición purificada y/o enriquecida que comprende dicha al menos una parte antigénica obtenida no comprende otras partes antigénicas de dichas partículas virales tratadas. En una realización más preferida, la invención proporciona métodos para preparar una vacuna, en los que dicha parte antigénica comprende la proteína hemaglutinina o una parte de la misma, y/o la proteína neuraminidasa o una parte de la misma a partir del virus Influenza. Las proteínas neuraminidasa (NA) y la hemaglutinina (HA) son las partes antigénicas más destacadas de la partícula de virus Influenza y son propensas a diferencias durante las diferentes etapas de propagación.

Tal como se mencionó, las células de la presente invención son extremadamente útiles para la propagación de aislados clínicos, primarios que comprenden partículas de virus Influenza, mientras que dichas células también pueden aplicarse para propagar aislados que ya habían realizado pases en huevos embrionados o en otros sistemas, para obtener una selección de partículas de virus Influenza que reconocen a los residuos de glicosilación específicos presentes en las glicoproteínas. Por tanto, la presente invención también proporciona el uso de una línea celular que sobreexpresa una alfa-2,6-sialiltransferasa para la propagación de una partícula viral y el uso de una línea celular que sobreexpresa una alfa-2,3-sialiltransferasa para la propagación de una partícula viral. Preferiblemente, dicha partícula viral es una partícula de virus Influenza. Más preferiblemente, dicha partícula de virus Influenza está presente en un aislado del virus Influenza obtenido a partir de al menos un sujeto mamífero infectado por el virus Influenza. Son incluso más preferidos los usos de dicha línea celular según la presente invención, en los que dicho sujeto mamífero infectado por el virus Influenza es un ser humano o un cerdo, mientras que también se prefiere que dicha partícula de virus Influenza esté presente en un aislado del virus Influenza obtenido a partir de al menos un ave infectada por el virus Influenza.

La presente invención proporciona además un método para la producción y/o propagación selectiva de un conjunto de partículas virales predeterminadas presentes en un aislado, en el que dicho conjunto de partículas virales predeterminadas tiene una preferencia por un resto de glicosilación específico presente en un receptor, y en el que dicho aislado comprende además de dicho conjunto también partículas virales que no tienen dicha preferencia, comprendiendo dicho método las etapas de: incubar una célula que puede expresar y exponer dicho receptor que comprende dicho resto de glicosilación específico, con dicho aislado en un medio de cultivo en condiciones propicias para la infección de dicha célula por al menos una partícula viral presente en dicho conjunto; cultivar dicha célula en condiciones propicias para la propagación de dicha partícula viral; y recoger las partículas virales así producidas a partir de dicha célula y/o dicho medio de cultivo. Un resto de glicosilación tal como se usa en el presente documento se refiere a cualquier clase de residuo, enlace y o grupo de tipos de azúcar presentes en una cadena de oligosacárido en una glicoproteína que una partícula viral reconoce para la infección. Preferiblemente dicho resto de glicosilación comprende un residuo SA-alfa-2,6-Gal o un residuo SA-alfa-2,3-Gal. Son más preferidos los métodos en los que dicho conjunto de partículas virales predeterminadas es un conjunto de partículas de virus Influenza predeterminadas. La proteína HA de la partícula viral reconoce el residuo SA-alfa-2,6-Gal y los residuos SA-alfa-2,3-Gal, en el caso del virus Influenza. De la proteína HA depende que haya o no cualquier especificidad en la interacción con cada uno de los residuos. En general, los aislados del virus Influenza comprenden virus que interaccionan específicamente con el residuo SA-alfa-2,6-Gal así como virus que interaccionan específicamente con el residuo SA-alfa-2,3-Gal. Con la presente invención ahora es posible propagar de manera selectiva cualquier conjunto de virus a partir de aislados clínicos, primarios y/o con pases para obtener conjuntos propagados de virus que son útiles en la producción de una vacuna frente al virus Influenza, útil en seres humanos. Además del hecho de que las vacunas pueden producirse para seres humanos, también es posible mediante el uso de métodos y medios de la presente invención propagar de manera selectiva virus para la fabricación de aplicaciones veterinarias para prevenir por ejemplo la transmisión de los virus Influenza a través de poblaciones de cerdos o caballos. Preferiblemente, dicho aislado del virus Influenza se obtiene a partir de al menos un ave, cerdo o ser humano infectado por el virus Influenza. También se prefiere que dicha célula sea una célula humana y que se transforme con El de adenovirus. Son sumamente preferidas las células que son células PER.C6 o derivados de las mismas. Derivados, tal como se usa en el presente documento, se refiere a versiones modificadas de las células PER.C6 originales, en las que por ejemplo se introducen otros ácidos nucleicos heterólogos, se desactivan o se modifican de otros modos. Ejemplos no limitativos de derivados de PER.C6 son células PER.C6 que expresan de manera estable un mutante sensible a la temperatura de adenovirus E2A, o que expresan otros ácidos nucleicos de adenovirus tales como E4. Si determinados ácidos nucleicos en las células PER.C6 se han conectado o desconectado por otros medios tales como tratamiento químico o técnicas de desactivación, estas células siguen siendo todavía derivados de PER.C6. Aunque los ejemplos proporcionados describen el uso de células que sobreexpresan la proteína eritropoyetina (EPO) debe observarse que no es una parte de la invención tener sobreexpresión de EPO en las células de la invención.

