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Gebiet der Erfindung
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Die
Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der Medizin. Die Erfindung
bezieht sich weiterhin auf Impfstoffe, die für einen Schutz vor einer Grippeinfektion
sorgen, und auf Verfahren und Mittel zu ihrer Gewinnung.
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Hintergrund der Erfindung
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Influenzaviren
sind die Erreger der Grippe, einer hochansteckenden Atemwegskrankheit,
die den Menschen schon seit dem Altertum befüllt. Das Virus wurde zuerst
1933 identifiziert, aber durch die Jahrhunderte wurden zahlreiche
Epidemien beschrieben, die fast sicher der Grippe zuzuschreiben
sind (Potter 1998). Im letzten Jahrhundert gab es drei größere Fälle von
Grippeausbrüchen.
Die sogenannte "spanische
Grippe" von 1918
war besonders schlimm. Sie führte
zum Tod von schätzungsweise
20 bis 40 Millionen Menschen auf der ganzen Welt, der schlimmste
beschriebene Ausbruch einer Krankheit beim Menschen, der in der
Geschichte bekannt ist. 1957 tötete
die "asiatische
Grippe" schätzungsweise
1 Million Menschen, und 1968 war die "Hongkong-Grippe" für
mehr als 700 000 Individuen tödlich.
Trotz der Anstrengungen der Wissenschaft fordern durch Influenzaviren
verursachte Infektionen weiterhin jedes Jahr einen schweren Tribut
in Form von Krankheits- und Todesfällen sowie ökonomischen Konsequenzen. Neuere
Arbeiten waren hilfreich, um die ungewöhnliche Virulenz einiger Influenzastämme, die
in der Vergangenheit größere Pandemien
verursachten, zu erklären
(Gibbs et al. 2001; Hatta et al. 2001). Das Verständnis der
zugrundeliegenden pathogenen Mechanismen ist jedoch unvollständig, was
die effiziente Prävention
und Behandlung der Krankheit einschränkt.
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Nach
Schätzungen,
die alle Altersgruppen einschließen, leiden allein in den USA
jedes Jahr 48 Millionen Personen an der Grippe. Diese Epidemien
führen
zu ungefähr
20 000 Toten pro Jahr, neben etwa 4 Millionen Individuen, die im
Krankenhaus behandelt werden müssen
(CDC-Statistik). Säuglinge,
Kinder und Senioren sind besonders anfällig für eine Grippeinfektion. Das
Auftreten einer neuen Virusvariante mit hoher pathogener und infektiöser Kapazität ist jedoch
weiterhin eine große
Bedrohung für
alle Individuen. Dies wurde 1997 bewiesen, als ein in Hongkong identifiziertes
Virus den Tod eines Drittels der 18 klinisch diagnostizierten Fälle verursachte
(Claas et al. 1998; Subbarao et al. 1998).
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Vögel bilden
das größte Reservoir
für das
Influenzavirus. Insbesondere wurden alle bekannten Untertypen des
Influenza-A-Virus (zusammen mit Untertyp B die häufigste Ursache der Grippe
beim Menschen) aus Wildvögeln
sowie Nutzgeflügel
isoliert. Ein Vogel-Influenza-A-Virus wird jedoch normalerweise
nicht direkt von Vögeln
auf Menschen übertragen.
In dieser Hinsicht war die einzige bisher beschriebene Ausnahme
das oben genannte Hongkong-Virus von 1997. Für die Wirtsspezifität spielen
vermutlich mehrere virale Proteine eine Rolle, aber der wichtigste
Faktor ist das Hämagglutinin(HA)-Membran-Protein.
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Das
HA-Gen war eines der ersten Gene des Influenzavirus, das identifiziert
und sequenziert wurde. Es codiert für ein Transmembranprotein,
das direkt an der Bindung an die Wirtszelle und dem Eindringen in dieselbe
beteiligt ist. HA leitet die Infektion ein, indem es an terminale
Sialyloligosaccharid-Rezeptor-Determinanten bindet, die an Glycoproteinen
und Gangliosiden, die sich auf der Wirtszelloberfläche befinden,
vorhanden sind. Terminale Sialinsäurereste von natürlichen
Sialylglycoproteinen und Gangliosiden sind bekanntermaßen die
minimalen Determinanten der Bindung. Die Bindung hängt jedoch
auch von der Art der Sialinsäurebindung
an die vorletzte Galactose und von der Struktur weiter entfernter
Teile des Sialylglycokonjugats ab.
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Humane
Influenzaviren binden vorzugsweise an Rezeptoren, die die Sialinsäure-α-2,6-Galactose(SAalpha2,6Gal)-Bindung
enthalten, während
Vogelviren die SAalpha2,3-Gal-Bindung verwenden (Übersicht
bei Suzuki 1994). Diese Bin dungsspezifität bestimmt auch den Zelltropismus
des Virus innerhalb des Wirts. Die Infektion mit humanem Influenzavirus
(und Replikation desselben) ist auf die Atemwege beschränkt, während man
das Vogelgrippevirus hauptsächlich
in den Zellen, die den Darmtrakt auskleiden, sowie in den Lungen
von Vögeln
findet. Unter Verwendung von für
die Sialinsäure-Galactose-Bindung
spezifischen Lectinen wurde gezeigt, dass Sialinsäurereste,
die über
die α-2,6-Bindung
an Galactose gebunden sind, aber nicht SAalpha2,3Gal, auf den Oberflächen von
Epithelzellen der menschlichen Luftröhre vorhanden sind (Baum und Paulson
1990). Weiterhin trägt
auch die große
Menge von SAalpha2,3Gal-Struktureinheiten in Mucinen der Atemwege
dazu bei, den SAalpha2,6Gal-spezifischen Phänotyp der humanen Grippe von
HA aufrechtzuerhalten (Baum und Paulson 1990; Couceiro et al. 1993).
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In
den meisten Labors wird die Vermehrung von Primärisolaten immer noch im Allantochorion
von embryonierten Eiern durchgeführt.
Dies ist nicht nur auf historische Gründe zurückzuführen, sondern auch darauf, dass
es kein geeignetes alternatives Wachstumsmedium gibt. Es ist zur
Zweit auch das System der Wahl für die
Produktion großer
Virusmengen zur Verwendung bei der Herstellung von Impfstoffen.
Embryonierte Eier unterliegen als Wirtssystem für die Impfstoffproduktion jedoch
schwerwiegenden Einschränkungen.
Zum Beispiel kann die Tatsache, das es keinen zuverlässigen Nachschub
von qualitativ hochwertigen Eiern durch das ganze Jahr hindurch
gibt, sowie allgemein die begrenzte Verfügbarkeit von embryonierten
Eiern die Impfstoffproduktion im Fall eines plötzlichen Ausbruchs eines neuen
Influenza-Untertyps behindern. Weitere Nachteile dieses Produktionssystems
sind die fehlende Flexibilität,
die Gefahr der Anwesenheit von Toxinen und die Gefahren von zufällig vorhandenen
Viren, insbesondere Retroviren, sowie Bedenken wegen der Sterilität.
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Neben
diesen Einschränkungen
führt die
Kultivierung des Virus auf Eiern zu einem sehr bedeutenden zusätzlichen
Problem, das für
Impfstoffzwecke besonders wichtig ist: Es gibt jetzt hinreichende
Beweise dafür, dass
Eikulturen zu einer substratspezifischen Adaptation des Virus führen. Tatsächlich sind
bereits wenige Durchgänge
in der Allantois von Eiern ausreichend, damit ein primäres humanes
Isolat sich an den SAalpha2,3-Gal-bindenden Phänotyp adaptieren kann (Rogers
et al. 1985). Dies ist auf die Anwesenheit von SAalpha2,3Gal-, aber
nicht von SAalpha2,6Gal-Resten auf den Zellen zurückzuführen, die
die Oberfläche
der Hühnerembryo-Chorion-Allantois-Membran
auskleiden. Virusvarianten, die in Primärisolaten vorhanden sind und
spezifisch mit SAalpha2,3Gal-Resten
Wechselwirken können,
haben einen replikativen Vorteil gegenüber Virusvarianten, die mit
größerer Spezifität mit SAalpha2,6Gal-Resten
Wechselwirken. Die SAalpha2,3Gal-spezifischen Virusvarianten werden
somit in embryonierten Eiern selektiert (Gambaryan et al. 1999;
Gambaryan et al. 1997). Die Ei-Adaptation
erhöht
nicht nur die Affinität
zu SAalpha2,3Gal, sondern führt
auch zu einer reduzierten Affinität zu SAalpha2,6Gal. HA kann
tatsächlich
nicht beide Typen von Analoga gleich gut unterbringen, und es wurden
multiple Mutationen identifiziert, die für diese veränderte Bindungsspezifität sorgen
(Daniels et al. 1987; Gambaryan et al. 1999; Ito et al. 1997; Suzuki
et al. 1989). In Anbetracht der Wichtigkeit von HA beim Hervorrufen
einer spezifischen Immunantwort führen diese Mutationen zu größeren Veränderungen seiner
antigenen Eigenschaften (Ilobi et al. 1994; Robertson et al. 1994).
