PT2808340T - Resumo - Google Patents
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- C12Y204/99006—N-Acetyllactosaminide alpha-2,3-sialyltransferase (2.4.99.6)
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Description
Descrição FSH recombinante incluindo uma sialilação A presente invenção relaciona-se com gonadotrofinas para uso no tratamento da infertilidade. Em particular refere-se ao hormônio folículo-estimulante (FSH).
As gonadotrofinas são um grupo de hormonas glicoproteinas heterodiméricas que regulam a função gonadal no homem e na mulher. Elas incluem o hormônio folículo-estimulante (FSH), a hormona luteinizante (LH) e a gonadotrofina coriônica (CG) . 0 FSH é segregada naturalmente pela glândula pituitária anterior e funciona para suportar o desenvolvimento folicular e a ovulação. 0 FSH compreende um aminoácido alfa 92 de subunidade, também comum às outras hormonas glicoproteicas de LH e CG, e o aminoácido beta 111 de subunidade, único ao FSH que confere a especificidade biológica da hormona (Pierce and Parsons, 1981). Cada subunidade é modificada pós-tradução pela adição de resíduos de hidratos de carbono complexos. Ambas as subunidades transportam 2 locais para o anexo de glicano N-ligado, a subunidade alfa de aminoácidos 52 e 78 e a subunidade beta nos resíduos de aminoácidos 7 e 24 (Rathnam and Saxena, 1975, Saxena and Rathnam, 1976). 0 FSH é assim glicosilada até cerca de 30% em massa (Dias and Van Roey. 2001. Fox et al., 2001). O FSH purificado a partir da urina humana pós-menopausal tem sido usado há muitos anos no tratamento de infertilidade; ambos para promover a ovulação em reprodução natural e fornecer ovócitos para as tecnologias de reprodução assistida. Duas versões recombinantes de FSH, Gonal-F (Serono) e Puregon (Organon) tornaram-se disponíveis em meados da década de 1990. Estas são ambas expressadas nas células do ovário do hamster chinês (CHO) (Howies, 1996) .
Existe uma heterogeneidade considerável associada com preparações de FSH, que se relaciona a diferença nas quantidades de várias isoformas presentes. As isoformas de FSH individuais apresentam sequências de aminoácidos idênticas mas diferem na medida em que elas são modificadas pós-tradução; isoformas particulares são caracterizadas pela heterogeneidade das estruturas de ramo de hidratos de carbono e diferentes quantidades de incorporação de ácido siálico (um açúcar terminal), ambas as quais parecem influenciar a bioatividade isoforma específica. A glicosilação de FSH natural é altamente complexa. Os glicanos no FSH pituitário derivados naturalmente podem conter uma ampla gama de estruturas que podem incluir combinações de glicanos bi, tri e tetra-antenários (Pierce and Parsons, 1981. Ryan et ai., 1987. Baenziger and Green, 1988). Os glicanos podem transportar outras modificações: fucosilação de núcleo, glucosamina bissetora, cadeias estendidas com lactosamina-acetil, sialilação completa ou parcial, sialilação com ligações a2,3 e a2,6, e galactosamina sulfatada substituída por galactose (Dalpathado et al, 2006 ) . Além disso, existem diferenças entre as distribuições de estruturas de glicano nos locais de glicosilação individuais. Um nível comparável da complexidade de glicano foi encontrado em FSH derivado a partir do soro de indivíduos e a partir da urina de mulheres na pós-menopausa (Wide et al., 2007) . A glicosilação de produtos de FSH recombinante refletem a gama de glicosil-transferases presentes na linha celular hospedeira. Os produtos de rFSH existentes são derivados a partir das células (células CHO) do ovário de hamster chinês modificadas. A gama das modificações de glicano no CHO derivado do rFSH é mais limitada do que aquelas encontradas nos produtos naturais, derivadas quer a partir de extratos pituitários ou urina. Os exemplos a heterogeneidade de glicano reduzida encontrada no CHO derivado do rFSH incluem a falta de glucosamina bissetora e um conteúdo reduzido da fucosilação do núcleo e extensões de lactosamina-acetil (Hard et al., 1990). Adicionalmente, as células do CHO são apenas capazes de adicionar ácido siálico usando a ligação a2,3 (Kagawa et al, 1988, Takeuchi et al, 1988, Svensson et al., 1990) . Isto é diferente do FSH produzido naturalmente que contém glicanos com uma mistura de ácido siálico ligado a2,3 e a2,6.
Tem sido demonstrado que uma preparação do FSH recombinante (Organon) difere nas quantidades do FSH com um ponto isoelétrico (pi) de abaixo de 4 (consideradas as *isoformas acídicas) em comparação com o FSH pituitário, de soro ou de urina pós-menopausal (Ulloa-Aguirre et al., 1995) . A quantidade de isoformas acídicas nas preparações urinárias foi muito mais elevada em comparação com os produtos recombinantes, Gonal-F (Serono) and Puregon (Organon) (Andersen et al., 2004) . Isto deve refletir um conteúdo molar inferior de ácido siálico no rFSH uma vez que o conteúdo de glicano carregado negativamente, modificado com sulfato é baixo no FSH. O conteúdo de ácido siálico inferior, em comparação com o FSH natural, é um recurso de ambos os produtos de FSH disponíveis comercialmente e, portanto, deve refletir uma limitação no processo de fabrico (Bassett and Driebergen, 2005) .
Existe um grande corpo de trabalho científico que analisa e tenta explicar as variações da glicosilação do FSH entre os indivíduos e as mudanças ao longo de um ciclo de ovulação. Uma das principais discussões relaciona-se com a observação de que a concentração do FSH e o conteúdo do ácido siálico ambos diminuem durante a fase pré-ovulatória do ciclo. 0 conteúdo de ácido siálico diminuído resulta em um FSH mais básico que é limpo mais rapidamente e, in vitro pelo menos, é mais potente no alvo recetor (Zambrano et ai.,1996). A questão quanto à relevância biológica destas mudanças e como elas podem estar envolvidas na seleção do folículo dominante continuam por ser resolvidas (revisto por Ulloa-Aguirre, 2003) . O tempo de vida circulatório do FSH tem sido documentado para materiais a partir de uma variedade de fontes. Alguns destes materiais foram fracionados com base na carga molecular geral, tal como caracterizado pela seu pl, em que mais ácido, equivale a uma carga negativa mais elevada. Como afirmado anteriormente, o principal contribuinte para a carga molecular global é o conteúdo siálico total de cada molécula do FSH. Por exemplo, o rFSH (Organon) possui um conteúdo de ácido siálico de cerca de 8 mol/mol, onde a urina derivada do FSH tem um conteúdo de ácido siálico mais elevado (de Leeuw et al., 1996) . As taxas de depuração do plasma correspondente, no rato são 0.34 e 0.14 ml/min (Ulloa-Aguirre et al., 2003). Em outro exemplo, onde a amostra do FSH recombinante foi dividida em frações de pi elevadas e baixas, a potência in vivo da fração do pl elevado (conteúdo de ácido siálico inferior) foi reduzida e teve uma meia-vida de plasma mais curta (D'Antonio et al., 1999) . Também tem sido relatado que o FSH mais básico que circula durante os estágios posteriores do ciclo de ovulação é devido à regulação negativa da «2,3-sialiltransferase na pituitária anterior, que é causada pelos níveis crescentes de estradiol (Damian-Matsumara et al. 1999. Ulloa-Aguirre et al. , 2001) . Os resultados para a a2,6-sialiltransferase não foram relatadas. O conteúdo de ácido siálico total do FSH e do rFSH não está diretamente comparável, uma vez que os ácidos siálicos estão normalmente ligados em dois modos. O FSH pituitário / de soro / urinário contêm ambos os ácidos siálicos ligados em a2,3 e a2,6, com predomínio da primeira. No entanto, a célula do CHO derivada dos recombinantes contêm apenas a2,3 (Kagawa et al, 1988, Takeuchi et al, 1988, Svensson et al., 1990). Esta é uma outra diferença entre os produtos recombinantes atuais e naturais para além do conteúdo de ácido siálico total inferior deste último.
As células do CHO são vulgarmente usadas para a produção de proteínas recombinantes humanas farmacêuticas. A análise estrutural identificou que o ácido siálico é exclusivamente anexado por uma ligação a2,3. (Kagawa et al, 1988, Takeuchi et al, 1988, Svensson et al., 1990). Muitas glicoproteínas humanas contêm uma mistura de ambas as ligações em a2,3 e a2,6. Por conseguinte, as proteínas recombinantes expressas, usando o sistema do CHO serão diferentes das suas contrapartes naturais no seu tipo de ligações de ácido siálico terminais. Esta é uma consideração importante na produção de produtos biológicos para uso farmacêutico, uma vez que as porções hidrato de carbono podem contribuir para os atributos farmacológicos da molécula. É desejável ter um produto do rFSH que mais perto, réplica ou imita o perfil físico-químico e farmacocinético do produto produzido a partir da urina humana. É desejável ter um produto do rFSH que tenha propriedade ou propriedades farmacocinéticas em comparação com o produto recombinante conhecido.
De acordo com a presente invenção é fornecido um FSH recombinante ("rFSH" ou "FSHrec") incluindo uma sialilação em a2,3 e uma sialilação em a.2,6, em que 80% ou mais do total de sialilação é uma sialilação em a2,3 e em que a partir de 5% a 20% do total da sialilação é uma sialilação em α2,6. O rFSH (ou a preparação do rFSH) da invenção pode ter 5% ou menos do total de sialilação sendo uma sialilação em a2,8, por exemplo 0.1-4% da sialilação total pode ser uma sialilação em a2,8.
Os requerentes descobriram que o tipo de ligação de ácido siálico, a2,3- ou a2,6-, pode ter uma influência dramática na depuração biológica do FSH. As linhas celulares humanas, em oposição às linhas celulares do CHO, podem expressar o FSH recombinante com ácidos siálicos anexados por ambas as ligações em a2,3 e em a2,6. No Exemplo 4 uma linha celular do FSH recombinante foi feita, que expressou o FSH contendo glicanos com baixos níveis de ambas as ligações em a2,3 e em a2,6 de ácido siálico (Figura 6) . Este material básico, com um conteúdo de ácido siálico limitado (Figura 4) foi apagado muito rapidamente da circulação no rato como seria previsto (Figura 7). A linha celular foi então sujeita a um segundo passo de engenharia com a adição do gene que codifica para a a2,6-sialiltransferase (Exemplo 5). O rFSH resultante foi altamente sialilado mostrando um conteúdo de ácido siálico e uma distribuição de pi comparável com o FSH urinário (Figura 5). No entanto, o material foi muito rapidamente eliminado da circulação dos ratos a uma taxa comparável à do material original que tinha um baixo conteúdo de ácido siálico (Figura 8). Esta foi uma observação inesperada uma vez que é conhecido que uma proporção de ácido siálico em um FSH natural e biologicamente ativo é de uma ligação em a2,6. A depuração do rFSH sialilado em a2,6 foi encontrada para ser mediada pelo recetor asialoglicoproteico (ASGP) encontrado no fígado (Exemplo 9) . Isto foi demonstrado por um bloqueio transiente dos recetores ASGP usando um excesso de um outro substrato para o recetor. Com o recetor bloqueado pela asialofetuina, a depuração prevista para o material altamente sialilado foi restaurada (Figura 9) . Isto foi mantido durante várias horas até o bloqueio ter sido superado e o rFSH altamente sialilado de ligação em a2,6 retomou a sua rápida depuração. 0 FSH recombinante com uma mistura de ambos os ácidos siálicos de ligação em a2,3 e em a2,6 foi feito pela engenharia de uma linha celular humana para expressar ambos o rFSH e a a2,3-sialiltransferase (Exemplo 4 e 5) . 0 produto expresso é altamente acídico e transporta uma mistura de ambos os ácido siálicos de ligação em a2,3 e em a2,6; este último fornecido pela atividade da sialiltransferase endógena (Figura 6). Isto tem duas vantagens sobre o rFSH expresso em células convencionais do CHO: em primeiro lugar o material é mais altamente sialilado, devido às atividades combinadas das duas sialiltransferases; e em segundo lugar o material assemelha-se mais ao FSH natural. Isto é suscetível de ser mais biologicamente apropriado em comparação com produtos recombinantes derivados de células do CHO que produzem apenas ácido siálico de ligação em a2,3 (Kagawa et al, 1988, Takeuchi et al, 1988, Svensson et al., 1990) e diminuíram o conteúdo de ácido siálico (Ulloa-Aguirre et al. 1995., Andersen et al., 2004).
