JPH06508982A

JPH06508982A - 組み込みベクターを用いた非−腫瘍性ヒトリンパ芽球系における発現

Info

Publication number: JPH06508982A
Application number: JP3513935A
Authority: JP
Inventors: バレイ，アニツク; ボフア，ジヨルジユ; カルトロン，ジヤン−ピエール; クレチアン，スタニイ; ランバン，パトリク; ロペ，クロード; プリジエン，シルビイ; サルモン，シヤルル
Original assignee: フオンダシヨン・ナシヨナル・ド・トランスフユジヨン・サンギン
Priority date: 1991-08-01
Filing date: 1991-08-01
Publication date: 1994-10-13
Also published as: ES2100953T3; EP0596881A1; EP0596881B1; WO1993003163A1; ATE150486T1; DE69125292T2; DE69125292D1; DK0596881T3

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】組み込みベクターを用いた非−腫瘍性ヒトリンパ芽球系における発現発明の分野本発明は異種蛋白質、特に治療的に有用な蛋白質をそれらのコード配列の遺伝子操作の後に工業的規模で生産するためのヒト細胞系の利用にさらに正確に言うと、本発明はエプスタイン−バールウィルス（ＥＢＶ）により試験管内で永久分裂能を与えられ、腫瘍又は腫瘍原性の不在に関して選択されたヒトリンパ芽球細胞系の利用に関する。該細胞による異種蛋白質の発現を確実にするために、蛋白質コード配列は遺伝子操作された組み込み型のベクタープラスミドに挿入され、そのベクタープラスミドはクローニング及び発現カセットの細胞染色体ＤＮＡ中への組み込みに関する選択の後に、形質転換リンパ芽球細胞中における該蛋白質の発現を促進するように設計された発現カセットを有する。

本発明は、形質転換リンパ芽球細胞による異種蛋白質の最適発現の促進を目的とする該ベクタープラスミドの設計及び構築も目的とする。

発明の背景蛋白質が少量で存在する天然の供給源から、又は腫瘍あるいはウィルスで汚染されている可能性のある血漿などのおそらく危険な供給源から精製することが困難な治療的有用蛋白質の生産のために、十分に標準化された条件下における全体的安全を保証された試験管内細胞培養に関する研究開発に投資することは正当なものである。

生物活性がその構造及び正しい成熟（グリコジル化、シアリル化・・・・・）に依存する巨大分子の発現はいずれの種類の細胞においても不可能であり、特に工業的規模の発酵で成育するのが容易な微生物において不可能である。対照的に真核細胞においては成熟過程が有効であるが、はとんどの非腫瘍性細胞は単層としてのみ成長し、か（して培養びんに付着するので細胞培養それだけでは工業的規模で問題が解決されない。

生物反応器における培養のためのマイクロキャリヤーの使用から有意な改良が得られたが、いくつかの種類の細胞はこれらの担体に適応せず、さらにこの培養法は蛋白質が培地中に排泄されない場合に適していない。

他方、ベロ（Ｖｅｒｏ）細胞系のようにこの種の培養に非常に適したい（つかの種類の細胞は遺伝子操作により形質転換するのが困難である。

新規細胞系及び該細胞の遺伝子操作を可能にする適したベクターに導く研究はまだ試みる価値がある。

かくして出願人等は、モノクローナル抗体の生産にすでに用いられた細胞系に類似のヒトリンパ芽球細胞系の利用を計画したが、そのような利用にはこれらの細胞に特に適合させた適したクローニング及び発現ベクターの設計が含まれる。

Ｎａｍａ　Ｉ　ｖａとして既知のヒトリンパ芽球系はすでに異種蛋白質の生産に用いられている。この細胞系は懸濁液中で成長し、培地に異種蛋白質を分泌し、培地から異種蛋白質を生物学的活性形態で回収することができる（Ｙａｎａｇｉ　ｅｔ　ａｔ、Ｇｅｎｅ　１９８９．７６．１９及びＤＮＡ　１９８９．８，４１９）が、この細胞系はバーキットリンパ腫（Ｂｕｒｋ　ｉ　ｔ　ｔ　１　ｙｍｐｈｏｍａ）由来であり、腫瘍原性が高い。

発明の詳細な説明非−腫瘍性及び非−腫瘍原性であるヒトリンパ芽球細胞の利用が本発明の１つの目的である。

この種の細胞はすでに既知であり、ＥＢＶ（エプスタイン−バールウィルス）を用いた形質転換により健康なドナーからの血液Ｂリンパ球に永久分裂能を与え、ＥＢＶの核抗原（ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｎｔｉｇｅｎ）ＥＢＮＡ−１を合成しない細胞系を選択することができる（Ｔｈｏｄａｅｔ　ａｔ、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、３８．１９７８．３５６０）。

このような細胞系は培養中で無限に成長するが腫瘍性でなく、それは寒天培地におけるコロニー形成能がないこと、及びヌードマウスにおける腫瘍原性がないことにより確認される（Ｇｕｒｔｓｅｖｉ　ｔｃｈ　ｅｔａｌ、Ｉｎｔ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ　４７，８７．１９８８．Ｔｕｒｓｚｚ、Ｍｅｄｅｃｉｎｅ／５ｃｉｅｎｃｅｓ　６，５ｕｐｐ１．４２゜１９８９）。

出願人等はすでにこの種の細胞をモノクローナル抗体の生産に用いている。分泌された蛋白質の精製過程を容易にするために蛋白質含有率の低い適した培地を設計した（フランス特許第２　６００　０７６号明細書）。

この細胞種はすでに異種蛋白質の発現のモデルとして用いられており、そのコード配列は自律性レプリコン中に挿入され、それは細胞系に永久分裂能を与えるために用いられたＥＢＶのＥＢＭＡ−１蛋白質の制御下にある複製のＥＢＶ起源を有するのでエピソームとして細胞中に残る（Ｋｉｏｕｓｓｉｓ　ｅｔ　ａｌ、ＥＭＢＯＪ、６，１９８７，３５５；Ｙｏｕｎｇ　ｅｔ　ａｌ、Ｇｅｎｅ　６２，１９８８．１７１：Ｊａｌａｎｋｏ　ｅｔ　ａｌ、Ｇｅｎｅ　７８，１９８９．２８７）。

それにもかかわらずこのレプリコンのエピソーム状態はその細胞コピー−数を保証せず、従って特に非常に多数回の細胞増殖サイクルを含む工業規模で時間の関数としての異種蛋白質生産の能力が保証されない。

従ってヒトリンパ芽球細胞における異種蛋白質の発現に必要なすべての要素、ならびに宿主細胞の染色体ＤＮＡ中への構築物全体の組み込みを促進するＤＮＡ配列を有するベクターを遺伝子操作により設計するのが、本発明の他の態様である。

従って１つの態様において本発明は、ＥＢＶを用いて試験管内で永久分裂能を与えられ、腫瘍性又は腫瘍原性がないことに関して選択されたヒトリンパ芽球細胞系の利用を目的とし、該細胞は無作為に選ばれた健康なドナーのＢリンパ球から、又はそのような細胞系の中から選ばれ、十分に特性化され、ＡＴＣＣに受け入れ番号ＣＣＬ　１５６　ＲＰＭ１１７８８として寄託された細胞から誘導される。

本発明に従う利用は、遺伝子操作されたベクタープラスミド中に挿入されるように設計されたＤＮＡのフラグメントによりコードされる異種蛋白質の工業的規模の生産に適しており、ベクタープラスミドは組み込み型であり、発現カセットがリンパ芽球細胞の染色体ＤＮＡ中に組み込まれた後に異種蛋白質の発現を可能にするすべての要素を含む発現カセットを有する。