En otra realización preferida, la invención proporciona métodos para la propagación selectiva de un conjunto de partículas virales presentes en un aislado, en los que dicha célula comprende un ácido nucleico que codifica una sialiltransferasa que es heterólogo con respecto a dicha célula. Son incluso más preferidos los métodos según la presente invención, en los que dicho ácido nucleico que codifica una sialiltransferasa está integrado en el genoma de dicha célula. Un ácido nucleico integrado de este tipo está integrado preferiblemente de manera estable a través del uso de marcadores de selección tales como los genes resistentes frente a higromicina y neomicina.

También se proporcionan células humanas que comprenden un ácido nucleico heterólogo que codifica una alfa-2,6-sialiltransferasa o una alfa-2,3-sialiltransferasa. Preferiblemente, dicho ácido nucleico está integrado en el genoma de dichas células humanas. La invención también proporciona el uso de tales células para la propagación selectiva de partículas virales, siendo preferiblemente partículas de virus Influenza.

También se proporciona la optimización de un procedimiento para la propagación de aislados primarios del virus Influenza humano y la optimización de un procedimiento para propagar aislados primarios así como de laboratorio de virus Influenza usando los restos de glicosilación SA-alfa-2,6-Gal o SA-alfa-2,3-Gal (o ambos) presentes en glicoproteínas de la superficie celular. En general, los virus Influenza humanos reconocen el resto SA-alfa-2,6-Gal, mientras que los virus Influenza aviares reconocen el resto SA-alfa-2,3-Gal. Los virus Influenza porcinos generalmente utilizan ambos residuos. La invención proporciona la optimización de un procedimiento para la propagación de cualquier virus para el que la replicación depende de la actividad de la alfa-2,3-sialiltransferasa y/o alfa-2,6-sialiltransferasa, o más generalmente, de la presencia de residuos SA-alfa-2,3-Gal o SA-alfa-2,6-Gal. Los métodos de la presente invención comprenden el uso de células en un medio de cultivo. Como ejemplo de un procedimiento de este tipo, se tomaron células humanas que se sabe que soportan la replicación y la producción eficaz de virus Influenza.

Las células utilizadas en los métodos de la presente invención no son sólo útiles para la propagación de virus Influenza. Se conoce bien en la técnica que otros virus tales como virus adenoasociados (VAA), poliomavirus humano y virus Parainfluenza utilizan los enlaces alfa-2,3 y alfa-2,6 en glicoproteínas para la infección (Liu et al. 1998; Suzuki et al. 2001; Walters et al. 2001). Por tanto, la presente invención también proporciona métodos para la producción y/o propagación (selectiva) de otros virus que utilizan estas estructuras de glicosilación para el reconocimiento y la infección de la célula seleccionada como diana. Además, la invención proporciona el uso de las células y los métodos y medios para la producción de virus distintos del virus Influenza y para la producción de vacunas frente a tales virus, si es aplicable. También se proporcionan vacunas frente a virus que utilizan los residuos SA-alfa-2,3-Gal y SA-alfa-2,6-Gal para el reconocimiento e infecciosidad celular.

Se ha demostrado previamente que las células PER.C6^{TM} (número de depósito de ECACC 96022940) representan un sustrato ideal para la propagación del virus Influenza y que los niveles de producción a partir de PER.C6 dieron como resultado preparaciones de alto título adecuadas con fines de vacunas (documento WO 01/38362). Una línea celular novedosa en el presente documento, denominada "PER.C6-alpha2,6ST" se deriva de PER.C6 a través del siguiente procedimiento: se transfectó en células PER.C6 un plásmido que alberga un ácido nucleico que codifica la alfa-2,6-sialiltransferasa humana bajo el control del promotor fuerte de CMV y posteriormente se seleccionaron las células para dar la integración estable del plásmido. Las células PER.C6-alpha2,6ST se caracterizan por la expresión superior de los receptores que contienen SA-alfa-2,6-Gal en comparación con los diversos receptores que portan el residuo de SA-alfa-2,6-Gal en las células PER.C6 originales. Esto no implica directamente que las proteínas que portan tales restos se sobreexpresen sino que el porcentaje de las proteínas que portan el residuo de SA-alfa-2,6-Gal es superior al porcentaje de tales proteínas en células PER.C6. Las células PER.C6, sin la sobreexpresión de la alfa-2,6-sialiltransferasa, que ya pueden expresar tanto los residuos de SA-alfa-2,3-Gal como de SA-alfa-2,6-Gal en las glicoproteínas de la superficie celular. Sin embargo, es un aspecto importante de la presente invención aumentar el porcentaje de proteínas que portan el residuo de SA-alfa-2,6-Gal en comparación con el porcentaje de proteínas que portan el residuo de SA-alfa-2,3-Gal. Debido a la competencia directa por el sustrato en la maquinaria de glicosilación intracelular, los receptores del tipo SA-alfa-2,3-Gal no tienen la representación que les corresponde en la superficie celular de las células que sobreexpresan la proteína alfa-2,6-sialiltransferasa. Estas características combinadas hacen que esta nueva línea celular sea un medio ideal para propagar aislados de virus Influenza primarios sin inducir presión de selección en la población de tipo natural. La propagación de tales aislados en las células de la presente invención da como resultado la producción eficaz de grandes reservas virales con inmunogenicidad y especificidad por HA inalteradas que son sumamente útiles para la producción de vacunas. Cuando el virus producido en PER.C6-alpha2,6ST no presenta mutaciones que resultan de la adaptación al receptor SA-alfa-2,3-Gal (tal como es el caso para huevos embrionados), las propiedades inmunogénicas de este virus pueden son las más comparables a las de los virus Influenza que circulan de manera natural. En consecuencia, las preparaciones de vacuna obtenidas a partir del virus Influenza que se hizo crecer en PER.C6-alpha2,6ST son idealmente adecuadas para inducir una respuesta protectora frente a virus Influenza de tipo natural circulante. Se conoce en la técnica que los virus Influenza humanos son del tipo que reconoce los enlaces SA-alfa-2,6-Gal y por tanto se reconoce en la técnica que se desea obtener vacunas que comprenden proteínas de estos virus con el fin de clasificar una respuesta inmunitaria más protectora en seres humanos (Newman et al. 1993).