Os requerentes verificaram, surpreendentemente, que o rFSH da invenção que pode mais de perto, replicar ou imitar o perfil fisico-quimico e farmacocinético do produto urinário humano natural do que outros produtos recombinantes. Por outras palavras, o rFSH da invenção pode estar mais próximo do FSH "natural". Isto pode ter vantagens significantes em relação à dosagem, etc. Além disso, um produto mais "humano" ou mais "natural" pode ser mais desejável para o paciente que pode desejar terapia, embora de certo modo artificial, para ser tão "natural" quanto possivel. Pode haver outras vantagens (por exemplo, vantagens farmacocinéticas) em um produto recombinante com uma estrutura de hidrato de carbono (por exemplo glicano) que está mais próxima do FSH natural (por exemplo urina humana) do que outros produtos recombinantes. A invenção é, assim, uma versão recombinante do FSH que transporta uma mistura de ácido siálico em a2,3 e em a2,6 e, portanto, assemelha-se mais estreitamente ao FSH natural. É esperado que o uso deste composto para a estimulação ovariana controlada, nas técnicas IVF, e a indução da ovulação irá resultar numa estimulação mais natural do ovário em comparação com produtos recombinantes existentes.
De acordo com a presente invenção, é fornecido um FSH recombinante ("rFSH" ou "recFSH") incluindo uma sialilação em a2,3 e em a2,6 em que 80% ou mais do total de sialilação é uma sialilação em a2,3 e a partir de 5% a 20% do total da sialilação é uma sialilação em α2,6. O rFSH ou a preparação do rFSH pode opcionalmente incluir ainda uma sialilação em a2,8 .
Em formas de realização da invenção, o rFSH pode estar presente como uma isoforma única ou como uma mistura de isoformas. 0 rFSH de acordo com a invenção pode ter um conteúdo de ácido siálico [expresso em termos de um rácio de moles de um ácido siálico para moles de proteína], de 6 mol/mol ou superior. 0 rFSH de acordo com a invenção tem 80% ou mais da sialilação total sendo uma sialilação em a2,3. Por exemplo, 90% ou mais da sialilação total pode ser uma sialilação em α2,3. O rFSH da invenção tem de 5 a 20% da sialilação total sendo uma sialilação em α2,6. O rFSH da invenção pode ter 5% ou menos da sialilação total sendo uma sialilação em a2,8. Por exemplo 2.5% ou menos da sialilação total pode ser uma sialilação em α2,8. O rFSH (ou preparação do rFSH) pode incluir uma sialilação em a2,8 numa quantidade que varia entre 0.1 e 4% da sialilação total, por exemplo de 0.5 a 3% da sialilação total, por exemplo de 0.5 a 2.5% da sialilação total. Por sialilação, pretende-se significar a quantidade de resíduos siálicos presentes nas estruturas de hidratos de carbono do FSH. A sialilação em a2,3 significa uma sialilação na posição 2,3 (tal como é bem conhecida na técnica) e uma sialilação em a2,6 na posição 2,6 (também bem conhecida na técnica). Assim, "a % da sialilação total pode ser uma sialilação em a2,3" refere-se à % do número total de resíduos de ácido siálico presentes no FSH que são sialilados na posição 2,3. O termo "% da sialilação total sendo uma sialilação em a2,6" refere-se à % o número total de resíduos de ácido siálico presentes no FSH que são sialilados na posição 2,6. 0 FSH recombinante expresso em células do ovário do hamster chinês (CHO) inclui, exclusivamente, uma sialilação em a2,3 (Kagawa et al, 1988, Takeuchi et ai., 1988, Svensson et al., 1990). O rFSH da invenção pode ser produzido ou expresso numa linha celular humana. Isto pode simplificar (e tornar mais eficaz) o método de produção, porque a manipulação e controlo de, por exemplo o meio de crescimento de células para manter a sialilação, pode ser menos crítico do que com os processos conhecidos. O método pode também ser mais eficiente porque existe pouco rFSH básico produzido do que na produção de produtos conhecidos de rFSH; mais rFSH ácido é produzido e a separação/remoção do FSH básico é menos problemática. O rFSH pode ser produzido ou expresso numa linha celular derivada de Per.C6 ou uma linha celular Per.C6 modificada. A linha celular pode ser modificada usando uma a2,3-sialiltransferase. A linha celular pode ser modificada usando uma a2,6-sialiltransferase. Alternativa ou adicionalmente, o rFSH pode incluir ácidos siálicos de liqação em a2,6 (sialilação em a2,6) fornecidos pela atividade de sialiltransferase endógena [da linha celular]. O rFSH pode ser produzido usando uma sialiltransferase α2,3 e/ou α2,6. O rFSH pode ser produzido utilizando uma a2,3-sialiltransferase. O rFSH pode incluir ácidos siálicos de ligação em a2,6 de (sialilação em a2,6) fornecidos pela atividade de sialiltransferase endógena.
De acordo com a presente invenção, num aspecto adicional é fornecido um método de produção do rFSH e/ou uma preparação do rFSH como aqui descrito (de acordo com os aspectos da invenção) compreendendo o passo de produzir ou expressar o rFSH numa linha celular humana, por exemplo uma linha celular Per.C6, uma linha celular derivada de Per.C6 ou uma linha celular Per.C6 modificada. Por exemplo, uma linha celular que tenha sido modificada usando uma oc2,3-sialiltransferase. A estrutura do rFSH contém porções de glicano. A ramificação pode ocorrer com o resultado de que os resíduos de glicano podem ter 1, 2, 3, 4 ou mais resíduos terminais de açúcar terminal ou "antenas", tal como é bem conhecido na técnica. 0 rFSH da invenção pode ter glicanos com presença de sialilação em estruturas mono-antenárias e/ou di-antenárias e/ou tri-antenárias e/ou tetra-antenárias.
De acordo com a presente invenção, num aspecto adicional, é fornecido uma composição farmacêutica que compreende o rFSH incluindo uma sialilação em a2,3 e em a2,6, em que 80% ou mais da sialilação total é uma sialilação em a2,3 e em entre 5% a 20% da sialilação total de uma sialilação em 2,6 (por exemplo, tal como definido acima). A composição farmacêutica pode ainda compreender hCG e/ou LH. A hCG pode ser obtida por quaisquer meios conhecidos na arte. A hCG, tal como aqui utilizado inclui uma hCG derivada de humano e recombinante. A hCG derivada de humano pode ser purificada a partir de qualquer fonte adequada (por exemplo, urina, e placenta), por qualquer método conhecido na arte. Os métodos de expressão e purificação da hCG recombinante são bem conhecidos na técnica. A LH pode ser obtida por quaisquer meios conhecidos na técnica. A LH, tal como aqui usada, inclui uma LH recombinante e derivada de humano. A LH derivada de humano pode ser purificada a partir de qualquer fonte adequada (por exemplo urina) através de qualquer método conhecido na técnica. Os métodos de expressão e purificação da LH recombinante são conhecidos na técnica.
[0031] A composição farmacêutica pode ser para o tratamento da infertilidade, por exemplo, para uso em, por exemplo, tecnologias de reprodução assistida (ART), indução da ovulação ou inseminação intra-uterina (IUI). A composição farmacêutica pode ser usada, por exemplo, em indicações médicas onde as preparações de FSH conhecidas são usadas. As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser formuladas em composições bem conhecidas para qualquer via de administração de drogas, por exemplo, oral, retal, parenteral, transdérmica (por exemplo, a tecnologia de pensos), intravenosa, intramuscular, subcutânea, intrasusternal, intravaginal, intraperitoneal, local (pós, pomadas ou gotas) ou como um bucal ou spray nasal. Uma composição típica compreende um veículo farmaceuticamente aceitável, tal como uma solução aquosa, excipientes não tóxicos, incluindo sais e conservantes, buffers e semelhantes, tal como descrito na déciam quinta edição de Remington Pharmaceutical Sciences (Matt Publishing Company, 1975), nas páginas 1405 a 1412 e 1461-1487, e a edição décima quarta do formulário nacional XIV (American Pharmaceutical Association, 1975), entre outros.
Exemplos de transportadores farmacêuticos aquosos e não-aquosos, diluentes, solventes ou veículos que incluem água, etanol, polióis (tais como glicerol, propileno glicol, polietileno glicol, e semelhantes) , carboximetilcelulose e suas misturas adequadas, óleos vegetais (tal como azeite), e ésteres orgânicos injetáveis como o oleato de etilo.
As composições da presente invenção também podem conter aditivos tais como, mas não limitados a, conservantes, agentes molhantes, agentes emulsionantes, e agentes dispersantes. Os agentes antibacterianos e antifúngicos podem ser incluídos para prevenir o crescimento de micróbios e incluem, por exemplo, parabeno, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, e semelhantes. Além disso, pode ser desejável incluir agentes isotónicos tais como açúcares, cloreto de sódio, e semelhantes.
Em alguns casos, para efeito da ação prolongada é desejável abrandar a absorção do FSH (e de outros Ingredientes ativos, se presentes) a partir da injeção subcutânea ou intramuscular. Isto pode ser conseguido pelo uso de uma suspensão líquida de material cristalino ou amorfo com fraca solubilidade em água. A taxa de absorção do FSH depende então da sua velocidade de dissolução que, por sua vez, pode depender do tamanho do cristal e da forma cristalina. Alternativamente, a absorção retardada de uma forma de combinação do FSH administrado parentericamente é conseguida pela dissolução ou suspensão da combinação do FSH num veículo oleoso.
