ES2610277T3

ES2610277T3 - FSH recombinante que incluye sialilación en alfa 2,3 y alfa 2,6

Info

Publication number: ES2610277T3
Application number: ES14178729.1T
Authority: ES
Inventors: Ian Cottingham; Daniel Plaksin; Richard Boyd White
Original assignee: Ferring BV
Current assignee: Ferring BV
Priority date: 2008-04-16
Filing date: 2009-04-16
Publication date: 2017-04-26
Anticipated expiration: 2029-04-16
Also published as: US9771407B2; LTPA2017018I1; CN102066414A; KR20190092608A; SI3045471T1; AU2017204259A1; EP3045471B1; RU2010141908A; EP3144318A1; PL2268666T3; HK1199039A1; KR20110005863A; TWI488640B; US20110105398A1; US20210332099A1; AU2017204259B2; JP2022031652A; AR071479A1; AU2014203277B2; CN105906703A

Abstract

FSH recombinante (rFSH) que incluye sialilación en α2,3 y α2,6 en la que el 80 % o más de la sialilación total es sialilación en α2,3 y en la que del 5 al 20 % de la sialilación total es sialilación en α2,6.

Description

imagen1

DESCRIPCIÓN

FSH recombinante que incluye sialilación en alfa 2,3 y alfa 2,6

5 La presente invención se refiere a gonadotropinas para su uso en el tratamiento de la infertilidad. En particular se refiere a la hormona estimulante del folículo (FSH por sus siglas en inglés).

Las gonadotropinas son un grupo de hormonas glucoproteínas heterodiméricas que regulan la función gonadal en el macho y la hembra. Incluyen la hormona estimulante del folículo (FSH), la hormona luteinizante (LH) y la gonadotropina coriónica (CG).

FSH se segrega de forma natural por la hipófisis anterior y funciona para apoyar el desarrollo folicular y la ovulación. FSH comprende una subunidad alfa de 92 aminoácidos, también común a las otras hormonas glucoproteínas LH y CG, y una subunidad beta de 111 aminoácidos exclusiva de FSH que confiere la especificidad biológica de la hormona

15 (Pierce y Parsons, 1981). Cada subunidad se modifica postraduccionalmente mediante la adición de restos de carbohidratos complejos. Ambas subunidad portan 2 sitios para unión de glucano unido en N, la subunidad alfa en los aminoácidos 52 y 78 y la subunidad beta en los restos de aminoácidos 7 y 24 (Rathnam y Saxena, 1975, Saxena y Rathnam, 1976). Por tanto, FSH está glucosilada hasta alrededor del 30 % en masa (Dias y Van Roey. 2001. Fox et al. 2001).

Se ha usado FSH purificada de orina humana posmenopáusica durante muchos años en el tratamiento de la infertilidad; tanto para fomentar la ovulación en la reproducción natural como para proporcionar ovocitos para tecnologías de reproducción asistida. A mediados de la década de 1990 estuvieron disponibles dos versiones recombinantes de FSH, Gonal-F (Serono) y Puregon (Organon). Éstas se expresan ambas en células de ovario de

25 hámster chino (CHO) (Howles, 1996).

Hay considerable heterogeneidad asociada con las preparaciones de FSH que se relaciona con diferencias en las cantidades de diversas isoformas presentes. Las isoformas individuales de FSH presentan secuencias de aminoácidos idénticas pero se diferencian en el grado hasta el que están modificadas postraduccionalmente; las isoformas particulares se caracterizan por la heterogeneidad de las estructuras de las ramificaciones de los carbohidratos y las diferentes cantidades de incorporación de ácido siálico (un azúcar terminal), ambas de las cuales parecen influir la bioactividad de la isoforma específica.

La glucosilación de la FSH natural es muy compleja. Los glucanos en la FSH hipofisaria de procedencia natural

35 pueden contener una amplia gama de estructuras que pueden incluir combinaciones de glucanos bi-, tri-y tetraantenarios (Pierce y Parsons, 1981. Ryan et al., 1987. Baenziger y Green, 1988). Los glucanos pueden portar modificaciones adicionales: fucosilación del núcleo, glucosamina bisectante, cadenas extendidas con acetil lactosamina, sialilación parcial o completa, sialilación con enlaces α2,3 y α2,6 y galactosamina sulfatada sustituida por galactosa (Dalpathado et al., 2006). Además, hay diferencias entre la distribución de las estructuras de glucano en los sitios de glucosilación individuales. Se ha encontrado un nivel comparable de complejidad de glucanos en FSH procedente del suero de individuos y de la orina de mujeres posmenopáusicas (Wide et al., 2007).

La glucosilación de productos de FSH recombinante refleja la gama de glucosiltransferasas presentes en la línea celular anfitriona. Los productos de rFSH existentes proceden de células de ovario de hámster chino (células CHO)

45 manipuladas. La gama de modificaciones de glucano en rFSH procedente de CHO es más limitada que las encontradas en los productos naturales, procedentes bien de extractos hipofisarios o bien de orina. Los ejemplos de la reducida heterogeneidad de glucanos encontrada en rFSH procedente de CHO incluyen una falta de glucosamina bisectante y un contenido reducido de fucosilación del núcleo y extensiones de acetil-lactosamina (Hard et al., 1990). Además, las células CHO solo son capaces de añadir ácido siálico usando el enlace α2,3 (Kagawa et al., 1988, Takeuchi et al, 1988, Svensson et al., 1990). Éste es diferente de la FSH producida de forma natural que contiene glucanos con una mezcla de ácido siálico unido en α2,3 y α2,6.

Se ha demostrado que una preparación de FSH recombinante (Organon) se diferencia en las cantidades de FSH con un punto isoeléctrico (pI) por debajo de 4 (consideradas las isoformas ácidas) al comparar con FSH hipofisaria, sérica

55 o de orina posmenopáusica (Ulloa-Aguirre et al., 1995). La cantidad de isoformas ácidas en las preparaciones urinarias fue mucho mayor en comparación con los productos recombinantes, Gonal-f (Serono) y Puregon (Organon) (Andersen et al., 2004). Esto ha de reflejar un contenido molar menor de ácido siálico en la rFSH ya que el contenido de glucano cargado negativamente modificado con sulfato es bajo en FSH. El menor contenido en ácido siálico, comparado con la FSH natural, es una característica de ambos productos de FSH disponibles comercialmente y, por tanto, ha de reflejar una limitación en el proceso de fabricación (Bassett y Driebergen, 2005).

Existe un gran volumen de trabajo científico que analiza e intenta explicar las variaciones en la glucosilación de FSH entre individuos y los cambios durante el transcurso de un ciclo de ovulación. Una de las discusiones principales se refiere a la observación de que tanto la concentración de FSH como el contenido de ácido siálico disminuyen durante 65 la fase preovulatoria del ciclo. El contenido disminuido en ácido siálico resulta en una FSH más básica que tanto se depura más rápidamente como, al menos in vitro, es más potente en el receptor diana (Zambrano et al., 1996). La

imagen2

pregunta con respecto a la importancia biológica de estos cambios y cómo pueden estar implicados en la selección del folículo dominante permanece sin resolver (revisado por Ulloa-Aguirre, 2003).

Se ha documentado el tiempo de vida circulatoria de la FSH para materiales de una variedad de fuentes. Algunos de

5 estos materiales se han fraccionado basándose en la carga molecular total, caracterizados por su pI, en los que más ácido equivale a mayor carga negativa. Como se ha afirmado previamente, el principal contribuyente a la carga molecular global es el contenido total en ácido siálico de cada molécula de FSH. Por ejemplo, rFSH (Organon) tiene un contenido de ácido siálico de alrededor de 8 mol/mol, mientras que la FSH procedente de orina tiene un contenido de ácido siálico mayor (de Leeuw et al., 1996). Las velocidades de eliminación plasmática correspondientes en rata son 0,34 y 0,14 ml/min (Ulloa-Aguirre et al., 2003). En otro ejemplo donde una muestra de FSH recombinante se separó en fracciones de alto y bajo pI, la potencia in vivo de la fracción de pI alto (menor contenido en ácido siálico) disminuyó y tuvo una semivida plasmática más corta (D'Antonio et al., 1999). También se ha publicado que la FSH más básica circulante durante los últimos estadios del ciclo de ovulación se debe a la regulación negativa de la α2,3 sialiltransferasa en la hipófisis anterior que se produce por el aumento de los niveles de estradiol (Damian-Matsumara

15 et al. 1999. Ulloa-Aguirre et al. 2001). No se han publicado resultados para la α2,6 sialiltransferasa.

