CN100547069C - 病毒、病毒分离物和疫苗的生产 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了用于生产病毒颗粒，包括细胞和所产生的病毒颗粒的手段、方法和应用。本发明的一个方面使用被赋予了编码翻译后修饰蛋白质的核酸的细胞，从而与未受操作的细胞相比改变了由所述细胞产生的病毒的至少一种特性。
Description
发明领域
本发明涉及医药领域。本发明进一步涉及提供抵御流感感染的疫苗和涉及获得这些物质的方法和手段。
发明背景
流感病毒是流感的病原体，是自古代起就折磨人类的具有高度传染性的呼吸疾病。这种病毒在1933年被首次确认，但是据整个世纪的报道(Potter 1998)许多流行病几乎均可归咎于流感。在上个世纪就有三次主要的流感爆发实例。1918年的称作“西班牙流感”尤为严重。它导致全世界估计2-4千万人死亡，是历史上已知记载的最严重的人类疾病的爆发。1957年“亚洲流感”造成估计1百万人死亡，而1968年的“香港流感”使超过700,000的个体致命。尽管科学界很努力，但每年由流感病毒引起的感染继续在疾病、死亡以及经济后果方面索取沉重的代价。最近的工作有助于解释导致过去主要的全国流行病的一些流感菌株的不寻常致病力(Gibbs等，2001；Hatta等，2001)。然而，对于基本致病机理的理解仍然是不完全的，因此限制了该疾病的有效预防和治疗。
据估计每年单只美国就有包括所有年龄层的480万人患流感。这些流行病每年导致大约20,000人死亡另外约4百万人需要在医院治疗(CDC统计)。婴儿、儿童和老人尤其易受流感传染。然而，一种具有高致病性和传染能力的新病毒变体的出现对于所有个体来说仍是主要威胁。这被1997年的实例证明，当时在香港确定的病毒导致18个临床诊断病历中的三分之一死亡(Claas等，1998；Subbarao等，1998)。
禽类表现为流感病毒的主要贮藏所。特别的，流感A病毒的所有已知亚型(与引起人类流感最常见的B亚型一起)都已从野生以及驯养的禽类中分离出来。然而，鸟类流感A病毒通常是不直接从禽类传给人类的。在这方面，至今记载的唯一例外就是上述1997年的香港病毒。几种病毒蛋白被认为在赋予宿主特异性上起作用，但是最重要的因子是血凝素(HA)膜蛋白。
HA基因是最先被确定和测序的流感病毒的基因之一。它编码直接涉及附着和插入宿主细胞中的跨膜蛋白。HA通过结合存在于糖蛋白上的末端唾液酸-寡糖受体决定簇和存在于宿主细胞表面的神经节苷脂引发感染。天然唾液酸-糖蛋白和神经节苷脂的末端唾液酸残基是已知的结合的最小决定簇。然而，结合也依赖于连接到次末端半乳糖上的唾液酸的类型和唾液酸-糖缀合物的较远部分的结构。
人类流感病毒优先结合含有唾液酸α-2，6-半乳糖(SA α-2，6Gal)键的受体，而鸟类病毒使用SA α-2，3Gal键(Suzuki 1994中评述)。这种结合的特异性也决定了宿主中病毒的细胞趋向性。人类流感病毒感染(和复制)限于呼吸道，而鸟类流感病毒被发现主要是在排列于肠道的细胞中以及鸟类的肺中。通过使用唾液酸-半乳糖键特异性凝集素，显示出通过α-2，6键而不是SA α-2，3Gal连接在半乳糖上的唾液酸残基存在于人类气管的上皮细胞的表面(Baum和Paulson 1990)。此外，呼吸粘蛋白的SAα-2，3Gal部分的冗余促进HA的人类流感SA α-2，6Gal-特异表型的维持(Baum和Paulson 1990；Couceiro等，1993)。
在大多数实验室，初级分离物的繁殖仍然在含胚鸡卵的绒膜尿囊中进行。这不仅是由于历史原因，而且还是由于缺少合适备选的生长培养基造成的。现在这也是用于生产在疫苗制备中使用的大量病毒所选择的系统。然而，含胚卵作为疫苗生产的宿主系统具有严重的局限性。例如，在突然出现新的流感亚型爆发的情况下，可靠的全年不变的高质量卵的供应缺乏以及含胚卵的有限供应通常会阻碍疫苗的生产。这种生产系统的其它缺点是缺少可变性，有出现毒素的风险和偶然性病毒尤其是逆转录病毒的风险，并且涉及无菌状态。
除这些限制外，在卵中培养病毒带来一个非常显著的附加问题，该问题对于疫苗目的来说尤为重要：现有充分的证据证明卵培养导致病毒的底物特异性适应。事实上，卵尿囊中的即使很少传代就足以使初级人分离物适应SA α-2，3Gal结合表型(Rogers等，1985)。这是由于鸡胚胎尿囊绒膜表面排列的细胞上存在SA α-2，3Gal而非SA α-2，6Gal残基。初级分离物中存在的能够与SA α-2，3Gal残基特异相互作用的病毒变体比与SA α-2，6Gal残基更特异相互作用的病毒变体具有复制优势。因此SA α-2，3Gal-特异的病毒变体在含胚卵中被筛选出来(Gambaryan等，1999；Gambaryan等，1997)。卵-适应性不仅提高了对SA α-2，3Gal的亲和性，还导致对SA α-2，6Gal亲和性的降低。事实上HA并不能很平均的接纳两种相似物的类型，而且多种突变体已被确定具有这种改变的结合特异性(Daniels等，1987；Gambaryan等，1999；Ito等，1997；Suzuki等，1989)。已知HA在引起特异性免疫应答中的重要性，这些突变体导致其抗原特性的主要改变(Ilobi等，1994；Robertson等，1994)。因此，在损害已获得的保护水平的情况下，使用含具有卵诱导突变的HA分子的疫苗免疫导致较少的对野生型流感株的中和抗体(Newman等，1993)。
附图的简要说明
图1.pα-2，6ST2000/Hygro的图示。