As formas de depósito injetáveis podem ser preparadas por formação de matrizes de microencapsulação do FSH (e outros agentes, se presentes) em polímeros biodegradáveis tais como polilactido poliglicólido. Dependendo do rácio do FSH para o polímero e da natureza do polímero particular empregue, a taxa de libertação do FSH pode ser controlada. Exemplos de outros polímeros biodegradáveis incluem polivinilpirrolidona, poli (ortoésteres), poli (anidridos), etc. As formulações injetáveis de depósito são também preparadas por aprisionamento do FSH em lipossomas ou microemulsões que são compatíveis com os tecidos corporais.
As formulações injetáveis podem ser esterilizadas, por exemplo, por filtração através de um filtro de retenção de bactérias, ou por incorporação de agentes esterilizantes na forma de composições sólidas estéreis que podem ser dissolvidas ou dispersas em água estéril ou outro meio injetável estéril, imediatamente, antes do uso. As formulações injetáveis podem ser fornecidas em qualquer recipiente adequado, por exemplo, frasco, seringa pré-cheia, cartuchos de injecção, e semelhantes.
[0037] As formulações injetáveis podem ser fornecidas como um produto com composições farmacêuticas contendo FSH (opcionalmente com hCG, LH, etc.) Se houver mais do que um ingrediente ativo (ou seja, FSH e por exemplo hCG ou LH) , estes podem ser adequados para a administração separadamente ou em conjunto. Se administrados separadamente, a administração pode ser sequencial. O produto pode ser fornecido em qualquer pacote apropriado. Por exemplo, um produto pode conter um número de seringas pré-cheias contendo quer o FSH, o hCG, ou uma combinação de ambos FSH e hCG, as seringas são acondicionadas numa embalagem blister ou outros meios para manter a esterilidade. Um produto pode conter opcionalmente, instruções para o uso das formulações do FSH e hCG. O pH e a concentração exata dos vários componentes da composição farmacêutica são ajustados de acordo com a prática de rotina neste campo. Ver GOODMAN and GILMAN's THE PHARMACOLOGICAL BASIS FOR THERAPEUTICS ,7a ed. Em uma forma de realização preferida, as composições da invenção são fornecidas na forma de composições para administração parentérica. Os métodos gerais para a preparação das formulações parentéricas são conhecidos na técnica e estão descritos em REMINGTON; THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY, supra, nas páginas 780-820. As composições parentéricas podem ser fornecidas em formulação liquida ou como um sólido, em que será misturado com um meio injetável estéril, imediatamente, antes da administração. Em uma forma de realização especialmente preferida, as composições parentéricas são fornecidas em forma de unidade de dosagem para a facilidade de administração e uniformidade de dosagem.
Descrição detalhada da invenção A presente invenção será agora descrita em mais detalhe com referência aos seguintes exemplos e aos os desenhos anexos, nos quais: A Figura 1 mostra um mapa de plasmideo do vetor de expressão pFSHalfa/beta; A Figura 2 mostra o vetor de expressão da sialiltransferase α2,3 (ST3GAL4) ; A Figura 3 mostra o vetor de expressão da sialiltransferase a2,6 (ST6GAL1) ; A Figura 4 mostra uma focagem isoeléctrica do FSH recombinante produzido por células PER.C6 que expressam de forma estável o FSH; A Figura 5 mostra um exemplo de clones analisados por focagem isoeléctrica do FSH recombinante produzido por células PER.C6 que expressam de forma estável o FSH após engenharia com a sialiltransferase em a2,6 ou em a2,3; A Figura 6 mostra a análise das ligações de ácido siálico do FSH Per .C6; A Figura 7 mostra as taxas de depuração metabólica (MCRs) das amostras do FSH Per.C6; A Figura 8 mostra as MCRs da sialiltransferase em α2,6 concebidas por amostras do FSH Per.C6; A Figura 9 mostra as MCRs da sialiltransferase em a2,6 concebidas por amostras do FSH Per.C6; A Figura 10 mostra as MCRs da sialiltransferase em a2,3 concebidas por amostras de FSH Per.C6; A Figura 11 mostra o aumento do peso do ovário por clones do rFSH Per.C6 do rFSH Per.C6 parental, de acordo com o método de Steelman e Pohley (1953); A Figura 12 mostra o aumento do peso do ovário por clones do rFSH Per.C6 do rFSH Per.C6 (sialiltransf erase em oí2,6) concebido; e A Figura 13 mostra o aumento de peso do ovário por clones do rFSH Per.C6 do rFSH Per.C6 (sialiltransferase α2,3) concebido.
Sequência da Selecção O FSH humano A região de codificação do gene para o polipéptido do FSH alfa foi usada de acordo com o Fiddes e Goodman. (1981). A sequência é depositada como AH007338 e no momento da construção não existiram outras variantes desta sequência de proteína. A sequência é aqui referida como SEQ ID 1.
A região de codificação do gene para o polipéptido do FSH beta foi usada de acordo com Keene et al (1989) . A sequência é depositada como MM_000510 e no momento da construção não existiram outras variantes desta sequência de proteína. A sequência é aqui referida como SEQ ID 2.
Sialiltransferase α2,3-sialiltransferase - A região de codificação do gene para o galactosido beta da sialiltransferase 4 em alfa 2,3 (a2,3-sialiltransferase, ST3GAL4) foi usada de acordo com Kitagawa e Paulson (1994). A sequência é depositada como L23767 e aqui referida como SEQ ID 3. α2,6-sialiltransferase - A região de codificação do gene para a galactosamide beta da sialiltransf erase 1 em alfa 2,6 (a2,6-sialiltransferase, ST6GAL1) foi usada de acordo com Grundmann et ai. (1990) . A sequência é depositada como NM 003032 e aqui referida como SEQ ID 4.
EXEMPLOS
Exemplo 1 Construção do vetor de expressão do FSH A sequência de codificação do polipéptido do FSH alfa (AH007338, SEQ ID 1) e do polipéptido do FSH beta (NM_003032, SEQ ID 2) foi amplificada por PCR usando as combinações iniciantes FSHa-fw, FSHa-rev e FSHb-fw e FSHb-rec, respetivamente. FSHa-fw 5 ' -CCAGGATCCGCCACCATGGATTACTACAGAAAAATATGC-3' FSHa-rev5'-GGATGGCTAGCTTAAGATTTGTGATAATAAC-3' FSHb-fw 5 '-CCAGGCGCGCCACCATGAAGACACTCCAGTTTTTC-3' FSHb-rev 5'-CCGGGTTAACTTATTATTCTTTCATTTCACCAAAGG-3 [0045] O ADN do FSH beta amplificado resultante foi digerido com as enzimas de restrição Ascl e Hpal e inserido nos locais Ascl e Hpal no vetor de expressão de um mamífero guiado por CMV, carregando um marcador de seleção de neomicina. Similarmente, o ADN do FSH alfa foi digerido com Bamlíl e Nhel e inserido nos locais Bamlíl e Nhel no vetor de expressão que já contenha o ADN do FSH beta polipéptido. 0 vetor de ADN foi usado para transformar a tensão DH5a de E.coli. Sessenta colónias foram escolhidas para a amplificação e cinquenta e sete continham o vetor contendo ambos o FSH alfa e beta. Vinte das mesmas foram selecionadas para a sequenciação e todas continham as sequências correctas de acordo com a SEQ ID 1 e SEQ ID 2. 0 plasmideo pFSH A+B#17 foi seleccionado para a transfeção (Figura 1).
Exemplo 2 Construção do vetor de expressão ST3 A sequência de codificação do galactosido beta da sialiltransferase 4 em alfa 2,3 (ST3, L23767, SEQ ID 3) foi amplificada por PCR usando a combinação de iniciadores 2,3STfw e 2,3STrev. 2,3STfw 5'-CCAGGATCCGCCACCATGTGTCCTGCAGGCTGGAAGC-3' 2,3STrev 5'-TTTTTTTCTTAAGTCAGAAGGACGTGAGGTTCTTG-3' [0048] O ADN ST3 amplificado resultante foi digerido com as enzimas de restrição BamBI e AflII e inserido nos locais BamEI e AflII no vetor de expressão de um mamífero guiado por OMV, carregando um marcador de resistência à higromicina. O vetor foi amplificado como anteriormente descrito e sequenciado. O clone pST3#l (Figura 2) continha a sequência correta de acordo com a SEQ ID 3 e foi seleccionado para a transfeção.
Exemplo 3 Construção do vetor de expressão ST6 A sequência de codificação da galactosamide beta da sialiltransferase 1 em alfa 2,6 (ST6, NM_003032, SEQ ID 4) foi amplificada por PCR usando a combinação de iniciadores 2,6STfw e 2,6STrev. 2,6STfw 5'-CCAGGATCCGCCACCATGATTCACACCAACCTGAAG 3' 2,6STrev 5'-TTTTTTTCTTAAGTTAGCAGTGAATGGTCCGG-3' [0050] O ADN ST6 amplificado resultante foi digerido com as enzimas de restrição BamHI e AflII e inserido nos locais Bamhl e Afl II no no vetor de expressão de um mamifero guiado por CMV, carregando um marcador de resistência à higromicina. O vetor foi amplificado como anteriormente descrito e sequenciado. O clone pST6#ll (Figura 3) continha a sequência correta de acordo com a SEQ ID 4 e foi selecionado para a transfeção.
Exemplo 4 Expressão estável do pFSH A + B em células PER.C6. O isolamento da transfeção and screening of clones.
Os clones PER.C6 que produzem o FSH foram gerados ao expressar ambas as cadeias polipeptídicas do FSH a partir de um único plasmídeo (ver Exemplo 1).
[0052] Para obter clones estáveis, um agente de transfeção baseado em lipossomas com a construção do pFSH A+B. Os clones estáveis foram selecionados em VPRO suplementados com 10% de FCS e contendo G418. Três semanas após a transfecção, os clones resistentes a G418 cresceram para fora. Um total de 250 clones foram selecionados para o isolamento. Os clones isolados foram cultivados em um meio de seleção até 70-80% confluentes. Os sobrenadantes foram analisados quanto ao conteúdo de proteína do FSH usando um ELISA seletivo do FSH e atividade farmacológica no recetor do FSH em linha celular colonada, usando um ensaio de acumulação de cAMP. Os clones (98) que expressam uma proteína funcional foram progredidos para a expanção da cultura para 24 well, 6 well e frascos T80.
Os estudos para determinar a produtividade e a qualidade do material a partir de sete clones foram iniciados em frascos T80 para gerar material suficiente. As células foram cultivadas em meio suplementado, como anteriormente descrito, durante 7 dias e o sobrenadante colhido. A produtividade foi determinada usando o ELISA seletivo do FSH. 0 perfil isoeléctrico do material foi determinado (Exemplo 6) . As amostras representativas são mostradas na Figura 4. A informação do IEF foi usada para selecionar os clones para análise da taxa de eliminação metabólica (Exemplo 9). Os clones (005, 104, 179, 223, 144), com produtividade suficiente e qualidade foram seleccionados para engenharia da sialiltransferase.
Exemplo 5 Nivel de sialilação é aumentado em células que sobre expressam a sialiltransferase em a2,3 ou α2,6. Ά expressão do pST3 ou pST6 em células PER.C6 que expressam o FSH; O isolamento da transfeção and screening of clones.
