JPH06508982A - 組み込みベクターを用いた非−腫瘍性ヒトリンパ芽球系における発現 - Google Patents

組み込みベクターを用いた非−腫瘍性ヒトリンパ芽球系における発現

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JPH06508982A JP3513935A JP51393591A JPH06508982A JP H06508982 A JPH06508982 A JP H06508982A JP 3513935 A JP3513935 A JP 3513935A JP 51393591 A JP51393591 A JP 51393591A JP H06508982 A JPH06508982 A JP H06508982A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 組み込みベクターを用いた非−腫瘍性ヒトリンパ芽球系における発現発明の分野 本発明は異種蛋白質、特に治療的に有用な蛋白質をそれらのコード配列の遺伝子 操作の後に工業的規模で生産するためのヒト細胞系の利用にさらに正確に言うと 、本発明はエプスタイン−バールウィルス(EBV)により試験管内で永久分裂 能を与えられ、腫瘍又は腫瘍原性の不在に関して選択されたヒトリンパ芽球細胞 系の利用に関する。該細胞による異種蛋白質の発現を確実にするために、蛋白質 コード配列は遺伝子操作された組み込み型のベクタープラスミドに挿入され、そ のベクタープラスミドはクローニング及び発現カセットの細胞染色体DNA中へ の組み込みに関する選択の後に、形質転換リンパ芽球細胞中における該蛋白質の 発現を促進するように設計された発現カセットを有する。
本発明は、形質転換リンパ芽球細胞による異種蛋白質の最適発現の促進を目的と する該ベクタープラスミドの設計及び構築も目的とする。
発明の背景 蛋白質が少量で存在する天然の供給源から、又は腫瘍あるいはウィルスで汚染さ れている可能性のある血漿などのおそらく危険な供給源から精製することが困難 な治療的有用蛋白質の生産のために、十分に標準化された条件下における全体的 安全を保証された試験管内細胞培養に関する研究開発に投資することは正当なも のである。
生物活性がその構造及び正しい成熟(グリコジル化、シアリル化・・・・・)に 依存する巨大分子の発現はいずれの種類の細胞においても不可能であり、特に工 業的規模の発酵で成育するのが容易な微生物において不可能である。対照的に真 核細胞においては成熟過程が有効であるが、はとんどの非腫瘍性細胞は単層とし てのみ成長し、か(して培養びんに付着するので細胞培養それだけでは工業的規 模で問題が解決されない。
生物反応器における培養のためのマイクロキャリヤーの使用から有意な改良が得 られたが、いくつかの種類の細胞はこれらの担体に適応せず、さらにこの培養法 は蛋白質が培地中に排泄されない場合に適していない。
他方、ベロ(Vero)細胞系のようにこの種の培養に非常に適したい(つかの 種類の細胞は遺伝子操作により形質転換するのが困難である。
新規細胞系及び該細胞の遺伝子操作を可能にする適したベクターに導く研究はま だ試みる価値がある。
かくして出願人等は、モノクローナル抗体の生産にすでに用いられた細胞系に類 似のヒトリンパ芽球細胞系の利用を計画したが、そのような利用にはこれらの細 胞に特に適合させた適したクローニング及び発現ベクターの設計が含まれる。
Nama I vaとして既知のヒトリンパ芽球系はすでに異種蛋白質の生産に 用いられている。この細胞系は懸濁液中で成長し、培地に異種蛋白質を分泌し、 培地から異種蛋白質を生物学的活性形態で回収することができる(Yanagi  et at、Gene 1989.76.19及びDNA 1989.8,4 19)が、この細胞系はバーキットリンパ腫(Burk i t t 1 ym phoma)由来であり、腫瘍原性が高い。
発明の詳細な説明 非−腫瘍性及び非−腫瘍原性であるヒトリンパ芽球細胞の利用が本発明の1つの 目的である。
この種の細胞はすでに既知であり、EBV(エプスタイン−バールウィルス)を 用いた形質転換により健康なドナーからの血液Bリンパ球に永久分裂能を与え、 EBVの核抗原(nucleic antigen)EBNA−1を合成しない 細胞系を選択することができる(Thodaet at、Cancer Res 、38.1978.3560)。
このような細胞系は培養中で無限に成長するが腫瘍性でなく、それは寒天培地に おけるコロニー形成能がないこと、及びヌードマウスにおける腫瘍原性がないこ とにより確認される(Gurtsevi tch etal、Int、J、Ca ncer 47,87.1988.Turszz、Medecine/5cie nces 6,5upp1.42゜1989)。
出願人等はすでにこの種の細胞をモノクローナル抗体の生産に用いている。分泌 された蛋白質の精製過程を容易にするために蛋白質含有率の低い適した培地を設 計した(フランス特許第2 600 076号明細書)。
この細胞種はすでに異種蛋白質の発現のモデルとして用いられており、そのコー ド配列は自律性レプリコン中に挿入され、それは細胞系に永久分裂能を与えるた めに用いられたEBVのEBMA−1蛋白質の制御下にある複製のEBV起源を 有するのでエピソームとして細胞中に残る(Kioussis et al、E MBOJ、6,1987,355;Young et al、Gene 62, 1988.171:Jalanko et al、Gene 78,1989. 287)。
それにもかかわらずこのレプリコンのエピソーム状態はその細胞コピー−数を保 証せず、従って特に非常に多数回の細胞増殖サイクルを含む工業規模で時間の関 数としての異種蛋白質生産の能力が保証されない。
従ってヒトリンパ芽球細胞における異種蛋白質の発現に必要なすべての要素、な らびに宿主細胞の染色体DNA中への構築物全体の組み込みを促進するDNA配 列を有するベクターを遺伝子操作により設計するのが、本発明の他の態様である 。