別の側面において本発明は、異種蛋白質の生産のためのリンパ芽球細胞の利用に適したベクタープラスミドの設計及び操作を目的とする。該プラスミドは、Ｅ、コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）などの宿主におけるその増幅に必要な、出発ｐＭＬＰＩＱプラスミドに由来するバクテリアＤＮＡ要素（Ｂａｌｌａｖ　ｅｔ　ａｌ、　Ｈｅｐａｄｎａ　Ｖｉｒｕｓｅｓ、　１９８７．４８１　Ｅｄ、Ａｌａｎ　Ｒ，Ｌｉ５ｓ）の他に、以下を含む。

−ヒトリンパ芽球細胞中で発現されるべきいずれの異種ＤＮＡの挿入も可能にする発現カセットを構成する要素ニーメツセンジャーＲＮＡ翻訳の最適化を目的とするＶＡ　Ｉ及びＶＡＩＩＲＮＡをコードする、アデノウィルス　５由来のＤＮＡ配列（Ｍａｔｈｅｗｓ、Ｃｅ１ｌ　６，２２３．１９７５；５ｏｄｅｒｌａｎｄｅｔ　ａｌ、Ｃｅ１ｌ　７，５８５．１９７６；５ｃｈｎｅｉｄｅｒ−真核細胞における選択マーカーとして有効であるように操作された遺伝子二単純ヘルペス１　（ＨＳＶＩ）　ＴＫ遺伝子プロモーター及び成熟シグナルの制御下で挿入されたキサンチン−グアニン−ホスホリボシル−トランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）をコードするＥ、コリＤＮＡを選ぶことができ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ　Ｂｅｒｇ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｋ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　９８，２０７２．１９８１）；メトトレキセートの存在下の遺伝子増幅を可能にするマウスジヒドロホレートレダクターゼｃＤＮＡ　（ＤＨＦＲ）を用いることもでき（Ａｆｔ　ｅｔ　ａｌ。

Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５３．１３５７．１９７８）；ベクタープラスミドの異なる位置に挿入された両方の選択遺伝子を用いることもできるニーリンパ芽球細胞の染色体ＤＮＡにおけるプラスミドＤＮＡの組み込みを促進する性質に関して選択されたＤＮＡセグメント。これらの要素は、哺乳類細胞のゲノムへの組み込み過程の間に異種ＤＮＡの縦列重複（ｔａｎｄｅｍ　ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）を促進することが知られているマウスミトコンドリアＤＮＡセグメントから選ばれるのが好ましい（Ｌｕｔｆａｌｌａ　ｅｔ　ａｌ、ｓｏｍａｔｉｃ　ｃｅｌｌ　ａｎｄ　Ｍｏ１．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１１，２２３．１９８５）。

発現カセットは選ばれた細胞中で機能する転写単位を形成する一連の要素を含み、さらに正確に言うとそれはニー異種ＤＮＡが挿入される位置の上流に、ヒトアデノウィルスから誘導され、アクチベーター配列及びプロモーターならびにリーダー配列を含む一組の調節要素； −及びこの位置の下流に、ウィルスＳＶ４０から誘導されたポリアデニル化シグナルを含む。

ヒトアデノウィルスから誘導される要素は好ましくはニープロモーターの上流の転写アクチベーター配列、好ましくはアデノウィルス５のＥＩＡアクチベーター配列の制御下におかれたアデノウィルス５プロモーター（Ｌａｖｅｒｙ　ｅｔ　ａｌ、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、６１゜１４６６６．１９８７）、一メツセンジャーＲＮＡのより有効な翻訳を確実にするアデノウィルス２の三部分リーダー配列のｃＤＮＡの１つのコピーとカップリングしたアデノウィルス２の後期主要プロモーター（ＭＬＰ）を含む。

これらの種々の独立した要素はＢｅｒｋｎｅｒ　（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　６．６１６．１９８８）に記載されている。

選択はこれらの要素に限られず、アデノウィルスから誘導された他の要素、例えばアデノウィルス５の後期主要プロモーター及びＢＫＶ　（Ｇｒｉｎｎｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ、Ｍｏｌ　Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、６．３５９６−３６０５．１９８６）又はＳＶ４０　（Ｚｅｎｋｅ　ｅ　ｔ　ａ　１゜ＥＭＢＯＪ、５．３８７−３９７．１９８６）のエンハンサ−１又はさらに正確に言うとそれらの縦列会合物（ｔａｎｄｅｍ　ａｓｓｏｃｉａｔｆｏｎ）（Ｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎｕｃｌ、Ａｃｆｄ、Ｒｅｓ。

１６．１６３５．１９８８）なども用いることができる。

異種ＤＮＡ配列の組み込みのための発現カセットの中心領域は、組み込み過程を容易にするために希少制限部位（ｒａｒｅ　ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　５ｉｔｅｓ）を備えるように設計され、該希少制限部位はＮｏｔ　Ｉ、Ｂｓｔ　Ｅ　ＩＩ、Ｂｇｌ　ＩＩ、ＭｌｕＩである。

さらに特定すると本発明は、天然の供給源からの精製が困難な治療的に有用な蛋白質を生産するために、前記のプラスミドと共に細胞を利用することを目的とする。従って１つの態様において本発明は、異種蛋白質をコードするＤＮＡ配列の前記の発現カセットへの挿入を目的とする。

その後ベクタープラスミドをエレクトロボレーシコンにより細胞中に導入する（Ｐｏｔｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８１，７１６１．１９８４）。

記載されている蛋白質生産の技術的可能性を示す最初のモデルとして、ヒトエリトロボイエチンＤＮＡを用いた。後文ではエリトロポイエチンを“Ｅｐｏ”又は “ＲＨＥｐｏ”　（組み替えヒトＥｐｏの場合）と呼ぶ。エリトロポイエチン活性を有する類似の蛋白質をコードするＤＮＡを用いることもできる。

天然のＥｐｏは腎臓で合成され、非常に少量で血漿中を循環する。それは赤血球の成熟過程で主要な役割を果す。

それは１６６のアミノ酸及び４０−５０％の炭水化物を含み、それがこの合成に適した宿主細胞の選択を制限する。無形成（ａｐｌａｓｉｃ）の患者の尿（Ｍｉｋａｋｅ　ｅｔ　ａｌ、Ｊ、Ｂｉｏ、Ｃｈｅｍ、２５２　５５５８．１９７７）、及び腎臓腫瘍（Ｓｈｅｒｗｏｏｄ　ｅ　ｔａｌ、ＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇＹ　９９，５０４．１９７６）からのＥｐｏの精製が記載されているが、それを工業的規模に拡大することはできない。

種々の細胞の型（ＣＯＳ、ＣＨＯ，ＢＨＫ、ＮＩＨ３Ｔ３）における組み替えヒトＥｐｏの生産も公開されているが、これらの細胞の欠点は前に議論した。

第２のモデルはインターロイキン−３（ＩＬ−３）のコード配列を用いて調べた。

！Ｌ−３は造血幹細胞の増殖及び分化を促進し、赤血球、巨核球、顆粒マクロファージ（ｇｒａｎｕｌｏ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）、好酸球及び好塩基球を生ずる２Ｏ−２６ｋＤａの糖蛋白質であり、そのヒトＣＤＮＡがＹａｎｇ　ｅｔ　ａｌ、（Ｃｅｌｌ　４７．３−１０．１９８６）によりクローニングされた。マウスの場合、ＩＬ−３は多分化能幹細胞ＣＦＵ−５の自己−再生及び分化にＩＬ− １と相乗的に含まれる。