El contenido total en ácido siálico de la FSH y rFSH no es directamente comparable ya que los ácidos siálicos se unen comúnmente de dos maneras. La FSH hipofisaria/sérica/urinaria contiene ácido siálico unido tanto en α2,3 como en α2,6, con una predominancia del primero. Sin embargo los recombinantes procedentes de células CHO solo contienen α2,3 (Kagawa et al, 1988, Takeuchi et al, 1988, Svensson et al., 1990). Esta es otra diferencia entre los productos naturales y recombinantes actuales, además del menor contenido total en ácido siálico de los últimos.

Las células CHO se usan comúnmente para la producción de proteínas recombinantes humanas farmacéuticas. Un análisis estructural ha identificado que el ácido siálico está unido exclusivamente por un enlace α2,3 (Kagawa et al,

25 1988, Takeuchi et al, 1988, Svensson et al., 1990). Muchas glucoproteínas humanas contienen una mezcla de enlaces tanto α2,3 como α2,6. Por tanto, las proteínas recombinantes expresadas usando el sistema de CHO se diferenciarán de sus homólogas naturales en su tipo de enlaces de ácido siálico terminal. Ésta es una consideración importante en la producción de productos biológicos para uso farmacéutico ya que las fracciones de carbohidrato pueden contribuir a los atributos farmacológicos de la molécula.

Es deseable tener un producto de rFSH que replique o mimetice más estrechamente el perfil fisicoquímico y farmacocinético del producto producido a partir de orina humana. Es deseable tener un producto de rFSH que tenga propiedad o propiedades farmacocinética(s) mejorada(s) comprado con el producto recombinante conocido.

35 Según la presente invención se proporciona FSH recombinante (“rFSH” o “recFSH”) que incluye sialilación en α2,3 y sialilación en α2,6 en donde el 60% o más de la sialilación total es sialilación en α2,3 y en la que del 5 al 40% de la sialilación total es sialilación en α2,6. La rFSH (o preparación de rFSH) de la invención puede tener un 5% o menos de la sialilación total que es sialilación en α2,8, por ejemplo, del 0,1-4% de la sialilación total puede ser sialilación en α2,8.

Los solicitantes han encontrado que el tipo de enlace de ácido siálico, α2,3 o α2,6, puede tener una influencia drástica en la eliminación biológica de FSH. Las líneas celulares humanas, en contraposición a las líneas celulares de CHO, pueden expresar FSH recombinante con ácidos siálicos unidos por enlaces tanto α2,3 como α2,6. En el ejemplo 4 se hizo una línea celular con FSH recombinante que expresaba FSH que contenía glucanos con bajos niveles de ácido siálico unidos tanto en α2,3 como en α2,6 (figura 6). Este material básico, con contenido limitado en ácido siálico 45 (figura 4) se eliminó de forma muy rápida de la circulación en rata como sería predecible (figura 7). La línea celular se sometió después a una segunda etapa de modificación con la adición del gen que codifica la α2,6-sialiltransferasa (ejemplo 5). La rFSH resultante estaba altamente sialilada mostrando un contenido en ácido siálico y distribución de pI comparable con la FSH urinaria (figura 5). Sin embargo, el material se eliminó muy rápidamente de la circulación de ratas a una velocidad comparable al material original que tenía bajo contenido en ácido siálico (figura 8). Ésta fue una observación inesperada ya que se sabe que una proporción de ácido siálico en la FSH natural y biológicamente activa está unido en α2,6. Se encontró que la eliminación de rFSH sialilada en α2,6 estaba mediada por el receptor de asialoglucoproteína (ASGP) que se encuentra en el hígado (ejemplo 9). Esto se demostró por el bloqueo transitorio de los receptores de ASGP usando un exceso de otro sustrato para el receptor. Con el receptor bloqueado por asialofetuína, la eliminación esperada por el material altamente sialilado se restableció (figura 9). Esto se mantuvo

55 durante varias horas hasta que el bloqueo se superó y la rFSH altamente sialilada unida en α2,6 reanudó su rápida eliminación.

Se hizo FSH recombinante con una mezcla de ácido siálico unido tanto en α2,3 como α2,6 modificando por ingeniería una línea celular humana para que exprese tanto rFSH como α2,3-sialiltransferasa (ejemplo 4 y 5). El producto expresado es muy ácido y porta una mezcla de ácidos siálicos unidos tanto en α2,3 como α2,6; el último proporcionado por la actividad sialiltransferasa endógena (figura 6). Esto tiene dos ventajas sobre la rFSH expresada en células CHO convencionales: Primero, el material está más altamente sialilado debido a las actividades combinadas de las dos sialiltransferasas; y en segundo lugar, el material se parece más estrechamente a la FSH natural. Es probable que esto es probable que sea biológicamente más apropiado comparado con los productos recombinantes procedentes de

65 células CHO que producen solo ácido siálico unido en α2,3 (Kagawa et al, 1988, Takeuchi et al, 1988, Svensson et al., 1990) y tienen contenido disminuido en ácido siálico (Ulloa-Aguirre et al., 1995, Andersen et al., 2004).

imagen3

Los solicitantes han encontrado sorprendentemente que la rFSH de la invención puede replicar o mimetizar más estrechamente el perfil fisicoquímico y farmacocinético del producto urinario humano natural que otros productos recombinantes. En otras palabras, la rFSH de la invención puede ser más cercana a la FSH “natural”. Esto puede tener ventajas significativas respecto a la dosificación, etc. Además, un producto más “natural” o más “humano” puede ser

5 más deseable para el paciente, que puede desear que la terapia, aunque en un sentido artificial, sea tan “natural” como sea posible. Puede haber otras ventajas (por ejemplo, ventajas farmacocinéticas) en un producto recombinante que tiene estructura de carbohidrato (por ejemplo, glucano) que es más cercana a la FSH natural (por ejemplo, urinaria humana) que otros productos recombinantes.

Por tanto, la invención es una versión recombinante de FSH que porta una mezcla de ácido siálico en α2,3 y α2,6 y por tanto se parece más estrechamente a la FSH natural. Se espera que el uso de este compuesto para la estimulación ovárica controlada, en técnicas de FIV, y la inducción de la ovulación resulte en una estimulación más natural del ovario en comparación con productos recombinantes existentes.

15 Según la presente invención se proporciona FSH recombinante (“rFSH” o “recFSH”) que incluye sialilación en α2,3 y α2,6 en la que el 80 % o más de la sialilación total es sialilación en α2,3 y del 5 al 20% de la sialilación total es sialilación en α2,6. La rFSH o preparación de rFSH pueden opcionalmente incluir además sialilación en α2,8.

En realizaciones de la invención, la rFSH puede estar presente como una única isoforma o como una mezcla de isoformas.

La rFSH según la invención puede tener un contenido en ácido siálico [expresado en cuanto a una proporción de moles de ácido siálico con respecto a moles de proteína] de 6 mol/mol o mayor.

25 La rFSH según la invención tiene el 80 % o más de la sialilación total que es sialilación en α2,3. Por ejemplo, el 90 % o más de la sialilación total puede ser sialilación en α2,3.

La rFSH de la invención tiene del 5 al 20% de la sialilación total que es sialilación en α2,6. La rFSH de la invención puede tener el 5 % o menos de la sialilación total que es sialilación en α2,8. Por ejemplo el 2,5% o menos de la sialilación total puede ser sialilación en α2,8. La rFSH (o preparación de rFSH) puede incluir sialilación en α2,8 en una cantidad que es del 0,1 al 4% de la sialilación total, por ejemplo del 0,5 al 3% de la sialilación total, por ejemplo, desde el 0,5 al 2,5% de la sialilación total. Mediante sialilación se quiere decir la cantidad de restos siálicos presentes en las estructuras de carbohidrato de la FSH. La sialilación en α2,3 significa sialilación en la posición 2,3 (como se sabe bien en la técnica) y sialilación en α2,6, en la posición 2,6 (como se sabe bien en la técnica). Por tanto, el “% de la sialilación

35 total puede ser sialilación en α2,3” se refiere al % del número total de residuos de ácido siálico presentes en la FSH que están sialilados en la posición 2,3. La expresión “% de sialilación total que es sialilación en α2,6” se refiere al % del número total de residuos de ácido siálico presentes en la FSH que están sialilados en la posición 2,6.

La FSH recombinante expresada en células de ovario de hámster chino (CHO) incluye exclusivamente sialilación en α2,3 (Kagawa et al, 1988, Takeuchi et al, 1988, Svensson et al., 1990).