Si los virus Influenza humanos se propagan a través de huevos de gallina embrionados, se seleccionarán las variantes virales que pueden unirse específicamente a SA-alfa-2,3-Gal, y se descartarán los virus que reconocen SA-alfa-2,6-Gal. Las células PER.C6 tienen en su superficie receptores que contienen tanto SA-alfa-2,6-Gal como SA-alfa-2,3-Gal. Por tanto, para una propagación preferida de los virus que reconocen SA-alfa-2,6-Gal se prefiere tener sobreexpresión de los receptores que albergan este componente, tal como se trató anteriormente. Para determinar el efecto de lo contrario, concretamente la sobreexpresión de alfa-2,3-sialiltransferasa humana, la presente invención también proporciona métodos y medios para generar otra línea celular novedosa denominada "PER.C6-alpha2,3ST". Estas células se derivan de PER.C6 de manera similar tal como se describió anteriormente para las células PER.C6-alpha2,6ST, mediante transfección de un plásmido que alberga un ácido nucleico que codifica la alfa-2,3-sialiltransferasa humana bajo el control del promotor fuerte de CMV, tras lo cual se seleccionan las células que portan una integración estable del plásmido. Una célula de PER.C6-alpha2,3ST se caracteriza por la expresión superior de receptores que contienen SA-alfa-2,3-Gal.

Las líneas celulares que sobreexpresan tanto la alfa-2,6-sialiltransferasa como la alfa-2,3-sialiltransferasa son útiles puesto que las células que sobreexpresan la alfa-2,6-sialiltransferasa pueden usarse para la propagación de virus Influenza que reconocen preferiblemente el residuo de SA-alfa-2,6-Gal, mientras que las células que sobreexpresan la alfa-2,3-sialiltransferasa pueden usarse para la propagación de virus Influenza que reconocen preferiblemente el residuo de SA-alfa-2,3-Gal. Cuando la infección y la transmisión de los virus se producen principalmente a través del contacto ser humano-ser humano y los virus se adaptan más a la vía infecciosa a través de los residuos de SA-alfa-2,6-Gal, entonces se prefiere aplicar la línea celular que sobreexpresa la alfa-2,6-sialiltransferasa. Por otro lado, cuando se produce la infectividad directamente a partir de aves que no tienen glicoproteínas que albergan el residuo de SA-alfa-2,3-Gal a seres humanos (como fue el caso en la epidemia pequeña pero grave en Hong Kong en 1997), entonces se prefiere aplicar células que sobreexpresan la alfa-2,3-sialiltransferasa.

Tal como se usa en el presente documento, los términos alfa-2,3-sialiltransferasa o alfa-2,3-sialiltransferasa se refieren a las respectivas transferasas y también a equivalentes de dicha transferasa, comprendiendo dichos equivalentes el mismo tipo de actividad transferasa pero no necesariamente la misma cantidad cuando la transferasa es equivalente. El experto en la técnica puede generar los equivalentes adecuados. Una parte de dicha transferasa es un equivalente adecuado si comprende el mismo tipo de actividad transferasa pero no necesariamente la misma cantidad. Otros equivalentes adecuados son derivados y/o análogos de la alfa-2,3-sialiltransferasa o la alfa-2,3-sialiltransferasa que comprenden el mismo tipo de actividad transferasa pero no necesariamente la misma cantidad cuando la transferasa es equivalente. Tales derivados pueden generarse a través de una sustitución conservativa de aminoácidos o de otro modo. También puede prepararse un derivado a partir de una parte de las respectivas transferasas. Una partícula de virus Influenza tal como se usa en el presente documento puede ser una partícula de virus Influenza o una similar a virus Influenza. Un equivalente de una partícula de virus Influenza es una partícula (similar) viral que comprende el mismo tipo de propiedades de infectividad pero no necesariamente la misma cantidad que una partícula de virus Influenza. Tales equivalentes pueden generarse, por ejemplo, mediante medios recombinantes. Tales equivalentes pueden comprender moléculas que no están presentes normalmente en un virus Influenza.

Ejemplos Ejemplo 1 Construcción de pAlpha2,6ST2000/Hygro

Se obtuvo el fragmento que contenía la secuencia que codifica la alfa-2,6-sialiltransferasa mediante digestión con EcoRI del plásmido pGST-Gal (un obsequio del Dr. I. van Die, Universidad Libre de Amsterdam; el plásmido consiste en una estructura principal de pBR322 que contiene la secuencia de ADNc completa que codifica la alfa-2,6-sialiltransferasa de rata, número de registro de GenBank M18769). Se preparó el fragmento de extremos romos mediante ADN polimerasa de T4 según los procedimientos habituales. Tras la purificación en gel, se ligó el fragmento que codifica la alfa-2,6-sialiltransferasa en pcDNA2000/Hygro (también conocido como plásmido pcDNA2000/Hyg(-)
que se ha descrito en el documento WO 00/63403), que se linealizó con PmeI, se desfosforiló y se purificó en gel según
los procedimientos de laboratorio habituales. El plásmido resultante se denominó pAlpha2,6ST2000/Hygro (figura 1).