さらにＩＬ−３は、細胞系特異的サイトカインと相乗的に成熟細胞（例えばマクロファージ、肥満細胞、好中球及び好塩基球多核細胞）の成長及び活性を促進する。造血幹細胞の刺激にＩＬ−３が含まれることは、骨髄無形成の処置における治療的用途を与える（Ｓｈｒａｄｅｒ、Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、４．２０５−２３０，１９８６；Ｍｔｚｅｌ、ＦＡＳＥＢ　Ｊ、３，２３７９，１９８９：Ｔｉｇａｕｄ　ｅｔａｌ、、Ｍｅｄｅｃｉｎｅ／５ｃｉｅｎｃｅ　７．４４４．１９９１）。

ＩＬ−３はＧＭ−Ｃ３Ｆと相乗的に霊長類における造血を刺激することも知られている（Ｄｏｎａｈｕｅ　ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ　２４１．１８２０．１９８８）。

第３のモデルはＣＭ−Ｃ３Ｆ　（顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子）のコード配列を用いて調べた。ＧＭ−Ｃ３Ｆもマルチ−蛋白質（ｍｕｌ　ｔ　１− ｐｒｏｔｅｉｎ）であり、すなわちＩＬ−３と同様に種々の造血細胞系（１ｍ粒単球（ｇｒａｎｕｌｏ　ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ）、赤血球及び混合コロニーの系）の成長及び分化、ならびに成熟細胞（マクロファージ）の活性を促進する成長因子である。

ヒトのＧＭ−Ｃ３Ｆの遺伝子は種々の研究グループによりクローニングされ（Ｗｏｎｇ　ｅｔ　ａｌ、５ｃｉｅｎｃｅ　２２８，８１０．１９８５；Ｌｅｅ　ｅｔ　ａｌ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ；Ｓｃｉ。

ＵＳＡ　８２．４３６０．１９８５；Ｃａｎｔｒｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ：Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８２．６２５０．１９８５；Ｍｉｙａｔａｋｅ　ｅｔ　ａｌ、ＥＭＢＯＪ、４．２５６１゜１９８５Ｌ現在この分子は抗−腫瘍化学療法によって起こる骨髄無形成、ウィルス（ＥＢＶ、ＨｒＶ）性白血球減少及び細胞減少（ｃｙｔ。

ｐｅｎｉａ）の処置に関する人間の臨床研究にて評価されている（Ｃ１ａｒｋ　ｅｔ　Ｋａｍｅｎ、５ｃｉｅｎｃｅ　２３６．１２２９．１９８７；Ｇｒｏｏｐｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、Ｎ、Ｅｎｇｌ、Ｊ、Ｍｅｄ、３２１．１４４９，１９８９；Ａｐｐｌｅｂａｕｍ　ｅｔ　ａｌ、Ｓｅｍ。

Ｈｅｍａｔｏｌ、２６．７．１９８９；Ｓｏｌａｌ−Ｃ６１ｉｇｎｙ。

ｍｅｄｅｃｉｎｅ／５ｃｉｅｎｃｅ　４，２３１，１９９１；Ｔｉｇａｕｄ　ｅｔ　ａｌ、、ｍｅｄｅｃｉｎｅ／５ｃｉｅｎｃｅ　７，４４４゜１９９１）。

他の側面において本発明は、所望の異種蛋白質の高収率分泌に関して多数の形質転換されたクローンをスクリーニングすることにより選ばれた、前記のベクタープラスミドの安定な組み込みの後の形質転換細胞系も目的とする。

収穫及び精製法は各蛋白質の特性に従って決定される。

プラスミドｐＭＬＰ１０から誘導される。種々のＤＮＡセグメントに関して以下の略字を用いる：Ｅ：Ａｄ５のＥＩＡ遺伝子のアクチベーター配列ＭＬＰ：Ａｄ２の後期主要プロモーターＬ：Ａｄ２の三部分リーダー配列のｃ　ＤＮＡＣＡＴ：クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードするバクテリア遺伝子Ｌｌ：ｐＵＣ１８からのポリリンカーム２：合成オリゴヌクレオチドＰ：異種蛋白質のコード配列ｐＡ：５Ｖ４０からのポリアデニル化シグナルＸＧＰＲＴ：キサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼをコードするバクテリア遺伝子ＶＡ：ＶＡ　ＲＮＡをコードするＡｄ５遺伝子ｍ１ｔｏ：マウスミトコンドリアＤＮＡセグメントＤＨＦＲニジヒドロホレートレダクターゼをコードするマウスｃＤＮＡ履ｌは組み込み型発現ベクターｐＴＳ３９の構造を示す。

ｍ１ｔｏ−ＤＮＡ：マウスミトコンドリアＤＮＡセグメント。

第２の選択マーカー（ＤＨＦＲ）はＰ配列の上流のビシストロン位置（ｂｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ　ｐｏｓｉｔｉｏｎ）に挿入される。以下の実施例は本発明を制限することな（例示することを目的とする。

実施例１：組み込みベクターの構築図２に示される組み込みベクターｐＴＳ３９は、図１に示す通り以下の段階により形成したニー出発プラスミドはｐＭＬＰｌｏ（Ｂａｌｌａｙ　ｅｔ　ａｌ、Ｈｅｐａｄｎａ　Ｖｉｒｕｓｅｓ、４８１．１９８７．Ｅｄ、Ａｌａｎ　Ｒ。

Ｌｉ５ｓ）である。

−ｐＭＬＰｃＡＴは、５Ｖ４０（Ｐ、Ｇ１１ａｒｄｉ　ｅｔ　ａｌ、Ｎｅｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　２０．７８７７−７８８７．１９８４）からのＣＡＴ遺伝子及び成熟シグナルを有するｐＨｐ３４−ＣＡＴからのＨｉｎｄ　ＩＩＩ−Ｂａｍ　ＨＩフラグメントをｐＭＬＰＩＯのＨｉｎｄ　ＩＩＩ及びＢａｍ　Ｈ１部位の間でｐＭＬＰｌｏ中に挿入することにより得られる。

−プラスミドｐＴＳ１はｐＵｃ１８からのポリリンカーＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄｌＩＩをｐＭＬＰＣＡＴのＮｒｕ１部位に挿入することにより得られる。

一プラスミドｐＴＳ２は、以下の合成ヌクレオチド（図中でＬ２と呼ばれている）ニーＡＧＣＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＴＴＡＣＣＡＧＡＴＣＴＡＣＧＣＧＴＧＴＴ −３’ −ＡＣＧＣＣＧＧＣＧＣＣＡＡＴＧＧＴＣＴＡＧＡＴＧＣＧＣＡＣＡＡ−５′ をｐ’ｒｓｌ中に挿入することにより得られ、ｐ’ｒｓ１のＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｐａＩ部位の間に希少制限部位であるＮｏｔＩ、５ａｃＩＩ、ＢｓｔＥＩ　Ｉ、Ｂｇｌ　Ｉ　Ｉ、Ｍｌｕｌを含み、その中に所望の異種蛋白質（Ｐ）のコード配列が挿入される。

−プラスミドｐＴＳ５は、ｐＡＧ６０ＶＡのＨｔｎｄＩＩＩ７ラグメント（Ａｄ５（７）ＶＡＩ及びＶＡＩＩ遺伝子を有する）をｐＴＳ２のＸｂａ■部位に挿入することにより得られる。

−プラスミドｐＴｓ１７は、ｐＡＧＴ４０からのＰｖｕＩＩ７ラグメント（Ｈ８ＶＩ　ＴＫ遺伝子のプロモーター及び成熟シグナルの制御下でＸＧＰＲＴ遺伝子を有する）をｐＴＳ５のＳｍａ　１部位に挿入することにより得られる。

一プラスミドｐＴＳ３７はマウスミトコンドリアＤＮＡ配列を有するｐδ１からのＥｃｏＲＩ−Ｐｖｕｌフラグメントをｐ”ｒｓ１７のＳｃ１部位に挿入することにより得られる。