La rFSH de la invención se puede producir o expresar en una línea celular humana. Esto puede simplificar (y hacer más eficaz) el método de producción porque la manipulación y control de, por ejemplo, el medio de crecimiento celular para mantener la sialilación puede ser menos crítico que con procesos conocidos. El método también puede ser más

45 eficaz porque hay poca rFSH básica producida con respecto la producción de productos de rFSH conocidos; se produce rFSH más ácida y la separación/eliminación de FSH básica es menos problemática. La rFSH se puede producir o expresar en una línea celular Per.C6, una línea celular procedente de Per.C6 o una línea celular Per.C6 modificada. La línea celular se puede modificar usando α2,3-sialiltransferasa. La línea celular se puede modificar usando α2,6-sialiltransferasa. Como alternativa o adicionalmente, la rFSH puede incluir ácidos siálicos unidos en α2,6 (sialilación en α2,6) proporcionados por la actividad sialiltransferasa endógena [de la línea celular].

La rFSH se puede producir usando α2,3-y/o α2,6-sialiltransferasa. La rFSH se puede producir usando α2,3sialiltransferasa. La rFSH puede incluir ácidos siálicos unidos en α2,6 (sialilación en α2,6) proporcionados por la actividad sialiltransferasa endógena.

55 Según la presente invención en un aspecto adicional se proporciona un método de producción de rFSH y/o preparación de rFSH tal como se describe en el presente documento (según aspectos de la invención) que comprende la etapa de producir o expresar la rFSH en una línea celular humana, por ejemplo una línea celular Per.C6, una línea celular procedente de Per.C6 o una línea celular Per.C6 modificada, por ejemplo una línea celular que se ha modificado usando α2,3-sialiltransferasa.

La estructura de rFSH contiene restos de glucano. Se puede producir ramificación con el resultado que el glucano puede tener 1, 2, 3, 4 o más restos de azúcares terminales o “antenas”, como se sabe bien en la técnica. La rFSH de la invención puede tener glucanos con presencia de sialilación en estructuras monoantenarias y/o diantenarias y/o

65 triantenarias y/o tetrantenarias.

imagen4

Según la presente invención en un aspecto adicional se proporciona una composición farmacéutica que comprende rFSH que incluye sialilación en α2,3 y sialilación en α2,6 en la que el 80 % o más de la sialilación total es sialilación en α2,3 y del 5 al 40 % de la sialilación total es sialilación en α2,6 (por ejemplo, como se ha expuesto anteriormente). La composición farmacéutica puede comprender además hCG y/o LH.

5 Se puede obtener hCG mediante cualquier medio conocido en la técnica. hCG, tal como se usa en el presente documento, incluye hCG humana y recombinante. Se puede purificar hCG humana a partir de cualquier fuente apropiada (por ejemplo, orina y placenta) mediante cualquier método conocido en la técnica. Los métodos de expresar y purificar hCG recombinante se conocen bien en la técnica.

Se puede obtener LH mediante cualquier medio conocido en la técnica. LH, como se usa en el presente documento, incluye LH humana y recombinante. Se puede purificar LH humana a partir de cualquier fuente apropiada (por ejemplo, orina) mediante cualquier método conocido en la técnica. Los métodos de expresar y purificar LH recombinante se conocen bien en la técnica.

15 La composición farmacéutica puede ser para el tratamiento de infertilidad, por ejemplo, para uso en, por ejemplo, tecnologías de reproducción asistida (TRA), inducción de la ovulación o inseminación intrauterina (IIU). La composición farmacéutica se puede usar, por ejemplo, en indicaciones médicas donde se usan preparaciones de FSH conocidas. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden formular en composiciones bien conocidas para cualquier vía de administración de fármacos, por ejemplo, oral, rectal, parenteral, transdérmica (por ejemplo, tecnología de parches), intravenosa, intramuscular, subcutánea, intrasubesternal, intravaginal, intraperitoneal, local (polvos, pomadas o gotas) o como un aerosol bucal o nasal. Una composición típica comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como una solución acuosa, excipientes atóxicos, incluyendo sales y conservantes, tampones y similares, tal como se describe en Remington's Pharmaceutical Sciences decimoquinta

25 edición (Matt Publishing Company, 1975), en las páginas 1405 a 1412 y 1481-87, y el formulario nacional XIV decimocuarta edición (American Pharmaceutical Association, 1975) entre otros.

Los ejemplos de vehículos, diluyentes, solventes o excipientes farmacéuticos acuosos y no acuosos adecuados incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol, y similares), carboximetilcelulosa y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales (tales como aceite de oliva) y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo.

Las composiciones de la presente invención también pueden contener aditivos tales como, pero no limitados a, conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes. También pueden estar incluidos

35 agentes antibacterianos y antifúngicos para prevenir el crecimiento de microbios e incluyen, por ejemplo, parabeno, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, y similares. Además, puede ser deseable incluir agentes isotónicos tales como azúcares, cloruro de sodio, y similares.

En algunos casos, para ejercer una acción prolongada es deseable ralentizar la absorción de FSH (y otros principios activos, si están presentes) de la inyección subcutánea o intramuscular. Esto se puede lograr mediante el uso de una suspensión líquida de material cristalino o amorfo con mala solubilidad en agua. La velocidad de absorción de FSH depende después de su velocidad de disolución que, a su vez, puede depender del tamaño de los cristales y la forma cristalina. Como alternativa, la absorción retrasada de una forma de combinación de FSH administrada por vía parenteral se logra disolviendo o resuspendiendo la combinación de FSH en un vehículo oleaginoso.

45 Pueden fabricarse formas inyectables de liberación prolongada formando matrices microencapsuladas de FSH (y otros agentes, si están presentes) en polímeros biodegradables tales como polilactida-poliglucolida. Dependiendo de la proporción de FSH con respecto al polímero y de la naturaleza del polímero particular empleado, se puede controlar la velocidad de liberación de FSH. Los ejemplos de otros polímeros biodegradables incluyen polivinilpirrolidona, poli(ortoésteres), poli(anhídridos) etc. Las formulaciones inyectables de liberación prolongada también se preparan atrapando la FSH en liposomas o microemulsiones que son compatibles con tejidos corporales.

Las formulaciones inyectables se pueden esterilizar, por ejemplo, mediante filtración a través de filtro que retine bacterias, o incorporando agentes esterilizadores en forma de composiciones estériles sólidas que se pueden disolver

55 o dispersar en agua estéril u otro medio inyectable estéril justo antes de su uso. Las formulaciones inyectables se pueden suministrar en cualquier envase adecuado, por ejemplo, vial, jeringuilla precargada, cartuchos de inyección, y similares.

Las formulaciones inyectables se pueden suministrar como un producto que tiene composiciones farmacéuticas que contienen FSH (opcionalmente con hCG, LH, etc.). Si hay más de un principio activo (es decir, FSH y por ejemplo, hCG

o LH) estos pueden ser adecuados para su administración por separado o juntos. Si se administran por separado, la administración puede ser secuencial. El producto se puede suministrar en cualquier paquete adecuado. Por ejemplo, un producto puede contener un número de jeringas precargadas que contienen, bien FSH, bien hCG o bien una combinación tanto de FSH como de hCG, las jeringas se empaquetan en un paquete blíster u otro medio para

65 mantener la esterilidad. Un producto puede contener opcionalmente instrucciones para usar las formulaciones de FSH y hCG.

imagen5

El pH y la concentración exacta de los varios componentes de la composición farmacéutica se ajustan de acuerdo con la práctica rutinaria en este campo. Véase, GOODMAN y GILMAN's THE PHARMACOLOGICAL BASIS FOR THERAPEUTICES, 7a ed. En una realización preferida, las composiciones de la invención se suministran como composiciones para la administración parenteral. Los métodos generales para la preparación de las formulaciones

5 parenterales se conocen en la técnica y se describen en REMINGTON; THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY, citado anteriormente, en las páginas 780-820. Las composiciones parenterales se pueden suministrar en formulación líquida o como un sólido que se mezclará con un medio inyectable estéril justo antes de la administración. En una realización especialmente preferida, las composiciones parenterales se suministran en formas de dosificación unitarias para la facilidad de la administración y uniformidad de la dosificación.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se describirá ahora en más detalle con referencia a los siguientes ejemplos y a los dibujos adjuntos en los que: 15 la figura 1 muestra un mapa plasmídico del vector de expresión pFSHalfa/beta;

la figura 2 muestra el vector de expresión de α2,3-sialiltransferasa (ST3GAL4);

la figura 3 muestra el vector de expresión de α2,6-sialiltransferasa (ST6GAL1);

la figura 4 muestra el isoelectroenfoque de FSH recombinante producida por células Per.C6 que expresan FSH de forma estable;