Ejemplo 2 Transfección de pAlpha2,6ST2000/Hygro en PER.C6-EPO y selección de clones de sobreexpresión

Se generaron inicialmente PER.C6-EPO para otros fines, concretamente para experimentos que se centran en la glicosilación de eritropoyetina (EPO). La EPO es una proteína que participa en la estimulación de la eritropoyesis y su actividad depende mucho de su contenido en ácido siálico para su funcionalidad in vivo. La línea celular PER.C6-EPO es un derivado de PER.C6 y sobreexpresa la proteína EPO humana (células que se han descrito en el documento WO 00/63403). No se cree que el hecho de que esta línea celular esté produciendo EPO sea crítico para la presente invención. Se cultivaron las células PER.C6-EPO y se transfectaron con pAlpha2,6ST2000/Hygro tal como se describe a continuación.

Se sembraron las células PER.C6 en placas de cultivo tisular (de 10 cm de diámetro) con aproximadamente 2-3 millones de células/placa y se mantuvieron durante la noche a 37ºC y 10% de CO_{2}. Al día siguiente se transfectan las células usando Lipofectamine (Gibco) según el protocolo del fabricante. Se transfectaron veinte placas cada una con 2 \mug de pAlpha2,6ST2000/Hygro todo según protocolos habituales bien conocidos por los expertos en la técnica. Otras 6 placas sirvieron como controles negativos para determinar la destrucción por higromicina y la eficacia de transfección. Al día siguiente, se añadió higromicina a las placas a una concentración de 50 \mug/ml, se disolvió en medio DMEM que contenía FBS. Se incubaron las células a lo largo de un periodo de 3-4 semanas, lavando regularmente las células con nuevo medio complementado con higromicina. Se monitorizaron las células diariamente para determinar, comparándolas con los controles negativos que no recibieron los plásmidos que albergan los marcadores de selección de higromicina. Se recogieron las colonias resultantes y se subcultivaron generalmente tal como se describe para las líneas que sobreexpresan eritropoyetina y anticuerpos en el documento WO 00/63403. Posteriormente se hicieron crecer aproximadamente 25 colonias resistentes a antibióticos seleccionadas en placas de 24 pocillos, 6 pocillos y matraz T25 sin higromicina. Cuando las células alcanzaron el crecimiento en los matraces de cultivo tisular T75, se congeló al menos un vial de cada clon y se almacenó como reserva. Posteriormente, se sometieron a prueba los clones para determinar la actividad alfa-2,6-ST mediante análisis por FACS en un aparato FACsort (Becton Dickinson) usando métodos descritos previamente por Govorkova et al. (1999). Para esto se usó la aglutinina de Sambucus nigra específica para SA-alfa-2,6-Gal (kit de diferenciación de glucanos DIG, Roche) siguiendo los protocolos del proveedor. Se subcultivaron estos clones en un intervalo de tiempo de dos meses, durante el cual se realizaron experimentos de análisis por FACS de manera regular para monitorizar la expresión de la alfa-2,6-sialiltransferasa en la superficie celular. El aumento de la expresión de SA-alfa-2,6-Gal era estable. El mejor clon que expresaba la alfa-2,6-sialiltransferasa, tal como se evaluó mediante la mayor densidad de SA-alfa-2,6-Gal en la superficie celular, era el clon 25-3.10. Este clon se denominó "PER.C6-alpha2,6ST". Los resultados en la figura 4A muestran un análisis por FACS en PER.C6-alpha2,6ST al final del procedimiento de selección. Es evidente que la transfección estable de pAlpha2,6ST2000/Hygro conduce a un aumento notable de los niveles de los residuos de SA-alfa-2,6-Gal en la superficie celular en comparación con la línea celular PER.C6 original. De manera interesante, la sobreexpresión de la alfa-2,6-sialiltransferasa también parece dar como resultado cantidades inferiores de residuos de SA-alfa-2,3-Gal, tal como se detectó mediante FACS usando aglutinina de Maackia amurensis específica para alfa-2,3-Gal (figura 4B). Lo más probable es que este efecto se deba a la competencia de la alfa-2,6-sialiltransferasa con la alfa-2,3-sialiltransferasa endógena para el mismo sustrato de glicoproteina.

Ejemplo 3 Generación de vectores de expresión de ADNc de alfa-2,6 y alfa-2,3-sialiltransferasa

Se obtiene un fragmento de PCR que contiene el ADNc de longitud completa de la alfa-2,6-sialiltransferasa humana (número de registro de GenBank: 14735135) mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en una biblioteca de ADNc humano usando métodos bien conocidos por los expertos en la técnica. Los cebadores usados para la amplificación (sentido: 5'-TTT TTT GGA TCC ATG ATT CAC ACC AAC CTG AAG AAA AAG-3', antisentido: 5'-TTT TTT CTT AAG TTA GCA GTG AAT GGT CCG GAA GC-3') contienen una cola en 5' adicional que permite la digestión con BamHI en el cebador sentido y con AflII en el cebador antisentido, respectivamente. Se purifica el producto de PCR a través de electroforesis en gel de agarosa y se digiere con BamHI y AflII y posteriormente se clona en pcDNA2000/Hygro (descrito como pcDNA2000/Hyg(-) en el documento WO 00/63403) y en pcDNA2000/Neo (este vector se construyó básicamente del mismo modo que pcDNA2000/Hyg(-) a partir de pcDNA2000/DHFR tal como se ha descrito en detalle en el documento WO 00/63403). Para esto, también se digirieron pcDNA2000/Hygro y pcDNA2000/Neo con las enzimas de restricción BamHI y AflII. Se comprueban la secuencia y la clonación correcta mediante la secuenciación de doble cadena según procedimientos habituales conocidos por los expertos en la técnica de la biología molecular. Los plásmidos resultantes se denominan pAlpha2,6STcDNA2000/Hygro (figura 2A) pAlpha2,6STcDNA2000/Neo (figura 2B). Comprenden ácido nucleico que codifica la alfa-2,6-sialiltransferasa humana bajo el control del promotor de CMV extendido (véase el documento WO 00/63403). Además, los plásmidos confieren resistencia a neomicina e higromicina respectivamente, que se usan para seleccionar clones que han integrado el plásmido en su genoma de manera estable.