Os clones PER.C6 que produzem o FSH altamente sialilado foram gerados ao expressar a sialiltransferase em a2,3 ou a sialiltransferase em a2,6, a partir de plasmídeos separados (ver Exemplos 2 e 3) em células PER.C6 já que expressam ambas as cadeias de polipeptídeo do FSH (ver Exemplo 4) . Quatro clones produzidos a partir de células PER.C6® tal como estabelecido no Exemplo 4 foram selecionados pelas suas características, incluindo a produtividade, bom perfil de crescimento, produção de proteína funcional, e produziram o FSH que incluía alguma sialilação.
Os clones estáveis foram gerados como descrito anteriormente no Exemplo 4. Um total de 202 clones do programa da sialiltransferase em a2,3 e 210 clones do programa da sialiltransferase em α2,6 foram isolados, expandidos e testados. 0 número de clones final para a o estudo em a2,3 foi de 12 e 30 para o estudo em a2,6.
Os clones da sialiltransferase em a2,3 foram adaptados ao meio isento de soro e às condições de suspensão.
Como antes, os clones foram ensaiados usando uma ELISA seletiva do FSH, com uma resposta funcional em uma linha celular recetora do FSH, IEF (Exemplo 6), a taxa de eliminação metabólica (Exemplo 9) e análise de Steelman Pohley (Exemplo 10) . Os resultados foram comparados com um FSH recombinante comercialmente disponível (Gonal-F, Serono) e as linhas celulares PER.C6 parentais do FSH. As amostras representativas são mostradas na Figura 5. Alguns clones não demonstram um aumento na sialilação mas pode ser visto que o FSH produzido pela maior parte dos clones tem uma sialilação significativamente melhorada, (ou seja, em média, mais isoformas do FSH com números elevados de ácidos siálicos) em comparação com o FSH expresso sem a sialiltransferase em a2,3 ou em a2,6.
Na expressão de conclusão do FSH juntamente com a sialiltransferase em células PER.C6 resulta em um aumento dos níveis do FSH sialilado em comparação com células que expressam somente o FSH.
Exemplo 6 Análise do pi das isoformas do FSH produzidas por Per.C6 por focagem isoeléctrica.
[0059] A electroforese é definida como o transporte de moléculas carregadas através de um solvente por meio de um campo eléctrico. A mobilidade de uma molécula biológica por meio de um campo eléctrico depende da intensidade de campo, carga líquida na molécula, tamanho e forma da molécula, força iónica e as propriedades do meio através do qual as moléculas migram.
[0060] A focagem isoelétrica (IEF) é uma técnica eletroforética para a separação de proteínas com base no seu pi. O pl é o pH ao qual uma proteína não possui carga liquida, e não migra em um campo eléctrico. O conteúdo de ácido siálico das isoformas do FSH, subtilmente, alteram o ponto de pl para cada isoforma, o que pode ser explorado usando esta técnica para visualizar as isoformas do FSH Per.C6 de cada clone.
Os pontos isoelétricos das isoformas do FSH produzidas por Per.C6 em sobrenadantes de cultura celular foram analisados através da focagem isoelétrica. O meio de cultura celular dos clones do FSH Per.C6 foi produzido como descrito no Exemplo 4 e 5.
As amostras do FSH Per.C6 foram separadas em géis de IEF Novex® contendo 5% de poliacrilamida em condições nativas em um gradiente de pH 3.0 -7.0 em uma solução anfotérica de pH 3.0 - 7.0.
[0063] As proteínas foram transferidas para a nitrocelulose suportada e visualizadas usando um anticorpo monoclonal anti-FSHa primário, secondary anti-raouse igG alkaline phosphatase conjugated anitbody e 5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato (BCIP) e reagente tetrazólio nitro azul (NBT) para visualizar as faixas.
Tal como indicado nas figuras 4 e 5, as faixas representam isoformas do FSH contendo diferentes números de moléculas de ácido siálico.
Usando este método, os clones que produzem isoformas do FSH com um número mais elevado de moléculas de ácido siálico foram identificados. A engenharia com a sialiltransferase em a2,3 e em a2,6 resultou em clones com mais ácido siálico e um pl mais baixo.
Exemplo 7 Análise das ligações de ácido siálico do FSH Per.C6
Os glicoconjugados foram analisados usando um método de diferenciação de glicano com base em lectina. Com este método as glicoproteínas e os glicoconjugados ligados à nitrocelulose podem ser caracterizados. As lectinas reconhecem seletivamente uma fracção particular, por exemplo ácido siálico de ligação em a2,3. As lectinas aplicadas são conjugadas com a digoxigenina hapteno esteróide que permite a deteção imunológica das lectinas ligadas. 0 FSH Per.C6 purificado a partir de um clone parental (sem a sialiltransferase adicional), um clone de engenharia a2,3-sialiltransferase e um clone de engenharia oí2,6-sialiltransferase foram separados usando técnicas padrão de SDS-PAGE. Um FSH recombinante (Gonal-F, Serono), comercialmente disponível, foi usado como um padrão.
0 ácido siálico foi analisado usando o DIG Glycan Differentiation Kit (Cat. No. 11 210 238 001, Roche) de acordo com as instruções do fabricante. As reacções positivas com Sambucus nigra aglutinina (SNA) indicaram um ácido siálico terminal de ligação (2-6) . As reações positivas com Maackia amurensis aglutinina II (MAA): indicaram um ácido siálico terminal de ligação (a2- 3)
Em resumo, o clone parental 005 continha baixos níveis de ácido siálico a2,3 e a2,6. Os clones concebidos com a a2,3-sialiltransferase continham altos níveis de ligações de ácido siálico em a2,3 e baixos níveis de ligações de ácido siálico em a2,6. Os clones concebidos com a oí2,6-sialiltransferase continham altos níveis de ligações de ácido siálico em a2,6 e baixos níveis de ligações de ácido siálico em α2,3. O controlo padrão Gonal-F contém apenas ligações de ácido siálico em a2,3. Isto é consistente com o que é conhecido sobre as proteínas recombinantes produzidas em células do ovário do hamster chinês (CHO) (Kagawa et al, 1988, Takeuchi et al, 1988, Svensson et al., 1990).
Em conclusão, a concessão de células do FSH PER.C6 com a sialiltransferase α2,3 e α2,6 aumentou com sucesso o número de moléculas conjugadas de ácido siálico para o FSH na amostra.
Exemplo 8a Quantificação do ácido siálico total O ácido siálico é um hidrato de carbono ligado à proteína considerado por ser um mono-sacarídeo e ocorre em combinação com outros mono-sacarídeos, como a galactose, manose, glucosamina, galactosamina e a fucose. O ácido siálico total do rFSH purificado (Exemplo 11) foi medido usando um kit de quantificação de ácido siálico enzimático de acordo com o protocolo do fabricante (Sigma, siálico-Q). Em resumo, a aldolase de ácido acetilneuramínico-N, catalisa o ácido siálico para ácido N-acetylmanoasina e pirúvico. O ácido pirúvico pode ser reduzido a ácido láctico por β-NADH e deshidrogenasa láctica. A oxidação de B-NADH pode ser medida, espectrofotometricamente, com precisão. A concentração de proteína foi medida em placas de microtitulação usando um kit de ensaio de ácido bicinconínico comercial (BCA) (Sigma, B 9643) com base no método de Lowry (Lowry et al, 1951). 0 conteúdo de ácido siálico total do FSH Per.C6 foi medido e verificou-se ser superior a 6 mol/mol.
Exemplo 8b Quantificação de quantidades relativas de ácido siálico em α2,3, a2,6 e a2,8
Os valores percentuais relativos do ácido siálico em a2,3, a2,6 e a2,8 sobre o rFSH purificado (Exemplo 11) foram medidos usando técnicas conhecidas.
Cada amostra do rFSH foi imobilizada (bloco de gel), lavada, reduzida, alquilado e digerida com PNGase F, durante a noite. Os N-glicanos foram, então, extraídos e processados. Os N-glicanos para a análise do NP-HPLC e do WAX-HPLC foram marcados com o fluoróforo 2AB como detalhado em Royle et al. Os N-glicanos foram corridos em fase normal (NP) por HPLC numa coluna amida TSK (tal como detalhado em Royle et al) com tempos de retenção expressos em unidades de glucose (GU).
[0077] As amostras dos glicanos extraídos, agrupados (extraídos tal como acima) foram digeridas com diferentes sialidases para determinar as ligações. A NAN 1 (sialidase recombinante) liberta ácidos siálico terminais não redutores de ligação em a2,3 (NeuNAc e NeuNGc), ABS (Arthrobacter ureafaciens sialidase) libera ácidos siálico terminais não redutores de ligação em α2,3, a2,6 e em a2,8 (NeuNAc e NeuNGc). As amostras foram analisadas por NP-HPLC, para permitir a comparação da amostra não digerida com aquela digerida com ΝΑΝΙ e aquela digerida com ABS. A comparação dos três traços NP-HPLC (não digerido, ΝΑΝΙ digerido, ABS digerido) mostra que a digestão com ABS e ΝΑΝΙ dão resultados diferentes. Isto indica que as amostras têm ácidos siálicos com ligações em α2,3, a2,6 e em oí2,8. As percentagens relativas foram calculadas a partir de estruturas presentes nas piscinas de glicano não digeridas e verificaram estar nas gamas de 65% - 85% (por exemplo, 77.75%) para a sialilação em a2,3; 15 a 35% (por exemplo, 21.46%) para a sialilação em a2,6; e 0.1 a 3% para a sialilação em a2,8.
Exemplo 8c Quantificação das quantidades relativas de estruturas sialiladas antenárias mono, di, tri e tetra
As quantidades relativas de estruturas sialiladas antenárias mono, di, tri e tetra nos glicanos extraídos a partir do rFSH purificado (Exemplo 11) foram medidas usando técnicas conhecidas.
Cada amostra do rFSH foi imobilizada (bloco de gel), lavada, reduzida, alquilada e digerida com PNGase F, durante a noite. Os N-glicanos foram, então, extraídos e processados. Os N-glicanos para a análise do NP-HPLC e do WAX-HPLC foram marcados com o fluoróforo 2AB como detalhado em Royle et al.
[0080] A troca aniônica fraca (WAX) HPLC para separar os N-glicanos por carga (Exemplo 8b) foi levada a cabo tal como estabelecido em Royle et al, com um padrão de fetuína N-glicano como referência. Os glicanos foram eluídos de acordo com o número de ácidos siálicos contidos. Todas as amostras incluíram as estruturas sialiladas mono (IS), di (2S) , tri (3S) e tetra (4S) . As quantidades relativas das estruturas sialiladas foram encontradas para estar nos seguintes rácios (1 S:2S:4S:4S): 9-15%: 27-30%: 30-36%: 25-29% (por exemplo 10.24:28.65:35.49:25,62).