従って1つの態様において本発明は、EBVを用いて試験管内で永久分裂能を与 えられ、腫瘍性又は腫瘍原性がないことに関して選択されたヒトリンパ芽球細胞 系の利用を目的とし、該細胞は無作為に選ばれた健康なドナーのBリンパ球から 、又はそのような細胞系の中から選ばれ、十分に特性化され、ATCCに受け入 れ番号CCL 156 RPM11788として寄託された細胞から誘導される 。
本発明に従う利用は、遺伝子操作されたベクタープラスミド中に挿入されるよう に設計されたDNAのフラグメントによりコードされる異種蛋白質の工業的規模 の生産に適しており、ベクタープラスミドは組み込み型であり、発現カセットが リンパ芽球細胞の染色体DNA中に組み込まれた後に異種蛋白質の発現を可能に するすべての要素を含む発現カセットを有する。
別の側面において本発明は、異種蛋白質の生産のためのリンパ芽球細胞の利用に 適したベクタープラスミドの設計及び操作を目的とする。該プラスミドは、E、 コリ(E、coli)などの宿主におけるその増幅に必要な、出発pMLPIQ プラスミドに由来するバクテリアDNA要素(Ballav et al、 H epadna Viruses、 1987.481 Ed、Alan R,L i5s)の他に、以下を含む。
−ヒトリンパ芽球細胞中で発現されるべきいずれの異種DNAの挿入も可能にす る発現カセットを構成する要素ニーメツセンジャーRNA翻訳の最適化を目的と するVA I及びVAIIRNAをコードする、アデノウィルス 5由来のDN A配列(Mathews、Ce1l 6,223.1975;5oderlan det al、Ce1l 7,585.1976;5chneider−真核細 胞における選択マーカーとして有効であるように操作された遺伝子二単純ヘルペ ス1 (HSVI) TK遺伝子プロモーター及び成熟シグナルの制御下で挿入 されたキサンチン−グアニン−ホスホリボシル−トランスフェラーゼ(XGPR T)をコードするE、コリDNAを選ぶことができ(Mulligan Ber g、Proc、Natl、Acak、Sci、USA 98,2072.198 1);メトトレキセートの存在下の遺伝子増幅を可能にするマウスジヒドロホレ ートレダクターゼcDNA (DHFR)を用いることもでき(Aft et  al。
J、Biol、Chem、253.1357.1978);ベクタープラスミド の異なる位置に挿入された両方の選択遺伝子を用いることもできるニ ーリンパ芽球細胞の染色体DNAにおけるプラスミドDNAの組み込みを促進す る性質に関して選択されたDNAセグメント。これらの要素は、哺乳類細胞のゲ ノムへの組み込み過程の間に異種DNAの縦列重複(tandem multi merization)を促進することが知られているマウスミトコンドリアD NAセグメントから選ばれるのが好ましい(Lutfalla et al、s omatic cell and Mo1.Genetics、11,223. 1985)。
発現カセットは選ばれた細胞中で機能する転写単位を形成する一連の要素を含み 、さらに正確に言うとそれはニー異種DNAが挿入される位置の上流に、ヒトア デノウィルスから誘導され、アクチベーター配列及びプロモーターならびにリー ダー配列を含む一組の調節要素; −及びこの位置の下流に、ウィルスSV40から誘導されたポリアデニル化シグ ナルを含む。
ヒトアデノウィルスから誘導される要素は好ましくはニープロモーターの上流の 転写アクチベーター配列、好ましくはアデノウィルス5のEIAアクチベーター 配列の制御下におかれたアデノウィルス5プロモーター(Lavery et  al、J、Virol、61゜14666.1987)、 一メツセンジャーRNAのより有効な翻訳を確実にするアデノウィルス2の三部 分リーダー配列のcDNAの1つのコピーとカップリングしたアデノウィルス2 の後期主要プロモーター(MLP)を含む。
これらの種々の独立した要素はBerkner (Biotechniques  6.616.1988)に記載されている。
選択はこれらの要素に限られず、アデノウィルスから誘導された他の要素、例え ばアデノウィルス5の後期主要プロモーター及びBKV (Grinnell  et al、Mol Ce11.Biol、6.3596−3605.1986 )又はSV40 (Zenke e t a 1゜EMBOJ、5.387−3 97.1986)のエンハンサ−1又はさらに正確に言うとそれらの縦列会合物 (tandem associatfon)(Berg et al、、Nuc l、Acfd、Res。
16.1635.1988)なども用いることができる。
異種DNA配列の組み込みのための発現カセットの中心領域は、組み込み過程を 容易にするために希少制限部位(rare restriction 5ite s)を備えるように設計され、該希少制限部位はNot I、Bst E II 、Bgl II、MluIである。
さらに特定すると本発明は、天然の供給源からの精製が困難な治療的に有用な蛋 白質を生産するために、前記のプラスミドと共に細胞を利用することを目的とす る。従って1つの態様において本発明は、異種蛋白質をコードするDNA配列の 前記の発現カセットへの挿入を目的とする。
その後ベクタープラスミドをエレクトロボレーシコンにより細胞中に導入する( Potter et al、Proc、Natl、Acad。
Sci、USA 81,7161.1984)。
記載されている蛋白質生産の技術的可能性を示す最初のモデルとして、ヒトエリ トロボイエチンDNAを用いた。後文ではエリトロポイエチンを“Epo”又は “RHEpo” (組み替えヒトEpoの場合)と呼ぶ。エリトロポイエチン活 性を有する類似の蛋白質をコードするDNAを用いることもできる。
天然のEpoは腎臓で合成され、非常に少量で血漿中を循環する。それは赤血球 の成熟過程で主要な役割を果す。
それは166のアミノ酸及び40−50%の炭水化物を含み、それがこの合成に 適した宿主細胞の選択を制限する。無形成(aplasic)の患者の尿(Mi kake et al、J、Bio、Chem、252 5558.1977) 、及び腎臓腫瘍(Sherwood e tal、EndocrinologY  99,504.1976)からのEpoの精製が記載されているが、それを工 業的規模に拡大することはできない。
