JP4583029B2 - 所定の翻訳後修飾を有する蛋白質の製造方法及び製造手段 - Google Patents

Description

本発明は、組換えＤＮＡ技術の分野に関する。本発明はさらに、蛋白質の製造に関する。さらに詳しくは、本発明は医薬製剤の治療上の有効成分として使用するための組換え蛋白質の製造に関する。本発明はまた、蛋白質の組換え製造のために同定され、選択され、及び／又は作製される哺乳類の細胞株に関する。本発明はさらにそのように製造された蛋白質の使用に関する。

蛋白質製造のための組換え細胞発現系は既知である。これらの系は細菌、酵母及び真菌から植物細胞に、更に昆虫細胞から哺乳類細胞の多岐にわたる。製造宿主及び発現系に関する選択は一般に、使用の容易さ、培養コスト、増殖の特徴、製造レベル及び無血清培地において増殖する能力のような検討材料に依存する。上述した細胞性の発現系はまた、折り畳み、リン酸化、γ−カルボキシル化及びγ−ヒドロキシル化のような翻訳時修飾及び翻訳後修飾を行う能力でも異なることが知られている。組換え発現系の選択が、発現された蛋白質の最終的な構造において劇的な結果を有する可能性があるという認識にもかかわらず、翻訳後修飾は一般に、所与の蛋白質に好適な発現系を選択するのに決定的な役割を果たしてきていない。

ここ数年間、研究によって、ヒトの蛋白質における差次的な翻訳後修飾の複雑さについてさらに多くが明らかにされ、人体での機能における潜在的な意味合いが明らかにされてきた。例えば、比較的最近の知見は、血中で生じるヒト蛋白質の差次的なグリコシル化パターン（いわゆる「血清型」修飾）は、脳における脳脊髄液で起きるもの（「脳型修飾」）とは異なることを示唆している。この差異は、有効な治療法を設計する上で最も重要な鍵となる問題点である可能性がある。

一般に、ヒト神経系の糖蛋白質はグリコシル化を特徴とし、それは「脳型」グリコシル化として文献に引用されている（Margolis & Margolis 1989; Hoffmann et al. 1994）。「血清型」のグリコシル化された蛋白質（すなわち、血中で循環する糖蛋白質）とは対照的に、脳型のグリコシル化された蛋白質は、ラクトサミン型のアンテナにおいてＮ−アセチル−グルコサミンに結合したα１，３−結合型のフコースで修飾されている複合型Ｎ−結合型の糖類を特徴的に持ち、それによってルイスＸ構造又はシアリル−ルイスＸ構造を形成する（図５）。２種類のルイスＸ構造があり：一つは末端ガラクトース残基を持つものであり、一つは末端Ｎ−アセチル−ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）残基を持つものである。これらの末端基がシアル酸に連結すれば、ルイスＸ構造はシアリルルイスＸ構造と呼ばれる。血清型のオリゴ糖と脳型のオリゴ糖との間のもう１つの差異は、後者が末端Ｎ−アセチル−グルコサミン及び／又は末端ガラクトースを含有することが多く、末端Ｎ−アセチル−グルコサミンの修飾を含んでもよいが、血清型のオリゴ糖は普通、そのような構造を少量含有するにすぎないことである。

血清中で循環している蛋白質に一般的に見い出されるオリゴ糖は多くガラクトシル化された構造を含有することが多い。このことは、ガラクトースは末梢のＮ−アセチル−グルコサミンに連結しており、それによってラクトサミン構造を形成することを意味している。糖蛋白質はこのような、肝臓の細網内皮細胞及びマクロファージ中に存在するＮ−アセチル−グルコサミン受容体（すなわち、末端Ｎ−アセチル−グルコサミンを認識する受容体）によってエンドサイトーシスから保護されている（Anchord et al. 1978; Stahl et al. 1978）。血清型のオリゴ糖も普通、アシアロ糖蛋白質受容体を介したクリアランスから糖蛋白質を保護する末端シアル酸（ノイラミン酸とも言われることも多い）を含有する。これらのクリアランス機構は血中を循環する糖蛋白質に特異的に適用され、ヒトの中枢神経系（ＣＮＳ）ではおそらく欠如している（Hoffmann et al. 1994）。

「血清型」の修飾を含む蛋白質製造のための組換え発現系は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞及び幼若ハムスターの腎臓（ＢＨＫ）細胞によって例示されるように、当該技術において利用可能である。しかしながら、「脳型」の修飾のようなそのほかの修飾を持つ蛋白質の製造については、そのような好都合な系は記載されてこなかった。従って、治療用蛋白質における異なった翻訳後修飾を勘案する発現系に対するニーズがある。特に、「脳型」の翻訳後修飾を含む蛋白質のための効率的な発現系に対するニーズが存在する。

これらの具体的なニーズを有する蛋白質は、あらゆる種類の疾患の治療に有益であってもよく、それらの中には、中枢神経系（ＣＮＳ）、末梢神経系及び心臓組織に関する病気がある。ＣＮＳに影響を与える障害には、急性の脳の損傷、神経変性疾患、及び例えば、癲癇、精神分裂症及び気分障害のようなそのほかの機能不全など、様々な種類の苦痛が包含される。神経細胞及び神経組織を冒すかもしれないそのほかの病理学的障害は、低酸素症、痙攣障害、神経毒による中毒、多発性硬化症、低血圧、心拍停止、放射線又は低血糖の結果である可能性がある損傷による。神経の損傷は、例えば動脈瘤の修復又は腫瘍の切除のような外科的処置の間にも起きる可能性もある。

少なくとも部分的に翻訳後修飾の差異に関係する異なった役割を有する蛋白質の例はエリスロポエチン（ＥＰＯ）として既知のホルモンである。ＥＰＯは、造血幹細胞を赤血球に分化させる役割で有名な蛋白質であり、神経組織における機能を含むそのほかの幾つかの機能を有する。ＣＮＳの発生におけるＥＰＯの役割が示唆されている（Dame et al. 2001）。ＥＰＯ蛋白質はまた、ヒト新生児及び成人の脳脊髄液（ＣＳＦ）でも検出されている（Juul et al. 1997; Buemi et al. 2000）。ＣＳＦに存在するようなＥＰＯは、それが無処置の血液脳関門を通過しないので、脳において局所的に産生されると思われる（Marti et al. 1997; Buemi et al. 2000）。ＥＰＯの発現の調節は組織特異的であり、そのことは、ＥＰＯが脳と骨髄で異なった組織特異的機能を有するという仮説をさらに強化する（Masuda et al. 1999; Chikuma et al. 2000; Sasaki et al. 2001）。従って、ＥＰＯは、その造血系の機能に加えて、神経分化誘導的役割を有する可能性があると仮定されてきた。神経分化誘導因子はニューロンに作用してそれらの発生、分化、維持及び再生に影響を及ぼす液性分子として定義されている（Konishi et al. 1993）。幾つかの研究の結果は今や、ＥＰＯが神経分化誘導因子として作用することができることを実証している（例えば、Sadamoto et al. 1998; Brines et al. 2000）。赤血球生成及び神経保護における言及されたＥＰＯの効果に加えて、例えば、内皮細胞及び筋肉細胞におけるＥＰＯのその他の役割が記載されている。（組換え）ＥＰＯの効果は、蛋白質上に存在するオリゴ糖のグリコシル化のパターンに強く依存することは当該技術で良く立証されている。ヒトＥＰＯのＮ−結合型オリゴ糖は、その周知の生物活性：赤血球生成の刺激に極めて重要である（Takeuchi & Kobata 1991; Wasley et al. 1991; Tsuda et al. 1990; Morimoto et al. 1996; Takeuchi et al. 1989; Misaizu et al. 1995）。

ＥＰＯの場合、脳のようなその他の組織により産生されるＥＰＯ（脳型）と比べて、腎臓で産生され、血中を循環する蛋白質については血清型ＥＰＯ（又は「腎臓型」又は「尿型」のＥＰＯ）と呼ぶこともできる。血清型ＥＰＯのための製造システム及び精製システムは当該技術において良く確立しており、組換え的に製造された血清型ＥＰＯは、例えば、赤血球のレベルが低い患者に日常的に且つ上手く使用されている。この組換えＥＰＯが、赤血球生成の誘導を可能にするのに十分な時間、血流で循環することができる安定な蛋白質の必要条件をすべて満たさねばならなかったことは当該技術で十分明らかにされている。これらの特徴を持つＥＰＯの製造には普通、ＣＨＯ又はＢＨＫを基にした細胞系が使用される。しかしながら、この製造及び精製システムから得られる血清型のＥＰＯは、中枢神経系又は末梢神経系に関連する疾患の治療において、並びに虚血／再潅流が誘発する疾患に関連する苦痛の治療において相対的に無効である。これは、これらの疾患の治療に適さないそのグリコシル化パターンのせいであり、また、これら非造血系疾患という背景においては望ましくない副作用と考えられる強い造血活性のために、赤血球の数の増加（赤血球生成）を招くからである（Wiessner et al. 2001）。従って、セレクチンを基にした輸送又は標的指向化が関与する脳又は組織において活性があるＥＰＯ分子の特有の特徴を有する、ＥＰＯのような蛋白質のための新しい製造システムに関するニーズが存在する。さらに、血清型のグリコシル化とは異なる、好ましくは脳型のグリコシル化を有する翻訳後修飾を持つＥＰＯのような蛋白質の薬学上許容可能な製剤、及びそれらを提供するための効率的な製造・精製システムに関するニーズがある。

別個の組織において異なったグリコシル化パターンを有し、異なったグリコシル化パターンの差次的役割を示唆する蛋白質のもう１つの例はトランスフェリンであり、それは、ＣＳＦにおいてアシアロトランスフェリンとしてかなりの量が生じるが、血清においてはその型では生じない（Van Eijk et al. 1983; Hoffmann et al. 1995）。

セレクチンと命名された、糖蛋白質の特定のファミリーは、虚血／再潅流障害における内皮への白血球の接着の最初の段階で重要な役割を担っている。セレクチンファミリーには３つのメンバー：Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン及びＬ−セレクチンがある。セレクチンは、それに結合する糖蛋白質リガンドの糖構造を認識するレクチンドメインを有する。セレクチンへの結合においてオリゴ糖にはシアリルルイスＸ修飾に対する役割がありうる（Foxall et al. 1992）。幾つかの研究は、虚血／再潅流のモデルにおける白血球の接着に関して、セレクチン及びシアリルルイスＸ構造が重要であることを指し示している。シアリルルイスＸオリゴ糖、Ｓｌｅ^ｘ−ＯＳは、例えば、心臓壊死を８３％低減することによって、虚血／再潅流のネコのモデルにおいて心臓を保護する性質を有することが明らかにされた（Buerke et al. 1994）。さらに、特許出願ＷＯ０２／３８１６８は、種々の病気の治療において抗炎症剤として使用するために、シアリルルイスＸ構造を含むセレクチン結合蛋白質を使用することを記載している。しかしながら、（シアリル）ルイスＸグリカンを含む蛋白質を調製するために好適な発現系は記載されていない。従って、（シアリル）ルイスＸ構造のような所定のグリコシル化構造を必要とする蛋白質のための組換え発現系に関するニーズが存在する。さらに一般的には、所定の翻訳後修飾を必要とする蛋白質の組換え製造のための発現系に関するニーズがある。

本発明は、翻訳後修飾を含むペプチド及び蛋白質のような蛋白質性分子を産生することが可能な哺乳類細胞を同定し、選択し、且つ獲得する方法を提供するものであって、この方法において前記翻訳後修飾は、蛋白質性分子を発現している哺乳類細胞によって予め定められ且つ成し遂げられる。本発明はさらに、本発明の方法に従って入手可能である哺乳類細胞を用いて、所望する所定の翻訳後修飾を示す蛋白質及び／又は翻訳後修飾を産生する能力に基づいて得られた哺乳類細胞において、エリスロポエチン（ＥＰＯ）のような蛋白質性分子を入手し、製造する方法を提供する。

本発明は、本発明の方法に従って入手可能な哺乳類細胞に、前記哺乳類細胞が前記核酸を発現可能な形態で有するような方法で、蛋白質性分子をコードする前記核酸を提供する工程；及び前記蛋白質性分子の産生を誘導する条件下にて前記哺乳類細胞を培養する工程からなる、所定の翻訳後修飾を含む前記蛋白質性分子を産生させる方法を提供する。

本発明の実施形態の１つでは、本発明は、蛋白質性分子に前記所定の翻訳後修飾を提供する能力を有する哺乳類細胞を同定する工程；前記哺乳類細胞が前記核酸を発現可能な形態で有するような方法で前記蛋白質性分子をコードする前記核酸を前記哺乳類細胞に提供する工程；及び前記蛋白質性分子の産生を誘導する条件下にて前記哺乳類細胞を培養する工程からなる、所定の翻訳後修飾を含む前記蛋白質性分子を産生させる方法を提供する。

もう１つの実施形態では、本発明は、所定の翻訳後修飾を含む蛋白質性分子を産生させる方法を提供するが、前記方法は、前記蛋白質性分子に前記所定の翻訳後修飾を提供する能力を有する哺乳類細胞を同定する工程；前記哺乳類細胞が発現可能な形態で核酸を有するような方法で前記蛋白質性分子をコードする前記核酸を前記哺乳類細胞に提供する工程；前記蛋白質性分子の産生を誘導する条件下にて前記哺乳類細胞を培養する工程；そのように産生された前記蛋白質性分子上の前記翻訳後修飾を分析する工程；及び前記蛋白質性分子上に存在する前記翻訳後修飾が前記所定の翻訳後修飾を含むかどうかを決定する工程を含む。

好ましい実施形態では、本発明は、「神経型」又は「脳型」の特性を有する十分な量の組換え蛋白質を産生することができるような、神経型の特徴及び特性を有する哺乳類細胞を提供する。本発明の方法及び手段を用いて、特異的な所定の翻訳後修飾を持つ脳型ＥＰＯのような組換え蛋白質の産生をすることを今は実行できる。

本発明はさらに、所定の翻訳後修飾を含む蛋白質性分子を産生させる方法を提供するが、前記方法は、本発明に係る方法によって入手可能な哺乳類細胞に、哺乳類細胞が発現可能な形態で核酸を有するような方法で、前記蛋白質性分子をコードする前記核酸を提供する工程；前記蛋白質性分子の産生を誘導する条件下にて前記哺乳類細胞を培養する工程、及び哺乳類細胞の培養物から前記蛋白質性分子を精製する工程を含む。

もう１つの実施形態では、本発明は所定の翻訳後修飾を含む蛋白質性分子を産生する方法を提供するが、前記方法は、本発明に係る方法によって入手可能な哺乳類細胞に、前記哺乳類細胞が発現可能な形態で核酸を有するような方法で、前記蛋白質性分子をコードする前記核酸を提供する工程；前記蛋白質性分子の産生を誘導する条件下にて前記哺乳類細胞を培養する工程；そのように産生された前記蛋白質性分子上の前記翻訳後修飾を分析する工程；及び前記蛋白質性分子上に存在する前記翻訳後修飾が前記所定の翻訳後修飾を含むかどうかを決定する工程を含む。

好ましくは、蛋白質性分子を産生させるための前記方法は、哺乳類細胞の培養物から前記蛋白質性分子を精製する付加的な工程を含む。本発明の哺乳類細胞において蛋白質性分子を産生させる方法において、前記哺乳類細胞が不死化されている及び／又はＥ１Ａアデノウイルス配列を発現していることはさらに好ましい。得られた哺乳類細胞を同定する前に、不死化又はＥ１Ａアデノウイルス配列の導入を行うことができるが、該細胞を同定し、選択し及び／又は獲得した後に行ってもよい。

本発明はさらに、分子上に存在する所定の翻訳後修飾に基づいて細胞培養物から蛋白質性分子を精製し、前記所定の翻訳後修飾が、該分子を産生する哺乳類細胞によって達成される、前記蛋白質性分子を精製する方法を提供する。

本発明はさらに、虚血、再潅流障害、低酸素が誘発する障害、炎症性疾患、神経変性障害、及び中枢性又は末梢性の神経系への急性の損傷より成る群から選択される障害の治療のために薬物を調製するための、エリスロポエチン、エリスロポエチンの１つ又はそれ以上の突然変異蛋白質、エリスロポエチンの１つ又はそれ以上の誘導体、又は種々の程度にシアリル化されたエリスロポエチン分子の１つ又はそれ以上の分画の収集物より成る群から選択されるエリスロポエチン様分子の組成物の使用を提供し、エリスロポエチン様分子の前記組成物は、蛋白質含量を基準にして、エポエチンα及びエポエチンβのような貧血の治療に現在使用されているエリスロポエチン様分子よりも生体内で低い赤血球生成活性を有する。本発明はまた、そのようなエリスロポエチン様分子を含む医薬組成物も提供する。本発明はまた、前記組成物を投与することからなる、前記障害の治療方法又は予防方法も提供する。

他の観点において本発明は、蛋白質性分子がエリスロポエチンであるとき、哺乳類細胞はＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞ではなく、前記蛋白質性分子がグリコデリン又はプロテインＣ又は組織因子経路阻害剤であるとき、前記哺乳類細胞はＨＥＫ２９３ではなく、且つ前記蛋白質性分子がマトリクスメタロプロテアーゼであるとき、前記哺乳類細胞はＨＴ１０８０細胞ではないという条件付きで、前記細胞がアデノウイルス由来のＥ１Ａをコードする核酸を発現することを特徴とする、Ｎ−結合型グリカン構造を含有する（シアリル）ルイスＸ及び／又はＬａｃｄｉＮＡｃより成る群から選択されるグリコシル化構造を必要とする蛋白質性分子を哺乳類細胞で産生させる方法を提供する。