Exemplo 9 Determinação das taxas de depuração metabólica do rFSH
Para determinar a taxa de depuração metabólica (MCR) das amostras do FSH Per.C6, ratos fêmeas conscientes (3 animais por clone) foram injetados na veia da cauda no tempo zero com um bolus do rFSH (1 - 10 pg/rato, com base na quantificação de amostras ELISA, DRG AIA 1288). As amostras de sangue (400μ1) foram tomadas a partir da ponta da cauda 1, 2, 4, 8, 12, 24 e 32 horas após a injecção da amostra de teste. O soro foi recolhido por centrifugação e ensaiado quanto a conteúdo do FSH por ELISA (DRG AIA 1288) . O receptor de asialoglicoproteína (ASGP-R) reconhece glicoproteínas dessialiladas (terminadas em galactose), como a asialofetuina (ASF). (Pricer e Ashwell, 1971. Van Lenten e Ashwell, 1972) . O recetor ASGP e a glicoproteína desialilada ligada são internalizados na célula onde o recetor é reciclado e o ligando é degradado (Regoeczi et al, 1978, Steer e Ashwell, 1980).
Para investigar se o material do FSH 0Per.C6 foi depurado através deste mecanismo, o ASGP-R foi saturado com a asialofetuina. A taxa de depuração metabólica do material concebido na sialiltransferase em a2,6 ou a2,3 parental foi determinada como descrito, com a co-administração de um excesso mínimo molar de 7.500 vezes de asialofetuina para saturar a ASGP-R durante 1-2 h.
[0084] O material produzido pelos clones parentais do FSH Per.C6 continha algum material MCR mais longo, mas uma percentagem elevada foi rapidamente eliminada (Figura 7). O clone de chumbo 005 que continha o material mais sialilado, foi concebido usando uma sialiltransferase em a2,6 ou em a2,3 (Exemplo 5). Embora os clones concebidos com a sialiltransferase em a2,6 tenham demonstrado uma sialilação aumentada (Figura 5) não houve melhoramento na MCR (Figura 7). O bloqueio do ASGR restaura o MCR do material em a2,6 à do padrão que demonstra que, mesmo com o aumento das ligações em α2,6, o material é rapidamente eliminado (Figura 8). A conceção com a sialiltransf erase em oí2,3, resultou em clones com MCR comparável ao padrão (Figura 9) e um conteúdo variável de siálico foi consistente com o que é conhecido para as isoformas do FSH (Figura 10).
Exemplo 10 Ensaio de Steelman-Pohley in vivo
Para demonstrar o aumento do conteúdo de ácido siálico nos resultados do FSH em um efeito biológico aumentado, foi examinado o aumento nos pesos dos ovário em ratos pelo FSH altamente sialilado tal como mostrado no Exemplo 5. O aumento nos pesos dos ovários devido aos clones do rFSH Per.C6 foi analisado de acordo com o método de Steelman and
Pohley (1953) . 0 rFSH Per.C6 a partir de amostras de meio celular filtrado foi quantificado por ELISA (DRG, EIA-1288) . As amostras (rFSH Per.C6) e padrões (Gonal-F rFSH) foram testados em cinco doses diferentes (3 animais / dose) . 0 Gonal-F foi administrado em doses de 50, 100, 200, 400, e 800 ng/rato, As doses de amostra foram calculadas usando os valores de AUC em relação à Gonal-f, tipicamente 0.05 - 10 pg/rato.
[0087] Em conclusão, o material sob sialilado produzido pelos clones parentais do FSH Per.C6 (Figura 11) não foi tão potente no ensaio de aumento de peso do ovário como o rFSH disponível comercialmente. O processo de sial,iItra.nsferase para adicionar ligações a2,6 adicionais, aumentou o conteúdo em ácido siálico, mas não melhorou a potência no ensaio in vivo (Figura 12) . No entanto, as ligações adicionais a2,3 aumentam significativamente a potência (Figura 13) e as duas preparações do FSH recombinante (Per.C6 e derivado do CHO) exibem perfis muito semelhantes neste ensaio.
Exemplo 11 Visão geral da produção e purificação
Um procedimento foi desenvolvido para produzir o FSH em células PER.C6 que foram cultivadas em suspensão em meio isento de soro. O procedimento é descrito abaixo e foi aplicado a várias linhas celulares PER.C6 produtoras do FSH. O FSH a partir do clone parental 005, clone 007 em a2,3 e clone 059 em a2,6 foi preparado usando uma modificação do método descrito por Lowry et al. (1976).
Para a produção do FSH PER.C6, as linhas celulares foram adaptadas a um meio isento de soro, ou seja, Exceli 525 (JRH Biosciences). As células foram primeiro cultivadas para formar uma monocamada confluente de 70%-90% em um frasco de cultura T80. Na passagem, as células foram ressuspensas no meio isento de soro, Exceli 525 + 4 mM L-glutamina, a uma densidade celular de 0.3xl06 células/ml. Uma suspensão celular de 25 ml foi colocada em um frasco agitador de 250 ml e agitado a 100 rpm a 37 °C em 5% de CO2 · Após atingir uma densidade celular de > lxlO6 células/ml, as células foram sub-cultivadas a uma densidade celular de 0.2 ou 0.3xl06 células/ml e ainda mais cultivadas em frascos de agitação a 37°C, em 5% de CO2 e 100 rpm.
Para a produção do FSH, as células foram transferidas para um meio de produção isento de soro, ou seja, VPRO (JRH Biosciences), que suporta o crescimento de células PER.C6 para densidades celulares muito elevadas (geralmente> 107 células / ml em um lote de cultura) . As células foram primeiro cultivadas até > 1x106 células / ml em Exceli 525 e, em seguida centrifugadas durante 5 min a 1000 rpm e em seguida suspensas em um meio VPRO + 6 mM de L-glutamina a uma densidade de lxlO6 células / ml. As células foram então cultivadas em um frasco agitador durante 7-10 dias a 37° C, em 5% de C02 e 100 rpm. Durante este período, as células cresceram até uma densidade de > 107 células / ml. O meio de cultura foi colhido após a viabilidade celular começar a diminuir. As células foram centrifugadas durante 5 min a 1000 rpm e o sobrenadante foi usado para a quantificação e a purificação do FSH. A concentração do FSH foi determinada usando ELISA (DRG EIA 1288).
Depois disso, a purificação do FSH foi levada a cabo usando uma modificação do método descrito por Lowry et al. (1976). Isto foi conseguido por meio de cromatografia em celulose DEAE, filtração em gel em Sephadex G100, adsorção cromatografia em hidroxiapatite, e eletroforese em poliacrilamida preparativa.
Durante todos os procedimentos cromatográficos, a presença do FSH imunorreativo foi confirmada por RIA (DRG EIA 1288) e IEF (Exemplo 6).
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Hormônio foilculo-estimulante alfa polipéptido Número de acesso AH007338 Sequência nucleotidica do FSH alfa
1 ATGGATTACT ACAGAAAATA TGCAGCTATC lTrCTGGTCA CAUGTCGGT GlTTCTGCAT
61 GlTCTCCATT CCGCTCCTGA TGTGCAGGAT TGCCCAGMT GCACGCTACA GGAAACCCA
121 TTCTTCTCCC AGCCGGGTGC CCCAATACTT CAGTGCATGG GCTGCTGCTT CTCTAGAGCA
181 TATCCCACTC CACTAAGGTC CMGAAGACG ATGTTGGTCC MMGAACGT CACCTCAGAG
241 TCCACTTGCT GTGTAGCTAA ATCATATMC AGGGTCACAG TMTGGGGGG TTTCAAAGTG 301 GAGAACCACA CGGCGTGCCA CTGCAGTACT TGTTAUATC ACAATCTTA A Sequência proteica do FSH alfa
1 MKTLQFFFLF CCWKAICCNS CELTNITIAI EKEECRFCIS INTTWCAGYC YTRDLVYKDP
61 ARPKIQKTCT FKELVYETVR VPGCAHHADS LYTYPVATQC HCGKCDSDST
DCTVRGLGPS
121 YCSFGEMKE SEQ ID 2
Hormônio foilculo-estimulante beta polipéptido Número de acesso NM 000510 Sequência nucleotídica do FSH beta
1 ATGAAGACAC TCCAGTTTTT CTTCCTTTTC TGTTGCTGGA AAGCAATCTG CTGCAATAGC
61 TGTGAGCTGA CCAACATCAC CATTGCAATA GAGAAAGAAG AATGTCGTTT CTGCATAAGC
121 ATCAACACCA CTTGGTGTGC TGGCTACTGC TACACCAGGG ATCTGGTGTA TAAGGACCCA
181 GCCAGGCCCA AAATCCAGAA AACATGTACC TTCAAGGAAC TGGTATATGA AACAGTGAGA
241 GTGCCCGGCT GTGCTCACCA TGCAGATTCC TTGTATACAT ACCCAGTGGC CACCCAGTGT
301 CACTGTGGCA AGTGTGACAG CGACAGCACT GATTGTACTG TGCGAGGCCT GGGGCCCAGC 361 TACTGCTCCT TTGGTGAAAT GAAAGAATAA Sequência proteica do FSH beta
1 MKTLQFFFLF CCWKAICCNS CELTNITIAI EKEECRFCIS INTTWCAGYC YTRDLVYKDP
61 ARPKIQKTCT FKELVYETVR VPGCAHHADS LYTYPVATQC HCGKCDSDST
DCTVRGLGPS
121 YCSFGEMKE SEQ ID 3
Beta-galactosidase alfa-2,3-sialiltransferase 4 Número de acesso L23767 Sequência nucleotídica do ST3GAL4
1 ATGTGTCCTG CAGGCTGGAA GCTCCTGGCC ATGTTGGCTC TGGTCCTGGT
CGTCATGGTG
61 TGGTATTCCA TCTCCCGGGA AGACAGGTAC ATCGAGCTTT TTTAI 11ICC CATCCCAGAG
121 AAGAAGGAGC CGTGCCTCCA GGGTGAGGCA GAGAGCAAGG CCTCTAAGCT CTTTGGCAAC
181 TACTCCCGGG ATCAGCCCAT CTTCCTGCGG CTTGAGGATT ATTTCTGGGT CAAGACGCCA
241 TCTGCTTACG AGCTGCCCTA TGGGACCAAG GGGAGTGAGG ATCTGCTCCT CCGGGTGCTA
301 GCCATCACCA GCTCCTCCAT CCCCAAGMC ATCCAGAGCC TCAGGTGCCG CCGCTGTGTG
361 GTCGTGGGGA ACGGGCACCG GCTGCGGAAC AGCTCACTGG GAGATGCCAT CAACAAGTAC
421 GATGTGGTCA TCAGATTGAA CAATGCCCCA GTGGCTGGCT ATGAGGGTGA CGTGGGCTCC
481 AAGACCACCA TGCGTCTCTT CTACCCTGAA TCTGCCCACT TCGACCCCAA AGTAGAAAAC
541 AACCCAGACA CACTCCTCGT CCTGGTAGCT TTCAAGGCAA TGGACTTCCA CTGGATTGAG
601 ACCATCCTGA GTGATAAGAA GCGGGTGCGA AAGGGTTTCT GGAAACAGCC TCCCCTCATC
661 TGGGATGTCA ATCCTAAACA GATTCGGATT CTCAACCCCT TCTTCATGGA GATTGCAGCT
721 GACAAACTGC TGAGCCTGCC AATGCAACAG CCACGGAAGA TTAAGCAGAA GCCCACCACG
781 GGCCTGTTGG CCATCACGCT GGCCCTCCAC CTCTGTGACT TGGTGCACAT TGCCGGCTTT