種々の細胞の型(COS、CHO,BHK、NIH3T3)における組み替えヒ トEpoの生産も公開されているが、これらの細胞の欠点は前に議論した。
第2のモデルはインターロイキン−3(IL−3)のコード配列を用いて調べた 。
!L−3は造血幹細胞の増殖及び分化を促進し、赤血球、巨核球、顆粒マクロフ ァージ(granulo−macrophage)、好酸球及び好塩基球を生ず る2O−26kDaの糖蛋白質であり、そのヒトCDNAがYang et a l、(Cell 47.3−10.1986)によりクローニングされた。マウ スの場合、IL−3は多分化能幹細胞CFU−5の自己−再生及び分化にIL− 1と相乗的に含まれる。
さらにIL−3は、細胞系特異的サイトカインと相乗的に成熟細胞(例えばマク ロファージ、肥満細胞、好中球及び好塩基球多核細胞)の成長及び活性を促進す る。造血幹細胞の刺激にIL−3が含まれることは、骨髄無形成の処置における 治療的用途を与える(Shrader、Ann、Rev、Immunol、4. 205−230,1986;Mtzel、FASEB J、3,2379,19 89:Tigaud etal、、Medecine/5cience 7.4 44.1991)。
IL−3はGM−C3Fと相乗的に霊長類における造血を刺激することも知られ ている(Donahue et al、、5cience 241.1820. 1988)。
第3のモデルはCM−C3F (顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子)の コード配列を用いて調べた。GM−C3Fもマルチ−蛋白質(mul t 1− protein)であり、すなわちIL−3と同様に種々の造血細胞系(1m粒 単球(granulo monocytes)、赤血球及び混合コロニーの系) の成長及び分化、ならびに成熟細胞(マクロファージ)の活性を促進する成長因 子である。
ヒトのGM−C3Fの遺伝子は種々の研究グループによりクローニングされ(W ong et al、5cience 228,810.1985;Lee e t al、Proc、Natl、Acad;Sci。
USA 82.4360.1985;Cantrell et al。
Proc、Natl Acad:Sci USA 82.6250.1985; Miyatake et al、EMBOJ、4.2561゜1985L現在こ の分子は抗−腫瘍化学療法によって起こる骨髄無形成、ウィルス(EBV、Hr V)性白血球減少及び細胞減少(cyt。
penia)の処置に関する人間の臨床研究にて評価されている(C1ark  et Kamen、5cience 236.1229.1987;Groop man et al、N、Engl、J、Med、321.1449,1989 ;Applebaum et al、Sem。
Hematol、26.7.1989;Solal−C61igny。
medecine/5cience 4,231,1991;Tigaud e t al、、medecine/5cience 7,444゜1991)。
他の側面において本発明は、所望の異種蛋白質の高収率分泌に関して多数の形質 転換されたクローンをスクリーニングすることにより選ばれた、前記のベクター プラスミドの安定な組み込みの後の形質転換細胞系も目的とする。
収穫及び精製法は各蛋白質の特性に従って決定される。
プラスミドpMLP10から誘導される。種々のDNAセグメントに関して以下 の略字を用いる: E:Ad5のEIA遺伝子のアクチベーター配列MLP:Ad2の後期主要プロ モーターL:Ad2の三部分リーダー配列のc DNACAT:クロラムフェニ コールアセチルトランスフェラーゼをコードするバクテリア遺伝子 Ll:pUC18からのポリリンカー ム2:合成オリゴヌクレオチド P:異種蛋白質のコード配列 pA:5V40からのポリアデニル化シグナルXGPRT:キサンチン−グアニ ン−ホスホリボシルトランスフェラーゼをコードするバクテリア遺伝子 VA:VA RNAをコードするAd5遺伝子m1to:マウスミトコンドリア DNAセグメントDHFRニジヒドロホレートレダクターゼをコードするマウス cDNA履lは組み込み型発現ベクターpTS39の構造を示す。
m1to−DNA:マウスミトコンドリアDNAセグメント。
第2の選択マーカー(DHFR)はP配列の上流のビシストロン位置(bici stronic position)に挿入される。以下の実施例は本発明を制 限することな(例示することを目的とする。
実施例1:組み込みベクターの構築 図2に示される組み込みベクターpTS39は、図1に示す通り以下の段階によ り形成したニ ー出発プラスミドはpMLPlo(Ballay et al、Hepadna  Viruses、481.1987.Ed、Alan R。
Li5s)である。
−pMLPcATは、5V40(P、G11ardi et al、Necle ic Ac1d Re5earch 20.7877−7887.1984)か らのCAT遺伝子及び成熟シグナルを有するpHp34−CATからのHind  III−Bam HIフラグメントをpMLPIOのHind III及びB am H1部位の間でpMLPlo中に挿入することにより得られる。
−プラスミドpTS1はpUc18からのポリリンカーEcoRI−Hindl IIをpMLPCATのNru1部位に挿入することにより得られる。
一プラスミドpTS2は、以下の合成ヌクレオチド(図中でL2と呼ばれている )ニ ーAGCTTGCGGCCGCGGTTACCAGATCTACGCGTGTT −3’ −ACGCCGGCGCCAATGGTCTAGATGCGCACAA−5′ をp’rsl中に挿入することにより得られ、p’rs1のHindIII−H paI部位の間に希少制限部位であるNotI、5acII、BstEI I、 Bgl I I、Mlulを含み、その中に所望の異種蛋白質(P)のコード配 列が挿入される。