Folglich induziert eine Immunisierung mit Impfstoffen, die HA-Moleküle enthalten,
welche Ei-induzierte Mutationen tragen, weniger neutralisierende Antikörper gegen
Wildtyp-Influenza-Stämme
auf Kosten des erreichten Schutzniveaus (Newman et al. 1993).
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Kurzbeschreibung der Figuren
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1.
Schematische Darstellung von pAlpha2,6ST2000/Hygro.
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2. Schematische Darstellung von (A) pAlpha2,6STcDNA2000/Neo
und (B) pAlpha2,6STcDNA2000/Hygro.
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3. Schematische Darstellung von (A) pAlpha2,3STcDNA2000/Neo
und (B) pAlpha2,3STcDNA2000/Hygro.
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4.
Nachweis von (A) SAalpha2,6Gal und (B) SAaplha2,3Gal in PER.C6 und
PER.C6/alpha2,6ST durch FACS-Analyse.
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5.
Vermehrung eines primären
klinischen Influenza-Isolats und einer Influenza-Charge, die Passagen
im Ei unterzogen wurde (aus demselben Primärisolat), an PER.C6 und PER.C6/alpha2,6ST,
bestimmt durch Fluoreszenz. Die Infektiosität wird als Prozentsatz von
Zellen, die positiv auf HA-Immunfluoreszenz-Anfärbung reagieren,
ausgedrückt.
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6.
Vermehrung eines primären
klinischen Influenza-Isolats und einer Influenza-Charge, die Passagen
im Ei unterzogen wurde (aus demselben Primärisolat), an PER.C6 und PER.C6/alpha2,6ST,
bestimmt durch Plaque-Assay. Die Infektiosität wird als plaquebildende Einheiten
(pfu) pro ml ausgedrückt.
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7.
Schematische Darstellung des Influenza-Titrations-Assays. Zuerst
werden Zellen mit Viruspartikeln infiziert, dann werden Zellen mit
Antiseren inkubiert und anschließend in einer FACS-Analyse
verwendet, in der infizierte Zellen abgetrennt und in der Gesamten
Zellpopulation gezählt
werden können.
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8.
Auftragung des Bruchteils von infizierten Zellen (%) gegen den Verdünnungsfaktor.
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Kurzbeschreibung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung offenbart Verfahren zur Herstellung und/oder
Vermehrung von Viruspartikeln, wie Influenzaviruspartikeln, die
vorzugsweise in einem Virusisolat vorhanden sind, das von einem
infizierten Probanden erhalten wurde, wobei das Verfahren die folgenden
Schritte umfasst: In-Kontakt-Bringen einer Zelle mit einem Viruspartikel
und Kultivieren der Zelle unter Bedingungen, die zur Vermehrung
des Viruspartikels führen,
wobei die Zelle eine Nucleinsäure,
die eine alpha2,6- oder eine alpha2,3-Sialyltransferase codiert, überexprimiert.
Die Erfindung gibt auch ein Verfahren für die selektive Vermehrung
einer Menge von Viruspartikeln, wie Influenzaviruspartikeln, an,
die in einem Influenza-Isolat vorhanden sind, wobei die Menge von
Viruspartikeln eine Affinität
zu Rezeptoren hat, die einen spezifischen Glycosylierungsrest umfassen,
wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: Inkubieren einer
Zelle mit dem Isolat; Kultivie ren der Zelle unter Bedingungen, die
zur Vermehrung des Viruspartikels führen; und Ernten der so produzierten
Viruspartikel aus der Zelle und/oder dem Kulturmedium.
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Zellen,
die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden,
sind vorzugsweise human und durch Adenovirus-E1 transformiert, wie
PER.C6-Zellen oder Derivate davon.
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Ausführliche Beschreibung
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Die
vorliegende Erfindung gibt Verfahren zur Herstellung und/oder Vermehrung
eines Viruspartikels an, wobei das Verfahren die folgenden Schritte
umfasst: In-Kontakt-Bringen
einer Zelle mit einem Viruspartikel in einem Kulturmedium unter
Bedingungen, die zur Infektion der Zelle durch den Viruspartikel
führen,
und Kultivieren der Zelle unter Bedingungen, die zur Vermehrung
des Viruspartikels führen,
wobei die Zelle eine Nucleinsäure,
die eine alpha2,6-Sialyltransferase codiert, überexprimiert. Die Nucleinsäure kann
eine alpha2,6-Sialyltransferase aus verschiedenen Quellen, wie Ratte
und Mensch, codieren. Vorzugsweise handelt es sich bei der alpha-2,6-Sialyltransferase
um humane alpha-2,6-Sialyltransferase.
Die Erfindung gibt weiterhin Verfahren zur Herstellung und/oder
Vermehrung eines Viruspartikels an, wobei das Verfahren die folgenden Schritte
umfasst: In-Kontakt-Bringen einer Zelle mit einem Viruspartikel
in einem Kulturmedium unter Bedingungen, die zur Infektion der Zelle
durch den Viruspartikel führen,
und Kultivieren der Zelle unter Bedingungen, die zur Vermehrung
des Viruspartikels führen,
wobei die Zelle eine Nucleinsäure,
die eine alpha2,3-Sialyltransferase codiert, überexprimiert. Die Nucleinsäure kann
eine alpha2,3-Sialyltransferase aus verschiedenen Quellen, wie Ratte
und Mensch, codieren. Vorzugsweise handelt es sich bei der alpha-2,3-Sialyltransferase um
humane alpha-2,3-Sialyltransferase. In einer Ausführungsform
der Erfindung ist der Viruspartikel ein Influenzaviruspartikel.
Weitere nichteinschränkende
Beispiele für
Viruspartikel, die unter Verwendung von Verfahren der vorliegenden
Erfindung hergestellt und/oder vermehrt werden können, sind Parainfluenzavirus,
adenoassoziiertes Virus (AAV) oder Polyomavirus. Jedes Virus, das
die Glycosylierungsstrukturen verwendet, die durch die alpha-2,3- und alpha2,6-Sialyltransferase
induziert werden, kann unter Verwendung von Verfahren der vorliegenden
Erfindung vermehrt und/oder hergestellt werden.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
gibt die Erfindung Verfahren zur Vermehrung eines Influenzaviruspartikels
an, wobei der Influenzaviruspartikel in einem Influenza-Isolat vorhanden
ist. Besonders bevorzugt sind Verfahren, bei denen das Influenza-Isolat
aus wenigstens einem Influenza-infizierten Säugerpatienten erhalten wird.
Ganz besonders bevorzugt sind Verfahren zur Vermehrung eines Influenzaviruspartikels,
bei denen der Influenza-infizierte Säugerpatient ein Mensch oder
ein Schwein ist. In einer anderen Ausführungsform gibt die Erfindung
Verfahren zur Herstellung und/oder Vermehrung eines Influenzaviruspartikels
an, wobei das Influenza-Isolat aus wenigstens einem Influenza-infizierten
Vogel erhalten wird. Der hier verwendete Ausdruck "Isolate" bezieht sich auf
Chargen von Influenzaviren, die von Patienten erhalten werden, die
mit Influenzaviren infiziert sind. Bei diesen Patienten kann es
sich um alle Spezies handeln, die für Influenzaviren anfällig sind,
wie Menschen, Vögel,
Schweine und Pferde. Menschen können
auf verschiedenen Wegen mit Influenza infiziert werden: entweder
direkt von anderen Menschen oder direkt von tierischen Patienten,
wie Schweinen und Vögeln.
Vermehrte Viren, die für
die Impfstoffherstellung verwendet werden, könnten ursprünglich von einem oder mehreren
Patienten (einem oder mehreren menschlichen Individuen oder einem
oder mehreren Vögeln,
Schweinen usw.) abgeleitet sein. In einem Fall, in dem die Übertragung
eines Influenzavirus von einem Vogel auf einen Menschen bei Menschen
direkt eine Krankheit verursacht, wie es in Hongkong im Jahre 1997
der Fall war (siehe oben), könnte
es nützlich
sein, die in dem Vogelisolat vorhandenen Influenzaviruspartikel
direkt für
die Impfstoffherstellung herstellen und/oder vermehren zu können. Die
vorliegende Erfindung gibt Verfahren zur Herstellung und/oder Vermehrung
von Influenzaviruspartikeln an, die in Isolaten vorhanden sind,
die von Spezies wie Vögeln,
Schweinen, Pferden und Menschen erhalten wurden, und zwar durch Überexpression
der Sialyltransferase-Proteine, die an der Glycosylierung von Zelloberflächenproteinen beteiligt
sind und die die sogenannten SAalpha2,3-Gal- und SAalpha2,6-Gal-Bindungen
in den Oligosaccharidketten erzeugen. Der hier verwendete Ausdruck "Isolate" bezieht sich vorzugsweise
auf klinische Isolate (d. h. Isolate, die von kranken Patienten
erhalten wurden). Solche klinischen Isolate werden auch als Primärisolate bezeichnet.