图2.(A)pα-2，6STcDNA2000/Neo和(B)pα-2，6STcDNA2000/Hygro的图示。
图3.(A)pα-2，3STcDNA2000/Neo和(B)pα-2，3STcDNA2000/Hygro的图示。
图4.通过FACS分析的PER.C6和PER.C6/α-2，6ST中(A)SAα-2，6Gal和(B)SAα-2，3Gal的检测。
图5.通过荧光测定的PER.C6和PER.C6/α-2，6ST中初级临床流感分离物和卵传代的流感批量物(来自相同的初级分离物)的繁殖。感染性以HA-免疫荧光染色的阳性细胞的百分率表示。
图6.通过噬斑测定确定的PER.C6和PER.C6/α-2，6ST中初级临床流感分离物和卵传代的流感批量物(来自同样的初级分离物)的繁殖。感染性以每毫升噬斑形成单位(pfu′s)表示。
图7.流感滴度测定的图示。首先细胞用病毒颗粒感染，然后细胞在抗血清中孵育，随后用于FACS分析，其中在整个细胞群体中的感染细胞可被分离和计数。
图8.感染细胞(％)与稀释因子的分数的曲线图。
发明概述
本发明公开了用于生产和/或繁殖病毒颗粒例如流感病毒颗粒的方法，该病毒颗粒优选存在于从感染个体中获得的病毒分离物中，所述方法包括步骤：将细胞与病毒颗粒接触，并在利于所述病毒颗粒繁殖的条件下培养所述细胞，其中所述细胞过度表达编码α-2，6或α-2，3唾液酸转移酶的核酸。本发明也提供了用于一组病毒颗粒例如出现在流感分离物中的流感病毒颗粒的选择性繁殖的方法，其中所述病毒颗粒组具有与包含特异的糖基化残基的受体的亲和性，该方法包括步骤：将所述细胞与所述分离物一起孵育；在利于所述病毒颗粒繁殖的条件下培养所述细胞；以及从所述细胞和/或所述培养基中收获这样生产出来的病毒颗粒。
本发明进一步提供了新的疫苗和用于制备该疫苗的方法，其中所述方法优选包括步骤：处理生产出来的病毒颗粒以产生抗原部分；和收获例如来自流感病毒的血凝素和/或神经氨酸酶的至少一种抗原部分。本发明进一步提供了过表达涉及用于例如抗流感感染疫苗的疫苗生产的糖基化中的某个蛋白质的细胞和细胞系及其应用。本发明的细胞优选人类和经腺病毒E1转化的细胞，例如PER.C6细胞或其衍生细胞。
发明详述
本发明提供用于生产和/或繁殖病毒颗粒的方法，所述方法包括步骤：在培养基中将细胞与病毒颗粒在利于所述病毒颗粒感染所述细胞的条件下接触；和在利于所述病毒颗粒繁殖的条件下培养所述细胞，其中所述细胞过表达编码α-2，6唾液酸转移酶或其功能等同物的核酸。所述核酸可编码例如大鼠和人的不同来源的α-2，6唾液酸转移酶。优选所述α-2，6唾液酸转移酶是人α-2，6唾液酸转移酶。本发明进一步提供用于生产和/或繁殖病毒颗粒的方法，所述方法包括步骤：在培养基中将细胞与病毒颗粒在利于所述病毒颗粒感染所述细胞的条件下接触；和在利于所述病毒颗粒繁殖的条件下培养所述细胞，其中所述细胞过表达编码α-2，3唾液酸转移酶或其功能等同物的核酸。所述核酸可编码例如大鼠和人的不同来源的α-2，3唾液酸转移酶。优选所述α-2，3唾液酸转移酶是人α-2，3唾液酸转移酶。在本发明的一个实施方案中，所述病毒颗粒是流感病毒颗粒。可使用本发明的方法生产和/或繁殖的病毒颗粒的其它非限制性的实施例是副流感病毒、腺伴随病毒(AVV)或poliomavirus。利用由α-2，3和α2，6唾液酸转移酶诱导的糖基化结构的任何病毒都可使用本发明的方法生产和/或繁殖。
在一个优选的实施方案中，本发明提供用于繁殖流感病毒颗粒的方法，其中所述流感病毒颗粒存在于流感分离物中。更优选的方法是其中所述流感分离物是从至少一种流感感染的哺乳动物体中获得的。更优选的用于繁殖流感病毒颗粒的方法是其中所述流感感染的哺乳动物体是人或猪。在另一个实施方案中，本发明提供了用于生产和/或繁殖流感病毒颗粒的方法，其中所述流感分离物是从至少一种流感感染的禽类中获得的。在此所用的分离物指从流感病毒感染个体中获得的大批流感病毒。这些感染个体可以是易受流感病毒感染的所有物种，例如人，禽类，猪和马。人可能通过不同方式被流感感染：直接来自其他人或直接来自例如猪和禽类的动物体。用以疫苗生产的经繁殖的病毒可能最初来源于一个或更多患者(一个或更多人类个体，或一个或更多禽类，猪，等)。在流感病毒由禽类传播到人类导致人类的直接疾病，如同1997年发生在香港(见上文)的实例中，能够生产和/或繁殖直接用于疫苗生产的存在于禽类分离物中的流感病毒颗粒可能是有用的。本发明提供用于生产和/或繁殖存在于从例如禽类、猪、马、人的物种中通过过表达涉及细胞表面蛋白质糖基化并产生寡糖链上的称之为SAα-2，3Gal和SAα-2，6Gal键的唾液酸转移酶蛋白质而获得的分离物中的流感病毒颗粒的方法。在此使用的分离物优选指临床分离物(即从患者获得的分离物)。这些临床分离物也指初级分离物。初级分离物可以是从例如感染了流感病毒的人或动物的鼻，粘液和/或粪便中直接获得的分离物。然而，在卵或细胞或其它系统中繁殖的分离物仍然可以通过本发明的方法进一步生产和/或繁殖。因此，使用本发明的方法生产和/或繁殖的病毒颗粒可以存在于传代的批量物中，但是优选存在于初级批量物中，例如临床分离物。
在本发明的一个优选实施方案中，流感病毒颗粒的生产和/或繁殖通过使用在培养基中的用腺病毒的E1转化的细胞进行。更优选的，所述细胞是人类细胞。在高度优选的方面，本发明提供用于繁殖本发明的流感病毒颗粒的方法，其中所述人类细胞是PER.C6或其衍生细胞。
