ES2629392T3

ES2629392T3 - FSH recombinante que incluye la sialilación alfa 2,3 y alfa 2,6

Info

Publication number: ES2629392T3
Application number: ES16158141.8T
Authority: ES
Inventors: Ian Cottingham; Daniel Plaksin; Richard Boyd White
Original assignee: Ferring BV
Current assignee: Ferring BV
Priority date: 2008-04-16
Filing date: 2009-04-16
Publication date: 2017-08-09
Anticipated expiration: 2029-04-16
Also published as: RU2010141908A; PL3045471T3; RU2014141994A; US10995128B2; EP3098234A1; KR20180095140A; MX348622B; BRPI0910461A2; AU2014203277A1; HUS1700036I1; FR17C1020I2; DK3144318T3; KR101622944B1; SI2808340T1; EP3144318B1; AU2009237479B2; RU2014141994A3; FR17C1020I1; HUE033830T2; BRPI0910461A8

Abstract

Un método de producción de rFSH que incluye sialilación en α2,3 y en α2,6, comprendiendo el método una etapa de producción o expresión de rFSH en una línea de células Per.C6; en el que la línea de células Per.C6 se ha modificado por ingeniería para expresar una α2,3-sialiltransferasa.

Description

DESCRIPCIÓN

FSH recombinante que incluye la sialilación α 2,3 y α 2,6.

La presente invención se refiere a gonadotropinas para su uso en el tratamiento de infertilidad. En particular se 5 refiere a la hormona foliculoestimulante (FSH, follicle stimulating hormone).

Las gonadotropinas son un grupo de hormonas glicoproteicas heterodiméricas que regulan la función de las gónadas en machos y hembras. Incluyen la hormona foliculoestimulante (FSH), la hormona luteinizante (LH, luteinising hormone) y la gonadotropina coriónica (CG, chorionic gonadotrophin). 10

La FSH se secreta de forma natural en la glándula pituitaria anterior y funciona para dar soporte al desarrollo folicular y a la ovulación. La FSH comprende una subunidad alfa de 92 aminoácidos, también común para otras hormonas glicoproteicas LH y CG, y una subunidad beta de 111 aminoácidos única para FSH que confiere la especificidad biológica de la hormona (Pierce y Parsons, 1981). Cada subunidad se modifica después de la traducción mediante la 15 adición de restos de carbohidrato complejos. Ambas subunidades portan 2 sitios para unión de glicano unido en N, la subunidad alfa en los aminoácidos 52 y 78 y la subunidad beta en los restos de aminoácidos 7 y 24 (Rathnam y Saxena, 1975, Saxena y Rathnam, 1976). Por lo tanto la FSH está glicosilada hasta aproximadamente un 30 % en masa (Dias y Van Roey. 2001. Fox et al., 2001).

20

Durante muchos años la FSH purificada de orina humana post-menopáusica se ha usado en el tratamiento de la infertilidad; tanto para estimular la ovulación en la reproducción natural como para proporcionar ovocitos para tecnologías de reproducción asistida. Dos versiones recombinantes de FSH, Gonal-F (Serono) y Puregon (Organon) llegaron a estar disponibles a mediados de los años 90. Ambas se expresan en células de ovario de hámster chino (CHO) (Howles, 1996). 25

Existe una heterogeneidad considerable asociada con las preparaciones de FSH que se relaciona con diferencias en las cantidades de diversas isoformas presentes. Las isoformas individuales de FSH presentan secuencias de aminoácidos idénticas pero se diferencian en el grado en el que se modifican después de la traducción; las isoformas en particular se caracterizan por la heterogeneidad de las estructuras de las ramificaciones de 30 carbohidratos y cantidades diferentes de incorporación de ácido siálico (un azúcar terminal), de las cuales parece que ambas influyen en la bioactividad de la isoforma específica.

La glicosilación de la FSH natural es muy compleja. Los glicanos en la FSH de la pituitaria obtenida de forma natural pueden contener una amplia gama de estructuras que pueden incluir combinaciones de glicanos bi-, tri- y tetra-35 antenarios (Pierce y Parsons, 1981. Ryan et al., 1987. Baenziger y Green, 1988). Los glicanos pueden portar modificaciones adicionales: fucosilación del núcleo, glucosamina bisectante, cadenas prolongadas con acetil-lactosamina, sialilación parcial o completa, sialilación con enlaces α2,3 y α2,6 y galactosamina sulfatada sustituida por galactosa (Dalpathado et al., 2006). Además, existen diferencias entre las distribuciones de las estructuras de glicano en los sitios de glicosilación individuales. Se ha encontrado un nivel comparable de complejidad de glicanos 40 en la FSH obtenida a partir del suero de individuos y de la orina de mujeres post-menopáusicas (Wide et al., 2007).

La glicosilación de productos de FSH recombinante refleja la gama de glicosiltransferasas presentes en la línea celular hospedadora. Los productos de rFSH existentes se obtienen a partir de células de ovario de hámster chino (células CHO) modificadas por ingeniería. La gama de modificaciones de glicano en rFSH obtenida a partir de CHO 45 está más limitada que las encontradas en los productos naturales, obtenidos a partir de extractos de pituitaria u orina. Los ejemplos de la reducción de heterogeneidad de glicanos encontrada en rFSH obtenida a partir de CHO incluyen una falta de glucosamina bisectante y una reducción del contenido de fucosilación del núcleo y extensiones de acetil-lactosamina (Hard et al., 1990). Además, las células CHO solo son capaces de añadir ácido siálico usando el enlace α2,3 (Kagawa et al., 1988, Takeuchi et al., 1988, Svensson et al., 1990). Esto es diferente de la FSH 50 producida de forma natural que contiene glicanos con una mezcla de ácido siálico unido en α2,3 y α2,6.

Se ha demostrado que una preparación de FSH recombinante (Organon) se diferencia en las cantidades de FSH con un punto isoeléctrico (pI) por debajo de 4 (consideradas las isoformas ácidas) cuando se comparan con FSH de pituitaria, suero o de orina post-menopáusica (Ulloa-Aguirre et al.,1995). La cantidad isoformas ácidas en las 55 preparaciones urinarias era mucho mayor en comparación con los productos recombinantes, Gonal-f (Serono) y Puregon (Organon) (Andersen et al.,2004). Esto debe reflejar un contenido molar menor de ácido siálico en la rFSH ya que el contenido de glicano con carga negativa modificado con sulfato es bajo en FSH. El menor contenido de ácido siálico, en comparación con la FSH natural, es una característica de ambos productos de FSH disponibles en el mercado y por lo tanto debe reflejar una limitación en el proceso de fabricación (Bassett y Driebergen, 2005). 60

Existe un gran cuerpo de trabajo científico que analiza e intenta explicar las variaciones en la glicosilación de FSH entre individuos y cambios durante el curso de un ciclo de ovulación. Una de las discusiones principales se refiere a la observación de que tanto la concentración de FSH como el contenido de ácido siálico disminuyen durante la fase preovulatoria del ciclo. La disminución del contenido de ácido siálico produce una FSH más básica que tanto se 65 elimina más rápidamente como, al menos in vitro, es más potente en el receptor diana (Zambrano et al.,1996). La

pregunta con respecto a la relevancia biológica de estos cambios y cómo pueden estar implicados en la selección del folículo dominante permanece sin resolver (revisado por Ulloa-Aguirre, 2003).

