BRPI0910461B1

BRPI0910461B1 - hormônio de estimulação do folículo recombinante, sua composição farmacêutica, seu método de produção e seu uso

Info

Publication number: BRPI0910461B1
Application number: BRPI0910461-5A
Authority: BR
Inventors: Ian Cottingham; Daniel Plaksin; Richard Boyd White
Original assignee: Ferring International Center S.A
Priority date: 2008-04-16
Filing date: 2009-04-16
Publication date: 2021-02-23
Also published as: SI3045471T1; EP3144318B1; US9546204B2; US20150065695A1; HUS1700024I1; US20110105398A1; JP6486310B2; AU2017204259B2; PL2808340T3; US20180079794A1; FR17C1020I2; HK1199039A1; PT3045471T; EP2808340A1; EP4015527A1; HRP20161520T1; IL208538A; NZ588381A; LT2808340T; US9771407B2

Abstract

hormônio de estimulação do folículo (fhs) recombinante incluindo sialilação alfa 2,3 e alfa 2,6, suas preparações e composições farmacêuticas, uso dos mesmos na fabricação de medicamentos, e método de produção do rfsh. a presente invenção refere-se a preparação incluindo fsh recombinante (rfsh).

Description

[001] A presente invenção refere-se às gonadotrofinas para usono tratamento de infertilidade. Em particular a invenção refere-se ao hormônio de estimulação do folículo (FSH).

[002] As gonadotrofinas são um grupo de hormônios de glicopro-teínas heterodiméricos que regulam a função gonadal nos machos e fêmeas. Elas incluem hormônio de estimulação do folículo (FSH), hormônio luteinizante (LH) e gonadotrofina coriônica (CG).

[003] O FSH é naturalmente secretado pela glândula pituitáriaanterior e funciona para sustentar o desenvolvimento e evolução foli- cular. O FSH compreende uma subunidade alfa de 92 aminoácidos, também comum aos outros hormônios de glicoproteínas LH e CG, e uma subunidade beta de 111 aminoácidos única ao FSH que confere especificidade biológica do hormônio (Pierce and Parsons, 1981). Cada subunidade é depois translacionalmente modificada pela adição de resíduos de carboidrato complexos. Ambas as subunidades transportam 2 sítios para Ligação de glicano ligada à N, a subunidade alfa em 52 e 78 aminoácidos e a subunidade beta em 7 e 24 resíduos de ami- noácidos (Rathnam and Saxena, 1975, Saxena and Rathnam, 1976). O FSH é desse modo glicosilado a cerca de 30% em massa (Dias and Van Roey. 2001. Fox e outros, 2001).

[004] O FSH purificado de urina humana pós-menopausa temsido usado durante muitos anos em tratamento de fertilidade; tanto para promover ovulação em produção natural quanto para fornecer ovó- citos para tecnologias de reprodução assistida. Duas versões recom- binantes de FSH, Gonal-F (Serono) e Puregon (Organon) tornaram-se disponíveis em meados de1990. Estes são ambos expressos em célu- las de ovário de hamsterchinês (CHO) (Howies, 1996).

[005] Existe heterogeneidade considerável associada com preparações de FSH que se refere a diferenças nas quantidades de várias isoformas presentes. As isoformas de FSH individuais apresentam sequências de aminoácidos idênticas, porém diferem no nível ao qual elas são pós translacionalmente modificadas; as isoformas particulares são caracterizadas por heterogeneidade das estruturas ramificadas de carboidrato e diferentes quantidades de incorporação de ácido siálico (um açúcar terminal), ambas das quais parecem influenciar a bioativi- dade de isoforma específica.

[006] A glicosilação de FSH natural é altamente complexa. Osglicanos em FSH pituitário naturalmente derivado podem conter uma ampla faixa de estruturas que podem incluir combinações de glicanos bi-, tri- e tetra-antenários (Pierce and Parsons, 1981. Ryan e outros, 1987. Baenziger and Green, 1988). Os glicanos podem realizar também modificações: fucozilação de núcleo, glicosamina de seccionamento, cadeias estendidas com acetil lactosamina, sialilação parcial ou completa, sialilação com ligações de α2,3 e α2,6, egalactosamina sul-fatadasubstituída por galactose (Dalpathado e outros, 2006). Além disso, existem diferenças entre as distribuições das estruturas de gli- cano nos sítios de glicosilação individuais. Um nível comparável de complexidade de glicano foi encontrado em FSH derivado de soro de indivíduos e da urina de mulheres na pós-menopausa (Wide e outros, 2007).

[007] A glicosilação de produtos recombinantes de FSH reflete afaixa de glicosil-transferases presente na linhagem celular hospedeira. Os produtos de rFSH são derivados de células de ovário de hamster chinês construídas (células de CHO). A faixa de modificações de gli- cano em rFSH derivado de CHO é mais limitada do que aquela encontrada nos produtos naturais, derivados dos extratos pituitários ou de urina. Os exemplos da heterogeneidade de glicano reduzida encontrados em rFSH derivado de CHO incluem uma falta de glicosamina de seccionamento e um teor reduzido de fucolisação de núcleo e extensões de acetil lactosamina (Hard e outros, 1990). Além disso, as células de CHO são apenas capazes de adicionar ácido siálico usando a ligação de α2,3 (Kagawa e outros, 1988, Takeuchi e outros, 1988, Svensson e outros,1990). Isto é diferente do FSH naturalmente produzido que contém glicanos com uma mistura de ácido siálico ligado a α2,3 e α2,6.

[008] Foi demonstrado que a preparação de FSH recombinante(Organon) difere nas quantidades de FSH com um ponto isoelétrico (pi) abaixo de 4 (consideradas as isoformas acídicas) quando comparado ao FSH de urina pós menopausa ou soro, pituitário (Ulloa-Aguirre e outros, 1995). A quantidade de isoformas acídicas nas preparações urinárias foi muito maior quando comparada com os produtos recom- binantes, Gonal-f (Serono) e Puregon (Organon) (Andersen e outros, 2004). Isto deve reflete um teor molar menor de ácido siálico no rFSH visto que o teor de glicano carregado negativamente modificado com sulfato é baixo no FSH. O menor teor de ácido siálico, em comparação com o FSH natural, é uma característica de ambos os produtos de FSH comercialmente disponíveis, e, portanto deve refletir uma limitação no processo de fabricação (Bassett and Driebergen, 2005).

[009] Existe um grande conjunto de trabalho científico que analisa e tenta explicar as variações em glicosilação de FSH entre indivíduos e mudanças durante o decorrer de um ciclo de ovulação. Uma das principais discussões refere-se à observação que concentração de FSH e teor de ácido siálico ambos diminuem durante a fase preovula- tória do ciclo.

[0010] O teor de ácido siálico diminuído resulta em um FSH maisbásico que é tanto depurado mais rapidamente quanto, in vitro pelo menos, é mais potente no receptor alvo (Zambrano e outros, 1996). A pergunta quanto à relevância biológica destas mudanças e como elas podem estar envolvidas na seleção do folículo dominante permanece não resolvida (revisto por Ulloa-Aguirre, 2003).