Primärisolate
können
Influenza-Isolate sein, die direkt zum Beispiel aus der Nase, dem
Schleim und/oder Stuhl von Menschen oder Tieren erhalten wurden,
die mit Influenzaviren infiziert sind. Isolate, die auf Eiern oder
Zellen oder auf anderen Systemen vermehrt wurden, können durch
Verfahren der vorliegenden Erfindung noch weiter produziert und/oder
vermehrt werden. Daher können
Viruspartikel, die unter Verwendung der vorliegenden Erfindung hergestellt
und/oder vermehrt werden, in Chargen vorhanden sein, die Passagen unterzogen
wurden, sind jedoch vorzugsweise in Primärchargen, wie klinischen Isolaten,
vorhanden.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung wird die Herstellung und/oder Vermehrung von Influenzaviruspartikeln
durchgeführt,
indem man Zellen in einem Kulturmedium verwendet, wobei die Zelle
mit E1 von einem Adenovirus transformiert ist. Besonders bevorzugt
ist die Zelle eine humane Zelle. In einem hochgradig bevorzugten
Aspekt gibt die Erfindung Verfahren zur Vermehrung eines Influenzaviruspartikels
gemäß der Erfindung
an, wobei die humane Zelle eine PER.C6-Zelle oder ein Derivat davon
ist.
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Es
zeigt sich, dass PER.C6-Zellen für
die Vermehrung verschiedener Arten von Viren, wie Rotavirus und
Influenzavirus, geeignet sind (siehe
WO
01/38362 ). PER.C6 wurden zuerst dadurch erzeugt, dass man Zellen,
die aus einer embryonalen Retina erhalten wurden, mit dem E1-Bereich
von Adenovirus Serotyp 5 transformierte. Es zeigte sich, dass sowohl
das alpha2,3- als auch das alpha2,6-Sialyltreansferase-Protein in PER.C6-Zellen
vorhanden und aktiv sind (Pau et al. 2001). Daher konnten Viruspartikel,
die spezifisch mit der Sialinsäure-Galactose-Bindung des 2,3-Typs
sowie des 2,6-Typs (SAalpha2,3Gal bzw. SAalpha2,6Gal) Wechselwirken,
auf PER.C6-Zellen wachsen. Es ist ein wichtiger Aspekt der Erfindung,
dass die Überexpression
eines dieser Sialyltransferase-Proteine zu einer spezifischen Vermehrung
von Mengen von Influenzaviren führt, die
entweder den SAalpha2,3Gal-Rest oder den SAalpha2,6Gal-Rest bevorzugen.
Dies ermöglicht
die Erzeugung von Viruschargen für
die Impfstoffproduktion, die den besten Gehalt für einen optimalen Schutz haben. Dieser
Gehalt kann unterschiedlich sein. Wie oben diskutiert, kommt es
zu einer gewissen Ausbreitung des Virus hauptsächlich durch Kontakt zwischen
Menschen, während
in anderen Fällen
(wie dem Hongkong-Fall von 1997) ein direkter Vogel-Mensch-Kontakt
genügte,
um eine dramatische Wirkung bei Menschen auszulösen. Je nach der Virulenz und
den Arten von Influenzaviren, die dabei eine Rolle spielen, kann
eine Wahl In Bezug darauf getroffen werden, welche Menge von Viruspartikeln
in einem Isolat vermehrt werden sollte, womit der endgültige Impfstoff
produziert wird.
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Die
vorliegende Erfindung gibt auch Verfahren zur Herstellung und/oder
Vermehrung eines Influenzaviruspartikels an, wobei die Nucleinsäure, die
die Sialyltransferase codiert, heterolog bezüglich der Zelle ist. Vorzugsweise
ist die Nucleinsäure,
die die Sialyltransferase codiert, in das Genom der Zelle integriert.
Der hier verwendete Ausdruck "heterolog" bedeutet, dass die
Nucleinsäure
so manipuliert ist, dass das die Sialyltransferase codierende Gen
eine größere Menge
des Proteins exprimiert als ohne die Manipulation. "Heterolog" bedeutet auch, dass
die Nucleinsäure
von einer anderen Spezies als der Spezies, von der die Zelle abgeleitet ist,
aber auch von derselben Spezies stammen kann. Man sagt, eine Zelle überexprimiere
die Sialyltransferase, wenn die Zelle mehr Sialyltransferase exprimiert,
als für
die Zelle typisch ist. Eine Zelle, die die Sialyltransferase überexprimiert,
kann auch das Protein durch Manipulation des Genoms der Zelle überexprimieren,
so dass das in dem Genom der Zelle vorhandene Gen eine größere Menge
des Proteins exprimiert, als die Zelle exprimierte, bevor sie manipuliert
wurde. Die Überexpression
kann durch externe Mittel, wie Integration eines anderen oder aktiveren
Promotors, durch Entfernung oder Hemmung von Suppressoren, die normalerweise die
Expression des Proteins beschränken,
oder durch chemische Mittel induziert werden. Die Überexpression kann
auch selektiert werden. Wenn Zellen bezüglich einer signifikanten Überexprimierung
wenigstens einer Sialyltransferase selektiert werden, können sie
für Verfahren
gemäß der vorliegenden
Erfindung verwendet werden. Daher ist die Verwendung solcher Zellen
ebenfalls Bestandteil der vorliegenden Erfindung.
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In
einer anderen Ausführungsform
gibt die vorliegende Erfindung Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs
an, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: Herstellen
und/oder Vermehren eines Viruspartikels gemäß Verfahren der Erfindung und
Inaktivieren der so hergestellten Viruspartikel. Vorzugsweise umfassen
die Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs weiterhin die folgenden
Schritte: Behandeln der so hergestellten Viruspartikel, so dass
man antigene Teile erhält,
und Gewinnen wenigstens eines antigenen Teils, vorzugsweise durch
Mittel zur Reinigung und/oder Anreicherung des wenigstens eines
Teils. Vorzugsweise umfasst eine gereinigte und/oder angereicherte
Zusammensetzung, die den wenigstens einen gewonnenen antigenen Teil
umfasst, keine anderen antigenen Teile der behandelten Viruspartikel.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform gibt die Erfindung
Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs an, wobei der antigene
Teil das Hämagglutininprotein
oder ein Teil davon und/oder das Neuraminidaseprotein oder ein Teil
davon des Influenzavirus umfasst. Das Neuraminidase-(NA) und das
Hämagglutininprotein
(HA) sind die herausragendsten antigenen Teile des Influenzaviruspartikels
und sind anfällig
für Unterschiede
während
verschiedener Vermehrungsschritte.
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Wie
erwähnt,
sind die Zellen der vorliegenden Erfindung äußerst nützlich für die Vermehrung von primären klinischen
Isolaten, die Influenzaviruspartikel umfassen, während die Zellen auch angewendet
werden können,
um Isolate zu vermehren, die bereits einer Passage über embryonierte
Eier oder andere Systeme unterzogen wurden, wobei man eine Selektion
von Influenzaviruspartikeln erhält,
die auf Glycoproteinen vorhandene spezifische Glycosylierungsreste
erkennen. Die vorliegende Erfindung gibt also die Verwendung einer Zelllinie,
die eine alpha-2,6-Sialyltransferase überexprimiert, zur Vermehrung
eines Viruspartikels und die Verwendung einer Zelllinie, die eine
alpha-2,3-Sialyltransferase überexprimiert,
zur Vermehrung eines Viruspartikels an. Vorzugsweise ist der Viruspartikel
ein Influenzaviruspartikel. Besonders bevorzugt ist der Influenzaviruspartikel
in einem Influenza-Isolat vorhanden, das aus wenigstens einem Influenza-infizierten
Säugerpatienten
erhalten wird. Ganz besonders bevorzugt sind Verwendungen der Zelllinie
gemäß der vorliegenden
Erfindung, bei denen der Influenza-infizierte Säugerpatient ein Mensch oder
ein Schwein ist, während es
außerdem bevorzugt
ist, dass der Influenzaviruspartikel in einem Influenza-Isolat vorhanden
ist, das aus wenigstens einem Influenza-infizierten Vogel erhalten
wird.