El tiempo de vida en circulación de la FSH se ha documentado para materiales a partir de una diversidad de fuentes. Algunos de estos materiales se han fraccionado basándose en la carga molecular total, tal como se caracterizan por 5 su pI, en los que más ácido equivale a mayor carga negativa. Como se ha indicado previamente el principal elemento de contribución a la carga molecular global es el contenido total de ácido siálico de cada molécula de FSH. Por ejemplo, rFSH (Organon) tiene un contenido de ácido siálico de aproximadamente 8 mol/mol, mientras que la FSH obtenida a partir de orina tiene un contenido mayor de ácido siálico (de Leeuw et al.,1996). Las tasas de eliminación en plasma correspondientes en rata son 0,34 y 0,14 ml/min (Ulloa-Aguirre et al.,2003). En otro ejemplo 10 en el que una muestra de FSH recombinante se separó en fracciones de alto y bajo pI, la potencia in vivo de la fracción de pI alto (menor contenido de ácido siálico) disminuyó y tenía una semivida en plasma más corta (D'Antonio et al.,1999). También se ha informado que la FSH más básica que circula durante los estadios tardíos del ciclo de ovulación se debe a la disminución de α2,3 sialil-transferasa en la pituitaria anterior que se produce por el aumento de los niveles de estradiol (Damian-Matsumara et al.,1999. Ulloa-Aguirre et al.,2001). No se han informado 15 resultados para la α2,6 sialiltransferasa.

El contenido total de ácido siálico de FSH y rFSH no es directamente comparable ya que los ácidos siálicos comúnmente se unen de dos maneras. La FSH de pituitaria/suero/urinaria contiene ácido siálico unido tanto en α2,3 como en α2,6, con una predominancia del primero. Sin embargo, los recombinantes obtenidos a partir de células 20 CHO solo contienen α2,3 (Kagawa et al., 1988, Takeuchi et al., 1988, Svensson et al., 1990). Esta es otra diferencia entre los productos recombinantes naturales y actuales además del menor contenido total de ácido siálico del último.

Las células CHO se usan comúnmente para la producción de proteínas recombinantes humanas farmacéuticas. Un análisis estructural ha identificado que el ácido siálico está exclusivamente unido por un enlace α2,3. (Kagawa et al., 25 1988, Takeuchi et al., 1988, Svensson et al., 1990). Muchas glicoproteínas humanas contienen una mezcla de enlaces tanto α2,3 como α2,6. Por lo tanto, las proteínas recombinantes expresadas usando el sistema de CHO se diferenciarán de sus homólogos naturales en su tipo de enlaces de ácido siálico terminal. Esta es una consideración importante en la producción de productos biológicos para uso farmacéutico ya que las fracciones de carbohidrato pueden contribuir a los atributos farmacológicos de la molécula. 30

Es deseable tener un producto de rFSH que replique o mimetice más estrechamente el perfil fisicoquímico y farmacocinético del producto producido a partir de orina humana. Es deseable tener un producto de rFSH que tenga una propiedad o propiedades farmacocinética(s) mejorada(s) en comparación con el producto recombinante conocido. 35

Los solicitantes han encontrado que el tipo de enlace de ácido siálico, α2,3 o α2,6, puede tener una influencia drástica en la eliminación biológica de FSH. Las líneas celulares humanas, a diferencia de las líneas de células CHO, pueden expresar FSH recombinante con ácidos siálicos unidos por enlaces tanto α2,3 como α2,6. En el Ejemplo 4 se hizo una línea celular con FSH recombinante que expresaba FSH que contenía glicanos con bajos 40 niveles de ácido siálico unidos tanto en α2,3 como en α2,6 (Figura 6). Este material básico, con un contenido limitado de ácido siálico (Figura 4) se eliminaba de forma muy rápida de la circulación en rata como se podría predecir (Figura 7). A continuación, la línea celular se sometió a una segunda etapa de manipulación genética con la adición del gen que codifica la α2,6-sialil-transferasa (Ejemplo 5). La rFSH resultante estaba altamente sialilada lo que muestra un contenido de ácido siálico y una distribución de pI comparable con la FSH urinaria (Figura 5). Sin 45 embargo, el material se eliminaba muy rápidamente de la circulación de ratas a una tasa comparable a la del material original que tenía bajo contenido de ácido siálico (Figura 8). Esta era una observación inesperada ya que se sabe que una proporción de ácido siálico en la FSH natural y biológicamente activa está unida en α2,6. Se encontró que la eliminación de rFSH sialilada en α2,6 estaba mediada por el receptor de asialoglicoproteína (ASGP) encontrado en el hígado (Ejemplo 9). Esto se demostró por el bloqueo transitorio de los receptores de ASGP usando 50 un exceso de otro sustrato para el receptor. Con el receptor bloqueado por asialofetuína, la eliminación esperada para el material altamente sialilado se restableció (Figura 9). Esto se mantuvo durante varias horas hasta que el bloqueo se superó y la rFSH altamente sialilada unida en α2,6 reanudó su rápida eliminación.

Se preparó FSH recombinante con una mezcla de ácido siálico unido tanto en α2,3 como en α2,6 modificando por 55 ingeniería una línea celular humana para que expresara tanto rFSH como α2,3 sialiltransferasa (Ejemplo 4 y 5). El producto expresado es muy ácido y tiene una mezcla de ácidos siálicos unidos tanto en α2,3 como en α2,6; el último proporcionado por la actividad de sialil transferasa endógena (Figura 6). Esto tiene dos ventajas con respecto a rFSH expresada en células CHO convencionales: en primer lugar el material está más altamente sialilado debido a las actividades combinadas de las dos sialiltransferasas; y en segundo lugar el material se parece más estrechamente a 60 la FSH natural. Es probable que esto sea más apropiado biológicamente hablando en comparación con los productos recombinantes obtenidos a partir de células CHO que producen solo ácido siálico unido en α2,3 (Kagawa et al., 1988, Takeuchi et al., 1988, Svensson et al., 1990) y presentan una disminución del contenido de ácido siálico (Ulloa-Aguirre et al.,1995., Andersen et al.,2004).

65

De acuerdo con la presente invención se proporciona un método de producción de FSH recombinante (en el

presente documento rFSH o recFSH) que incluye sialilación en α2,3 y sialilación en α2,6, método que comprende una etapa de producción o expresión de rFSH en una línea de células Per.C6, en la que la línea de células Per.C6 se ha modificado mediante ingeniería para expresar una α2,3-sialiltransferasa.