[0011] O tempo de vida circulatória de FSH foi documentado paramateriais de várias fontes. Alguns destes materiais foram fracionados sobre a base de carga molecular total, como caracterizado por seu pi, em que mais ácido iguala-se a uma carga negativa maior. Como anteriormente estabelecido o principal contribuinte para a carga molecular é o conteúdo siálico total de cada molécula de FSH. Por exemplo, rFSH (Organon) tem um teor de ácido siálico em torno de 8 mol/mol, enquanto FSH derivado de urina tem um teor de ácido siálico maior (de Leeuw e outros, 1996). As taxas de depuração de plasma correspondentes no rato são 0,34 e 0,14 ml/minuto (Ulloa-Aguirre e outros, 2003). Em outro exemplo onde uma amostra de FSH recombinante foi dividida em frações de alto e baixo pi, a potência in vivo da fração de alto pi (menor teor de ácido siálico) foi diminuída e teve uma meia vida de plasma mais curta (D'Antonio e outros, 1999). Foi também reportado que a circulação de FSH mais básico durante os estágios posteriores do ciclo de ovulação é devido à subregulação de α2,3 sialil- transferase no pituitário anterior que é causado por níveis crescentes de estradiol (Damian-Matsumara e outros, 1999. Ulloa- Aguirre e outros, 2001). Os resultados para a α2,6 sialil-transferase não foi reportado.

[0012] O teor de ácido siálico total de FSH e rFSH não é diretamentecomparável, visto que os ácidos siálicos são geralmente ligados de dois modos. O FSH pituitário/ soro/ urinário contém ácido siálico ligado tanto a α2,3 quanto a α2,6, com uma predominância do primeiro. Entretanto, as combinações derivadas de célula de CHO apenas contêm α2,3 (Kagawa e outros, 1988, Takeuchi e outros, 1988, Svens son e outros, 1990). Esta é outra diferença entre produtos recombinan- tes naturais e atuais além do menor teor de ácido siálico total do último.

[0013] As células de CHO são geralmente usadas para a produçãode proteínas recombinantes humanas farmacêuticas. A análise estrutural identificou que ácido siálico é exclusivamente ligado por uma ligação de α2,3. (Kagawa e outros, 1988, Takeuchi e outros, 1988, Svensson e outros, 1990). Muitas glicoproteínas contêm uma mistura tanto de ligações de α2,3 quanto de α2,6. Consequentemente, as proteínas recombinantes expressas usando o sistema de CHO diferir-se- ão de suas contrapartes em seus tipos de ligações. Isto é uma importanteconsideração na produção de biológicos para uso farmacêutico visto que as porções de carboidrato podem contribuir para os atributos farmacêuticos da molécula.

[0014] É desejável ter um produto de rFSH que replique ou imite operfil fisioquímico e farmacocinético do produto produzido de urina humana. É desejável ter um produto de rFSH que melhore a propriedade ou propriedades farmacocinéticas comparadas ao produto re- combinante conhecido.

[0015] Neste contexto de acordo com a presente invenção é fornecido FSH recombinante ("rFSH" ou "recFSH") incluindo sialilação α2,3 e sialilação α2,6 e, opcionalmente, sialilação α2,8. O rFSH (ou preparação de rFSH) de acordo com a invenção pode ter 10% ou mais da sialilação total sendo sialilação α2,3, por exemplo 65 a 85% da siali- lação total podem ser sialilação α2,3. O rFSH (ou preparação de rFSH) da invenção pode ter 50% ou menos da sialilação total sendo sialila- ção α2,6, por exemplo, 15 a 35% da sialilação total podem ser sialila- ção α2,6. O rFSH (ou preparação de rFSH) da invenção pode ter 5% ou menos da sialilação total sendo sialilação α2,8, por exemplo 0,1 a 4% da sialilação total podem ser sialilação α2,8. O rFSH (ou prepara- ção de rFSH) de acordo com a invenção podem ter um teor de ácido siálico [expresso em termos de uma relação de moles de ácido siálico para moles de proteína] de 6 moles/moles ou maior, por exemplo de entre 6 moles/moles e 15 moles/moles.

[0016] Os requerentes descobriram que o tipo de ligação de ácidosiálico, α2,3- ou α2,6-, podem ter uma influência dramática sobre a depuração biológica de FSH. As linhagens celulares humanas, em oposição às linhagens celulares de CHO, podem expressar FSH recombi- nante com ácidos siálicos ligados tanto por ligações de α2,3 quanto de α2,6. No Exemplo 4 uma linhagem celular de FSH recombinante foi feita, a qual o FSH expresso contendo glicanos com baixos níveis tanto de ácido siálico ligado à α2,3 quanto à α2,6 (figura 6). Este material básico, com teor de ácido siálico limitado (figura 4) foi depurado muito rapidamente da circulação em rato como seria previsto (figura 7). Uma linhagem celular foi em seguida submetida a uma segunda etapa de engenharia com a adição da codificação de gene para a α2,6-sialil- transferase (Exemplo 5). O rFSH resultante foi altamente sialilado mostrando teor de ácido siálico e distribuição de pi comparável com FSH urinário (figura 5). Entretanto, o material foi depurado muito rapidamente da circulação de ratos em uma taxa comparável ao material original que teve baixo teor de ácido siálico (figura 8). Isto foi uma observação inesperada visto que é sabido que uma proporção de ácido siálico em FSH natural e biologicamente ativo é ligada por α2,6. A depuração do rFSH sialilado por α2,6 foi descoberta ser mediada pelo receptor de asialoglicoproteína (ASGP) encontrado no fígado (Exemplo 9). Isto foi demonstrado por bloqueio transitório dos receptores de ASGP usando um excesso de outro substrato para o receptor. Com o receptor bloqueado por asialofetuína, a depuração esperada para o material altamente sialilado foi restaurada (figura 9). Isto foi mantido durante várias horas até o bloqueio ser superado e o rFSH altamente sialilado ligado à α2,6 resumir sua rápida depuração.

[0017] O FSH recombinante com uma mistura de ácido siálico ligado tanto à α2,3 quanto à α2,6 foi feito construindo-se uma linhagem celular humana para expressar tanto rFSH quanto c-2,3 sialiltransfera- se (Exemplos 4 e 5). O produto expresso é altamente acídico e transporta uma mistura de ácidos siálicos tanto ligados à α2,3- quanto à α2,6; o último fornecido pela atividade de sialiltransferase endógena (figura 6). Isto tem duas vantagens sobre rFSH expresso em células de CHO convencionais: primeiro o material é mais altamente sialilado devido às atividades combinadas das duas sialiltransferases; e em se-gundo lugar o material mais intimamente parece com o FSH natural. Isto deve provavelmente ser mais biologicamente apropriado comparado com produtos recombinantes derivados de célula de CHO que produzem apenas ácido siálico ligado à α2,3 (Kagawa e outros, 1988, Takeuchi e outros, 1988, Svensson e outros,1990) e têm teor de ácido siálico diminuído (Ulloa-Aguirre e outros, 1995., Andersen e outros, 2004).