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Die
vorliegende Erfindung gibt weiterhin ein Verfahren zur selektiven
Herstellung und/oder Vermehrung einer Menge von vorbestimmten Viruspartikeln,
die in einem Isolat vorhanden sind, an, wobei die Menge von vorbestimmten
Viruspartikeln eine Präferenz
für eine
spezifische Glycosylierungs-Struktureinheit hat, die an einem Rezeptor
vorhanden ist, und wobei das Isolat außer der Menge auch Viruspartikel
umfasst, die die Präferenz
nicht aufweisen, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:
Inkubieren einer Zelle, die den Rezeptor, der die spezifische Glycosylierungs-Struktureinheit
umfasst, exprimieren und exponieren kann, mit dem Isolat in einem
Kulturmedium unter Bedingungen, die zur Infektion der Zelle durch
wenigstens einen Viruspartikel führen,
der in der Menge vorhanden ist; Kultivieren der Zelle unter Bedingungen,
die zur Vermehrung des Viruspartikels führen; und Ernten der so produzierten
Viruspartikel aus der Zelle und/oder dem Kulturmedium. Der hier
verwendete Ausdruck "Glycosylierungs-Struktureinheit" bezieht sich auf
irgendeine Art von Rest, Bindung und/oder Gruppe von Zuckerarten,
die in einer Oligosaccharidkette an einem Glycoprotein vorhanden
sind, das zur Infektion von einem Viruspartikel erkannt wird. Vorzugsweise
umfasst die Glycosylierungs-Struktureinheit einen SAalpha2,6Gal-Rest
oder einen SAalpha2,3Gal-Rest. Besonders bevorzugt sind Verfahren,
bei denen die Menge von vorbestimmten Viruspartikeln eine Menge
von vorbestimmten Influenzaviruspartikeln ist. Der SAalpha2,6Gal-Rest
und der SAalpha2,3Gal-Rest werden im Falle einer Grippe spezifisch
vom HA-Protein des Viruspartikels erkannt. Es hängt vom HA-Protein ab, ob es
eine Spezifität
der Wechselwirkung mit einem der beiden Reste gibt. Im Allgemeinen
umfassen Influenza-Isolate Viren, die spezifisch mit dem SAalpha2,6Gal-Rest
Wechselwirken, sowie Viren, die spezifisch mit dem SAalpha2,3Gal-Rest
Wechselwirken. Mit der vorliegenden Erfindung ist es nun möglich, eine
der beiden Mengen von Viren aus klinischen, primären und/oder einer Passage
unterzogenen Isolaten selektiv zu vermehren und so vermehrte Gruppen von
Viren zu erhalten, die für
die Herstellung eines bei Menschen geeigneten Influenza-Impfstoffs
geeignet sind. Neben der Tatsa che, dass Impfstoffe für Menschen
hergestellt werden können,
ist es auch möglich,
unter Verwendung von Verfahren und Mitteln der vorliegenden Erfindung
selektiv Viren für
die Herstellung von Veterinäranwendungen
zu vermehren, um zum Beispiel die Ausbreitung von Influenzaviren
in Schweine- oder Pferdepopulationen zu verhindern. Vorzugsweise
wird das Influenza-Isolat aus wenigstens einem Influenza-infizierten
Menschen, Schwein oder Vogel erhalten. Es ist außerdem bevorzugt, dass die
Zelle eine humane Zelle ist und dass sie mit E1 aus Adenovirus transformiert
ist. Hochgradig bevorzugt sind Zellen, bei denen es sich um PER.C6-Zellen
oder Derivate davon handelt. Der hier verwendete Ausdruck "Derivate" bezieht sich auf
modifizierte Versionen der ursprünglichen
PER.C6-Zellen, in die zum Beispiel andere heterologe Nucleinsäuren eingeführt, ausgeschaltet
oder in anderer Weise modifiziert sind. Nichteinschränkende Beispiele
für PER.C6-Derivate
sind PER.C6-Zellen, die stabil eine temperaturempfindliche Mutante
von Adenovirus E2A exprimieren oder die andere Adenovirus-Nucleinsäuren, wie
E4, exprimieren. Wenn bestimmte Nucleinsäuren in PER.C6-Zellen durch
andere Mittel, wie chemische Behandlung oder Knock-Out-Techniken, ein-
oder ausgeschaltet wurden, bleiben dieser Zellen dennoch PER.C6-Derivate.
Die angegebenen Beispiele beschreiben zwar die Verwendung von Zellen,
die das Protein Erythropoietin (EPO) überexprimieren, doch sei angemerkt, dass
es nicht Bestandteil der Erfindung ist, dass es eine Überexpression
von EPO in den Zellen der Erfindung gibt.
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In
einer anderen bevorzugten Ausführungsform
gibt die Erfindung Verfahren zur selektiven Vermehrung einer Menge
von Viruspartikeln, die in einem Isolat vorhanden sind, an, wobei
die Zelle eine Nucleinsäure umfasst,
die eine Sialyltransferase codiert, welche heterolog in Bezug auf
die Zelle ist. Ganz besonders bevorzugt sind Verfahren gemäß der vorliegenden
Erfindung, bei denen die Nucleinsäure, die eine Sialyltransferase codiert,
in das Genom der Zelle integriert ist. Eine solche integrierte Nucleinsäure wird
vorzugsweise durch die Verwendung von Selektionsmarkern, wie das
Hygromycin- und das Neomycin-Resistenz-Gen,
stabil integriert.
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Ebenfalls
bereitgestellt werden humane Zellen, die eine heterologe Nucleinsäure umfassen,
die eine alpha2,6-Sialyltransferase oder eine alpha2,3-Sialyltransferase
codiert. Vorzugsweise ist die Nucleinsäure in das Genom der humanen
Zelle integriert. Die Erfindung gibt auch die Verwendung solcher
Zellen für
die selektive Vermehrung von Viruspartikeln an, bei denen es sich
vorzugsweise um Influenzaviruspartikel handelt.
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Ebenfalls
angegeben wird die Optimierung eines Verfahrens zur Vermehrung von
Primärisolaten
von Humaninfluenzavirus und die Optimierung eines Verfahrens zur
Vermehrung von Primär-
sowie Laborisolaten von Influenzaviren unter Verwendung der SAalpha2,6Gal-
oder SAalpha2,3Gal-Glycosylierungs-Struktureinheiten (oder beider),
die an Glycoproteinen der Zelloberfläche vorhanden sind. Im Allgemeinen
erkennen Humaninfluenzaviren die SAalpha2,6Gal-Struktureinheit,
während
die Vogelinfluenzaviren die SAalpha2,3Gal-Struktureinheit erkennen.
Die Schweineinfluenzaviren verwenden im Allgemeinen beide Reste.
Die Erfindung gibt die Optimierung eines Verfahrens zur Vermehrung
jedes Virus an, dessen Replikation von der Aktivität von alpha2,3-Sialyltransferase
und/oder alpha2,6-Sialyltransferase oder allgemeiner von der Anwesenheit
von SAalpha2,3Gal- oder SAalpha2,6Gal-Resten abhängt. Die Verfahren der vorliegenden
Erfindung umfassen die Verwendung von Zellen in einem Kulturmedium.
Als Beispiel für
ein solches Verfahren wurden humane Zellen genommen, die bekanntermaßen eine
effiziente Replikation und Produktion von Influenzaviren unterstützen.
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Die
Zellen, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet
werden, sind nicht nur für
die Herstellung von Influenzaviren geeignet. Es ist in der Technik
wohlbekannt, dass auch andere Viren, wie das Adeno-assoziierte Virus
(AAV), humanes Polyomavirus und Parainfluenzaviren, die alpha2,3-
und die alpha2,6-Bindung in Glycoproteinen für die Infektion verwenden (Liu
et al. 1998; Suzuki et al. 2001; Walters et al. 2001). Daher gibt
die vorliegende Erfindung auch Verfahren für die (selektive) Herstellung
und/oder Vermehrung von anderen Viren an, die diese Glycosylierungsstrukturen
für die
Erkennung und Infektion der angesteuerten Zelle verwenden. Weiterhin
gibt die Erfindung die Verwendung der Zellen und der Verfahren und Mittel
für die
Herstellung von anderen Viren als Influenzaviren und gegebenenfalls
für die
Herstellung von Impfstoffen gegen solche Viren an. Ebenfalls bereitgestellt
werden Impfstoffe gegen Viren, die den SAalpha2,3Gal- und den SAalpha2,6Gal-Rest
für die
zelluläre
Erkennung und Infektiosität
verwenden.