−プラスミドpTS5は、pAG60VAのHtndIII7ラグメント(Ad 5(7)VAI及びVAII遺伝子を有する)をpTS2のXba■部位に挿入 することにより得られる。
−プラスミドpTs17は、pAGT40からのPvuII7ラグメント(H8 VI TK遺伝子のプロモーター及び成熟シグナルの制御下でXGPRT遺伝子 を有する)をpTS5のSma 1部位に挿入することにより得られる。
一プラスミドpTS37はマウスミトコンドリアDNA配列を有するpδ1から のEcoRI−Pvulフラグメントをp”rs17のSc1部位に挿入するこ とにより得られる。
−プラスミドpTS39は、pTG1086からのBamHl−BglIIフラ グメント(マウスDHFRcDNA、すなわちXGPRTの代わりの代替選択マ ーカーのコード配列を有する)を、L2オリゴヌクレオチド中に挿入されるPコ ード配列の前のビシストロンとしてそれが位置するように、pTS37のBgl 11部位に挿入することにより得られる。
一プラスミドpTS39は、異種蛋白質コード配列がL2オリゴヌクレオチド中 に挿入されると(かくしてL2−Pと呼ばれる) 、pTS39−Pと呼ばれる 。
ゲノムDNAライブラリを、遺伝子の配列(Lin et al、Proe、N atl、Acad、Sci ;USA 82,7580.1985により公開) から推定された3Q−marオリゴヌクレオチド:5’ −CGTGATATT CTCGGCCTCCTTGCCTCCAA−3゛ を用いてスクリーニングし た。このプローブはmRNAの逆に相補的であり、Epoの配列の位置129− 159を同定する(塩水n。
1が翻訳の開始に対応する)。
EMBL3をクローニングベクターとして用いた。12−20kbのヒトDNA フラグメントをこのベクターに挿入する。107のクローンを10個の皿(直径 15cm)上に接種した。これらの皿の3系列のプロットを以下の条件で洗浄し 、オリゴヌクレオチドプローブとハイブリッド形成させ、T4ポリヌクレオチド キナーゼで10’cpm/μgの比活性まで標識したニ ー予備−ハイブリッド形成:3xSSC,2xデンハート培地、0.00596 テトラナトリウムジホスフエート(Napp i) 、100μg/mlのサケ 精子、52℃で4時間。
−ハイブリッド形成: 5xSSC12Xデンハート培地、0,05%Napp i、20μg/ml t、RNA、Epoプローブ(フィルター当たり10”c pm/mI)の存在下の55℃にて終夜。
−洗浄:−2xSSC,室温にて 一2xSSC,0,005%Nappi152℃にて、20分間で3回。
−さらに行う洗浄: 1xSSC,0,05%Nappi、52℃にて20分間 、及び/又はO,’1xSSC,0,05%Nappi、52℃にて20分間。
4回の連続的スクリーニングを行い、プローブと強くノ1イブ百ルソド形成する 3個の純粋なりローンを特性化した。
これらの3個のファージのDNAを増幅し、分析した。完全なEp。
遺伝子の存在を確認するため、3個のクローンの制限地図を確立し、Epo遺伝 子の3′及び5′末端の存在を両末端とハイブリツド形成するオリゴヌクレオチ ドプローブを用いて調べた。3個のクローン中の2個が完全なEpo遺伝子を有 することが示された。
完全なEpo遺伝子を有する制限フラグメントをpUCなどの増幅ベクター中に サブクローニングした。2種のそのようなフラグメントをサブクローニングした +5.4kbのBamHI−HindI I Iフラグメント及び4kbのBg l I I−Bgl I Iフラグメント。
2.2 ヒトEpo cDNAの単離 構成的にEpoを発現する腎臓腫瘍から全RNAを単離した。これらの全RNA からオリゴ−dTカラムを介してポリA RNA留分を単離し、PCR法を用い てクローニングした。
Epo cDNAの回りの2種のプローブを選んだニーINTS10 : 5’  −CTGGAGTGTCCATGGGACAG−3゛ この20−marオリゴヌクレオチドはATGのアデノシン1(Ep。
mRNAの翻訳の開始)からの位置694にある。このオリゴヌクレオチドはE po mRNAの相補的配列の逆と一致し、cDNAの3′末端に接する。
−INTS9 : 5’ −AGGCGGGAGATGGGGTGC−3’この 20−merオリゴヌクレオチドはmRNAと同一の配向を有し、Epo cD NAの5゛末端と接する(出発コドンのA1からの位置10にて)。
INTSIOプローブはEpo mRNA鋳型の逆転写に有用である。
転写の後、mRNAは65℃にてソーダの存在下で1時間分解する。その後1本 鎖cDNAを、cDNAの回りのINTSlo及びINTS9の2個のプローブ を用いたPCR法により増幅する。その結果、723bpのDNAフラグメント が増幅され、電気泳動により単離され、pU・ C−型増幅ベクター中にクロー ニングされ、配列決定される。
2.3Epoコ一ド配列のpTS39ベクターへの挿入Epoコード配列(ゲノ ム又はcDNA)をプラスミドpTs39のし2オリゴヌクレオチド中に、Bs  tEI I−Bgl I IフラグメントとしてHindlII及びBgll I部位に挿入した。
得られた構築物をpTS39−Epoと呼ぶ。
2.4 細胞トランスフェクション及び形質転換細胞の選択エレクトロポレーシ ョンの装置(ATEIM(商標)−Biobl。
ck−France)を用いてトランスフェクションを行った。
トランスフェクションに先立ち、2種類の水溶液を調製したニー融合培地:イノ シトール 250mM、KH2PO41mM、酢酸Mg O,5mM、酢酸Ca  O,1mM、pH7,4゜−融合一後培地:NaCl 132mM、KCI  8mMSKHzP041mM、酢酸Mg O,1mM、酢酸Ca 0.1mM、 pH7,4゜細胞を2日間成育し、その後洗浄し、融合培地中で4 10’/m lに調節した。細胞懸濁液を、5μg DNA/10’細胞の存在下で0℃にて 10分間インキュベートした。懸濁液の試料を装置の電極の間に置き、以下の条 件下でエレクトロポレーションを行った:1500V/cm2の電場を用い、1 秒間隔で100μsの4回の矩形インパルス。
電気衝撃の直後に懸濁液を1/20に希釈し、37℃で20分間インキュベート した。細胞の生存率を20−60%と評価した。その後細胞を0゜5 10’/ mlの濃度で培養した。