Se obtiene el ADNc de la alfa-2,3-sialiltransferasa humana (número de registro de GenBank L23767) y se clona tal como se describió anteriormente para el gen de la alfa-2,6-sialiltransferasa humana. Los cebadores que se usan para la reacción de PCR son: sentido 5'-TTT TTT GGA TCC ATG TGT CCT GCA GGC TGG AAG CTC-3' y antisentido 5'-TTT TTT CTT AAG TCA GAA GGA CGT GAG GTT CTT GAT AG-3'. Los plásmidos resultantes se denominan pAlpha2,3STcDNA2000/Hygro (figura 3A) pAlpha2,3STcDNA2000/Neo (figura 3B).

Ejemplo 4 Generación de células PER.C6 estables que sobreexpresan o bien la alfa2,6-sialiltransferasa humana o bien la alfa-2,3-sialiltransferasa humana

Se sembraron células de la línea celular PER.C6 en 40 placas de cultivo tisular (de 10 cm de diámetro) con aproximadamente 2-3 millones de células/placa y se mantienen durante la noche a 37ºC y 10% de CO_{2}. Al día siguiente, se transfectan las células usando Lipofectamine (Gibco) según el protocolo del fabricante y procedimientos de cultivo habituales conocidos por los expertos en la técnica. Se transfectan veinte placas cada una con 5 \mug de pAlpha2,6STcDNA2000/Neo. Otras 20 placas con células no transfectadas sirven como controles negativos para determinar la destrucción por neomicina y la eficacia de transfección. Al día siguiente, se añade neomicina (0,5 mg/ml) a las placas apropiadas, se disuelve en medio que contiene FBS. Se incuban las células a lo largo de un periodo de 4-5 semanas, lavando regularmente las células con nuevo medio complementado con el agente de selección. Se monitorizan las células diariamente para determinar la muerte, en comparación con los controles negativos que no recibieron los plásmidos que albergan los marcadores de selección de neomicina e higromicina. Se recogen las colonias resultantes y se subcultivan generalmente tal como se describió para las líneas celulares que sobreexpresan eritropoyetina y anticuerpos en el documento WO 00/63403.

A partir de cada línea celular, se hacen crecer aproximadamente 50 colonias resistentes a neomicina seleccionadas en placas de 96 pocillos, 24 pocillos, 6 pocillos y matraz T25 con neomicina. Cuando las células alcanzan el crecimiento en los matraces de cultivo tisular T25 se congela al menos un vial de cada clon y se almacena como reserva. Posteriormente, se somete a prueba cada clon para determinar la producción de la alfa-2,6-sialiltransferasa humana recombinante mediante análisis por FACS usando aglutinina de Sambucus nigra específica para SA-alfa-2,6-Gal tal como se describió anteriormente y tal como se describió previamente por Govorkova et al. (1999). La siguiente selección de buenos clones productores se basa en la expresión, el comportamiento en cultivo y la viabilidad. Para permitir las comprobaciones de la viabilidad a largo plazo, del crecimiento en suspensión en frascos rotativos y en birreactor durante periodos de tiempo prolongados, se congelan más viales de los clones con mejor rendimiento, y se seleccionan para la investigación adicional. Se subcultivan estos clones en un intervalo de tiempo de dos meses. Durante estos dos meses, se realizan experimentos de análisis por FACS de manera regular para monitorizar la expresión de la alfa- 2,6-sialiltransferasa en la superficie celular. Se selecciona el mejor productor estable y se usa para la formación de bancos de células. Se expande este clon para generar una línea celular que se denomina PER.C6-H-alpha2,6ST.

Se generan líneas celulares que sobreexpresan la proteína alfa-2,3-sialiltransferasa humana generalmente del mismo modo tal como se describió anteriormente para las células PER.C6 que sobreexpresan la alfa-2,6-sialiltransferasa humana. En este caso, se usa el plásmido pAlpha2,3STcDNA2000/Neo. La línea celular resultante se denomina PER.C6-H-alpha2,3ST.