[0018] Os requerentes descobriram surpreendentemente que orFSH da invenção pode replicar ou imitar mais intimamente o perfil fi- sioquímico e farmacocinético do produto urinário humano natural do que outros produtos recombinantes. Em outras palavras, o rFSH da invenção pode ser mais próximo ao FSH "natural". Isto pode ter vantagens significantes com respeito à dosagem etc. Além disso, um produto"natural" ou mais "humano" pode ser mais desejável para o paciente, que pode desejar terapia, embora em um sentido artificial, para ser tão "natural" quanto possível. Podem existir outras vantagens (por exemplo, vantagens farmacocinéticas) em um produto recombinante tendo estrutura de carboidrato (por exemplo, glicano) que é mais próxima ao FSH natural (por exemplo, urinário humano) do que outros produtos recombinantes.

[0019] A invenção é desse modo uma versão recombinante deFSH que transporta uma mistura de ácido siálico de α2,3 e α2,6 e, portanto mais intimamente parece com FSH natural. Espera-se que o uso deste composto para estimulação ovariana controlada, em técnicas de IVF, e a indução de ovulação resulte em uma estimulação mais natural do ovário comparada com produtos recombinantes existentes.

[0020] De acordo com a presente invenção neste contexto é fornecido FSH ("rFSH" ou "recFSH") (e/ou uma preparação de FSH re- combinante) incluindo sialilação α2, 3 e sialilação α2,6. O rFSH ou preparação de rFSH pode opcionalmente também incluir sialilação α2, 8.

[0021] Aqui, o termo "preparação de FSH recombinante" incluiuma preparação, por exemplo, uso farmacêutico que inclui FSH re- combinante. Nas modalidades da invenção, o rFSH pode estar presente como uma única isoforma ou como uma mistura de isoformas.

[0022] O rFSH (ou preparação de rFSH) de acordo com a invenção pode ter um teor de ácido siálico [expresso em termos de uma relação de moles de ácido siálico para moles de proteína] de 6 mo- les/moles ou maior (Exemplo 8), por exemplo entre 6 moles/moles e 15 moles/moles, por exemplo, entre 8 moles/moles e 14 moles/moles, por exemplo entre 10 moles/moles e 14 moles/moles, por exemplo, entre 1 moles/moles e 14 moles/moles, por exemplo, entre 12 mo- les/moles e 14 moles/moles, por exemplo, entre 12 moles/moles e 13 moles/moles. O rFSH da invenção pode ser produzido ou expresso em uma linhagem celular humana.

[0023] O rFSH (ou preparação de rFSH) de acordo com a invenção pode ter 10% ou mais da sialilação total sendo sialilação α2,3. Por exemplo, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 ou 90% ou mais da sialilação total podem ser sialilação α2,3. O rFSH (ou preparação de rFSH) pode incluirsialilação α2,3 em uma quantidade que é de 65 a 85% da sialila- ção total, por exemplo de 70 a 80% da sialilação total, por exemplo de 71 a 79% da sialilação total. O rFSH (ou preparação de rFSH) da invenção podem ter 50% ou menos da sialilação total sendo sialilação α2,6. Por exemplo, 40, 30, 20, 10, 5% ou menos da sialilação total podem ser sialilação α2,6. O rFSH (ou preparação de rFSH) pode incluir a2,6-sialilação em uma quantidade que é de 15 a 35% da sialilação total, por exemplo de 20 a 30% da sialilação total, por exemplo de 21 a 29% da sialilação total. O rFSH (ou preparação de rFSH) da invenção pode ter 5% ou menos da sialilação total sendo sialilação α2,8. Por exemplo, 2,5% ou menos da sialilação total podem ser sialilação α2,8. O rFSH (ou preparação de rFSH) pode incluir sialilação α2,8 em uma quantidade que é de 0,1 a 4% da sialilação total, por exemplo de 0,5 a 3% da sialilação total, por exemplo de 0,5 a 2,5% da sialilação total, por sialilação entende-se a quantidade de resíduos siálicos presentes sobre as estruturas de carboidrato de FSH. Sialilação α2,3 significa sialilação na posição 2,3 (como é bem conhecido na técnica) e sialila- ção α2,6 na posição 2,6 (também bem conhecido na técnica). Desse modo, "% da sialilação total pode ser sialilação α2,3"refere-se à % do número total de resíduos de ácido siálico presentes no FSH que são sialilados na posição 2,3. O termo "% da sialilação total sendo α2,6- sialilação" refere-se à % do número total de resíduos de ácido siálico presentes no FSH que são sialilados na posição 2,6.

[0024] O rFSH (ou preparação de rFSH) de acordo com a invenção pode ter um teor de ácido siálico (quantidade de sialilação por molécula de FSH) (com base na massa de proteína, em vez de massa de proteína mais carboidrato) de 6% ou mais (por exemplo entre 6% e 15%, por exemplo, entre 7% e 13%, por exemplo, entre 8% e 12%, por exemplo, entre 11% e 15%, por exemplo, entre 12% e 14%) por massa.

[0025] O FSH recombinante expresso em células de ovário de hamsterchinês (CHO) inclui exclusivamente sialilação α2,3 (Kagawa e outros, 1988, Takeuchi e outros, 1988, Svensson e outros, 1990).

[0026] O rFSH da invenção pode ser produzido ou expresso emuma linhagem celular humana. Isto pode simplificar (e render maior eficiência) o método de produção, porque a manipulação e controle, por exemplo, do meio de crescimento celular para reter a sialilação pode ser menos crítico do que com processos conhecidos. O método pode também ser mais eficiente porque há pouco rFSH básico produzido do que em outra produção de produtos de rFSH conhecidos; rFSH mais acídico é produzido e a separação/remoção de FSH básico é menos problemática. O rFSH pode ser produzido ou expresso em uma linhagem celular de Per.C6, uma linhagem celular derivada de Per.C6 ou uma linhagem celular de Per.C6 modificada. A linhagem celular pode ser modificada usando α2,3-sialiltransferase. A linhagem celular pode ser modificada usando α2,6-sialiltransferase. Alternativamente ou adicionalmente, o rFSH pode incluir ácidos siálicos ligados à α2,6 (sialilação α2,6) fornecidos pela atividade de sialiltransferase endógena[da linhagem celular].

[0027] O rFSH pode ser produzido usando α2,3- e/ou α2,6- sialil-transferase. O rFSH pode ser produzido usando α2,3- sialiltransferase. O rFSH pode incluir ácidos siálicos ligados à α2,6 (α2,6 sialilação) fornecidos pela atividade de sialiltransferase endógena.

[0028] De acordo com a presente invenção em outro aspecto éfornecido um método de produção de rFSH e/ou uma preparação de rFSH como descrito aqui (de acordo com os aspectos da invenção) compreendendo a etapa de produção ou expressão do rFSH em uma linhagem celular humana, por exemplo uma linhagem celular de Per.C6, uma linhagem celular derivada de Per.C6 ou uma linhagem celular de Per.C6 modificada, por exemplo uma linhagem celular que foi modificada usando α2,3- sialiltransferase.