ａ）アデノウイルス由来のＥ１Ａをコードする核酸を発現している細胞において蛋白質性分子を組換えて発現させる工程；及びｂ）そのように産生された蛋白質性分子を分画し、それによって（シアリル）ルイスＸ構造及び／又はＬａｃｄｉＮＡｃ構造を含むＮ−結合型グリカンを有する分子が濃縮された分画を得る工程からなる、（シアリル）ルイスＸ構造及び／又はＬａｃｄｉＮＡｃ構造を含む前記Ｎ−結合型グリカンを有する蛋白質性分子中で濃縮した分画を生成する方法を提供することは、本発明のもう１つの観点である。本発明はもう１つの観点では、ルイスＸ構造を含む蛋白質性分子を含む混合物を分画する方法を提供し、前記方法において、ＡＬＬレクチンへの前記分子の結合を採用する。そのほかの実施形態では、そのように得られた分画が提供される。エリスロポエチン様分子当たりのＮ結合型グリカン上のルイスＸ構造の平均数が少なくとも約２．２であることを特徴とする、エリスロポエチン、エリスロポエチンの１つ又はそれ以上の突然変異蛋白質、及びエリスロポエチンの１つ又はそれ以上の誘導体より成る群から選択されるエリスロポエチン様分子を含む組成物を提供することは、本発明のもう１つの観点である。そのほかの実施形態では、前記平均数は少なくとも約２．６、２．７、３．６、４．１、又は５．７である。もう１つの観点では、本発明に係る組成物又は分画を薬剤の調製に使用する。もう１つの観点では、本発明は、虚血、再潅流障害、低酸素が誘発する障害、炎症性疾患、神経変性障害、及び中枢性又は末梢性の神経系への急性の損傷より成る群から選択される障害の治療のために薬物を調製するために、アデノウイルス由来のＥ１Ａをコードする核酸を発現する哺乳類細胞において組換えによって生産可能であるエリスロポエチンの使用する方法を提供する。もう１つの実施形態では、本発明は、虚血、再潅流障害、低酸素が誘発する障害、炎症性疾患、神経変性障害、及び中枢性又は末梢性の神経系への急性の損傷より成る群から選択される障害の予防的な及び／又は治療的な処理方法を提供し、前記方法は、エリスロポエチン、エリスロポエチンの１つ又はそれ以上の突然変異蛋白質、及びエリスロポエチンの１つ又はそれ以上の誘導体より成る群から選択されるエリスロポエチン様分子の組成物をヒト又は動物の披験対象に投与する工程からなり、エリスロポエチン様分子の前記組成物がアデノウイルス由来のＥ１Ａをコードする核酸を含む哺乳類細胞中で組換えにより生産可能であることを特徴とする。特定の好ましい実施形態では、前記細胞はＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞である。

発明の詳細な説明

所定の翻訳後修飾を必要とする蛋白質を産生させるために適した組換え産生系を提供することは本発明の利点である。第１の観点では、問題となる蛋白質又は問題となる蛋白質の意図される使用方法に必要な翻訳後修飾に適用することができる発現系を同定するために、本発明に係る方法を用いて、そのような組換え系を提供することができる。第２の態様では、本発明は、それを必要とする蛋白質の所望の翻訳後修飾を適用する能力を有する発現系を作製する方法を提供する。本発明の更なる観点は、そのように産生された所定の翻訳後修飾を有する単離された蛋白質、その使用方法、及びそれを含む医薬組成物を含む。従って本発明は、所定の翻訳後修飾を含む蛋白質性分子を産生することが可能である哺乳類細胞を同定する方法を提供し、前記方法は、ａ）前記哺乳類細胞により産生された蛋白質上の翻訳後修飾を解析する工程；及びｂ）前記蛋白質が前記所定の翻訳後修飾を含むかどうかを決定する工程を含む。

もう１つの実施形態では、本発明は、所定の翻訳後修飾を含む蛋白質性分子を産生することが可能である哺乳類細胞を選択する方法を提供し、前記方法は、ａ）組換えＤＮＡ及び細胞培養の技術、さもなければ当業者に周知の技術を用いて前記細胞中で産生される場合、マーカー又は前記マーカーの組み合わせがそれを必要とする蛋白質性分子上で所定の翻訳後修飾を適用する前記細胞の能力を示す、前記哺乳類細胞中又は前記哺乳類細胞の細胞表面上で組織特異的マーカー又は組織特異的マーカーの組み合わせの有無を解析する工程、及びｂ）前記組織特異的マーカーの有無に基づいて前記哺乳類細胞を選択する工程を含む。

さらにもう１つの実施形態では、本発明は、異質性の細胞集団から哺乳類細胞を獲得する方法を提供し、前記哺乳類細胞は、所定の翻訳後修飾を含む蛋白質性分子を産生することが可能であり、前記方法は、ａ）前記異質性の細胞集団の中における前記細胞により産生される蛋白質上の翻訳後修飾に基づいて細胞を分類する工程；及びｂ）前記所定の翻訳後修飾を含む蛋白質を産生することが可能である細胞を選択する工程を含む。そのような分類は、当該技術で既知の方法を用いて達成してもよく、そのような方法には、所定の翻訳後修飾を認識する蛍光標識された抗体を用いて細胞を分類することを含むが、これに限定されない。

もう１つの実施形態では、本発明は、所定の翻訳後修飾を含む蛋白質性分子を産生することが可能である哺乳類細胞を同定する方法を提供し、前記方法は、哺乳類細胞が発現可能な形態で核酸を有するような方法で、翻訳後修飾を必要とする及びそれを受け入れるのが可能である蛋白質をコードする前記核酸を前記哺乳類細胞に提供する工程；前記蛋白質の産生を誘導する条件下で前記哺乳類細胞を培養する工程；前記哺乳類細胞により産生された蛋白質上の翻訳後修飾を解析する工程；及び前記蛋白質上で前記翻訳後修飾の存在を立証する工程を含む。もう１つの実施形態によれば、本発明は、所定の翻訳後修飾を含む蛋白質性分子を産生することが可能である哺乳類細胞を同定する方法を提供し、前記方法は、哺乳類細胞が発現可能な形態で核酸を有するような方法で翻訳後修飾を含むことが可能である前記蛋白質性分子をコードする前記核酸を前記哺乳類細胞に提供する工程；前記蛋白質性分子の産生を誘導する条件下で前記哺乳類細胞を培養する工程；前記哺乳類細胞により産生された蛋白質性分子上の翻訳後修飾を解析する工程；及び前記蛋白質性分子上のに存在する前記翻訳後修飾が前記所定の翻訳後修飾を含むかどうかを決定する工程を含む。

本明細書で使用するとき、蛋白質性分子は、それらが、所定の翻訳後修飾を受け入れることが可能であり、すなわち、修飾を受けやすいという正しい背景において必要とされるアミノ酸を有する限り（例えば、Ｎ−結合型グリカン構造の付加が所望である場合、それらはＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒの配列を含むべきであり、この背景ではそれをＡｓｎ残基に適用することができる）、ペプチド、ポリペプチド及び蛋白質、並びにペプチド、ポリペプチド及び蛋白質の突然変異体（欠失、点突然変異、交換及び／又は化学的に誘導した変異を含む分子）のような分子を言うが、これらに限定されない。それはタグ及び／又は他の蛋白質性の標識及び非蛋白質性の標識（例えば、放射活性化合物）を持つペプチド、ポリペプチド及び蛋白質も言う。そのような蛋白質の一例はヒトのＥＰＯであり、それはさらに、腎臓型又は血清型、例えば脳型形態のようなその他の表現型を有する。特定の組織における蛋白質の機能性において重要な役割を担っているかもしれない特定の特徴を有し、（組換える事により発現する場合）適切な機能のために所定の翻訳後修飾を内部に持つべきである蛋白質のクラスの他の例として、それらに限定されるものではないが、モノクローナル抗体、ニューロトロフィン類、サイトカイン類、インスリン様成長因子、ＴＧＦ−β様成長因子、線維芽細胞増殖因子、上皮成長因子、ヘパリン結合性成長因子、チロシンキナーゼ受容体リガンド及びそのほかの栄養因子が挙げられる。これらの因子はほとんど病徴と関連しているので、該蛋白質のほとんどは、蛋白質が生体内で活性を持つことが必要である翻訳後修飾を有することを条件として、ヒトの治療では組換え型で使用してもよい。従って、これらの蛋白質は、所望の翻訳後修飾を提供することが可能である発現系で産生されるべきである。そのような蛋白質の例は、トランスフェリン、グリコデリン、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子、ニューロトロフィン−３、−４／５及び−６、毛様体神経栄養因子、白血病阻害因子、カルディオトロフィン−１、オンコスタチン−Ｍ、数種のインターロイキン類、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＧＦ−１及び−２、ＴＧＦ−β、グリア由来の神経栄養因子、ニューロツリン、パーセフィン、ミオスタチン、線維芽細胞増殖因子−１、−２及び−５、アンフィレグリン、アセチルコリン受容体誘導活性、ネトリン−１及び−２、ニューレグリン−２及び−３、プレイオトロフィン、ミッドカイン、幹細胞因子（ＳＣＦ）、アグリン、ＣＳＦ−１、ＰＤＧＦ及びサポシンＣであるが、これらに限定されない。本明細書で使用するとき、モノクローナル抗体は、ヒト抗体及びヒト化抗体、その一部、並びに例えば、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、Ｆａｂ断片、ＣＤＲ領域、可変領域、軽鎖及び重鎖のような同等物、又は特異的リガンドとして使用するのに好適なそのほかの任意の型を言う。

１つの具体的な実施形態によると、Ｎ−結合型グリカン構造を受容することが可能である蛋白質上にルイスＸ構造及び／又はＬａｃｄｉＮＡｃを適用することが可能である産生系が提供される。本発明に従ってそのような発現系を同定し、選択し、具体的に設計することができる。そのような目的に適った設計の一例は、アデノウイルスのＥ１Ａ配列を含む核酸を、前記Ｅ１Ａ配列が哺乳類細胞で発現されるように前記哺乳類細胞に導入することである。すでに存在しているそのような細胞の例は、ＨＥＫ２９３、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）、９１１である。これらの細胞株はそれ自体が知られており、蛋白質の産生に使用されてきたが（Van den Nieuwenhof et al. 2000; WO 00/63403; Grinnell et al. 1994）、その上に産生される蛋白質にルイスＸ構造及び／又はＬａｃｄｉＮＡｃ構造を適用する能力におけるＥ１Ａの決定的な効果はこれまで十分には理解されていなかった。

本明細書で使用するとき、翻訳後修飾は、前記蛋白質性分子上又は前記蛋白質性分子中に存在するいかなる修飾も言う。それは、生体内又は試験管内でＲＮＡから前記分子を翻訳している間又は翻訳に引き続いて導入される修飾を言う。そのような修飾には、グリコシル化、折り畳み、リン酸化、γ−カルボキシル化、γ−ヒドロキシル化、多量体化、スルフィド架橋及び例えば、１つ以上のアミノ酸の切り取り又は付加のようなプロセッシング事象が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で使用するとき、所定の翻訳後修飾とは、選択された治療に有用であるいかなる翻訳後修飾も言う。好ましい実施形態によれば、所定の翻訳後修飾とは、修飾した蛋白質を、人体又は動物の体の特定の組織、臓器、区分及び／又は細胞の治療のために特に有用とするような修飾の形態を言う。そのような所定の翻訳後修飾を有する蛋白質性分子は、その結果、治療されるべき組織、臓器、区分及び／又は細胞に対する以外の重大な効果（例えば、有害な、又はそのほかの望ましくない副作用）を欠くものであればよい。実施形態の１つによれば、所定の翻訳後修飾は、所定の翻訳後修飾を含む蛋白質をさらに迅速に血液から消失させる原因となり、例えば、それによって有害な副作用を軽減する。所定の翻訳後修飾はあらかじめ詳細に完全に理解することができるが、そのような所定の翻訳後修飾を含む蛋白質性分子の適切で且つ望ましい活性に必要とされる所望の状態であるとも一般に言うことができ、そのことは、所望の活性がある限り、関心のある蛋白質性分子上に存在する詳細な修飾が必ずしも完全に理解されるわけではなく、及び／又は定義なければならないわけではないことを意味している。意図した使用方法に依存するＯ−グリカン及び／又はＮ−グリカンにおける所望のグリコシル化修飾の例は、ルイスＸ、シアリルルイスＸ、ＧａｌＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｃ、ＬａｃｄｉＮＡｃ、Ｎ−アセチル−グルコサミンに結合したα１，３−結合型フコース、末端Ｎ−アセチル−グルコサミン、末端ガラクトース、二分（ｂｉｓｅｃｔｉｎｇ）Ｎ−アセチル−グルコサミン、硫酸基、及びシアル酸のような構造である。

本発明の哺乳類細胞は、ヒトの蛋白質を産生するために好ましくはヒト又はヒト由来であり、哺乳類の特徴、及び好ましくはヒトの特徴を持つ可能性が最も高い蛋白質を産生する。神経の翻訳後修飾を有すべき蛋白質性分子を産生させるには、神経細胞を示すものである蛋白質マーカーのような神経の特徴を有する細胞を使用するのが好ましい。このことは、神経型の翻訳後修飾を含む蛋白質を産生させるのに非神経系細胞が極めて有用であるかもしれないということを除外するものではない。そのような翻訳後修飾を生じることが可能である細胞を選択し、同定し、又は獲得することは、必要とされる蛋白質活性に依存する。

治療上の設定においてこれらが適用される場合、蛋白質を大量に製造することが必要とされるので、本発明の哺乳類細胞は不死化されることが好ましい。多数の方法において不死化を成し遂げることができる。不死化された細胞を得る方法の例として、形質転換する及び／又は不死化する蛋白質をコードする核酸の添加によって、又は内因性蛋白質が形質転換する可能性がある化学処理を介して、又は腫瘍材料からの細胞を利用することによって静止細胞を分裂細胞へと活性に形質転換することが挙げられる。非腫瘍細胞を不死化する好ましい方法の１つは、９１１及びＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）のような細胞株で示されたように、アデノウイルスのＥ１領域を添加することである。特定のヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の蛋白質をコードする配列（例えば、Ｈｅｌａ細胞）を用いた形質転換のような、細胞を不死化するその他の方法が知られている。アデノウイルスのＥ１のような特定のウイルス蛋白質の添加は、そのような蛋白質の多くは抗アポトーシス効果のみならず転写を活性化する特徴を有するので、組換え蛋白質の産生に有益である。今や驚くべきことに、本発明に係る発現系として使用される宿主細胞においてアデノウイルスのＥ１Ａを発現させると、細胞がルイスＸ及び／又はＬａｃｄｉＮＡｃを含むＮ−結合型グリコシル化構造を適用する能力を獲得するように、発現系の特徴が変化することが見い出されている。

ルイスＸ及び／又はＬａｃｄｉＮＡｃを含有するＮ−結合型グリカンを必要とする蛋白質性分子を産生させる方法に好適な細胞株は、応用微生物学・研究センターにある欧州動物細胞培養コレクションでＮｏ．９６０２２９４０として供託されているＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）である。この観点によるそのほかの好適な細胞株には、ＨＥＫ２９３、９１１、及び発現可能な形式でアデノウイルスのＥ１Ａ配列を含有する核酸を１つ又はそれ以上の哺乳類細胞又はその原種に導入することによって修飾されるその他の前記哺乳類細胞が挙げられる。必要に応じて発現可能な形式のＥ１Ｂ配列も含まれ、それは、Ｅ１Ｂにより抗アポトーシス効果が発揮され、Ｅ１Ａ発現によるアポトーシス効果の可能性に対抗するので有利でありうる。

本発明に係る蛋白質性分子を産生させる方法はさらに、哺乳類細胞の培養物から前記蛋白質性分子を精製する付加的な工程を含んでもよい。本明細書で使用するとき、精製は、当該技術で記載されてきた従来の方法を用いることによって実行してもよいが、前記蛋白質性分子の中及び／又はその上に存在する翻訳後修飾を用いた工程を含んでいる精製方法を使用することが好ましい。その上さらに好ましいのは、前記蛋白質性分子の中及び／又はその上に存在する所定の翻訳後修飾を用いた工程を含んでいる精製方法である。アフィニティ精製法を適用する場合、例えば、特別の炭水化物部分に特異的なレクチンのような、及び特定の種類の翻訳後修飾に向けられた抗体又はそのほかの結合剤を使用するのが好ましい。そのような抗体の例には、（シアリル）ルイスＸ構造、ＬａｃｄｉＮＡｃ構造又はＧａｌＮＡｃルイスＸ構造に向けられた抗体がある。本発明のこの観点において有用であるレクチンの例は、これらに限定されるものではないが、ＡＡＬ、及び、例えばＥ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｌ−セレクチンのようなセレクチン類である。そのような結合剤を使用することによって、高い比率の精製された蛋白質が所望の所定の翻訳後修飾を有するように、（組換え）蛋白質を精製することが可能になる。その上さらに好ましいのは、蛋白質性分子が均質に精製される方法である。本発明によって哺乳類細胞の培養物から蛋白質を精製する方法の例が提供され、その例には、例えば、組換えにより産生された生成物のＮ−グリカン中に存在するルイスＸ構造を認識する抗体又はレクチンを用いることによって脳型のグリコシル化ＥＰＯを精製するためのアフィニティクロマトグラフィ法が包含される。