La rFSH se produce o expresa en una línea celular Per.C6. Esto puede simplificar (y hacer más eficaz) el método de 5 producción porque la manipulación y control de, por ejemplo, el medio de crecimiento celular para retener la sialilación puede ser menos crítico que con procesos conocidos. El método también puede ser más eficaz porque se produce poca rFSH básica en comparación con la producción de productos de rFSH conocidos; se produce rFSH más ácida y la separación/eliminación de FSH básica es menos problemática. La rFSH se produce o expresa en una línea de células Per.C6 modificada usando α2,3-sialiltransferasa. La línea celular se puede modificar usando α2,6-10 sialiltransferasa. Como alternativa o adicionalmente, la rFSH puede incluir ácidos siálicos unidos en α2,6 (sialilación en α2,6) proporcionados por la actividad de sialil transferasa endógena [de la línea celular].

La rFSH se produce usando α2,3-sialiltransferasa. La rFSH puede incluir ácidos siálicos unidos en α2,6 (sialilación en α2,6) proporcionados por la actividad de sialiltransferasa endógena. 15

Los solicitantes han encontrado de forma sorprendente que la rFSH producida con el método de la invención puede replicar o imitar más estrechamente el perfil fisicoquímico y farmacocinético del producto urinario humano natural que otros productos recombinantes. En otras palabras, la rFSH producida con el método de la invención puede ser más cercana a la FSH "natural". Esto puede tener ventajas significativas respecto a la dosificación, etc. Además, un 20 producto más "natural" o más "humano" puede ser más deseable para el paciente, que puede desear que la terapia, aunque en un sentido artificial, sea tan "natural" como sea posible. Puede haber otras ventajas (por ejemplo, ventajas farmacocinéticas) en un producto recombinante que tenga estructura de carbohidrato (por ejemplo, glicano) que sea más cercana a la FSH natural (por ejemplo, urinaria humana) que otros productos recombinantes.

25

Por tanto el método de la invención proporciona una versión recombinante de FSH que porta una mezcla de ácido siálico en α2,3 y α2,6 y por lo tanto se parece más estrechamente a la FSH natural. Se espera que el uso de este compuesto para la estimulación ovárica controlada, en técnicas de FIV, e inducción de la ovulación de como resultado una estimulación más natural del ovario en comparación con los productos recombinantes existentes.

30

La FSH recombinante expresada en células de ovario de hámster chino (CHO) incluye exclusivamente una sialilación en α2,3 (Kagawa et al., 1988, Takeuchi et al., 1988, Svensson et al.,1990).

La FSH recombinante ("rFSH" o "recFSH") (y/o preparación de FSH recombinante) producida de acuerdo con la invención incluye sialilación en α2,3 y sialilación en α2,6. Opcionalmente, la preparación de rFSH o rFSH puede 35 incluir adicionalmente sialilación en α2,8.

En el presente documento, la expresión "preparación de FSH recombinante" incluye una preparación para, por ejemplo, uso farmacéutico que incluye FSH recombinante. En realizaciones de la invención, la rFSH puede estar presente en una isoforma individual o como una mezcla de isoformas. 40

La rFSH (o preparación de rFSH) puede tener un contenido de ácido siálico [expresado en términos de una proporción de moles de ácido siálico con respecto a moles de proteína] de 6 mol/mol o superior (Ejemplo 8), por ejemplo entre 6 mol/mol y 15 mol/mol, por ejemplo entre 8 mol/mol y 14 mol/mol, por ejemplo entre 10 mol/mol y 14 mol/mol, por ejemplo entre 11 mol/mol y 14 mol/mol, por ejemplo entre 12 mol/mol y 14 mol/mol, por ejemplo entre 45 12 mol/mol y 13 mol/mol.

La rFSH (o preparación de rFSH) puede tener un 10 % o más de la sialilación total que es sialilación en sialilación en α2,3. Por ejemplo, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o un 90 % o más de la sialilación total puede ser sialilación en α2,3. La rFSH (o preparación de rFSH) puede incluir sialilación en α2,3 en una cantidad que es de un 65 a un 85 % de la 50 sialilación total, por ejemplo de un 70 a un 80 % de la sialilación total, por ejemplo de un 71 a un 79 % de la sialilación total. La rFSH (o preparación de rFSH) puede tener un 50 % o menos de la sialilación total que es sialilación en α2,6. Por ejemplo un 40, 30, 20, 10, 5 % o menos de la sialilación total puede ser sialilación en α2,6. La rFSH (o preparación de rFSH) puede incluir sialilación en α2,6 en una cantidad que es de un 15 a un 35 % de la sialilación total, por ejemplo de un 20 a un 30 % de la sialilación total, por ejemplo de un 21 a un 29 % de la 55 sialilación total. La rFSH (o preparación de rFSH) puede tener 5 % o menos de la sialilación total que es sialilación en α2,8. Por ejemplo un 2,5 % o menos de la sialilación total puede ser sialilación en α2,8. La rFSH (o preparación de rFSH) puede incluir sialilación en α2,8 en una cantidad que es de un 0,1 a un 4 % de la sialilación total, por ejemplo de un 0,5 a un 3 % de la sialilación total, por ejemplo de un 0,5 a un 2,5 % de la sialilación total. Por sialilación se hace referencia a la cantidad de restos siálicos presentes en las estructuras de la FSH. La sialilación en 60 α2,3 se refiere a sialilación en la posición 2,3 (como se sabe bien en la técnica) y sialilación en α2,6 en la posición 2,6 (también se sabe bien en la técnica). Por lo tanto, "% de la sialilación total puede ser sialilación en α2,3", se refiere al % del número total de restos de ácido siálico presentes en la FSH que están sialilados en la posición 2,3. El término "% de sialilación total que es sialilación en α2,6" se refiere al % del número total de restos de ácido siálico presentes en la FSH que están sialilados en la posición 2,6. 65

La rFSH (o preparación de rFSH) puede tener un contenido de ácido siálico (cantidad de sialilación por molécula de FSH) de (basándose en la masa de la proteína, en lugar de la masa de proteína más carbohidrato) de un 6 % o superior (por ejemplo, entre un 6 % y un 15 %, por ejemplo entre un 7 % y un 13 %, por ejemplo entre un 8 % y un 12 %, por ejemplo entre un 11 % y un 15 %, por ejemplo entre un 12 % y un 14 %) en masa.

5

La estructura de rFSH contiene fracciones de glicano. Se pueden producir ramificaciones con el resultado de que el glicano puede tener 1, 2, 3, 4 o más restos de azúcares terminales o "antenas", como se sabe bien en la técnica. La rFSH puede tener glicanos con presencia de sialilación en estructuras monoantenarias y/o diantenarias y/o triantenarias y/o tetrantenarias. La rFSH puede incluir preferentemente estructuras de glicano monosialilado, disialilado, trisialilado y tetrasialilado con cantidades relativas como sigue a continuación: monosialilado en un 9-10 15 %, disialilado en un 27 - 30 %, trisialilado en un 30-36 % y tetrasialilado en un 25-29 % (por ejemplo, como se muestra por análisis WAX de glicanos cargados, como se expone en el Ejemplo 8 c).