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Es
wurde schon früher
nachgewiesen, dass PER.C6
TM-Zellen (ECACC-Hinterlegung
96022940) ein ideales Substrat für
die Vermehrung von Influenzaviren darstellen und dass die Produktionsniveaus
ausgehend von PER.C6 zu Präparaten
mit hohem Titer führen,
die für
Impfungszwecke geeignet sind (
WO 01/38362 ).
Eine neue hier offenbarte Zelllinie, die "PER.C6-alpha2,6ST" heißt, ist durch das folgende
Verfahren von PER.C6 abgeleitet: Mit einem Plasmid, das eine Nucleinsäure beherbergt,
die humane alpha2,6-Sialyltransferase unter der Kontrolle des starken
CMV-Promotors codiert, wurden PER.C6-Zellen transfiziert, und die
Zellen wurden anschließend
in Bezug auf eine stabile Integration des Plasmids selektiert. Die PER.C6-alpha2,6ST-Zellen
sind durch die höhere
Expression von SAalpha2,6Gal-haltigen Rezeptoren im Vergleich zu
der Zahl von Rezeptoren, die den SAalpha2,6Gal-Rest tragen, in den
ursprünglichen
PER.C6-Zellen gekennzeichnet.
Dies impliziert nicht direkt, dass die Proteine, die solche Struktureinheiten
tragen, überexprimiert
werden, aber dass der Prozentsatz von Proteinen, die den SAalpha2,6Gal-Rest
tragen, höher
ist als der Prozentsatz solcher Proteine in PER.C6-Zellen. PER.C6-Zellen
sind ohne Überexpression
der alpha2,6-Sialyltransferase bereits in der Lage, sowohl SAalpha2,3Gal-
als auch SAalpha2,6Gal-Reste auf Glycoproteinen der Zelloberfläche zu exprimieren.
Es ist jedoch ein wichtiger Aspekt der vorliegenden Erfindung, den
Prozentsatz an Proteinen, die den SAalpha2,6Gal-Rest tragen, im
Vergleich zu dem Prozentsatz an Proteinen, die den SAalpha2,3Gal-Rest
tragen, zu erhöhen.
Aufgrund von direkter Substratkonkurrenz in der intrazellulären Glycosylierungsmaschinerie
werden Rezeptoren des SAalpha2,3Gal-Typs auf der Zelloberfläche von
Zellen, die das alpha2,6-Sialyltransferase-Protein überexprimieren,
unterrepräsentiert.
Aufgrund dieser kombinierten Merkmale ist diese neue Zelllinie ein
ideales Medium für
die Vermehrung von primären
Influenzavirusisolaten, ohne einen Selektionsdruck in der Wildtyppopulation
zu induzieren. Die Vermehrung solcher Isolate auf den Zellen der
vorliegenden Erfindung führt
zu einer effizienten Produktion von großen Virusvorräten mit
unveränderter
HA-Spezifität
und Immunogenität,
die für
die Herstellung von Impfstoffen in hohem Maße geeignet sind. Da in PER.C6-alpha2,6ST
produziertes Virus keine Mutationen aufweist, die aus der Adaptation
an den SAalpha2,3Gal-Rezeptor resultieren (wie im Falle von embryonierten
Eiern), sind die immunogenen Eigenschaften dieses Virus am besten
mit denen von natürlich
zirkulierenden Influenzaviren vergleichbar. Folglich sind Impfstoffpräparate,
die von auf PER.C6-alpha2,6ST gezüchteten Influenzaviren erhalten
werden, ideal geeignet, um eine schützende Antwort gegen zirkulierendes
Wildtyp-Influenzavirus zu induzieren. In der Technik ist bekannt,
dass humane Influenzaviren von dem Typ sind, der die SAalpha2,6Gal-Bindungehn erkennt, und
daher ist in der Technik anerkannt, dass man Impfstoffe erhalten
möchte,
die Proteine von diesen Viren umfassen, um beim Menschen eine besser
schützende
Immunantwort hervorzurufen (Newman et al. 1993).
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Wenn
humane Influenzaviren über
embryonierte Hühnereier
vermehrt werden, werden Virusvarianten selektiert, die spezifisch
an SAalpha2,3Gal binden können,
und die SAalpha2,6Gal-erkennenden Viren werden ausselektiert. PER.C6-Zellen haben sowohl
SAalpha2,6Gal- als auch SAalpha2,3Gal-haltige Rezeptoren an ihrer
Oberfläche.
Für eine
bevorzugte Vermehrung der SAalpha2,6Gal-erkennenden Viren gibt es
daher vorzugsweise eine Überexpression
von Rezeptoren, die diese Komponente beherbergen, wie oben diskutiert wird.
Um die Wirkung des Gegenteils zu bestimmen, nämlich der Überexpression von humaner alpha2,3-Sialyltransferase,
gibt die vorliegende Erfindung auch Verfahren und Mittel zur Erzeugung
einer weiteren neuen Zelllinie namens "PER.C6-alpha2,3ST" an. Diese Zellen sind in ähnlicher
Weise, wie es oben für
die PER.C6-alpha2,6ST-Zellen beschrieben ist, durch Transfektion
eines Plasmids abgeleitet, das eine Nucleinsäure beherbergt, die humane
alpha2,3-Sialyltransferase
unter der Kontrolle des starken CMV-Promotors codiert, und danach
werden Zellen selektiert, die eine stabile Integration des Plasmids
tragen. Eine PER.C6-alpha2,3ST-Zelle ist durch die höhere Expression
von SAalpha2,3Gal-haltigen Rezeptoren gekennzeichnet.
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Sowohl
Zelllinien, die alpha2,6-Sialyltransferase, als auch solche, die
alpha2,3-Sialyltransferase überexprimieren,
sind geeignet, da alpha2,6-Sialyltransferase überexprimierende Zellen für die Vermehrung
von Influenzaviren verwendet werden können, die vorzugsweise den
SAalpha2,6Gal-Rest erkennen, während
die alpha2,3-Sialyltransferase überexprimierenden
Zellen für
die Vermehrung von Influenzaviren verwendet werden können, die
vorzugsweise den SAalpha2,3Gal-Rest erkennen. Wenn die Infektion
und die Ausbreitung der Viren hauptsächlich über Kontakt zwischen Menschen
erfolgen und die Viren besser an den Infektionsweg über die
SAalpha2,6-Gal-Reste angepasst werden, wird vorzugsweise die alpha2,6-Sialyltransferase überexprimierende
Zelllinie angewendet. Wenn die Infektiosität andererseits direkt von Vögeln, die
keine Glycoproteine aufweisen, welche den SAalpha2,3Gal-Rest beherbergen,
auf Menschen erfolgt (wie bei der kleinen, aber schweren Epidemie
in Hongkong im Jahre 1997), werden vorzugsweise Zellen angewendet,
die die alpha2,3-Sialyltransferase überexprimieren.
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Die
hier verwendeten Ausdrücke "alpha2,3-Sialyltransferase" oder "alpha2,3-Sialyltransferase" beziehen sich auf
die jeweiligen Transferasen und auch auf Äquivalente der Transferase,
wobei die Äquivalente
dieselbe Art, aber nicht unbedingt dieselbe Menge von Transferase-Aktivität umfassen
wie die Transferase, zu der sie äquivalent
sind. Geeignete Äquivalente
können
vom Fachmann erzeugt werden. Ein Teil der Transferase ist ein geeignetes Äquivalent,
wenn es dieselbe Art, aber nicht unbedingt dieselbe Menge von Transferase-Aktivität umfasst.
Weitere geeignete Äquivalente
sind Derivate und/oder Analoga von alpha2,3-Sialyltransferase oder
alpha2,3-Sialyltransferase, die dieselbe Art, aber nicht unbedingt
dieselbe Menge von Transferase-Aktivität umfassen wie die Transferase,
zu der sie äquivalent
sind. Solche Derivate können
durch konservative Aminosäuresubstitution
oder auf andere Weise erzeugt werden. Ein Derivat kann auch aus
einem Teil der jeweiligen Transferasen hergestellt werden.
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Der
hier verwendete Ausdruck "Influenzaviruspartikel" kann einen Influenzaviruspartikel
oder einen influenzavirusartigen Partikel beschreiben. Ein Äquivalent
eines Influenzaviruspartikels ist ein Viruspartikel (virusartiger
Partikel), der dieselbe Art, aber nicht unbedingt dasselbe Ausmaß an Infektiositätseigenschaften umfasst
wie ein Influenzaviruspartikel. Solche Äquivalente können zum
Beispiel durch rekombinante Mittel erzeugt werden. Solche Äquivalente
können
Moleküle
umfassen, die in einem Influenzavirus nicht typischerweise vorhanden
sind.