25 la figura 5 muestra un ejemplo de clones analizados por isoelectroenfoque de FSH recombinante producida por células Per.C6 que expresan FSH de forma estable después de modificarlas por ingeniería con α2,3-o a2,6-sialiltransferasa;

la figura 6 muestra el análisis de los enlaces de ácido siálico de Per.C6 FSH;

la figura 7 muestra las velocidades de eliminación metabólica (MRC, por sus siglas en inglés) de muestras de FSH de Per.C6;

la figura 8 muestra las MRC de muestras de FSH de Per.C6 modificadas por ingeniería con α 2,6-sialiltransferasa;

35 la figura 9 muestra las MRC de muestras de FSH de Per.C6 modificadas por ingeniería con α 2,6-sialiltransferasa;

la figura 10 muestra las MRC de muestras de FSH de Per.C6 modificadas por ingeniería con α 2,3-sialiltransferasa

la figura 11 muestra el aumento del peso ovárico por clones de rFSH de Per.C6 de FSH de Per.C6 original, según el método de Steelman y Pohley (1953);

la figura 12 muestra el aumento de peso ovárico por clones de FSH de Per.C6 de FSH de Per.C6 original modificada por ingeniaría (α2,6-sialiltransferasa); y

45 la figura 13 muestra el aumento de peso ovárico por clones de FSH de Per.C6 de FSH de Per.C6 original modificada por ingeniería (α2,3-sialiltransferasa).

Selección de secuencias

FSH humana

Se usó la región codificadora del gen para el polipéptido alfa de FSH según Fiddes y Goodman (1981). La secuencia está depositada como AH007338 y en el momento de construcción no había otras variantes de esta secuencia de

55 proteína. La secuencia se denomina en el presente documento SEQ ID 1.

Se usó la región codificadora del gen para el polipéptido beta de FSH según Keene et al (1989). La secuencia está depositada como NM_000510 y en el momento de construcción no había otras variantes de esta secuencia de proteína. La secuencia se denomina en el presente documento SEQ ID 2.

Sialiltransferasa

α2,3-sialiltransferasa -Se usó la región codificadora del gen para la beta-galactósido alfa-2,3-sialiltransferasa 4 (α2,3sialiltransferasa, ST3GAL4) según Kitagawa y Paulson (1994). La secuencia está depositada como L23767 y se

65 denomina en el presente documento SEQ ID 3.

α2,6-sialiltransferasa -Se usó la región codificadora del gen para la beta-galactosamida alfa-2,6-sialiltransferasa 1 (α2,6-sialiltransferasa, ST6GAL1) según Grundman et al. (1990). La secuencia está depositada como NM_003032 y se denomina en el presente documento SEQ ID 4.

5 Ejemplos

Ejemplo 1. Construcción del vector de expresión de FSH

Las secuencias codificadoras del polipéptido alfa de FSH (AH007338, SEQ ID 1) y del polipéptido beta de FSH (NM_003032, SEQ ID 2) se amplificaron mediante PCR usando las combinaciones de cebadores FSHa-fw y FSHa-rev y FSHb-fw y FSHb-rev respectivamente.

FSHa-fw 5'-CCAGGATCCGCCACCATGGATTACTACAGAAAAATATGC-3' FSHa-rev 5'-GGATGGCTAGCTTAAGATTTGTGATAATAAC-3'

15 FSHb-fw 5'-CCAGGCGCGCCACCATGAAGACACTCCAGTTTTTC-3' FSHb-rev 5'-CCGGGTTAACTTATTATTCTTTCATTTCACCAAAGG-3'

El ADN de FSH beta amplificado resultante se digirió con las enzimas de restricción AscI y HpaI y se insertó en los sitios de AscI y HpaI en el vector de expresión de mamífero dirigido por CMV que porta un marcador de selección de neomicina. De forma similar, el ADN de FSH alfa se digirió con BamHI y NheI y se insertó en los sitios de BamHI y NheI en el vector de expresión que ya contiene el ADN del polipéptido beta de FSH.

Se usó el ADN del vector para transformar la cepa DH5α de E. coli. Se recogieron sesenta colonias para amplificación y cincuenta y siete contenían el vector que contenía tanto FSH alfa como beta. Se seleccionaron veinte de estas para

25 secuenciación y todas contenían las secuencias correctas según las SEQ ID 1 y SEQ ID 2. Se seleccionó el plásmido pFSH A+B#17 para la transfección (figura 1).

Ejemplo 2. Construcción del vector de expresión de ST3

Se amplificó la secuencia de beta-galactósido alfa-2,3-sialiltransferasa 4 (ST3, L23767, SEQ ID 3) mediante PCR usando la combinación de cebadores 2,3STfw y 2,3STrev

2,3STfw 5'-CCAGGATCCGCCACCATGTGTCCTGCAGGCTGGAAGC-3'

2,3STrev 5'-TTTTTTTCTTAAGTCAGAAGGACGTGAGGTTCTTG-3'

35 El ADN de ST3 amplificado resultante se digirió con las enzimas de restricción BamHI y AflII y se insertó en los sitios de BamHI y AflII del vector de expresión de mamífero dirigido por CMV que porta un marcador de resistencia a higromicina. El vector se amplificó como se ha descrito previamente y se secuenció. El clon pST3#1 (figura 2) contenía la secuencia correcta según la SEQ ID 3 y se seleccionó para transfección.

Ejemplo 3. Construcción del vector de expresión de ST6

Se amplificó la secuencia de beta-galactosamida alfa-2,6-sialiltransferasa 1 (ST6, NM_003032, SEQ ID 4) mediante PCR usando la combinación de cebadores 2,6STfw y 2,6STrev.

45 2,6STfw 5'-CCAGGATCCGCCACCATGATTCACACCAACCTGAAG-3' 2,6STrev 5'-TTTTTTTCTTAAGTTAGCAGTGAATGGTCCGG-3'

El ADN de ST6 amplificado resultante se digirió con las enzimas de restricción BamHI y AflII y se insertó en los sitios BamHI y AflII del vector de expresión de mamíferos dirigido por CMV que tiene un marcador de resistencia a higromicina. El vector se amplificó como se ha descrito previamente y se secuenció. El clon pST6#11 (figura 3) contenía la secuencia correcta según SEQ ID 4 y se seleccionó para transfección.

Ejemplo 4. Expresión estable de pFSH A+B en células PER.C6. Transfección, aislamiento y cribado de clones

55 Se generaron clones de Per.C6 que producen FSH expresando ambas cadenas polipeptídicas de FSH a partir de un único plásmido (véase el ejemplo 1).

Para obtener clones estables un agente de transfección basado en liposomas con la construcción pFSH A+B. Se seleccionaron clones estables en VPRO complementado con SBF al 10 % y que contenía G418. Tres semanas después de la transfección los clones resistentes a G418 crecieron. Se seleccionaron un total de 250 clones para aislamiento. Los clones aislados se cultivaron en medio de selección hasta el 70-80 % de confluencia. Se ensayó el contenido de proteína FSH de los sobrenadantes usando un ELISA selectivo de FSH y la actividad farmacológica en el receptor de FSH en la línea celular clonada, usando un ensayo de acumulación de AMPc. Se siguió adelante con la

65 expansión en cultivo en 24 pocillos, 6 pocillos y matraces T80, con los clones que expresaron proteína funcional (98).

Se iniciaron estudios para determinar la productividad y calidad del material de siete clones en matraces T80 para generar material suficiente. Las células se cultivaron en medio complementado como se ha descrito previamente durante 7 días y se recogió el sobrenadante. Se determinó la productividad usando el ELISA selectivo para FSH. Se determinó el perfil isoeléctrico del material (figura 6). Se muestran muestras representativas en la figura 4. La

5 información del IEF se usó para seleccionar clones para análisis la velocidad de eliminación metabólica (ejemplo 9). Se seleccionaron clones con suficiente productividad y calidad (005, 104, 179, 223, 144) para la modificación por ingeniería con sialiltransferasa.

Ejemplo 5. El nivel de sialilación aumenta en células que sobreexpresan α2,3-o α 2,6-sialiltransferasa. Expresión estable de pST3 o pST6 en células PER.C6 que expresan FSH; transfección, aislamiento y cribado de clones

Se generaron clones de Per.C6 que producían FSH altamente sialilada expresando α2,3-sialiltransferasa o α2,6sialiltransferasa a partir de plásmidos separados (véanse los ejemplos 2 y 3) en células Per.C6 que ya expresan

15 ambas cadenas polipeptídicas de FSH (véase el ejemplo 4). Se seleccionaron cuatro clones producidos a partir de células PER.C6® como se expone en el ejemplo 4 por sus características incluyendo productividad, buen perfil de crecimiento, producción de proteína funcional y FSH producida que incluía cierta sialilación.