La rFSH preparada con el método de la invención se puede usar en una composición farmacéutica que comprende rFSH que incluye sialilación en α2,3 y sialilación en α2,6 (por ejemplo, como se ha establecido anteriormente). La 15 composición farmacéutica puede comprender adicionalmente hCG y/o LH.

La hCG se puede obtener por cualquier medio conocido en la técnica. Como se usa en el presente documento, la hCG incluye hCG obtenida a partir de ser humano y recombinante. La hCG obtenida a partir de ser humano se puede purificar a partir de cualquier fuente apropiada (por ejemplo, orina y placenta) mediante cualquier método 20 conocido en la técnica. Los métodos para expresar y purificar hCG recombinante se conocen bien en la técnica.

La LH se puede obtener por cualquier medio conocido en la técnica. Como se usa en el presente documento, la LH incluye LH obtenida a partir de ser humano y recombinante. La LH obtenida a partir de ser humano se puede purificar a partir de cualquier fuente apropiada (por ejemplo, orina) mediante cualquier método conocido en la 25 técnica. Los métodos para expresar y purificar LH recombinante se conocen bien en la técnica.

La composición farmacéutica puede ser para el tratamiento de infertilidad, por ejemplo, para uso en, por ejemplo, tecnologías de reproducción asistida (TRA), inducción de la ovulación o inseminación intrauterina (IIU). La composición farmacéutica se puede usar, por ejemplo, en indicaciones médicas en las que se usan preparaciones 30 de FSH conocidas. La presente invención también proporciona el uso de rFSH y/o una preparación de rFSH descrita en el presente documento (de acuerdo con aspectos de la invención) para, o en la preparación de un medicamento para, el tratamiento de infertilidad. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden formular en composiciones bien conocidas para cualquier vía de administración de fármacos, por ejemplo, oral, rectal, parenteral, transdérmica (por ejemplo, tecnología de parches), intravenosa, intramuscular, subcutánea, 35 intrasusternal, intravaginal, intraperitoneal, local (polvos, pomadas o gotas) o como una pulverización bucal o nasal. Una composición habitual comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como solución acuosa, excipientes no tóxicos, incluyendo sales y conservantes, tampones y similares, como se describe en la decimoquinta edición de Pharmaceutical Sciences de Remington (Matt Publishing Company, 1975), en las páginas 1405 a 1412 y 1461 - 87, y en el formulario nacional XIV decimocuarta edición (American Pharmaceutical Association, 1975), entre 40 otros.

Los ejemplos de excipientes, diluyentes, disolventes o vehículos farmacéuticos acuosos y no acuosos adecuados incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol, y similares), carboximetilcelulosa y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales (tales como aceite de oliva) y ésteres orgánicos inyectables 45 tales como oleato de etilo.

Las composiciones de la presente invención también pueden contener aditivos tales como, pero no limitados a, conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes. También se pueden incluir agentes antibacterianos y antifúngicos para prevenir el crecimiento de microbios e incluyen, por ejemplo, parabeno, 50 clorobutanol, fenol, ácido sórbico, y similares. Además, puede ser deseable incluir agentes isotónicos tales como azúcares, cloruro sódico, y similares.

En algunos casos, para realizar una acción prolongada es deseable ralentizar la absorción de FSH (y otros principios activos, si estuvieran presentes) de la inyección subcutánea o intramuscular. Esto se puede conseguir mediante el 55 uso de una suspensión líquida de material cristalino o amorfo con baja solubilidad en agua. La velocidad de absorción de FSH depende entonces de su tasa de disolución que, a su vez, puede depender del tamaño de los cristales y la forma cristalina. Como alternativa, la absorción retrasada de una forma de combinación de FSH administrada por vía parenteral se consigue disolviendo o suspendiendo la combinación de FSH en un vehículo oleaginoso. 60

Las formas en depósito inyectables se pueden preparar formando matrices microencapsuladas de FSH (y otros agentes, si estuvieran presentes) en polímeros biodegradables tales como polilactida-poliglicólido. Dependiendo de la proporción de FSH con respecto al polímero y de la naturaleza del polímero usado en particular, la tasa de liberación de FSH se puede controlar. Los ejemplos de otros polímeros biodegradables incluyen polivinilpirrolidona, 65 poli(ortoésteres), poli(anhídridos), etc. Las formulaciones inyectables en depósito también se preparan atrapando la

FSH en liposomas o microemulsiones que sean compatibles con tejidos corporales.

Las formulaciones inyectables se pueden esterilizar, por ejemplo, mediante filtración a través de un filtro de retención de bacterias, o mediante la incorporación de agentes de esterilización en forma de composiciones estériles sólidas que se pueden disolver o dispersar en agua estéril u otro medio inyectable estéril justo antes de su uso. Las 5 formulaciones inyectables se pueden suministrar en cualquier envase adecuado, por ejemplo, vial, jeringuilla cargada previamente, cartuchos de inyección, y similares.

Las formulaciones inyectables se pueden suministrar como un producto que tiene composiciones farmacéuticas que contienen FSH (opcionalmente con hCG, LH, etc.). Si hay más de un principio activo (es decir, FSH y por ejemplo 10 hCG o LH) estos pueden ser adecuados para la administración por separado o juntos. Si se administran por separado, la administración puede ser secuencial. El producto se puede suministrar en cualquier envase adecuado. Por ejemplo, un producto puede contener un número de jeringas cargadas previamente que contienen bien FSH, hCG o una combinación tanto de FSH como de hCG, las jeringas embaladas en un envase de tipo blíster u otro medio para mantener la esterilidad. Un producto puede contener opcionalmente instrucciones para usar las 15 formulaciones de FSH y hCG.

El pH y la concentración exacta de los diversos componentes de la composición farmacéutica se ajustan de acuerdo con la práctica de rutina en este campo. Véase, THE PHARMACOLOGICAL BASIS FOR THERAPEUTICES de GOODMAN y GILMAN, 7ª ed. En una realización referente, las composiciones de la invención se suministran como 20 composiciones para administración parenteral. Los métodos generales para la preparación de las formulaciones parenterales se conocen en la técnica y se describen en REMINGTON; THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY, mencionado anteriormente, en las páginas 780-820. Las composiciones parenterales se pueden suministrar en formulación líquida o en forma de un sólido que se mezclará con un medio inyectable estéril justo antes de su administración. En una realización especialmente preferente, las composiciones parenterales se 25 suministran en formas farmacéuticas unitarias para facilitar la administración y la uniformidad de la dosificación.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se describirá ahora con más detalle con referencia a los siguientes Ejemplos y a las figuras 30 adjuntas en las que:

la Figura 1 muestra un mapa plasmídico del vector de expresión pFSHalfa/beta;

la Figura 2 muestra el vector de expresión de α2,3-sialiltransferasa (ST3GAL4);

la Figura 3 muestra el vector de expresión de α2,6-sialiltransferasa (ST6GAL1); 35

la Figura 4 muestra el enfoque isoeléctrico de FSH recombinante producida por células Per.C6 que expresan FSH de forma estable;