−プラスミドｐＴＳ３９は、ｐＴＧ１０８６からのＢａｍＨｌ−ＢｇｌＩＩフラグメント（マウスＤＨＦＲｃＤＮＡ、すなわちＸＧＰＲＴの代わりの代替選択マーカーのコード配列を有する）を、Ｌ２オリゴヌクレオチド中に挿入されるＰコード配列の前のビシストロンとしてそれが位置するように、ｐＴＳ３７のＢｇｌ１１部位に挿入することにより得られる。

一プラスミドｐＴＳ３９は、異種蛋白質コード配列がＬ２オリゴヌクレオチド中に挿入されると（かくしてＬ２−Ｐと呼ばれる）　、ｐＴＳ３９−Ｐと呼ばれる。

ゲノムＤＮＡライブラリを、遺伝子の配列（Ｌｉｎ　ｅｔ　ａｌ、Ｐｒｏｅ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ　；ＵＳＡ　８２，７５８０．１９８５により公開）から推定された３Ｑ−ｍａｒオリゴヌクレオチド：５’　−ＣＧＴＧＡＴＡＴＴＣＴＣＧＧＣＣＴＣＣＴＴＧＣＣＴＣＣＡＡ−３゛　を用いてスクリーニングした。このプローブはｍＲＮＡの逆に相補的であり、Ｅｐｏの配列の位置１２９− １５９を同定する（塩水ｎ。

１が翻訳の開始に対応する）。

ＥＭＢＬ３をクローニングベクターとして用いた。１２−２０ｋｂのヒトＤＮＡフラグメントをこのベクターに挿入する。１０７のクローンを１０個の皿（直径１５ｃｍ）上に接種した。これらの皿の３系列のプロットを以下の条件で洗浄し、オリゴヌクレオチドプローブとハイブリッド形成させ、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼで１０’ｃｐｍ／μｇの比活性まで標識したニー予備−ハイブリッド形成：３ｘＳＳＣ，２ｘデンハート培地、０．００５９６テトラナトリウムジホスフエート（Ｎａｐｐ　ｉ）　、１００μｇ／ｍｌのサケ精子、５２℃で４時間。

−ハイブリッド形成：　５ｘＳＳＣ１２Ｘデンハート培地、０，０５％Ｎａｐｐｉ、２０μｇ／ｍｌ　ｔ、ＲＮＡ、Ｅｐｏプローブ（フィルター当たり１０”ｃｐｍ／ｍＩ）の存在下の５５℃にて終夜。

−洗浄：−２ｘＳＳＣ，室温にて一２ｘＳＳＣ，０，００５％Ｎａｐｐｉ１５２℃にて、２０分間で３回。

−さらに行う洗浄：　１ｘＳＳＣ，０，０５％Ｎａｐｐｉ、５２℃にて２０分間、及び／又はＯ，’１ｘＳＳＣ，０，０５％Ｎａｐｐｉ、５２℃にて２０分間。

４回の連続的スクリーニングを行い、プローブと強くノ１イブ百ルソド形成する３個の純粋なりローンを特性化した。

これらの３個のファージのＤＮＡを増幅し、分析した。完全なＥｐ。

遺伝子の存在を確認するため、３個のクローンの制限地図を確立し、Ｅｐｏ遺伝子の３′及び５′末端の存在を両末端とハイブリツド形成するオリゴヌクレオチドプローブを用いて調べた。３個のクローン中の２個が完全なＥｐｏ遺伝子を有することが示された。

完全なＥｐｏ遺伝子を有する制限フラグメントをｐＵＣなどの増幅ベクター中にサブクローニングした。２種のそのようなフラグメントをサブクローニングした＋５．４ｋｂのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉフラグメント及び４ｋｂのＢｇｌ　Ｉ　Ｉ−Ｂｇｌ　Ｉ　Ｉフラグメント。

２．２　ヒトＥｐｏ　ｃＤＮＡの単離構成的にＥｐｏを発現する腎臓腫瘍から全ＲＮＡを単離した。これらの全ＲＮＡからオリゴ−ｄＴカラムを介してポリＡ　ＲＮＡ留分を単離し、ＰＣＲ法を用いてクローニングした。

Ｅｐｏ　ｃＤＮＡの回りの２種のプローブを選んだニーＩＮＴＳ１０　：　５’ 　−ＣＴＧＧＡＧＴＧＴＣＣＡＴＧＧＧＡＣＡＧ−３゛この２０−ｍａｒオリゴヌクレオチドはＡＴＧのアデノシン１（Ｅｐ。

ｍＲＮＡの翻訳の開始）からの位置６９４にある。このオリゴヌクレオチドはＥｐｏ　ｍＲＮＡの相補的配列の逆と一致し、ｃＤＮＡの３′末端に接する。

−ＩＮＴＳ９　：　５’　−ＡＧＧＣＧＧＧＡＧＡＴＧＧＧＧＴＧＣ−３’この２０−ｍｅｒオリゴヌクレオチドはｍＲＮＡと同一の配向を有し、Ｅｐｏ　ｃＤＮＡの５゛末端と接する（出発コドンのＡ１からの位置１０にて）。

ＩＮＴＳＩＯプローブはＥｐｏ　ｍＲＮＡ鋳型の逆転写に有用である。

転写の後、ｍＲＮＡは６５℃にてソーダの存在下で１時間分解する。その後１本鎖ｃＤＮＡを、ｃＤＮＡの回りのＩＮＴＳｌｏ及びＩＮＴＳ９の２個のプローブを用いたＰＣＲ法により増幅する。その結果、７２３ｂｐのＤＮＡフラグメントが増幅され、電気泳動により単離され、ｐＵ・　Ｃ−型増幅ベクター中にクローニングされ、配列決定される。

２．３Ｅｐｏコ一ド配列のｐＴＳ３９ベクターへの挿入Ｅｐｏコード配列（ゲノム又はｃＤＮＡ）をプラスミドｐＴｓ３９のし２オリゴヌクレオチド中に、Ｂｓ　ｔＥＩ　Ｉ−Ｂｇｌ　Ｉ　ＩフラグメントとしてＨｉｎｄｌＩＩ及びＢｇｌｌＩ部位に挿入した。

得られた構築物をｐＴＳ３９−Ｅｐｏと呼ぶ。

２．４　細胞トランスフェクション及び形質転換細胞の選択エレクトロポレーションの装置（ＡＴＥＩＭ（商標）−Ｂｉｏｂｌ。

ｃｋ−Ｆｒａｎｃｅ）を用いてトランスフェクションを行った。

トランスフェクションに先立ち、２種類の水溶液を調製したニー融合培地：イノシトール　２５０ｍＭ、ＫＨ２ＰＯ４１ｍＭ、酢酸Ｍｇ　Ｏ，５ｍＭ、酢酸Ｃａ　Ｏ，１ｍＭ、ｐＨ７，４゜−融合一後培地：ＮａＣｌ　１３２ｍＭ、ＫＣＩ　８ｍＭＳＫＨｚＰ０４１ｍＭ、酢酸Ｍｇ　Ｏ，１ｍＭ、酢酸Ｃａ　０．１ｍＭ、ｐＨ７，４゜細胞を２日間成育し、その後洗浄し、融合培地中で４　１０’／ｍｌに調節した。細胞懸濁液を、５μｇ　ＤＮＡ／１０’細胞の存在下で０℃にて１０分間インキュベートした。懸濁液の試料を装置の電極の間に置き、以下の条件下でエレクトロポレーションを行った：１５００Ｖ／ｃｍ２の電場を用い、１秒間隔で１００μｓの４回の矩形インパルス。

電気衝撃の直後に懸濁液を１／２０に希釈し、３７℃で２０分間インキュベートした。細胞の生存率を２０−６０％と評価した。その後細胞を０゜５　１０’／ｍｌの濃度で培養した。

