TW201302783A - 藥學製備物 - Google Patents

Abstract

本發明係有關於包括FSH(例如重組型FSH)的製備物，其中唾液酸化聚醣結構之17%至23%為四唾液酸化聚醣結構。

Description

藥學製備物 發明領域

本發明係有關於用以治療不孕症的促性腺激素(gonadotrophin)。詳細地說，本發明係有關於卵泡刺激激素(FSH)。

發明背景

該等促性腺激素為可調節雄性及雌性體內之性腺機能的雜二聚合性醣蛋白激素群。其等包括卵泡刺激激素(FSH)、黃體化激素(LH)及絨毛膜促性腺激素(CG)。

FSH係藉前垂體腺而自然地分泌且其作用可支撐卵泡形成及排卵。FSH包含一92胺基酸α亞單位，其亦為其它醣蛋白激素LH及CG所共有；及一為FSH所特有的111胺基酸β亞單位，其可以使該激素得到生物特異性(Pierce and Parsons,1981)。藉添加複雜的碳水化合物殘基而進行各亞單位的後轉譯修飾。該兩種亞單位皆具有兩個用於N-鍵聯性聚醣附著的部位，亦即該位於胺基酸52及78的α亞單位、與該位於胺基酸殘基7及24的β亞單位(Rathnam and Saxena,1975、Saxena and Rathnam,1976)。FSH因此經醣化成約30質量%(Dias and Van Roey.2001.Fox等人，2001)。

多年來，自絕經期後的人尿純化之FSH業經用於不孕症的治療；其係兼用於促進自然生殖之排卵及使協助生殖技術得到卵母細胞。在1990年代中期得到FSH之兩重組型 變體，亦即Gonal-F(Serono)及Puregon(Organon)。這些皆表現在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞內(Howles,1996)。

有與FSH製備物有關的重大異質性，其係有關於所存在各種同系型(isoform)之數量的差異。各該FSH同系型顯示相同的胺基酸序列，但是其等經後轉譯修飾的程度不同；特殊同系型的特徵為該等碳水化合物分支結構的異質性及唾液酸(一末端糖)併入的不同數量，其等皆似乎可影響該特定同系型的生物活性。

天然FSH的糖化反應具高複雜性。在天然衍生的垂體FSH可含有廣範圍的結構，其可包括單-、二-、三-及四-觸角狀聚醣的組合(Pierce and Parsons,1981、Ryan等人，1987、Baenziger and Green,1988)。該等聚醣可具有另外的修飾法：核心岩藻醣化、對分葡萄糖胺、經乙醯基乳糖胺延長的鏈、部份或完全唾液酸化反應、使用α 2,3與α 2,6鍵合物之唾液化反應、及取代半乳糖之硫酸化半乳糖胺(Dalpathado等人，2006)。此外，於各該醣化作用部位之聚醣結構的分佈有差異。在自個體之血清及自絕經期後的婦女之尿所衍生的FSH內已發現類似的聚醣複雜性程度(Wide等人，2007)。

重組型FSH產物的醣化反應顯示存在於宿主細胞株內之醣基轉移酶的範圍。市售rFSH產物係衍生自工程中國倉鼠的卵巢細胞(CHO細胞)。經CHO細胞衍生的rFSH內之聚醣修飾法的範圍比在自然產物所發現的範圍受到更多的限制。在經CHO衍生的rFSH內所發現之減少的聚醣異質性之 實例包括對切葡萄糖胺的缺乏以及核心岩藻醣化及乙醯基乳糖胺伸長量的減少(Hard等人，1990)。此外，CHO細胞僅可利用該α 2,3鍵合以添加唾液酸(Kagawa等人，1988、Takeuchi等人，1988、Svensson等人，1990)；經CHO細胞衍生的rFSH僅包括α 2,3-鍵合的唾液酸且不包括α 2,6-鍵合的唾液酸。其不同於含有具有α 2,3-與α 2,6-鍵合的唾液酸之混合物的聚醣之天然產生的FSH(例如人類垂體/血清/尿的FSH)，前者佔優勢。

而且，亦業經證明當與垂體、血清或絕經期後的尿FSH比較時，一重組型FSH製備物(Organon)的FSH數量不同且等電點(pl)在4以下(就該等酸性同系型而言)(Ulloa-Aguirre等人，1995)。與該等重組型產物，Gonal-f(Serono)及Puregon(Organon)比較，該等尿製備物內之酸性同系型的數量高很多(Andersen等人，2004)。其應該表示該重組型FSH內之較低莫耳濃度含量的唾液酸，因為在重組型FSH內之經硫酸鹽修飾之帶負電荷的聚醣含量低。與天然FSH比較，該較低的唾液酸含量為這兩種市售重組型FSH產物之一特徵且可表示該製法內之一限制因素(Bassett and Driebergen,2005)。

已證明得自各種來源之物質之FSH的循環壽命。部份這些物質業經根據總分子內電荷(如藉其等之pl而表示)而分級分離，其中更多的酸表示較高的負電荷。如先前所述，總分子內電荷之主要促成因素為各FSH分子之總唾液酸含量。例如rFSH(Organon)具有約8莫耳/莫耳之唾液酸含量， 然而經尿衍生的FSH具有較高的唾液酸含量(de Leeuw等人，1996)。大鼠體內之相應血漿清除率為0.34及0.14毫升/分鐘(Ulloa-Aguirre等人，2003)。在另一實例中(其中係將一重組型FSH分解成高及低pl溶雜份)，該高pl(較低唾液酸含量)溶離份的活體內效力降低且其具有較短的血漿半衰期(D’Antonio等人，1999)。業經敘述在排卵週期的較後階段期間之更具鹼性的FSH循環作用係起因於在該前垂體內之α 2,3唾液轉移酶的下調，其係藉增加雌二醇的含量而導致(Damian-Matsumara等人，1999。Ulloa-Aguirre等人，2001)。該α 2,6唾液轉移酶的結果尚未經報告。

因此，如上述，使用該CHO系統所表現之重組型蛋白質的末端唾液酸鍵合之類型可不同於其等的天然對應物。在用於藥學用途之生物製劑的製造時，其係為一重要考慮因素，因為該等碳水化合物分子團可促成該分子的藥理學特性。因此，較佳具有可更緊密地複製或摹擬自人尿所製成的產物之物理化學及藥物動力學輪廓的rFSH產物。亦較佳具有一改良的rFSH產物。

本發明申請者已研發一經人衍生的重組型FSH，其係為以WO2009/127826A公開的國際專利申請案第PCT/GB2009/000978號之主題。兼具有α 2,3及α2,6-鍵連的唾液酸之混合物的重組型FSH係藉設計一可兼表現rFSH及α 2,3唾液轉移酶的細胞株而製成。該經表現產物具高酸性且具有一兼含α 2,3-及α 2,6-鍵連唾液酸的混合物；後者係藉內源性唾液轉移酶活性而提供。已發現該唾液酸鍵合 (α 2,3-或α 2,6-)的類型對FSH之生物清除率可具有一引人注目的影響。與在習知CHO細胞內表現的rFSH比較，具有一兼含α 2,3-及α 2,6-鍵連性唾液酸的混合物之重組型FSH具有兩項優點：第一項，由於這兩種唾液轉移酶的合併活性，所以該物質更具高唾液酸性；及第二項，該物質更緊密地類似天然FSH。與僅能產生α 2,3鍵連的唾液酸(Kagawa等人，1988、Takeuchi等人，1988、Svensson等人，1990)且具有減少的唾液酸含量(Ulloa-Aguirre等人，1995、Andersen等人，2004)之經CHO衍生的重組型產物比較，其可能更具生物合適性。

在國際專利申請案第PCT/GB2009/000978號內所揭示的rFSH產物含有分支鏈聚醣分子團。FSH包含聚醣(其係與該等FSH醣蛋白連接)且這些聚醣可含有多種結構。如本項技藝中所熟知，由於該聚醣可具有1,2,3,4或更多個末端糖殘基或“觸角(antennae)”，所以可出現聚醣的分支性；具有1,2,3或4末端糖殘基或“觸角”的聚醣分別被稱為單觸角狀、二觸角狀、三觸角狀或四觸角狀結構。聚醣之單觸角狀及/或二觸角狀及/或三觸角狀及/或四觸角狀結構上可出現唾液酸化反應。在國際專利申請案第PCT/GB2009/000978號內所揭示的一實例rFSH包括具有以下相對數量之單唾液酸化、二唾液酸化、三唾液酸化及四唾液酸化聚醣結構：9-15%單唾液酸化；27-30%二唾液酸化；30-36%三唾液酸化及25-29%四唾液酸化。如已為吾人所熟知，單唾液酸化聚醣結構具有一個唾液酸殘基；二唾液酸化聚醣結構具有 兩個唾液酸殘基；三唾液酸化聚醣結構具有3個唾液酸殘基；而四唾液酸化聚醣結構具有4個唾液酸殘基。文中，諸如“X%單唾液酸化”、“X%二唾液酸化”、“X%三唾液酸化”或“X%四唾液酸化”術語係指在分別經單-、二、三或四唾液酸化的FSH上之聚醣結構數，其係以在經任何方式而唾液酸化(具有唾液酸)的FSH上之聚醣結構的總數的百分率(X%)。因此，在該具有唾液酸殘基(亦即經唾液酸化)之FSH上之聚醣結構的總數之該措辭“20-36%三唾液酸化聚醣結構”意指這些聚醣結構的20至36%經三唾液酸化(具有3個唾液酸殘基)。