Ejemplo 5 Cultivo celular e infección con aislados de virus Influenza primarios y adaptados en células PER.C6 y en células que sobreexpresan la alfa-2,6-sialiltransferasa

Se realizaron experimentos para comparar la susceptibilidad a la infección de PER.C6 con la de PER.C6-alpha2,6ST. Se cultivaron los cultivos en suspensión de PER.C6 y PER.C6-alpha2,6ST en medio ExCell 525 sin suero (JRH Biosciences) complementado con L-glutamina 4 mM (Gibco), a 37ºC y 10% de CO_{2} en frascos rotativos de cultivo tisular de 490 cm^{2} durante rotación continua a 1 rpm. Se aplicó el procedimiento descrito a continuación para todas las infecciones por virus Influenza notificadas. En el día de la infección, se sembraron las células en placas de 6 pocillos, a la densidad de 1x10^{6} células/ml en un volumen final de 2 ml de medios sin suero, que contenían pen/estrep 2 mg/ml (Gibco), Fungizone 200 ng/ml (Gibco) y tripsina-EDTA 3 \mug/ml (Gibco). Se infectaron las células con un inóculo viral de un aislado primario y con un lote adaptado de PER.C6 (derivado del aislado primario y con pases para 1 pase en células PER.C6). El aislado primario que se usó es A/Netherlands/002/01 (H1N1, tipo A/New Caledonia, obsequio del Prof. Dr. A. Osterhaus, Universidad de Rotterdam). Se usaron ambos lotes a una dilución de 10-2 v/v. Se mantuvieron las células infectadas en cultivo estático a 35ºC, en 10% de CO_{2}, durante seis días. Se recuperaron los sobrenadantes virales de todo el experimento y posteriormente se clarificaron. Se realizó la clarificación viral mediante la sedimentación de las células en una microcentrífuga Microfuge a 5000 rpm durante 5 min., a temperatura ambiente. Se analizaron los sedimentos celulares mediante ensayo directo de inmunofluorescencia tal como se describe a continuación. Se transfirieron los sobrenadantes a un nuevo tubo Eppendorf, se congelaron rápidamente en N_{2} líquido y se almacenaron a -80ºC hasta su uso en los ensayos de placas de lisis (véase a continuación).

Ejemplo 6 Prueba de inmunofluorescencia

Se llevaron a cabo los ensayos directos de inmunofluorescencia (I.F.) para la detección de la infección por el virus Influenza en células infectadas (véase anteriormente) usando el kit de virus Influenza A y B IMAGEN^{TM} (Dako) según el protocolo proporcionado por el proveedor. Brevemente, se centrifugaron las células infectadas durante 5 min. Se eliminó el sobrenadante y se resuspendió el sedimento en PBS. Esto se repitió dos veces para lavar las células cuidadosamente. Se resuspendió en PBS el sedimento celular lavado y se añadieron 20 \mul de suspensión celular a cada uno de los dos pocillos de un portaobjetos de I.F. Éste se dejó secar a temperatura ambiente. Se fijaron las células añadiendo 20 \mul de acetona a cada pocillo y se secaron al aire. A cada pocillo, se añadieron 20 \mul del reactivo de virus Influenza IMAGEN apropiado (es decir, anticuerpo marcado específico frente a virus Influenza A o B). Después se incubó el portaobjetos durante 15 min. a 37ºC sobre una toallita húmeda. Se eliminó por lavado el reactivo en exceso con PBS y después se enjuagó durante 5 min. en PBS. Se secó al aire el portaobjetos a temperatura ambiente. Se añadió una gota de fluido de montaje IMAGEN a cada pocillo y se colocó un cubreobjetos sobre el portaobjetos (éste se fijó en su sitio con una pequeña cantidad de laca de uñas). Se observaron las muestras microscópicamente usando iluminación epifluorescente. Se caracterizaron las células infectadas por una fluorescencia de color verde manzana brillante. Se registró el porcentaje aproximado de células que mostraban positivo (verde fluorescente) en comparación con las células negativas (rojas). Los resultados se muestran en la figura 5. Es evidente que PER.C6-alfa2,6ST soportó de manera eficaz la replicación del aislado clínico (barras blancas).

Ejemplo 7 Ensayo de placas

Se estudió la producción de virus en PER.C6 y PER.C6-alpha2,6ST mediante la puntuación de la formación de placas de lisis en células MDCK ("Madin Darbin Canine Kidney" ("de riñón canino Madin-Darbin")) inoculadas con sobrenadantes virales. Las células MDCK son particularmente útiles para tales experimentos de ensayo de placas de lisis. Se inoculó un total de 1 ml de sobrenadantes virales diluidos 10 veces de virus Influenza primario y con pases en PER.C6 ambos propagados en PER.C6 y PER.C6-alpha2,6ST según los métodos descritos en el ejemplo 5, en células MDCK que se hicieron crecer hasta una confluencia del 95% en placas de 6 pocillos en DMEM complementado con L-glutamina 2 mM. Después de 1 h a 37ºC, se lavaron las células dos veces con PBS y se sobrecargaron con 3 ml de mezcla de agarosa (1,2 ml de agarosa al 2,5%, 1,5 ml de 2x MEM, 30 \mul de L-glutamina 200 mM, 24 \mul de tripsina-EDTA, 250 \mul de PBS). Después se incubaron las células en una atmósfera húmeda con 10% de CO_{2} a 37ºC durante aproximadamente 3 días y se realizó el recuento y se puntuaron visualmente las placas de lisis virales. Los resultados se muestran en la figura 6. El aislado clínico de virus Influenza (barras blancas) y el virus con pases en PER.C6 (barras grises) pudieron infectar las células PER.C6-alpha2,6ST de manera muy eficaz (panel derecho), mientras que las células PER.C6 (panel izquierdo) no fueron muy susceptibles a la infección por el aislado clínico primario. Esto muestra que las células que sobreexpresan la alfa-2,6-sialiltransferasa son particularmente útiles para propagar aislados virales primarios y muestra que estas células son extremadamente útiles en métodos rápidos y seguros para la producción de vacunas frente a, por ejemplo, la infección por el virus Influenza.