[0029] A estrutura de rFSH contém porções de glicano. A ramificação pode ocorrer com o resultado que o glicano pode ter 1 , 2, 3, 4 ou mais terminais de resíduos de açúcar ou "antenas", como é bem conhecido na técnica. O rFSH da invenção pode ter glicanos com presença de sialilação em estruturas monoantenárias e/ou diantenárias e/ou triantenárias e/ou tetra-antenárias. O rFSH pode preferivelmente incluir estruturas de glicano monossialiladas, dissialiladas, trissialiladas e tetrassialiladas com quantidades relativas como segue: 9 a 15% mo- nossialiladas; 2 a 30% di-sialiladas; 30 a 36% trissialiladas e 25 a 29% tetrassialiladas (por exemplo como mostrado por análise de WAX de glicanos carregados, como estabelecido aqui no Exemplo 8 c).

[0030] De acordo com a presente invenção em outro aspecto éfornecido rFSH produzido (por exemplo, expresso) em uma linhagem celular humana. O rFSH pode incluir sialilação α2,3 e α2,6. O rFSH pode ser produzido ou expresso em uma linhagem celular de Per.C6, uma linhagem celular derivada de Per.C6 ou uma linhagem celular de Per.C6 modificada. A linhagem celular pode ser modificada usando α2,3-sialiltransferase. A linhagem celular pode ser modificada usando α2,6-sialiltransferase. Alternativamente ou adicionalmente, o rFSH pode incluir ácidos siálicos ligados à α2,6 (sialilação α2,6) fornecidos pela atividade de sialiltransferase endógena [da linhagem celular]. O rFSH (ou preparação de rFSH) pode ter 10% ou mais da sialilação total sendosialilação α2,3, por exemplo, 65 a 85% da sialilação total podem ser sialilação α2,3. O rFSH (ou preparação de rFSH) da invenção pode ter 50% ou menos da sialilação total sendo a2,6-sialilação, por exemplo, 15 a 35% da sialilação total podem ser sialilação α2,6. O rFSH (ou preparação de rFSH) da invenção pode ter 5% ou menos da sialilação total sendo sialilação α2,8, por exemplo 0,5 a 4% da sialilação total pode ser sialilação α2,8. O rFSH pode ter um teor de ácido siálico [expresso em termos de uma relação de moles de ácido siálico para mo- les de proteína] de 6 moles/moles ou maior, por exemplo entre 6mol/mol e 15 moles/moles.

[0031] De acordo com a presente invenção em outro aspecto éfornecida uma composição farmacêutica compreendendo rFSH incluindo sialilação α2,3 e sialilação a2,6-sialilação (por exemplo, como estabelecido acima). A composição farmacêutica pode também compreender hCG e/ou LH.

[0032] hCG pode ser obtido por qualquer meio conhecido na técnica. hCG como usado aqui inclui hCG recombinante e derivado de humano. O hCH derivado de humano pode ser purificado de qualquer fonte apropriada (por exemplo, urina, e placenta) por qualquer método conhecido na técnica. Os métodos de expressão e purificação de hCG recombinante são bem conhecidos na técnica.

[0033] LH pode ser obtido por qualquer meio conhecido na técnica. LH, como usado aqui, inclui LH recombinante e derivado de humano. O LH derivado de humano pode ser purificado de qualquer fonte apropriada (por exemplo, urina) por qualquer método conhecido na técnica. Os métodos de expressão e purificação de LH são bem conhecidos na técnica.

[0034] A composição farmacêutica pode ser para o tratamento deinfertilidade, por exemplo, para uso em, por exemplo, tecnologias reprodutivas assistidas (ART), indução de ovulação ou inseminação in- trauterina (IUI). A composição farmacêutica pode ser usada, por exemplo, em indicações médicas onde as preparações de FSH são usadas. A presente invenção também fornece o uso de rFSH e/ou uma preparação de rFSH descrito aqui (de acordo com os aspectos da invenção) para, ou na fabricação de um medicamento para o tratamento de infertilidade. As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser formuladas em composições bem conhecidas para qualquer rotina de administração de fármaco, por exemplo, oral, retal, pa- renteral, transdérmica (por exemplo, tecnologia de emplastro), intravenosa, intramuscular, subcutânea, intrassusternal, intravaginal, intraperitoneal, local (pós, unguentos ou gotas) ou como um spray bucal ou nasal. Uma composição típica compreende um portador farmaceuti- camente aceitável, tal como solução aquosa, excipientes não tóxicos, incluindo sais e conservantes, tampões e similares, como descrito em Remington's Pharmaceutical Sciences décima quinta edição (Matt Publishing Company, 1975), nas páginas 1405 a 1412 e 1461 - 87, e no national formulary XIV décima quinta edição (American Pharmaceutical Association, 1975), entre outros.

[0035] Exemplos de veículos farmacêuticos aquosos e não aquosos adequados, diluentes, solventes ou veículos incluem água, etanol, polióis (tais como glicerol, propileno glicol, polietileno glicol, e similares), carboximetilcelulose e misturas adequadas dos mesmos, óleos vegetais (tal como óleo de oliva), e ésteres orgânicos injetáveis tal como oleato de etila.

[0036] As composições da presente invenção também podem conter aditivos tais como, porém não limitados a, conservantes, agentes umectantes, agentes emulsificantes, e agentes dispersantes. Os agentes antibacterianos e antifúngicos podem ser incluídos para prevenir crescimento de micróbios e incluem, por exemplo, parabeno, clorobu- tanol, fenol, ácido sórbico, e similares. Além disso, pode ser desejável incluir agentes isotônicos tais como açúcares, cloreto de sódio, e similares.

[0037] Em alguns casos, para ação prolongada de efeito é desejável diminuir a absorção de FSH (e de outros ingredientes ativos, se presentes) de injeção subcutânea ou intramuscular. Isto pode ser realizado pelo uso de uma suspensão líquida de material cristalino ou amorfo com má solubilidade de água. A taxa de absorção de FSH então de sua taxa de dissolução que, por sua vez, pode depender do ta- manho de cristal e forma cristalina. Alternativamente, a absorção retardada de uma forma de combinação de FSH parenteralmente administradaé realizada dissolvendo-se ou suspendendo a combinação de FSH em um veículo oleoso.

[0038] As formas de depósito injetáveis podem ser feitas formando-se matrizes microencapsuladas do FSH (e de outros agentes, se presentes) em polímeros biodegradáveis tal como poliactídeo- poliglicolídeo. Dependendo da relação de FSH para polímero e a natureza do polímero particular empregado, a taxa de liberação de FSH pode ser controlada. Exemplos de outros polímeros biodegradáveis incluem polivinilpirrolidona, poli(ortoésteres), poli(anidridos) etc. As formulações injetáveis de depósito são também preparadas capturando-se o FSH em lipossomas ou microemulsões que são compatíveis com tecidos corporais.

[0039] As formulações injetáveis podem ser esterilizadas, porexemplo, por filtração através de um filtro de retenção de bactérias, ou incorporando-se agentes de esterilização na forma de composições sólidas estéreis que podem ser dissolvidas ou dispersas em água estéril ou outro meio injetável estéril justamente antes do uso. As formulações injetáveis podem ser fornecidas em qualquer recipiente adequado, por exemplo, frasconete, seringa pré-carregada, cartuchos de injeção, e similares.