該等申請者非可預期地發現具有一特定數量之四唾液酸化聚醣結構的FSH(其不同於上述PCT/GB2009/000978內所揭示的實例rFSH產物之結構)明顯比目前在市面上的重組型FSH產物更有效力。

發明概要

根據本發明，係提供包括單-、二-、三-及四-唾液酸化聚醣結構之卵泡刺激激素，其中15-24%，例如17-23%該等唾液酸化聚醣結構為四唾液酸化聚醣結構(例如如藉以下實例中所揭示的帶電聚醣之WAX分析所示)。該FSH較佳包括α 2,3-及α 2,6-唾液酸化反應。根據本發明之該FSH(rFSH)之總唾液酸化反應之1%至99%為α 2,3-唾液酸化反應。根據本發明該FSH(rFSH)之總唾液酸化反應之1%至99%為α 2,6-唾液酸化反應。該總唾液酸化反應之50至70%，例如60至 69%，例如約65%較佳為α 2,3-唾液酸化反應。該總唾液酸化反應之25至50%，例如30至50%，例如31至38%，例如約35%較佳為α 2,6-唾液酸化反應。

該FSH包含聚醣(其係與該等醣蛋白連接)。熟知FSH中之聚醣可含有多種結構。這些可包括單、二、三、及四-觸角狀聚醣的組合。文中，諸如“該等唾液酸化聚醣結構之X%為四唾液酸化聚醣結構“術語係指在經四唾液酸化(亦即具有4個唾液酸殘基)之該FSH上的聚醣結構數，其係以在經任何方式而唾液酸化(具有唾液酸)之該FSH上之聚醣結構總數的百分率(X%)表示。因此，在具有唾液酸殘基(亦即經唾液酸化)之FSH上之聚醣結構總數的“15-24%該等唾液酸化聚醣結構為四唾液酸化聚醣結構”意指15至24%之這些聚醣結構經四唾液酸化(具有4個唾液酸殘基)。

根據本發明，亦提供一卵泡刺激激素製備物，例如一重組型卵泡刺激激素製備物，其含包括單-、二-、三-及四-唾液酸化聚醣結構之卵泡刺激激素(FSH)，其中15-24%，例如17-23%該等唾液酸化聚醣結構為四唾液酸化聚醣結構。該FSH較佳包括α 2,3-及α 2,6-唾液酸化反應。根據本發明之該FSH(rFSH)之總唾液酸化反應的1%至99%為α 2,3-唾液酸化反應。根據本發明之該FSH(rFSH)之總唾液酸化反應的1%至99%為α 2,6-唾液酸化反應。該總唾液酸化反應之50至70%，例如60至69%，例如約65%較佳為α 2,3-唾液酸化反應。該總唾液酸化反應之25至50%，例如30至50%，例如31至38%，例如約35%較佳為α 2,6-唾液酸化反應。文中， 該名詞“重組型FSH製備物”包括一用於，例如藥學用途之包括重組型FSH的製備物。在本發明之實施例中，該rFSH可以呈單一同系類型或呈同系類型之混合物存在。該等申請者發現與Gonal-F(其係為市售經CHO細胞衍生的產物)比較，本發明該(例如重組型)FSH及(例如重組型)FSH製備物提供一更高的活體內每一劑量的反應。

該FSH較佳為重組型FSH(“rFSH”或“recFSH”)。該FSH較佳為經人細胞株衍生的重組型FSH。

該rFSH可較佳包括27-33%，例如30-32%三唾液酸化聚醣結構。該rFSH可較佳包括24-33%，例如26-30%二唾液酸化聚醣結構。該rFSH可較佳包括12-21%，例如15-17%單唾液酸化聚醣結構。該rFSH較佳包括單唾液酸化、二唾液酸化、三唾液酸化及四唾液酸化聚醣結構，其等之相對數量如下：15至17%單唾液酸化；26-30%二唾液酸化；27-33%(例如29至32%，例如30-32%，例如30至31%)三唾液酸化及17-23%四唾液酸化(例如藉如以下實例中所揭示的帶電聚醣之WAX分析所示)。該rFSH可包括自0至7%，例如3至6%，例如5至6%天然唾液酸化結構。

該FSH包含聚醣(其係與該等FSH醣蛋白連接)。文中，諸如“X%單唾液酸化”、“X%二唾液酸化”、X%三唾液酸化”、或“X%四唾液酸化”係指分別經單-、二-三或四唾液酸化之FSH上的聚醣結構數，其係以在該經任何方式而唾液酸化(具有唾液酸)之FSH上之聚醣結構總數的百分率(X%)。因此，在具有唾液酸殘基(亦即經唾液酸化)之FSH 上之聚醣結構總數的該說法“27-33%三唾液酸化聚醣結構”意指27至33%之這些聚醣結構經三唾液酸化(具有3個唾液酸殘基)。

該根據本發明之rFSH(或rFSH製備物)可具有以下之唾液酸含量[其係以唾液酸之莫耳數對蛋白質之莫耳數的比率表示]：6莫耳/莫耳或更大，例如介於6莫耳/莫耳與15莫耳/莫耳之間，例如介於8莫耳/莫耳與14莫耳/莫耳之間，例如介於10莫耳/莫耳與14莫耳/莫耳之間，例如介於11莫耳/莫耳與14莫耳/莫耳之間，例如介於12莫耳/莫耳之間與14莫耳/莫耳之間，例如介於12莫耳/莫耳與13莫耳/莫耳之間。可在人細胞株內製造或表現本發明該rFSH。

根據本發明該rFSH(或rFSH製備物)的總唾液酸化反應之10%或更高係為α 2,3-唾液酸化反應。例如該總唾液酸化反應之20、30、40、50、60、70、80或90%或更高可以是α 2,3-唾液酸化反應。該rFSH(或rFSH製備物)可較佳包括以下數量之α 2,3-唾液酸化反應：該總唾液酸化反應之自50至70%，例如該總唾液酸化反應之自60至69%，例如該總唾液酸化反應之自63至67%，例如約65%。本發明該rFSH(或rFSH製備物)之總唾液酸化反應的5%或更高，例如5%至99%可以是α 2,6-唾液酸化反應。本發明該rFSH(或rFSH製備物)之總唾液酸化反應之55%或更少可以是α 2,6-唾液酸化反應。該rFSH(或rFSH製備物)可較佳包括以下數量之α 2,6-唾液酸化反應：該總唾液酸化反應之自25至50%，例如該總唾液酸化反應之自30至50%，例如該總唾酸化反應 之自31至38%，例如約35%。唾液酸化反應意指存在於該等FSH碳水化合物結構上之唾液酸殘基數。α 2,3-唾液酸化反應意指發生於2,3位置之唾液酸化反應(如本項技藝內所熟知)，而α 2,6-唾液酸化反應係發生於2,6位置(亦為本項技藝內所熟知)。因此，“該總唾液酸化反應之%可以是α 2,3-唾液酸化反應“係指存在於在2,3位置經唾液酸化之該FSH內之唾液酸殘基總數的%。該名詞“該總唾液酸化反應之%是α 2,6-唾液酸化反應”係指存在於在2,6-位置經唾液酸化之該FSH內之唾液酸殘基總數的%。

根據本發明該rFSH(或rFSH製備物)可具有以蛋白質之質量計(而非以蛋白質加上碳水化合物的質量計)，6質量%或更高(例如介於6質量%與15質量%之間，例如介於7質量%與13質量%之間，例如介於8質量%與12質量%之間，例如介於11質量%與15質量%之間，例如介於12質量%與14質量%之間)之唾液酸含量(每一FSH分子之唾液酸化反應數)。

根據本發明該rFSH(或rFSH製備物)可以是FSH或FSH製備物，其中該等聚醣之16%或較少(例如0.1至16%)包含(例如具有)對切N-乙醯基葡萄醣胺(對切GlcNAc或bisGlcNAc)。根據本發明該rFSH(或rFSH製備物)為其中該等聚醣之8至14.5%包含(例如具有)一對切N-乙醯基葡萄糖胺(對切GlcNAc或bisGlcNAc)的FSH或FSH製備物。

可知FSH包含已連接至該等FSH醣蛋白之聚醣。亦可知該等聚醣之100%係指或意指所有該等聚醣已連接至該等FSH醣蛋白。因此，文中，該術語“該等聚醣之8至14.5%包 含(具有)對切N-乙醯基葡萄糖胺”意指已連接至該等FSH醣蛋白之聚醣總數的8至14.5%包括/具有對切N-乙醯基葡萄糖胺；“該等聚醣之16%或較少包含(具有)對切N-乙醯基葡萄糖胺”意指已連接至該等FSH醣蛋白之聚醣總數的16%或較少包括/具有對切N-乙醯基葡萄糖胺、及諸如此類。