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Beispiele
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Beispiel 1. Konstruktion von pAlpha2,6ST2000/Hygro.
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Das
Fragment, das die Sequenz enthält,
die für
alpha2,6-Sialyltransferase codiert, wurde durch EcoRI-Verdau des
Plasmids pGST-Gal erhalten (einer Spende von Dr. I. van Die, Freie
Universität
Amsterdam; das Plasmid besteht aus einem pBR322-Gerüst, das
die gesamte cDNA-Sequenz enthält,
die für
Ratten-alpha2,6-Sialyltransferase codiert, GenBank-Zugriffs-Nr.
M18769). Das Fragment wurde nach Standardverfahren mit T4-DNA-Polymerase
mit glatten Enden versehen. Nach der Gelreinigung wurde das alpha2,6-Sialyltransferasecodierende
Fragment in pcDNA2000/Hygro (auch als Plasmid pcD-NA2000/Hyg(-)bekannt,
das in
WO 00/63403 beschrieben
wurde) ligiert, das mit PmeI linearisiert, dephosphoryliert und
nach Standardlaborverfahren gelgereinigt worden war. Das resultierende
Plasmid wurde pAlpha2,6ST2000/Hygro genannt (
1).
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Beispiel 2. Transfektion von PER.C6-EPO
mit pAlpha2,6ST2000/Hygro und Selektion von überexprimierenden Klonen
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PER.C6-EPO
wurde anfangs für
andere Zwecke erzeugt, nämlich
für Experimente,
die sich auf die Glycosylierung von Erythropoietin (EPO) konzentrierten.
EPO ist ein Protein, das an der Stimulation der Erythropoese beteiligt
ist, und seine Aktivität
hängt für die in-vivo-Funktionalität stark
von seinem Sialinsäuregehalt
ab. Die PER.C6-EPO-Zelllinie ist ein Derivat von PER.C6 und überexprimiert
das humane EPO-Protein (die Zellen sind in
WO 00/63403 beschrieben). Die Tatsache,
dass diese Zelllinie EPO produziert, ist für die vorliegende Erfindung vermutlich
nicht entscheidend. PER.C6-EPO-Zellen wurden mit pAlpha2,6ST-2000/Hygro kultiviert
und transfiziert, wie es unten beschrieben ist.
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PER.C6-Zellen
wurden in Gewebekulturschalen (10 cm Durchmesser) mit ungefähr 2–3 Millionen
Zellen/Schale ausgesät
und wurden über
nacht bei 37°C
und 10% CO
2 gehalten. Am nächsten Tag
werden die Zellen mit Hilfe von Lipofectamine (Gibco) nach den Anweisungen
des Herstellers transfiziert. Zwanzig Schalen wurden jeweils mit
2 μg pAlpha2,6ST2000/Hygro
transfiziert, alle nach Standardvorschriften, die dem Fachmann wohlbekannt
sind. Weitere 6 Schalen dienten als negative Kontrollen für die Abtötung durch
Hygromycin und die Transfektionseffizienz. Am nächsten Tag wurde Hygromycin
in einer Konzentration von 50 μg/ml, gelöst in einem
FBS-haltigen DMEM-Medium, zu den Schalen gegeben. Die Zellen wurden über einen
Zeitraum von 3–4
Wochen inkubiert, wobei die Zellen regelmäßig mit frischem Medium, das
mit Hygromycin ergänzt
war, gewaschen wurden. Die Zellen wurden täglich in Bezug auf Abtötung überwacht,
wobei mit den negativen Kontrollen verglichen wurde, die die Plasmide,
welche die Hygromycin-Selektionsmarker beherbergten, nicht erhielten.
Die auswachsenden Kolonien wurden herausgesucht und subkultiviert,
und zwar im Allgemeinen so, wie es in
WO 00/65403 für Erythropoietin und Antikörper überexprimierende
Zelllinien beschrieben ist.
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Anschließend wurden
ungefähr
25 ausgewählte
antibiotikumresistente Kolonien in Platten mit 24 Näpfen, 6
Näpfen
und T25-Kolben ohne Hygrornycin gezüchtet. Wenn die Zellen das
Wachstum in T75-Gewebekulturkolben erreichten, wurde wenigstens
ein Vial von jedem Klon eingefroren und als Ersatz gelagert. Die Klone
wurden anschließend
durch FACS-Analyse mit einer FACsort-Apparatur (Becton Dickinson)
auf alpha2,6ST-Aktivität
getestet, wobei Verfahren verwendet wurden, die zuvor von Govorkova
et al. (1999) beschrieben wurden. Dazu wurde das SAalpha2,6Gal-spezifische
Agglutinin von Sambucus nigra (DIG Glycan Differentiation Kit, Roche)
gemäß den Anweisungen
des Herstellers verwendet. Diese Klone wurden in einer Zeitspanne
von zwei Monaten subkloniert, und währenddessen wurden regelmäßig FACS-Analyse-Experimente
durchgeführt,
um die Expression von alpha2,6-Sialyltransferase auf der Zelloberfläche zu überwachen. Die
erhöhte
Expression von SAalpha2,6Gal war stabil. Der beste alpha2,6-Sialyltransferase-exprimierende Klon
gemäß einer
Bewertung der höchsten
Dichte von SAalpha2,6Gal auf der Zelloberfläche war der Klon 25-3.10. Dieser
Klon wurde "PER.C6-alpha2,6
ST" genannt. Die
Ergebnisse in 4A zeigen eine FACS-Analyse
von PER.C6-alpha2,6 ST am Ende des Selektionsvorgangs. Es ist zu
sehen, dass die stabile Transfektion von pAlpha2,6ST2000/Hygro zu
merklich erhöhten
Mengen an SAalpha2,6Gal-Resten auf der Zelloberfläche im Vergleich
zur maternalen PER.C6-Zelllinie führt. Interessanterweise scheint
die Überexpression
von alpha2,6-Sialyltransferase auch zu geringeren Mengen an SAalpha2,3Gal-Resten
zu führen,
was durch FACS unter Verwendung von alpha2,3Gal-spezifischem Agglutinin
von Maackia amurensis (4B) nachgewiesen wird.
Diese Wirkung ist höchstwahrscheinlich
auf die Konkurrenz von alpha2,6-Sialyltransferase mit endogener
alpha2,3-Sialyltransferase um dasselbe Glycoprotein-Substrat zurückzuführen.
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Beispiel 3. Erzeugung von alpha2,6- und
alpha2,3-Sialyltransferase-cDNA-Expressionsvektoren
-
Ein
PCR-Fragment, das die volle Länge
der cDNA von humaner alpha2,6-Sialyltransferase
enthält (GenBank-Zugriffs-Nr.:
14735135) wird durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) an einer humanen
cDNA-Bibliothek erhalten, wobei man Verfahren verwendet, die dem
Fachmann wohlbekannt sind. Die für
die Amplifikation verwendeten Primer (Sense: 5'-TTT TTT GGA TCC ATG ATT CAC ACC AAC
CTG AAG AAA AAG-3', Antisense:
5'-PTT TTT CTT AAG
PTA GCA GTG AAT GGT CCG GAA GC-3')
enthalten einen zusätzlichen 5'-Schwanz, der einen
Verdau mit BamHI beim Sense-Primer bzw. mit AflII beim Antisense-Primer
ermöglicht. Das
PCR-Produkt wird durch Agarose-Gel-Elektrophorese gereinigt und
mit BamHI und AflII verdaut und anschließend in pcDNA2000/Hygro (in
WO 00/63403 beschrieben
als pcDNA2000/Hyg(-)) und in pcDNA2000/Neo (dieser Vektor war grundsätzlich genauso
aufgebaut wie pcDNA2000/Hyg(-) aus pcDNA2000/DHFR, das ausführlich in
WO 00/63403 beschrieben
ist) kloniert. Dazu wurden pcDNA2000/Hygro und pcDNA2000/Neo auch
mit den Restriktionsenzymen BamHI und AflII verdaut. Die Sequenz
und die korrekte Klonierung werden durch doppelsträngige Sequenzierung
gemäß Standardverfahren,
die dem Fachmann auf dem Gebiet der Molekularbiologie bekannt sind, überprüft. Die
resultierenden Plasmide werden pAlpha2,6STcDNA2000/Hygro (
2A)
und pAlpha2,6STcDNA2000/Neo (
2B) genannt.
Sie umfassen Nucleinsäure,
die humane alpha2,6-Sialyltransferase unter der Kontrolle des verlängerten
CMV-Promotors (siehe
WO 00/63403 )
codiert. Weiterhin verleihen die Plasmide Resistenz gegen Neomycin
bzw. Hygromycin, die verwendet werden, um Klone zu selektieren,
die das Plasmid stabil in ihr Genom integriert haben.