841 GGCTACCCAG ACGCCTACAA CAAGAAGCAG ACCATTCACT ACTATGAGCA GATCACGCTC
901 AAGTCCATGG CGGGGTCAGG CCATAATGTC TCCCAAGAGG CCCTGGCCAT TAAGCGGATG 961 CTGGAGATGG GAGCTATCAA GAACCTCACG TCCTTCTGA Sequência proteica do ST3GAL4
1 MCPAGWKLLA MLALVLWMV WYSISREDRY IELFYFPIPE KKEPCLQGEA ESKASKLFGN
61 YSRDQPIFLR LEDYFWVKTP SAYELPYGTK GSEDLLLRVL AITSSSIPKN IQSLRCRRCV
121 WGNGHRLRN SSLGDAINKY DWIRLNNAP VAGYEGDVGS KTTMRLFYPE SAHFDPKVEN
181 NPDTLLVLVA FKAMDFHWIE TILSDKKRVR KGFWKQPPLI WDVNPKQIRI LN PFFMEIAA
241 DKLLSLPMQQ PRKIKQKPTT GLLAITLALH LCDLVHIAGF GYPDAYNKKQ TIHYYEQITL 301 KSMAGSGHNV SQEALAIKRM LEMGAIKNLT SF SEQ ID 4
Beta-galactosidase alfa-2,6-sialiltransferase 1 Número de acesso NM_003032 Sequência nucleotidica do ST6GAL
1 ATGATTCACA CCAACCTGAA GAAAAAGTTC AGCTGCTGCG TCCTGGTCTT TCTTCTGTTT
61 GCAGTCATCT GTGTGTGGAA GGAAAAGAAG AAAGGGAGTT ACTATGATTC CTTTAAATTG
121 CAAACCAAGG AATTCCAGGT GTTAAAGAGT CTGGGGAAAT TGGCCATGGG GTCTGATTCC
181 CAGTCTGTAT CCTCAAGCAG CACCCAGGAC CCCCACAGGG GCCGCCAGAC CCTCGGCAGT
241 CTCAGAGGCC TAGCCAAGGC CWCCAGAG GCCTCCTTCC AGGTGTGGAA CAAGGACAGC
301 TCTTCCAAAA ACCTTATCCC TAGGCTGCAA AAGATCTGGA AGAATTACCT AAGCATGAC
361 AAGTACAAAG TGTCCTACAA GGGGCCAGGA CCAGGCATCA AGTTCAGTGC AGAGGCCCTG
421 CGCTGCCACC TCCGGGACCA TGTGAATGTA TCCATGGTAG AGGTCACAGA TTTTCCCTTC
481 AATACCTCTG MTGGGAGGG TTATCTGCCC AAGGAGAGCA TTAGGACCAA GGCTGGGCCT
541 TGGGGCAGGT GTGCTGTTGT GTCGTCAGCG GGATCTCTGA AGTCCTCCCA ACTAGGCAGA
601 GAAATCGATG ATCATGACGC AGTCCTGAGG TTTAATGGGG CACCCACAGC CAACTTCCAA
661 CAAGATGTGG GCACAMAAC TACCATTCGC CTGATGAACT CTCAGTTGGT TACCACAGAG
721 AAGCGCTTCC TCAAAGACAG TTTGTACAAT GAAGGAATCC TIATTGTATG GGACCCATCT
781 GTATACCACT CAGATATCCC AAAGTGGTAC CAGAATCCGG ATTATAATTT CTTTAACAAC
841 TACAAGACTT ATCGTAAGCT GCACCCCAAT CAGCCCI iii ACATCCTCAA GCCCCAGATG
901 CCTTGGGAGC TATGGGACAT TCTTCAAGAA ATCTCCCCAG AAGAGATTCA GCCAAACCCC
961 CCATCCTCTG GGATGCTTGG TATCATCATC ATGATGACGC TGTGTGACCA GGTGGATATT
1021 TATGAGTTCC TCCCATCCM GCGCAAGACT GACGTGTGCT ACTACTACCA GAAGTTCTTC
1081 GATAGTGCCT GCACGATGGG TGCCTACCAC CCGCTGCTCT ATGAGAAGAA TTTGGTGAAG
1141 CATCTCAACC AGGGCACAGA TGAGGACATC TACCTGCTTG GAAAAGCCAC ACTGCCTGGC
1201 TTCCGGACCA TTCACTGCTA A 0p-
Sequência proteica do ST6GAL1
1 MIHTNLKKKF SCCVLVFLLF AVICVWKEKK KGSYYDSFKL QTKEFQVLKS LGKLAMGSDS
61 QSVSSSSTQD PHRGRQTLGS LRGLAKAKPE ASFQVWNKDS SSKNLIPRLQ KIWKNYLSMN
121 KYKVSYKGPG PGIKFSAEAL RCHLRDHVNV SMVEVTDFPF NTSEWEGYLP
KESI RTKAGP
181 WGRCAVVSSA GSLKSSQLGR EIDDHDAVLR FNGAPTANFQ QDVGTKTTIR LM NSQ LVTTE
241 KRFLKDSLYN EGILIVWDPS VYHSDIPKWY QNPDYNFFNN YKTYRKLHPN QPFYI LKPQM
301 PWELWDILQE ISPEEIQPNP PSSGMLGIII MMTLCDQVDI YEFLPSKRKT DVCYYYQKFF
361 DSACTMGAYH PLLYEKNLVK HLNQGTDEDI YLLGKATLPG FRTIHC
Foram aqui divulgados, anteriormente, os FSHs recombinantes, as preparações de FSH recombinante, as composições farmacêuticas, usos e métodos definidos pelos seguintes parágrafos numerados: 1. O FSH recombinante (rFSH) incluindo a2,3- e oé2,6-sialilação. 2. O FSH recombinante de acordo com o parágrafo 1, tem um conteúdo de ácido siálico [expresso em termos de um rácio de moles de ácido siálico para moles de proteína] de 6 mol/mol ou maior. 3. O FSH recombinante de acordo com o parágrafo 1 ou parágrafo 2, tem um conteúdo de ácido siálico compreendido entre 6 mol/mol e 15 mol/mol. 4. O FSH recombinante de acordo com qualquer parágrafo precedente em que 10% ou mais da sialilação total é a.2,3-sialilação. 5. O FSH recombinante de acordo com qualquer parágrafo precedente que inclua a2,3-sialilação numa quantidade que é de 65 a 85% da sialilação total. 6. 0 FSH recombinante de acordo com qualquer parágrafo precedente que inclua a2,3-sialilação numa quantidade que é de 70 a 80% da sialilação total. 7. O FSH recombinante de acordo com qualquer parágrafo v em que 50% ou menos da sialilação total é a2,6-sialilação. 8. O FSH recombinante de acordo com qualquer parágrafo precedente que inclua a2,6-sialilação numa quantidade que é de 15 a 35% da sialilação total. 9. O FSH recombinante de acordo com qualquer parágrafo precedente que inclua a2,6-sialilação numa quantidade que é de 20 a 30% da sialilação total, 10. O FSH recombinante de acordo com qualquer parágrafo precedente que inclua ainda a2,8-sialilação. 11. O FSH recombinante de acordo com qualquer parágrafo precedente em que o conteúdo de ácido siálico é de 6% ou maior em massa. 12. O FSH recombinante de acordo com qualquer parágrafo precedente produzido ou expresso numa linha celular humana. 13. O FSH recombinante de acordo com qualquer parágrafo precedente produzido ou expresso numa linha celular Per.C6, uma linha celular derivada de Per.C6 ou uma linha celular Per.C6 modificada. 14. O FSH recombinante de acordo com o parágrafo 12 ou 13, em que a linha celular foi modificada usando a2,3-sialiltransferase. 15. 0 FSH recombinante de acordo com qualquer um dos parágrafos 12 a 14, que incluem ácidos siálicos oí2,6-ligados (sialilação a2,6) fornecidos pela actividade da transferase sialil endógena. 16. 0 FSH recombinante expresso numa linha celular humana. 17. 0 FSH recombinante de acordo com o parágrafo 16 em que 10% ou mais da sialilação total é a2,3-sialilação. 18. O FSH recombinante de acordo com o parágrafo 16 ou 17 que inclui a2,3-sialilação numa quantidade que é de 65 a 85% da sialilação total. 19. O FSH recombinante de acordo com qualquer um dos parágrafos 16 a 18, em que 50% ou menos da sialilação total é a2,6-sialilação. 20. O FSH recombinante de acordo com qualquer um dos parágrafos 16 a 19, que inclui a2,6-sialilação numa quantidade que é de 15 a 35% da sialilação total. 21. O FSH recombinante de acordo com qualquer um dos parágrafos 16 a 20 que inclui um conteúdo de ácido siálico [expresso em termos de um rácio de moles de ácido siálico para moles de proteína] de 6 mol/mol ou maior. 22. O FSH recombinante de acordo com qualquer um dos parágrafos 16 ou 21 incluindo a2,3-sialilação e oí2, 6-sialilação. 23. Uma preparação de FSH recombinante incluindo a2,3- e a2,6-sialilação. 24. Uma preparação de acordo com o parágrafo 23 que é uma preparação farmacêutica. 25. Uma preparação de acordo com o parágrafo 23 ou 24 com um conteúdo de ácido siálico [expresso em termos de um rácio de moles de ácido siálico para moles de proteína] de 6 mol/mol ou mais. 26. Uma preparação de acordo com qualquer um dos parágrafos 23 a 25 em que 10% ou mais da sialilação total é oí2,3-sialilação. 27. Uma preparação de acordo com qualquer um dos parágrafos 23 a 26 que inclui a2,3-sialilação numa quantidade que é de 65 a 85% da sialilação total. 28. Uma preparação de acordo com qualquer um dos parágrafos 23 a 27 em que 50% ou menos da sialilação total é oí2,6-sialilação. 29. Uma preparação de acordo com qualquer um dos parágrafos 23 a 28, que inclui a2,6-sialilação numa quantidade que é de 15 a 35% da sialilação total. 30. Uma preparação de acordo com qualquer um dos parágrafos 23 a 29 produzida ou expressa em uma linha celular humana. 31. Uma composição farmacêutica compreendendo o rFSH incluindo a2,3-sialilação e a2,6-sialilação. 32. Uma composição farmacêutica de acordo com o parágrafo 31 em que 10% ou mais da sialilação total é a2,3-sialilação. 33. Uma composição farmacêutica de acordo com os parágrafos 31 ou 32 que inclui a2,3-sialilação numa quantidade que é de 65 a 85% da sialilação total. 34. Uma composição farmacêutica de acordo com qualquer um dos parágrafos 31 a 33 em que 50% ou menos da sialilação total é a2,6-sialilação. 35. Uma composição farmacêutica de acordo com qualquer um dos parágrafos 31 a 33, que inclui a2,6-sialilação numa quantidade que é de 15 a 35% da sialilação total. 36. Uma composição farmacêutica compreendendo um rFSH de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 22 e/ou uma preparação de acordo com qualquer um dos parágrafos 23 a 30 . 37. Uma composição farmacêutica de acordo com qualquer um dos parágrafos 31 a 36 compreendendo ainda hCG e/ou LH. 38. Uma composição farmacêutica de acordo com qualquer um dos parágrafos 31 a 37 para uso no tratamento da infertilidade. 39. Um método do tratamento da infertilidade compreendendo uma fase de administração a um indivíduo de uma composição compreendendo rFSH de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 22 e/ou uma preparação de acordo com qualquer um dos parágrafos 23 a 30 e/ou uma composição farmacêutica de acordo com qualquer dos parágrafos 31 a 37. 40. O uso do rFSH de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 22 e/ou uma preparação de rFSH de acordo com qualquer um dos parágrafos 23 a 30 no fabrico de um medicamento para o tratamento da infertilidade. 41. Um método de produção de rFSH de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 22 e/ou uma preparação de rFSH de acordo com qualquer um dos parágrafos 23 a 30 compreendendo a fase de produzir ou expressar o rFSH em uma linha celular humana.