該等申請者已發現其中包含在FSH醣蛋白內之該等聚醣的16%或較少(例如8至14.5%)具有對切GlcNac的重組型FSH(rFSH製備物；rFSH組成物)可具有有利的藥物動力學性質。咸信由於具有對切GlcNac之聚醣數量與經人尿衍生的產物Bravelle內之彼等數量類似(但其最好小於，諸如在WO2012/017058內所揭示的其它重組型FSH製備物之彼等數量)，所以可得到該等有利性質。

根據本發明該rFSH(或rFSH製備物)可以是FSH或FSH製備物，其中該等聚醣之20%或更多包含(例如具有N-乙醯基半乳糖胺(GalNAc)，例如其中該等聚醣之20%或更多包含(例如具有)一末端性GalNAc。根據本發明該rFSH(或rFSH製備物)較佳為其中該等聚醣之40至55%，例如42%至52%包含(例如具有)GalNAc的FSH或FSH製備物。根據本發明該rFSH(或rFSH製備物)較佳為其中該等聚醣之40至55%，例如42%至52%包含(例如具有)末端性GalNAc的FSH或FSH製備物。

可知FSH包含已連接至該等FSH醣蛋白的聚醣。亦可知100%之該等聚醣係指或意指所有聚醣已連接至該等FSH醣蛋白。因此，文中，該術語“該等聚醣之20%或更多包含(例 如具有)GalNAc”意指已連接至該等FSH醣蛋白之聚醣總數的20%或更多包括/具有N-乙醯基半乳糖胺(GalNAc)；“該等聚醣之”40至55%，例如42%至52%包含(例如具有)末端性GalNAc”意指已連接至該等FSH醣蛋白之聚醣總數的40至55%，例如42%至52%包括/具有末端性GalNAc、及諸如此類。

與可獲得之僅具有該α 2,3-鍵合之經CHO細胞衍生的產物比較，該α 2,6-鍵合之可利用性似乎可增加四唾液化結構數。該等申請者亦已發現由於該糖組成物，所以其等之rFSH不同於其它已核准的產物。該糖組成物包括或可包括一特定量之GalNAc。其可以與四唾液酸化反應及效力有關，因為該2,6-唾液酸化反應係與GalNAc有關。換言之，本發明之申請者已研發一包括可提供似乎能在活體內獲得改良效力的具高度唾液酸化反應之rFSH的特定特性(2,6-交聯劑部位，GalNAc)之rFSH產物。

該rFSH(或rFSH製備物)可具有16至24%之該等含(例如末端性)路易士1岩藻糖(fucose-lewis)的聚醣，例如16.5至18%之該等含(例如末端性)路易士1岩藻糖。該rFSH(或rFSH製備物)可具有1.5至4.5%，例如2至4%，例如3.7%之該等含(例如末端性)路易士2岩藻糖的聚醣。該路易士岩藻糖的含量對效力可具有影響。

可在人細胞株(例如Per.C6細胞株、HEK293細胞株、HT1080細胞株等)內製造或表現本發明該rFSH。其可簡化(且得以更有效率)該製法，因為與已知方法比較，例如可保 持唾液酸化反應之該細胞成長介質的操作及控制法可較不具關鍵性。該方法亦可更有效率，因為與已知rFSH產物的製法比較，幾乎未產生鹼性rFSH；更具酸性之rFSH的製成、及鹼性FSH之分離/移除較不成問題。可在PER.C6®細胞株、PER.C6®衍生的細胞株或經改造的PER.C6®細胞株內產生或表現該rFSH。在一人細胞株(例如PER.C6®細胞株、HEK293細胞株、HT1080細胞株等)內產生或表現的rFSH可包括藉該細胞株之內源性唾液轉移酶活性而提供的某些α 2,6-鍵連性唾液酸(α 2,6-唾液酸化反應)、且可包括藉唾液轉移酶活性而提供的某些α 2,3-鍵連性唾液酸(α 2,3唾液酸化反應)。可使用α 2,3-唾液轉移酶修飾該細胞株。可使用α 2,6-唾液轉移酶修飾該細胞株。或者或另外，該rFSH可包括藉該細胞株之內源性唾液轉移酶而提供的α 2,6-鍵連性唾液酸(α 2,6-唾液酸化反應)。

可使用α 2,3及/或α 2,6-唾液轉移酶製造該rFSH。在一實例中，係使用α 2,6-唾液轉移酶製造rFSH。該rFSH可包括藉內源性唾液轉移酶活性而提供的α 2,6-鍵連性唾液酸(α 2,6-唾液酸化反應)。根據本發明，在另一方面中，係提供製造如文中所述之rFSH及/或rFSH製備物(根據本發明各該方面)的方法，其包括在一人細胞株(例如PER.C6®細胞株、PER.C6®衍生的細胞株或經修飾的PER.C6®細胞株，例如業經使用α 2,3-唾液轉移酶修飾的細胞株)內產生或表現該rFSH之步驟。

根據本發明，在另一方面中，係提供在一人細胞株內 所製成(例如所表現)的rFSH，該rFSH包括單-、二-、三-及四-唾液酸化聚醣結構，其中該等唾液酸化聚醣結構之15-24%，例如17-23%為四唾液酸化聚醣結構(例如如在以下實例中藉帶電聚醣之WAX分析所表示)。該FSH較佳包括α 2,3-及α 2,6-唾液酸化反應。根據本發明該FSH(rFSH)之總唾液酸化反應的1%至99%可以是α 2,3-唾液酸化反應。根據本發明該FSH(rFSH)之總唾液酸化反應的1%至99%可以是α 2,6-唾液酸化反應。該總唾液酸化反應之50至70%，例如60至69%，例如約65%較佳為α 2,3-唾液酸化反應。該總唾液酸化反應之25至50%，例如30至50%，例如31至38%，例如約35%較佳為α 2,6-唾液酸化反應。

可在PER.C6®細胞株、PER.C6®衍生的細胞株或經改造的PER.C6®細胞株內產生或表現該rFSH。可使用α 2,3-唾液轉移酶修飾該細胞株。可使用α 2,6-唾液轉移酶修飾該細胞株。或者或另外，該rFSH可包括藉該細胞株之內源性唾液轉移酶活性而提供的α 2,6-鍵連唾液酸(α 2,6-唾液酸化反應)。該rFSH(或rFSH製備物)之總唾液酸化反應的40%或更多可以是α 2,3-唾液酸化反應，該總唾液酸化反應之，例如50-70%，例如60至69%，例如約65%可以是α 2,3-唾液酸化反應。本發明該rFSH之總唾液酸化反應的5%或更多，例如5%至99%可以是α 2,6-唾液酸化反應。本發明該rFSH(或rFSH製備物)之總唾液酸化反應的50%或較少可以是α 2,6-唾液酸化反應，該總唾液酸化反應之，例如30至50%，例如31至38%，例如約35%可以是α 2,6-唾液酸化反應。該 rFSH可具有6莫耳/莫耳或更高，例如介於6莫耳/莫耳與15莫耳/莫耳之間的唾液酸含量[以唾液酸之莫耳數對蛋白質之莫耳數的比率表示]。

該rFSH(在該人細胞株內產生)可以是一含聚醣的FSH，其中該等聚醣之16%或較少(例如0.1至16%)包含(或具有)對切乙醯基葡萄糖胺(對切GlcNAc或bisGlcNAc)。該rFSH較佳為一其中該等聚醣之8至14.5%包含(例如具有)一對切N-乙醯基葡萄糖胺(對切GlcNAc或bisGlcNAc)的FSH。

可知FSH包含已連接至該等FSH醣蛋白的聚醣。亦可知100%之該等聚醣係指或意指所有聚醣已連接至該等FSH醣蛋白。因此，文中，該術語“該等聚醣之8至14.5%包含(具有)對切N-乙醯基葡萄糖胺”意指已連接至該等FSH醣蛋白之聚醣總數的8至14.5%包括/具有對切N-乙醯基葡萄糖胺；“該等聚醣之16%或較少包含(具有)對切N-乙醯基葡萄糖胺”意指已連接至該等FSH醣蛋白之聚醣總數的16%或較少包括/具有對切N-乙醯基葡萄糖胺、及諸如此類。

該等申請者已發現其中包含在FSH醣蛋白內之該等聚醣的16%或較少(例如8至14.5%)具有對切GlcNAc之重組型FSH(rFSH製備物；rFSH組成物)可具有有利的藥物動力學性質。

該rFSH(在該人細胞株內所製成)可具有一其中該等聚醣之20%或更多包含(例如具有)N-乙醯基半乳糖胺(GalNAc)的FSH，例如其中該等聚醣之20%或更高包含(例如具有)一末端性GalNAc。該rFSH較佳為一其中該等聚醣之40至 55%，例如42%至52%包含(例如具有)GalNAc的FSH。該rFSH較佳為一其中該等聚醣之40至55%，例如42%至52%包含(例如具有)末端性GalNAc的FSH。