PER.C6细胞被发现有助于繁殖不同种类的病毒例如轮状病毒和流感病毒(参见WO 01/38362)。PER.C6细胞最先通过从胚胎视网膜获得的具有腺病毒血清型5的E1区域的转化细胞产生。据发现α-2，3和α-2，6唾液酸转移酶蛋白质都存在于PER.C6细胞中并具有活性(Pau等，2001)。因此，与2，3型和2，6型的唾液酸-半乳糖键(分别为SAα-2，3Gal和SAα-2，6Gal)特异相互作用的病毒颗粒能够在PER.C6细胞中生长。本发明的一个重要方面是这些唾液酸转移酶蛋白质中的任一种的过表达导致一组倾向SAα-2，3Gal残基或SAα-2，6Gal残基的流感病毒的特异性繁殖。这使得能够产生用于疫苗生产的具有最佳保护能力的最适含量的批量病毒。这种含量可以不同。如前面所讨论的，一些病毒的传播主要发生在人-人接触中，而在其它例如1997年香港的实例中，直接的禽类-人接触足以在人类中发生显著的影响。根据此中起作用的流感病毒的毒性和类型，可以选择分离物中的哪一组病毒颗粒应该被繁殖并最终用其生产出疫苗。
本发明也提供用于生产和/或繁殖流感病毒颗粒的方法，其中所述编码唾液酸转移酶的核酸与所述细胞异源。优选地，所述编码唾液酸转移酶的核酸被整合到所述细胞的基因组中。在此所说的异源指核酸被操作以使得编码唾液酸转移酶的基因比未经过所述操作的基因表达更多的蛋白质。异源也指核酸可以来源于与细胞来源物种不同的物种，但也可来源于相同的物种。当细胞比其一般情况下表达更多的唾液酸转移酶时，该细胞被认为过表达唾液酸转移酶。过表达唾液酸转移酶的细胞也可通过操作所述细胞的基因组来过表达蛋白质，以使得存在于所述细胞基因组中的基因比被操作前的所述细胞表达更多的蛋白质。这种过表达可通过外部的途径，例如整合不同的或更有活性的启动子，通过移除或抑止通常会限制蛋白质表达的抑制子，或通过化学方法诱导。这种过表达也可被筛选。如果细胞由于显著过表达至少一种唾液酸转移酶而被筛选出来，它们可用于本发明的方法。因此，这些细胞和这些细胞的应用也是本发明的一部分。
在另一个实施方案中，本发明提供用于制备疫苗的方法，所述方法包含步骤：根据本发明的方法生产和/或繁殖病毒颗粒；并将这样生产出来的病毒颗粒灭活。优选所述用于制备疫苗的方法包含步骤：处理这样生产出来的病毒颗粒以生产抗原部分；并获得至少一种所述抗原部分，优选通过纯化和/或浓缩所述至少一部分的方式。优选含有所述至少一种已获得的抗原部分的纯化和/或浓缩的组合物不含有所述经处理的病毒颗粒的其它抗原部分。在一个更优选的实施方案中，本发明提供了用于制备疫苗的方法，其中所述抗原部分包含源自流感病毒的血凝素蛋白或其部分，和/或神经氨酸酶蛋白或其部分。神经氨酸酶(NA)和血凝素(HA)蛋白是流感病毒颗粒的最突出的抗原部分并且在不同的繁殖步骤中易产生差异。本发明还提供了根据本发明的方法可获得的疫苗，同时还提供了包含本发明可获得的疫苗的药物组合物。
如所提到的，本发明的细胞对于含有流感病毒颗粒的初级、临床分离物的繁殖是极为有用的，同时所述细胞还可以应用于繁殖已经在含胚卵或其它系统中传代的分离物，从而获得识别存在于糖蛋白上的特异性糖基化残基的流感病毒颗粒的筛选物。因此，本发明也提供了用于繁殖病毒颗粒的过表达α-2，6唾液酸转移酶或其功能部分的细胞系的应用和用于繁殖病毒颗粒的过表达α-2，3唾液酸转移酶或其功能部分的细胞系的应用。优选所述病毒颗粒是流感病毒颗粒。更优选所述流感病毒颗粒存在于从至少一种流感感染的哺乳动物体中获得的流感分离物中。甚至更优选的是本发明的所述细胞系的应用，其中所述流感感染的哺乳动物体是人或猪，同时也优选所述流感病毒颗粒存在于从至少一种流感感染的禽类中获得的流感分离物中。
本发明进一步提供用于选择性生产和/或繁殖一组存在于分离物中的预先确定的病毒颗粒的方法，其中所述预先确定的病毒颗粒组偏好存在于受体上的特异性糖基化部分，并且其中所述分离物除了所述病毒组外还包含不具有上述偏好的病毒颗粒，所述方法包括步骤：在培养基中将能够表达和暴露所述含有特异性糖基化部分的所述受体的细胞与所述分离物在利于所述组中的至少一种病毒颗粒感染所述细胞的条件下，一起孵育；在利于所述病毒颗粒繁殖的条件下培养所述细胞；以及从所述细胞和/或所述培养基中收获这样生产出来的病毒颗粒。在此所用的糖基化部分指能够被病毒颗粒识别而引发感染的存在于糖蛋白的寡糖链上的任何种类的残基、键和或糖基类型。优选所述糖基化部分包含SAα-2，6Gal残基或SAα-2，3Gal残基。更优选其中所述预先确定的病毒颗粒组是一组预先确定的流感病毒颗粒的方法。在流感中，SAα-2，6Gal残基和SAα-2，3Gal残基被病毒颗粒的HA蛋白特异识别。这依赖于HA蛋白是否具有与任意一种残基相互作用的特异性。一般说来，流感分离物包含与SAα-2，6Gal残基特异作用的病毒以及与SAα-2，3Gal残基特异作用的病毒。根据本发明，现在选择性地繁殖任一来自临床、初级和/或传代分离物的病毒组以获得有助于利于人类的流感疫苗的生产的经繁殖的病毒组已成为可能。除了能够生产用于人类的疫苗这一事实外，通过使用本发明的方法和手段选择性繁殖用于例如防止流感病毒在猪或马种群中传播的兽用生产的病毒也成为可能。优选所述流感分离物是从至少一种流感感染的人、猪或禽类上获得的。也优选所述细胞是人细胞并且该细胞用来自腺病毒的E1转化。高度优选的细胞是PER.C6细胞或其衍生细胞。在此所用的衍生细胞指原始PER.C6细胞的修饰物，其中例如其它异源核酸被引入，敲除或是以其它方式修饰。PER.C6衍生细胞的非限制性实施例是稳定表达腺病毒E2A的温度敏感突变体或表达例如E4的其它腺病毒核酸的PER.C6细胞。如果PER.C6细胞中特定的核酸已经通过例如化学处理或敲除技术的其它方式被打开或关闭，这些细胞仍然是PER.C6的衍生细胞。尽管所提供的实施例描述了过表达红细胞生成素(EPO)蛋白质的细胞的应用，应该注意的是在本发明的细胞中过表达EPO并不是本发明的一部分。