[0040] As formulações injetáveis podem ser fornecidas como umproduto tendo composições farmacêuticas contendo FSH (opcionalmente com hCG, LH etc.) se existir mais do que um ingrediente ativo (isto é, FSH e, por exemplo, hCG ou LH), isto pode ser adequado para administração separadamente ou conjunta. Se separadamente administrada, a administração pode ser sequencial. O produto pode ser fornecido em qualquer embalagem adequada. Por exemplo, um produto pode conter várias seringas pré-carregadas contendo FSH, hCG, ou uma combinação tanto de FSH quanto de hCG, as seringas embaladas em uma embalagem de bolhas ou outros meios para manter a esterilidade. Um produto pode opcionalmente conter instruções para usar as formulações de FSH e hCG.

[0041] O pH e concentração dos vários componentes da composição farmacêutica são ajustados de acordo com prática de rotina neste campo. Veja GOODMAN and GILMAN's THE PHARMACOLOGICAL BASIS FOR THERAPEUTICES, 7a edição. Em uma modalidade preferida, as composições da invenção são fornecidas como composições para administração parenteral. Os métodos gerais para a preparação das formulações parenterais são conhecidos na técnica e são descritos em REMINGTON; THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY, supra, nas páginas 780 a 820. As composições parenterais podem ser fornecidas em formulação líquida ou como um sólido que será misturado com um meio injetável estéril justamente antes da administração. Em uma modalidade especialmente preferida, as composições parenterais são fornecidas em forma unitária de dosagem para facilidade de administração e uniformidade de dosagem.

Descrição Detalhada da Invenção

[0042] A presente invenção agora será descrita em mais detalhecom referência aos exemplos seguintes e aos desenhos seguintes em que: a figura 1 mostra um mapa de plasmídeo do vetor de expressão de pFSHalfa/beta; a figura 2 mostra o vetor de expressão de α2,3-sialiltransferase (ST3GAL4); a figura 3 mostra o vetor de expressão de α2,6-sialiltransferase (ST6GAL1); a figura 4 mostra focagem isoelétrica de FSH recombinante produzido por células Per.C6 estavelmente expressando FSH; a figura 5 mostra exemplo de clones analisados por focagemisoelétrica de FSH recombinante produzido por células Per.C6 estavelmente expressando FSH após engenharia com α2,3- ou α2,6- sialiltransferase; a figura 6 mostra análise do das ligações de ácido siálico de FSH de Per.C6; a figura 7 mostra as taxas de depuração metabólica (MCRs) de amostras de FSH de Per.C6; a figura 8 mostra MCRs de amostras de FSH de Per.C6construído por α2,6-sialiltransferase; a figura 9 mostra MCRs de amostras de FSH de Per.C6construído por α2,6-sialiltransferase; a figura 10 mostra MCRs de amostras de FSH de Per.C6 construído por α2,3-sialiltransferase; a figura 11 mostra aumento de peso ovariano por clones de rFSH de Per.C6 de rFSH de Per.C6 parental, de acordo com o método de Steelman e Pohley (1953); a figura 12 mostra aumento de peso ovariano por clones de rFSH de Per.C6 de rFSH de Per.C6 construído (α2,6-sialiltransferase); e a figura 13 mostra aumento de peso ovariano por clones de rSFH de Per.C6 de rFSH de Per.C6 construído (α2,3-sialiltransferase).

Seleção de Sequência FSH humano

[0043] A região de codificação do gene para alfa peptídeo de FSHfoi usada de acordo com Fiddes e Goodman. (1981). A sequência é depositada como AH007338 e no tempo de construção não houve nenhuma variante desta sequência de proteína. A sequência é referida aqui como SEQ ID 1.

[0044] A região de codificação do gene para FSH beta polipeptí- deo foi usada de acordo com Keene e outro (1989). A sequência é depositada como NM_000510 e no tempo de construção não ouve nenhuma outra variante desta sequência de proteína. A sequência é referida aqui como SEQ ID 2.

Sialiltransferase

[0045] α2,3-sialiltransferase - A região de codificação do gene parabeta-galactosídeo alfa-2,3-sialiltransferase 4 (α2,3-sialiltransferase, ST3GAL4) foi usada de acordo com Kitagawa e Paulson (1994). A sequência é depositada como L23767 e referida aqui como SEQ ID 3.

[0046] α2,6-Sialiltransferase - A região de codificação do gene para beta- galactosamida alfa-2,6-sialiltransferase 1 (α2,6-sialiltransferase, ST6GAL1) foi usada de acordo com Grundmann e outros, (1990). A sequência é depositada como NM_003032 e referida aqui como SEQ ID 4.

EXEMPLOS Exemplo 1: construção do vetor de expressão de FSH

[0047] As sequência de codificação de FSH alfa polipeptídeo(AH007338, SEQ ID 1) e FSH beta polipeptídeo (NM_003032, SEQ ID 2) foram amplificadas por PCR usando as composições iniciadoras FSHa-fw e FSHa-rev e FSHb-fw e FSHb-rec respectivamente. FSHa-fw 5’-CCAGGATCCGCCACCATGGATTACTACAGAAAAATATGC-3' FSHa-retf 5’-GGATGGCTAGCTTAAGATTTGTGATAATAAC-3‘ FSHb-fw 5-CCAGGCGCGCCACCATGAAGACACTCCAGTTTTTC-3' FSHb-rev 5 -CCGGGTTAACTTATTATTCTTTCATTTCACCAAAGG-3’

[0048] O DNA de FSH beta amplificado resultante foi digerido comas enzimas de restrição Ascl e Hpal e inserido nos sítios de Ascl e Hpal sobre o vetor de expressão de mamífero regulado por CMV transportando um marcador de seleção de neomicina. Similarmente o alfa DNA de FSH foi digerido com BamHI e Nhel e inseridos nos sítios BamHI e Nhel sobre o vetor de expressão já contendo o DNA de FSH beta polipeptídeo.

[0049] O vetor DNA foi usado para transformar a linhagem deDH5α de E.coli. Sessenta clones foram capturados para amplificação e cinquenta e sete continham o vetor contendo tanto FSH alfa quanto beta. Vinte destes foram selecionados para sequenciamento e todos continham o sequenciamento correto de acordo com SEQ ID 1 e SEQ ID 2. O plasmídeo pFSH A+B#17 foi selecionado para transfecção (figura 1).

Exemplo 2: construção do vetor de expressão de ST3

[0050] A sequência de codificação de beta-galactosídeo alfa-2,3-sialiltransferase 4 (ST3, L23767, SEQ ID 3) foi amplificada por PCR usando a combinação iniciadora 2,3STfw e 2,3STrev. 2.3STfw 5’-CCAGGATCCGCCACCATGTGTCCTGCAGGCTGGAAGC 3’ 2,3STrev S-TTTTTTTCTTAAGTCAGAAGGACGTGAGGTTCTTG-y

[0051] O DNA de ST3 amplificado resultante foi digerido com asenzimas de restrição BamHI e AFlll e inseridos nos sítios de SamHI e AfIllsobre sobre o vetor de expressão de mamífero regulado por CMV transportando um marcador de resistência de higromicina. O vetor foi amplificado como anteriormente descrito e sequenciado. O clone pST3#1 (figura 2) conteve a sequência correta de acordo com SEQ ID 3 e foi selecionado para transfecção.