可知FSH包含已連接至該等FSH醣蛋白的聚醣。亦可知100%之該等聚醣係指或意指所有聚醣已連接至該等FSH醣蛋白。因此，文中，該術語“該等聚醣之20%或更多包含(例如具有)GalNAc”意指已連接至該等FSH醣蛋白之聚醣總數的20%或更多包括/具有N-乙醯基半乳糖胺(GalNAc)；“該等聚醣之40至55%，例如42%至52%包含(例如具有)末端性GalNAc”意指已連接至該等FSH醣蛋白之聚醣總數的40至55%，例如42%至52%包括/具有末端性GalNAc、及諸如此類。

與可獲得之僅具有該α 2,3-鍵合之經CHO細胞衍生的產物比較，該α 2,6-鍵合之可利用性似乎可增加四唾液化結構數。該等申請者亦已發現由於該糖組成物，所以其等之rFSH不同於其它已核准的產物。該糖組成物包括或可包括一特定量之GalNAc。其可以與四唾液酸化反應及效力有關，因為該2,6-唾液酸化反應係與GalNAc有關。換言之，本發明之申請者已研發一包括可提供似乎能在活體內獲得改良效力的具高度唾液酸化反應之rFSH的特定特性(2,6-交聯劑部位，GalNAc)之rFSH產物。

該rFSH(在一人細胞株內所製成)可具有16至24%之該等含(例如末端性)路易士1岩藻糖的聚醣，例如16.5至18%該等含(例如末端性)路易士1岩藻糖的聚醣。該rFSH(在一人細胞株內所製成)可具有1.5至4.5%，例如2至4%，例如3.7% 之該等含(例如末端性)路易士2岩藻糖的聚醣。

根據本發明，在又另一方面中，係提供一(重組型)卵泡刺激激素(FSH)，其中該等聚醣之16%或較少(例如0.1至16%)包含(例如具有)對切N-乙醯基葡萄糖胺(對切GlcNAc或bisGlcNAc)。該等聚醣之8至14.5%較佳包含(例如具有)一對切N-乙醯基葡萄糖胺(對切GlcNAc或bisGlcNAc)。根據本發明，在另一方面中，係提供一含一(重組型)卵泡刺激激素(FSH)的藥學組成物或製備物，其中該等聚醣之16%或較少(例如0.1至16%)包含(例如具有)對切N-乙醯基葡萄糖胺(對切GlcNAc或bisGlcNAc)。該等聚醣8至14.5%較佳包含(例如具有)一對切N-乙醯基葡萄糖胺(對切GlcNAc或bisGlcNAc)。

可知FSH包含已連接至該等FSH醣蛋白之聚醣。亦可知該等聚醣之100%係指或意指所有該等聚醣已連接至該等FSH醣蛋白。因此，文中，該術語“該等聚醣之8至14.5%包含(具有)對切N-乙醯基葡萄糖胺”意指已連接至該等FSH醣蛋白之聚醣總數的8至14.5%包括/具有對切N-乙醯基葡萄糖胺；“該等聚醣之16%或較少包含(具有)對切N-乙醯基葡萄糖胺”意指已連接至該等FSH醣蛋白之聚醣總數的16%或較少包括/具有對切N-乙醯基葡萄糖胺、及諸如此類。

該等申請者已發現其中包含在FSH醣蛋白內之該等聚醣的16%或較少(例如8至14.5%)具有對切GlcNac的重組型FSH(rFSH製備物；rFSH組成物)可具有有利的藥物動力學性質。咸信由於具有對切GlcNac之聚醣數量與經人尿衍生 的產物Bravelle內之彼等數量類似(但其最好小於，諸如在WO2012/017058內所揭示的其它重組型FSH製備物之彼等數量)，所以可得到該等有利性質。

該FSH較佳為重組型FSH。較佳在一人細胞株(例如PER.C6®細胞株、PER.C6®衍生的細胞株或經改造的PER.C6®細胞株)內產生或表現該重組型FSH。

該卵泡刺激激素(FSH)可包括α 2,3-唾液酸化反應及α 2,6-唾液酸化反應。該FSH(rFSH)之總唾液酸化反應的1%至99%可以是α 2,3-唾液酸化反應。該FSH(rFSH)之總唾液酸化反應的1%至99%可以是α 2,6-唾液酸化反應。該總唾液酸化反應之25至50%，例如30至50%較佳為α 2,6-唾液酸化反應。該總唾液酸化反應之50至70%較佳為α 2,3-唾液酸化反應。

該卵泡刺激激素(FSH)可包括單-、二-、三-及四-唾液酸化聚醣結構，其中該等唾液酸化聚醣結構之15-24%，例如17-23%為四唾液酸化聚醣結構。該等唾液酸化聚醣結構之27至33%較佳為三唾液酸化聚醣結構。該等唾液酸化聚醣結構之24至33%較佳為二唾液酸化聚醣結構。該等唾液酸化聚醣結構之12至21%較佳為單唾液酸化聚醣結構。該FSH較佳包括自0.1至7%中性聚醣結構。

該FSH較佳具有6莫耳/莫耳或更高，例如介於6莫耳/莫耳與15莫耳/莫耳之間的唾液酸含量[其係以唾液酸之莫耳數對蛋白質之莫耳數的比率表示]。

該rFSH可以是一FSH，其中該等聚醣之20%或更多包 含(例如具有)N-乙醯基半乳糖胺(GalNAc)，例如其中該等聚醣之20%或更多包含(或具有)一末端性GalNAc。該rFSH較佳為一其中該等聚醣之40至55%，例如42%至52%包含(例如具有)GalNAc的FSH。該rFSH較佳為一其中該等聚醣之40至55%，例如42%至52%包含(例如具有)末端性GalNAc的FSH。

該rFSH可具有16至24%之該等含(例如末端性)路易士1岩藻糖之聚醣，例如16.5至18%之該等含(例如末端性)路易士1岩藻糖之聚醣。該rFSH可具有1.5至4.5%，例如2至4%，例如3.7%之該等含(例如末端性)路易士2岩藻糖之聚醣。

根據本發明，在又另一方面中係提供一卵泡刺激激素(FSH)，其中該等聚醣之20%或更多包含(例如具有)GalNAc。該等聚醣之20%或更多較佳包含(例如具有)一末端性GalNAc。該等聚醣之40至55%，例如42%至52%較佳包含(例如具有)GalNAc。該等聚醣之40至55%，例如42%至52%較佳包含(例如具有)末端性GalNAc。根據本發明，在另一方面中係提供一含一卵泡刺激激素(FSH)之藥學組成物或製備物，其中該等聚醣之20%或更多包含(例如具有)GalNAc。該等聚醣之20%或更多較佳包含(例如具有)一末端性GalNAc。該等聚醣之40至55%，例如42%至52%較佳包含(例如具有)GalNAc。該等聚醣之40至55%，例如42%至52%較佳包含(例如具有)末端性GalNAc。

可知FSH包含已連接至該等FSH醣蛋白的聚醣。亦可知100%之該等聚醣係指或意指所有聚醣已連接至該等FSH醣 蛋白。因此，文中，該術語“該等聚醣之20%或更多包含(例如具有)GalNAc”意指已連接至該等FSH醣蛋白之聚醣總數的20%或更多包括/具有GalNAc；“該等聚醣之40至55%，例如42%至52%包含(例如具有)末端性GalNAc”意指已連接至該等醣蛋白之聚醣總數的40至55%，例如42%至52%包括/具有末端性GalNAc、及諸如此類。

該FSH較佳為重組型FSH。較佳在一人細胞株(例如PER.C6®細胞株、PER.C6®衍生的細胞株或經改造的PER.C6®細胞株)內產生或表現該重組型FSH。

該卵泡制激激素(FSH)可包括α 2,3-唾液酸化反應及α 2,6-唾液酸化反應。該FSH(rFSH)之總唾液酸化反應的1%至99%可以是α 2,3-唾液酸化反應。該FSH(rFSH)之總唾液酸化反應的1%99%可以是α 2,6-唾液酸化反應。該總唾液酸化反應之25至50%，例如30至50%較佳為α 2,6-唾液酸化反應。該總唾液酸化反應之50至70%較佳為α 2,3-唾液酸化反應。

如上述，與僅具有該α 2,3-鍵合之可獲得的CHO細胞衍生之產物比較，該α 2,6-鍵合之可利用性似乎可增加該等四唾液酸化結構數。Ferring亦已發現由於該糖組成，所以其等之rFSH不同於其它許可的產物，該糖組成包括或可包括一特定量之GalNAc。其可以與四唾液酸化反應及效力有關，因為該2,6-唾液酸化反應係與GalNAc有關。換言之，本發明之申請者已研發一包括可提供似乎能在活體內獲得改良效力的具高度唾液酸化反應之rFSH的特定特性(2,6-交聯劑部位，GalNAe)之rFSH產物。

該卵泡刺激激素(FSH)可包括單-、二-、三-及四-唾液酸化聚醣結構，其中該等唾液酸化聚醣結構之15-24%，例如17-23%為四唾液酸化聚醣結構。該等唾液酸化聚醣結構之27至33%較佳為三唾液酸化聚醣結構。該等唾液酸化聚醣結構之24至33%較佳為二唾液酸化聚醣結構。該等唾液酸化聚醣結構之12至21%較佳為單唾液酸化聚醣結構。該FSH較佳包括自0.1至7%中性聚醣結構。