トランスフェクションの４８時間後、Ｅｐｏ定量（ｄｏｓａｇｅ）のために上澄み液のアリコートを採取した。細胞をさらに選択遺伝子ＸＧＰＲＴに対応する選択培地（ＩＳＣＯＶＥ　（商標）、１０％透析コウジ血清、マイコフェノール酸（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ　ａｃｆｄ）１μｇ／ｍ＋、キサンチン　２５０μ ｇ／ｍｌ）中で培養した。

２．５　形質転換細胞を用いたＨＲ−Ｅｐｏの生産＊発現ベクターｐＴＳ３９− Ｅｐｏを用いて形質転換されたＡＴＣＣ−ＣＬ１５６約６１０６のＣＣＬ１５６細胞を３０μｇのプラスミドＤＮＡを用いたエレクトロポレーションによりトランスフェクションし、４８時間後にキサンチン及びマイコフェノール酸を含む選択培地の存在下で培養した。生存耐性細胞を、支持細胞（放射線照射されたヒトリンパ球）の存在下の限界希釈によりクローニングした。得られた種々のクローンの中で、１個のクローン、ｎ’１５６　０．５ＡＦ８が７２時間で培地１ｍｌ当たり約１００−１５０単位のＥｐｏを分泌する。それを選択圧（Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ　ｐｒｅｓｓｕｒｅ）の存在下及び不在下で追跡した。

このクローンは選択圧の存在下で４８継代、すなわち約７カ月安定であることが見いだされた。

クローン１５６　０．５　ＡＦ８から抽出された全ＤＮＡのサザンプロット分析は、ベクターｐＴＳ３９−ＥｐＯが細胞ゲノム中に縦列に組み込まれ、選択圧の存在下で培養しても不在下で培養しても１５−２０のコピーが各細胞中に存在することを示した。

回転培養の場合、クローン１５６　０．５　ＡＦ８は、蛋白質−欠乏培地ＣＫ４又はＣＫ４Ｎ　（基本培地：ＩＳＣＯＶＥ−Ｈａｍ　Ｆ１２の混合物（１：１）：ＣＫ４：ヒトアルブミン　５Ｏｍｇ／ｍｌ；ヒトトランスフェリン、ＦｅＣｌ３の添加により３０％飽和、１ｍｇ／ｍｌ；ウシインスリン　３ｍｇ／ｍｌ：リルン酸　１ｍｇ／ｍｌ；プトレシン　１０μＭ；エタノールアミン　２０μＭを補足：　ＣＫ４Ｎ：同組成にリボヌクレオチドを加える：アデノシン　１００ｍｇ／ｍｌ、シチジン　１００ｍｇ／ｍＩ、グアノシン　１００ｍｇ／ｍｌ、ウリジン　１００ｍｇ／ｍｌ）中で３日後に８Ｏ−４００Ｕ　Ｅｐｏ／ｍｌを分泌する。培地を３日毎に新しくするとこの分泌の収率は３倍にすることができる。

＊ＥＢＶを用いて試験管内で永久分裂能を与えられた細胞（系ＩＮＴＳ−Ｆ５）ＣＣＬ１５６を用いた前記の実験と同一の実験を、以前にモノクローナル抗体の生産に用いられたＦ５細胞系を用いて再現した（Ｇｏｏｓｅｎｓ　ｅｔ　ａｌ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　１９８７゜１０１，１９３）。それらをベクターｐＴｓ３９−Ｅｐｏを用いてトランスフェクションした。トランスフェクションの後の種々の時間にＥｐＯの定量を行い、陽性であることが見いだされた：選択の２１日後に２９Ｕ　Ｅｐｏ／ｍｌ／１０’細胞が得られた。

２．５　ＲＨ−Ｅｐｏの生物学的及び免疫学的活性の測定胎児肝臓赤芽球の培養５ｔｅｐｈｅｎｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ８８．１５１９．１９７１）に記載の通りに２６時間培養されたマウス胎児肝臓赤芽球（妊娠１３日の雌から集めた）中へのｓ＠ｐ’ｅの取り込みによりＥｐｏ活性を試験管内で測定した。

細胞を機械的に分離し、７％のウシ胎児血清、アルブミン　８５μＭ及びヒトトランスフェリン　０．　４μＭを含むＲＰＭ１１６４０培地（Ｔａｍｂｏｕｒｉｎ　ｅｔ　ａｌ、Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ　１９，１１２．１９８３；Ｇｏｌｄｗａｓｓｅｒ　ｅｔ　ａｔ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　９７，３１５．１９７５）１ｍｌ当たり１．６１０’細胞の濃度で再懸濁したある条件下では、天然源又は合成から精製した天然のリン脂質（大豆、卵レシチン）（３２１０−３’Ｍ）及び後に窒素流下で蒸発させるクロロホルムに溶解したコレステロール（１，６１０−”Ｍ）を含む血清−非含有培地を用いた。脂質は冷却水浴中の超音波処理によりアルブミン溶液（ＲＰＭＩ中１ｍｇ／ｍｌ）に溶解した（Ｂｏｆｆａ　ｅｔ　ｃｏｌｌ、Ｅｘｐ、Ｈｅｍａｔｏｌ、１０，６７５．１９８２）。

細胞懸濁液を２００μｍの試料としてアリコートに分け、培養ミクロプレート　Ｎｕｎｃｌｏｎ　（商標）のウェルに分配した。３７℃の０゜７％ＣＯ２下で２１時間インキュベートした後　５ｅＦｅ　）ランスフェリンをウェルに加え、ミクロプレートを振り、さらに５時間インキュベートした。

各試料を３又は４の異なる蛋白質濃度で測定し、各活性を４回測定した。メチルアセトン抽出ヘム上、又は細胞中への５９Ｆｅの取り込みの比率を試料の量の対数の関数として測定した。結果をミリ単位／ｍｌ又はｍｇ蛋白質として表す。

標準は力価が１００ＯＯＯＵ／ｍｇの組み替えヒトＥｐｏである。その比活性はヒトＥｐｏの第２国際標準との比較により決定する（Ａｎｎａｂｌｅ　ｅｔ　ａｌ、Ｂｕｌｌ、Ｗｌｄ、Ｈｌｔｈ、Ｏｒｇ、４７゜９９．１９７２）。

骨髄幹細胞又は末梢血細胞の培養ＢＦＵｅ及びＣＦＵｅの細胞成熟へのＲＨ−Ｅｐｏの影響を、メチルセルロース −ＩＭＤＭ血清−非含有培地（Ｃｏｒｍｉｅｒ　ｅ　ａｌ。

Ｃｅ１ｌ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ、１７，２６１．１９８５）上の赤血球の細胞前駆体の培養において決定した。ＲＨ−Ｅｐｏは尿のＥｐｏと同様に、マウス骨髄由来又はヒト末梢血由来のＢＦＵｅの分化及び成熟を促“進した。

ＣＦＵｅ発生に対するＲＨ−Ｅｐｏの用量の関連性を天然のＥｐｏのものと比較した。

放射性免疫定量（ｒａｄｉｏ−ｉｍｍｕｎｏ−ｄｏｓａｇｅ）以下の２つの方法に従って細胞上澄み液に関し、ＲＨ−Ｅｐｏの放射性免疫定量を行った。

１一液相における二重抗体沈澱による：単−特異性抗一ヒト尿Ｅｐｏウサギ免疫血清（Ｔｅｒｒｙ　Ｆｏｘ　Ｌａｂ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ）をヒトＥｐｏ標準又は試験試料と共に４℃で１６時間インキュベートした。