la Figura 5 muestra un ejemplo de clones analizados mediante enfoque isoeléctrico de FSH recombinante producida por células Per.C6 que expresan FSH de forma estable después de modificadas mediante ingeniería con α2,3- o α2,6-sialiltransferasa; 40

la Figura 6 muestra el análisis de los enlaces de ácido siálico de ácido siálico de Per.C6 FSH;

la Figura 7 muestra las tasas de eliminación metabólica (MCR) de muestras de Per.C6 FSH;

la Figura 8 muestra las MCR de muestras de Per.C6 FSH modificadas mediante ingeniería con α2,6-sialiltransferasa;

la Figura 9 muestra las MCR de muestras de Per.C6 FSH modificadas mediante ingeniería con α2,6-sialiltransferasa;

la Figura 10 muestra las MCR de muestras de Per.C6 FSH modificadas mediante ingeniería con α2,3-45 sialiltransferasa;

la Figura 11 muestra el aumento de peso ovárico por clones de Per.C6 rFSH de Per.C6 rFSH precursoras, de acuerdo con el método de Steelman y Pohley (1953);

la Figura 12 muestra el aumento de peso ovárico por clones de Per.C6 rFSH de Per.C6 rFSH modificados mediante ingeniería (α2,6-sialiltransferasa); y 50

la Figura 13 muestra el aumento de peso ovárico por clones de Per.C6 rFSH de Per.C6 rFSH modificados mediante ingeniería (α2,3-sialiltransferasa).

Selección de Secuencias

55

FSH Humana

La región codificante del gen para el polipéptido alfa de FSH se usó de acuerdo con Fiddes y Goodman (1981). La secuencia está depositada como AH007338 y en el momento de construcción no había otras variantes de esta secuencia de proteína. En el presente documento la secuencia se denomina SEQ ID 1. 60

La región codificante del gen para el polipéptido beta de FSH se usa de acuerdo con Keene et al (1989). La secuencia está depositada como NM_000510 y en el momento de construcción no había otras variantes de esta secuencia de proteína. En el presente documento la secuencia se denomina SEQ ID 2.

65

Sialiltransferasa

α2,3-Sialiltransferasa - La región codificante del gen para la beta-galactósido alfa-2,3-sialiltransferasa 4 (α2,3-sialiltransferasa, ST3GAL4) se usó de acuerdo con Kitagawa y Paulson (1994). La secuencia está depositada como L23767 y en el presente documento se denomina SEQ ID 3. 5

α2,6-Sialiltransferasa - La región codificante del gen para la beta-galactósido alfa-2,6-sialiltransferasa 1 (α2,6-sialiltransferasa, ST6GAL1) se usó de acuerdo con Grundmann et al., (1990). La secuencia está depositada como NM_003032 y en el presente documento se denomina SEQ ID 4.

10

Ejemplos

Ejemplo 1 Construcción del vector de expresión de FSH

La secuencia codificante del polipéptido alfa de FSH (AH007338, SEQ ID 1) y del polipéptido beta de FSH 15 (NM_003032, SEQ ID 2) se amplificaron por PCR usando las combinaciones de cebadores FSHa-dir y FSHa-inv y FSHb-dir y FSHb-rec respectivamente.

FSHa-dir 5'-CCAGGATCCGCCACCATGGATTACTACAGAAAAATATGC-3'

FSHa-inv 5'-GGATGGCTAGCTTAAGATTTGTGATAATAAC-3' 20

FSHb-dir 5'-CCAGGCGCGCCACCATGAAGACACTCCAGTTTTTC-3'

FSHb-inv 5'-CCGGGTTAACTTATTATTCTTTCATTTCACCAAAGG-3'

El ADN de FSH beta amplificado resultante se digirió con las enzimas de restricción AscI y HpaI y se insertó en los sitios AscI y HpaI en el vector de expresión de mamíferos dirigido por CMV que porta un marcador de selección de 25 neomicina. De forma análoga el ADN de FSH alfa se digirió con BamHI y NheI y se insertó en los sitios BamHI y NheI en el vector de expresión que ya contenía el ADN del polipéptido beta de FSH.

El ADN del vector se usó para transformar la cepa DH5α de E. coli. Se cogieron sesenta colonias para amplificación y cincuenta y siete contenían el vector que contenía FSH tanto alfa como beta. Se seleccionaron veinte de estas 30 colonias para secuenciación y todas contenían las secuencias correctas de acuerdo con SEQ ID 1 y SEQ ID 2. Para transfección se seleccionó el plásmido pFSH A+B N.º 17 (Figura 1).

Ejemplo 2 Construcción del vector de expresión de ST3

35

La secuencia codificante de beta-galactósido alfa-2,3-sialiltransferasa 4 (ST3, L23767, SEQ ID 3) se amplificó por PCR usando la combinación de cebadores 2,3STdir y 2,3STinv.

2,3STdir 5'-CCAGGATCCGCCACCATGTGTCCTGCAGGCTGGAAGC-3'

2,3STinv 5'-TTTTTTTCTTAAGTCAGAAGGACGTGAGGTTCTTG-3' 40

El ADN de ST3 amplificado resultante DNA se digirió con las enzimas de restricción BamHI y AflII y se insertó en los sitios BamHI y AflII en el vector de expresión de mamíferos dirigido por CMV que porta un marcador de resistencia a higromicina. El vector se amplificó como se ha descrito anteriormente y se secuenció. El clon pST3 N.º 1 (Figura 2) contenía la secuencia correcta de acuerdo con SEQ ID 3 y se seleccionó para transfección. 45

Ejemplo 3 Construcción del vector de expresión de ST6

La secuencia codificante de beta-galactosamida alfa-2,6-sialiltransferasa 1 (ST6, NM_003032, SEQ ID 4) se amplificó por PCR usando la combinación de cebadores 2,6STdir y 2,6STinv. 50

2,6STdir 5'-CCAGGATCCGCCACCATGATTCACACCAACCTGAAG-3'

2,6STinv 5'-TTTTTTTCTTAAGTTAGCAGTGAATGGTCCGG-3'

El ADN de ST6 amplificado resultante se digirió con las enzimas de restricción BamHI y AflII y se insertó en los sitios 55 BamHI y AflII en el vector de expresión de mamíferos dirigido por CMV que porta un marcador de resistencia a higromicina. El vector se amplificó como se ha descrito anteriormente y se secuenció. El clon pST6 N.º 11 (Figura 3) contenía la secuencia correcta de acuerdo con SEQ ID 4 y se seleccionó para transfección.

Ejemplo 4 Expresión estable de pFSH A+B en células PER.C6. Transfección, aislamiento e identificación 60 sistemática de clones.

Se generaron clones de Per.C6 que producen FSH mediante la expresión de ambas cadenas polipeptídicas de FSH a partir de un único plásmido (véase el Ejemplo 1).