該FSH較佳具有6莫耳/莫耳或更高，例如介於6莫耳/莫耳與15莫耳/莫耳之間的唾液酸含量[其係以唾液酸之莫耳數對蛋白質之莫耳數的比率表示]。

該rFSH(在該人細胞株內產生)可以是一含聚醣的FSH，其中該等聚醣之16%或較少(例如0.1至16%)包含(或具有)對切乙醯基葡萄糖胺(對切GlcNAc或bisGlcNAc)。該rFSH較佳為一其中該等聚醣之8至14.5%包含(例如具有)一對切N-乙醯基葡萄糖胺(對切GlcNAc或bisGlcNAc)的FSH。

該rFSH可具有16至24%之該等含(例如末端性)路易士1岩藻糖之聚醣，例如16.5至18%之該等含(例如末端性)路易士1岩藻糖之聚醣。該rFSH可具有1.5至4.5%，例如2至4%，例如3.7%之該等含(例如末端性)路易士2岩藻糖之聚醣。

根據本發明，在另一方面中係提供一其中該等聚醣之16至24%包含(例如末端性)路易士1岩藻糖的重組型卵泡刺激激素(FSH)。該rFSH可具有15至23%之該等含(例如末端性)路易士1岩藻糖的聚醣，例如16.5至18%之該等含(例如末端性)路易士1岩藻糖的聚醣。根據本發明，在另一方面 中係提供一其中該等聚醣之1.5至4.5%包含(例如末端性)路易士2岩藻糖的重組型卵泡刺激激素(FSH)。該rFSH可具有1.5至4.5%，例如2至4%，例如3.7%之該等含(例如末端性)路易士2岩藻糖的聚醣。根據本發明，在另一方面中，係提供一含一其中該等聚醣之16至24%包含(例如末端性)路易士1岩藻糖的重組型卵泡刺激激素(FSH)之藥學組成物。該rFSH可具有15至23%之該等含(例如末端性)路易士1岩藻糖的聚醣，例如16.5至18%之該等含(例如末端性)路易士1岩藻糖的聚醣。根據本發明，在另一方面中係提供一含一其中該等聚醣之1.5至4.5%包含(例如末端性)路易士2岩藻糖的重組型卵泡刺激激素(FSH)之藥學組成物。該rFSH可具有1.5至4.5%，例如2至4%，例如3.7%之該等含(例如末端性)路易士2岩藻糖的聚醣。

根據本發明，在另一方面中係提供一含包括單-、二-、三-及四-唾液酸化聚醣結構之(例如重組型)卵泡刺激激素(rFSH)的藥學組成物，其中該等唾液酸化聚醣結構的15-24%，例如17-23%為四唾液酸化聚醣結構(例如如藉在以下實例中所揭示之帶電聚醣的WAX分析而表示)。

該藥學組成物可進一步包含hCG及/或LH及/或LH活性。

該rFSH可包括α 2,3-及α 2,6-唾液酸化反應。該FSH(rFSH)之總唾液酸化反應的1%至99%可以是α 2,3-唾液酸化反應。該FSH(rFSH)之總唾液酸化反應的1%至99%可以是α 2,6-唾液酸化反應。可在PER.C6®細胞株、PER.C6®衍生的細胞株或經改造的PER.C6®細胞株內產生 或表現該rFSH。可使用α 2,3-唾液轉移酶修飾該細胞株。可使用α 2,6-唾液轉移酶修飾該細胞株。或者或另外，該rFSH可包括藉該細胞株之內源性唾液轉移酶活性而提供的α 2,6-鍵連唾液酸(α 2,6-唾液酸化反應)。該rFSH(或rFSH製備物)之總唾液酸化反應的40%或更多可以是α 2,3-唾液酸化反應，該總唾液酸化反應之，例如50-70%，例如60至69%，例如約65%可以是α 2,3-唾液酸化反應。本發明該rFSH之總唾液酸化反應的5%或更多，例如5%至99%可以是α 2,6-唾液酸化反應。本發明該rFSH(或rFSH製備物)之總唾液酸化反應的50%或較少可以是α 2,6-唾液酸化反應，該總唾液酸化反應之，例如30至50%，例如31至38%，例如約35%可以是α 2,6-唾液酸化反應。該rFSH可具有6莫耳/莫耳或更高，例如介於6莫耳/莫耳與15莫耳/莫耳之間的唾液酸含量[以唾液酸之莫耳數對蛋白質之莫耳數的比率表示]。該總唾液酸化反應的50至70%較佳為α 2,3-唾液酸化反應。該總唾液酸化反應之25至50%，例如30至50%較佳為α 2,6-唾液酸化反應。

該rFSH可以是一含聚醣的FSH，其中該等聚醣之16%或較少(例如0.1至16%)包含(或具有)對切乙醯基葡萄糖胺(對切GlcNAc或bisGlcNAc)。該rFSH較佳為一其中該等聚醣之8至14.5%包含(例如具有)一對切N-乙醯基葡萄糖胺(對切GlcNAc或bisGlcNAc)的FSH。

該rFSH可以是一FSH，其中該等聚醣之20%或更多包含(例如具有)N-乙醯基半乳糖胺(GalNAc)，例如其中該等聚 醣之20%或更多包含(或具有)一末端性GalNAc。該rFSH較佳為一其中該等聚醣之40至55%，例如42%至52%包含(例如具有)GalNAc的FSH。該rFSH較佳為一其中該等聚醣之40至55%，例如42%至52%包含(例如具有)末端性GalNAc的FSH。

根據本發明，在另一方面中係提供一含(例如重組型)卵泡刺激激素(rFSH)之藥學組成物，其中該等聚醣之16%或較少(例如0.1至16%)包含(例如具有)對切N-乙醯基葡萄糖胺(對切GlcNAc或bisGlcNAc)。該等聚醣之8至14.5%較佳包含(例如具有)一對切N-乙醯基葡萄糖胺(對切GlcNAc或bisGlcNAc)。該藥學組成物可進一步包含hCG及/或LH及/或LH活性。

根據本發明，在另一方面中係提供一含(例如重組型)卵泡刺激激素(rFSH)之藥學組成物，其中該等聚醣之20%或更多包含(例如具有)GalNAc。該等聚醣之20%或更多較佳包含(例如具有)一末端性GalNAc。該等聚醣之40至55%，例如42%至52%較佳包含(例如具有)GalNAc。該等聚醣之40至55%，例如42%至52%較佳包含(例如具有)末端性GalNAc。這藥學組成物可進一步包含hCG及/或LH及/或LH活性。

可藉本項技藝中已知的任何方法而獲得hCG。如文中使用的hCG包括人衍生的及重組型hCG。可藉本項技藝中已知的任何方法而自任何合適來源(例如尿、及胎盤)純化人衍生的hCG。表現且純化重組型hCG的方法在本項技藝中已為 吾人所熟知。

可藉本項技藝中已知的任何方法而獲得LH。如文中使用之LH包括人衍生的及重組型LH。可藉本項技藝中已知的任何方法而自任何合適來源(例如尿)純化人衍生的LH。表現且純化重組型LH的方法在本項技藝中係已知。

該藥學組成物(根據本發明之任一方面)可用於治療不孕症，例如用於，例如輔助性生殖技術(ART)、誘導排卵或子宮內受孕(IUI)。該藥學組成物可用於，例如其中係使用已知FSH製備物的醫學指標內。本發明亦提供文中所述的rFSH及/或rFSH製備物(根據本發明之方面)用於或用以製造用於不孕症之治療之藥物的用途。可將本發明該等藥學組成物調配成適於藥物投與的任何方式(例如口服、直腸投藥、非經腸投藥、經皮投藥(例如貼劑技術)、靜脈內注射、肌內注射、皮下注射、腦池內注射、陰道內投藥、腹膜內注射、局部(散劑、軟膏或滴劑)或呈頰或鼻噴劑投藥)之已為吾人所熟知的組成物。除了別的以外，如Remington’s Pharmaceutical Sciences第15版(Matt Publishing Company,1975)，第1405至1412頁及第1461-1487頁、以及國家處方集(the national formulary)XIV第14版(American Pharmaceutical Association,1975)中所述，典型的組成物包含一藥學上可接受的載劑，諸如水性溶液、非毒性賦形劑(其包括鹽及防腐劑)、緩衝劑等。

合適的水性及非水性藥學載劑、稀釋劑、溶劑或媒劑包括水、乙醇、多元醇(諸如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)、 羧甲基纖維素及其等之合適混合物、植物油(諸如橄欖油)、及可注射有機酯，諸如油酸乙酯。

本發明該等組成物亦可含有添加物，諸如但不限於：防腐劑、濕潤劑、乳化劑、及分散劑。可包括能防止微生物成長的抗細菌劑及抗真菌劑且其等包括，例如間-甲酚、苄醇、對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、酚、山梨酸等。而且，可較佳包括等滲壓劑，諸如糖、氯化鈉等。