在另一个优选的实施方案中，本发明提供了用于选择性繁殖存在于分离物中的一组病毒颗粒的方法，其中所述细胞包含编码与所述细胞异源的唾液酸转移酶的核酸。更优选的是本发明的方法，其中所述编码唾液酸转移酶的核酸被整合到所述细胞的基因组中。这种整合的核酸优选通过使用例如潮霉素和新霉素抗性基因的选择性标记来稳定整合。
本发明还提供了包含编码一个α-2，6唾液酸转移酶或α-2，3唾液酸转移酶的异源核酸的人细胞。优选的，所述核酸被整合到所述人细胞的基因组中。本发明也提供了用于病毒颗粒，优选为流感病毒颗粒的选择性繁殖的这些细胞的应用。
本发明提供了一种用于繁殖人类流感病毒初级分离物的方法的优化。本发明也提供了通过使用存在于细胞表面糖蛋白上的SAα-2，6Gal或SAα-2，3Gal(或两者)糖基化部分来繁殖流感病毒初级以及实验室分离物的方法的优化。通常人流感病毒识别SAα-2，6Gal部分，而鸟类流感病毒识别SAα-2，3Gal部分。猪流感病毒一般使用这两种残基。本发明提供用于繁殖其复制依赖于α-2，3唾液酸转移酶和/或α-2，6唾液酸转移酶活性，或更一般的说依赖于SAα-2，3Gal或SAα-2，6Gal残基的存在的任意一种病毒的方法的优化。本发明的方法包括培养基中细胞的使用。作为该方法的一个实例，已知使用人细胞可支持流感病毒的有效复制和生产。
本发明的细胞不仅有助于流感病毒的繁殖。本领域公知例如腺伴随病毒(AVV)，人poliomavirus和副流感病毒的其它病毒使用糖蛋白上的α-2，3和α-2，6键引发感染(Liu等，1998；Suzuki等，2001；Walters等，2001)。因此本发明还提供了用于(选择性)生产和/或繁殖利用该糖基化结构识别和感染靶细胞的其它病毒的方法。此外，如果可应用的话，本发明提供了本发明的细胞和用于生产除了流感之外的病毒和用于生产抗这些病毒的疫苗方法和途径的应用。本发明因此也提供了抗使用SAα-2，3Gal和SAα-2，6Gal残基进行细胞识别和侵染的病毒的疫苗。
先前已经证实PER.C6TM细胞(ECACC保藏号96022940)表现为用于繁殖流感病毒的理想基质，并且PER.C6的生产水平产生了适于以疫苗为目的的高滴度的制剂(WO 01/38362)。本发明提供的新的细胞系，命名为‘PER.C6-α-2，6ST’是通过下面的方法由PER.C6衍生而来：将编码人α-2，6唾液酸转移酶的核酸锚定于强CMV启动子调控下的质粒转染到PER.C6细胞中，随后筛选稳定整合了该质粒的细胞。与原始PER.C6细胞中携带SAα-2，6Gal残基的受体的数量相比，PER.C6-α-2，6ST细胞特征为更高地表达了含有SAα-2，6Gal的受体。这并不直接意味着携带这些部分的蛋白质是过表达的，而是携带SAα-2，6Gal残基的蛋白质的比例要高于PER.C6细胞中该蛋白质的比例。非过表达α-2，6唾液酸转移酶的PER.C6细胞已经能够表达位于细胞表面糖蛋白上的SAα-2，3Gal和SAα-2，6Gal残基。然而本发明的一个重要方面是提高携带SAα-2，6Gal残基的蛋白质与携带SAα-2，3Gal残基的蛋白质的相对比例。由于细胞内糖基化机制的直接底物竞争，SAα-2，3Gal型受体变得不能完全代表细胞表面上细胞过表达的α-2，6唾液酸转移酶蛋白质。这些组合特性使得该新的细胞系成为用于繁殖初级流感病毒分离物且不会引发野生型种群中的筛选压力的理想介质。在本发明的细胞上繁殖这些分离物实现了不改变对疫苗生产非常重要的HA特异性和免疫原性的大量病毒原液的有效生产。由于在PERC6-α-2，6ST中生产的病毒不呈现由适应SAα-2，3Gal受体导致的突变(如含胚卵中的情况)，该病毒的免疫原性与那些自然传播的流感病毒最具可比性。因此，从生长于PER C6-α-2，6ST的流感病毒获得的疫苗制剂是理想的适于诱导抗传播的野生型流感病毒的保护应答。本领域公知人类流感病毒是识别SAα-2，6Gal键的类型并且因此在本领域中公认为为在人体内诱导更具保护性的免疫应答需要获得含有来自于这些病毒的蛋白质的疫苗(Newman等，1993)。
如果人流感病毒通过含胚鸡卵繁殖，那些能够特异结合SAα-2，3Gal的病毒变体将会被筛选，而SAα-2，6Gal识别病毒将被筛选掉。PER.C6细胞在其表面具有含有SAα-2，6Gal和SAα-2，3Gal的受体。如上所讨论的，为了优先繁殖SAα-2，6Gal识别病毒，因此优选具有锚定这种成分的受体的过表达。为了确定相对的效果，也就是人α-2，3唾液酸转移酶的过表达，本发明也提供了用于产生另一种命名为‘PER.C6-α-2，3ST’的新细胞系的方法和手段。这些细胞以与上述用于PER C6-α-2，6ST相似的方式，通过将编码人α-2，3唾液酸转移酶的核酸锚定于强CMV启动子的调控下的质粒的转染，然后筛选携带稳定整合该质粒的细胞而衍生自PER.C6。PER.C6-α-2，3ST细胞特征在于含有SAα-2，3Gal的受体的更高表达。