Exemplo 3: construção do vetor de expressão de ST6

[0052] A sequência de codificação de beta-galactosamida alfa-2,6-sialiltransferase 1 (ST6, NM_003032, SEQ ID 4) foi amplificada por PCR usando a combinação iniciadora 2,6STfw e 2,6STrev. 2,6STfw 5,-CCAGGATCCGCCACCATGATTCACACCAACCTGAAG-3, 2,6STrev S -TTTTTTTCTTAAGTTAGCAGTGAATGGTCCGG-S''

[0053] O DNA de ST6 amplificado resultante foi digerido com asenzimas de restrição SamHI e AFlll e inseridos nos sítios de SamHl e AFlll sobre o vetor de expressão de mamífero regulado por CMV transportando um marcador de resistência de higromicina. O vetor foi amplificado como anteriormente descrito e sequenciado. O clone pST6#11 (figura 3) conteve a sequência correta de acordo com SEQ ID 4 e foi selecionado para transfecção.

Exemplo 4: expressão estável de pFSH A+B em células PER.C6. Isolamento e análise de transfecção de clones.

[0054] Os clones de Per.C6 produzindo FSH foram gerados porexpressão de ambas as cadeias de polipeptídeo de FSH de um único plasmídeo (veja Exemplo 1).

[0055] Para obter-se clones estáveis uma lipossoma com base noagente de transfecção com a construção de pFSH A+B. Os clones estáveisforam selecionados em VPRO suplementado com 10% de FCS e contendo G418. Nas semanas após a transfecção os clones resistentes ao G418 desenvolveram-se. Um total de 250 clones foi selecionado para isolamento. Os clones isolados foram cultivados em meio de seleção até 70 a 80% de confluentes. Os sobrenadantes foram ensaiados quanto ao teor de proteína de FSH usando um ELISA seletivo de FSH e atividade farmacológica no receptor de FSH em linhagem celular clonada, usando um ensaio de acumulação de cAMP. Os clones (98) expressando proteína funcional foram progredidos para expansãode cultura em frascos de 24 cavidades, 6 cavidades e T80.

[0056] Os estudos para obter produtividade e qualidade do material de sete clones foram iniciados em frascos T80 para gerar material suficiente. As células foram cultivadas em meio suplementado como anteriormente descrito durante 7 dias e o sobrenadante colhido. A produtividade foi determinada usando o ELISA seletivo de FSH. O perfil isoelétrico do material foi determinado (Exemplo 6). As amostras representativassão mostradas na figura 4. A informação do IEF foi usada para selecionar clones para análise de taxa de depuração metabólica (Exemplo 9). Os clones (005, 104, 179, 223, 144) com produtividade e qualidade suficientes foram selecionados para engenharia de sia- liltransferase.

Exemplo 5: Nível de sialilação é aumentado em células que superexpressam α2,3- ou α2,6-sialiltransferase. Expressão estável de pST3 ou pST6 em células PER.C6 de expressão de FSH; Isolamento e análise de transfecção de clones.

[0057] Os clones de Per.C6 produzindo FSH altamente sialiladoforam gerados por expressão de α2,3 sialiltransferase ou α2,6 sialil- transferase de plasmídeos separados (veja os exemplos 2 e 3) em células PER.C6 anteriormente expressando ambas as cadeias de poli- peptídeo de FSH (veja Exemplo 4). Quatro clones produzidos de células PER.C6® como estabelecido aqui no Exemplo 4 foram selecionados quanto a suas características incluindo produtividade, bom perfil de crescimento, produção de proteína funcional, e FSH produzidos que incluíram alguma sialilação.

[0058] Clones estáveis foram gerados como anteriormente descrito no Exemplo 4. Um total de 202 clones do programa de α2,3- sialiltransferase e 210 clones do programa α2,6-sialiltransferase forram isolados, expandidos e ensaiados. O número de clone final do estudo de α2,3 foi 12 e 30 do estudo de α2,6.

[0059] Os clones de α2,3-sialiltransferase foram adaptados aosmeios livre de soro e condições de suspensão.

[0060] Como antes, os clones foram ensaiados usando um ELISAseletivo de FSH, resposta funcional em uma linhagem celular receptora de FSH, IEF (Exemplo 6), taxa de depuração metabólica (Exemplo 9) e análise de Steelman Pohley (Exemplo 10). Os resultados foram comparados a um FSH recombinante comercialmente disponível (Go- nal-f, Serono) and the linhagens celulares de Per.C6 FSH parenterais. As amostras representativas são conhecidas na figura 5. Alguns clones não demonstram um aumento em sialilação, porém pode ser visto que o FSH produzido pela maior parte dos clones tem sialilação signi- ficantemente melhorada (isto é, em média, mais isoformas de FSH com altos números de ácidos siálicos) comparados com FSH expresso sem α2,3- ou α2,6- sialiltransferase.

[0061] Em conclusão, a expressão de FSH junto com sialiltransfe-rase em células PER.C6 resulta em níveis aumentados de FSH sialila- do comparado com células expressando FSH apenas.

Exemplo 6: Análise do pi de isoformas de FSH produzidas por Per.C6 por focagem isoelétrica.

[0062] A eletroforese é definida como o transporte de moléculascarregadas por meio de um solvente por um campo elétrico. A mobilidade de uma molécula biológica através de um campo elétrico dependerá da intensidade do campo, carga líquida sobre a molécula, tamanho de forma da molécula, intensidade iônica e propriedades do meio por meio do qual as moléculas migram.

[0063] Focagem isoelétrica (IEF) é uma técnica eletroforética par aseparação de proteínas com base em seu pi. O pi é o pH no qual uma proteína não tem nenhuma carga líquida e não migrará em um campo elétrico. O teor de ácido siálico das isoformas de FSH sutilmente altera o ponto de pi para cada isoforma, o qual pode ser explorado usando esta técnica para visualizar as isoformas de FSH de Per.C6 de cada clone.

[0064] Os pontos isoelétricos das isoformas de FSH produzidaspor Per.C6 em sobrenadantes de cultura de célula foram analisados usando focagem isoelétrica. O meio de cultura celular de clones de FSH de Per.C6 foi produzido como descrito nos exemplos 4 e 5.

[0065] Amostras de Per.C6 FSH foram separadas em Novex® IEFGels contendo 5% de poliacrilamida sob condições negativas em um gradiente de pH 3,0 a 7,0 em um pH 3,0 a 7,0 de solução de anfólito.

[0066] As proteínas foram transferidas sobre nitrocelulose sustentada e visualizadas usando um anticorpo monoclonal de anti-FSHα primário, anticorpo conjugado de fosfato alcalino de IgG anticamun- dongo secundário e 5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato (BCIP) e reagente de tetrazólio de nitrazul (NBT) para visualizar as ligaduras.

[0067] Como indicado nas figuras 4 e 5, as ligaduras representamisoformas de FSH contendo números diferentes de moléculas de ácido siálico.

[0068] Usando este método, os clones produzindo isoformas de FSH com um número maior de moléculas de ácido siálico foram identificados. A engenharia com α2,3- ou α2,6- sialiltransferase resultou em clones com ,ais ácido siálico e menor.