トランスフェクションの48時間後、Epo定量(dosage)のために上澄 み液のアリコートを採取した。細胞をさらに選択遺伝子XGPRTに対応する選 択培地(ISCOVE (商標)、10%透析コウジ血清、マイコフェノール酸 (mycophenolic acfd)1μg/m+、キサンチン 250μ g/ml)中で培養した。
2.5 形質転換細胞を用いたHR−Epoの生産*発現ベクターpTS39− Epoを用いて形質転換されたATCC−CL156 約6106のCCL156細胞を30μgのプラスミドDNAを用いたエレクト ロポレーションによりトランスフェクションし、48時間後にキサンチン及びマ イコフェノール酸を含む選択培地の存在下で培養した。生存耐性細胞を、支持細 胞(放射線照射されたヒトリンパ球)の存在下の限界希釈によりクローニングし た。得られた種々のクローンの中で、1個のクローン、n’156 0.5AF 8が72時間で培地1ml当たり約100−150単位のEpoを分泌する。そ れを選択圧(Selective pressure)の存在下及び不在下で追 跡した。
このクローンは選択圧の存在下で48継代、すなわち約7カ月安定であることが 見いだされた。
クローン156 0.5 AF8から抽出された全DNAのサザンプロット分析 は、ベクターpTS39−EpOが細胞ゲノム中に縦列に組み込まれ、選択圧の 存在下で培養しても不在下で培養しても15−20のコピーが各細胞中に存在す ることを示した。
回転培養の場合、クローン156 0.5 AF8は、蛋白質−欠乏培地CK4 又はCK4N (基本培地:ISCOVE−Ham F12の混合物(1:1) :CK4:ヒトアルブミン 5Omg/ml;ヒトトランスフェリン、FeCl 3の添加により30%飽和、1mg/ml;ウシインスリン 3mg/ml:リ ルン酸 1mg/ml;プトレシン 10μM;エタノールアミン 20μMを 補足: CK4N:同組成にリボヌクレオチドを加える:アデノシン 100m g/ml、シチジン 100mg/mI、グアノシン 100mg/ml、ウリ ジン 100mg/ml)中で3日後に8O−400U Epo/mlを分泌す る。培地を3日毎に新しくするとこの分泌の収率は3倍にすることができる。
*EBVを用いて試験管内で永久分裂能を与えられた細胞(系INTS−F5) CCL156を用いた前記の実験と同一の実験を、以前にモノクローナル抗体の 生産に用いられたF5細胞系を用いて再現した(Goosens et al、 J、Immunol、Methods 1987゜101,193)。それらを ベクターpTs39−Epoを用いてトランスフェクションした。トランスフェ クションの後の種々の時間にEpOの定量を行い、陽性であることが見いだされ た:選択の21日後に29U Epo/ml/10’細胞が得られた。
2.5 RH−Epoの生物学的及び免疫学的活性の測定胎児肝臓赤芽球の培養 5tephenson et al(Endocrinology88.151 9.1971)に記載の通りに26時間培養されたマウス胎児肝臓赤芽球(妊娠 13日の雌から集めた)中へのs@p’eの取り込みによりEpo活性を試験管 内で測定した。
細胞を機械的に分離し、7%のウシ胎児血清、アルブミン 85μM及びヒトト ランスフェリン 0. 4μMを含むRPM11640培地(Tambouri n et al、Biomedicine 19,112.1983;Gold wasser et at、Endocrinology 97,315.19 75)1ml当たり1.610’細胞の濃度で再懸濁した ある条件下では、天然源又は合成から精製した天然のリン脂質(大豆、卵レシチ ン)(3210−3’M)及び後に窒素流下で蒸発させるクロロホルムに溶解し たコレステロール(1,610−”M)を含む血清−非含有培地を用いた。脂質 は冷却水浴中の超音波処理によりアルブミン溶液(RPMI中1mg/ml)に 溶解した(Boffa et coll、Exp、Hematol、10,67 5.1982)。
細胞懸濁液を200μmの試料としてアリコートに分け、培養ミクロプレート  Nunclon (商標)のウェルに分配した。37℃の0゜7%CO2下で2 1時間インキュベートした後 5eFe )ランスフェリンをウェルに加え、ミ クロプレートを振り、さらに5時間インキュベートした。
各試料を3又は4の異なる蛋白質濃度で測定し、各活性を4回測定した。メチル アセトン抽出ヘム上、又は細胞中への59Feの取り込みの比率を試料の量の対 数の関数として測定した。結果をミリ単位/ml又はmg蛋白質として表す。
標準は力価が100OOOU/mgの組み替えヒトEpoである。その比活性は ヒトEpoの第2国際標準との比較により決定する(Annable et a l、Bull、Wld、Hlth、Org、47゜99.1972)。
骨髄幹細胞又は末梢血細胞の培養 BFUe及びCFUeの細胞成熟へのRH−Epoの影響を、メチルセルロース −IMDM血清−非含有培地(Cormier e al。
Ce1l Differentiation、17,261.1985)上の赤 血球の細胞前駆体の培養において決定した。RH−Epoは尿のEpoと同様に 、マウス骨髄由来又はヒト末梢血由来のBFUeの分化及び成熟を促“進した。
CFUe発生に対するRH−Epoの用量の関連性を天然のEpoのものと比較 した。
放射性免疫定量(radio−immuno−dosage)以下の2つの方法 に従って細胞上澄み液に関し、RH−Epoの放射性免疫定量を行った。
1一液相における二重抗体沈澱による:単−特異性抗一ヒト尿Epoウサギ免疫 血清(Terry Fox Lab、Vancouver)をヒトEpo標準又 は試験試料と共に4℃で16時間インキュベートした。
その後2000cpmの”’ I −RH−E p o (Amer s h  am)を加え、混合物を4℃で2時間インキュベートした。20−30%の吸着 放射性を与えるように免疫血清希釈を選んだ。免疫血清の最終的希釈は10−’ −10−’である。抗−ウサギFcヒツジ免疫グロブリンの存在下の20℃で2 時間インキュベートした後、ペレット中で放射性を測定した。