Se generaron clones estables tal como se ha descrito previamente en el ejemplo 4. Se aislaron, expandieron y ensayaron un total de 202 clones del programa de α2,3-sialiltransferasa y 210 clones del programa de α2,6-sialiltransferasa. El número final de clones para el estudio de α2,3 fue 12 y 30 para el estudio de α2,6.

Los clones de α2,3-sialiltransferasa se adaptaron a medio sin suero y condiciones en suspensión.

25 Como anteriormente, los clones se ensayaron usando un ELISA selectivo de FSH, respuesta funcional en una línea celular con receptor de FSH, IEF (Ejemplo 6), velocidad de eliminación metabólica (ejemplo 9) y análisis de Steelman Pohley (ejemplo 10). Los resultados se compararon con una FSH recombinante disponible comercialmente (Gonal-f, Serono) y con la FSH original de líneas celulares Per.C6. Se muestran muestras representativas en la figura 5. Algunos clones no demostraron un aumento de la sialilación pero se puede ver que la FSH producida por la mayoría de los clones tiene sialilación significativamente mejorada (es decir, de media más isoformas de FSH con números altos de ácidos siálicos) en comparación con FSH expresada sin α2,3-o α2,6-sialiltransferasa.

En conclusión, la expresión de FSH junto con sialiltransferasa en células Per.C6 resulta en niveles aumentados de FSH sialilada en comparación con células que expresan solo FSH.

35 Ejemplo 6. Análisis del pI de isoformas de FSH producidas en Per.C6 mediante isoelectroenfoque

La electroforesis se define como el transporte de moléculas cargadas a través de un solvente mediante un campo eléctrico. La movilidad de una molécula biológica a través de un campo eléctrico dependerá de la fuerza del campo, la carga neta en la molécula, el tamaño y la forma de la molécula, la fuerza iónica y las propiedades del medio a través del cual migran las moléculas.

El isoelectroenfoque (IEF) es una técnica electroforética para la separación de proteínas basada en su pI. El pI es el pH al cual la proteína no tiene carga neta y no migrará en un campo eléctrico. El contenido en ácido siálico de las

45 isoformas de FSH altera ligeramente el punto de pI para cada isoforma, lo cual se puede aprovechar usando esta técnica para visualizar las isoformas de FSH de Per.C6 de cada clon.

Los puntos isoeléctricos de las isoformas de FSH producidas en Per.C6 en sobrenadantes de cultivo celular se analizaron usando isoelectroenfoque. El medio de cultivo celular de los clones de FSH de Per.C6 se produjo como se ha descrito en el ejemplo 4 y el 5.

Las muestras de FSH de Per.C6 se separaron en geles de IEF Novex® que contenían poliacrilamida al 5 % en condiciones nativas en un gradiente de pH 3,0-7,0 en una solución de anfolitos de pH 3,0-7,0.

55 Las proteínas se transfirieron a soporte de nitrocelulosa y se visualizaron usando un anticuerpo monoclonal primario anti-FSHα, un anticuerpo secundario anti-IgG de ratón conjugado con fosfatasa alcalina y reactivo fosfato de 5bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (BCIP, por sus siglas en inglés) y nitroazul de tetrazolio (NBT) para visualizar las bandas.

Tal como se indica en las figuras 4 y 5, las bandas representan isoformas de FSH que contienen diferentes números de moléculas de ácido siálico.

Usando este método se identificaron clones que producen isoformas de FSH con un número mayor de moléculas de ácido siálico. La modificación por ingeniería con α2,3-o α2,6-sialiltransferasa resultó en clones con más ácido siálico y

65 un pI menor.

imagen6

Ejemplo 7. Análisis de los enlaces de ácido siálico de FSH de Per.C6

Se analizaron glucoconjugados usando un método de diferenciación de glucano basado en lectina. Con este método se pueden caracterizar glucoproteínas y glucoconjugados unidos a nitrocelulosa. Las lectinas reconocen 5 selectivamente una fracción particular, por ejemplo ácido siálico unido en α2,3. Las lectinas aplicadas se conjugan con el hapteno esteroide digoxigenina que permite la detección inmunológica de las lectinas unidas.

Se separaron FSH de Per.C6 de un clon original (sin sialiltransferasa adicional), un clon modificado por ingeniería con α2,3-sialiltransferasa y un clon modificado por ingeniería con α2,6-sialiltransferasa usando técnicas convencionales de

10 SDS-PAGE. Como patrón se usó una FSH recombinante disponible comercialmente (Gonal-f, Serono).

Se analizó el ácido siálico usando el kit DIG Glycan Differentiation (n.º de catálogo 11 210 238 001, Roche) según las instrucciones del fabricante. Las reacciones positivas con aglutinina de Sambucus nigra (SNA) indicaron ácido siálico unido terminalmente (2-6). Las reacciones positivas con aglutinina II de Maackia amurensis (MAA) indicaron ácido

15 siálico unido terminalmente (α2-3).

En resumen, el clon original 005 contenía niveles bajos de ácido siálico tanto en α2,3 como en α2,6. Los clones modificados por ingeniería con α2,3-sialiltransferasa contenían niveles altos de enlaces de ácido siálico α2,3 y niveles bajos de enlaces de ácido siálico α2,6. Los clones modificados por ingeniería con α2,6-sialiltransferasa contenían

20 niveles altos de enlaces de ácido siálico α2,6 y niveles bajos de enlaces de ácido siálico α2,3. El control de patrón Gonal-f solo contiene enlaces de ácido siálico α2,3. Esto es coincidente con lo que se sabe sobre las proteínas recombinantes producidas en células de ovario de hámster chino (CHO) (Kagawa et al, 1988, Takeuchi et al, 1988, Svensson et al., 1990).

25 En conclusión, la modificación por ingeniería de FSH de células Per.C6 con α2,3-o α2,6-sialiltransferasa aumentó con éxito el número de moléculas de ácido siálico conjugadas con la FSH en la muestra.

Ejemplo 8a. Cuantificación del ácido siálico total

30 El ácido siálico es un carbohidrato unido a proteína que se considera que es un monosacárido y aparece en combinación con otros monosacáridos como galactosa, manosa, glucosamina, galactosamina y fucosa.

El ácido siálico total en rFSH purificada (ejemplo 11) se midió usando un kit de cuantificación enzimática de ácido siálico según el protocolo del fabricante (Sigma, Sialic-Q). Brevemente, la ácido N-acetilneuramínico aldolasa cataliza

35 ácido siálico a N-acetilmanosamina y ácido pirúvico. El β-NADH y la láctico deshidrogenasa pueden reducir el ácido pirúvico a ácido. La oxidación de β-NADH se puede medir de forma precisa espectrofotométricamente.

Se midió la concentración de proteína en placas de microtitulación usando un kit comercial de ensayo de ácido bicinconínico (BCA) (Sigma, B 9643) basado en el método de Lowry (Lowry et al, 1951).

40 Se midió el contenido total de ácido siálico de FSH de Per.C6 y se encontró que fue mayor de 6 mol/mol.

Ejemplo 8b. Cuantificación de cantidades relativas de ácido siálico α2,3, α2,6 y α2,8

45 Se midieron las cantidades de porcentaje relativo de ácido siálico α2,3, α2,6 y α2,8 en rFSH purificada (ejemplo 11) usando técnicas conocidas.

Cada muestra de rFSH se inmovilizó (bloque de gel), lavó, redujo, alquilo y digirió con PNGasa F durante toda la noche. Después se extrajeron y procesaron los N-glucanos. Los N-glucanos se marcaron con el fluoróforo 2AB para el

50 análisis de NP-HPLC y WAX-HPLC tal como se detalla en Royle et al. Los N-glucanos se corrieron en HPLC de fase normal (NP, por sus siglas en inglés) en una columna TSK amida (tal como se detalla en Royle et al) con los tiempos de retención expresados en unidades de glucosa (UG).