Exemplo 7: Análise das ligações de ácido siálico de FSH de Per.C6

[0069] Os glicoconjugados foram analisados usando um métodode diferenciação de glicano com base em lectina. Com este método as glicoproteínas e glicoconjugados liagados à nitrocelulose podem ser caracterizados. As lectinas seletivamente reconhecem uma porção particular, por exemplo, ácido siálico ligado à α2,3. As lectinas aplicadas são conjugadas com o esteroide hapteno digoxigenina que permite a detecção imunológica das lectinas ligadas.

[0070] O FSH de Per.C6 purificado de um clone parental (nenhumsialiltransferase adicional), um clone construído por α2,3- sialiltransferase e um clone construído por α2,6-sialiltransferase foram separados usando técnicas de SDS-PAGE padrões. Um FSH recom- binante comercialmente disponível (Gonal-f, Serono) foi usado como padrão.

[0071] O ácido siálico foi analisado usando o DIG Glycan Differentiationkit (Cat. n° 11 210 238 001, Roche) de acordo com as estruções dos fabricantes. As reações positivas com aglutinina de Sambucus nigra (SNA) indicaram ácido siálico terminalmente ligado (α2-6). As reações positivas com aglutinina de Maackia amurensis Il (MAA) indica- ram ácido siálico terminalmente ligado (α2-3).

[0072] Em resumo, o clone parental 005 conteve baixos níveis tanto de ácido siálico de α2,3 quanto de α2,6. Os clones construídos com α2,3-sialiltransferase continham altos níveis de ligações de ácido siáli- co de α2,3 e baixos níveis de ligações de ácido siálico de α2,6. Os clones construídos com α2,6-sialiltransferase continham altos níveis de ligações de ácido siálico de α2,6 e baixos níveis de ligações de ácido siálico de α2,3. O controle padrão Gonal-f contém apenas ligações de ácido siálico de α2,3. Isto é consistente com o que é conhecido a cerca de proteínas recombinantes produzidas em células ovarianas de hamster chinês (Kagawa e outros, 1988, Takeuchi e outros, 1988, Svensson e outros, 1990).

[0073] Em conclusão, a engenharia de células de FSH de Per.C6com α2,3- ou α2,6- sialiltransferase sucessivamente aumentou o número de moléculas de ácido siálico conjugadas ao FSH na amostras.

Exemplo 8a: Quantificação de ácido siálico total

[0074] O ácido siálico é um carboidrato ligado à proteína considerado ser um monossacarídeo e ocorre em combinação com outros monossacarídeos como galactose, manose, glicosamina, galactosami- na e fucose.

[0075] O ácido siálico total em rFSH purificado (Exemplo 11) foimedido usando um kit de quantificação de ácido siálico enzimático de acordo com o protocolo dos fabricantes (Sigma, Sialic-Q). Em resumo, a aldolase de ácido N-acetilneuramínico catalisa ácido siálico para N- acetilmanoasina e ácido pirúvico. O ácido pirúvico pode ser reduzido a ácido lático por β-NADH e desidrogenagem lática. A oxidação de B- NADH pode ser espectrofotometricamente acuradamente medida.

[0076] A concentração de proteína foi medida em placas de micro-título usando um kit de ensaio de ácido bicinconímico comercial (BCA) (Sigma, B 9643) com base no método de Lowry (Lowry e outros, 1951).

[0077] O teor de ácido siálico total de FSH de Per.C6 foi medido edescoberto ser maior do que 6 mol/mol.

Exemplo 8b: Quantificação de quantidades relativas de ácido siálico de α2,3, α2,6 e α2,8.

[0078] As quantidades percentuais relativas de ácido siálico deα2,3, α2,6 e α2,8 em rFSH purificado (Exemplo 11) foram medidas usando técnicas conhecidas.

[0079] Cada amostra de rFSH foi imobilizada (bloqueio de gel),lavada, reduzida, alquilada e digerida com PNGase F durante a noite. Os N-glicanos foram, em seguida, extraídos e processados. Os N- glicanos para análise de NP-HPLC e WAX-HPLC foram rotulados com o fluoróforo 2AB como detalhado em Royle e outros. Os N-glicanos foram trabalhados em HPLC de fase normal (NP) em uma coluna de amida de TSK (como detalhado em Royle e outros) com tempo de retençãoexpresso em unidades de glicose (GU).

[0080] As amostras extraídas, misturadas, glicanos (extraídos como acima) foram digeridos com sialidases diferentes para determinar as ligações. O NAN 1 (sialidase recombinante) libera ácidos siálicos de terminal de não redução ligados à α2,3 (NeuNAc e NeuNGc), ABS (Ar- throbacter ureafaciens sialidase) libera ácidos siálicos de terminação de não redução ligados a α2,3, α2,6 e α2,8 (NeuNAc e NeuNGc). As amostras foram analisadas por NP-HPLC, para permitir a comparação da amostra não digerida com aquela digerida com NAN1 e aquela di-gerida com ABS. A comparação destes três traços de NP-HPLC (não digerida, digerida com NAN1, digerida com ABS) mostra que a digestãocom ABS e NAN1 fornece resultados diferentes. Isto indica que as amostras têm ácidos siálicos com ligações de α2,3, α2,6 e α2,8. As porcentagens relativas foram calculadas de estruturas presentes nas misturas de glicano não digeridas e foram descobertas serem nas fai- xas de 65% a 85% (por exemplo, 77,75%) para sialilação α2,3; 15 a 35% (por exemplo, 21,46%) para sialilação α2,6; e 0,1 a 3% para α2,8 sialilação.

Exemplo 8c: Quantificação de quantidades relativas de estruturas sialiladas mono-, di-, tri- e tetra-antenárias

[0081] As quantidades percentuais relativas de estruturas mono,di, tri e tetra sialiladas em glicanos extraídos de rFSH purificado (Exemplo 11) foram medidas usando técnicas conhecidas.

[0082] Cada amostra de rFSH foi imobilizada (bloqueio de gel),lavada, reduzida, alquilada e digerida com PNGase F durante a noite. Os N-glicanos foram, em seguida, extraídos e processados. Os N- glicanos para análise de NP-HPLC e WAX-HPLC foram rotulados com o fluoróforo 2AB como detalhado em Royle e outros,

[0083] HPLC de troca de ânion fraca (WAX) para separar os N-glicanos por carga (Exemplo 8b) foi realizada como estabelecido aqui no Royle e outros, com um padrão de N-glicano de fetuína como referência. Os glicanos foram eluídos de acordo com o número de ácidos siálicos que eles continham. Todas as amostras incluíram estruturas mono(1S), di(2S), tri(3S) e tetra(4S) sialiladas. As quantidades relativas de estruturas sialiladas foram descobertas serem nas seguintes relações (1S:2S:4S:4S): 9 a 15%: 27 a 30%: 30 a 36%: 25 a 29% (por exemplo, 10,24:28,65:35,49:25,62).

Exemplo 9: Determinação das taxas de depuração metabólica de rFSH

[0084] Para determinar a taxa de depuração metabólica (MCR) deFSH de amostras de Per.C6, ratos fêmeas conscientes (3 três animais por clone) foram injetados na veia do rabo no tempo zero com um bolo de rFSH (1 - 10 μg/rato, com base em quantificação de ELISA de amostras, DRG EIA 1288). Amostras de sangue (400 μl) foram colhidas da ponta do rabo em 1, 2, 4, 8, 12, 24 e 32 horas após a injeção de amostra de teste. Soro foi coletado por centrifugação e ensaiado quanto ao teor de FSH por ELISA (DRG EIA 1288).