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Die
cDNA von humaner alpha2,3-Sialyltransferase (GenBank-Zugriffs-Nr.
L23767) wird so erhalten und kloniert, wie es oben für das humane
alpha2,6-Sialyltransferase-Gen
beschrieben ist. Die Primer, die für die PCR-Reaktion verwendet
werden, sind: Sense 5'-TTT
TTT GGA TCC ATG TGT CCT GCA GGC TGG AAG CTC-3' und Antisense 5'-TTT TTT CTT AAG TCA GAA GGA CGT GAG
GTT CTT GAT AG-3'.
Die resultierenden Plasmide werden pAlpha2,3STcDNA-2000/Hygro (3A)
und pAlpha2,3STcDNA2000/Neo (3B) genannt.
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Beispiel 4. Erzeugung von stabilen PER.C6-Zellen,
die entweder humane alpha2,6- oder humane alpha2,3-Sialyltransferase überexprimieren
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Zellen
der PER.C6-Zelllinie werden in 40 Gewebekulturschalen (10 cm Durchmesser)
mit ungefähr 2–3 Millionen
Zellen/Schale ausgesät
und über
Nacht bei 37°C
und 10% CO
2 gehalten. Am nächsten Tag
werden Zellen mit Hilfe von Lipofectamin (Gibco) nach den Anweisungen
des Herstellers und nach Standardkulturverfahren, die dem Fachmann
bekannt sind, transfiziert. Zwanzig Schalen werden jeweils mit 5 μg pAlpha2,6STcDNA2000/Neo
transfiziert. Weitere 20 Schalen mit nichttransfizierten Zellen
dienen als negative Kontrollen für
die Abtötung
durch Neomycin und die Transfektionseffizienz. Am nächsten Tag
wird Neomycin (0,5 mg/ml), gelöst
in FBS-haltigem Medium, zu den geeigneten Schalen gegeben. Die Zellen
werden über einen
Zeitraum von 4–5
Wochen inkubiert, wobei die Zellen regelmäßig mit frischem Medium, das
mit dem Selektionsmittel ergänzt
ist, gewaschen werden. Die Zellen werden täglich in Bezug auf Abtötung überwacht,
wobei mit den negativen Kontrollen verglichen wird, die die Plasmide,
welche die Selektionsmarker Neomycin und Hygromycin beherbergen,
nicht erhalten. Die auswachsenden Kolonien werden herausgesucht
und subkultiviert, und zwar im Allgemeinen so, wie es in
WO 00/65403 für Erythropoietin
und Antikörper überexprimierende Zelllinien
beschrieben ist.
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Von
jeder Zelllinie werden anschließend
ungefähr
50 ausgewählte
neomycinresistente Kolonien in Platten mit 96 Näpfen, 24 Näpfen, 6 Näpfen und T25-Kolben mit Neomycin
gezüchtet.
Wenn die Zellen das Wachstum in T25-Gewebekulturkolben erreichen,
wird wenigstens ein Vial von jedem Klon eingefroren und als Ersatz
gelagert. Jeder Klon wird anschließend durch FACS-Analyse auf
die Produktion von rekombinanter humaner alpha2,6-Sialyltransferase
getestet, wobei das SAalpha2,6Gal-spezifische Agglutinin von Sambucus
nigra verwendet wird, wie es von Govorkova et al. (1999) beschrieben
ist. Die folgende Selektion von Klonen, die gute Produzenten sind,
beruht auf Expression, Kulturverhalten und Lebensfähigkeit.
Um eine Überprüfung der
langfristigen Lebensfähigkeit,
Suspensionswachstum in Rollflaschen und Bioreaktor während längerer Zeiträume zu ermöglichen,
werden weitere Vials der leistungsfähigsten Klone eingefroren und
für die
weitere Untersuchung selektiert. Diese Klone werden in einer Zeitspanne
von zwei Monaten subkultiviert. Während dieser zwei Monate werden
regelmäßig FACS-Analyse-Experimente
durchgeführt,
um die Expression von alpha2,6-Sialyltransferase auf der Zelloberfläche zu überwachen.
Der beste stabile Produzent wird ausgewählt und für die Zellbankbildung verwendet.
Dieser Klon wird expandiert, um eine Zelllinie zu erzeugen, die PER.C6-H-alpha2,6
ST genannt wird.
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Zelllinien,
die das humane alpha2,3-Sialyltransferase-Protein überexprimieren,
werden im Allgemeinen genauso erzeugt, wie es oben für die humane
alpha2,6-Sialyltransferase überexprimierenden
PER. C6-Zellen beschrieben ist. In diesem Fall wird das Plasmid
pAlpha2,3STcDNA2000/Neo verwendet. Die resultierende Zelllinie wird
PER.C6-H-alpha2,3 ST genannt.
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Beispiel 5. Zellkultur und Infektion mit
primären
und adaptierten Influenzavirusisolaten in PER.C6-Zellen und in alpha2,6-Sialyltransferase überexprimierenden
PER.C6-Zellen
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Experimente
wurden durchgeführt,
um die Infektionsanfälligkeit
von PER.C6 mit der von PER.C6-alpha2,6 ST zu vergleichen. Suspensionskulturen
von PER.C6 und PER.C6-alpha2,6 ST wurden in serumfreiem ExCeII-525-Medium
(JRH Biosciences), das mit 4 mM L-Glutamin (Gibco) ergänzt war,
bei 37°C und
10% CO2 in 490-cm2-Gewebekultur-Rollflaschen
bei ständiger
Drehung mit 1 U/min durchgeführt.
Das unten beschriebene Verfahren wurde auf alle angegebenen Influenza-Infektionen
angewendet. Am Tag der Infektion wurden die Zellen in 6-Napf-Platten in einer
Dichte von 1 × 106 Zellen/ml in einem Endvolumen von 2 ml
serumfreiem Medium, das 2 mg/ml Pen/Strep (Gibco), 200 ng/ml Fungizone
(Gibco) und 3 pg/ml Trypsin-EDTA (Gibco) enthielt, ausgesät. Zellen
wurden mit einem viralen Inokulum eines Primärisolats und mit einer PER.C6-adaptierten Charge
(abgeleitet vom Primärisolat
und 1 Passage in PER.C6-Zellen unterzogen) infiziert. Das verwendete
Primärisolat
ist A/Netherlands/002/01 (H1N1, A/New-Caledonia-ähnlich, Spende von Prof. Dr.
A. Osterhaus, Universität
Rotterdam). Beide Chargen wurden in einer Verdünnung von 10–2 v/v
verwendet. Infizierte Zellen wurden sechs Tage lang in statischer
Kultur bei 35°C
in 10% CO2 gehalten. Während des gesamten Experiments
wurden virale Überstände gewonnen
und anschließend
geklärt.
Die Klärung
wurde durchgeführt,
indem man die Zellen 5 min lang in einer Mikrofuge mit 5000 U/min
bei Raumtemperatur sedimentierte. Zellsedimente wurden durch direkten
Immunfluoreszenz-Assay, wie er unten beschrieben ist, analysiert. Überstände wurden
in ein neues Eppendorf-Röhrchen übergeführt, in
flüssigem
N2 schnell eingefroren und bis zur Verwendung
bei Plaque-Assays (siehe unten) bei –80°C gelagert.
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Beispiel 6. Immunfluoreszenz-Test
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Direkte
Immunfluoreszenz(IF)-Assays für
den Nachweis einer Infektion mit Influenzavirus wurden bei infizierten
Zellen (siehe oben) unter Verwendung des IMAGENTM-Influenza-Virus-A-and-B-Kits
(Dako) nach den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Kurz
gesagt, infizierte Zellen wurden 5 min lang zentrifugiert. Der Überstand
wurde entfernt, und das Sediment wurde in PBS resuspendiert. Dies
wurde zweimal wiederholt, um die Zellen gründlich zu waschen. Das gewaschene
Zellsediment wurde in PBS resuspendiert, und 20 μl Zellsuspension wurden in jeden
von zwei Näpfen
eines IF-Objektträgers
gegeben. Man ließ bei
Raumtemperatur trocknen. Die Zellen wurden durch Zugabe von 20 μl Aceton
in jeden Napf fixiert und an der Luft getrocknet. In jeden Napf
wurden 20 μl
des geeigneten IMAGEN-Influenza-Reagens (d. h. markierter Antikörper, spezifisch
für Influenza
A oder B) gegeben. Dann wurde der Objektträger 15 min lang bei 37°C auf einem
feuchten Papiertuch inkubiert. Überschüssiges Reagens
wurde mit PBS weggewaschen und dann 5 min lang in PBS gespült. Der
Objektträger
wurde bei Raumtemperatur an der Luft getrocknet. Ein Tropfen IMAGEN-Montageflüssigkeit
wurde in jeden Napf gegeben, und ein Deckglas wurde auf den Objektträger gelegt
(es wurde mit einer kleinen Menge Nagellack an Ort und Stelle gehalten).