本発明は、本発明の方法により入手可能である、所定の翻訳後修飾を有する蛋白質性分子を含む薬学上許容可能な組成物、及び薬学上許容可能なキャリアを提供する。薬学上許容可能なキャリアは当業者に既知である。好ましい実施形態では、前記薬学上許容可能な組成物における前記蛋白質性分子はエリスロポエチンである。本発明によって、神経系蛋白質のマーカーを持つ細胞において産生されるエリスロポエチンが神経組織中において又は神経細胞上において活性がある翻訳後修飾を獲得する。しかしながら、該翻訳後修飾は、血中で循環するＥＰＯで見られる翻訳後修飾に匹敵しない。神経系蛋白質のマーカーを持つ細胞で産生されるＥＰＯの赤血球生成効果は有意に低い。本発明によって今や、そのことは、高い比率のシアル酸が存在しないこと及び／又はルイスＸ構造及び末端ガラクトシドのような脳型の特徴が存在することによると強く示唆されている。このことは、神経組織に関係する障害の治療又は虚血により損傷された組織（例えば、虚血の心臓）の治療に相対的に高い投与量でそのような脳型ＥＰＯを使用することができ、一方、同時に、脳型ＥＰＯは現在利用可能なＥＰＯ製剤に比べて赤血球生成に対する効果が有意に低いので、有利である。本発明は、シアリルルイスＸ構造、ルイスＸ構造、Ｎ−アセチル−グルコサミンに結合したα−１，３−結合型フコース、ＬａｃｄｉＮＡｃ構造、末端Ｎ−アセチル−グルコサミン基及び末端ガラクトース基より成る群から選択された少なくとも１つの翻訳後修飾を含む組換えエリスロポエチンを提供する。前記組換えエリスロポエチンは、本発明に従って入手可能な哺乳類細胞で産生可能であり、それのみならず、以前から知られているが、この目的に好適であることは十分理解されていなかった哺乳類細胞においても産生可能である。一例はＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞である。実施形態の１つに従って、本発明はさらに、所定の翻訳後修飾を含む蛋白質性分子の産生のためのＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞の使用を提供するが、その際、前記蛋白質性分子は血液から迅速に消失し、及び／又は高い投与量で使用されることが好ましい。ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）で産生可能なＥＰＯの場合、高い投与量を用いて低酸素症に関係する急性の損傷を治療してもよいし、予防してもよいが、一方、赤血球生成の有害な副作用は限定される。

本発明の実施形態の１つでは、本発明の蛋白質性分子は、外科処置、治療又は診断によるヒト又は人体の処置に好適である。好ましくは、本発明に係るＥＰＯ様分子は、低酸素症に誘導された障害、神経変性の苦痛、又は中枢神経系若しくは末梢神経系の急性の損傷を治療するための薬物の製造に使用される。もう１つの好ましい実施形態では、ＥＰＯのような前記蛋白質性分子は、虚血及び／又は再潅流障害の治療のための薬物の製造に使用される。さらにもう１つの好ましい実施形態では、ＥＰＯのような前記蛋白質性分子は、免疫性障害び／又は炎症性疾患の治療のための薬物の製造に使用される。

組換え蛋白質の産生及び製造のために方法及び組成物が本明細書で開示される。本発明は、グリコシル化及び適切な折り畳みのような翻訳時及び／又は翻訳後の修飾を必要とする蛋白質の産生に特に有用であり、さらに、蛋白質性分子上で脳型の翻訳時及び／又は翻訳後の修飾を生じることが可能であるヒト細胞の使用に関する。これらの細胞は例えば、その神経系の特徴のために治療上有益である神経系の特徴を持つヒトの糖蛋白質の産生に使用することができる。

本発明はまた、グリコシル化、リン酸化又は折り畳みのような「脳型」又は「神経型」の翻訳後修飾のような神経系の特性を有する組換えにより発現した蛋白質を修飾する神経系の特徴を持つヒト細胞株の使用を提供する。ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）（米国特許第６，０３３，９０８号）と命名されたそのような細胞株の一例が、アデノウイルスのＥ１遺伝子を有しているコンストラクトを用いたヒト胎児の網膜細胞の不死化によって作成された。ヒトＥＰＯや完全なヒトモノクローナル抗体のような蛋白質を高い収率で得ることができるので（ＷＯ００／６３４０３に記載された）、以前からＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞は、組換えヒト蛋白質の産生に特に好適であることが分かっていた。本発明は、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）により産生された組換え蛋白質が、神経系の特徴のような（例えば、グリコシル化のような翻訳後修飾）特定の組織に特異的な特徴を獲得できることを開示する。このことは、いわゆる脳型オリゴ糖を有する蛋白質の産生によって例示される。ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞により産生されたヒトＥＰＯは、Ｎ−結合型の糖で修飾されることが明らかにされ、ヒト尿中ＥＰＯ又はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞若しくは幼若ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞により産生される組換えヒトＥＰＯで見られるＮ−結合型の糖とは明らかに異なっている。ヒト尿中ＥＰＯ並びにＣＨＯ細胞及びＢＨＫ細胞で産生される組換えヒトＥＰＯは、「腎臓型」又は「血清型」のオリゴ糖と言われるグリコシル化構造を含有する。通常、これらＣＨＯ−ＥＰＯ及びＢＨＫ−ＥＰＯの調製物は高度に分枝し、高度にガラクトシル化され、高度にシアリル化されているが、周辺のα１，３−結合型フコースを欠いている（Tsuda et al. 1988; Takeuchi et al. 1988; Nimtz et al. 1993; Watson et al. 1994; Rahbek-Nielsen et al. 1997）。

本明細書では、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）で産生されるヒトＥＰＯに結合するオリゴ糖の性質を解明し、ヒト尿中ＥＰＯ並びにＣＨＯ細胞及びＢＨＫ細胞で産生される組換えヒトＥＰＯに存在するオリゴ糖とは有意に異なることを明らかにしている。第１に、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）で産生されたヒトＥＰＯのオリゴ糖における平均シアル酸含量は、ヒト尿中ＥＰＯ又は組換えヒトＥＰＯ（ＣＨＯ細胞及びＢＨＫ細胞からの）の平均シアル酸含量よりも有意に低い。ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）で産生されるヒトＥＰＯにおける極めて低いＥＰＯシアル酸含量は、末端となるガラクトース及び／又はＮ−アセチル−ガラクトサミン及び／又はＮ−アセチル−グルコサミンを含有するＮ−結合型オリゴ糖の存在を示している。第２に、Ｎ−アセチル−ガラクトサミンは、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）で産生されるヒトＥＰＯのＮ−結合型の糖においてかなりの量で見い出されるが、一方、Ｎ−アセチル−ガラクトサミンは、ヒト尿中ＥＰＯ及びＣＨＯ細胞により産生された組換えヒトＥＰＯのＮ−結合型の糖には見い出されない。ＢＨＫ細胞で産生された組換えヒトＥＰＯのわずかなバッチにおけるＮ−結合型の糖で、ほんのわずかな量のＮ−アセチル−ガラクトサミンが生じることが報告されている（Nimtz et al. 1993）。第３に、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞で産生されるヒトＥＰＯのＮ−結合型の糖は、極めて高い量のフコースを含有することが見い出されている。フコースの分画は、周辺のＮ−アセチル−グルコサミンにα１，３−結合しており、それによっていわゆるルイスＸ構造を形成する（図５）。ヒト尿中ＥＰＯ又はＣＨＯ細胞及びＢＨＫ細胞中で産生される組換えヒトＥＰＯにおいて、ルイスＸ構造を生じることは今までに報告されたことがない。本発明に係るＥＰＯに存在する（シアリル）ルイスＸ構造は、このＥＰＯがセレクチンへの結合に好適であるようにし、心臓保護における更なる適用が予見される。

蛋白質に結合したオリゴ糖は、例えば、三次構造、溶解性、粘度及び電荷等のような、ポリペプチドの物理化学的特性に大きな影響を有するので、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）で産生されたＥＰＯは、ヒト尿中ＥＰＯ並びにＣＨＯ細胞及びＢＨＫ細胞で産生された組換えヒトＥＰＯとは明らかに異なる物理化学的特性を有する（Toyoda et al. 2000）。明らかに、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）で産生されたヒトＥＰＯは、低いシアル酸含量のために、ヒト尿中ＥＰＯ並びにＣＨＯ細胞及びＢＨＫ細胞で産生される組換えヒトＥＰＯよりも電荷が低い。また、フコース含量が極めて高いためにさらに疎水性でありうる。その結果、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）で産生されるヒトＥＰＯの平均ＰＩは、ヒト尿中ＥＰＯ又はＣＨＯ細胞とＢＨＫ細胞で産生される組換えヒトＥＰＯの平均ＰＩよりも明らかに高い。ＥＰＯのグリカン、特にシアル酸はＥＰＯ受容体との結合にも影響を有するので、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）で産生されたヒトＥＰＯは、ヒト尿中ＥＰＯ並びにＣＨＯ細胞及びＢＨＫ細胞で産生された組換えヒトＥＰＯとは異なった、ＥＰＯ受容体への親和性を有することが予想される。ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）でのＥＰＯの産生は以前開示されているが（WO 00/63403）、産生されたＥＰＯの構造的詳細はそのとき何も開示されなかった。従って、本明細書で得られた見識によって、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）におけるＥＰＯの産生は、全く新しい適用、特に赤血球生成が（望ましくない）副作用とみなされる場合には適したものとなる、という結論が今や正しいと証明される。当然、本明細書で提供される新しい見識から、そのほかの蛋白質も恩恵を受けることができる。本発明のそのほかの態様の１つによると、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞又はＥ１Ａを発現している任意の哺乳類細胞を用いて、Ｎ−グリカンを含有するルイスＸ及び／又はＬａｃｄｉＮＡｃを必要とする蛋白質を産生するための方法が提供される。そのような構造から恩恵を受けてもよく、従って、前記細胞において好適に産生されることができる蛋白質の例は、エリスロポエチン、トランスフェリン、グリコデリンＡ（ＰＰ１４）のようなグリコデリン、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来の神経栄養因子、ニュートロフィン−３、−４／５、及び−６、毛様体神経栄養因子、白血病阻害因子、カルディオトロフィン−１、オンコスタチン−Ｍ、インターロイキン、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＧＦ−１及び−２、ＴＧＦ−β、グリア由来の神経栄養因子、ニューロツリン、パーセフィン、ミオスタチン、線維芽細胞増殖因子−１、−２及び−５、アンフィレグリン、アセチルコリン受容体誘導活性、ネトリン−１及び−２、ニューレグリン−２及び−３、プレイオトロフィン、ミッドカイン、幹細胞因子（ＳＣＦ）、アグリン、ＣＳＦ−１、ＰＤＧＦ、サポシンＣ、可溶性補体受容体−１、アルファ−１酸性糖蛋白質、急性期蛋白質、Ｅ−セレクチンリガンド−１、ＬＡＭ−１、癌胎児性抗原様ＣＤ６６抗原、末梢リンパ節アドレシン、ＣＤ７５、ＣＤ７６、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ２１、Ｐ−セレクチン糖蛋白質リガンド−１、ＧｌｙＣＡＭ−１、ムチン型糖蛋白質、ＣＤ３４、ポドカリキシン、α１−アンチキモトリプシン、α１−プロテアーゼ阻害剤、α−アミラーゼ、唾液プロリンリッチ糖蛋白質、ＳＥＲＰ−１、インターフェロン−β、β−トレース蛋白質、プロテインＣ、ウロキナーゼ、住血吸虫の糖蛋白質、グリコデリンＡ、組織因子経路阻害剤、α−フェトプロテイン、例えば、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体ホルモン（ＬＨ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）などの性腺刺激ホルモンのようなヒトの妊娠性蛋白質、又は前記グリコシル化構造を受け入れることが可能であるこれらの任意の物の断片若しくは変異体である。本明細書で使用するとき、断片とは蛋白質の一部であり、数個のアミノ酸の長さからほとんど蛋白質全体までのペプチドであることもある。変異体は、突然変異蛋白質、融合蛋白質、その他の非蛋白質部分に結合した蛋白質又はペプチドなどであることができる。本発明に係るそのような断片又は変異体は、翻訳後修飾を受け入れることができるべきである。

本発明のそのほかの観点では、（シアリル）ルイスＸ構造及び／又はＬａｃｄｉＮＡｃ構造を含むＮ−結合型グリカンを有する蛋白質性分子が濃縮された分画を生成するための方法が提供され、本方法は、（ａ）アデノウイルスのＥ１Ａをコードする核酸を発現している細胞において前記蛋白質性分子を組換えにより発現させる工程、及び（ｂ）そのように産生された蛋白質性分子を分画し、それによって（シアリル）ルイスＸ構造及び／又はＬａｃｄｉＮＡｃ構造を含む前記Ｎ−結合型グリカンを有する分子が濃縮された分画を得る工程を含む。前述の蛋白質性分子は、本発明のこの態様から恩恵を得ることができる。ＨＥＫ２９３細胞で産生され、引き続き精製されたプロテインＣは、ＧａｌＮＡｃルイスＸ構造を含む特定のグリコシル化構造を有することが記載されたが（Grinnell et al. 1994）、精製された蛋白質は意図的にこの種の糖において濃縮されておらず、Ｅ１Ａを発現する産生細胞は故意に選択されていなかった。（シアリル）ルイスＸ構造及び／又はＬａｃｄｉＮＡｃ構造を含むＮ−結合型グリカンを有する蛋白質を意図的に産生するのに、アデノウイルスのＥ１Ａを発現している哺乳類細胞を使用することができ、さらにこれら特定の分画を濃縮することを教示するのが本発明の長所である。好ましくは、例えば、（シアリル）ルイスＸ構造及び／又はＬａｃｄｉＮＡｃ構造を含む前記Ｎ−結合型グリカンに結合するレクチン又はモノクローナル抗体への結合を用いるような、所望のグリカン構造を採用するアフィニティ精製工程を含む方法によって前記分画を濃縮する。本明細書では、ＥＰＯ産生にこれらの方法を用いて、特定のグリコシル化プロフィールを持つＥＰＯの画分を得られることを示す。エリスロポエチン様分子当たりのＮ−結合型グリカン上のルイスＸ構造の平均数が少なくとも約２．２であることを特徴とする、エリスロポエチン、エリスロポエチンの１つ又はそれ以上の突然変異蛋白質、及びエリスロポエチンの１つ又はそれ以上の誘導体から成る群から選択されたエリスロポエチン様分子を含む組成物を提供することは本発明の態様である。そのほかの実施形態では、エリスロポエチン様分子当たりのＮ−結合型グリカン上のルイスＸ構造の前記平均数は少なくとも約２．６、２．７、３．６、４．１、又は５．７である。そのような組成物は、本明細書で開示するように医薬目的で有益であることができる。

本発明はさらに、哺乳類及び特にヒトにおける虚血／再潅流障害を治療するために、ヒト神経系細胞で産生される脳型蛋白質の使用を開示する。本明細書で使用するとき、虚血／再潅流障害は、前から生存可能な虚血組織に再潅流を施した後、生じる細胞性の損傷として定義される。虚血／再潅流障害は、例えば、血栓溶解療法、冠状動脈血管形成、大動脈交差金具止め、心肺バイパス、臓器及び組織の移植、外傷及びショックに関係するが、これらに限定されない。

本発明は、哺乳類細胞で産生される、脳型オリゴ糖を持つ治療用蛋白質の使用を提供する。これら脳型のオリゴ糖は、ヒトのような哺乳類披験体で虚血／再潅流障害を治療するために、特に、特定のルイスＸ構造、シアリルルイスＸ構造、又は（シアリル）ルイス構造を含有するその誘導体を含む。組換え蛋白質上における（シアリル）ルイスＸ構造の存在は、これら蛋白質を虚血／再潅流障害部位に向かわせ、それによって（シアリル）ルイスＸ構造を含有しない蛋白質よりもさらに効果的に虚血／再潅流保護の効果を発揮する。組換えにより発現した蛋白質上における脳型オリゴ糖の存在は、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞上で産生されるエリスロポエチン（ＥＰＯ）により、本発明において例示される。この特定の型のＥＰＯは、シアリルルイスＸ構造と同様にルイスＸを含有する。本発明では、心臓の虚血／再潅流障害の生体内モデルにおける心臓保護機能及び卒中に関して、血清型（又は腎臓型）のＥＰＯと比べて、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）の脳型（又は神経型）ＥＰＯの優位であることを示す実験が記載される。

本発明により提示されるもう１つの利点は、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）が産生するヒトＥＰＯは神経栄養の活性を有することである。ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）が産生するＥＰＯは、神経栄養剤及び／又は神経保護剤として機能することにおいて、ＥＰＯ蛋白質に物理化学的及び／又は薬物動態的及び／又は薬力学的な利点を与える。ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）が産生するＥＰＯは、ＣＨＯ細胞及びＢＨＫ細胞で産生される高度にシアリル化された血清型のグリコシル化ヒト組換えＥＰＯよりも、神経細胞及び神経細胞上のＥＰＯ−Ｒに対して高い親和性を有する。非神経細胞で産生される組換えヒトＥＰＯは（Goto et al. 1988）、赤血球前駆細胞上のＥＰＯ−Ｒよりも神経細胞上のＥＰＯ−Ｒに対して低い親和性を有する（Musada et al. 1993 & 1994）。

ＥＰＯの神経保護的役割は、炎症によって又は低酸素及び／又は虚血によって誘導される可能性がある有毒な化学物質に対する神経保護療法として、組換えヒトＥＰＯの使用についての新しい可能性を明らかに開くものである。今までのところ、主な欠点は、神経保護剤として適用すると、血液循環中に存在する組換えＥＰＯが赤血球総量又はヘマトクリットの上昇を生じることである。このことは、言い換えれば、さらに高い血液の粘性を招き、それは脳虚血において有害な影響を有する可能性がある（Wiessner et al. 2001）。