α-2，6唾液酸转移酶和α-2，3唾液酸转移酶过表达的细胞系是有用的，因为α-2，6唾液酸转移酶过表达的细胞能够用于繁殖优先识别SAα-2，6Gal残基的流感病毒，而α-2，3唾液酸转移酶过表达的细胞能够用于繁殖优先识别SAα-2，3Gal残基的流感病毒。当病毒的感染和传播主要通过人-人接触发生并且病毒变得更加适应经SAα-2，6Gal残基的感染路径时，那么优选应用α-2，6唾液酸转移酶过表达的细胞系。另一方面，当感染从不具有锚定的SAα-2，3Gal残基的糖蛋白的禽类直接传到人类时(如1997年发生在香港的规模虽小但十分严重的传染病)，那么优选应用过表达α-2，3唾液酸转移酶的细胞。
在此所使用的术语α-2，3唾液酸转移酶或α-2，3唾液酸转移酶是指各自的转移酶并且也指所述转移酶的等同物，其中所述等同物包含等同于所述转移酶的同类但不必等量的相同转移酶活性。合适的等同物可以被本领域技术人员生产出来。所述转移酶的一部分是合适的等同物，如果其包含同类但不必等量的相同转移酶活性。其它合适的等同物是α-2，3唾液酸转移酶的衍生物和/或类似物或者包含等同于所述转移酶的同类但不必等量的相同转移酶活性的α-2，3唾液酸转移酶。这样的衍生物可通过保守氨基酸的置换或其它方式产生。也可以从各自的转移酶的一部分获得该衍生物。
在此所用的流感病毒颗粒可以是流感病毒或流感病毒样颗粒(influenza virus like particle)。流感病毒颗粒的等同物是包含与流感病毒颗粒同类但不必等量的相同感染特性的病毒(样)颗粒。这样的等同物能够例如通过重组的方式产生。该等同物可包含一般不存在于流感病毒中的分子。
实施例
实施例1.pα-2，6ST2000/Hygro的构建。
含有编码α-2，6唾液酸转移酶的序列的片段通过用EcoRI消化质粒pGST-Gal(Free University ofAmsterdam的I.van Die博士惠赠；该质粒由含有编码大鼠α-2，6唾液酸转移酶的完整cDNA序列的pBR322骨架组成，所述序列的GenBank登录号是M18769)得到。该片段依照标准步骤用T4DNA聚合酶形成平末端。经凝胶纯化后，将该α-2，6唾液酸转移酶的编码片段连接到pcDNA2000/Hygro中(也被称为质粒pcDNA2000/Hyg(-)，其已在WO 00/63403中描述)，该质粒根据标准的实验室步骤用PmeI线性化、去磷酸化并用凝胶纯化。所得到的质粒被命名为pα-2，6ST2000/Hygro(图1)。
实施例2.pα-2，6ST2000/Hygro转染PER.C6-EPO和过表达克隆的筛选。
PER.C6-EPO最初是为其它目的产生的，也就是为了用于关注红细胞生成素(EPO)糖基化的实验。EPO是涉及刺激红细胞生成的一种蛋白质，其活性主要依赖于其用于体内功能的唾液酸含量。PER.C6-EPO细胞系衍生自PER.C6并过表达人EPO蛋白(细胞已在WO 00/63403中描述)。该细胞系产生EPO这一事实并不被认为是本发明的关键。PER.C6-EPO细胞如下所述进行培养并用pα-2，6ST2000/Hygro转染。
PER.C6细胞以大约2-3百万个细胞/皿接种于组织培养皿(直径10cm)中并于37℃和10％CO2下保持过夜。次日，根据生产商的方法用Lipofectamine(Gibco)转染细胞。二十个皿都根据本领域技术人员公知的标准方法以每个皿2μg pα-2，6ST2000/Hygro转染。其它6个皿作为潮霉素致死和转染效率的阴性对照。第三日，溶解于含有FBS的DMEM培养基中的潮霉素以50μg/ml的浓度加入皿中。孵育细胞超过3-4周的时间，期间用补充了潮霉素的新鲜培养基定期洗涤细胞。每天与未转染含有潮霉素选择标记的质粒的阴性对照比较，监测细胞死亡的情况。挑选出生长的克隆并按照WO 00/63403中对红细胞生成素和抗体过表达细胞系的描述进行常规传代培养。大约25个筛选出来的抗生素抗性克隆随后生长于无潮霉素的24-孔，6-孔板和T25培养瓶中。当细胞在T75组织培养瓶中生长时，冷冻每一克隆的至少一小瓶并保藏备用。随后这些克隆使用先前由Govorkova等(1999)描述过的方法在FACsort仪器(BectonDickinson)上通过FACS分析测试α-2，6ST活性。为此，依照供应商的方法使用SAα-2，6Gal-特异的西洋接骨木(Sambucus nigra)凝集素(DIGGlycan differentiation试剂盒，Roche)。这些克隆在两个月时间内传代培养，期间定期进行FACS分析实验以监测细胞表面α-2，6唾液酸转移酶的表达。SAα-2，6Gal的升高表达是稳定的。通过细胞表面SAα-2，6Gal的最高密度评定的最好的α-2，6唾液酸转移酶表达克隆为克隆25-3.10。该克隆被命名为‘PER.C6-α-2，6ST’。图4A中的结果显示筛选过程结束时PER.C6-α-2，6ST的FACS分析。很明显pα-2，6ST2000/Hygro的稳定转染导致细胞表面SAα-2，6Gal残基的水平与PER.C6母细胞系相比显著提高。有趣的是，如通过使用α-2，3Gal-特异的怀槐(Maackia amurensis)凝集素的FACS所检测的(图4B)，α-2，6唾液酸转移酶的过表达也似乎导致SAα-2，3Gal残基的数量下降。这种效果极有可能是由于α-2，6唾液酸转移酶与内源α-2，3唾液酸转移酶竞争相同的糖蛋白底物造成的。
实施例3.α-2，6-和α-2，3唾液酸转移酶cDNA表达载体的产生。