在某些情況下，為了獲得延長的作用，較佳使得自皮下或肌內注射之FSH(及若存在的其它活性成份)的吸收作用變慢。其可藉使用具劣水溶性之結晶狀或非晶形材料的液體懸浮液而達成。接著，該FSH之吸收速率取決於其溶解速率，其隨後可取決於晶體大小及結晶形式。或者，係藉使該FSH組合溶解或懸浮在油媒劑內而達成一非經腸投與之FSH組合形式的延緩吸收作用。可藉在生物可降解聚合物(諸如聚內交酯-聚乙交酯)內形成該FSH(及若存在之其它藥劑)之微膠囊基質而製成可注射貯存形式。根據FSH對聚合物之比率以及所使用該粒狀聚合物的性質，可控制FSH釋放率。其它生物可降解聚合物的實例包括聚乙烯吡咯啶酮、聚(原酯)、聚(酸酐)等。貯存可注射調配物亦係藉使該FSH包藏在與身體組織具相容性的微脂粒或微乳液內而製成。

可，例如藉經由一細菌滯留濾器或藉併入呈無菌的固體組成物形式(其可僅在使用前溶解或分散在無菌水或其它無菌可注射介質內)之滅菌劑。可以以任何合適容器，例 如小玻瓶、預填充注射器、注射藥筒等，供應可注射調配物。

可供應呈具有含FSH(其可視需要選用hCG、LH等)之藥學組成物的產物形式之調配物(例如可注射調配物)。若有不僅一種活性成份(亦即FSH及，例如hCG或LH)，這些可適於各別或一起投與。若各別投與，則可連續投藥。可以呈任何合適包裝供應該產物。例如一產物可含有許多含FSH、hCG、或FSH與hCG之組合的預裝填注射器或小玻瓶。可將該等注射器或小玻瓶包裝在氣泡包裝或其它裝置內以維持無菌。一產物可選擇性含有使用該等FSH及hCG調配物的用藥說明。根據本領域之例行實務而調整該藥學組成物之各該組份的pH及精確濃度。見GOODMAN and GILMAN’s THE PHARMACOLOGICAL BASIS FOR THERAPEUTICES，第7版。在一較佳實施例中，本發明該等組成物係以適用於非經腸投藥的組成物供應。用於製造該等非經腸調配物的一般方法在本項技藝內係已知且描述在上述REMINGTON；THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY，第780-820頁中。該非經腸組成物可以呈液體調配物或呈一固體(其可僅在投與前與無菌可注射介質混合)形式供應。在一尤佳實施例中，為了容易投與及劑量之均勻性，該等非經腸組成物可以呈劑量單位形式供應。

較佳實施例之詳細說明

現在參考以下附圖而更詳細描述本發明，其中： 第1、2及3圖：該等pFSH α/β、pST3及pST6表現載體之質體圖。CMV=巨細胞病毒促進質，BGHp(A)=牛的生長激素多腺苷形成序列，fl ori=fl之複製源，SV40=猿病毒40促進質，Neo=新黴素抗性標記，Hyg=潮黴素抗性標記，SV40p(V)=猿病毒40多腺苷形成序列，FSH A=卵泡刺激激素α多胜肽。FSH β=卵泡刺激激素β多胜肽，ST3GAL4=α 2,3-唾液轉移酶，ST6GAL1=α 2,6-唾液轉移酶，ColEI=COlEI之複製源，Amp=胺苄青黴素抗性標記。

第1圖表示pFSH α/β表現載體的質體圖；第2圖表示該α 2,3-唾液轉移酶(ST3GAL4)表現載體；第3圖表示該α 2,3-唾液轉移酶(ST6GAL1)表現載體；第4圖表示藉PER.C6®細胞而製成的經α 2,3-唾液轉移酶操控後可穩定地表現FSH之重組型FSH之實例的唾液酸分佈豐度%；第5圖表示藉PER.C6®細胞而製成的經α 2,3-唾液轉移酶操控後可穩定地表現FSH之重組型FSH之實例的聚醣電荷分佈豐度%；第6圖表示在投與225IU Gonal f(底線，虛線)及本發明之225IU該實例(上線，實線)後，抑制素-B之濃度的比較。

序列選擇 人類FSH

根據Fiddes and Goodman.(1981)使用用於該FSH α多胜肽之基因的編碼區。該序列係以AH007338經儲存且於建構時，本蛋白質序列並無其它變體。本序列在文中稱為SEQ ID1。

根據Keene等人(1989)使用用於FSH β多胜肽之基因的編碼區域。該序列係以NM-000510經儲存且於建構時，本蛋白質序列並無其它變體。本序列在文中稱為SEQ ID2。

唾液轉移酶

α 2,3-唾液轉移酶-根據Kitagawa and Paulson(1994)使用用於β-半乳糖苷α 2,3-唾液轉移酶4(α 2,3-唾液轉移酶，ST3GAL4)之基因的編碼區域。該序列係以L23767經儲存且在文中稱為SEQ ID3。

α 2,6-唾液轉移酶-根據Grundmann等人(1990)使用用於β-半乳糖醯胺α 2,6-唾液轉移酶1(α 2,6-唾液轉移酶，ST6GAL1)之基因的編碼區域。該序列係以NM_003032經儲存且在文中稱為SEQ ID4。

實例 實例1 該FSH表現載體之建構

藉PCR分別使用起始質組合FSHa-fw及FSHa-rev與FSHb-fw及FSHb-rec而擴大FSH α多胜肽(AH007338,SEQ ID1)及FSH β多胜肽(NM_003032,SEQ ID2)的編碼序列。

FSHa-fw 5’-CCAGGATCCGCCACCATGGATTACTACAGAAAAATATGC-3’

FSHa-rev 5’-GGATGGCTAGCTTAAGATTTGTGATAATAAC-3’

FSHb-fw 5’-CCAGGCGCGCCACCATGAAGACACTCCAGTTTTTC-3’

FSHb-rev 5’-CCGGGTTAACTTATTATTCTTTCATTTCACCAAAGG-3’

使所形成擴大FSH β DNA經限制酶Ascl及Hpal消化且插入具有一新黴素(neomycin)選擇標誌的(MV驅動之哺 乳動物表現載體上的該第Ascl與Hpal位置內。類似地，使該FSH α DNA經BamHl及Nhel消化並插入已含有該FSH β多胜肽DNA之表現載體上的該等BamHl及Nhel位置內。

使用該載體DNA以變換大腸桿菌(E.coli)之DH5 α菌株。挑選用於擴大作用之菌落。選擇用於定序之該兼含FSH α及β的載體之菌落且根據SEQ ID1及SEQ ID2，全部含有正確的序列。選擇用於轉移感染的質體pFSH A+B#17(第1圖)。

實例2 該ST3表現載體之建構

藉PCR使用起始質組合2,3STfw及2,3STrev而擴大β-半乳糖苷-2,3-唾液轉移酶4(ST3,L23767,SEQ ID3)的編碼序列。

2,3STfw 5’-CCAGGATCCGCCACCATGTGTCCTGCAGGCTGGAAGC-3’

2,3STrev 5’-TTTTTTTCTTAAGTCAGAAGGACGTGAGGTTCTTG-3’

使所形成擴大的ST3 DNA經限制酶BamHl及Af/II消化且插入具有一潮黴素(hygromycin)抗性標誌的CMV驅動之哺乳動物表現載體上的該等BamHl及Af/II位置內。如先前所述擴大該載體並定序。根據SEQ ID3，純系pST3#1(第2圖)含有正確序列且經選擇用於轉移感染。

實例3 該ST6表現載體的建構

藉PCR使用起始質組合2,6STfw及2,6STrev而擴大β-半乳糖醣胺α-2,6-唾液轉移酶1(ST6,NM-003032,SEQ ID4)的編碼序列。

2,6STfw 5’-CCAGGATCCGCCACCATGATTCACACCAACCTGAAG-3’

2,6STrev 5’-TTTTTTTCTTAAGTTAGCAGTGAATGGTCCGG-3’

使所形成之擴大的ST6 DNA經限制酶BamHl及Af/II消化且插入具有一潮黴素抗性標誌的CMV驅動之哺乳動物表現載體上的該等BamHl及Af/II位置內。如先前所述擴大該載體且經定序。根據SEQ ID4純系pST6#11(第3圖)含有正確序列且經選擇用於轉移感染。

實例4 pFSH α+β在PER.C6®細胞內之穩定表現性。轉移感染離析及純系的篩選

可產生FSH之PER.C6®純系係藉表現得自單一質體之FSH的兩種多胜肽鏈而產生(見實例1)。

為了獲得穩定的純系，建構一具有該pFSH α+β之以微脂粒為基礎的轉移感染劑。在經10% FCS增補且含有G418之VPRO內選擇穩定的純系。轉移感染後3週，產生G418抗性純系。選擇純系以進行離析。在選擇培養基內培養該等經離析的純系，直到達70-80%融合性為止。使用cAMP蓄積檢定法，利用一FSH選擇性ELISA及於選殖細胞株內之該FSH受體下的藥理活性分析上澄清液的FSH蛋白質含量。使表現機能性蛋白質的純系生長以進行達24#、6#及T80燒瓶的培養擴張。

在T80燒瓶內開始進行得自7種純系之物質之生產力與品質的測定研究以產生足夠的物質。在如前述的增補培養基內培養細胞，費時7天且採集上澄清液。使用該FSH選擇性ELISA測定生產力。藉等電子聚焦(IEF)、藉本項技藝內已知的方法而測定該物質之等電子輪廓。選擇具有足夠的生產力及品質之純系以進行唾液轉移酶操控。