65

Para obtener clones estables, se usó un agente de transfección basado en liposomas con la construcción pFSH

A+B. Se seleccionaron clones estables en VPRO suplementado con FCS al 10 % y que contenía G418. Tres semanas después de la transfección los clones resistentes a G418 crecieron. Se seleccionaron un total de 250 clones para aislamiento. Los clones aislados se cultivaron en medio de selección hasta una confluencia de un 70-80 %. Los sobrenadantes se sometieron a ensayo para contenido de proteína de FSH usando un ELISA selectivo de FSH y la actividad farmacológica en el receptor de FSH en la línea celular clonada, usando un ensayo de 5 acumulación de AMPc. Los clones (98) que expresaban proteína funcional se desarrollaron para expansión del cultivo en formato de 24 pocillos, 6 pocillos y matraces T80.

Se iniciaron estudios para determinar la productividad y calidad del material de siete clones en matraces T80 para generar material suficiente. Las células se cultivaron en medio suplementado como se ha descrito anteriormente 10 durante 7 días y el sobrenadante se recogió. La productividad se determinó usando el ELISA selectivo para FSH. Se determinó el perfil isoeléctrico del material (Ejemplo 6). En la Figura 4 se muestran muestras representativas. La información del IEF se usó para seleccionar clones para análisis de tasa de eliminación metabólica (Ejemplo 9). Los clones (005, 104, 179, 223, 144) con suficiente productividad y calidad se seleccionaron para modificación mediante ingeniería con sialiltransferasa. 15

Ejemplo 5 El nivel de sialilación aumenta en células que sobreexpresan α2,3- o α2,6-sialiltransferasa. Expresión estable de pST3 o pST6 en células PER.C6 que expresan FSH; Transfección, aislamiento e identificación sistemática de clones

20

Se generaron clones de Per.C6 que producían FSH altamente sialilada mediante expresión de α2,3 sialiltransferasa o α2,6 sialiltransferasa de plásmidos separados (véanse los Ejemplos 2 y 3) en células Per.C6 que ya expresan ambas cadenas polipeptídicas de FSH (véase el Ejemplo 4). Se seleccionaron cuatro clones producidos a partir de células PER.C6® como se muestra en el Ejemplo 4 por sus características incluyendo productividad, buen perfil de crecimiento, producción de proteína funcional y FSH producida que incluía una cierta sialilación. 25

Se generaron clones estables como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 4. Un total de 202 clones del programa de α2,3-sialiltransferasa y 210 clones del programa de α2,6-sialiltransferasa se aislaron, se expandieron y 40 se sometieron a ensayo. El número final de clones para el estudio de α2,3 fue 12 y 30 para el estudio de α2,6.

30

Los clones de α2,3-sialiltransferasa se adaptaron a medio sin suero y condiciones en suspensión.

Como se ha mencionado anteriormente, los clones se sometieron a ensayo usando un ELISA selectivo de FSH, respuesta funcional en un línea celular con receptor de FSH, IEF (Ejemplo 6), tasa de eliminación metabólica (Ejemplo 9) y análisis de Steelman Pohley (Ejemplo 10). Los resultados se compararon con una FSH recombinante 35 disponible en el mercado (Gonal-f, Serono) y las líneas de células Per.C6 con FSH precursoras. En la Figura 5 se muestran muestras representativas. Algunos clones no demostraron un aumento de la sialilación pero se puede observar que la FSH producida por la mayoría de los clones presenta una sialilación significativamente mejorada (es decir, como promedio más isoformas de FSH con índices elevados de ácidos siálicos) en comparación con la FSH expresada sin α2,3-o α2,6-sialiltransferasa. 40

En conclusión, la expresión de FSH junto con sialiltransferasa en células Per.C6 da como resultado un aumento de los niveles de FSH sialilada en comparación con células que expresan solo FSH.

Ejemplo 6 Análisis del pI de isoformas de FSH producidas en Per.C6 mediante enfoque isoeléctrico. 45

La electroforesis se define como el transporte de moléculas cargadas a través de un solvente mediante un campo eléctrico. La movilidad de una molécula biológica a través de un campo eléctrico dependerá de la fuerza del campo, la carga neta en la molécula, el tamaño y la forma de la molécula, la fuerza iónica y las propiedades del medio a través del cual migran las moléculas. 50

El enfoque isoeléctrico (IEF) es una técnica electroforética para la separación de proteínas basada en su pI. El pI es el pH al que la proteína no tiene carga neta y no migrará en un campo eléctrico. El contenido de ácido siálico de las isoformas de FSH altera sutilmente el punto de pI para cada isoforma, lo que se puede aprovechar usando esta técnica para visualizar la isoformas de Per.C6 FSH de cada clon. 55

Los puntos isoeléctricos de las isoformas de FSH producidas en Per.C6 en sobrenadantes de cultivo celular se analizaron usando enfoque isoeléctrico. Se produjo medio de cultivo celular de clones de Per.C6 FSH como se ha descrito en el Ejemplo 4 y 5.

60

Las muestras de Per.C6 FSH se separaron en geles de IEF Novex® que contenían poliacrilamida al 5 % en condiciones nativas en un gradiente de pH 3,0-7,0 en una solución de anfolitos de pH 3,0-7,0.

Las proteínas se transfirieron sobre soporte de nitrocelulosa y se visualizaron usando un anticuerpo monoclonal primario anti-FSHα, anticuerpo secundario anti-IgG de ratón conjugado con fosfatasa alcalina y reactivo de fosfato 65 de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo (BCIP) y nitro azul de tetrazolio (NBT) para visualizar las bandas.

Como se indica en las Figuras 4 y 5, las bandas representan isoformas de FSH que contienen diferentes índices de moléculas de ácido siálico.

Usando este método se identificaron clones que producían isoformas de FSH con un número mayor de moléculas de ácido siálico. La modificación mediante ingeniería con α2,3-o α2,6-sialiltransferasa dio como resultado clones con 5 más ácido siálico y un pI menor.

Ejemplo 7 Análisis de los enlaces de ácido siálico en Per.C6 FSH

Los glicoconjugados se analizaron usando un método de diferenciación de glicano basado en lectina. Con este 10 método se pueden caracterizar glicoproteínas y glicoconjugados unidos a nitrocelulosa. Las lectinas reconocen de forma selectiva un resto en particular, por ejemplo ácido siálico unido en α2,3. Las lectinas aplicadas se conjugan con la digoxigenina de hapteno esteroide que permite la detección inmunológica de las lectinas unidas.

La FSH de Per.C6 purificada a partir de un clon precursor (sin sialiltransferasa adicional), un clon modificado por 15 ingeniería con α2,3-sialiltransferasa y un clon modificado por ingeniería con α2,6-sialiltransferasa se separaron usando técnicas convencionales de SDS-PAGE. Como patrón se usó una FSH recombinante disponible en el mercado (Gonal-f, Serono).

El ácido siálico se analizó usando el kit de Diferenciación de Glicano DIG (N.º de Cat. 11 210 238 001, Roche) de 20 acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las reacciones positivas con aglutinina de Sambucus nigra (SNA) indicaban ácido siálico unido terminalmente en (2-6). Las reacciones positivas con aglutinina II de Maackia amurensis (MAA) indicaban ácido siálico unido terminalmente en (α2-3).