含有人α-2，6唾液酸转移酶全长cDNA(GenBank登录号：14735135)的PCR片段使用本领域技术人员熟知的方法在人cDNA文库中通过聚合酶链式反应(PCR)获得。用于扩增的引物(正义：5′-TTT TTT GGA TCCATG ATT CAC ACC AAC CTG AAG AAA AAG-3′，反义：5′-TTT TTT CTTAAG TTA GCA GTG AAT GGT CCG GAA GC-3′)含有附加的5′-尾，以容许分别用BamHI消化正义引物和用AflII消化反义引物。该PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳纯化并用BamHI和AflII消化随后克隆到pcDNA2000/Hygro(如WO 00/63403中描述的pcDNA2000/Hyg(-))和pcDNA2000/Neo中(该载体主要以与源自pcDNA2000/DHFR的pcDNA2000/Hyg(-)相同的方式基本构建，如WO 00/63403中已详细描述的)。为此，pcDNA2000/Hygro和pcDNA2000/Neo也用BamHI和AflII限制酶消化。根据分子生物学领域技术人员熟知的标准方法通过双链测序法(double stranded sequencing)检验该序列和正确的克隆。所得质粒被命名为pα-2，6STcDNA2000/Hygro(图2A)，pα-2，6STcDNA2000/Neo(图2B)。它们包含编码受延伸的CMV启动子调控的人α-2，6唾液酸转移酶的核酸(参见WO 00/63403)。此外，这些质粒分别具有新霉素和潮霉素抗性，这被用于筛选已将质粒以稳定方式整合到其基因组中的克隆。
人α-2，3唾液酸转移酶的cDNA(GenBank登录号L23767)用如上述用于人α-2，6唾液酸转移酶基因的方法获得并克隆。用于PCR反应的引物是：正义：5′-TTT TTT GGA TCC ATG TGT CCT GCA GGC TGG AAGCTC-3′和反义：5′-TTT TTT CTT AAG TCA GAA GGA CGT GAG GTTCTT GAT AG-3′。所得质粒被命名为pα-2，3STcDNA2000/Hygro(图3A)，pα-2，3STcDNA2000/Neo(图3B)。
实施例4.过表达人α-2，6-或人α-2，3唾液酸转移酶的稳定PER.C6细胞的产生。
PER.C6细胞系的细胞以大约2-3百万个细胞/皿接种于40个组织培养皿中(直径10cm)并在37℃和10％CO2下保持过夜。次日，根据生产商的方法和本领域技术人员熟知的标准培养步骤用Lipofectamine(Gibco)转染细胞。二十个皿以每皿5μg的pα-2，6STcDNA2000/Neo转染。其它20个未转染细胞的皿作为新霉素致死和转染效率的阴性对照。第三日，将溶解于含有FBS的培养基中的新霉素(0.5mg/ml)加入合适的皿中。细胞培养超过4-5周的时间，期间用补充了筛选试剂的新鲜培养基定期洗涤细胞。每天与未转染含有新霉素和潮霉素选择标记的质粒的阴性对照相比，监测细胞的死亡情况。挑选出生长的克隆并如WO 00/63403中红细胞生成素和抗体过表达细胞系的描述进行常规传代培养。
从每个细胞系中挑选出的大约50个新霉素抗性克隆随后生长于有新霉素的96-孔，24-孔，6-孔板和T25培养瓶中。当细胞在T25组织培养瓶中生长时，冷冻每一克隆的至少一小瓶并保藏备用。接着通过先前由Govorkova等(1999)描述的和使用上述的SAα-2，6Gal-特异的西洋接骨木凝集素经FACS分析测试每个克隆的重组人α-2，6唾液酸转移酶的生产。接下来优良生产克隆的挑选是基于表达，培养方式和生存能力。为了允许检验长期生存能力，在滚瓶和生物反应器中的长期悬浮生长，冷冻更多小瓶的最佳表现克隆并进行用于进一步研究的筛选。这些克隆在两个月的时间里传代培养。在这两个月期间，定期进行FACS分析实验以监测细胞表面α-2，6唾液酸转移酶的表达。挑选最稳定的生产克隆并用于细胞存库(banking)。该克隆被扩增以形成命名为PER.C6-H-α-2，6ST的细胞系。
过表达人α-2，3唾液酸转移酶蛋白质的细胞系以与前面所述用于人α-2，6唾液酸转移酶过表达PER.C6细胞的同样方式常规生产。在此情况下使用了pα-2，3STcDNA2000/Neo质粒。所产生的细胞系命名为PER.C6-H-α-2，3ST。
实施例5.细胞培养以及PER.C6细胞和α-2，6唾液酸转移酶过表达的PER.C6细胞中初级和适应的流感病毒分离物的感染。
进行实验比较PER.C6与PER.C6-α-2，6ST对感染的易受性。PER.C6和PER.C6-α-2，6ST的悬浮培养物在补充有4mM L-谷氨酰胺(Gibco)的无血清ExCell 525培养基(JRH Biosciences)中，在37℃和10％CO2下于490cm2的组织培养滚瓶中以1rpm连续旋转培养。下述的步骤应用于所有报道过的流感感染。在感染当天，细胞在终体积为2ml的无血清培养基中以1×106细胞/ml的密度接种于6-孔板中，所述培养基含有2mg/ml青霉素/链霉素(Gibco)，200ng/ml两性霉素B(Gibco)和3μg/ml胰蛋白酶-EDTA(Gibco)。细胞用初级分离物的病毒接种物和一批PER.C6-适应物(衍生自初级分离物并在PER.C6细胞上经一次传代)感染。所使用的初级分离物是A/荷兰/002/01(H1N1，A/New Caledonia like，University ofRotterdam的Dr.A.Osterhaus教授惠赠)。两批都以10-2v/v稀释度使用。被感染的细胞于35℃和10％CO2下静置培养6天。通过该实验重新获得病毒上清液并随后进行澄清化。澄清化通过在离心机中以5000rpm室温离心5分钟沉淀细胞来实现。细胞沉淀通过下文描述的直接免疫荧光测定分析。上清液转移到新的eppendorf管中，在液氮中快速冷冻并于-80℃保存直到用于噬斑测定(见下文)。