[0085] O receptor de assialoglicoproteína (ASGP-R) reconhece asglicoproteínas dessialiladas (terminadas por galactose) tal como asia- lofetuína (ASF). (Pricer and Ashwell, 1971. Van Lenten and Ashwell, 1972). O receptor de ASGP e a glicoproteínas dessialilada ligada são internalizados na célula onde o receptor é reciclado e o ligante é degradado (Regoeczi e outros, 1978, Steer and Ashwell, 1980).

[0086] Para investigar se o material de FSH de Per.C6 foi depurado por meio deste mecanismo, o ASGP-R saturado com asialofetuína. A taxa de depuração metabólica de material construído de α2,6 ou α2,3-sialiltransferase, parental foi determinada como descrito com co- administração de um excesso molar 7500 vezes mínimo de asialofetu- ína para saturar a ASGP-R durante 1 a 2 horas.

[0087] O material produzido pelos clones de FSH de Per.C6 parentais continha material MCR um pouco mais duradouro, porém uma alta porcentagem foi depurada rapidamente (figura 7). O clone de chumbo que continha 005 que continha material mais sialilado foi construído usando α2,6- ou α2,3-sialiltransferase (Exemplo 5). Embora os clones construídos com α2,6-sialiltransferase demonstraram sialila- ção aumentada (figura 5) não houve nenhuma melhora no MCR (figura 7). O bloqueio do ASGR restaurou o MCR do material de α2,6 para aquele do padrão demonstrando que, mesmo com ligações de α2,6 aumentadas, o material é depurado rapidamente (figura 8). A engenharia com α2,3- sialiltransferase resultou em clones com MCR comparável ao padrão (figura 9) e variação de teor siálico foi consistente com a que é conhecida para as isoformas de FSH (figura 10).

Exemplo 10: ensaio in vivo de Steelman-Pohley

[0088] Para demonstrar aumento de teor de ácido siálico sobre osresultados de FSH em um efeito biológico aumentado, o aumento nos pesos ovarianos em ratos por FSH altamente sialilado tal como produzido no Exemplo 5 foi examinado.

[0089] O aumento nos pesos ovarianos devido aos clones de rFSHde Per.C6 foram analisados de acordo com o método de Steelman e Pohley (1953). O rFSH de Per.C6 de amostras de meios de célula filtrados foi quantificado por ELISA (DRG1EIA- 1288). As amostras (rFSH de Per.C6) e padrões (rFSH de Gonal-f) foram testados em cinco doses diferentes (3 animais/dose). A Gonal-f foi dosada em 50, 100, 200, 400, e 800 ng/rato, As doses amostrais foram calculadas usando seus valores de AUC relativos à Gonal-f, tipicamente 0,05 a 10 μg/rato.

[0090] Em conclusão, o material subsialilado produzido pelos clones de FSH de Per.C6 parentais (figura 11) não foi tão potente no ensaio de aumento de peso ovariano como o rFSH comercialmente disponível. Sialiltransferase engenheirando para adicionar ligações de α2,6 adicionais elevadas de teor do ácido siálico mas não forneceu potência no ensaio in vivo (figura 12).

[0091] Entretanto, as ligações de α2,3 adicionais significantementemelhoraram a potência (figura 13) e as duas preparações de FSH re- combinante (Per.C6 e derivado de CHO) apresentaram perfis muito similares neste ensaio.

Exemplo 11: Avaliação de produção e purificação

[0092] O procedimento foi desenvolvido para produzir FSH em células PER.C6 que foram cultivadas em suspensão em meio livre de soro. O procedimento é descrito abaixo e foi aplicado a várias linhagens celulares PER.C6 produtoras de FSH.

[0093] O FSH do clone parental 005, clone α2,3 007 e clone α2,6059 foram preparados usando uma modificação do método descrito por Lowry e outros, (1976).

[0094] Para a produção de PER.C6-FSH, as linhagens celularesforam adaptadas a um meio livre de soro, isto é, Excell 525 (JRH Bios- ciences). As células foram primeiro cultivadas para formar uma mono- camada confluente de 70% a 90% em um frasco de cultura T80. Na passagem as células foram suspensas novamente no meio livre de soro, Excell 525 + 4 mM L-Glutamine, a uma densidade celular de 0,3x106células/ml. Uma suspensão de célula a 25 ml foi colocada em frasco agitador de 250 ml e agitada a 100 rpm a 37°C em CO2 a 5%. Após alcançar uma densidade celular de > 1X106células/ml, as células foram subdesenvolvidas para uma densidade celular de 0,2 ou 0,3x106células/ml e também cultivadas em frascos agitadores a 37°C, 5% de CO2 e 100 rpm.

[0095] Para a produção de FSH, as células foram transferidas paraum meio de produção livre de soro, isto é, VPRO (JRH Biosciences), que suporta o crescimento de células PER.C6 a densidades celulares muito altas (geralmente células/ml > 107 em uma cultura de batelada). As células foram primeiro cultivadas a células/ml > 1x106 em Excell 525, em seguida giradas durante 5 minutos em 1000 rpm e subsequentemente suspensas em meio de VPRO + L-glutamina a 6 mM a uma densidade de 1x106células/ml. As células foram em seguida cultivadas em um frasco agitador durante 7 a 10 dias a 37°C, CO2 a 5% e 100 rpm. Durante este período, as células desenvolveram-se para uma densidade de > 107células/ml. O meio de cultura foi colhido após a viabilidade celular começar a declinar. As células foram giradas durante 5 minutos a 1000 rpm e o sobrenadante foi usado para a quantificação e purificação de FSH. A concentração de FSH foi determinada usando ELISA (DRG EIA 1288).

[0096] Depois disso, a purificação de FSH foi realizada usandouma modificação do método descrito por Lowry e outro (1976). I foi obtido por cromatografia em DEAE celulose, filtração de gel em Sephadex G100, cromatografia de absorção em hidroxiapatita, e eletroforese de poliacrilamida preparativa.

[0097] Durante todos os procedimentos cromatográficos, a presença de FSH imunorreativo foi confirmada por RIA (DRG EIA 1288) e IEF (Exemplo 6).

Referências

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Claims

1. Hormônio de estimulação do folículo recombinante (rFSH), caracterizado pelo fato de que inclui α2,3- e a2,6-sialilação, em que 80% ou mais da sialilação total é a2,3-sialilação e em que de 5% a 20% da sialilação total é α2,6-sialilação.

2. Hormônio de estimulação do folículo recombinante (rFSH), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser expresso em uma linhagem de célula humana.

3. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o rFSH como definido na reivindicação 1 ou 2.

4. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que também compreende hCG e/ou LH.

5. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizada pelo fato de ser para uso no tratamento de infertilidade.

6. Método de produção do rFSH como definido na reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de produção ou expressão do rFSH em uma linhagem de célula humana, em que a linhagem de célula foi modificada pelo uso de α2,3-sialiltransferase.

7. Uso do rFSH como definido na reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento para o tratamento de infertilidade.