その後２０００ｃｐｍの”’　Ｉ　−ＲＨ−Ｅ　ｐ　ｏ　（Ａｍｅｒ　ｓ　ｈ　ａｍ）を加え、混合物を４℃で２時間インキュベートした。２０−３０％の吸着放射性を与えるように免疫血清希釈を選んだ。免疫血清の最終的希釈は１０−’ −１０−’である。抗−ウサギＦｃヒツジ免疫グロブリンの存在下の２０℃で２時間インキュベートした後、ペレット中で放射性を測定した。

２−ＴＡＣＨＩＳＯＲＢ（商標）上の固相における二重抗体沈澱による：反応物を、９６ウエルの微量滴定プレートＤＹＮＡＴＥＣＨ（商標）上に２２０μｌの最終体積で１度に分配した。室温における水平回転震盪下で２時間インキュベートした後、５ＫＡＴＲＯＮ　（商標）装置上のガラス中空繊維フィルター上に収穫した。反応物は１００μｌのＥｐ。

（標準又は試験試料）、１０μＩの抗−Ｅｐｏ免疫血清、１０μｌの１２５１− ＲＨ−Ｅｐｏ及び１００μｌのＴＡＣＨＳＯＲＢ　（商標）を含む。

試料がガラス中空繊維中に吸着されたら、放射性の測定のためにそれをポリスチレン管に移した。

本方法の感度は１−１−１Ｏ０以内である。

形質転換された細胞の上澄み液の場合に測定される活性は８００　Ｕ／ｍ１に達するがアンチセンスベクターを用いて形質転換された細胞の上澄み液は活性を示さない。試験管内生物活性と放射性免疫定量の間に高い関連性が観察される。

２．７．ＲＨ−Ｅｐｏの生体内生物活性の検出と測定形質転換されたリンパ芽球細胞の培養上澄み液から集めたＥｐ、を、内因性Ｅｐｏ合成を阻害するために人工的にポリグロブリン性（ｐｏｌｙｇｌｏｂｕｌｉｃ）とされたマウス中に注射した後、その生体内活性を調べた（Ｊａｃｏｂｓｏｎ、ｅｔ　ａｌ　Ｐｒｏｃ、Ｓｏｃ、Ｅｘｐ。

Ｂｔｏｌ、Ｍｅｄ、９４，２４３．１９５７）。リンパ芽球細胞からのＥｐｏはＣＨＯ細胞内で生産されたＲＨ−Ｅｐｏの場合と比較して高い生物活性を示す（Ｋｉｒｉｎ−Ａｍｇｅｎ−欧州特許第０　１４８　６０５号明細書）。

結果はヒト尿Ｅｐｏの国際標準と比較して行われた試験管内の生物学的定量とも一致する。

３、　ａ　第１法蛋白質欠乏培地（ＣＫ４）中の細胞培養の上澄み液をＰＭＩＯ膜（ＡＭＩＣＯＮ（商標））上の限外濾過、又はＰＬＧＣ膜を用いたＭＩＮＩＴＡＮ　（商標）上の接線濾過（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ　ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）により濃縮し、その後グルコース　１２．５ｍＭ、ガラクトース　１２．５ｍＭ５ＰＥＧ６０００　０．１ｍｇ／ｍ＋、β−メルカプトエタノール　１０−’Ｍの溶液で、濾液の抵抗率が５０００オームより高くなるまで洗浄した。

濃厚液を凍結乾燥し、酢酸カルシウム　１０ｍＭ、ＮａＣ１１００ｍＭ、フェノール　５．６　１０−’Ｍ、グルコース　１２．５ｍＭ、ガラクトース　１２．５ｍＭ、ＰＥＧ６０００　０．１ｍｇ／ｍｌを含む緩衝液中のｐＨ６，８にてＵＬＴＲＯＧＥＬ　（商標）ＡｃＡ４４上のクロマトグラフィーにかけた。活性留分を限外濾過により濃縮し、凍結乾環シタ。サラニ生成物を、酢酸塩　０．０４８ｍＭ、ＣａＣ１，３ｍＭ、グルコース　１２．５ｍＭ、ガラクトース　１２．５ｍＭ、ＰＥＧ−６００００，１ｍｇ／ｍｌ、β−メルカプトエタノ−／Ｉ／　１０−’Ｍを含む緩衝液中でＤＥＡＥ−ＴＳＫ　５４５カラム上のＨＰＬＣにより精製し、ＮａＣｌの不連続勾配により溶離した。約７５％の活性が回収される。生成物の透析及び濃縮の後、それをさらにＮａＣｌ　１５０ｍＭを含むｌＱｍＭのリン酸塩緩衝液中のｐＨ７，２にてＣＯＭ−ＡＦＦＩＧＥＬ−ＢＬＵＥ上のクロマトグラフィーにかけた。Ｅｐｏは１．１５ＭのＮａＣＩを用いて溶離した。Ｅｐｏの比活性は１００ＯＯＯＵ／ｍｇより高い。

３、　ｂ　第２法限外濾過により濃縮した細胞培養培地を、酢酸塩　４８ｍＭ５ＣａＣ１，３ｍＭ、フェノール　５．４　１０−’Ｍを含む緩衝液中のｐＨ４゜５及び４℃にてＤＥＡＥ−８ＥＰＨＡＣＥＬ　（商標）上に注入した。吸着された活性を０．６ＭのＮａＣｌで溶離した。

溶離液を透析し、濃縮し、ＵＬＴＲＯＧＥＬ　（商標）ＡｃＡ４４上で濾過した。活性留分をＲＩＡにより検出し、還元剤及び安定剤としてのヘキソースの存在下でＤＥＡＥ−ＨＰＬＣにかけた。低モル濃度のＮａＣ１を含むｐＨ５，５の緩衝液で溶離したＲＨ−ＥｐｏをさらにＡＭＩＣＯＮ　（商標）ＰＭＩＯ膜上で濃縮し、ＰＢＳ緩衝液中の４℃にてＷＧＡ−５ＥＰＨＡＲＯ３Ｅ　６ＭＢのカラム上に注入した。

それを０．５ＭのＮ−アセチルグルコサミンで溶離した。生成物を４−３０％のポリアクリルアミド勾配を用いた５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、３４ｋＤａの成分が観察された。この成分をポリクローナル抗−Ｅｐｏ免疫グロブリン及びモノクローナル抗−ＲＨ−Ｅｐｏ抗体を用（またイムノブロッティングにより同定した。４２ｋＤａにて移動する少量成分がいくつかの試料で観察された。この成分は抗−Ｅｐｏポリクローナル血清を用いたイムノブロッティングにより検出されなかった。この結果はラジオイムノ検出及びマウス胎児腎臓赤芽球に関する研究により確認される。

場合によりＣＭ−ＡＦＦＩＧＥＬＬ　ＢＬＵＥ（商標）又はＨＡ−ＵＬＴＲＯＧＥＬ　（商標）上で、あるいは５Ｄ８０．１％培地中のＨＰＬＣによりさらに精製段階を行うことができる。ポリアクリルアミド−８ＤＳゲル上で決定されたＲＨ−Ｅｐｏの見掛けの分子量は３４ｋＤａである。

その比活性は赤芽球培養及びＲＩＡで測定して１２０ＯＯＯＵ／ｍｇより高く、回収効率は２０−３０％である。

３、ｃ　第３法：ＲＨ−Ｅｐｏの免疫精製（ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）Ｃ−１免疫吸着剤の調製細胞上澄み液からのＲＨ−Ｅｐｏを、前記第２法と同様にして精製した。ＲＩＡにより、及び赤芽球培養へのその活性により決定したその比活性は１３００００１Ｕであった。凍結乾燥したＲＨ−Ｅｐｏを０．０５％　ＳＤＳの存在下で再− 溶解し、Ｂａ１ｂ／ｃマウスの免疫化に用いた。