Las muestras de los glucanos extraídos, agrupados (extraídos como anteriormente) se digirieron con diferentes

55 sialidasas para determinar los enlaces. NAN 1 (sialidasa recombinante) libera ácidos siálicos terminales no reductores (NeuNAc y NeuNGc), unidos en α2,3, ABS (sialidasa de Arthrobacter ureafaciens) libera ácidos siálicos terminales no reductores (NeuNAc y NeuNGc unidos en α2,3, α2,6 y α2,8. Las muestras se analizaron por NP-HPLC, para permitir la comparación de la muestra sin digerir con la digerida con NAN1 y la digerida con ABS. La comparación de las tres trazas de NP-HPLC (sin digerir, digerida con NAN1, digerida con ABS) muestra que la digestión con ABS y NAN1 da

60 diferentes resultados. Esto indica que las muestras tienen ácidos siálicos con enlaces α2,3, α2,6 y α2,8. Se calcularon los porcentajes relativos a partir de estructuras presentes en el conjunto de glucanos sin digerir y se encontró que estaban en los intervalos de 65 %-85 % (por ejemplo, 77,75 %) para sialilación en α2,3; del 15 al 35 % (por ejemplo, 21,46 %) para sialilación en α2,6 y del 0,1 al 3 % para sialilación en α2,8.

65

Ejemplo 8c. Cuantificación de las cantidades relativas de estructuras sialiladas mono, di, tri y tetra antenarias

Se midieron las cantidades de porcentaje relativo de estructuras mono, di, tri y tetra sialiladas en glucanos extraídos de rFSH purificada (ejemplo 11) usando técnicas conocidas.

5 Cada muestra de rFSH se inmovilizó (bloque de gel), lavó, redujo, unió grupos alquilo y digirió con PNGasa F durante toda la noche. Después se extrajeron y procesaron los N-glucanos. Los N-glucanos se marcaron con el fluoróforo 2AB para el análisis de NP-HPLC y WAX-HPLC tal como se detalla en Royle et al.

Se llevó a cabo HPLC de intercambio aniónico débil (WAX, por sus siglas en inglés) para separar los N-glucanos por carga (ejemplo 8b) tal como se muestra en Royle et al, con un patrón de fetuína N-glucano como referencia. Los glucanos eluyeron según el número de ácidos siálicos que contenían. Todas las muestras incluyeron estructuras mono (1S), di (2S), tri (3S) y tetra (4S) sialiladas. Se encontró que las cantidades relativas de las estructuras sialiladas estuvieron en las siguientes proporciones (1S:2S:4S:4S): 9-15 %: 27-30 %: 30-36 %: 25-29 % (por ejemplo,

15 10,24:28,65:35,49:25,62).

Ejemplo 9. Determinación de las velocidades de eliminación metabólica de rFSH

Para determinar la velocidad de eliminación metabólica (MCR) de muestras de FSH de Per.C6 se inyectó un bolo de rFSH a ratas hembras conscientes (3 animales por clon) en la vena caudal en el momento cero (1-10 μg/rata, basado en la cuantificación por ELISA de las muestras, DRG ElA 1288). Se tomaron muestras de sangre (400 μl) de la punta de la cola 1, 2, 4, 8, 12, 24 y 32 horas después de la inyección de la muestra de análisis. El suero se recogió por centrifugación y se ensayó el contenido de FSH por ELISA (DRG ElA 1288).

25 El receptor de asialoglucoproteína (ASGP-R) reconoce glucoproteínas desialiladas (terminadas en galactosa) tal como asialofetuína (ASF) (Pricer y Ashwell, 1971, Van Lenten y Ashwell, 1972). El receptor de ASGP y la glucoproteína desialilada unida se internalizan en la célula donde el receptor se recicla y el ligando se degrada (Regoeczi et al, 1978, Steer y Ashwell, 1980).

Para investigar si el material de FSH de Per.C6 se eliminaba por medio de este mecanismo, el ASGP-R se saturó con asialofetuína. La velocidad de eliminación metabólica de material original o modificado por ingeniería con α2,6 o a2,3-sialiltransferasa se determinó tal como se ha descrito con la coadministración de un exceso molar mínimo de 7500 veces de asialofetuína para saturar el ASPG-R durante 1-2 horas.

35 El material producido por los clones de FSH de Per.C6 originales contenía algún material de MCR más largo pero un alto porcentaje se eliminó rápidamente (figura 7). El clon principal 005 que contenía el material más sialilado se modificó por ingeniería usando α2,6 o a2,3-sialiltransferasa (ejemplo 5). Aunque los clones modificados por ingeniería con α2,6-sialiltransferasa demostraron sialilación aumentada (figura 5) no hubo mejora en la MCR (figura 7). El bloqueo de ASGR restableció el MCR del material α2,6 al del patrón, demostrando que incluso con enlaces α2,6 aumentados el material se elimina rápidamente (figura 8). La modificación por ingeniería con a2,3-sialiltransferasa resultó en clones con MCR comparable al parón (figura 9) y el contenido siálico variable fue coincidente con lo que se sabe para las isoformas de FSH (figura 10).

Ejemplo 10. Ensayo in vivo de Steelman-Pohley

45 Para demostrar que el contenido creciente en ácido siálico en la FSH resulta en un efecto biológico aumentado, se examinó el aumento en los pesos ováricos en ratas por FSH altamente sialilada, tal como la producida en el ejemplo 5.

El aumento en los pesos ováricos debido a los clones de rFSH de Per.C6 se analizó según el método de Steelman y Pohley (1953). Se cuantificó rFSH de Per.C6 de muestras de medio celular filtrado por ELISA (DRG, EIA-1288). Las muestras (rFSH de Per.C6) y patrones (rFSH de Gonal-f) se analizaron a cinco dosis diferentes (3 animales/dosis). Gonal-f se dosificó a 50, 100, 200, 400 y 800 ng/rata. Las dosis de las muestras se calcularon usando sus valores de ABC relativos a Gonal-f, típicamente 0,05-10 μg/rata.

55 En conclusión, el material subsialilado producido por los clones de FSH de Per.C6 originales (figura 11) no fue tan potente en el ensayo de aumento del peso ovárico como la rFSH disponible comercialmente. La modificación por ingeniería con sialiltransferasa para añadir enlaces α2,6 adicionales aumentó el contenido de ácido siálico pero no mejoró la potencia en el ensayo in vivo (figura 12). Sin embargo, los enlaces α2,3 adicionales mejoraron significativamente la potencia (figura 13) y las dos preparaciones de FSH recombinante (procedentes de Per.C6 y CHO) muestran perfiles muy similares en este ensayo.

Ejemplo 11. Visión de conjunto de la producción y purificación

Se desarrolló un procedimiento para producir FSH en células PER.C6 que se cultivaron en suspensión en medio sin 65 suero. El procedimiento se describe a continuación y se aplicó a varias líneas celulares PER.C6 productoras de FSH.

Se preparó FSH del clon original 005, del clon de α2,3 007 y del clon de α2,6 059 usando una modificación del método descrito por Lowry et al. (1976).

Para la producción de FSH de PER.C6, las líneas celulares se adaptaron a un medio sin suero, es decir, Excell 525

5 (JRH, Biosciences). Las células se cultivaron primero para formar una monocapa confluente al 70 %-90 % en un matraz de cultivo T80. En el pase, las células se resuspendieron en el medio sin suero, Excell 525 + L-glutamina 4 mM, a una densidad celular de 0,3x106 células/ml. Se puso una suspensión celular de 25 ml en un matraz de agitación de 250 ml y se agitó a 100 rpm a 37 °C en CO2 al 5%. Después de alcanzar una densidad celular > 1x106 células/ml, las células se subcultivaron hasta una densidad celular de 0,2 o 0,3x106 células/ml y se cultivaron adicionalmente en matraces de agitación a 37 °C, CO2 al 5% y 100 rpm.

Para la producción de FSH, las células se transfirieron a un medio de producción sin suero, es decir, VPRO (JRH, Biosciences), que soporta el crecimiento de células PER.C6 a densidades celulares muy altas (habitualmente > 107 células/ml en un cultivo por lotes). Las células se cultivaron primero hasta > 1x106 células/ml en Excell 525, después se

15 centrifugaron durante 5 minutos a 1000 rpm y posteriormente se resuspendieron en medio VPRO + L-glutamina 6 mM hasta una densidad de 1x106 células/ml. Las células se cultivaron después en un matraz de agitación durante 7-10 días a 37 °C, CO2 al 5% y 100 rpm. Durante este periodo, las células crecieron hasta una densidad > 107 células/ml. El medio de cultivo se recogió después de que la viabilidad celular empezara a decaer. Las células se centrifugaron durante 5 minutos a 100 rpm y el sobrenadante se usó para la cuantificación y purificación de FSH. La concentración de FSH se determinó usando ELISA (DRG EIA 1288).

A partir de ahí, la purificación de FSH se llevó a cabo usando una modificación del método descrito por Lowry et al. (1976). Esto se logró por cromatografía en DEAE celulosa, filtración en gel en Sephadex G100, cromatografía de adsorción en hidroxiapatita y electroforesis en poliacrilamida preparatoria.