實例5 在可過度表現α 2,3-唾液轉移酶的細胞內增加唾液酸化反應的位準。pST3在可表現細胞PER.C6®細胞之FSH內的穩定表現性；純系之轉移感染離析及篩選。

藉自在已兼表現FSH之多胜肽鏈的PER.C6®細胞(得自實例4)內之各別質體(實例2)表現α 2,3-唾液轉化酶而產生可製造高唾液酸化FSH的PER.C6®純系。選擇自實例4內所揭示之PER.C6®細胞製成的純系之特徵，其包括生產力、良好成長輪廓、機能性蛋白質的製造、及包含部份唾液酸化反應之所產生的FSH。如先前在實例4內所述產生穩定的純系。離析、擴張並分析純系。使該等α 2,3-唾液轉移酶純系適應無血清培養基及懸浮條件。

如前述，使用一FSH選擇性ELISA、在一FSH受體細胞株內之機能性反應、IEF、代謝清除率及Steelman Pohley分析法分析純系。比較市售重組型FSH(Gonal-f,Serono)與親代FSH PER.C6®細胞株的結果。與未經α 2,3-唾液轉移酶表現的FSH比較，藉大部份該等純系而製成的FSH具有明顯改善的唾液酸化反應(亦即平均更多具有很多唾液酸的FSH同系型)。總之，與僅表現FSH的細胞比較，FSH連同唾液轉移酶在PER.C6®細胞內的表現性可得到較高位準的唾液酸化FSH。

實例6 製造及純化概述

已研發一在PER.C6®細胞(其係已在無血清培養基內進行懸浮培養)內製造FSH的程序。下文描述該程序且其適用於數種產生FSH之PER.C6®細胞株。

使用藉Lowry等人(1976)所述的方法之修飾法自α 2,3-純系(實例5)製造FSH。

就該PER.C6®-FSH之製造而言，係使該等細胞株適應無血清培養基，亦即Excell 525(JRH Biosciences)。首先培養該等細胞以在T80培養燒瓶內形成70%-90%融合性單層。一旦導入時，係使該等細胞再懸浮於該無血清培養基(Excell 525+4mM L-麩胺)內以達0.3×10⁶個細胞/毫升的細胞密度。將25毫升細胞懸浮液放入250毫升搖動器燒瓶內並於37℃在5% CO₂下以100rpm搖動。達>1×I0⁶個細胞/毫升之細胞密度後，使該等細胞進行次培養以達0.2或0.3×10⁶個/毫升之細胞密度且於37℃在5% CO₂下以100rpm在搖動器燒瓶內進行進一步培養。

就該FSH之製造而言，係將該等細胞轉移至無血清製造介質，亦即VPRO(JRH Biosciences)，其可以使PER.C6®細胞生長至很高細胞密度(在一批式培養基內通常>10⁷個細胞/毫升)。首先在Excell 525內使該等細胞培養至>1×I0⁶個細胞/毫升，然後以1000rpm向下旋轉且接著在VPRO培養基+6mM L-麩胺內懸浮以達1×10⁶個細胞/毫升的密度。然後於37℃在5% CO₂下以100rpm在搖動器燒瓶內培養該等細胞，費時7-10天。在本期間，使該等細胞生長至>10⁷個細胞/毫升的密度。該細胞存活力開始下降後，採集該培養基。以1000rpm向下旋轉該等細胞，費時5分鐘，且使用該上澄清液以進行FSH的定量及純化。使用ELISA(DRG EIA 1288)測定該FSH的濃度。

其後，使用藉Lowry等人(1976)所述之方法的修飾法進行FSH之純化。藉本項技藝內號己熟知的方法而進行使用電荷選擇性層析法之純化以濃縮該等高唾液酸化形式。

在所有層析程序進行期間，係藉RIA(DRG EIA 1288)及/或IEF而確認如文中主張之FSH的唾液酸化形式的濃縮。

實例7 α 2,3及α 2,6唾液酸之相對數量的定量

使用已知技術測定在純化rFSH(實例6)上之α 2,3及α 2,6唾液酸的相對數量%。

在變性條件下使用PNGase F自該等試樣釋放N-聚醣，然後經2-胺基苄醯胺標記。接著藉用於測定電荷分佈之弱陰離子交換(WAX)柱而分離並分析經釋放之聚醣形式。進一步藉wax柱而分析經用於測定總唾液酸之2,3,6,8唾液酶處置的經標記聚醣以及經用於測定2,3唾液之2,3唾液酶處置的經標記聚醣。

自存在於未經消化及經消化之聚醣池內的結構計算該等帶電聚醣之相對%且示於第4圖(就8種試樣而言)內，就2,3唾液酸化反應而言，已發現這些相對數量%在50%-70%範圍內(例如約60%或65%)且就α 2,6唾液酸化反應而言，係在28至50%、通常在30至35%範圍內(例如約31%或35%)。

實例8 單、二、三及四唾液酸化聚醣結構之相對數量的定量

使用已知技術測定在自純化rFSH(實例6)萃取之聚醣上之單、二、三及四唾液酸化結構的相對數量%。

在變性條件下使用PNGase F自該等試樣釋放N聚醣，然後經2-胺基苄醯胺標記。在變性條件下使用PNGase F自 該等試樣釋放聚醣，然後經2-胺基苄醯胺標記。然後藉用於測定唾液酸化分佈的弱陰離子交換(WAX)柱而分離並分析經釋放聚醣形式。中性、單唾液酸化、二唾液酸化、三唾液酸化及四唾液酸化結構之相對數量示於第5圖(就第4圖內所示的8種試樣而言)內。

該rFSH包括具有如下相對數量之中性、單唾液酸化、二唾液酸化、三唾液酸化及四唾液酸化聚醣結構：中性5-6%；15-17%單唾液酸化；26-30%二唾液酸化；30-32%三唾液酸化及17-23%四唾液酸化。

實列8a

使用已知技術測定在自9種純化rFSH試樣(藉實例6之方法而製成)萃取之純化rFSH上之α 2,6唾液酸的相對數量%。

在變性條件下使用PNGase F自該等試樣釋放N-聚醣，然後經2-胺基苄醯胺標記。接著藉用於測定電荷分佈之弱陰離子交換(WAX)柱而分離並分析經釋放之聚醣形式。進一步藉wax柱而分析經用於測定總唾液酸之2,3,6,8唾液酶處置的經標記聚醣以及經用於測定2,3唾液之2,3唾液酶處置的經標記聚醣(見實例8)。該分析可計算α 2,6唾液酸。

自存在於該等未經消化及經消化聚醣池內結構計算該等帶電聚醣之相對%且示於下表內。已發現就α 2,6-唾液酸化反應而言，其等係在25至50%、通常在30至35%範圍內。

使用已知技術測定在自這9種純化rFSH試樣(藉實例6之方法而製成)萃取之聚醣上的對切GlcNac、GalNac及路易士1岩藻糖之相對數量%。使用PNGase F自該醣蛋白釋放N- 聚醣並經2-胺基苄醯胺(2AB)標記。藉二維(2D)HPLC分析以及該等聚醣之酶催降解反應而進行該分析。為了證實，藉MALDI-MS而分析該等聚醣。α 2,6-唾液酸與該等末端殘基以及Gonal F(CHO細胞衍生的重組型FSH)與Bravelle(人尿FSH)的相對數量示於下表內。

可知在本發明該FSH內之GalNac的數量係在約44.9與51%之間不等，平均約47.1%。

可知在本發明該FSH內之對切GalNac的數量係在8.7與13.9%之間不等，平均約10.9%。

可知在本發明該FSH內之路易士1岩藻糖的數量係在16.1與23.3%之間不等，平均約19%。

可知在本發明該FSH內之路易士2岩藻糖的數量係在1.9與4.4%之間不等，平均約3.7%。

實例9-A 調查與GONAL-F比較之FE 999049的安全性、耐受性、藥物動力學、藥力學、及免疫原性之多劑量研究研究群體

總共48個(各藥物24個)健康女性接受14.6微克每日劑量之FE 999049(一根據本發明之組成物，其係根據實例6製 成)或16.5微克每日劑量之Gonal-F，費時7天。該組成物具有如實例8內所揭示的相對數量%之單、二、三及四唾液酸化結構[中性5-6%；15-17%單唾液酸化；26-30%二唾液酸化；30-32%三唾液酸化及17-23%四唾液酸化]。該GalNAc的數量為約50%，該bisGlcNac的數量為約9%，該路易士1岩藻糖的數量為約20%，而該路易士2岩藻糖的數量為約3%。

完全性結果

如藉不良事件(AE)、生命徵象、ECG、臨床實驗室測定法、及身體檢查所評估，FE 999049及GONAL-F的多劑量投與具安全性且通常具良好耐受性。在本研究期間並未發生嚴重不良事件或死亡。

藥物動力學結果

在7天內進行FE 999049及GONAL-F之投與後，如在接下來的注射前所立即評估的FSH濃度值增加且似乎在6-7天後達一穩態位準。然而，與Gonal-F比較，FE 999049之暴露(AUC及Cmax)高60%。