各マウスに以下の投薬量を用い、１５日の間隔で腹腔内注射した：９０．４５及び最後の注射の場合１０又は３５ｍｇ。

最後の注射の５日後に融合（ｆｕｓｉｏｎ）を行った。３０−９０％の融合ウェルを調べた。抗体はその上澄み液中で１２’　Ｉ　−ＲＨ−Ｅ　ｐ　。

に結合する能力により検出した。放射性標識複合体をスタフィロコックス蛋白質Ａ上に共有結合したヒツジ抗体、抗−マウスＩｇＧを用いて検出した。複合体を集め、その放射性を測定した。

′　１０番目の融合から３個のハイブリドーマが陽性であることが見いだされ、それをクローニングした。膵臓細胞が由来するマウスの血清は１／３０００希釈にて６５％の免疫学的反応を与えた。ＩｇＧの種類の１個のモノクローナル抗− Ｅｐｏ抗体が得られ、ＥｐｌＯ−１４１Ａ２６とされた。その固定容量は５０− ６０％である。この抗体を生産するクローンは多数回のサブクローニングの後も安定なままであった。

腹水中の培養によりそれを増殖させ、それにより数ミリグラムの抗体の精製に十分な量となった。抗体の精製は蛋白質Ｇ−ＳＥＰＨＡＲＯ８Ｅ上への吸着により行い、腹水液はＯ，ＬＭのリン酸塩を用いてｐＨ７゜５にて緩衝し、吸着材料はｐｉ（６，５で洗浄し、グリシン−ＨＣｌ　Ｏ。

１Ｍ緩衝液を用いてｐＨ２，８にて溶離した。３０ｍｇのＥｐｌＯ−１４１Ａ２６精製抗体のバッチが得られ、シアノゲンブロミドで活性化された５ＥＰＨＡＲＯ３Ｅ　４Ｂ　（８ｍｌのゲル）上に結合した。得られたカラムは約５−６ｍｇのＲＨ−Ｅｐｏを吸着することができる。

予備試験によりＥｐｏがほとんど中性のｐＨで抗体に吸着することが示された。

その溶離を６．５．４５．２．８．２．２の種々のｐＨで調べ、主にｐＨ４，５ −２，８で溶離する。

免疫吸着剤はＴＨＹＭＩＲＯ３ＡＬ　０．０２％の存在下のｐＨ７゜５のリン酸塩緩衝液中にて４℃で保存する。カラムは多数回のサイクルに再利用することができる。

Ｃ−２Ｅｐｏ精製精製は２段階で行う。

一第１段階：リンパ芽球細胞培養上澄み液を３−４ｍｇ／ｍｌの蛋白質濃度まで限外濾過し、透析し、酢酸を用いてｐＨ４，５に、及び水を用いて１０００オームに平衡化した。

沈澱を遠心し、上澄み液を０．００２５Ｍ　ＣａＣ１！及び５．４１０−’Ｍ　フェノールを含む０．０４Ｍ　酢酸塩緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−８ＥＰＨＡＣＥＬ　（商標）カラム上に０．１（交換体の体積で表す、ｍｌ／注入された蛋白質のｍｇ）の比率で注入した。

緩衝液中のＱ、５Ｍ　ＮａＣｌを加えることにより活性留分を溶離し、カラム上に注入された蛋白質の合計量の１５−２０％を示した。溶離液をｐＨ７に平衡化し、抵抗率が８０−１００オームとなるまで透析した。

−第２段階この段階は前記の免疫吸着剤上で行った。

第１段階ＤＥＡＥ−８ＥＰＨＡＣＥＬの溶離液をｐＨ４，５の０．１Ｍのリン酸塩緩衝液中、４℃及び６−７ｍ１／時間の流量で免疫吸着剤カラム上に注入した。

同緩衝液を用い、ｐＨ６，５にて洗浄を行った。さらにＥｐｏは０゜１Ｍのグリシン−ＨＣｌを含む緩衝液を用い、ｐＨ２゜２、室温及び５０ｍ１／時間の流量で溶離した。

溶離液をＩＭ　ＴＲｌ５緩衝液を用い、ｐＨ７，５で平衡化した。

Ｅｐｏ活性の回収効率は出発材料中の活性Ｅｐｏの５０−６０％である。

Ｃ−３−リンパ芽球細胞により生産された免疫精製ＲＨ−Ｅｐｏの特性ＲＨ−Ｅｐｏ試料の均一性を５ＤＳ−ＰＡＧＥの後で濃度測定により評価した。Ｅｐｏの均一性は９８％より高いことが見いだされ、その見掛けの分子量は３４０００ダルトンと決定された。

その電気泳動における移動度はＣＨＯ細胞で生産されたＥｐｏ及び市販の標準” ”ｒ−Ｅｐｏ　（Ａｍｅｒｓｈａｍ）の移動度と同一である。

その等電点は３．５−４である。その比活性は尿Ｅｐｏより高（、約２０００００Ｕ／ｍｇｔ’ある。

ＩＬ−３の配列の逆に相補的な以下＋５’　ＴＡＡ　ＧＴＧ　ＴＧＴＴＡＴ　ＡＡＴ　ＴＴＣＡＴＣＧＡＴ　ＣＡＴ　ＧＴＴ３’の３０−ｍａｒのオリゴヌクレオチドをプローブとして用い、ヒト白血球のゲノムＤＮＡライブラリ及びヒト胎児腎臓のｃＤＮＡライブラリのスクリーニングを行った。合成プローブはＩＬ− ３コ一ド配列の開始−ＡＴＧからｎ’１１０下流の塩基で始まる配列に対応する。

数個のクローンを単離し、制限分析により遺伝子の存在を確認した。

遺伝子を含むことが示されたファージを５．４ｋｂのＡｃｃＩフラグメントとしてｐＵｃ１８中にサブクローニングした。発現カセットに挿入する前にプロモーター及び３゛非非翻訳列を除去した。以下：ＩＮＴＳ１６：ＡＴＧから−９の位置に対応する５’　ＧＡＴＣＣＡＡＡＣＡＴＧＡＧＣＣＧＣＣＴ３’ ＩＮＴＳ１７：停止コドンから５２下流の位置に対応する５’　ＡＴＧＴＣＣＣＧＡＧＧＣＧＣＴＧＴＧＧＴ３’の２個の合成オリゴヌクレオチドを用い、以前に特性化され、ｐＵｃ１８中にクローニングされたゲノム配列を鋳型として用いてコード配列をＰＣＨにより増幅した。

２１４０ｂｐフラグメントの増幅生成物をｐＵｃ１８のＳｍａｒ部位にサブクローニングし、部分的に配列決定してＩＬ−３遺伝子の組み込みを確認した（Ｙａｎｇ　ｅｔ　Ｃ１ａｒｋ、於“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　ｇｌｏｂｉｎ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ″Ａ、Ｒ，ＬＩＳＳ　Ｐ、３−１１　１９８７に従い）。

得られた十分に制御されたコード配列を、実施例１で記載したベクタープラスミドの発現カセットに挿入した。強い陽性の発現を与える細胞クローンを選択し、増殖させた。

細胞培養培地中に生物活性インロイキン−３が分泌されるのが見いだされた。

実施例５．リンパ芽球細胞におけるヒトＧＭ−Ｃ３Ｆの生産のための組み込みベクタープラスミドの利用ＧＭ−ＣＳＦ配列の逆に相補的な以下５’　ＴＴＧ　ＣＴＣＴＡＡ　ＧＣＡ　ＣＴＴ　ＧＡＧ　ＣＡＧ　ＧＡＡ　ＧＣＴ　ＣＴＧ３’ の３０−ｍｅｒオリゴヌクレオチドをプローブとして用い、ヒト白血球のゲノムＤＮＡライブラリ及びヒト胎児腎臓のｃＤＮＡライブラリをスクリーニングした。合成プローブはＣＭ−ＣＳＦコード配列の開始ＡＴＧから００下流の塩基に対応する。