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<210> 1 <211> 351 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> SEQ ID 1 Sequência Nucleotidica de FSH alfa <4 0 0> 1 atggattact acaqaaaata tgcagctatc tttctggtca cattqtcqgt gtttctgcat 60 gttctccatt ccgctcctga tgtgcaggat tgcccagaat gcacgctaca ggaaaaccca 120 ttcttctccc agccgggtgc cccaatactt cagtgcatgg gctgctgctt ctctagagca 180 tatcccactc cactaaggtc caagaagacg atgttggtcc aaaagaacgt cacctcagag 240 tccacttqct qtgtagctaa atcatataac aggqtcacag taatqqqqqq tttcaaaqtg 300 gagaaccaca cggcgtgcca ctgcagtact tqttattatc acaaatctta a 351
<210> 2 <211> 390 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> SEQ ID 2 Sequência Nucleotidica de FSH beta <400> 2 atgaaqacac tccaqttttt cttccttttc tqttgctqga aagcaatctg ctgcaataqc 60 tgtgagctga ccaacatcac cattqcaata gagaaagaag aatgtcgttt ctgcataagc 120 atcaacacca cttgqtgtgc tggctactgc tacaccaggg atctqgtgta taaggaccca 180 gccaggccca aaatccagaa aacatgtacc ttcaaggaac tggtatatga aacagtgaga 240 qtgcccggct gtgctcacca tgcagattcc ttgtatacat acccagtgqc cacccagtgt 300 cactgtqgca agtqtqacaq cgacagcact gattgtactg tgcgaggcct qqggcccagc 360 tactgctcct ttggtgaaat gaaagaataa 390
<210> 3 <211> 999 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> SEQ ID 3 Sequência Nucleotidica de ST3GAL4 <400> 3 atgtqtcctq caggctqqaa gctcctggcc atgttggctc tggtcctqgt cqtcatgqtg 60 tggtattcca tctcccggga agacaggtac atcgagcttt tttattttcc catcccagag 120 aagaaggagc cgtgcctcca qqgtqagqca qaqaqcaaqg cctctaaqct ctttggcaac 180 tactcccqgg atcagcccat cttcctgcgg cttgaggatt atttctgggt caagacgcca 240 tctgcttacq agctgcccta tqgqaccaaq qqgagtgagg atctgctcct ccqqqtgcta 300 qccatcacca qctcctccat ccccaaqaac atccagaqcc tcaqqtqccg ccgctgtqtg 360 gtcgtgggga acgggcaccg gctqcggaac agctcactqg gagatgccat caacaagtac 420 gatgtggtca tcagattgaa caatgcccca qtggctggct atgagggtga cgtgggctcc 480 aagaccacca tgcqtctctt ctaccctgaa tctgcccact tcgaccccaa aqtagaaaac 540 aacccagaca cactcctcgt cctggtagct ttcaaggcaa tggacttcca ctggattgag 600 accatcctga qtgataagaa gcgggtgcga aagggtttct ggaaacagcc tcccctcatc 660 tgggatgtca atcctaaaca gattcggatt ctcaacccct tcttcatgga gattgcagct 720 gacaaactgc tgagcctgcc aatgcaacag ccacggaaga ttaagcagaa gcccaccacg 780 ggcctgttgg ccatcacgct ggccctccac ctctgtgact tqgtgcacat tgccggcttt 840 ggctacccag acgcctacaa caagaagcag accattcact actatgagca gatcacgctc 900 aagtccatgg cggggtcagg ccataatgtc tcccaagagg ccctggccat taagcggatg 960 ctggagatgg gagctatcaa gaacctcacg tccttctga 999 <210> 4 <211> 1221
<212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> SEQ ID 4 Sequência Nucleotidica de ST6GAL1 <400> 4 atgattcaca ccaacctgaa qaaaaagttc aqctgctgcg tcctgqtctt tcttctqttt 60 gcagtcatct qtqtqtqgaa ggaaaagaag aaagggaqtt actatgattc ctttaaattg 120 caaaccaagg aattccaqgt gttaaagagt ctggggaaat tggccatggg qtctgattcc 180 caqtctgtat cctcaagcag cacccaggac ccccacaggg gccgccagac cctcggcaqt 240 ctcagaggcc tagccaaggc caaaccagag gcctccttcc agqtgtggaa caaggacagc 300 tcttccaaaa accttatccc taggctgcaa aagatctgga aqaattacct aagcatgaac 360 aagtacaaag tgtcctacaa ggggccagga ccaggcatca agttcagtgc agaggccctg 420 cgctgccacc tccgggacca tgtgaatgta tccatggtag aggtcacaga ttttcccttc 480 aatacctctg aatgggaggg ttatctgccc aaggagagca ttaggaccaa gqctgggcct 540 tggggcaggt gtgctgttgt gtcqtcagcg ggatctctga agtcctccca actaggcaga 600 gaaatcgatg atcatgacgc aqtcctgagg tttaatgqgg cacccacagc caacttccaa 660 caagatqtqg qcacaaaaac taccattcgc ctgatqaact ctcaqttggt taccacagag 720 aagcgcttcc tcaaagacag tttgtacaat gaaggaatcc taattgtatg gqacccatct 780 gtataccact cagatatccc aaagtggtac cagaatccgg attataattt ctttaacaac 840 tacaagactt atcgtaagct gcaccccaat cagccctttt acatcctcaa gccccagatg 900 ccttgggagc tatgggacat tcttcaagaa atctccccag aagagattca gccaaacccc 960 ccatcctctg ggatgcttgg tatcatcatc atgatgacgc tgtgtgacca ggtggatatt 1020 tatgagttcc tcccatccaa gcgcaagact gacqtgtgct actactacca gaagttcttc 1080 gatagtqcct gcacgatggg tgcctaccac ccgctgctct atgagaagaa tttggtgaag 1140 catctcaacc agggcacaga tgaggacatc tacctgcttg gaaaagccac actgcctggc 1200 ttccggacca ttcactgcta a 1221
<210> 5 <211> 129 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sequência Proteica de FSH alfa <400> 5
Met Lys Thr Leu Gin Phe Phe Phe Leu Phe Cys Cys Trp Lys Ala lie 15 10 15
Cys Cys Asn Ser Cys Glu Leu Thr Asn lie Thr lie Ala lie Glu Lys 20 25 30
Glu Glu Cys Arg Phe Cys Ile Ser Ile Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly 35 40 45
Tyr Cys Tyr Thr Arg Asp Leu Vai Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Lys 50 55 60
Ile Gin Lys mr Cys Thr Phe Lys Glu Leu Vai Tyr Glu Thr Vai Arg 65 70 75 80
Vai Pro Gly Cys Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Vai 85 90 95
Ala Thr Gin Cys His Cys Gly Lys Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp Cys 100 105 110
Thr Vai Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Gly Glu Met Lys 115 120 125
Glu
<210> 6 <211> 129 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sequência Proteica de FSH beta <4 0 0> 6
Met Lys Thr Leu Gin Phe Phe Phe Leu Phe Cys Cys Trp Lys Ala Ile 15 10 15
Cys Cys Asn Ser Cys Glu Leu Thr Asn Ile Thr Ile Ala Ile Glu Lys 20 25 30
Glu Glu Cys Arg Phe Cys Ile Ser Ile Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly 35 40 45
Tyr Cys Tyr Thr Arg Asp Leu Vai Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Lys 50 55 60
Ile Gin Lys Thr Cys Thr Phe Lys Glu Leu Vai Tyr Glu Thr Vai Arg 65 70 75 80
Vai Pro Gly Cys Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Vai 85 90 95
Ala Thr Gin Cys His Cys Gly Lys Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp Cys 100 105 110
Thr Vai Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Pha Gly Glu Mat Lys 115 120 125
Glu
<210> 7 <211> 332 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sequência Proteica de ST3GAL4 <400> 7
Met Cys Pro Ala Gly Trp Lys Leu Leu Ala Met Leu Ala Leu Vai Leu 15 10 15
Vai Vai Met Vai Trp Tyr Ser Ile Ser Arg Glu Asp Arg Tyr Ile Glu 20 25 30
Leu Phe Tyr Phe Pro lie Pro Glu Lys Lys Glu Pro Cys Leu Gin Gly 35 40 45
Glu Ala Glu Ser Lys Ala Ser Lys Leu Phe Gly Asn Tyr Ser Arg Asp 50 55 60
Gin Pro lie Phe Leu Arg Leu Glu Asp Tyr Phe Trp Val Lys Thr Pro 65 70 75 80
Ser Ala Tyr Glu Leu Pro Tyr Gly Thr Lys Gly Ser Glu Asp Leu Leu 85 90 95
Leu Arg Val Leu Ala lie Thr Ser Ser Ser lie Pro Lys Asn lie Gin 100 105 110
Ser Leu Arg Cys Arg Arg Cys Val Val Val Gly Asn Gly His Arg Leu 115 120 125
Arg Asn Ser Ser Leu Gly Asp Ala lie Asn Lys Tyr Asp Val Val lie 130 135 140
Arg Leu Asn Asn Ala Pro Val Ala Gly Tyr Glu Gly Asp Val Gly Ser 145 150 155 160
Lys Thr Thr Met Arg Leu Phe Tyr Pro Glu Ser Ala His Phe Asp Pro 165 170 175
Lys Val Glu Asn Asn Pro Asp Thr Leu Leu Val Leu Val Ala Phe Lys 180 185 190
Ala Met Asp Phe His Trp lie Glu Thr lie Leu Ser Asp Lys Lys Arg 195 200 205
Val Arg Lys Gly Phe Trp Lys Gin Pro Pro Leu lie Trp Asp Val Asn 210 215 220
Pro Lys Gin lie Arg lie Leu Asn Pro Phe Phe Met Glu lie Ala Ala 225 230 235 240
Asp Lys Leu Leu Ser Leu Pro Met Gin Gin Pro Arg Lys lie Lys Gin 245 250 255
Lys Pro Thr Thr Gly Leu Leu Ala lie Thr Leu Ala Leu His Leu Cys 260 265 270
Asp Leu Val His lie Ala Gly Phe Gly Tyr Pro Asp Ala Tyr Asn Lys 275 280 285
Lys Gin Thr lie His Tyr Tyr Glu Gin lie Thr Leu Lys Ser Met Ala 290 295 300
Gly Ser Gly His Asn Val Ser Gin Glu Ala Leu Ala lie Lys Arg Met 305 310 315 320
Leu Glu Met Gly Ala lie Lys Asn Leu Thr Ser Phe 325 330
<210> 8 <211> 406 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Sequência Proteica de ST6GAL1 <400> 8
Met lie His Thr Asn Leu Lys Lys Lys Phe Ser Cys Cys Val Leu Val 15 10 15
Phe Leu Leu Phe Ala Val lie Cys Val Trp Lys Glu Lys Lys Lys Gly 20 25 30
Ser Tyr Tyr Asp Ser Phe Lys Leu Gin Thr Lys Glu Phe Gin Val Leu 35 40 45
Lys Ser Leu Gly Lys Leu Ala Met Gly Ser Asp Ser Gin Ser Val Ser 50 55 60
Ser Ser Ser Thr Gin Asp Pro His Arg Gly Arg Gin Thr Leu Gly Ser 65 70 75 80
Leu Arg Gly Leu Ala Lys Ala Lys Pro Glu Ala Ser Phe Gin Val Trp 85 90 95
Asn Lys Asp Ser Ser Ser Lys Asn Leu lie Pro Arg Leu Gin Lys lie 100 105 110
Trp Lys Asn Tyr Leu Ser Met Asn Lys Tyr Lys Val Ser Tyr Lys Gly 115 120 125