En resumen el clon precursor 005 contenía niveles bajos de ácido siálico tanto en α2,3 como en α2,6. Los clones 25 modificados por ingeniería con α2,3-sialiltransferasa contenían niveles altos de enlaces de ácido siálico α2,3 y niveles bajos de enlaces de ácido siálico α2,6. Los clones modificados por ingeniería con α2,6-sialiltransferasa contenían niveles altos de enlaces de ácido siálico α2,6 y niveles bajos de enlaces de ácido siálico α2,3. El control patrón Gonal-f solo contiene enlaces de ácido siálico α2,3. Esto es coherente con lo que se sabe sobre las proteínas recombinantes producidas en células de ovario de hámster chino (CHO) (Kagawa et al., 1988, Takeuchi et al., 1988, 30 Svensson et al., 1990).

En conclusión, la modificación por ingeniería con células Per.C6 FSH con α2,3- o α2,6-sialiltransferasa aumentada de forma satisfactoria el número de moléculas de ácido siálico conjugadas a la FSH en la muestra.

35

Ejemplo 8a Cuantificación del ácido siálico total

El ácido siálico es un carbohidrato unido a proteína que se considera que es un monosacárido y se produce en combinación con otros monosacáridos como galactosa, manosa, glucosamina, galactosamina y fucosa.

40

El ácido siálico total en la rFSH purificada (Ejemplo 11) se midió usando un kit de cuantificación enzimática de ácido siálico de acuerdo con el protocolo del fabricante (Sigma, Sialic-Q). En resumen, la ácido N-acetilneuramínico aldolasa cataliza ácido siálico para N-acetilmanoasina y ácido pirúvico. El ácido pirúvico se puede reducir a ácido láctico por β-NADH y láctico deshidrogenasa. La oxidación de B-NADH se puede medir de forma precisa por vía espectrofotométrica. 45

La concentración de proteína se midió en placas de microtitulación usando un kit comercial de ensayo del ácido bicinconínico (BCA) (Sigma, B 9643) basado en el método de Lowry (Lowry et al., 1951).

El contenido total de ácido siálico de Per.C6 FSH se midió y se encontró que era superior a 6 mol/mol. 50

Ejemplo 8b Cuantificación de las cantidades relativas de ácido siálico en α2,3, α2,6 y α2,8

El porcentaje de las cantidades relativas de en ácido siálico α2,3, α2,6 y α2,8 en rFSH purificada (Ejemplo 11) se midieron usando técnicas conocidas. 55

Cada muestra de rFSH se inmovilizó (bloque de gel), se lavó, se redujo, se alquiló y se digirió con PNGasa F durante una noche. A continuación, los N-glicanos se extrajeron y se procesaron. Los N-glicanos para análisis de NP-HPLC y WAX-HPLC se etiquetaron con el fluoróforo 2AB como se detalla en Royle et al. Los N-glicanos se desarrollaron en HPLC de fase normal (NP) en una columna de amida de TSK (como se detalla en Royle et al.) con los tiempos de 60 retención expresados en unidades de glucosa (UG).

Las muestras de los glicanos extraídos, combinados (extraídos como se ha mencionado anteriormente) se digirieron con diferentes sialidasas para determinar los enlaces. La NAN 1 (sialidasa recombinante) libera ácidos siálicos terminales no reductores unidos en α2,3 (NeuNAc y NeuNGc), ABS (sialidasa de Arthrobacter ureafaciens) libera 65 ácidos siálicos terminales no reductores unidos en α2,3, α2,6 y α2,8 (NeuNAc y NeuNGc). Las muestras se

analizaron por NP-HPLC, para permitir la comparación de la muestra sin digerir con la digerida con NAN1 y la digerida con ABS. La comparación de las tres trazas de NP-HPLC (sin digerir, digerida con NAN1, digerida con ABS) muestra que la digestión con ABS y NAN1 da resultados diferentes. Esto indica que las muestras tienen ácidos siálicos con enlaces en α2,3, α2,6 y α2,8. Los porcentajes relativos se calcularon a partir de estructuras presentes en el conjunto de glicanos sin digerir y se encontró que estaban en los intervalos de un 65 % - 85 % (por ejemplo, 5 77,75 %) para sialilación en α2,3; de un 15 a un 35 % (por ejemplo, 21,46 %) para sialilación en α2,6; y de un 0,1 a un 3 % para sialilación en α2,8.

Ejemplo 8c Cuantificación de las cantidades relativas de estructuras sialiladas mono, di, tri y tetra antenarias

10

Las cantidades de porcentaje relativo se midieron de estructuras mono, di, tri y tetra sialiladas en glicanos extraídos a partir de rFSH purificada (Ejemplo 11) se midieron usando técnicas conocidas.

Cada muestra de rFSH se inmovilizó (bloque de gel), se lavó, se redujo, se alquiló y se digirió con PNGasa F durante una noche. A continuación, los N-glicanos se extrajeron y procesaron. Los N-glicanos se etiquetaron para análisis de 15 NP-HPLC y WAX-HPLC con el fluoróforo 2AB como se detalla en Royle et al.

La HPLC de intercambio aniónico débil (WAX) para separar los N-glicanos por carga (Ejemplo 8b) se realizó como se establece En Royle et al., con un patrón de Fetuína N-glicano como referencia. Los glicanos se eluyeron de acuerdo con el número de ácidos siálicos que contenían. Todas las muestras incluían estructuras mono (1S), di (2S), 20 tri (3S) y tetra (4S) sialiladas. Se encontró que las cantidades relativas de las estructuras sialiladas estaban en las siguientes proporciones (1S:2S:4S:4S): 9-15 %: 27-30 %: 30-36 %: 25-29 % (por ejemplo 10,24:28,65:35,49:25,62).

Ejemplo 9 Determinación de las tasas de eliminación metabólica de rFSH

25

Para determinar la tasa de eliminación metabólica (MCR) de muestras de Per.C6 FSH, se inyectaron ratas hembras conscientes (3 animales por clon) en la vena de la cola en el tiempo cero con un bolo de rFSH (1 - 10 µg/rata, basándose en la cuantificación de las muestras por ELISA, DRG EIA 1288). Se extrajeron muestras de sangre (400 µl) de la punta de la cola 1, 2, 4, 8, 12, 24 y 32 horas después de la inyección de la muestra de ensayo. El suero se recogió por centrifugación y se sometió a ensayo para el contenido de FSH por ELISA (DRG EIA 1288). 30

El receptor de asialoglicoproteína (ASGP-R) reconoce glicoproteínas desialiladas (terminadas en galactosa) tal como asialofetuína (ASF) (Pricer y Ashwell, 1971, Van Lenten y Ashwell, 1972). El receptor de ASGP y la glicoproteína desialilada unida se internalizan en la célula en la que el receptor se recicla y el ligando se degrada (Regoeczi et al., 1978, Steer y Ashwell, 1980). 35