本発明は、これまで神経保護剤として適用されてきた組換えヒトＥＰＯが望ましくない血液栄養性の副作用を有する（Wiessner et al. 2001）という問題に対して解決を提供する。従って、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）が産生する脳型のグリコシル化組換えヒトＥＰＯは、神経形成剤及び／又は神経保護剤として高い潜在能力を有するが、赤血球生成の刺激においては低い潜在能力を有することが示される。

本発明によれば、例えば、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）が産生するＥＰＯのようなＥ１Ａを発現している哺乳類細胞で産生されるＥＰＯは、全身性に（静脈内、腹腔内、皮内）に投与して、例えば、急性の頭部及び脳の損傷又は神経変性の障害によって誘発される神経の損傷を阻害し、予防し、及び／又は修復することができる。本発明はまた、哺乳類における中枢性及び末梢性の神経系、腎臓組織及び心臓組織のような、低酸素により重い損傷を被った可能性がある組織の機能を調節するのに使用することができる製品を提供する。そのような組織は病気であってもよいが、正常及び健常であってもよい。本発明により提供される製品によって治療することができる障害は、急性の頭部の、脳の及び／又は心臓の損傷、神経変性疾患、発作性障害、神経毒中毒、低血圧、心臓発作、放射線、多発性硬化症、及び／又は低酸素による損傷の結果生じることがある。低酸素は、出生前の又は出生後の酸素剥奪、窒息、気腫、敗血症ショック、心臓発作、息詰まり、溺死間際、鎌状赤血球病、成人呼吸器疾患症候群、律動不整、窒素昏睡、術後認知機能障害、一酸化炭素中毒、煙吸入、慢性閉塞性肺疾患アナフィラキシーショック又はインスリンショックの結果であることがある。発作性傷害には、癲癇、慢性発作性障害又は痙攣が挙げられるが、これらに限定されない。病態が神経変性疾患の結果である場合、障害は、ＡＩＤＳ痴呆、アルツハイマー病、パーキンソン病、クロイツフェルト・ヤコブ病、卒中、脳性麻痺、脊髄損傷、脳損傷、加齢に関連した認知機能の喪失、筋萎縮性側索硬化症、アルコール依存症、網膜虚血、緑内障、神経の一般的な喪失、記憶喪失又は加齢によることがある。本発明により提供される製品によって治療されるその他の疾患の例には、自閉症、鬱病、不安性障害、気分障害、注意欠陥過活動性障害（ＡＤＨＤ）及び認知機能障害が挙げられる。

血管脳関門機能障害の場合、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯは無抵抗に血管脳関門を通過することができる。血管脳関門がそのままである場合、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯは、ＥＰＯ−Ｒを介して血管脳関門を越えて積極的に輸送されると考えられている。幾つかの研究は、高い用量の組換えＥＰＯを投与した場合、ＥＰＯ自体が血管脳関門を越えてことができることを示唆している（WO 00/61164）。血管脳関門を越える組換えＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯの予想されるもう１つの経路は、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）が産生するＥＰＯ上に存在する（シリアル−）ルイスＸグリカン構造の、ヒト脳の微小血管の内皮細胞に存在するＥ−セレクチン分子との相互作用を介している（Lou et al. 1996）。Ｅ−セレクチンはまたＴリンパ球の中枢神経系（ＣＮＳ）への移動に関与するとみなされているので（Wong et al. 1999）、Ｅ−セレクチンとＥＰＯとの間の相互作用は、脳内皮関門を越えたＥＰＯの輸送を促進する可能性がある。神経を最適に保護するために必要ならば、血清型ＲＰＯよりもはるかに高い用量でＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯを投与することができるが、それは、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯは、ヘマトクリットが上昇するという有害効果が軽減するような、又は無いような、はるかに低い効率でしか赤血球生成を誘導しないからである。

本発明のもう１つの観点では、点滴によりくも膜下に、又は心室留置カテーテルを介して、又は腰椎注射を介して、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯのようなＥ１Ａを発現している哺乳類細胞で産生されるＥＰＯを投与して神経の損傷を阻害する又は予防することができる。再び、血清型ＥＰＯに対する脳型ＥＰＯを使用することの利点は、例えば卒中により血管脳関門が機能障害がある場合に血液循環への漏出したときに、赤血球生成に関する望ましくない副作用が生じないことである。

本発明は、無血清条件のもと極めて高い密度で増殖し、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）のような神経としての特徴を有する無限に増殖する形質転換細胞が、その機能性がこれらの特徴に依存する因子を産生させるのに極めて有用であることを確立する。これは、神経としての特徴又は神経に関連した機能を有さないが、にもかかわらず、そのような細胞によりもたらされる翻訳後修飾からの恩恵を受ける因子を生じる可能性も本質的に提供する。いくつかの因子は非神経組織においても役割を担うが、依然として、本発明でＥＰＯについて記載されるように、例えば、ルイスＸ構造又はフコース残基を含み、本発明の手段及び方法によって提供することができるグリコシル化構造を必要とすることを想定することができる。ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）により産生され、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞の神経の特徴を上手く利用する因子の例には、脳型エリスロポエチン、トランスフェリン及び上述の様々な因子が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明は、そのほかの組換えた神経栄養的な糖蛋白質の産生がそのような細胞で生じる脳型修飾から恩恵を受ける可能性が極めて高いことを明らかにする。

本発明によれば、驚きべきことに、蛋白質の主鎖当たりの平均シアル酸残基数がさらに低いエリスロポエチン様分子が、種々の障害の治療及び／又は予防にさらに有効であることが見い出されている。このことは、これまでは使用されることが少ないか又は無いと考えられていたＥＰＯ及びＥＰＯ様分子の使用の完全に新しい道を開くものであり、それには組換え哺乳類細胞系で産生されるＥＰＯバッチのシアル酸が低いＥＰＯ画分を含むがそに限定されるものではなく、そのＥＰＯ画分は平均シアリル化度が低い及び／又は関連する赤血球生成活性が低いために分画の際に捨てられていた。従って本発明は、シアル酸含量の低いＥＰＯが、ラットにおいて実験的に誘導した卒中での梗塞の大きさの軽減において、シアル酸含量の高いＥＰＯとほぼ同様の効き目があることを実証する。ＥＰＯにおけるシアル酸含量が高いことは、生体内でのより長い循環半減期及び赤血球生成能の上昇と相関していることは、当該技術で確立している（Tsuda et al. 1990; Morimoto et al. 1996）。

従って、大まかに言えば、本発明は、虚血、再潅流障害、低酸素が誘導する障害、炎症性疾患、神経変性障害、及び中枢性又は末梢性の神経系への損傷より成る群から選択された障害を治療するために薬物を調製するための、エリスロポエチン、エリスロポエチンの１つ又はそれ以上突然変異蛋白質、エリスロポエチンの１つ又はそれ以上の誘導体、種々の程度にシアリル化されたエリスロポエチン分子の１つ又はそれ以上の画分の組成物より成る群から選択されるエリスロポエチン様分子の組成物の使用を提供し、エリスロポエチン様分子の前記組成物は、蛋白質含量に基づき、エポエチンα及びエポエチンβよりも低い生体内での赤血球生成活性を有する。本発明の実施形態は、生体内での前記赤血球生成活性が、エポエチンα（エプレックス）又はエポエチンβよりも少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、又は９０％低い組成物及びその使用を含む。エリスロポエチン様分子は、ＥＰＯの現在知られている形態と同一又はそれに類似する蛋白質主鎖を有する分子、例えば、ＥＰＯの突然変異蛋白質、ＥＰＯの誘導体、又は質的な及び／又は量的な点で蛋白質主鎖のグリコシル化が異なっているＥＰＯ分子を包含することを意味する。本明細書で使用するとき、突然変異蛋白質は、エポエチンαの蛋白質主鎖に比較して、アミノ酸の欠失、付加、置換及び／又は転座によって蛋白質主鎖に１又はそれ以上の突然変異を有するエリスロポエチン様分子から成ることを意味するが、遺伝的に及び／又は化学的に及び／又は酵素的に得られる変異体のみならず天然由来の対立遺伝子の変異体も包含しなければならない。そのような分子は依然としてＥＰＯの機能的活性を与えることができるはずである。それらは、当業者に周知の分子生物学の常法を用いて入手可能である。本明細書で使用するとき、誘導体とは、エリスロポエチン又はエポエチンαから入手可能であるエリスロポエチン様分子、又はその化学的若しくは酵素的な修飾によるその他の任意の機能的な突然変異蛋白質である。本明細書で意味される赤血球生成活性とは、ヒト又は動物の被験対象における赤血球産生をＥＰＯが刺激する効果であって、エリスロポエチン様分子をヒト又は動物の被験対象へ投与した後、特定の時点でのヘマトクリット値の増加によって（例えば、実施例９を参照のこと）、又はヘモグロビン濃度を測定することによって測定することができる。これらの方法はすべて当業者に周知である。エポエチンαは現在市販されているエプレックス（登録商標）に存在する組換えヒトＥＰＯの形態であって、貧血患者の尿から単離されたヒトのエリスロポエチンに（アミノ酸及び炭水化物組成について）類似するか又は同一である。赤血球生成目的での治療投薬計画は確立している。一般的に、ＥＰＯの投与量は、赤血球生成におけるＥＰＯの活性を参照してＩＵ（国際単位）で与えられる。そのようなＩＵは、ＥＰＯの蛋白質含量に相関しているが、操作上規定されているので、異なったバッチ間で相関は異なってもよい。大雑把なやり方では、１Ｕは８〜１０ｎｇのエポエチンαに相当する。本発明を記載する目的では、エリスロポエチン様分子の赤血球生成活性は、蛋白質含量を基にして、ＩＵで規定することにより導入される可変を除くことを言う。ＩＵは普通、市販のＥＰＯ製剤に対して与えられるが、そのような製剤におけるＥＰＯ分子の濃度は常法に従って容易に規定することができることは当業者に明らかであろう。これによって、例えば、ＩＵ／ｇにおける相対的比活性を決定することができる（例えば、ＥＰ０４２８２６７を参照のこと）。これらの目的に有用な幾つかの生体内及び試験管内のアッセイもシュテリング（Storring et al. 1992）らによって記載されている。現在市販されているＥＰＯのその他の形態の例には、プロクリット又はエポジェン（双方ともエポエチンα）及びアラネスプ（ダルベポエチンα、循環半減期及び赤血球生成活性を高めるために余分のＮ−グリコシル化部位を持つＥＰＯ）がある。市販の種々のエポエチンα製剤及びエポエチンβ製剤の間で赤血球生成活性は幾分異なることがあるが、一般的にそれらは高い赤血球生成活性のために最適化されている。本発明は、より低い造血活性又は赤血球生成活性を有し、それによって望ましくない場合には、赤血球生成の増加という副作用を軽減する又は回避するＥＰＯ−様分子又はＥＰＯ−形態の使用を開示する。

本発明のもう１つの実施形態によれば、エリスロポエチン様分子の組成物は、エポエチンαにおけるエリスロポエチン様分子当たりのシアル酸残基の平均数よりも、エリスロポエチン様分子当たりのシアル酸残基の平均数が少なくとも１０％少ないことを特徴とする。そのほかの実施形態によれば、シアル酸残基の前記平均数は、エポエチンαにおけるＥＰＯ蛋白質主鎖当たりのシアル酸残基の平均数よりも少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％少ないように選択されることがある。エリスロポエチン様分子におけるシアル酸残基の前記平均数は好ましくは、エポエチンαにおけるＥＰＯ分子当たりのシアル酸残基の平均数の０〜９０％の間にあるが、患者−疾患の組み合わせによっては他よりも高いヘマトクリット値に対して脆弱でないこともあるので、正確な比率は、疾患から疾患、時には患者から患者に依る。別の方法としては、シアル酸残基の数を、ＥＰＯ様分子当たり、例えば１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１又は０のシアル酸残基というように、ＥＰＯ様分子当たりで記載すればよい。値は、種々の程度のシアリル化度のＥＰＯ様分子から成る組成物について計算した平均なので、本発明により分子を定義するには、述べられた値の間の非整数であることも可能である。最適な範囲は、当業者に過度の負担をかけずに実験により決定すればよい。分子当たりのシアル酸残基の平均数又はＥＰＯのシアル酸含量は公開された手順に従って決定することができ、当業者に周知である。可能性のある手順の１つは、ＥＰ０４２８２６７に記載されている。簡単に言えば、０．３５Ｍの硫酸で８０℃にて３０分間加水分解することによってＥＰＯ様分子からシアル酸残基を切断し、分析に先立って水酸化ナトリウムで溶液を中和する。別の方法では、常法に従って、酵素的な切断によってシアル酸を除くことができる。周知の手順を用いて、例えば、市販の蛋白質アッセイキット（例えば、ブラッドフォードアッセイ、バイオラッド）及び標準としての組換えヒトＥＰＯを用いた検量線、２８０ｎｍでの吸収、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡなどを用いてＥＰＯの量を概算する。ジョーダンら（１９７１年）の方法によってシアル酸の含量を分析することができる。別の方法として、高速陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて、当業者に周知の手順を用いて（例えば、高速陰イオン交換クロマトグラフィー、ディオネックス製、アプリケーションノート番号ＴＮ４１を用いたシアル酸の分析）シアル酸を分析することができる。シアル酸含量は、ＥＰＯのモル当たりのシアル酸のモルとして、又はＥＰＯ−様分子当たりのシアル酸残基の平均数として表現することができる。等電点（ＰＩ）を測定する等電点電気泳動（実施例４を参照のこと）によって、ＥＰＯ−様分子当たりのシアル酸残基の平均数の指標を得ることもできる。

エリスロポエチン様分子当たりの平均数のシアル酸残基がさらに少ないエリスロポエチン様分子を得るには、幾つかの方法を想定することができる。これらには、例えば、ノイラミニダーゼのような特にシアル酸を切断する酵素、若しくは例えば、Ｎ−グリカナーゼＦ（Ｎ−グリカン全体を除去する）、エンドグリコシダーゼＦ_２（２アンテナ構造を除去する）、エンドグリコシダーゼＦ_３（２アンテナ及び３アンテナ構造を除去する）等のような、グリコシル化構造の更なる置換基（シアル酸を含めて）を切断する酵素を用いた、例えば、好適な宿主細胞で組換えにより産生されたＥＰＯ様分子の処理、又は酸を含むがこれに限定されるものではない化学物質によりＥＰＯ様分子当たりのシアル酸残基の平均数が低下する事になるＥＰＯ様分子の処理が含まれるが、これらに限定されるものではない。特に、このようにして、高度にシアリル化されたＥＰＯ分画を脱シアリル化し、本発明で使用すればよい。さらにもう１つの実施形態では、シアル酸分子の平均数がさらに少ないＥＰＯ様分子を、高度にシアリル化及び少なくシアリル化されたＥＰＯの双方を含有する混合物から、そのような形態を精製又は分離することによって得られる。現在使用されている生産系は一般的にそのような混合物を生じ、赤血球生成目的を意図するＥＰＯは、平均数のシアル酸残基が高い形態を精製することによって調製される。本発明は、この工程での他の画分、すなわち、低い平均数のシアル酸残基を持つ形態のＥＰＯのの使用を開示する。そのような画分の精製又は分離は、例えば、イオン交換、アフィニティー精製などのような、当業者に既知の確立した技術を用いて行うことができる。本発明のエリスロポエチン様分子は好ましくは組換えにより産生される。これは任意の好適な発現系において行うことができるが、それにはチャイニーズハムスターの卵巣細胞、幼若ハムスターの腎臓細胞、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３又はＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）のようなヒト細胞が含まれるが、これらに限定されるものではない。例えば、昆虫細胞又は酵母のような下等な真核細胞における発現も可能である。例えば、特定の原核宿主のようなシアリル化酵素の天然の欠損によって、又はそうでなければシアリル化蛋白質を産生することが可能である宿主の突然変異誘発若しくは遺伝的改変によって、シアリル化欠損細胞系により低いシアル酸含量を有するＥＰＯ様分子の産生を行ってもよい。組換え蛋白質を産生する方法及び手段は文書で十分記載されており、当業者に既知であり、また、本発明の範囲から逸脱することなくＥＰＯ様蛋白質について異なった供給源を使用することが可能であることは当業者に明らかであろう。本発明の１つの観点では、本発明に係る方法によってＥＰＯ様分子が産生され、それによって所定の翻訳後修飾を持つ分子を生じる。本発明のもう１つの観点では、エリスロポエチン様分子を含む組成物は、ヒト又は動物の被験対象にいったん非経口的に投与されるとエポエチンα及びエポエチンβよりも速い速度で血流から消失するエリスロポエチン様分子の存在を特徴とする。血流中からのクリアランスは、当該技術で周知の方法、例えば、実施例１８で行われたような血中における蛋白質の半減期を決定することによって測定することができる。健常な志願者では、エポエチンαは、反復した静脈注射の後、約４時間の循環半減期を有する。慢性腎不全患者では約５時間及び子供では約６時間の半減期が報告されている。実施例８の方法を用いて我々は、エポエチンα（エプレックス）について１８０分の半減期を測定している。この方法を用いて、本発明の組成物の半減期を測定し、この半減期を時間、又は標準ＥＰＯ（エプレックス）の半減期のパーセンテージで表現することができることは、当業者に明らかなはずである。ヒトにおける半減期を決定するために、ヒトにおいて同様の実験を実行する事が可能である。