2−TACHISORB(商標)上の固相における二重抗体沈澱による:反応物 を、96ウエルの微量滴定プレートDYNATECH(商標)上に220μlの 最終体積で1度に分配した。室温における水平回転震盪下で2時間インキュベー トした後、5KATRON (商標)装置上のガラス中空繊維フィルター上に収 穫した。反応物は100μlのEp。
(標準又は試験試料)、10μIの抗−Epo免疫血清、10μlの1251− RH−Epo及び100μlのTACHSORB (商標)を含む。
試料がガラス中空繊維中に吸着されたら、放射性の測定のためにそれをポリスチ レン管に移した。
本方法の感度は1−1−1O0以内である。
形質転換された細胞の上澄み液の場合に測定される活性は800 U/m1に達 するがアンチセンスベクターを用いて形質転換された細胞の上澄み液は活性を示 さない。試験管内生物活性と放射性免疫定量の間に高い関連性が観察される。
2.7.RH−Epoの生体内生物活性の検出と測定形質転換されたリンパ芽球 細胞の培養上澄み液から集めたEp、を、内因性Epo合成を阻害するために人 工的にポリグロブリン性(polyglobulic)とされたマウス中に注射 した後、その生体内活性を調べた(Jacobson、et al Proc、 Soc、Exp。
Btol、Med、94,243.1957)。リンパ芽球細胞からのEpoは CHO細胞内で生産されたRH−Epoの場合と比較して高い生物活性を示す( Kirin−Amgen−欧州特許第0 148 605号明細書)。
結果はヒト尿Epoの国際標準と比較して行われた試験管内の生物学的定量とも 一致する。
3、 a 第1法 蛋白質欠乏培地(CK4)中の細胞培養の上澄み液をPMIO膜(AMICON (商標))上の限外濾過、又はPLGC膜を用いたMINITAN (商標)上 の接線濾過(tangential filtration)により濃縮し、そ の後グルコース 12.5mM、ガラクトース 12.5mM5PEG6000  0.1mg/m+、β−メルカプトエタノール 10−’Mの溶液で、濾液の 抵抗率が5000オームより高くなるまで洗浄した。
濃厚液を凍結乾燥し、酢酸カルシウム 10mM、NaC1100mM、フェノ ール 5.6 10−’M、グルコース 12.5mM、ガラクトース 12. 5mM、PEG6000 0.1mg/mlを含む緩衝液中のpH6,8にてU LTROGEL (商標)AcA44上のクロマトグラフィーにかけた。活性留 分を限外濾過により濃縮し、凍結乾環シタ。サラニ生成物を、酢酸塩 0.04 8mM、CaC1,3mM、グルコース 12.5mM、ガラクトース 12. 5mM、PEG−60000,1mg/ml、β−メルカプトエタノ−/I/  10−’Mを含む緩衝液中でDEAE−TSK 545カラム上のHPLCによ り精製し、NaClの不連続勾配により溶離した。約75%の活性が回収される 。生成物の透析及び濃縮の後、それをさらにNaCl 150mMを含むlQm Mのリン酸塩緩衝液中のpH7,2にてCOM−AFFIGEL−BLUE上の クロマトグラフィーにかけた。Epoは1.15MのNaCIを用いて溶離した 。Epoの比活性は100OOOU/mgより高い。
3、 b 第2法 限外濾過により濃縮した細胞培養培地を、酢酸塩 48mM5CaC1,3mM 、フェノール 5.4 10−’Mを含む緩衝液中のpH4゜5及び4℃にてD EAE−8EPHACEL (商標)上に注入した。吸着された活性を0.6M のNaClで溶離した。
溶離液を透析し、濃縮し、ULTROGEL (商標)AcA44上で濾過した 。活性留分をRIAにより検出し、還元剤及び安定剤としてのヘキソースの存在 下でDEAE−HPLCにかけた。低モル濃度のNaC1を含むpH5,5の緩 衝液で溶離したRH−EpoをさらにAMICON (商標)PMIO膜上で濃 縮し、PBS緩衝液中の4℃にてWGA−5EPHARO3E 6MBのカラム 上に注入した。
それを0.5MのN−アセチルグルコサミンで溶離した。生成物を4−30%の ポリアクリルアミド勾配を用いた5DS−PAGEにより分析し、34kDaの 成分が観察された。この成分をポリクローナル抗−Epo免疫グロブリン及びモ ノクローナル抗−RH−Epo抗体を用(またイムノブロッティングにより同定 した。42kDaにて移動する少量成分がいくつかの試料で観察された。この成 分は抗−Epoポリクローナル血清を用いたイムノブロッティングにより検出さ れなかった。この結果はラジオイムノ検出及びマウス胎児腎臓赤芽球に関する研 究により確認される。
場合によりCM−AFFIGELL BLUE(商標)又はHA−ULTROG EL (商標)上で、あるいは5D80.1%培地中のHPLCによりさらに精 製段階を行うことができる。ポリアクリルアミド−8DSゲル上で決定されたR H−Epoの見掛けの分子量は34kDaである。
その比活性は赤芽球培養及びRIAで測定して120OOOU/mgより高く、 回収効率は20−30%である。
3、c 第3法:RH−Epoの免疫精製(immunopurificati on) C−1免疫吸着剤の調製 細胞上澄み液からのRH−Epoを、前記第2法と同様にして精製した。RIA により、及び赤芽球培養へのその活性により決定したその比活性は130000 1Uであった。凍結乾燥したRH−Epoを0.05% SDSの存在下で再− 溶解し、Ba1b/cマウスの免疫化に用いた。
各マウスに以下の投薬量を用い、15日の間隔で腹腔内注射した:90.45及 び最後の注射の場合10又は35mg。
最後の注射の5日後に融合(fusion)を行った。30−90%の融合ウェ ルを調べた。抗体はその上澄み液中で12’ I −RH−E p 。
に結合する能力により検出した。放射性標識複合体をスタフィロコックス蛋白質 A上に共有結合したヒツジ抗体、抗−マウスIgGを用いて検出した。複合体を 集め、その放射性を測定した。