25 Durante todos los procedimientos cromatográficos, la presencia de FSH inmunorreactiva se confirmó por RIA (DRG EIA 1288) e IEF (ejemplo 6).

Referencias

Andersen CY, Westergaard LG, y van Wely M. (2004). FSH isoform composition of commercial gonadotrophin preparations: a neglected aspect? Reprod Biomed Online. 9(2), 231-236.

Arey BJ, Stevis PE, Deecher DC, Shen ES, Frail DE, Negro-Vilar A, y Lopez FJ. (1997) Induction of promiscuous G

35 protein coupling of the follicle-stimulating hormone (FSH) receptor: a novel mechanism for transducing pleiotropic actions of FSH isoforms. Mol Endocrinol. 11(5), 517-526.

Baenziger JU y Green ED. (1988). Pituitary glycoprotein hormone oligosaccharides: structure, synthesis and function of the asparagine-linked oligosaccharides on lutropin, follitropin and thyrotropin. Biochim Biophys Acta. 947(2), 287-306.

Bassett RM, y Driebergen R. (2005). Continued improvements in the quality and consistency of follitropin alfa, recombinant human FSH. Reprod Biomed Online. 10(2), 169-177.

Damián-Matsumura P, Zaga V, Maldonado A, Sánchez-Hernández C, Timossi C, y Ulloa-Aguirre A. (1999).

45 Oestrogens regulate pituitary alpha2,3-sialyltransferase messenger ribonucleic acid levels in the female rat. J Mol Endocrinol. 23(2), 153-165.

D'Antonio M., Borrelli F. , Datola A., Bucci R. , Mascia M. , Polletta P., Piscitelli D., y Papoian R. (1999) Biological characterization of recombinant human follicle stimulating hormone isoforms. Human Reproduction 14, 1160-1167

Dalpathado DS, Irungu J, Go EP, Butnev VY, Norton K, Bousfield GR, y Desaire H. (2006). Comparative glycomics of the glycoprotein folliclestimulating hormone: glycopeptide analysis of isolates from two mammalian species. Biochemistry. 45(28), 8665-8673. Sin copia.

55 Dias JA, Van Roey P. (2001). Structural biology of human follitropin and its receptor. Arch Med Res. 32(6), 510-519.

Fiddes, J. C. y Goodman, H. M. (1979) Isolation, cloning and sequence analysis of the cDNA for the alpha-subunit of human chorionic gonadotropin. Nature, 281, 351-356.

Flack, M.R., Bennet, A.P., Froehlich, J. Anasti, JN y Nisula, B. (1994). Increased biological activity due to basic isoforms in recombinant human follicle-stimulating hormone produced in a human cell line. J. Clin. Endocrinol. Metab. 79, 756-760

Fox KM, Dias JA, y Van Roey P. (2001). Three-dimensional structure of human follicle-stimulating hormone. Mol 65 Endocrinol. 15(3), 378-89

imagen7

Grabenhorst E, Hoffmann A, Nimtz M, Zettlmeissl G, y Conradt HS. (1995). Construction of stable BHK-21 cells coexpressing human secretory glycoproteins and human Gal(beta 1-4)GIcNAc-R alpha 2,6-sialyltransferase alpha 2,6-linked NeuAc is preferentially attached to the Gal(beta 1-4)GIcNAc(beta 1-2)Man(alpha 1-3)-branch of diantennary oligosaccharides from secreted recombinant beta-trace protein. Eur J Biochem. 232(3), 718-25.

5 Green ED y Baenziger JU. (1988). Asparagine-linked oligosaccharides on lutropin, follitropin, and thyrotropin. II. Distributions of sulfated and sialylated oligosaccharides on bovine, ovine, and human pituitary glycoprotein hormones. J Biol Chem. 263(1), 36-44.

Grundmann, U., Nerlich, C., Rein, T. y Zettlmeissl, G. (1990). Complete cDNA sequence encoding human betagalactoside alpha-2,6-sialyltransferase. G Nucleic Acids Res. 18 (3), 667.

Howles, C.M. (1996). Genetic engineering of human FSH (Gonal-F). Hum Reprod. Update, 2,172-191.

15 Kagawa Y, Takasaki S, Utsumi J, Hosoi K, Shimizu H, Kochibe N, y Kobata A. (1988). Comparative study of the asparagine-linked sugar chains of natural human interferon-beta 1 and recombinant human interferon-beta 1 produced by three different mammalian cells. J Biol Chem. 263(33), 17508-17515.

Keene, J.L., Matzuk, M.M., Otani, T., Fauser, B,C,J,M., Galway, A.B., Hsueh, A.J.W. y Boime, I. (1989). Expression of Biologically active Human Follitropin in Chinese Hamster Ovary Cells. The Journal of Biological Chemistry, 264(9), 4769-4775.

Kitagawa, H. y Paulson, J.C (1994) Cloning of a novel alpha 2,3-sialyltransferase that sialylates glycoprotein and glycolipid carbohydrate groups. J. Biol. Chem. 269(2), 1394-1401.

25 Lee EU, Roth J, y Paulson JC (1989) Alteration of terminal glycosylation sequences on N-linked oligosaccharides of Chinese hamster ovary cells by expression of beta-galactoside alpha 2,6-sialyltransferase. J Biol Chem. 264(23), 13848-13855.

de Leeuw, R., Mulders, J., Voortman, G. Rombout, F. Darnm, J. y Kloosterboer, L. (1996) Structure-function relationship of recombinant follicle stimulating hormone (Puregon). Mol. Hum. Reprod. 2, 361-369.

Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ. (1951) Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem. 193(1), 265-75.

35 Lowry, PJ, McLean, C, Jones RL y Satgunasingam N. (1976) Purification of anterior pituitary and hypothalamic hormones Clin Pathol Supl (Assoc Clin Pathol). 7, 16-21.

Pierce JG, y Parsons TF (1981) Glycoprotein hormones: structure and function Annu Rev Biochem. 50, 465-495.

Pricer WE Jr, y Ashwell G. (1971). The binding of desialylated glycoproteins by plasma membranes of rat liver. J Biol Chem. 246(15), 4825-33.

Rathnam P, y Saxena BB. (1975). Primary amino acid sequence of follicle-stimulating hormone from human pituitary 45 glands. I. alpha subunit. J Biol Chem. 250(17):6735-6746.

Regoeczi E, Debanne MT, Hatton MC, y Koj A. (1978) Elimination of asialofetuin and asialoorosomucoid by the intact rat. Quantitative aspects of the hepatic clearance mechanism. Biochim Biophys Acta. 541(3), 372-84.

Royle L, Radcliffe CM, Dwek RA y Rudd PM (2006) Methods in Molecular Biology, ed I Brockhausen-Schutzbach (Humana Press), 347: Glycobiology protocols, 125-144.

Ryan RJ, Keutmann HT, Charlesworth MC, McCormick DJ, Milius RP, Calvo FO y Vutyavanich T. (1987). Structurefunction relationships of gonadotropins. Recent Prog Horm Res. 43, 383-429.

55 Saxena BB y Rathnam P. (1976) Amino acid sequence of the beta subunit of follicle-stimulating hormone from human pituitary glands. J Biol Chem. 251(4), 993-1005

Steelman SL, y Pohley FM. (1953) Assay of the follicle stimulating hormone based on the augmentation with human chorionic gonadotropin. Endocrinology. 53(6), 604-616.

Steer CJ, y Ashwell G. (1980) Studies on a mammalian hepatic binding protein specific for asialoglycoproteins. Evidence for receptor recycling in isolated rat hepatocytes. J Biol Chem. 255(7), 3008-13.

65 Svensson EC, Soreghan B, y Paulson JC. (1990) Organization of the beta-galactoside alpha 2,6-sialyltransferase gene. Evidence for the transcriptional regulation of terminal glycosylation. J Biol Chem. 265(34):20863-20868.

Takeuchi M, Takasaki S, Miyazaki H, Kato T, Hoshi S, Kochibe N, y Kobata A (1988). Comparative study of the asparagine-linked sugar chains of human erythropoietins purified from urine and the culture medium of recombinant Chinese hamster ovary cells. J Biol Chem. 263(8), 3657-3663.

5 Timossi CM, Barrios de Tomasi J, Zambrano E, González R, Ulloa-Aguirre A. (1998). A naturally occurring basically charged human follicle-stimulating hormone (FSH) variant inhibits FSH-induced androgen aromatization and tissuetype plasminogen activator enzyme activity in vitro. Neuroendocrinology. 67(3), 153-163.