２アンテナ型構造に対する４アンテナ型構造の比率が小さいエリスロポエチン様分子も、血漿において短い半減期を有する（Misaizu et al. 1995; Takeuchi et al. 1989）。そのような低い比率を生じる細胞株でＥＰＯの産生を行う事が可能であり、又は別の方法では、４アンテナ型構造をより多く含有する形態からこれらの形態を精製する。２アンテナ型構造を相対的により多く含むそのような組成物も本発明に従って有用である。本発明の利点の１つは、例えば、エプレックス、プロクリット、ＮＥＳＰのような現在使用されているＥＰＯの形態に比べて、循環中でのエリスロポエチン様分子の最大濃度により高いことであることも明らかであろう。前記治療に高濃度のＥＰＯ様分子が所望であれば、本発明の組成物の高用量を、例えばそのような高用量を含有する医薬製剤の形態で投与することにより行うことができる。現在使用されているＥＰＯ様分子の蛋白質含量を基にして同様の用量を投与すると、結果として更に高い赤血球生成を招くことになるが、それは前記治療に対する望ましくない副作用である。

本発明はまた、前記エリスロポエチン様分子を含む医薬組成物、及び前記群から選択される障害を治療する又は予防する方法、並びに人体又は動物の生体の予防的及び／又は治療的な処置のためのエリスロポエチン様分子の組成物を提供する。

実施例１．ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞におけるマーカー蛋白質の発現に関する検討
ヒトのアデノウイルス５型のＥ１領域で形質転換され、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞株（ＥＣＡＣＣ、Ｎｏ．９６０２２９４０として寄託されているような）を生じる結果となった細胞は、ヒトの胎児網膜から得た。一般的に網膜は、神経細胞及び線維芽様細胞を含めて多数の異なった細胞種（少なくとも５５の異なった神経系のサブタイプ）を含む（Masland, 2000）。ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）の細胞起源を辿るために、検討を行って細胞中又は細胞上におけるマーカー蛋白質の発現を調べた。これらのマーカーは、特定の細胞種及び／又は組織に特徴的であることが当該技術で既知である。マーカー蛋白質を表Ｉに示す。

マーカー蛋白質に対する抗体を用いてマーカー蛋白質の発現を調べた。各実験では、陰性対照（抗体と一緒にインキュベートしなかったＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞）及び陽性対照を共に用いた。これらの陽性対照は、マーカー蛋白質を発現することが既知であるヒトの組織の切片である（表ＩＩ）。

培地チャンバー（ライフテクノロジーズ、ヌンクラボテック［Nunc Lab-Tek］、チャンバースライド、放射線滅菌、２つの培地チャンバー、カタログ番号１５４４６４Ａ）の中におけるガラススライド上で、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞を培養した。６５〜７０％の集密度（confluency）でＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞を播き（培養チャンバー当たり２ウエル）、３７℃（１０％ＣＯ_２、９５％空気）にて２４時間培養した。培地を吸引し、細胞の付いたガラススライドを滅菌ＰＢＳで洗浄し、培地チャンバーから取り出して風乾させた。アセトン中で２分間インキュベートすることにより細胞をガラススライドに固定化した。風乾後、アルミホイルでスライドを包み、使用まで−１８℃以下の温度で凍結した。

エラスムス（Erasmus）大学基礎医学病院（オランダ、ロッテルダム）の病理部門における通常的使用のために調製された組織スライドのバンクから、陽性対照の組織を入手した。通常の手順に従って凍結切片を調製し（５μｍ）、アセトンで固定した。

一次抗体、それらの各々のマーカー蛋白質、供給業者及び抗体のカタログ番号を表ＩＩＩに示す。表ＩＩＩに詳説されている希釈は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、１％ウシ血清アルブミンで行った。一次抗体とのスライドのインキュベートは室温にて３０分行い、ＰＢＳで洗浄し、二次抗体と共にインキュベートした。これらの二次抗体は、使用した一次抗体の性質によって、ヤギ抗ウサギ（ダコ［Dako］Ｅ０４３２；１：５０の希釈）又はヤギ抗マウス（ダコＥ０４３３；１：５０の希釈）のいずれかであった。二次抗体はビオチンに結合した。ＰＢＳで洗浄した後、アルカリホスファターゼ（ダコ、Ｋ０３７６）を結合させたストレプトアビジン−アビジン／ビオチン複合体と共に、スライドをインキュベートした。３０分インキュベートした後、トリス／ＨＣｌ、ｐＨ８．０で試料を洗浄し、暗室で３０分間、フクシン基質のクロマジェン（ダコ、Ｋ０６２４）で発色させた。続いて、水道水にて２分間スライドを洗浄し、当業者に周知の通常の手順に従ってヘマトキシリンで対比染色した。次いで、顕微鏡でスライドを調べ、マーカー蛋白質の発現についてスコア化した（陽性又は陰性）。結果を表ＩＶに提示する。ニューロフィラメントの染色については（陽性）、細胞集団の細胞周期又は成熟段階が異なっている結果として、全てのＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞が陽性に染色されたわけではなかった。これはニューロフィラメントの染色についての正常な所見である。

得られたデータから、細胞がビメンチン、シナプトフィシン、ニューロフィラメント、ＧＦＡＰ及びＮ−ＣＡＭについて陽性に染色されたので、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞は神経起源であると結論付けられた。

実施例２．エプレックスと比べた、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）ＥＰＯに由来するＮ−グリカンの単糖類組成物
ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）により産生されるＮ−グリカン構造を特徴付ける第１工程は、種々の単糖類のモル比の測定である。単糖類の分析は、パルス状の電流検知を伴う高速陰イオン交換クロマトグラフィ（ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ）を用いて行った。ＤＭＥＭ及び／又はＪＲＨ培地中のＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞に由来するクローン、Ｐ７、Ｐ８及びＣ２５（Ｐ７及びＰ８はＷＯ００／６３４０３に記載されており、Ｃ２５はネオマイシン耐性遺伝子を選抜マーカーとして用い［プラスミド、ｐＥＰＯ２００１／Ｎｅｏ］、これらの方法に従って一般的に作製した）により産生されるＥＰＯ試料を、この分析のために選択した。市販の、ＣＨＯに由来する組換えエリスロポエチンであるエプレックス（ヤンセン・シラグ社）を並行して用い、参照として使用した。

マウスのモノクローナル抗ＥＰＯ（ＩｇＧ１）抗体を結合したＣ４セファロースビーズ（４ｍｌのカラム体積、アマシャム・ファルマシア・バイオテック[Amerhsam pharmacia Biotech]）を充填したカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィにより、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯ試料を精製した。結合したＥＰＯ分子を０．１Ｍのグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．７で溶出し、リン酸ナトリウム／カリウム緩衝液、ｐＨ８．０を添加することにより、得られた画分を直ちに中和した。それに続いて、ＥＰＯを含有する画分をプールし、ハイプレップ（Hiprep）２６／１０脱塩カラム（アマシャム・ファルマシア・バイオテック）を利用して、緩衝液を０．１％（ｖ／ｖ）のツイーン２０を含有する２０ｍＭのトリス−ＨＣｌに交換した。

グリカンの分析のために、精製したＥＰＯ試料をミリＱ等級の水に対して一晩透析し、スピードバックエバポレーターで乾燥した。乾燥したＥＰＯ試料（３９〜１０５μｇの範囲にわたる量）をインキュベート用緩衝液（１：１希釈のＣ３プロファイリング緩衝液、グリコ［Glyko］）に溶解した。それぞれの最終濃度が０．１％（ｗ／ｖ）及び０．３％（ｖ／ｖ）となるように、ドデシル硫酸ナトリウム及びβ−メルカプトエタノールを添加し、１００℃にて５分間、試料を変性させた。その後、ノニデットＰ−４０（ＢＤＨ）を最終濃度が０．７５％（ｖ／ｖ）になるように加え、Ｎ−グリカナーゼＦ（ｍＵ、グリコ）を用いて３７℃にて一晩ＥＰＯを脱グリコシル化した。脱グリコシル化の際、パッカー（Packer et al. 1998）らに従って、黒鉛化したカーボンブラック（カルボグラフ［Carbograph］）ＳＰＥカラム（アルテック［Alltech］）を用いて、蛋白質、塩及び界面活性剤から放出されるＮ−グリカンを分離した。

精製したＮ−グリカン鎖を、２Ｍのトリフルオロ酢酸中１００℃にて４時間の加水分解した。加水分解の後、スピードバックエバポレータで単糖類を乾燥し、水で洗浄して再びスピードバックで蒸発させた。乾燥した単糖類を２６μｌのミリＱ等級の水に溶解した。内部標準として使用される６μｌのデオキシグルコース（１００ｎｍｏｌ／ｍｌ）を添加した後、直径２ｍｍのカルボパックＰＡ１カラム（ディオネックス[Dionex]）と共に、試料（２４．５μｌ）をＨＰＡＥＣ−ＰＡＤシステムに適用した。０．２５ｍｌ／分の流速にて１６ｍＭのＮａＯＨ（ベーカー[Baker]）で、定組成的にカラムを作動させた。フコース、デオキシグルコース、ガラクトサミン、グルコサミン、ガラクトース及びマンノースから成る単糖類標準の混合物で得られたものとプロフィールを比較することによって、単糖類組成を計算した。

単糖類の分析により、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯのグリコシル化状況がエプレックスとは有意に異なっていることが示された（表Ｖ）。示された単糖類（Ｍａｎ＝マンノース、Ｆｕｃ＝フコース、ＧａｌＮＡｃ＝Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、ＧｌｃＮＡｃ＝Ｎ−アセチル−グルコサミン、Ｇａｌ＝ガラクトース）の比は、３Ｍａｎに標準化した。２つ値があるものは括弧内に入れてある。ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯ試料は、かなりの量のＧａｌＮＡｃを含有するが、エプレックスのＮ−結合型の糖はこの残基を欠く。このことは、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯがいわゆるＬａｃｄｉＮＡｃ（例えば、ＧａｌＮＡｃβ１−４ＧａｌＮａｃ）構造を含有することを示唆している。ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯのもう１つの特徴は、表Ｖに示されるように、フコース残基が相対的に豊富なことである。このことは、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯのＮ−グリカンにおいてルイス構造が存在することを強く示している。それにひきかえ、エプレックスはルイス構造を欠くことが知られている。その結果、エプレックスで見い出されるフコースは、Ｎ−グリカン核のフコシル化に起因するのみでありうる。とりわけ単糖類の分析データは、培養条件がＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）におけるＥＰＯのグリコシル化状況に影響を及ぼすことも実証した。培養条件が産生された蛋白質上に存在する所定の翻訳後修飾が単独で関与すると結論付けるべきではない。当然その細胞株は、転移酵素のような特定の特異的グリコシル化酵素の存在を介して、そのような細胞上で産生された蛋白質の翻訳後修飾を改変することができるはずである。培養条件は単に追加的な活性を発揮することができる。例えば、ＥＰＯ産生クローンをＪＲＨエクセル５２５培地で（浮遊させて）培養すると、ＤＭＥＭで（付着させて）培養された細胞に由来するＥＰＯのＮ−結合型の糖に比べて、ＥＰＯのＮ−結合型グリカンは、高レベルのＧｌｃＮＡｃ、ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌ及びＦｕｃを含有することが見い出された（表Ｖ）。この効果はクローンＰ８の場合には特に明らかである。細胞をＪＲＨ培地中で培養した場合、ＧｌｃＮＡｃのレベルの上昇は、Ｎ−結合型の糖の分枝が増加している及び／又はＮ−結合型の糖がさらに多くのラクトサミンの繰り返しを含有することを示唆してもよい。Ｎ−アセチルグルコサミン化及び（Ｎ−アセチル−）ガラクトシル化の上昇は、言い換えればフコースアクセプター部位の数の増加を生じ、それによってＦｕｃ含量の増加に対する説明を提供する。

実施例３．ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯとエプレックスのＮ−グリカンの間の構造的差異を明らかにするための質量分光分析
ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）により産生されるＮ−グリカンの構造に関する更に詳細な情報を得るために、ＭＡＬＤＩ−ＭＳによってＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯの完全な糖鎖を分析することを決定した。この分析のために、ＤＭＥＭ中のＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）に由来するクローンＰ７及びＰ８により作製され、陰イオン交換クロマトグラフィ（以下に記載するような）でさらに分画した、アフィニティ精製したＥＰＯ試料を利用した。実施例２に記載されるようにアフィニティー精製したＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯ試料を、その後、その緩衝液をＰＢＳに変換して、ハイトラップ（Hitrap）セファロースＱのＨＰカラム（アマシャム・ファルマシア・バイオテック）を用いて陰イオン交換クロマトグラフィーにかけた。４５ｍＭのＮａＣｌ（分画１）で開始し、それに続く７５ｍＭのＮａＣｌ（分画２）、および１３５ｍＭのＮａＣｌ（分画３）で終了する２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ／２０μＭのＣｕＳＯ_４における段階勾配により、３つのＥＰＯのサブフラクションが得られた。勾配の各段階は、１ｍｌ／分の流速で１０分間続けた。４回の作動の画分１をプールＡにまとめ、画分２をプールＢに、画分３をプールＣにまとめた。その後、ハイプレップ２６／１０脱塩カラム（アマシャム・ファルマシア・バイオテック）を利用して、得られたプールＡ、Ｂ及びＣを脱塩した。Ｎ−グリカナーゼＦ処理によりＮ−結合型グリカンをＥＰＯのプールから放出させ、ノイラミニダーゼ処理により脱シアリル化した。参照としてエプレックスを並行して分析した。種々のＥＰＯ試料の代表的な質量スペクトルを図１Ａ〜Ｇ：エプレックス及び精製したもの、分画したもの（陰イオン交換クロマトグラフィカラムからのプールＡ、Ｂ及びＣ）に示す。ＤＭＥＭで培養した示されたクローンに由来するＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯ試料をグリカナーゼＦ及びノイラミニダーゼで処理し、その後、ＭＡＬＤＩ−ＭＳにより分析した。記号（エプレックスのスペクトルで描かれている）は：黒四角がＧｌｃＮＡｃであり、白丸がＭａｎであり、黒丸がＧａｌであり、白三角がＦｕｃである。エプレックスのＮ−結合型の糖の質量プロフィール（図１Ａ）は、以前公開されたデータに一致し、ラクトサミンの繰り返しを有するまたは有さない４アンテナ型の糖がこのＥＰＯ調製物では優勢であることを示している。エプレックスとＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯは、類似する質量の糖構造を含有するが（図１Ｂ〜Ｇ）、後者の糖構造のプロフィールの方がはるかに複雑であるということは、これらの糖の異質性の程度が大きい事を表すと示唆している。観察された質量（表ＶＩ及びＶＩＩ）に基づいて糖の組成を予測するのに、ＥｘＰＡｓｙのコンピュータープログラムを用いた。各プール中の異なったオリゴ糖の相対量も提示した。データにより、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯに由来するＮ−結合型オリゴ糖はほとんど複数のフコース残基を含有することが実証された（表ＶＩ及びＶＩＩ、ｄＨｅｘ残基のレベルを参照のこと）。一部のグリカンはさらに四重にフコシル化されていた。その結果、これらのデータは我々の単糖類の分析と一致し、ＥＰＯが超フコシル化されており、従って、いわゆるルイス構造を有するＮ−グリカンで広範に修飾されている可能性が最も高いことを強く示唆している。（シアリル化された）ルイスＸエピトープを持つオリゴ糖は、炎症反応及び免疫反応の双方において細胞−細胞の接着に介在するセレクチンの必須認識配列として知られ（Varki et al. 1999）、脳の糖蛋白質に特徴的に見い出される（Margolis & Margolis, 1989）。従って、これらのルイスＸ構造を持つ多数の糖蛋白質は、抗炎症活性及び免疫抑制活性を呈することによって治療潜在力を有することが示されてきた。ここでは、質量シグナルは特定の糖構造に常に明らかに割り当てられるとは限らない：例えば、ＧｌｃＮＡｃ及びＧａｌＮＡｃのような残基は同一の質量を有することを言及する。ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯの単糖類の分析によりＮ−結合型の糖におけるＧａｌＮＡｃの存在が示されたので、ピークの一部は、いわゆるＬａｃｄｉＮＡｃ（例えば、ＧａｌＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）構造を持つＮ−グリカンを表すことが予想される。例えば、〜２０３８及び〜２１８５（表ＶＩ及びＶＩＩ）の値のｍ／ｚを持つピークがＬａｃｄｉＮＡｃモチーフを持つＮ−グリカンである可能性が最も高い。さもなければ、これらのピークは、Ｇａｌ又はＧａｌＮＡｃが存在しないためにＧｌｃＮＡｃで終了する４アンテナ型構造を表すであろう。そのような構造は不完全なグリコシル化に依存して存在してもよいが、近位Ｆｕｃの存在は、ルイス構造の形成を触媒するフコシル転移酵素（ＦＵＴ）によって認識されるモチーフを形成するのに必要なＧａｌ残基又はＧａｌＮＡｃ残基を、糖が含有することを含蓄している。

特定のピークの相対的な高さが異なることによって判断されるように、異なった糖の相対的な存在は２つの独立したＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）クローンの間で異なる。特にＬａｃｄｉＮＡｃモチーフを持つ推定上２アンテナ型の糖（図１；表ＶＩ及びＶＩＩ、〜２０３８及び〜２１８５のｍ／ｚ値をもつシグナル）が、Ｐ８に由来するＥＰＯ試料における主な糖である一方で、Ｐ７試料では、これらの構造は極めて少ない。後者のクローンでは、完全にガラクトシル化された４アンテナ型グリカンに推定上相当する〜２５４１のｍ／ｚ値を持つピークが最も豊富な構造だった。これらのデータは、ＤＭＥＭ中で増殖させると、Ｐ８は、Ｐ７−ＥＰＯに由来するものよりも分枝度が少ないグリカンを持つＥＰＯを産生する（表Ｖ）ということを既に示した我々の単糖類の分析と一致している。