Proben wurden mikroskopisch mit Epifluoreszenz-Beleuchtung beobachtet. Die infizierten
Zellen waren durch eine helle apfelgrüne Fluoreszenz gekennzeichnet.
Der ungefähre
Prozentsatz von Zellen, die sich als positiv erwiesen (grüne Fluoreszenz),
im Vergleich zu negativen (rot) Zellen wurde aufgezeichnet. Die
Ergebnisse sind in 5 gezeigt. Es ist offensichtlich,
dass PER.C6-alpha2,6 ST die Replikation des klinischen Isolats (weiße Balken)
effizient unterstützte.
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Beispiel 7. Plaque-Assay
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Die
Virusproduktion in PER.C6 und PER.C6-alpha2,6 ST wurde untersucht,
indem man eine Punktzahl für
die Plaquebildung in mit Virusüberständen geimpften
MDCK-Zellen (Madin-Darbin-Hundenierenzellen) vergab. MDCK-Zellen
sind für
solche Plaque-Assay-Experimente besonders gut geeignet. Mit insgesamt
1 ml 10fach verdünnten
viralen Überständen von
primärem
und PER.C6-Passagen unterzogenem Influenzavirus, die beide nach
den in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren in PER.C6 und PER.C6-alpha2,6
ST vermehrt wurden, wurden MDCK-Zellen
geimpft, die in 6-Napf-Platten in DMEM, das mit 2 mM L-Glutamin
ergänzt
war, bis zu 95% Konfluenz gezüchtet
wurden. Nach 1 h bei 37°C
wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen und mit 3 ml Agarose-Mischung
(1,2 ml 2,5% Agarose, 1,5 ml 2 × MEM,
30 μl 200
mM L-Glutamin, 24 μl
Trypsin-EDTA, 250 μl
PBS) überladen.
Dann wurden die Zellen ungefähr
3 Tage lang in einer feuchten Atmosphäre mit 10% CO2 bei
37°C inkubiert,
und virale Plaques wurden visuell bewertet und gezählt. Die
Ergebnisse sind in 6 gezeigt. Das klinische Isolat
von Influenzavirus (weiße
Balken) und das PER.C6-Passagen unterzogene Virus (graue Balken)
konnten die PER.C6-alpha2,6-ST-Zellen sehr effizient infizieren
(rechte Graphik), während
PER.C6-Zellen (linke Graphik) für
eine Infektion durch das primäre
klinische Isolat nicht sehr anfällig waren.
Dies zeigt, dass Zellen, die die alpha2,6-Sialyltransferase überexprimieren,
besonders gut geeignet sind, um primäre Virusisolate zu vermehren,
und es zeigt, dass diese Zellen in schnellen und sicheren Verfahren
zur Herstellung von Impfstoffen gegen zum Beispiel Influenzainfektion äußerst nützlich sind.
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Beispiel 8. Titration von Influenzaviruspartikeln
mit Hilfe von PER.C6-Zellen in FACS
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Ein
neues Verfahren auf FACS-Basis wurde eingesetzt, um den Titer von
Influenzavirus in Überständen zu
messen. Das Verfahren führt
zur Quantifizierung von replikationskompetenten Virionen durch Nachweis des
Bruchteils der Zellen, die innerhalb der ersten Runde der viralen
Replikation produktiv infiziert werden. Unter Verwendung einer Suspensionskultur
von PER.C6 und einer M. O. I. zwischen 0,01 und 1 ist es möglich, innerhalb
weniger Stunden sehr genaue Werte zu erhalten. Dieselbe Titration
durch Plaque-Assay mit MDCK-Zellen, was zurzeit der Standardassay
für die
Influenzavirustitration ist, der von vielen Fachleuten verwendet
wird, ist viel langwieriger (im Allgemeinen fast zwei Wochen), aufwändiger und
insbesondere weniger gut reproduzierbar. Was folgt, ist die technische
Beschreibung der eingesetzten Materialien und Verfahren. Hier wird
gezeigt, dass Suspensionszellen für die Titration von Influenzaviruspartikeln
in Überständen unter Verwendung
der FACS-Analyse verwendet werden können.
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PER.C6-Zellen,
die in Suspension in serumfreiem AEM-Medium (Gibco) gezüchtet wurden,
wurden in einer 24-Napf-Platte plattiert (1 ml Zellen pro Napf bei 1 × 106 Zellen/ml). Trypsin-EDTA (Gibco) wurde
bis zu einer endgültigen
Konzentration von 3 μg/ml
hinzugefügt.
Zellen wurden mit einem Influenzavirus-Typ-A-Überstand (X-127, einer Reassortante
von A/Beijing/262/95 und X-31, erhalten vom National Institute for
Biological Standards and Control) infiziert. 200 μl Virusüberstand
wurden in 3fachen Verdünnungsschritten
zu den Zellen gegeben, wobei man mit unverdünnter Virusvorratslösung begann.
Eine Kontrolle von scheininfizierten Zellen wurde mitverwendet.
Nach der Zugabe des Virus wurden die Zellen 5 h lang auf 35°C gehalten.
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Von
infizierten Zellen wurde eine Probe (jeweils 350 μl) in 1,5-ml-Eppendorf-Röhrchen genommen. Kaltes PBS
wurde bis zu 1 ml hinzugefügt,
und die Röhrchen
wurden 5 min lang bei 5000 U/min in einer Eppendorf-Tischzentrifuge
zentrifugiert. Der Überstand
wurde verworfen, und die Zellen wurden vorsichtig in 100 μl kalter
Cytoperm/Cytofix-Permeabilisierungslösung (Pharmingen) resuspendiert.
Nach 20 min bei 4°C
wurde kaltes PBS (900 μl)
hinzugefügt,
und die Zellen wurden erneut sedimentiert wie oben. Die sedimentierten
Zellen wurden in 350 μl
kaltem Anfärbungsmedium
(PBS, 1% BSA, 0,1% Na-Azid), das 5 μl Influenza-A-Nucleoprotein-spezifischen,
mit FITC (Imagen Kit, Dako) markierten Antikörper enthielt, resuspendiert.
Die Zellen wurden 15 min bis 30 min lang bei 4°C inkubiert und anschließend einmal
mit 1 ml kaltem PBS und einmal mit 1 ml 1 × Cellfix-Fixierungslösung (Becton
Dickinson) gewaschen. Dann wurden die Zellen durch FACS analysiert
oder für
die spätere
FACS-Analyse bis zu 1 Woche lang bei 4°C im Dunkeln aufbewahrt.
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Angefärbte Zellen
wurden mit einer FACsort-Apparatur (Becton Dickinson) analysiert.
Influenza/FITC-positive Zellen wurden im FL1-Kanal nachgewiesen
und erschienen im oberen rechten Quadranten (7). Im unteren
Teil der Figur sind die Ergebnisse der FACS-Analyse mit uninfizierten
Zellen und Zellen 5 h nach der Infektion aufgetragen. Der obere
rechte Quadrant und der obere linke Quadrant der Graphiken stellen
die FITC-positiven/infizierten bzw. FITC-negativen/uninfizierten Zellen dar.
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Dann
wurden infizierte Zellen als Prozentsatz auf der Y-Achse gegen die
Verdünnung
des Überstands, der
für ihre
Infektion verwendet wurde, auf der X-Achse aufgetragen (8).
Der Wert, der 50% der infizierten Zellen entspricht, stellt das
TCID50 des Überstands dar. Wenn man weiß, dass
1 000 000 Zellen für
diese anfängliche
Infektion verwendet wurden, leitet man daraus ab, dass 200 μl 1/6 verdünnter Überstand
500 000 infektiöse
Partikel enthalten, was einem Titer von 1,5 × 107 infektiösen Partikel/ml
entspricht. Als derselbe Überstand
mit dem Standard-Plaque-Assay mit MDCK-Zellen unter Verwendung von
Standardverfahren, die dem Fachmann bekannt sind, quantifiziert
wurde, wurde ein Wert von 1,7 × 107 erhalten, mit einer Variation von ± 50%.
-
Es
ist für
den Fachmann offensichtlich, dass verschiedene Volumina und Verdünnungen
von Virusüberstand
zusammen mit verschiedenen Mengen an PER.C6 verwendet werden können, um
die Empfindlichkeit des Assays zu variieren. Analog können auch
Titer von anderen Influenzaviren als X-127 gemessen werden, vorausgesetzt,
beim Anfärben
wird der richtige Antikörper
verwendet.
-
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