Timossi CM, Barrios-de-Tomasi J, González-Suárez R, Arranz MC, Padmanabhan V, Conn PM, y Ulloa-Aguirre A. 10 (2000). Differential effects of the charge variants of human follicle-stimulating hormone. J Endocrinol. 165(2), 193-205.

Ulloa-Aguirre, A., Espinoza, R., Damian-Matsumura, P. y Chappel, S.C. (1988) Immunological and biological potencies of the different molecular species of gonadotrophins. Hum. Reprod. 3, 491-501.

15 Ulloa-Aguirre, A., Cravioto, A., Damian-Matsumura, P. Jimenez, M, Zambrano, E y Diaz-Sanchez, V. (1992) Biological characterization of the naturally occurring analogues of intrapituitary human follicle stimulating hormone. Hum. Reprod. 7, 23-30.

Ulloa-Aguirre A, Midgley AR Jr, Beitins IZ, y Padmanabhan V. (1995). Follicle-stimulating isohormones: 20 characterization and physiological relevance. Endocr Rev. 16(6), 765-787.

Ulloa-Aguirre A, Maldonado A, Damián-Matsumura P, y Timossi C (2001). Endocrine regulation of gonadotropin glycosylation. Arch Med Res. 32(6), 520-532.

25 Ulloa-Aguirre A, Timossi C, Barrios-de-Tomasi J, Maldonado A, y Nayudu P. (2003). Impact of carbohydrate heterogeneity in function of follicle-stimulating hormone: studies derived from in vitro and in vivo models. Biol Reprod. 69(2), 379-389.

Van Lenten L, y Ashwell G. (1972). The binding of desialylated glycoproteins by plasma membranes of rat liver. 30 Development of a quantitative inhibition assay. J Biol Chem. 247(14), 4633-40.

Wide, L. y Albertsson-Wikland, K. (1990) Change in electrophoretic mobility of human follicle-stimulating hormone in serum after administration of gonadotropin-releasing hormone. J. Clin. Endocrinol. Metab. 70, 271-276.

35 Wide, L. y Bakos, O. (1993). More basic forms of both human follicle-stimulating hormone and luteinizing hormone in serum at midcycle compared with the follicular or luteal phase. J. Clin. Endocrinol. Metab. 76, 885-889.

Wide L, Naessén T, Sundström-Poromaa I, Eriksson K. (2007) Sulfonation and sialylation of gonadotropins in women during the menstrual cycle, after menopause, and with polycystic ovarian syndrome and in men. J Clin Endocrinol 40 Metab. 92(11), 4410-4417.

Zambrano E, Zariñán T, Olivares A, Barrios-de-Tomasi J, y Ulloa-Aguirre A. (1999). Receptor binding activity and in vitro biological activity of the human FSH charge isoforms as disclosed by heterologous and homologous assay systems: implications for the structure-function relationship of the FSH variants. Endocrine. 10(2), 113-121.

45 Zhang X, Lok SH, y Kon OL (1998) Stable expression of human alpha-2,6-sialyltransferase in Chinese hamster ovary cells: functional consequences for human erythropoietin expression and bioactivity. Biochim Biophys Acta. 1425(3), 441-452.

50 LISTADO DE SECUENCIAS

SEQ ID 1

Polipéptido alfa de la hormona estimulante del folículo 55 Número de acceso AH007338

Secuencia de nucleótidos de FSH alfa

imagen8

Secuencia de proteína de FSH alfa

imagen9

SEQ ID 2

Polipéptido beta de la hormona estimulante del folículo Número de acceso NM_000510 Secuencia de nucleótidos de FSH beta

imagen10

Secuencia de proteína de FSH beta

imagen11

5 SEQ ID 3 Beta-galactósido alfa-2,3-sialiltransferasa 4 Número de acceso L23767

10

Secuencia de nucleótidos de ST3GAL4 Secuencia de proteína de ST3GAL4

imagen12

imagen13

imagen14

SEQ ID 4

Beta-galactosamida alfa-2,6-sialiltransferasa 1 10 Número de acceso NM_003032

Secuencia de nucleótidos de ST6GAL1

imagen15

imagen16

Secuencia de proteína de ST6GAL1

imagen17

En lo que antecede se han desvelado las FSH recombinantes, preparaciones de FSH recombinante, composiciones farmacéuticas, usos y métodos definidos por los siguientes párrafos numerados:

1. FSH recombinante (rFSH) que incluye sialilación en α2,3 y α2,6 5

2.: FSH recombinante según el párrafo 1 que tiene un contenido en ácido siálico [expresado en cuanto a proporción de moles de ácido siálico con respecto a moles de proteína] de 6 mol/mol o mayor.

3.: FSH recombinante según el párrafo 1 o el párrafo 2 que tiene un contenido en ácido siálico de entre 6 mol/mol y 15 mol/mol.

4.: FSH recombinante según cualquiera de los párrafos precedentes en la que un 10 % o más de la sialilación total es sialilación en α2,3.

15 5. FSH recombinante según cualquiera de los párrafos precedentes que incluye sialilación en α2,3 en una cantidad que es del 65 al 85 % de la sialilación total.

6.: FSH recombinante según cualquiera de los párrafos precedentes que incluye sialilación en α2,3 en una cantidad que es del 70 al 80 % de la sialilación total.

7.: FSH recombinante según cualquiera de los párrafos precedentes en la que un 50 % o menos de la sialilación total es sialilación en α2,6.

8. FSH recombinante según cualquiera de los párrafos precedentes que incluye sialilación en α2,6 en una cantidad 25 que es del 15 al 35 % de la sialilación total.

9.: FSH recombinante según cualquiera de los párrafos precedentes que incluye sialilación en α2,6 en una cantidad que es del 20 al 30 % de la sialilación total.

10.: FSH recombinante según cualquiera de los párrafos precedentes que incluye adicionalmente sialilación en α2,8.

11.: FSH recombinante según cualquiera de los párrafos precedentes en la que el contenido en ácido siálico es del 6 %

o mayor en masa.

35 12. FSH recombinante según cualquiera de los párrafos precedentes producida o expresada en una línea celular humana.

13.: FSH recombinante según cualquiera de los párrafos precedentes producida o expresada en una línea celular Per.C6, una línea celular procedente de Per.C6 o una línea celular Per.C6 modificada.

14.: FSH recombinante según cualquiera de los párrafos 12 o 13 en la que la línea celular se ha modificado usando α2,3-sialiltransferasa.

15.: FSH recombinante según cualquiera de los párrafos 12 a 14 que incluye ácidos siálicos unidos en α2,6 (sialilación 45 en α2,6) proporcionados por actividad sialil transferasa endógena.

16.: FSH recombinante expresada en una línea celular humana.

17.: FSH recombinante según el párrafo 16 en la que un 10 % o más de la sialilación total es sialilación en α2,3.

18.: FSH recombinante según el párrafo 16 o 17 que incluye sialilación en α2,3 en una cantidad que es del 65 al 85 % de la sialilación total.

19.: FSH recombinante según cualquiera de los párrafos 16 a 18 en la que un 50 % o menos de la sialilación total es 55 sialilación en α2,6.

20.: FSH recombinante según cualquiera de los párrafos 16 a 19 que incluye sialilación en α2,6 en una cantidad que es del 15 al 35 % de la sialilación total.

21.: FSH recombinante según cualquiera de los párrafos 16 a 20 que incluye un contenido en ácido siálico [expresado en cuanto a proporción de moles de ácido siálico con respecto a moles de proteína] de 6 mol/mol o mayor.

22. FSH recombinante según cualquiera de los párrafos 16 a 21 que incluye sialilación en α2,3 y sialilación en α2,6. 65 23. Una preparación de FSH recombinante que incluye sialilación en α2,3 y sialilación en α2,6.

Claims

imagen1

REIVINDICACIONES

1. FSH recombinante (rFSH) que incluye sialilación en α2,3 y α2,6 en la que el 80 % o más de la sialilación total es

sialilación en α2,3 y en la que del 5 al 20 % de la sialilación total es sialilación en α2,6. 5
2.

FSH recombinante según la reivindicación 1 expresada en una línea celular humana.
3.

Una composición farmacéutica que comprende rFSH según la reivindicación 1 o la reivindicación 2.

10 4. Una composición farmacéutica según la reivindicación 3 que comprende adicionalmente hCG y/o LH.
5. Una composición farmacéutica según la reivindicación 3 o 4 para su uso en el tratamiento de la infertilidad.
6. Un método de producción de rFSH según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 que comprende la etapa de 15 producir o expresar la rFSH en una línea celular humana.
7. Un método según la reivindicación 6 en la que la línea celular se ha modificado usando α2,3-sialiltransferasa y/o α2,6-sialiltransferasa.

31