実施例４．ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯとＣＨＯ−ＥＰＯのシアル酸含量の比較
３〜１０のリニアーなｐＨ勾配を有するＩＰＧストリップ（アマシャム・ファルマシア・バイオテック）を用いた等電点電気泳動法により、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯのシアル酸含量を分析し、チャイニーズハムスターの卵巣細胞に由来するエリスロポエチン（ＣＨＯ−ＥＰＯ）と比較した。等電点分画後、ＥＰＯのアイソフォームをニトロセルロース上に受動的にブロットし、ＥＰＯ特異抗体及びＥＣＬを用いて視覚化した（図２）。安定してＥＰＯを発現している４つの異なったＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）クローン（レーンＣ、Ｄ、Ｅ及びＦ）、及び３つの異なったＣＨＯクローン（レーンＧ、Ｈ及びＩ）により作製されたＥＰＯを等電点電気泳動によって分析し、シアル酸含量を決定した。ＥＰＯを産生するＣＨＯ細胞株及びＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞株は、選抜マーカーとしてネオマイシン耐性遺伝子を用いて、ＷＯ００／６３４０３に記載された方法に従って一般的に作成された。ストリップ当たり１０００ｅＵのＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯ及び５００ｅＵのＣＨＯ−ＥＰＯを負荷した。５００ＩＵのエプレックス（レーンＡ）及びノイラミニダーゼ処理した（部分的に脱シアリル化した）エプレックス（レーンＢ）を用いて、種々のＥＰＯアイソフォームを同定した。等電点分画後、ニトロセルロースのフィルター上にＥＰＯをブロットし、ＥＰＯに対するモノクローナル抗体及びＥＣＬを用いて視覚化した。市販のＥＰＯであるエプレックス試料は、高度にシアリル化されたアイソフォームを含有する製剤であり、マーカーとして使用した。

結果は、ＣＨＯ細胞が分子当たり少なくとも１２までのシアル酸を含有するＥＰＯアイソフォーム（レーンＧ〜Ｉ）を作ることができることを実証し、モリモトら（１９９６年）のデータを裏付けている。それにひきかえ、８〜１０のシアル酸を持つ幾つかのアイソフォームがＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）により産生されたが、これらはフィルムの露光を延長した後でも表示Ｆ不十分であり、検出可能というのみであった（レーンＣ〜Ｆ）。その結果、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯはＣＨＯ−ＥＰＯよりもシアリル化がかなり少ないと結論付けることができる。

実施例５．ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞におけるα１，３−、α１，６−及びα１，２−フコシル転移酵素の活性
細胞のグリコシル化潜在力は、Ｎ−結合型の糖及びＯ−結合型の糖の段階を追った生合成に関与するグリコシル転移酵素の広範なレパートリーによって主として決定される。これらのグリコシル転移酵素の活性は、細胞株間で異なるので、異なった細胞株で産生される糖蛋白質は異なったグリカンを獲得する。本明細書で示されるデータに照らして、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯのグリカンが多くフコシル化されていることを実証して、当業者に一般に既知である方法を用いて（Van den Nieuwenhof et al. 2000）、Ｎ−結合型の糖の合成に関与する多数のフコシル転移酵素（ＦＵＴｓ）の活性を分析した。この研究では、我々は、Ｎ−グリカンの核のフコシル化に関与するα１，６−ＦＵＴ、末端ガラクトース残基のキャッピングに介在し、いわゆるルイスＹエピトープを生じるα１，２−ＦＵＴ、及びルイスＸ構造を生じるα１，３−ＦＵＴの活性を検討した。比較のために、我々はＣＨＯ細胞に存在する相当するＦＵＴの活性も分析した。

グリコシル転移酵素活性のアッセイを用いて、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）及びＣＨＯの細胞抽出物中における対応するＦＵＴの活性を測定した。このアッセイは、糖類（この場合、フコース）と糖基質との間のグリコシル転移酵素が触媒する反応を測定する。内部対照としてＧａｌＴ活性も測定した。値は２回の実験の平均値を表す。値はすべて、特にＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）の値が、２回目の実験で２〜３倍低かった。特に、活性は蛋白質のｍｇ（細胞抽出物に存在する）当たりで表した。ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞の方がＣＨＯ細胞よりもはるかに大きいので、ＣＨＯ細胞及びＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞のＦＵＴ活性及びＧａｌＴ活性の間の差異は、それらの見かけよりも大きいか又は小さくてもよい。グリコシル転移酵素活性のアッセイの結果を表ＶＩＩＩに示し、結果は、ＣＨＯと同様にＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）も明らかなα１，６−ＦＵＴ活性を持つことを示し、それは双方の細胞株が核フコシル化されたグリカン鎖を生じることができることを示唆している。しかしながら、α１，３−ＦＵＴはＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞でのみ明らかであり、ＣＨＯ細胞ではほとんど検出不可能であった。２つの細胞株は双方とも、α１，２−ＦＵＴ活性を示さなかった。総合すると、これらのデータは、ＣＨＯとＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）のグリコシル化潜在力の間の差異を示しており、何故ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯはＣＨＯが産生したＥＰＯ（エプレックス）よりも多量のフコースを含有するのかを説明するものである。

実施例６．ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯ上に存在するルイスＸエピトープを持ったグリカン
ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）は、α１，２−フコシル転移酵素活性ではなく、α１，３−フコシル転移酵素活性を持つので、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）はルイスＹエピトープの代わりにルイスＸを含有するＮ−グリカン鎖を産生する可能性が高い。我々は、ウエスタンブロットを用いて、ルイスＸ構造を特異的に認識するマウスのモノクローナル抗体（抗ルイスＸ、ヒトＩｇＭ；カルビオケム［Calbiochem］）でＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯを標識することによりこれを証明した。無処理の（−）又はＨＣｌで処理した（＋）、同量のＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯ（クローンＰ７に由来する、ここではＰ７．１００として示される）及びエプレックスをＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で流し、当業者に既知の方法を用いてニトロセルロース膜上にブロットした。モノクローナル抗体（抗マウスＩｇＭ、カルビオケム）及びＥＣＬ（アマシャム・ファルマシア・バイオテック）を用いてルイスＸエピトープを検出した。図３に見ることができるように、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯだけがルイスＸエピトープに特異的な抗体で標識された。分子量マーカー（５２、３５及び２５ｋＤａ）の位置を示す。α１，３−フコース結合は酸に不安定なので、ＨＣｌで処理した後、シグナルを喪失した。

実施例７．ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞の細胞表面でのルイスＸ構造の発現
ルイスＸ構造が一般にＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞に存在するのかどうかを突きとめるために、我々はＣＨＯ細胞及び通常（すなわち、ＥＰＯを産生していない）のＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞の表面をルイスＸ特異抗体（カルビオケム）で標識した。一次抗体（０．１６μｇ／ｍｌで使用されたｍＡｂ抗ルイスＸ、５μｇ／ｍｌで使用されたｍＡｂ抗ルイスＸ）と共に細胞をインキュベートした。ＦＩＴＣを結合した抗ＩｇＭを二次抗体として用いた。標識した細胞をＦＡＣＳで解析した。破線は、二次抗体のみと共にインキュベートした細胞のシグナル（陰性対照）を表す。図４に示された結果は、これらの構造を生じることができないＣＨＯ細胞とは対照的に、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞は抗体で強く標識されることを示した。とりわけ、我々は、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞がルイスＸ抗体での染色で異質なパターンを呈することを繰り返し観察した。シリアルルイスＸ構造に特異的な抗体（カルビオケム）による標識は、極めて高い抗体濃度を使用した場合のみ、中程度の陽性シグナルが得られた。

実施例８．低酸素条件下で培養したＮＴ２細胞及びｈＮＴ細胞における試験管内でのＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯ（脳型）によるアポトーシスの阻害
低酸素条件下での、及びグルコース枯渇による細胞死からラット、マウス及びヒトの皮質神経系細胞を保護する試験管内での活性についてＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）が産生する（脳型）ＥＰＯと血清型ＥＰＯを比較する。これに関して、他に者によって（Koretz et al. 1994; Nagayama et al. 1999; White et al. 1996）記載されたように、ラットの胎児から神経系細胞の培養物を調製する。ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）が産生した脳型ＥＰＯと血清型ＥＰＯの効果を評価するために、精製したＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）が産生した３０ｐＭの脳型ＥＰＯ、又は３０ｐＭのエプレックスの非存在下又は存在下で、３０ｍＭのグルコースを加えた無血清培地にて湿った９５％空気／５％ＣＯ_２（正常酸素）又は３０ｍＭのグルコースを加えずに及び湿った９５％Ｎ_２／５％ＣＯ_２（低酸素及びグルコース枯渇）にて、水ジャケットと取り付けたインキュベーター内の規格寸法のインキュベーターのチャンバーにおいて３７℃で４８時間、細胞を維持する。細胞培養を低酸素及びグルコース枯渇に２４時間未満暴露し、その後、残りの２４時間、正常酸素条件に戻す。代謝活性の機能として細胞の生存率を伝えるアラマー（Alamer）ブルーの蛍光によって細胞傷害性を分析する。

もう１つの方法では、種々の濃度の、精製したＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）が産生する脳型ＥＰＯ又はエプレックスの、非存在下又は存在下にて、正常酸素条件において、神経細胞培養を１ｍＭの１−グルタメート又はα−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチルイソキサゾール−４−プロピオン酸（ＡＭＰＡ）に暴露する。代謝活性の機能として細胞の生存率を伝えるアラマーブルーの蛍光によって細胞傷害性を分析する。ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯで処理した細胞の生存率はエプレックスで処理した細胞の生存能力に類似することが予想される。

実施例９．血清型ＥＰＯと比べた、ラットにおける赤血球生成の刺激におけるＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯ（脳型）の活性
赤血球の生成を刺激する組換えヒトＥＰＯの潜在能力は、バルボン（Barbone et al. 1994）らによって記載されているげっ歯類のモデルによってモニターすることができる。このモデルによれば、組換えヒトＥＰＯ製剤の生物活性の尺度として網状赤血球の数の増加を使用する。網状赤血球は赤血球の前駆体であり、ＥＰＯに反応したその生成は、赤血球の生成を刺激するＥＰＯの潜在能力に対する尺度として用いることができる。赤血球生成の増加は言い換えれば、さらに高いヘマトクリット値を招く。

ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯ及びエプレックスの活性を、３匹のＷＡＧ／Ｒｉｊ系ラットの６群において比較した。０日、１日及び２日に、種々の用量のＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯ（Ｐ７−ＥＰＯ）、エプレックス及び陰性対照としての希釈緩衝液を、陰茎静脈に静脈注射した。市販のＥＰＯ特異的なＲ＆ＤのＥＬＩＳＡキットにより決定した５、２５又は１２５ｅＵ（ＥＬＩＳＡの単位）にてＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯを投与したが、一方、エプレックスは１又は５ｅＵの用量で投与した。ＥＰＯ製剤はすべて、５００μ１の総容積で、ＰＢＳ／０．０５％ツイーン８０において適当な濃度に希釈した。３日目に舌穿刺により２５０μｌのＥＤＴＡ血液を採取した。同日、赤血球総数中の網状赤血球の比率を決定した。

図６（棒は赤血球総数に存在する網状赤血球の比率を示す）に示されるように、総期間３日間について、ラットへ１ｅＵのエプレックスを毎日投与すると、希釈緩衝液のみを投与されたラットにおける網状赤血球の数に比べて、４日目の網状赤血球の数に有意な増加が誘発された。エプレックスの用量を５倍に増すことによって網状赤血球の数は一層さらに増加した（ブーストされた）。等価の量のＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯを用いると、網状赤血球の数の増加は明らかに低かった。１ｅＵのエプレックスと２５ｅＵのＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯを用いた場合、似たような網状赤血球の増加が認められたということは、赤血球の生成の刺激において、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯはエプレックスよりも２５倍活性が低いことを示している。赤血球の生成を刺激することにおけるエプレックスとＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯとの間の潜在能力の差異は、さらに高い用量（例えば、５ｅＵのエプレックスと１２５ｅＵのＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯ）で一層さらに顕著であった。

実施例１０．実験的クモ膜下出血に続く脳虚血におけるＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯの効果
血清型ＥＰＯよりもＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯの方が脳虚血の間の神経保護において更に有効であることを示すために、我々は、クモ膜下出血により誘発された急性脳虚血のウサギモデルにおいて、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）が産生する脳型ＥＰＯと血清型ＥＰＯの全身性投与の効果を比較する。従って、４群（ｎ＝８）に分けた３２匹の動物を調べる。
第１群：くも膜下出血；
第２群：くも膜下出血に加えてプラセボ；
第３群：くも膜下出血に加えて組換えヒト血清型ＥＰＯ；及び
第４群：くも膜下出血に加えて組換えＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）産生ＥＰＯ

実験的くも膜下出血は、動物を麻酔した後、自己血液を大槽（cisterna magna）に経皮注入することによって作製する。注入後、１５分間、腹側を下にして寝かせ、腹側に血餅を形成させる。くも膜下出血の誘発後５分において、第２群、第３群及び第４群の動物にそれぞれ、希釈緩衝液、エプレックス及び精製したＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）産生の脳型ＥＰＯを注射し、その後８、１６及び２４時間続行する。注射はすべて腹腔内に投与する。希釈緩衝液は、血清アルブミン（２．５ｍｇ／ｍｌ）、塩化ナトリウム（５．８４ｍｇ／ｍｌ）、無水クエン酸（０．０５７ｍｇ／ｍｌ、Ｈ_２Ｏ）から成る。くも膜下出血後２４時間で動物を安楽死させ、脳を取り出す。その後、凍結ミクロトームで冠状に１０〜２５μｍで切片にするが、それは十字縫合（ブレグマ）で開始し、後方に続け、小脳を含める（Ireland & Macleod 1993）。虚血が誘発した損傷ニューロンの数を視覚化し、評価するために、切片をヘマトキシリンとエオシンで染色する。十字縫合の後方の幾つかの冠状レベルで得た側面皮質の５つの無作為に選択した切片において、高性能の顕微鏡の視野（１００ｘ）当たりの核濃縮の核を含有するエオシン好性の特性を持つニューロンのプロファイルを測定する。ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯで治療した動物は、治療しなかった動物又はプラセボで治療した動物よりも、損傷を受けたニューロンの数が少ないことが予想される。

実施例１１．新生児ラットの心筋細胞における低酸素／再酸化に続くエリスロポエチン受容体の発現
以前記載されたように（Simpson & Savion 1982）、１日齢のスプラーグ・ドーリー系ラットの心室から、新生児ラットの心筋細胞の一次培養を調製する。ガスパックプラス（Ga Pack Plus）（ＢＢＬ）を用い、＜１％のＯ_２及び５％ＣＯ_２／９５％Ｎ_２の密閉したプレキシガラスのチャンバーで３７℃にて２時間、心筋細胞をインキュベートすることにより、低酸素状態を作った。９５％の空気及び５％のＣＯ_２で飽和した培地に置き換えることにより、細胞を正常酸素雰囲気（再酸化）に暴露した。

氷冷ＰＢＳにより心筋細胞を２回洗浄し、トリゾール（Trizol、ギブコ）を用いて全ＲＮＡを単離し、クロロホルムにより抽出し、イソプロピルアルコールにより沈殿させる。ノーザンブロット解析のために、１５μｇのＲＮＡを１．５％のホルムアルデヒド／ＭＯＰＳ−アガロースゲル上で分離し、ニトロセルロースにブロットして、ＥＰＯ受容体用の^３２Ｐ標識したプローブ（±４００ｂｐのｃＤＮＡ断片）とハイブリッド形成させる。ｐＨ７．２のリン酸緩衝液中で６５℃にてハイブリッド形成を一晩行い、その後、室温にて２ｘＳＳＣで２回洗浄し、６５℃にて０．２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで２回洗浄し、室温にて２ｘＳＳＣで２回洗浄する。膜をＸ線フィルム（コダック）に暴露することにより、ハイブリッド形成のシグナルを視覚化する。発現レベルをＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルで補正する。

実施例１２．低酸素条件下で培養した、ラット新生児の心筋細胞におけるアポトーシスに対する脳型ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯ及び血清型ＥＰＯ（エプレックス）の効果
既に述べられたように（Simpson & Savion 1982）、１日齢のスプラーグ・ドーリー系ラットの心室から、新生児ラットの心筋細胞の一次培養を調製する。ガスパックプラス（ＢＢＬ）を用い、＜１％のＯ_２及び５％ＣＯ_２／９５％Ｎ_２の密閉したプレキシガラスのチャンバーで３７℃にて２時間、心筋細胞をインキュベートすることにより低酸素状態を創る。９５％の空気及び５％のＣＯ_２で飽和した培地に置き換えることにより、細胞を正常酸素雰囲気（再酸化）に暴露する。実験を４群に分ける：
Ａ）正常酸素条件下（９５％の空気／５％ＣＯ_２）で培養する心筋細胞；
Ｂ）３０ｐＭの精製したＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）産生ＥＰＯの存在下、低酸素／再酸化の条件下で培養する心筋細胞；
Ｃ）３０ｐＭの精製したエプレックスの存在下、低酸素／再酸化の条件下で培養する心筋細胞；及び
Ｄ）ＥＰＯの非存在下、低酸素／再酸化の条件下で培養する心筋細胞。

実験はすべて３連一組で行う。形態的解析、ＤＮＡのはしご化現象及び末端デオキシリボヌクレオチド転移酵素が介在するｄＵＴＰのニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）によってアポトーシスを定量する。形態的解析については、筋細胞の単層を固定し、ヘキスト３３３２４で染色する。アポトーシスの形態的特徴（細胞の収縮、クロマチンの濃縮、及び断片化）を蛍光顕微鏡で観察する。ディッシュ当たり無作為に選択した１２視野から少なくとも４００個の細胞を数える。