Para investigar si el material de Per.C6 FSH se eliminaba a través de este mecanismo, el ASGP-R se saturó con asialofetuína. La tasa de eliminación metabólica del material precursor modificado por ingeniería con α2,6 o α2,3-sialiltransferasa se determinó como se ha descrito con la coadministración de un mínimo de exceso molar de 7500 veces de asialofetuína para saturar el ASPG-R durante 1-2 horas. 40

El material producido por los clones precursores de Per.C6 FSH contenía una cierta cantidad de material de MCR de mayor duración pero un alto porcentaje se eliminó rápidamente (Figura 7). El clon director 005 que contenía el material más sialilado se modificó por ingeniería usando α2,6 o α2,3-sialiltransferasa (Ejemplo 5). Aunque los clones modificados por ingeniería con α2,6-sialiltransferasa demostraban un aumento de la sialilación (Figura 5) no había 45 mejora en la MCR (Figura 7). El bloqueo de ASGR restableció la MCR del material α2,6 con respecto a la del patrón lo que demuestra que incluso con un aumento de los enlaces α2,6 el material se elimina rápidamente (Figura 8). La modificación por ingeniería con α2,3-sialiltransferasa dio como resultado clones con MCR comparable a la del patrón (Figura 9) y el contenido siálico variable era coherente con lo que se sabe para las isoformas de FSH (Figura 10).

50

Ejemplo 10 Ensayo in vivo de Steelman-Pohley

Para demostrar que el aumento del contenido de ácido siálico en FSH produce un aumento del efecto biológico, se examinó el aumento en los pesos ováricos en ratas por FSH altamente sialilada tal como la producida en el Ejemplo 5. 55

El aumento en los pesos ováricos debido a los clones de Per.C6 rFSH se analizó de acuerdo con el método de Steelman y Pohley (1953). Se cuantificó la rFSH de Per.C6 de muestras de medio celular filtrado por ELISA (DRG, EIA-1288). Las muestras (rFSH de Per.C6) y los patrones (rFSH de Gonal-f) se sometieron a ensayo a cinco dosis diferentes (3 animales/dosis). El Gonal-f se administró a 50, 100, 200, 400 y 800 ng/rata. Las dosis de las muestras 60 se calcularon usando sus valores de AUC con respecto a Gonal-f, por lo general de 0,05 - 10 µg/rata.

En conclusión, el material subsialilado producido por los clones Per.C6 FSH precursores (Figura 11) no era tan potente en el ensayo de aumento del peso ovárico como la rFSH disponible en el mercado. La modificación por ingeniería con sialiltransferasa para añadir enlaces α2,6 adicionales aumentaba el contenido de ácido siálico pero no 65 mejoraba la potencia en el ensayo in vivo (Figura 12). Sin embargo, los enlaces en α2,3 adicionales mejoraban la

potencia de forma significativa (Figura 13) y las dos preparaciones de FSH recombinante (obtenidas a partir de Per.C6 y CHO) presentan perfiles muy similares en este ensayo.

Ejemplo 11 Visión de conjunto de producción y purificación

5

Se desarrolló un procedimiento para producir FSH en células PER.C6 que se cultivaron en suspensión en medio sin suero. El procedimiento se describe a continuación y se aplicó a varias líneas de células PER.C6 productoras de FSH.

La FSH del clon precursor 005, del clon 007 de α2,3, y del clon 059 de α2,6 se preparó usando una modificación del 10 método descrito por Lowry et al.,(1976).

Para la producción de PER.C6-FSH, las líneas celulares se adaptaron a un medio sin suero, es decir, Excell 525 (JRH, Biosciences). Las células se cultivaron primero para formar una monocapa confluente en un 70 %-90 % en un matraz de cultivo T80. Al pasarlas las células se volvieron a suspender en el medio sin suero, Excell 525 + L-15 glutamina 4 mM, a una densidad celular de 0,3 x 106 células/ml. Una suspensión celular de 25 ml se colocó en un matraz agitador de 250 ml y se agitó a 100 rpm a 37 ºC en CO2 al 5 %. Después de alcanzar una densidad celular > 1 x 106 células/ml, las células se subcultivaron a una densidad celular de 0,2 o 0,3 x 106 células/ml y se cultivaron adicionalmente en matraces agitadores a 37 ºC en CO2 al 5 % y 100 rpm.

20

Para la producción de FSH, las células se transfirieron a un medio de producción sin suero, es decir, VPRO (JRH, Biosciences), que soporta el crecimiento de células PER.C6 a densidades celulares muy altas (habitualmente > 107 células/ml en un cultivo por lotes). Las células primero se cultivaron a > 1 x 106 células/ml en Excell 525, a coordinación se centrifugaron durante 5 minutos a 1000 rpm y posteriormente se volvieron a suspender en medio VPRO + L-glutamina 6 mM a una densidad de 1 x 106 células/ml. A continuación, las células se cultivaron en un 25 matraz agitador durante 7-10 días a 37 ºC en CO2 al 5 % y 100 rpm. Durante este periodo, las células crecieron a una densidad > 107 células/ml. El medio de cultivo se recogió después de que la viabilidad celular empezara a decaer. Las células se centrifugaron durante 5 minutos a 100 rpm y el sobrenadante se usó para la cuantificación y purificación de FSH. La concentración de FSH se determinó usando ELISA (DRG EIA 1288).

30

A partir de ese momento, la purificación de FSH se realizó usando una modificación del método descrito por Lowry et al.,( 1976). Esto se consiguió por cromatografía sobre DEAE celulosa, filtración en gel en Sephadex G100, cromatografía de adsorción sobre hidroxiapatita, y electroforesis en poliacrilamida preparativa.

Durante todos los procedimientos cromatográficos, la presencia de FSH inmunorreactiva se confirmó por RIA (DRG 35 EIA 1288) e IEF (Ejemplo 6).

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SEQ ID 1

Polipéptido alfa de la hormona foliculoestimulante

Número de registro AH007338 5

Secuencia de nucleótidos de alfa FSH

10

Secuencia de proteína de alfa FSH

SEQ ID 2 15

Polipéptido beta de la hormona foliculoestimulante

Número de registro NM_000510

20

Secuencia de nucleótidos de beta FSH

Secuencia de proteína de beta FSH

5

SEQ ID 3

Beta-galactósido alfa -2,3-sialiltransferasa 4

10

Número de registro L23767

Secuencia de nucleótidos de ST3GAL4

15

Secuencia de proteína de ST3GAL4

5

SEQ ID 4

Beta-galactosamida alfa-2,6-sialitransferasa 1

10

Número de registro NM_003032

Secuencia de nucleótidos de ST6GAL1

0p-

Secuencia de proteína de ST6GAL1

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método de producción de rFSH que incluye sialilación en α2,3 y en α2,6, comprendiendo el método una etapa de producción o expresión de rFSH en una línea de células Per.C6; en el que la línea de células Per.C6 se ha modificado por ingeniería para expresar una α2,3-sialiltransferasa. 5
2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 en el que la línea de células Per.C6 tiene actividad de α2,6-sialil transferasa endógena.
3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2 en el que de un 10 % a un 90 % de la sialilación total es 10 sialilación en α2,3.