实施例6.免疫荧光测试。
用于检测流感病毒感染的直接免疫荧光(I.F.)测定根据供应商提供的方法使用IMAGENTM流感病毒A和B试剂盒(Dako)在被感染的细胞中(见上文)进行。简而言之，被感染细胞离心5分钟。移去上清液并将沉淀重悬于PBS中。该过程重复两遍以彻底洗涤细胞。洗涤过的细胞沉淀重悬于PBS并将20μl细胞悬液加入I.F.载玻片两个孔的每一孔中。室温干燥。细胞通过加入20μl丙酮到每一孔中固定并经空气干燥。每一孔中加入20μl合适的IMAGEN流感试剂(即经标记的流感A或B的特异抗体)。然后该载玻片在湿润的绵纸上于37℃孵育15分钟。多余的试剂用PBS冲洗掉然后在PBS中漂洗5分钟。该载玻片在室温下空气干燥。每孔中加入一滴IMAGEN封固液并将盖玻片置于载玻片上(用少量的指甲油固定)。使用表面荧光照射来显微观察样品。被感染的细胞由明亮的苹果绿荧光表征。记录显示阳性(绿色荧光)细胞与阴性(红色)细胞相比较的大约的百分率。结果显示在图5中。很明显PER.C6-α-2，6ST有效地支持临床分离物的复制(白条)。
实施例7.噬斑测定。
在PER.C6和PER.C6-α-2，6ST中的病毒生产通过在接种了病毒上清液的MDCK(Madin Darbin Canine Kidney)细胞中形成噬斑的计数而研究。MDCK细胞尤其利于这样的噬斑测定试验。总的1ml 10-倍稀释的根据实施例5中描述的方法在PER.C6和PER.C6-α-2，6ST中繁殖的初级和PER.C6传代流感病毒的病毒上清液被接种于在补充有2mM L-谷氨酰胺的DMEM的6-孔板中生长至95％铺满的MDCK细胞中。37℃一小时后，细胞用PBS洗涤两遍并过载3ml琼脂糖混合物(1.2ml 2.5％琼脂糖，1.5ml2×MEM，30μl 200mM L-谷氨酰胺，24μl胰蛋白酶-EDTA，250μlPBS)。然后细胞在湿润的10％CO2空气中于37℃培养大约3天并观察病毒噬斑，记录并计数。结果显示在图6中。流感病毒的临床分离物(白条)和PER.C6-传代病毒(灰条)能够非常有效地感染PER.C6α-2，6ST细胞(右侧系列)，而PER.C6细胞(左侧系列)不易受初级临床分离物的感染。这表明过表达α-2，6唾液酸转移酶的细胞特别利于繁殖初级病毒分离物，并表明这些细胞对用于生产抗例如流感感染的疫苗的快速而安全的方法是极为有利的。
实施例8.在FACS中使用PER.C6细胞滴定流感病毒颗粒。
应用基于FACS的新方法测量上清液中流感病毒的滴度。该过程需要通过检测在首轮病毒复制中可能被感染的细胞的分数进行有复制活性的病毒的定量。使用PER.C6的悬浮培养物和0.01至1的部分感染物，就可能在几小时内获得十分精确的值。使用MDCK细胞的噬斑检测的相同滴定是此时被本领域许多技术人员所使用的用于流感病毒滴定的标准测定，也是耗时(一般几乎要两周)更长，更费力并且尤其是不可再生的。接下来是对所使用的材料和方法的技术说明。在此表明了悬浮细胞可用于使用FACS分析的上清液中流感病毒颗粒的滴定。
无血清AEM培养基(Gibco)中悬浮生长的PER.C6细胞被接种于24-孔板(每孔1ml1×106细胞/ml细胞)。加入胰蛋白酶-EDTA(Gibco)至终浓度为3μg/ml。细胞用流感病毒A型上清液(X-127，A/北京/262/95的重排物和X-31(获得自National Institute for Biological Standards and Control))。200μl病毒上清液由未稀释的病毒原液开始经三倍稀释的步骤被加入到细胞中，。模拟-感染的细胞对照组也包括在内。加入病毒后，细胞于35℃保持5小时。
从被感染的细胞取样(每个350μl)至1.5ml eppendorf管中。加入冷的PBS至1ml并将这些管在eppendorf台式离心机上以5000rpm离心5分钟。弃除上清夜并将细胞温和地重悬于100μl冷的Cytoperm/Cytofix透析液(permeabilizing solution)(Pharmingen)中。4℃20分钟后，加入冷的PBS(900μl)并如上述再次沉淀细胞。沉淀的细胞重悬于含有5μl标记有FITC(Imagen试剂盒，Dako)的流感A核蛋白-特异性抗体的350μl冷的染色培养基(PBS，1％BSA，0.1％叠氮化钠)中。细胞在4℃下孵育15-30分钟，随后用1ml冷的PBS洗涤一次，再用1ml1×Cellfix固定溶液(Becton Dickinson)洗涤一次。然后细胞经FACS分析或于4℃黑暗中保存一周再进行FACS分析。
染色细胞在FACsort仪(Becton Dickinson)上分析。流感/FITC阳性细胞在FL1通道中检测并出现在右上象限处(图7)。图的下面部分显示的是未感染细胞和感染后5小时的细胞的FACS分析结果。该图的右上象限和左上象限分别表示FITC-阳性/被感染和FITC-阴性/未感染的细胞。
然后被感染细胞以百分率为Y-轴对应用于感染它们的上清液的稀释度为X-轴作曲线(图8)。相应于50％被感染细胞的值表示上清液的TCID50。已知1,000,000个细胞用于最初的感染，可推导出稀释1/6的200μl上清液含有500,000感染性颗粒，相应的滴度为1.5×107感染性颗粒/ml。当同样的上清液使用本领域技术人员熟知的标准步骤在MDCK细胞的标准噬斑测定中被量化时，获得了1.7×107的值，并具有+/-50％的变异。