数個のクローンを選択し、制限分析により遺伝子の存在を確認した。

遺伝子を含むことが示されたファージを３．２ｋｂのＨｉｎｄｌＩＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントとしてｐＵＣ１８中にサブクローニングした。

発現カセットに挿入する前に、プロモーター及び３′非非翻訳列を除去した。以下：ＩＮＴＳ１９：ＡＴＧから−３１の位置に対応する５°　ＣＡＣＡＧＡＧＡＧＡＡＡＧＧＣＴＡＡＡＧ３゜ＩＮＴＳ１８・停止コドンから１７７下流の位置に対応する５’　ＡＴＴＣＣＣＡＴＴＣＴＴＣＴＧＣＣＡＴＧ３’の２個の合成オリゴヌクレオチドを用い、以前に特性化され、ｐＵｃ１８中にクローニングされたゲノム配列を鋳型として用いてコード配列をＰＣＲにより増幅した。

２２４０ｂｐフラグメントの増幅生成物をｐＵｃ１８のＳｍａ　Ｉ部位にサブクローニングし、部分的に配列決定してＧＭ−ＣＳＦ遺伝子の組み込みを確認した（Ｍｉｙａｔａｋｅ　ｅｔ　ａｌ、ＥＭＢＯＪ、４゜２５６１．１９８５に従い）。

細胞培養培地中に生物活性ＧＭ−Ｃ３Ｆが分泌されるのが見いだされた。

′　Ｅ　門しｐｌＬ１２３　ｔ　ｐＭＬρ　１０−＋ ’　ＥｌｆｆｌＬｌ）ｌＬ１２３１　ＣＡＴ　ＯＡ　ｔ　ｐ門ＬＰ　ＣＡＴ＋＋／　Ｅ　ｒ１ＬＰＬ１２３２　Ａ　ＸＧｔ）ＱＴ　ＶＡ　／　ＧＩＴＳＩ７↓ ÷ 国際調査報告フロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号／／（Ｃ１２Ｐ　２１１０２Ｃ１２Ｒ１：９１）（７２）発明者　カルトロン、ジャン−ビニールフランス国エフー７５００７パリ・スクワールロビアク２（７２）発明者　クレチアン、スタニイフランス国エフ−７５０１５パリ・リュグラム（７２）発明者　ランパン、パトリクフランス国エフー７５０１５パリ・リュデアントルプルヌール５４Ｉ（７２）発明者　ロへ、クロードフランス国エフー９４３６０プリスユールマルヌ・アベニュージョルジュクレマンソー３９（７２）発明者　プリジエン、シルビイフランス国エフー９１４４０ピュールスユールイベット・リュデュロワヨーム９ビス（７２）発明者　サルモン、シャルルフランス国エフ−７５０１２パリ・リュファブルデグランチーヌ１２

Claims

【特許請求の範囲】

１．発現カセットが細胞染色体ＤＮＡ内に組み込まれた後、リンパ芽球細胞中で異種蛋白質の発現を可能にするすべての要素を含む発現カセットを有する遺伝子操作された組み込み型のベクタープラスミド中に挿入されたＤＮＡフラグメントによりコードされる異種蛋白質の工業的規模の生産のための、エプスタイン−バールウィルス（ＥＢＶ）により試験管内で永久分裂能を与えられ、腫瘍又は腫瘍原性の不在に関して選択されたヒトリンパ芽球細胞系の利用。
２．その増幅に必要なバクテリアＤＮＡ要素と共に以下のＤＮＡフラグメントーヒトリンパ芽球細胞中で発現されるべき異種ＤＮＡの挿入を可能にする発現カセットを構成するＤＮＡ要素；一メッセンジャーＲＮＡ翻訳の最適化を目的とするＶＡＩ及びＶＡＩＩＲＮＡをコードする、アデノウイルス５由来のＤＮＡ配列 −真核細胞における選択マーカーとして有効であるように操作された遺伝子 −細胞染色体ＤＮＡ中へのプラスミドＤＮＡの組み込みを促進する性質に関して選択されたＤＮＡセグメントを含む、異種蛋白質の生産のための請求の範囲１に記載のリンパ芽球細胞の利用のために設計されたベクタープラスミド。
３．ベクター中に組み込まれる発現カセットを形成するＤＮＡ要素がａ）アデノウイルス由来の転写アクチベーター配列、ｂ）アデノウイルス由来のプロモーター及びリーダー配列、ｃ）異種蛋白質のＤＮＡコード配列の組み込みを目的とした制限部位を含む合成オリゴヌクレオチド、ｄ）ＳＶ４０ウィルス由来のポリアデニル化シグナルを含むことを特徴とする請求の範囲２に記載のベクタープラスミド。
４．発現カセットが： −要素ａ）としてヒトアデノウイルス５のＥＩＡ遺伝子のアクチベータ−配列、 −要素ｂ）としてアデノウイルス２の三部分リーダー配列とカップリングした同一のアデノウイルス２の後期主要プロモーター、−要素ｃ）として異種蛋白質の組み込みを容易にするために希少制限部位、例えばＮｏｔＩ、ＢｓｔＥＩＩ、ＢｇＩＩＩ、ＭＬｕＩを備えるように設計された配列を含むことを特徴とする請求の範囲２に記載のベクタープラスミド。
５．選択マーカーとして有効なように操作された遺伝子が：−単純ヘルペスウィルス１Ｔｋ遺伝子プロモーター及び成熟シグナルの制御下で挿入されたキサンチン−グアニン−ホスホリルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）をコードするＥ．コリＤＮＡ、−マウスジヒドロホレートセダクターゼ（ＤＨＦＲ）ｃＤＮＡ、− 又はベクタープラスミド中の異なる位置に挿入された両遺伝子の組み合わせから選ばれることを特徴とする請求の範囲２に記載のベクタープラスミド。
６．該プラスミドＤＮＡ組み込みを促進するその性質に関して選択されたＤＮＡセグメントがマウスミトコンドリアＤＮＡのフラグメントを含むことを特徴とする請求の範囲２に記載のベクタープラスミド。
７．発現カセットに挿入される異種ＤＮＡが天然の供給源からの精製が困難な治療的有用蛋白質のコード配列から選ばれることを特徴とする請求の範囲２に記載のベクタープラスミド。
８．発現カセットに挿入される異積ＤＮＡがエリトロポイエチン又はエリトロポイエチン活性を有する蛋白質のコード配列であることを特徴とする請求の範囲２に記載のベクタープラスミド。
９．発現カセットに挿入される異種ＤＮＡがインターロイキン−３又はインターロイキン−３活性を有する蛋白質のコード配列であることを特徴とする請求の範囲２に記載のベクタープラスミド。
１０．発現カセットに挿入される異種ＤＮＡがＧＭ−ＣＳＦのコード配列であることを特徴とする請求の範囲２に記載のベクタープラスミド。
１１．請求の範囲２に記載のベクターにより安定に形質転換され、異種蛋白質の多量の分泌に関してスクリーニングされた、ＥＢＶにより永久分裂能を与えられたヒトリンパ芽球細胞系。
１２．ベクタープラスミドにより形質転換される出発細胞系がＡＴＣＣ−ＣＣＬ１５６ＲＰＭＩ１７８８細胞系である、請求の範囲１に従って利用されるヒトリンパ芽球細胞系。
１３．ベクタープラスミドにより形質転換される出発細胞系が健康なドナーのＢリンパ球から誘導され、ＥＢＶにより永久分裂能を与えられた細胞系であることを特徴とする、請求の範囲１に従って利用されるヒトリンパ芽球細胞系。