Pro Gly Pro Gly lie Lys Phe Ser Ala Glu Ala Leu Arg Cys His Leu 130 135 140
Arg Asp His Val Asn Val Ser Met Val Glu Val Thr Asp Phe Pro Phe 145 150 155 160
Asn Thr Ser Glu Trp Glu Gly Tyr Leu Pro Lys Glu Ser lie Arg Thr 165 170 175
Lys Ala Gly Pro Trp Gly Arg Cys Ala Val Val Ser Ser Ala Gly Ser 180 185 190
Leu Lys Ser Ser Gin Leu Gly Arg Glu lie Asp Asp His Asp Ala Val 195 200 205
Leu Arg Phe Asn Gly Ala Pro Thr Ala Asn Phe Gin Gin Asp Val Gly 210 215 220
Thr Lys Thr Thr lie Arg Leu Met Asn Ser Gin Leu Val Thr Thr Glu 225 230 235 240
Lys Arg Phe Leu Lys Asp Ser Leu Tyr Asn Glu Gly lie Leu lie Val 245 250 255
Trp Asp Pro Ser Val Tyr His Ser Asp lie Pro Lys Trp Tyr Gin Asn 260 265 270
Pro Asp Tyr Asn Phe Phe Asn Asn Tyr Lys Thr Tyr Arg Lys Leu His 275 280 285
Pro Asn Gin Pro Phe Tyr lie Leu Lys Pro Gin Met Pro Trp Glu Leu 290 295 300
Trp Asp lie Leu Gin Glu lie Ser Pro Glu Glu lie Gin Pro Asn Pro 305 310 315 320
Pro Ser Ser Gly Met Leu Gly lie lie lie Met Met Thr Leu Cys Asp 325 330 335
Gin Val Asp lie Tyr Glu Phe Leu Pro Ser Lys Arg Lys Thr Asp Val 340 345 350
Cys Tyr Tyr Tyr Gin Lys Phe Phe Asp Ser Ala Cys Thr Met Gly Ala 355 360 365
Tyr His Pro Leu Leu Tyr Glu Lys Asn Leu Val Lys His Leu Asn Gin 370 375 380
Gly Thr Asp Glu Asp lie Tyr Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Pro Gly 385 390 395 400
Phe Arg Thr lie His Cys 405
<210> 9 <211> 39 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> PCR Primer FSHa-fw <400> 9 ccaggatccg ccaccatgga ttactacaga aaaatatgc 39
<210> 10 <211> 31 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> PCR Primer FSHa-rev <4 0 0> 10 ggatggctag cttaagattt gtgataataa c 31
<210> 11 <211> 35 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> PCR Primer FSHb-fw <4 0 0> 11 ccaggcgcgc caccatgaag acactccagt ttttc 35
<210> 12 <211> 36 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> PCR Primer FSHb-rev <4 0 0> 12 ccgggttaac ttattattct ttcatttcac caaagg 36
<210> 13 <211> 37 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> PCR Primer 2,3STfw <4 0 0> 13 ccaggatccg ccaccatgtg tcctgcaggc tggaagc 37
<210> 14 <211> 35 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> PCR Primer 2,3STrev <4 0 0> 14 tttttttctt aagtcagaag gacgtgaggt tcttg 35 <210> 15 <211> 36
<212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> PCR Primer 2,6STfw <4 0 0> 15
ccaggatccg ccaccatgat tcacaccaac ctgaag 36 <210> 16 <211> 32 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> PCR Primer 2,6STrev <4 0 0> 16 tttttttctt aagttagcag tgaatggtcc gg 32
Claims (13)
- Reivindicações 1. 0 FSH recombinante (rFSH) incluindo a2,3- e oé2,6- sialilação em que 80% ou mais da sialilação total é oí2,3-sialilação e em que de 5% a 20% da sialilação total é a2,6-sialilação.
- 2. O FSH recombinante de acordo com a reivindicação 1 expresso em uma linha celular humana.
- 3. Uma composição farmacêutica compreendendo o rFSH de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2
- 4. Uma composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 3 compreendendo ainda hCG e/ou LH.
- 5. Uma composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 3 ou 4 para uso no tratamento da infertilidade.
- 6. Um método de produção de rFSH de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, compreendendo a fase de produção ou expressão do rFSH em uma linha celular humana.
- 7. Um método de acordo com a reivindicação 6 em que a linha celular tenha sido modificada usando a2,3-sialiltransferase e/ou a2,6-sialiltransferase. Resumo Preparações incluindo recombinante FSH (rFSH). Figura 1. vetor de expressão do FSHAs Figs 1, 2 e 3: Mapas de plasmideos dos vectores de expressão pFSHalfa/beta, pST3 e pST6. CMV = promotor do citomegalovirus, BGHp (A) = sequência de poli-adenilação da hormona de crescimento de bovina, fl ori = fl origem da replicação, SV40 = promotor do virus Simian 40, Neo = marcador de resistência à neomicina, Hyg = marcador de resistência à higromicina, SV40 p (A) = sequência de poli-adenilação do virus Simian 40, FSH A = hormônio foliculo-estimulante polipéptido alfa, FSH B = hormônio foliculo-estimulante polipéptido beta, ST3GAL4 = ot2,3- sialiltransferase, ST6GAL1 = a2, 6-sialiltransferase, ColEl = ColEl origem da replicação, Amp = marcador de resistência à ampicilina. Figura 1. vetor de expressão do FSHFigura 2. vetor de expressão a2,3-sialiltransferase (ST3GAL4)Figura 3. vetor de expressão a2,3-sialiltransferase (ST6GAL1)Figura 4. A focalização isoeléctrica do FSH recombinante produzido por células Per.C6 expressando o FSH de forma estável. Os sobrenadantes da cultura celular foram separados sob condições nativas em um gradiente de pH 3.0-7.0. O clone 005 é representativo dos cinco clones levados adiante para a engenharia da sialiltransferase. Os clones contendo menos isoformas acidicas foram eliminados.Figura 5. Exemplo de clones analisados por focagem isoeléctrica do FSH recombinante produzido por células Per.C6 expressando o FSH de forma estável após engenharia com a2,3- ou a2,6-sialiltransferase. Os sobrenadantes da cultura celular foram separados sob condições nativas em um gradiente de pH 3.0-7.0. O clone 005 é a linha celular do FSH Per.C6 parental. Os clones que apresentam perfis básicos ou misturados foram descontinuados (*) . Os clones restantes demonstram uma engenharia bem sucedida com uma sialiltransferase para aumentar o número de moléculas de ácido siálico no FSH.Figura 6. Análise das ligações de ácido siálico do FSH Per.C6. 0 FSH Per.C6 purificado foi separado por SDS PAGE em géis duplicados, transferido para a nitrocelulose e visualizado usando o Kit de Diferenciação de Glicano DIG (Cat. No. 11 210 238 001, Roche) de acordo com as instruções do fabricante. As reações positivas com Sambucus nigra agglutinin (SNA) indicaram um ácido siálico (2-6) ligado terminalmente (A) . As reações positivas com Maackia amurensis agglutinin (MAA): indicaram um ácido siálico (2-3) ligado terminalmente (B). A faixa I, controlo de fabricantes contendo apenas ligações α2,6. A faixa II controlo de fabricantes contendo ligações a2,6 e a2,3. A amostra a, CHO comercial derivado do FSH recombinante (Gonal-f, Serono) . A amostra b, rFSH Per.C6 parental, sem engenharia de sialiltransferase. A amostra c, rFSH Per.C6 com engenharia a2,6-sialiltransferase. A amostra d, rFSH Per.C6 com engenharia a2,3-sialiltransferase.Figura 7. Taxas de depuração metabólica de amostras do FSH Per.C6. Ratos fêmea (3 animais por clone) foram injetados na veia da cauda no tempo zero com um bolo de rFSH (1 - 10 pg/rato). As amostras de sangue recolhidas ao longo do tempo foram ensaiadas quanto ao conteúdo do FSH por ELISA.Figura
- 8. Taxas de depuração metabólica das amostras do FSH Per.C6 projetadas por a2,6-sialiltransferase. Ratos fêmea (3 animais por clone) foram injetados na veia da cauda no tempo zero com um bolo de rFSH (1 - 10 pg/rato) . As amostras de sangue recolhidas ao longo do tempo foram ensaiadas quanto ao conteúdo de FSH por ELISA.Figura
- 9. Taxas de depuração metabólica das amostras do FSH Per.C6 projetadas por a2,6-sialiltransferase com co-administração de um excesso molar de 7500 vezes de asialofetuina para saturar o ASGP-R durante 1-2 h.Figura
- 10. Taxas de depuração metabólica das amostras do FSH Per.C6 projetadas por a2,3-sialiltransferase. As amostras foram escolhidas pelo seu conteúdo de ácido siálico com base no seu perfil IEF.Figura
- 11. Aumento do peso ovariano de acordo com o método de Steelman e Pohley (1953) . 0 rFSH Per.C6 e padrões (Gonal-f rFSH) foram testados em diferentes doses (3 ratos/dose).Figura
- 12. Aumento do peso ovariano de acordo com o método de Steelman andPohley (1953) . 0 rFSH Per.C6 projetado por a2,6-sialiltransferasee e os padrões (Gonal-f rFSH) foram testados em diferentes doses (3 ratos/dose).Figura
- 13. Aumento do peso ovariano de acordo com o método de Steelman and Pohley (1953). 0 rFSH Per.C6 parental, o rFSH Per.C6 projetado por a2,6-sialiltransferasee e os padrões (Gonal-f rFSH) foram testados em cinco doses diferentes (3 ratos/dose).
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