′ 10番目の融合から3個のハイブリドーマが陽性であることが見いだされ、 それをクローニングした。膵臓細胞が由来するマウスの血清は1/3000希釈 にて65%の免疫学的反応を与えた。IgGの種類の1個のモノクローナル抗− Epo抗体が得られ、EplO−141A26とされた。その固定容量は50− 60%である。この抗体を生産するクローンは多数回のサブクローニングの後も 安定なままであった。
腹水中の培養によりそれを増殖させ、それにより数ミリグラムの抗体の精製に十 分な量となった。抗体の精製は蛋白質G−SEPHARO8E上への吸着により 行い、腹水液はO,LMのリン酸塩を用いてpH7゜5にて緩衝し、吸着材料は pi(6,5で洗浄し、グリシン−HCl O。
1M緩衝液を用いてpH2,8にて溶離した。30mgのEplO−141A2 6精製抗体のバッチが得られ、シアノゲンブロミドで活性化された5EPHAR O3E 4B (8mlのゲル)上に結合した。得られたカラムは約5−6mg のRH−Epoを吸着することができる。
予備試験によりEpoがほとんど中性のpHで抗体に吸着することが示された。
その溶離を6.5.45.2.8.2.2の種々のpHで調べ、主にpH4,5 −2,8で溶離する。
免疫吸着剤はTHYMIRO3AL 0.02%の存在下のpH7゜5のリン酸 塩緩衝液中にて4℃で保存する。カラムは多数回のサイクルに再利用することが できる。
C−2Epo精製 精製は2段階で行う。
一第1段階: リンパ芽球細胞培養上澄み液を3−4mg/mlの蛋白質濃度まで限外濾過し、 透析し、酢酸を用いてpH4,5に、及び水を用いて1000オームに平衡化し た。
沈澱を遠心し、上澄み液を0.0025M CaC1!及び5.410−’M  フェノールを含む0.04M 酢酸塩緩衝液で平衡化したDEAE−8EPHA CEL (商標)カラム上に0.1(交換体の体積で表す、ml/注入された蛋 白質のmg)の比率で注入した。
緩衝液中のQ、5M NaClを加えることにより活性留分を溶離し、カラム上 に注入された蛋白質の合計量の15−20%を示した。溶離液をpH7に平衡化 し、抵抗率が80−100オームとなるまで透析した。
−第2段階 この段階は前記の免疫吸着剤上で行った。
第1段階DEAE−8EPHACELの溶離液をpH4,5の0.1Mのリン酸 塩緩衝液中、4℃及び6−7m1/時間の流量で免疫吸着剤カラム上に注入した 。
同緩衝液を用い、pH6,5にて洗浄を行った。さらにEpoは0゜1Mのグリ シン−HClを含む緩衝液を用い、pH2゜2、室温及び50m1/時間の流量 で溶離した。
溶離液をIM TRl5緩衝液を用い、pH7,5で平衡化した。
Epo活性の回収効率は出発材料中の活性Epoの50−60%である。
C−3−リンパ芽球細胞により生産された免疫精製RH−Epoの特性RH−E po試料の均一性を5DS−PAGEの後で濃度測定により評価した。Epoの 均一性は98%より高いことが見いだされ、その見掛けの分子量は34000ダ ルトンと決定された。
その電気泳動における移動度はCHO細胞で生産されたEpo及び市販の標準” ”r−Epo (Amersham)の移動度と同一である。
その等電点は3.5−4である。その比活性は尿Epoより高(、約20000 0U/mgt’ある。
IL−3の配列の逆に相補的な以下+5’ TAA GTG TGTTAT A AT TTCATCGAT CAT GTT3’の30−marのオリゴヌクレ オチドをプローブとして用い、ヒト白血球のゲノムDNAライブラリ及びヒト胎 児腎臓のcDNAライブラリのスクリーニングを行った。合成プローブはIL− 3コ一ド配列の開始−ATGからn’110下流の塩基で始まる配列に対応する 。
数個のクローンを単離し、制限分析により遺伝子の存在を確認した。
遺伝子を含むことが示されたファージを5.4kbのAccIフラグメントとし てpUc18中にサブクローニングした。発現カセットに挿入する前にプロモー ター及び3゛非非翻訳列を除去した。以下:INTS16:ATGから−9の位 置に対応する5’ GATCCAAACATGAGCCGCCT3’ INTS17:停止コドンから52下流の位置に対応する5’ ATGTCCC GAGGCGCTGTGGT3’の2個の合成オリゴヌクレオチドを用い、以前 に特性化され、pUc18中にクローニングされたゲノム配列を鋳型として用い てコード配列をPCHにより増幅した。
2140bpフラグメントの増幅生成物をpUc18のSmar部位にサブクロ ーニングし、部分的に配列決定してIL−3遺伝子の組み込みを確認した(Ya ng et C1ark、於“Developmental Control  of globin gene expression″A、R,LISS P 、3−11 1987に従い)。
得られた十分に制御されたコード配列を、実施例1で記載したベクタープラスミ ドの発現カセットに挿入した。強い陽性の発現を与える細胞クローンを選択し、 増殖させた。
細胞培養培地中に生物活性インロイキン−3が分泌されるのが見いだされた。
実施例5.リンパ芽球細胞におけるヒトGM−C3Fの生産のための組み込みベ クタープラスミドの利用 GM−CSF配列の逆に相補的な以下 5’ TTG CTCTAA GCA CTT GAG CAG GAA GC T CTG3’ の30−merオリゴヌクレオチドをプローブとして用い、ヒト白血球のゲノム DNAライブラリ及びヒト胎児腎臓のcDNAライブラリをスクリーニングした 。合成プローブはCM−CSFコード配列の開始ATGから00下流の塩基に対 応する。
数個のクローンを選択し、制限分析により遺伝子の存在を確認した。
遺伝子を含むことが示されたファージを3.2kbのHindlII−EcoR IフラグメントとしてpUC18中にサブクローニングした。
発現カセットに挿入する前に、プロモーター及び3′非非翻訳列を除去した。以 下: INTS19:ATGから−31の位置に対応する5° CACAGAGAGA AAGGCTAAAG3゜ INTS18・停止コドンから177下流の位置に対応する5’ ATTCCC ATTCTTCTGCCATG3’の2個の合成オリゴヌクレオチドを用い、以 前に特性化され、pUc18中にクローニングされたゲノム配列を鋳型として用 いてコード配列をPCRにより増幅した。