Ejemplo 8 Titulación de partículas de virus Influenza usando células PER.C6 en FACS

Se empleó un método novedoso basado en FACS para medir el título del virus Influenza en sobrenadantes. El procedimiento implica la cuantificación de viriones adecuados para la replicación mediante la detección de la fracción de células que están infectadas de manera productiva dentro de la primera tanda de replicación viral. Con el uso de un cultivo en suspensión de PER.C6 y un resto de infección entre 0,01 y 1 es posible obtener valores muy precisos en el plazo de algunas horas. La misma titulación mediante ensayo de placas de lisis con las células MDCK, que por el momento es el ensayo habitual para la titulación del virus Influenza usado por muchos en la técnica, es mucho más largo (generalmente casi dos semanas), requiere mucho trabajo y es especialmente menos reproducible. Lo que sigue es la descripción técnica de los materiales y el método empleados. En este caso, se muestra que las células en suspensión pueden usarse para la titulación de las partículas de virus Influenza en sobrenadantes usando análisis por FACS.

Se cultivaron en placa células PER.C6, que se hicieron crecer en suspensión en medio AEM sin suero (Gibco), en una placa de 24 pocillos (1 ml de células por pocillo a 1x10^{6} células/ml). Se añadió tripsina-EDTA (Gibco) hasta una concentración final de 3 \mug/ml. Se infectaron las células con un sobrenadante de virus Influenza tipo A (X-127, un virus reagrupado de A/Beijing/262/95 y X-31 (obtenido a partir del Instituto Nacional de Patrones Biológicos y Control). Se añadieron 200 \mul de sobrenadante viral a las células en etapas de dilución de 3 veces, partiendo de la reserva viral sin diluir. Se incluyó un control de células infectadas de manera simulada. Tras la adición del virus, se mantuvieron las células durante 5 h a 35ºC.

Se tomaron muestras de las células infectadas (350 \mul de cada una) en tubos Eppendorf de 1,5 ml. Se añadió PBS frío hasta 1 ml y se centrifugaron los tubos durante 5 min. a 5000 rpm en una centrifuga de mesa para tubos tipo Eppendorf. Se desechó el sobrenadante y se resuspendieron las células cuidadosamente en 100 \mul de disolución permeabilizante Cytoperm/Cytofix fría (Pharmingen). Tras 20 min. a 4ºC, se añadió PBS frío (900 \mul) y se sedimentaron las células de nuevo tal como anteriormente. Se resuspendieron las células sedimentadas en 350 \mul de medio de tinción frío (PBS, BSA al 1%, azida de Na al 0,1%) que contenía 5 \mul de anticuerpo específico frente a nucleoproteína de influenza A marcado con FITC (kit Imagen, Dako). Se incubaron las células a 4ºC durante de 15 min. a 30 min. y posteriormente se lavaron una vez con 1 ml de PBS frío y una vez con 1 ml de disolución de fijación 1x Cellfix (Becton Dickinson). Después se analizaron las células mediante FACS o se almacenaron a 4ºC en la oscuridad durante hasta 1 semana para el posterior análisis por FACS.

Se analizaron las células teñidas en un aparato FACsort (Becton Dickinson). Se detectaron las células positivas para virus Influenza/FITC en el canal FL1 y aparecieron en el cuadrante superior derecho (figura 7). En la parte inferior de la figura se representan gráficamente los resultados del análisis por FACS en células no infectadas y células a las 5 h tras la infección. El cuadrante superior derecho y el cuadrante superior izquierdo de los gráficos representan las células infectadas/positivas para FITC y las células no infectadas/negativas para FITC, respectivamente.

Después se representaron gráficamente las células infectadas como porcentaje en el eje Y frente a la dilución del sobrenadante usado para infectarlas en el eje X (figura 8). El valor que corresponde al 50% de las células infectadas representa el DICT50 del sobrenadante. Sabiendo que se usaron 1.000.000 de células para esta infección inicial, se deriva que 200 \mul de sobrenadante diluido 1/6 contiene 500.000 partículas infecciosas, lo que corresponde a un título de 1,5x10^{7} partículas infecciosas/ml. Cuando se cuantificó el mismo sobrenadante en el ensayo de placas de lisis habitual con células MDCK usando procedimientos habituales bien conocidos por los expertos en la técnica, se obtuvo un valor de 1,7x10^{7}, con una variación de +/- 50%.

Es obvio para un experto en la técnica que pueden usarse diluciones y volúmenes diferentes del sobrenadante viral junto con diferentes cantidades de PER.C6 para variar la sensibilidad del ensayo. De manera análoga, pueden medirse títulos de virus Influenza distintos de X-127, siempre que se use el anticuerpo apropiado en la tinción.

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<110> Crucell Holland B.V.

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<120> Producción de virus, aislados virales y vacunas

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<130> 0071WO00ORD

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<140> PCT/NL 02/000804

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<141> 09-12-2002

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<160> 4

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<170> PatentIn versión 3.1

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<210> 1

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<211> 39

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido sintético

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<400> 1

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ttttttggat ccatgattca caccaacctg aagaaaaag

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39

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<210> 2

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<211> 35

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido sintético

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<400> 2

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ttttttctta agttagcagt gaatggtccg gaagc

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35

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<210> 3

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<211> 36

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido sintético

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<400> 3

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ttttttggat ccatgtgtcc tgcaggctgg aagctc

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<210> 4

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<211> 38

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido sintético

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<400> 4

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ttttttctta agtcagaagg acgtgaggtt cttgatag

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38

Claims (30)

1. Método para producir una partícula viral, comprendiendo dicho método las etapas de:

-

poner en contacto una célula con una partícula viral en un medio de cultivo en condiciones propicias para la infección de dicha célula por dicha partícula viral; y

-

cultivar dicha célula en condiciones propicias para la propagación de dicha partícula viral, en el que dicha célula sobreexpresa, mediante manipulación genética, un ácido nucleico que codifica una alfa-2,6-sialiltransferasa.