ＤＮＡのはしご化現象（アポトーシスに特徴的）の測定については、心筋細胞を溶解緩衝液で溶解し、２％アガロースゲルにて電気泳動する。ゲルを臭化エチジウムで染色し、紫外線光のもとでＤＮＡ断片を視覚化する。インジツ（in situ）での心筋細胞のアポトーシスの検出は、インジツ細胞死検出キット（ベーリンガーマンハイム[Boehringer Mannheim]）によるＴＵＮＥＬを用いて行う。

実施例１３．心筋虚血／再潅流のラットモデルにおける梗塞サイズに対するＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯ及び血清型ＥＰＯの効果
ペントバルビタールナトリウム（２０ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ）及び塩酸ケタミン（６０ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ）により、成熟オスのスプラーグ・ドーリー系ラット（３００〜４００ｇ）を麻酔する。頚静脈及び気管に挿管し、３．５％〜５％の間に呼気ＣＯ_２を調整したげっ歯類用の人工呼吸器により通気を１００％酸素に維持する。左開胸術を行い、左冠状動脈の根本から３〜４ｍｍを縫合した。虚血の５分前に種々の濃度のＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯ、血清型ＥＰＯ又は生理食塩水を動物に無作為に投与する（各群についてｎ＝６）。冠状動脈の周りの縫合を堅く締めることによって虚血（３０分）を開始し、引き続いて４時間の再潅流を行う。縫合を堅く締めないことを除き、同様にして偽手術ラットを用意する（ｎ＝６）。

再潅流後、パテントブルーバイオレット（５％）及び塩化トリフェニルテトラゾリウム（ＴＴＣ）で差次的に染色することにより梗塞のサイズを決定する。冠動脈の結紮を再び堅く締め、パテントブルーバイオレットを静注して心臓の正常に潅流された領域を染色する。次いで心臓を取り出し、心房、大きな血管及び右心室を取り出す前に氷冷生理食塩水に漬ける。左心室は薄い切片にし、染色されない危険な状態の領域（ＡＡＲ）を正常に潅流された青い区分から分離して１〜２ｍｍ^３の小片に切断し、ＴＴＣと共にインキュベートする。解剖顕微鏡によって、壊死領域（ＡＮ、青白い）をＴＴＣ陽性（赤レンガ色に染色）から分離する。次いで、心筋の全領域を個々に重量測定し、梗塞のサイズを算出する。

実施例１４．高いα１，３−結合型フコース含量を含有するＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯのグリコフォームの単離及び分画
高いルイスＸ及び／又はシアリルルイスＸ含量を持つＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯのグリコフォームを優先的に精製するために、フコース特異的なアレウリア・アウランチア（Aleuria aurantia）のレクチン（ＡＡＬ）を用いた。ＥＰＯを産生するＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞によって培養培地中に分泌されるＥＰＯを先ず細胞残渣からきれいにし、その他の混入物を、ヒトＥＰＯ特異的モノクローナル抗体を用いてアフィニティカラムクロマトグラフィーによって除いた（実施例２を参照のこと）。その後、約２７０μｇ（又は２７，０００ｅＵ）の精製ＥＰＯを第２のカラムクロマトグラフィーにかけ、固定化したＡＡＬを含有するカラム（ＡＡＬハイトラップ、バイオ・メド・ラボズ[Bio Med Labs]）に、０．１ｍｌ／分にてＥＰＯ分子を結合させた。ＡＡＬへの結合に対する競合物として、Ｌ−フコース（シグマ[Sigma]）を用いて、フコースを有するＥＰＯグリコフォームを溶出した。ＰＢＳにおける段階勾配（ギブコ[Gibco]、１５４ｍＭのＮａＣｌ、１．０５ｍＭのＫＨ_２ＰＯ_４、及び３．０ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４、ｐＨ＝７．４を含有する）を適用することにより、４つのＥＰＯサブフラクションを得たが、それは、６０μＭのフコース（分画１）に始まり、２００μＭのフコース（分画２）が続き、４００μＭのフコース（分画３）が続き、１０００μＭのフコース（分画４）で終了した。流速０．５ｍｌ／分にて、最初の段階の勾配を１０分間続け、その他の段階は５分間続けた。クロマトグラムの２１４ｎｍにおけるＵＶシグナルは、全ての画分毎にカラムから物質が溶出することを示した（図９を参照のこと）。０．５ｍｌ部分を回収し、２つ又は３つのピーク画分をプールした（図９を参照のこと）。

１０ｋＤａのミクロコン（ミリポア[Millipore]）を用いて画分の緩衝液を２０ｍＭのリン酸塩に変換し、同じミクロコンで画分を２０〜３０μｌに濃縮した。Ｎ−グリカナーゼＦ処理によってＥＰＯのプールからＮ−結合型グリカンを放出し、ノイラミニダーゼ処理によって脱シアリル化した。種々のＥＰＯ試料の代表的なＭＡＬＤＩ−ＴＯＦのＭＳスペクトルを図１０Ａに示す。各プールにおける異なったオリゴ糖の相対量も提示した（表ＩＸを参照のこと）。データは、ＡＡＬカラムからより遅く溶出する画分が、相対的により多くのフコース残基を含有することを実証している。例えば、カラムから遅く溶出する画分は、３つ又は４つのフコース残基を含有し、２５０７．９及び２９７８．１ダルトンでピークを生じるグリカンが多いが、１つのフコース残基しか含有しない１８９１．７及び２２１５．８の質量を有するグリカンがこれらの画分で現れる量は比較的少ない。従って、これらの画分にはいわゆるルイスＸ構造を有するＮ−グリカンが多い。ＰＮＧアーゼＦを用いて放出され、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦのＭＳで検出されるＮ−結合型グリカンにおけるルイスＸ構造のＥＰＯ分子当たりの平均数は、この実験については、画分１で２．２、画分２で２．７、画分３で３．６、及び画分４で４．１であった。出発物質はＥＰＯ分子当たり２．６のルイスＸ構造を含有していた。クローンＣ２５による別個の実験では、ルイスＸ構造が一層さらに増加した、ＥＰＯ分子当たりＮ−結合型グリカン上に５．７のルイスＸ構造を有する画分４が得られた（図１０Ｂにおけるスペクトル）。この方法は、蛋白質が産生される細胞によってもたらされるルイスＸ構造などの翻訳後修飾に特異的な特徴を用いることにより、培養培地からエリスロポエチンを精製することを可能にする。しかしながら、このことは、（所定）の翻訳後修飾を持つ蛋白質の適切な精製にほかの方法を採用することができないことを意味するのではない。

画分４に溶出された物質は、ＥＰＯの新規の形態を表しており；それは、〜２１８５ｋＤａの質量を持つ、言い換えれば双方のアンテナにＧａｌＮＡｃ−ルイスＸ構造を持つ複合型の２アンテナ型Ｎ−結合型の糖に相当するＮ−結合型グリカンを優位に含有する。画分４は、画分１〜４に溶出された全ＥＰＯの約８％を含有した。このことは、２アンテナ型のＧａｌＮＡｃ−ルイスＸ構造を優位に持つ、ＥＰＯの新規の形態はＥＰＯの少量の形態を表し、上述の方法を用いてそれを濃縮することができることを示している。

実施例１５．高いＬａｃｄｉＮＡｃ含量を持つＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯのグリコフォームの単離及び分画
いわゆるＬａｃｄｉＮＡｃオリゴ糖構造を持つＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯのグリコフォームは、これらＬａｃｄｉＮＡｃ構造に対するモノクローナル抗体を使用することによって特異的に単離される。例えば、９９−２Ａ５−Ｂ、１００−２Ｈ５−Ａ、１１４−２Ｈ１２−Ｃ、２５９−２Ａ１及び２７３−３Ｆ２（Van Remoortere et al. 2000）のようなマウスのモノクローナル抗体は、ＬａｃｄｉＮＡｃ構造を特異的に認識し、当業者に一般に既知の手順に従って精製され、ＣＮＢｒで活性化したセファロース４Ｂビーズに結合される。ヒトＥＰＯを産生するＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞によって培養培地中に分泌されるＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯを先ず細胞残渣から大雑把に分離し、その他の混入物をヒトＥＰＯ特異的モノクローナル抗体を用いたアフィニティーカラムクロマトグラフィーによって分離する。その後、ＬａｃｄｉＮＡｃ構造を持つＥＰＯ分子が固定化された、ＬａｃｄｉＮＡｃ特異的モノクローナル抗体を含有するカラムに結合する第２のカラムクロマトグラフィーに精製したＥＰＯをかける。ＬａｃｄｉＮＡｃ構造を欠くＥＰＯのグリコフォームはカラムに結合せず、通過物に回収される。ＬａｃｄｉＮＡｃ構造を持つＥＰＯグリコフォームは低いｐＨで、又はＬａｃｄｉＮＡｃ特異抗体に結合するための競合物として、ＧａｌＮＡｃ又は合成ＬａｃｄｉＮＡｃのオリゴ糖を用いることによりカラムから溶出される。溶出の間、ＧａｌＮＡｃ又はＬａｃｄｉＮＡｃの濃度を段階的に又は徐々に高めることにより、ＬａｃｄｉＮＡｃ構造を相対的に高い比率で持つＥＰＯグリコフォームがカラムから別に溶出される。さらに高い濃度のＧａｌＮＡＣ又はＬａｃｄｉＮＡｃにてＬａｃｄｉＮＡｃ構造を相対的に低い比率で持つＥＰＯグリコフォームよりも、ＬａｃｄｉＮＡｃ構造を相対的に高い比率で持つＥＰＯグリコフォームが溶出される。上述の方法に従って、この方法もまた、蛋白質が産生される細胞によってもたらされるルイスＸ構造及びＬａｃｄｉＮＡＣ構造のような翻訳後修飾の特異的な特徴を用いることにより、培養培地からエリスロポエチンを精製することが可能となる。

実施例１６．高いＧａｌＮＡｃ−ルイスＸ含量を有するＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯのグリコフォームの単離及び分画
いわゆるＧａｌＮＡｃ−ルイスＸオリゴ糖構造を持つＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯのグリコフォームは、これらＧａｌＮＡｃ−ルイスＸ構造に対するモノクローナル抗体を使用することによって特異的に単離される。例えば、１１４−５Ｂ１−Ａ、１７６−３Ａ７、２９０−２Ｄ９−Ａ、及び２９０−４Ａ８（Van Remoortere et al. 2000）のようなマウスのモノクローナル抗体はＧａｌＮＡｃ−ルイスＸ構造を特異的に認識し、当業者に一般に既知の手順に従って精製され、ＣＮＢｒで活性化したセファロース４Ｂビーズに結合される。ヒトＥＰＯを産生するＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞によって培養培地中に分泌されるＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯを先ず細胞残渣から大雑把に分離し、その他の混入物をヒトＥＰＯ特異的なモノクローナル抗体を用いたアフィニティーカラムクロマトグラフィーによって分離する。その後、ＧａｌＮＡｃ−ルイスＸ構造を持つＥＰＯ分子が固定化されたＧａｌＮＡｃ−ルイスＸ特異的なモノクローナル抗体を含有するカラムに結合する第２のカラムクロマトグラフィに精製したＥＰＯをかける。ＧａｌＮＡｃ−ルイスＸ構造を欠くＥＰＯのグリコフォームはカラムに結合せず、通過物に回収される。ＧａｌＮＡｃ−ルイスＸ構造を持つ結合したＥＰＯグリコフォームは低いｐＨで、又はＧａｌＮＡｃ−ルイスＸ特異抗体に結合するための競合物として合成ＧａｌＮＡｃ−ルイスＸを用いることによってカラムから溶出される。溶出の間、ＧａｌＮＡｃ−ルイスＸ競合物の濃度を段階的に又は徐々に高めていくことによって、高いＧａｌＮＡｃ−ルイスＸ含量を持つＥＰＯグリコフォームを別に溶出することができる。高いＧａｌＮＡｃ−ルイスＸ濃度にて、低いＧａｌＮＡｃ−ルイスＸ含量を持つＥＰＯグリコフォームよりも高いＧａｌＮＡｃ−ルイスＸ含量を持つＥＰＯグリコフォームが溶出される。再び、上述の方法に従って、この方法もまた、蛋白質が産生される細胞によってもたらされるルイスＸ構造、ＬａｃｄｉＮＡＣ構造又はＧａｌＮＡｃ−ルイスＸ構造のような翻訳後修飾の特異的な特徴を用いることにより、培養培地からエリスロポエチンを精製することを可能にする。しかしながら、このことは、（所定の）翻訳後修飾を持つその他の修飾を蛋白質の適切な精製に採用できないことを意味するものではない。

ＥＰＯに関する詳細な実施例によって本発明を説明してきたが、本発明は脳型の特徴を持つＥＰＯの製造及び精製に限定されないことは当業者によって理解されるであろう。脳並びに中枢性及び末梢性の神経系のその他の部分の障害及び／又は虚血／再潅流障害を受けた組織を治療することにおける使用方法が見い出されることのある、種々のそのほかの（ヒトの）治療用及び／又は診断用のペプチド及び蛋白質を、本発明の手段及び方法によって製造することができる。

実施例１７．ラットにおける中大脳動脈の閉塞後の梗塞サイズの低減において低いシアル酸含量を持つＥＰＯは高いシアル酸含量を持つＥＰＯと同様の効能を有する
２００１年シレン（Siren et al. 2001）らによって公開された方法に類似する方法を用いて、体重２００〜２５０ｇのＦ３４４／Ｉｃｏ系の雄ラットにて、中大脳動脈（ＭＣＡ）閉塞によって実験的に誘発した脳梗塞のサイズに対するＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯ及びエプレックスの効果を検討した。動物の右の頚動脈を永続的に閉塞し、一方、金属クリップを用いてＭＣＡを６０分間可逆的に閉塞した。ＭＣＡ閉塞の開始５分前に、体重ｋｇ当たり５０００ｅＵ（ＥＬＩＳＡ単位）の用量にて、分子当たり＜６のシアル酸の平均シアル酸含量を持つ精製したＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯ及びエプレックス（ヤンセン・シラグ；市販のＥＰＯ、分子当たり＞９のシアル酸の平均シアル酸含量を持つ）を静脈内に適用した。とりわけ、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯ製剤のシアル酸含量は分子当たり０〜９のシアル酸の範囲であったが、一方、エプレックスは分子当たり８より多いシアル酸を含有した。６０分後、ＭＣＡ周囲の金属クリップを取り除くことにより閉塞を終了した。クリップを除いた後、再潅流が顕微鏡的に認められた。２４時間後、生きているラットの脳をＭＲＩを用いて調べ、見かけの拡散係数（ＡＤＣ）及びＴ２地図を明らかにした。これらの地図を用いて梗塞容積を定量した（図７Ａ及び７Ｂ）。

図７Ａ及び７Ｂにおける結果は、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯ製剤及びエプレックス製剤で治療したラットは治療しなかった動物に比べて、梗塞サイズに同様の低減を呈したことを示す。ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯ製剤はエプレックス製剤よりもはるかに少ないシアル酸含量を有するので、この結果は、高いシアル酸含量が生体内におけるＥＰＯの神経保護的活性に必須ではないことを実証している。

実施例１８．ラットにおけるＥＰＯの半減期の決定
生体内におけるエプレックスの半減期を決定するために、ＰＢＳ／０．０５％ツイーン８０で最終容積５００μｌに希釈した１５０ｅＵのエプレックスを、オスのＷＡＧ／Ｒｉｊ系ラットに静注した。Ｌａｂ Ａｎｉｍａｌ３４、３７２に記載された技法を用いて、基質を投与する直前にＥＤＴＡ血液を２００μｌ採取した。同じ技法を用いて、注射後、ｔ＝５、１５、３０、６０、１２０、１８０、２４０、３００、３６０、４２０、４８０及び５４０分に、２００μｌのＥＤＴＡ血液を動物から採取した。最後の採血後、動物を殺処理した。採血の３０分以内にＲＴにて７６０ｘｇで１５分検体を遠心した。ＥＰＯ特異的ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ）で血漿試料を調べて各試料中のＥＰＯの濃度を決定した。

図８に示すように、血漿におけるエプレックスの濃度の低下は、分布相とクリアランス相を表す二相性曲線を示している。この結果に基づいて、エプレックスはクリアランス相の間に約１８０分の半減期を有していると推定することができる。同じプロトコールを用いてＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯの半減期を測定する。

実施例１９．ＨＴ１０８０細胞におけるＥＰＯのグリコシル化に対するＥ１Ａ発現の効果
アデノウイルス５型Ｅ１Ａ遺伝子（ｐＩｇ．Ｅ１Ａ．ｎｅｏ）又はＥ１Ａ＋Ｅ１Ｂ（ｐＩｇ．Ｅ１Ａ．Ｅ１Ｂ；米国特許第５，９９４，１２８号に記載された両プラスミド）遺伝子をコードする発現ベクターをＨＴ１０８０細胞に安定に形質移入し、グリコシル化におけるアデノウイルス５型Ｅ１Ａ遺伝子及び／又はＥ１Ａ＋Ｅ１Ｂ遺伝子の発現の効果を決定した。マーカー蛋白質のグリコシル化を追跡するために、ＥＰＯをコードする発現ベクター（ｐＥＰＯ２００１／ｎｅｏ）を細胞に共に形質移入した。対照のＨＴ１０８０細胞にはＥＰＯ発現ベクターのみを形質移入した。