2240bpフラグメントの増幅生成物をpUc18のSma I部位にサブク ローニングし、部分的に配列決定してGM−CSF遺伝子の組み込みを確認した (Miyatake et al、EMBOJ、4゜2561.1985に従い )。
得られた十分に制御されたコード配列を、実施例1で記載したベクタープラスミ ドの発現カセットに挿入した。強い陽性の発現を与える細胞クローンを選択し、 増殖させた。
細胞培養培地中に生物活性GM−C3Fが分泌されるのが見いだされた。
′ E 門しplL123 t pMLρ 10−+ ’ ElfflLl)lL1231 CAT OA t p門LP CAT+ + / E r1LPL1232 A XGt)QT VA / GITSI7↓ ÷ 国際調査報告 フロントページの続き (51) Int、 C1,5識別記号 庁内整理番号//(C12P 211 02 C12R1:91) (72)発明者 カルトロン、ジャン−ビニールフランス国エフー75007パ リ・スクワールロビアク2 (72)発明者 クレチアン、スタニイフランス国エフ−75015パリ・リュ グラム(72)発明者 ランパン、パトリク フランス国エフー75015パリ・リュデアントルプルヌール54 I (72)発明者 ロへ、クロード フランス国エフー94360プリスユールマルヌ・アベニュージョルジュクレマ ンソー39(72)発明者 プリジエン、シルビイフランス国エフー91440 ピュールスユールイベット・リュデュロワヨーム9ビス (72)発明者 サルモン、シャルル フランス国エフ−75012パリ・リュファブルデグランチーヌ12

Claims (13)

    【特許請求の範囲】
  1. 1.発現カセットが細胞染色体DNA内に組み込まれた後、リンパ芽球細胞中で 異種蛋白質の発現を可能にするすべての要素を含む発現カセットを有する遺伝子 操作された組み込み型のベクタープラスミド中に挿入されたDNAフラグメント によりコードされる異種蛋白質の工業的規模の生産のための、エプスタイン−バ ールウィルス(EBV)により試験管内で永久分裂能を与えられ、腫瘍又は腫瘍 原性の不在に関して選択されたヒトリンパ芽球細胞系の利用。
  2. 2.その増幅に必要なバクテリアDNA要素と共に以下のDNAフラグメント ーヒトリンパ芽球細胞中で発現されるべき異種DNAの挿入を可能にする発現カ セットを構成するDNA要素;一メッセンジャーRNA翻訳の最適化を目的とす るVAI及びVAIIRNAをコードする、アデノウイルス5由来のDNA配列 −真核細胞における選択マーカーとして有効であるように操作された遺伝子 −細胞染色体DNA中へのプラスミドDNAの組み込みを促進する性質に関して 選択されたDNAセグメント を含む、異種蛋白質の生産のための請求の範囲1に記載のリンパ芽球細胞の利用 のために設計されたベクタープラスミド。
  3. 3.ベクター中に組み込まれる発現カセットを形成するDNA要素がa)アデノ ウイルス由来の転写アクチベーター配列、b)アデノウイルス由来のプロモータ ー及びリーダー配列、c)異種蛋白質のDNAコード配列の組み込みを目的とし た制限部位を含む合成オリゴヌクレオチド、 d)SV40ウィルス由来のポリアデニル化シグナルを含むことを特徴とする請 求の範囲2に記載のベクタープラスミド。
  4. 4.発現カセットが: −要素a)としてヒトアデノウイルス5のEIA遺伝子のアクチベータ−配列、 −要素b)としてアデノウイルス2の三部分リーダー配列とカップリングした同 一のアデノウイルス2の後期主要プロモーター、−要素c)として異種蛋白質の 組み込みを容易にするために希少制限部位、例えばNotI、BstEII、B gIII、MLuIを備えるように設計された配列 を含むことを特徴とする請求の範囲2に記載のベクタープラスミド。
  5. 5.選択マーカーとして有効なように操作された遺伝子が:−単純ヘルペスウィ ルス1Tk遺伝子プロモーター及び成熟シグナルの制御下で挿入されたキサンチ ン−グアニン−ホスホリルトランスフェラーゼ(XGPRT)をコードするE. コリDNA、−マウスジヒドロホレートセダクターゼ(DHFR)cDNA、− 又はベクタープラスミド中の異なる位置に挿入された両遺伝子の組み合わせ から選ばれることを特徴とする請求の範囲2に記載のベクタープラスミド。
  6. 6.該プラスミドDNA組み込みを促進するその性質に関して選択されたDNA セグメントがマウスミトコンドリアDNAのフラグメントを含むことを特徴とす る請求の範囲2に記載のベクタープラスミド。
  7. 7.発現カセットに挿入される異種DNAが天然の供給源からの精製が困難な治 療的有用蛋白質のコード配列から選ばれることを特徴とする請求の範囲2に記載 のベクタープラスミド。
  8. 8.発現カセットに挿入される異積DNAがエリトロポイエチン又はエリトロポ イエチン活性を有する蛋白質のコード配列であることを特徴とする請求の範囲2 に記載のベクタープラスミド。
  9. 9.発現カセットに挿入される異種DNAがインターロイキン−3又はインター ロイキン−3活性を有する蛋白質のコード配列であることを特徴とする請求の範 囲2に記載のベクタープラスミド。
  10. 10.発現カセットに挿入される異種DNAがGM−CSFのコード配列である ことを特徴とする請求の範囲2に記載のベクタープラスミド。
  11. 11.請求の範囲2に記載のベクターにより安定に形質転換され、異種蛋白質の 多量の分泌に関してスクリーニングされた、EBVにより永久分裂能を与えられ たヒトリンパ芽球細胞系。
  12. 12.ベクタープラスミドにより形質転換される出発細胞系がATCC−CCL 156RPMI1788細胞系である、請求の範囲1に従って利用されるヒトリ ンパ芽球細胞系。
  13. 13.ベクタープラスミドにより形質転換される出発細胞系が健康なドナーのB リンパ球から誘導され、EBVにより永久分裂能を与えられた細胞系であること を特徴とする、請求の範囲1に従って利用されるヒトリンパ芽球細胞系。
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