藥力學結果

在投與FE 999049及GONAL-F後，抑制素-B(見第6圖)、雌二醇、及黃體脂酮的濃度皆增加，然而與GONAL-F比較，FE 999049投與後，增加的程度較高。卵泡的數量及大小分佈顯示對於FE 999049之反應高於GONAL-F。

實例9證實具有一特定量(17-23%)之四唾液酸化聚醣結構及，例如特定量之α 2,3-唾液酸化反應及α 2,6-唾液酸 化反應的FSH比目前市售之FSH產物明顯更有效力。

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第1圖表示pFSH α/β表現載體的質體圖； 第2圖表示該α 2,3-唾液轉移酶(ST3GAL4)表現載體；第3圖表示該α 2,3-唾液轉移酶(ST6GAL1)表現載體；第4圖表示藉PER.C6®細胞而製成的經α 2,3-唾液轉移酶操控後可穩定地表現FSH之重組型FSH之實例的唾液酸分佈豐度%；第5圖表示藉PER.C6®細胞而製成的經α 2,3-唾液轉移酶操控後可穩定地表現FSH之重組型FSH之實例的聚醣電荷分佈豐度%；第6圖表示在投與225IU Gonal f(底線，虛線)及本發明之225IU該實例(上線，實線)後，抑制素-B之濃度的比較。

<110> 菲瑞茵公司(FERRINGB.V.)

<120> 藥學製備物

<130> P/66645.WO01

<150> EP 11168816.4

<151> 2011-06-06

<160> 16

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 351

<212> DNA

<213> 智人

<400> 1

<210> 2

<211> 390

<212> DNA

<213> 智人

<400> 2

<210> 3

<211> 999

<212> DNA

<213> 智人

<400> 3

<210> 4

<211> 1221

<212> DNA

<213> 智人

<400> 4

<210> 5

<211> 116

<212> PRT

<213> 智人

<400> 5

<210> 6

<211> 129

<212> PRT

<213> 智人

<400> 6

<210> 7

<211> 332

<212> PRT

<213> 智人

<400> 7

<210> 8

<211> 406

<212> PRT

<213> 智人

<400> 8

<210> 9

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引子FSHa-fw

<400> 9

<210> 10

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引子FSHa-rev

<400> 10

<210> 11

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引子FSHb-fw

<400> 11

<210> 12

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引子FSHb-rev

<400> 12

<210> 13

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引子2,3STfw

<400> 13

<210> 14

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引子2,3STrev

<400> 14

<210> 15

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引子2,6STfw

<400> 15

<210> 16

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引子2,6STrev

<400> 16

Claims (35)

1. 一種包括單-、二-、三-及四-唾液酸化聚醣結構的卵泡刺激激素(FSH)，其中該等唾液酸化聚醣結構之15-24%，例如17-23%為四唾液酸化聚醣結構。
2. 如申請專利範圍第1項之卵泡刺激激素(FSH)，其包括α 2,6-唾液酸化反應。
3. 如申請專利範圍第2項之卵泡刺激激素(FSH)，其中該總唾液酸化反應之25至50%，例如30至50%為α 2,6-唾液酸化反應。
4. 如申請專利範圍第1-3項任一項之卵泡刺激激素(FSH)，其包括α 2,3-唾液酸化反應。
5. 如申請專利範圍第4項之卵泡刺激激素(FSH)，其中該總唾液酸化反應之50至70%為α 2,3-唾液酸化反應。
6. 如申請專利範圍第1-5項任一項之卵泡刺激激素(FSH)，其係為一重組型FSH。
7. 如申請專利範圍第1-6項任一項之重組型卵泡刺激激素，其包括α 2,3-及α 2,6-唾液酸化反應，其中該總唾液酸化反應之50至70%為α 2,3-唾液酸化反應且該總唾液酸化反應之25至50%為α 2,6-唾液酸化反應。
8. 如申請專利範圍第1-7項任一項之卵泡刺激激素(FSH)，其中該等唾液酸化聚醣結構之27至33%為三-唾液酸化聚醣結構。
9. 如申請專利範圍第1-8項任一項之卵泡刺激激素(FSH)，其中該等唾液酸化聚醣結構之24至33%為二-唾 液酸化聚醣結構。
10. 如申請專利範圍第1-9項任一項之卵泡刺激激素(FSH)，其中該等唾液酸化聚醣結構之12至21%為單-唾液酸化聚醣結構。
11. 如申請專利範圍第1-10項任一項之卵泡刺激激素(FSH)，其包括自0.1至7%之中性聚醣結構。
12. 如申請專利範圍第1-11項任一項之卵泡刺激激素(FSH)，其具有6莫耳/莫耳或更多，例如介於6莫耳/莫耳與15莫耳/莫耳間的唾液酸含量[係根據唾液酸之莫耳數對蛋白質之莫耳數的比率表示]。
13. 如申請專利範圍第1-12項任一項之重組型卵泡刺激激素(FSH)，其係在一人類細胞株，例如一PER.C6®細胞株、一PER.C6®衍生的細胞株或一經改造的PER.C6®細胞株內產生或表現。
14. 如申請專利範圍第1-13項任一項之重組型卵泡刺激激素(FSH)，其中該等聚醣之16%或較少包含對切N-乙醯基葡萄糖胺(對切GlcNAc或雙GlcNAc)。
15. 如申請專利範圍第1-14項任一項之重組型卵泡刺激激素(FSH)，其中該等聚醣之8至14.5%包含一對切N-乙醯基葡萄糖胺。
16. 如申請專利範圍第1-15項任一項之重組型卵泡刺激激素(FSH)，其中該等聚醣之20%或更多包含N-乙醯基半乳糖胺(GalNAc)。
17. 如申請專利範圍第1-16項任一項之重組型卵泡刺激激 素(FSH)，其中該等聚醣之40至55%，例如42%至52%包含一末端性GalNAc。
18. 如申請專利範圍第1-17項任一項之重組型卵泡刺激激素(FSH)，其中該等聚醣之16至24%，例如18%至20%包含一(例如末端性)路易士1岩藻糖。
19. 如申請專利範圍第1-18項任一項之重組型卵泡刺激激素(FSH)，其中該等聚醣之1.5至5%，例如3.7%包含一(例如末端性)路易士2岩藻糖。
20. 一種重組型卵泡刺激激素(FSH)，其中該等聚醣之16%或較少包含對切N-乙醯基葡萄糖胺。
21. 如申請專利範圍第20項之重組型卵泡刺激激素(FSH)，其中該等聚醣之8至14.5%包含一對切N-乙醯基葡萄糖胺。
22. 一種卵泡刺激激素(FSH)，其中該等聚醣之20%或更多包含GalNAc。
23. 如申請專利範圍第22項之卵泡刺激激素(FSH)，其中該等聚醣之20%或更多，例如該等聚醣之42%至52%包含一末端性GalNAc。
24. 如申請專利範圍第22或23項之卵泡刺激激素(FSH)，其係為一重組型FSH。
25. 一種重組型卵泡刺激激素(FSH)，其中該等聚醣之16至24%包含(例如末端性)路易士1岩藻糖。
26. 一種重組型卵泡刺激激素(FSH)，其中該等聚醣之1.5至4.5%，例如3.7%包含(例如末端性)路易士2岩藻糖。
27. 如申請專利範圍第20至26項中任一項之重組型卵泡刺 激激素(FSH)，其包括α 2,3-唾液酸化反應及α 2,6-唾液酸化反應。
28. 如申請專利範圍第20至27項中任一項之重組型卵泡刺激激素(FSH)，其包括單-、二-、三-及四-唾液酸化聚醣結構，其中該等唾液酸化聚醣結構之15-24%，例如17-23%為四唾液酸化聚醣結構。
29. 一種含一如上述申請專利範圍任一項之卵泡刺激激素(FSH)的卵泡刺激激素(FSH)製劑。
30. 一種含一如上述申請專利範圍任一項之卵泡刺激激素(FSH)的藥學組成物。
31. 一種用於治療不孕症的藥學組成物，其包含一包括單-、二-、三-及四-唾液酸化聚醣結構的卵泡刺激激素(FSH)，其中該等唾液酸化聚醣結構之15-24%，例如17-23%為四唾液酸化聚醣結構。
32. 一種含一卵泡重組型刺激激素(rFSH)的藥學組成物，其中該等聚醣之16%或較少包含對切N-乙醯基葡萄糖胺。
33. 一種含一重組型卵泡刺激激素(rFSH)的藥學組成物，其中該等聚醣之20%或更多包含GalNAc。
34. 一種治療不孕症的方法，其包括一對患者投與一包括單-、二-、三-及四-唾液酸化聚醣結構的卵泡刺激激素(FSH)之步驟，其中該等唾液酸化聚醣結構之15-24%，例如17-23%為四唾液酸化聚醣結構。
35. 一種治療不孕症的方法，其包括一對患者投與一重組型卵泡刺激激素(rFSH)之步驟，其中該等聚醣之16%或較 少(例如0.1至16%)包含(例如具有)對切N-乙醯基葡萄糖胺；及/或，其中該等聚醣之20%或更多包含(或具有)GalNAc。