2. Método según la reivindicación 1, en el que dicha alfa-2,6-sialiltransferasa es alfa-2,6-sialiltransferasa humana.

3. Método para producir una partícula viral, comprendiendo dicho método las etapas de:

-

poner en contacto una célula con una partícula viral en un medio de cultivo en condiciones propicias para la infección de dicha célula por dicha partícula viral; y

-

cultivar dicha célula en condiciones propicias para la propagación de dicha partícula viral,

en el que dicha célula sobreexpresa, mediante manipulación genética, un ácido nucleico que codifica una alfa-2,3-sialiltransferasa.

4. Método según la reivindicación 3, en el que dicha alfa-2,3-sialiltransferasa. es alfa-2,3-sialiltransferasa humana.

5. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que dicha partícula viral es una partícula de virus Influenza.

6. Método según la reivindicación 5, en el que dicha partícula de virus Influenza está presente en un aislado de Influenza.

7. Método según la reivindicación 6, en el que dicho aislado de Influenza se obtiene a partir de al menos un sujeto mamífero infectado por Influenza.

8. Método según la reivindicación 7, en el que dicho sujeto mamífero infectado por Influenza es un ser humano o un cerdo.

9. Método según la reivindicación 6, en el que dicho aislado de Influenza se obtiene a partir de al menos un ave infectada por Influenza.

10. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que dicha célula se transforma con E1 de adenovirus.

11. Método según la reivindicación 10, en el que dicha célula es una célula humana.

12. Método según la reivindicación 11, en el que dicha célula es una célula PER.C6.

13. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en el que dicho ácido nucleico que codifica la sialiltransferasa es heterólogo con respecto a dicha célula.

14. Método según la reivindicación 13, en el que dicho ácido nucleico que codifica la sialiltransferasa está integrado en el genoma de dicha célula.

15. Método para preparar una vacuna, comprendiendo dicho método las etapas de:

-

producir una partícula viral según una cualquiera de las reivindicaciones 1-14; e

-

inactivar las partículas virales así producidas.

16. Método según la reivindicación 15, en el que dicho método comprende además las etapas de:

-

tratar dichas partículas virales así producidas para producir partes antigénicas; y

-

obtener al menos una parte antigénica.

17. Método según la reivindicación 16, en el que dicha parte antigénica comprende la proteína hemaglutinina o una parte de la misma, y/o la proteína neuraminidasa o una parte de la misma, a partir del virus Influenza.

18. Uso de una célula que sobreexpresa una alfa-2,6-sialiltransferasa para la propagación de una partícula viral.

19. Uso de una célula que sobreexpresa una alfa-2,3-sialiltransferasa para la producción de una partícula viral.

20. Uso de una célula según la reivindicación 18 ó 19, en el que dicha partícula viral es una partícula de virus Influenza.

21. Uso según la reivindicación 20, en el que dicha partícula de virus Influenza está presente en un aislado de Influenza obtenido a partir de al menos un sujeto mamífero infectado por Influenza.

22. Uso según la reivindicación 21, en el que dicho sujeto mamífero infectado por Influenza es un ser humano o un cerdo.

23. Uso según la reivindicación 20, en el que dicha partícula de virus Influenza está presente en un aislado de Influenza obtenido a partir de al menos un ave infectada por Influenza.

24. Método para la propagación selectiva de un conjunto de partículas virales predeterminadas presentes en un aislado, en el que dicho conjunto de partículas virales predeterminadas tiene afinidad por un residuo de SA-alfa-2,6-Gal presente en un receptor, y en el que dicho aislado comprende además de dicho conjunto también partículas virales que no tienen la especificidad predeterminada, comprendiendo dicho método las etapas de:

-

incubar una célula que expresa y expone dicho receptor que comprende un residuo de SA-alfa-2,6-Gal, con dicho aislado en un medio de cultivo en condiciones propicias para la infección de dicha célula por al menos una partícula viral presente en dicho conjunto de partículas virales predeterminadas que tiene afinidad por un residuo de SA-alfa-2,6-Gal presente en un receptor;

-

cultivar dicha célula en condiciones propicias para la propagación de dicha partícula viral; y

-

recoger las partículas virales así producidas a partir de dicha célula y/o dicho medio de cultivo,

en el que dicha célula comprende un ácido nucleico heterólogo que codifica una alfa-2,6-sialiltransferasa, integrado en el genoma de dicha célula.

25. Método según la reivindicación 24, en el que dicho conjunto de partículas virales predeterminadas es un conjunto de partículas de virus Influenza predeterminadas.

26. Método según la reivindicación 24 ó 25, en el que dicho aislado es un aislado de Influenza.

27. Método según la reivindicación 26, en el que dicho aislado de Influenza se obtiene a partir de al menos un ave, cerdo o ser humano infectado por el virus Influenza.

28. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 24-27, en el que dicha célula se transforma con E1 de adenovirus.

29. Método según la reivindicación 28, en el que dicha célula es una célula humana.

30. Método según la reivindicación 29, en el que dicha célula humana es una célula PER.C6.