对本领域技术人员来说不同体积和稀释度的病毒上清液可与不同量的PER.C6一起用于改变测定的敏感度是显而易见的。类似的，只要提供合适的用于染色的抗体，除了X-127外的流感病毒的滴度都可测定。
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Claims (35)
1、一种用于生产病毒颗粒的方法，所述方法包括步骤：
-在培养基中将细胞与病毒颗粒在利于所述病毒颗粒感染所述细胞的条件下接触；和
-在利于所述病毒颗粒繁殖的条件下培养所述细胞，
其中所述细胞过表达编码α-2，6唾液酸转移酶或其功能等同物的核酸。
2、权利要求1的方法，其中所述α-2，6唾液酸转移酶是人α-2，6唾液酸转移酶。
3、一种用于生产病毒颗粒的方法，所述方法包括步骤：
-在培养基中将细胞与病毒颗粒在利于所述病毒颗粒感染所述细胞的条件下接触；和
-在利于所述病毒颗粒繁殖的条件下培养所述细胞，
其中所述细胞过表达编码α-2，3唾液酸转移酶或其功能等同物的核酸。
4、权利要求3的方法，其中所述α-2，3唾液酸转移酶是人α-2，3唾液酸转移酶。
5、权利要求1-4中任意一项的方法，其中所述病毒颗粒是流感病毒颗粒或其等同物。
6、权利要求5的方法，其中所述流感病毒颗粒存在于流感分离物中。
7、权利要求6的方法，其中所述流感分离物是从至少一种流感感染的哺乳动物体中获得的。
8、权利要求7的方法，其中所述被流感感染的哺乳动物体是人或猪。
9、权利要求6的方法，其中所述流感分离物是从至少一种流感感染的禽类中获得的。
10、权利要求1-4中任意一项的方法，其中所述细胞用源自腺病毒的E1转化。
11、权利要求10的方法，其中所述细胞是人细胞。
12、权利要求11的方法，其中所述人细胞是PER.C6。
13、权利要求1-4中任意一项的方法，其中所述编码唾液酸转移酶的核酸与所述细胞异源。
14、权利要求13的方法，其中所述编码唾液酸转移酶或功能等同物的核酸被整合到所述细胞的基因组中。
15、用于制备疫苗的方法，所述方法包括步骤：
-根据权利要求1-14中任意一项的方法生产病毒颗粒；和
-将这样生产出来的病毒颗粒灭活。
16、权利要求15的方法，其中所述方法进一步包括步骤：
-处理所述这样生产出来的病毒颗粒以生产抗原部分；和
-获得至少一个抗原部分。
17、权利要求16的方法，其中所述抗原部分包含源自流感病毒的血凝素蛋白质或其部分，和/或神经氨酸酶蛋白质或其部分。
18、根据权利要求15-17中任意一项的方法可获得的疫苗。
19、一种包含权利要求18的疫苗的药物组合物。
20、一种过表达α-2，6唾液酸转移酶或其功能等同物的细胞在繁殖病毒颗粒中的应用。
21、一种过表达α-2，3唾液酸转移酶或其功能等同物的细胞在生产病毒颗粒中的应用。
22、权利要求20或21的细胞的应用，其中所述病毒颗粒是流感病毒颗粒。
23、权利要求22的应用，其中所述流感病毒颗粒存在于从至少一种流感感染的哺乳动物体获得的流感分离物中。
24、权利要求23的应用，其中所述被流感感染的哺乳动物体是人或猪。
25、权利要求22的应用，其中所述流感病毒颗粒存在于从至少一种流感感染的禽类获得的流感分离物中。
26、一种用于选择性繁殖一组存在于分离物中的预先确定的病毒颗粒的方法，其中所述预定的病毒颗粒组具有与存在于受体上的特异性糖基化部分的亲和性，并且其中除了所述病毒组外所述分离物还包含不具有所述预定特异性的病毒颗粒，所述方法包括步骤：
-在培养基中将能够表达和暴露所述含有该特异性糖基化部分的受体的细胞与所述分离物一起在利于所述细胞被所述组中的至少一种病毒颗粒感染的条件下孵育；
-在利于所述病毒颗粒繁殖的条件下培养所述细胞；以及
-从所述细胞和/或所述培养基中收获这样所生产的病毒颗粒，其中所述糖基化部分包含SAα-2，6Gal残基，并且其中所述细胞过表达α-2，6唾液酸转移酶。
27、一种用于选择性繁殖一组存在于分离物中的预先确定的病毒颗粒的方法，其中所述预定的病毒颗粒组具有与存在于受体上的特异性糖基化部分的亲和性，并且其中除了所述病毒组外所述分离物还包含不具有所述预定特异性的病毒颗粒，所述方法包括步骤：
-在培养基中将能够表达和暴露所述含有该特异性糖基化部分的受体的细胞与所述分离物一起在利于所述细胞被所述组中的至少一种病毒颗粒感染的条件下孵育；
-在利于所述病毒颗粒繁殖的条件下培养所述细胞；以及
-从所述细胞和/或所述培养基中收获这样所生产的病毒颗粒，其中所述糖基化部分包含SAα-2，3Gal残基，并且其中所述细胞过表达α-2，3唾液酸转移酶。
28、权利要求26或27的方法，其中所述预先确定的病毒颗粒组是一组预定的流感病毒颗粒。
29、权利要求26或27的方法，其中所述分离物是流感分离物。
30、权利要求29的方法，其中所述流感分离物是从被至少一种流感感染的人，猪或禽类中获得的。
31、权利要求26或27中任意一项的方法，其中所述细胞用源自腺病毒的E1转化。
32、权利要求31的方法，其中所述细胞是人细胞。
33、权利要求32的方法，其中所述人细胞是PER.C6。
34、权利要求26或27中任意一项的方法，其中所述细胞包含编码与所述细胞异源的唾液酸转移酶的核酸。
35、权利要求34的方法，其中所述编码唾液酸转移酶的核酸被整合到所述细胞的基因组中。
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