細胞が７０〜９０％の集密度に達したとき、７．８５ｃｍ^２のディッシュ当たり１．０μｇのｐＥ１Ａ．ｎｅｏ又はｐＥ１Ａ．Ｅ１Ｂ及び１．０μｇのｐＥＰＯ２００１．ｎｅｏを用いて、リポフェクタミン（ギブコ）によって形質移入を行った。２、３、７、１０及び１３日目に培地を、ＤＭＥＭ、１％ＮＥＡＡ（非必須アミノ酸、インビトロゲン）２５０μｇ／ｍｌのゲネチシン（ギブコ）及び１０％ＦＢＳを含有する選抜用培地に交換した。安定的にＥ１Ａを形質移入したＨＴ１０８０細胞による予備実験は、Ｅ１Ａの発現が細胞の形態変化を誘発することを示した。フリッシュ（Frisch et al. 1991）らにより記載された所見に一致して、我々はＥ１Ａの安定した発現によって平坦な形態が誘導されることを観察した。この知識と共に、我々は平坦なクローンを選択することによりＥ１Ａ発現クローンに関する大雑把な選抜を行った。１４日目にクローンを選択し、２４穴プレートにおいて３７℃／１０％ＣＯ_２にて選抜用培地で培養した。

細胞がほぼ集密に達したとき、培地におけるＥＰＯの存在によってＥＰＯ産生細胞を選択した。ＥＰＯ特異的ＥＬＩＳＡ（クアンチキンＩＶＤヒトＥＰＯ−ＥＬＩＳＡ、Ｒ＆Ｄシステムズ）を用いてＥＰＯを測定した。ＥＰＯ産生の培養の規模を拡大し、Ｅ１Ａの発現を分析した。従って、１０ｍｌ当たり１錠のコンプリートミニプロテイナーゼ阻害剤（ロシュ・ダイアグノスティクス[Roche Diagnostics]）を添加した溶解緩衝液（１％のＮＰ４０、０．５％のデオキシコール酸、０．５％のＳＤＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのトリス塩酸、ｐＨ７．５）で細胞を溶解した。１４，０００ｇにて１０分間遠心することにより溶解物を透明化した。等量（蛋白質含量に基づいて）の透明化した細胞溶解物を還元条件下にて、１０％ビストリスゲル（ＮｕＰＡＧＥ、インビトロゲン[Invitrogen]）にて電気泳動した。その後、ＮｕＰＡＧＥのトランスブロットシステム（インビトロゲン）を用いて、蛋白質をＰＤＶＦ膜（Ｐ−イモビロン[Imobilon]）上に移した。ＴＢＳＴ中５％のプロチファー[Protifar]（ヌトリシア[Nutricia]）にて室温で１時間又は一晩、ブロット物をブロックし、次いで、５％プロチファー／ＴＢＳＴで１：４００に希釈したモノクローナルマウス抗ヒトＥ１ＡＩｇＧ２（クローンＭ７３、サンタクルーズ[Santa Cruz]）と共に、室温で１時間又は４℃で一晩インキュベートした。ブロット物をＴＢＳＴで洗浄し、５％プロチファー／ＴＢＳＴで１：１０００に希釈したペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（バイオラッド[Biorad]）と共に、室温で４５分間インキュベートした。ＴＢＳＴで洗浄した後、ブロット物をＥＣＬプラスシステム（アマシャム・ファルマシア・バイテック）で染色した。ＥＰＯ陽性Ｅ１Ａクローンの５５％及びＥＰＯ陽性Ｅ１Ａ．Ｅ１Ｂクローンの６８％がＥ１Ａの明瞭な発現を示した（表Ｘ）。高レベルでＥ１Ａを発現するＨＴ１０８０／Ｅ１Ａ−ＥＰＯクローン及びＨＴ１０８０／Ｅ１Ａ．Ｅ１Ｂ−ＥＰＯクローンは平坦な形態を呈した（例えば、図１１）。

グリカンの分析のためにＨＴ１０８０／ＥＰＯクローン、ＨＴ１０８０／Ｅ１Ａ−ＥＰＯクローン及びＨＴ１０８０／Ｅ１Ａ．Ｅ１Ｂ−ＥＰＯクローンによりＥＰＯを産生させた。従って、継代数（ｐｎ）７で１７５ｃｍ^２のフラスコに、ＨＴ１０８０／Ｅ１Ａ．ＥＰＯクローン００８、ＨＴ１０８０／Ｅ１Ａ．Ｅ１Ｂ．ＥＰＯクローン０７２及びＨＴ１０８０／ＥＰＯクローン０３３（表Ｘ）を播いた。２４時間後、細胞が６０〜８０％の集密度に達したとき、選抜用培地を生成用培地（ＤＭＥＭ、１％ＮＥＡＡ）に代えた。３日後、この培地を回収し、溶解緩衝液で細胞を溶解した。実施例２に従って、培地からＥＰＯを精製した。

Ｎ−グリカナーゼＦ処理により種々のＥＰＯ調製物のＮ−結合型グリカンを放出させ、続いてパルス電流検知を伴った高速陰イオン交換クロマトグラフィ（ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ；ディオネックス）によって分析した。この特別なクロマトグラフィシステムでは、ＥＰＯに由来するグリカン鎖はその電荷に基づいてアルカリ条件下で分離される。図１２に実証されるように、ＨＴ１０８０／Ｅ１Ａ−ＥＰＯ細胞により産生されるＥＰＯのグリカンは、対照のＨＴ１０８０／ＥＰＯにより産生されるＥＰＯのグリカンよりも荷電が少なく、それは、後者の細胞によって産生されるＥＰＯがＥ１Ａを発現している細胞によって産生されるＥＰＯよりも広範にシアリル化されていることを示している。ＥＰＯ調製物の糖鎖のＭＡＬＤＩ−ＭＳの解析によって、Ｎ−グリカンの構造に関する更に詳細な情報が得られた。Ｎ−結合型グリカンはＮ−グリカナーゼＦ処理によりＥＰＯ調製物から放出され、ノイラミニダーゼ処理によって脱シアリル化された。種々の代表的なＥＰＯ調製物の質量スペクトルを図１３に示す。ＧｌｙｃｏＭｏｄソフトウエア（ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｔｏｏｌｓ／ｇｌｙｃｏｍｏｄ）を用いて、観察された質量に基づいて糖の組成を予測した（表ＸＩ）。データは、対照のＨＴ１０８０／ＥＰＯ細胞によって産生されたＥＰＯのグリカンの質量スペクトルが、ＨＴ１０８０／Ｅ１Ａ−ＥＰＯ細胞及びＨＴ１０８０／Ｅ１Ａ．Ｅ１Ｂ−ＥＰＯ細胞により産生されたＥＰＯのグリカンとは異なることを示している。質量スペクトルは、対照細胞により産生されるＥＰＯに比べて、後者の細胞により産生されるＥＰＯが相対的に少ないヘキソースを持ち、相対的に多いデオキシヘキソースを持つことを示した。さらに、相対的に高い量のヘキソサミン及びデオキシヘキソースを含有する相対的に少ない質量を持つグリカン構造は、ＨＴ１０８０／Ｅ１Ａ−ＥＰＯ細胞及びＨＴ１０８０／Ｅ１Ａ．Ｅ１Ｂ−ＥＰＯ細胞によって産生されるＥＰＯに見い出された。これらの一部は対照細胞によって産生されるＥＰＯには存在しなかった。Ｅ１Ａ及びＥ１Ａ．Ｅ１Ｂを発現するＨＴ１０８０細胞によって産生されたＥＰＯのグリカンの質量プロフィールが、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞において産生されたＥＰＯのグリカンに似ているということは（実施例３を参照のこと）、前者の細胞により産生されるＥＰＯのグリカンがルイスＸ構造及びＬａｃｄｉＮＡｃ構造を含有し、並びに末端ガラクトースを欠く構造を含有することを示唆している。

Ｅ１Ａ及びＥ１Ａ＋Ｅ１Ｂを発現するＨＴ１０８０細胞によって産生されるＥＰＯが、対照ＨＴ１０８０細胞によって産生されるＥＰＯよりも多くのフコース及びＧａｌＮＡｃを含有することを裏付けるために、単糖類解析を行った。従って、Ｎ−グリカナーゼＦノイラミニダーゼ処理によってＥＰＯ調製物からＮ−結合型グリカンを放出させ、その後、加水分解してＨＰＡＥＣ−ＰＡＤによって分析した。図１４は、マンノースの量で標準化した、ＥＰＯグリカンの単糖類プロフィールを示す。データは、Ｅ１Ａ及びＥ１Ａ＋Ｅ１Ｂを発現する細胞によって産生されたＥＰＯのＮ−結合型グリカンが実際、相対的に高い量のフコース及びＧａｌＮＡｃを持つことを示している。

質量スペクトル及び単糖類のデータは、Ｅ１Ａ及びＥ１Ａ＋Ｅ１Ｂを発現する細胞によって産生されたＥＰＯが複数のフコース残基を含有することを強く示唆している。これらのデータを裏付けるために、ＥＰＯ調製物を末端α１−３とα１−４のフコース残基を切断するα−フコシダーゼ（アーモンドミール）で処理した。その後、試料をＭＡＬＤＩ−ＭＳにより解析し、その結果をα−フコシダーゼ処理をしなかったＥＰＯ調製物から得られた結果と比較した。図１５は、α−フコシダーゼ処理した後、アンテナ型フコースを持つＮ−グリカンを表すピークが低下し、これらの構造に由来するピークが増加したことを示している。例えば、〜２０３８及び〜２１８４のｍ／ｚ値を持つピークは低下したが、〜１８９２のピークは増加した。

まとめると、データは、単独で又はＥ１Ｂと一緒になったアデノウイルスのＥ１Ａの発現は、細胞のグリコシル化のプロフィールを変化させることができることを示している。Ｅ１Ａ単独の発現がこの変化に十分であるという所見には、Ｅ１Ａがこの変化の原因であることを示している。グリコシル化における変化には通常、ルイスＸ構造、ＬａｃｄｉＮＡｃ構造、及びＧａｌＮＡｃ−ルイスＸ構造の形成が挙げられる。多数のＥ１Ａ及びＥ１Ａ＋Ｅ１Ｂを発現するＨＴ１０８０細胞の特徴を検討したが、これらの細胞の大半はこれら特徴的なグリカン構造を持つグリカンを生じた。さらに、ＨＴ１０８０親細胞により産生されるグリカン構造と比べた、これらの構造の豊富さ（データは示さず）は様々である。グリカン構造の豊富さはＥ１Ａの発現に大きく相関した。このことは、Ｅ１Ａに影響されるグリコシル化プロフィールの程度は、Ｅ１Ａ遺伝子が発現するレベルに大きく依存することを示している。

実施例２０．高用量におけるＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯとＣＨＯ−ＥＰＯの造血活性の比較
ラットにおいてＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯの造血活性を測定し、チャイニーズハムスター卵巣細胞に由来するＥＰＯ（ＣＨＯ−ＥＰＯ）と比較した。２種のＣＨＯ−ＥＰＯ調製物を以下から選択した；（１）高いシアル酸含量を持つ市販の組換えＣＨＯ−ＥＰＯである、エプレックス（ヤンセン・シラグ）及び（２）ＣＨＯ細胞によりＥＰＯを産生させ、続いて、実施例２及び３並びにＥＰ０４２８２６７に記載されているクロマトグラフィー法により、シアリル化が少ないアイソフォームを精製することにより得られた、シアル酸含量（ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯに類似する）が低いＣＨＯ−ＥＰＯ調製物である、ｆｒＣＨＯ−ＥＰＯ（図１６を参照のこと）。

６匹のＷＡＧ／Ｒｉｊ系ラットの４群で検討を行った。体重ｋｇ当たり５０００ｅＵ（ＥＬＩＳＡ単位、Ｒ＆Ｄの市販のＥＰＯ特異的ＥＬＩＳＡキットにより測定したとき）の単回用量のエプレックス、ｆｒＣＨＯ−ＥＰＯ、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯ又は希釈緩衝液（対照としての）を陰茎静脈に静注した。ＥＰＯ調製物は全て、総容積５００μｌにて、希釈緩衝液（ＰＢＳ、０．０３％ツイーン８０、０．５％グリシン）で適切な濃度に希釈した。４日後、舌穿刺により２５０μｌのＥＤＴＡ血液を採取した。同一日に、自動血球計算機を用いて、血液試料のヘマトクリット及び総赤血球数中の網状赤血球の比率についてを分析した。

ヘマトクリットのレベルを測定し、血液を遠心して得られる赤血球の塊の容積比率として表した（図１７）。結果は、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯ及びｆｒＣＨＯ−ＥＰＯはヘマトクリットを誘発しなかったが、エプレックスは誘発した。

図１８に示すように、ＥＰＯは、希釈緩衝液のみを投与したラットに比べて網状赤血球の数を有意に増加させた。エプレックス及びｆｒＣＨＯ−ＥＰＯは類似の刺激を呈し；この刺激はＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯ処置した動物よりも有意に高かった（ｐ＜０．００１）。網状赤血球におけるＲＮＡ含量を評価することにより、我々はそれらの成熟度を決定することができる。未熟な網状赤血球の画分（ＩＲＦ）を図１９に示す。エプレックス処置したラットは対照ラットに比べて、未熟網状赤血球の比率が有意に高かった。このことは、エプレックスにより刺激された網状赤血球の形成が、注射の４日後で未だ進行中であることを示している。この効果は、ｆｒＣＨＯ−ＥＰＯ及びＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯで処置したラットではそれぞれ、さほど顕著ではない又は存在しない（図１９）。

まとめると、データは、３種のＥＰＯ調製物はすべて網状赤血球の形成を誘導し；けれども、効果の持続時間は、エプレックスでは最も長く、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯでは最も短いが、ｆｒＣＨＯ−ＥＰＯは中間の効果を呈したことを示している。このことは、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯの造血効果が低いことは、その低いシアル酸含量によるだけでなく、その他のグリカンの特徴にもよることを示唆している。

実施例２１．ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯのＮ−グリカンの詳細な構造解析
質量分光光度計によって得られる質量シグナルは、種々の異性体構造が存在する可能性があるという事実のために、疑い無しに特定の糖構造に割り当てることができるわけではない。ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯのＮ−結合型グリカンの構造に関する更なる情報を得るために、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯのエンドグリコシダーゼ処理及びエキソグリコシダーゼ処理を採用した。

先ず、エンドグリコシダーゼＦ２を用いた。この酵素は、高マンノース又は２アンテナ型の複合型Ｎ−結合型グリカンのトリマンノシル核のＧｌｃＮＡｃ残基の間を切断する（図２０）。ＰＮＧアーゼＦとは対照的に、エンドグリコシダーゼＦ２は３アンテナ型グリカン又は４アンテナ型グリカンを切断しないので、２アンテナ型グリカン構造と３／４アンテナ型グリカン構造との間を識別するのに使用することができる。図２１は、ＰＮＧアーゼＦ又はエンドプロテイナーゼＦ２のいずれかで処理したＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯのＭＡＬＤＩスペクトルを示す。これらのスペクトルを比較すると、エンドグリコシダーゼＦ２により放出されたグリカンは、ＰＮＧアーゼＦにより放出されたグリカンよりも小さいことに留意すべきである。これが、ＧｌｃＮＡｃとフコース残基（３４９Ｄａ）の差異であり、酵素の切断部位が異なっている事に起因する（図２０を参照のこと）。

ｍ／ｚ＞２１８５でのＰＮＧアーゼＦ消化物で観察される構造はすべて、これらのグリカンがいずれもエンドグリコシダーゼＦ２消化物では認められないので、３アンテナ型又は４アンテナ型の構造である。さらに小さな質量、すなわち、ｍ／ｚ１４８５、１６４８、１６８９、１８３５、１８５１、１９９７、２０３８及び２１８５での構造は、ほとんどエンドグリコシダーゼＦ２消化物の中に相当するピークを有し、２アンテナ型である。幾つかの異性体３又は４アンテナ型の構造が存在するという可能性はあるが、図２１における両スペクトルのピーク比はほとんど同等なので、これは多くはない。エンドグリコシダーゼＦ２消化物のスペクトルは、ＰＮＧアーゼＦ消化物のスペクトルにおけるｍ／ｚ１８９２及び２０５４に相当するピークを欠いている。このことは、これらのピークが、２型アンテナではない代わりに、それぞれガラクトース残基を持たない又は１つ持つ４アンテナ型であるグリカンを表すことを証明している。これらのデータは、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯは末端ＧｌｃＮＡｃを持つグリカンを含有することを裏付けている。

次に、Ｎ−グリカンの構造をさらに調べるためにエキソグリコシダーゼを用いた。ＰＮＧアーゼＦによりＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯからグリカンを放出させ、ノイラミニダーゼを用いて脱シアリル化した。それに続いて、以下のエキソグリコシダーゼの異なった組み合わせで試料を処理した。
１）非還元の、末端Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ（及びＧａｌβ１−４ＧａｌＮＡｃ及び高い酵素比ではＧａｌβ１−３結合）を切断するβ−ガラクトシダーゼ。
２）α１−２、３，４及び６結合のフコースをＮ−グリカン及びＯ−グリカンから切断するウシ腎臓のα−フコシダーゼ。それは、Ｎ−結合型グリカンのトリマンノシル核にてそのほかのαフコース結合よりも効率良くα１−６結合のフコースを切断する。
３）非還元の、末端α１−３又はα１−４フコシダーゼ残基を切断するアーモンドミールのα−フコシダーゼ。
４）非還元の、末端β１−２、３、４、６結合のＮ−アセチルグルコサミンを複合炭水化物から切断するβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（ＧｌｃＮＡｃ−アーゼ）。それはＮ−アセチルガラクトサミン残基を切断しない。

ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯのグリカンで予想される結合の種類を図２２に示す。ガラクトシダーゼとフコシダーゼのインキュベートは同時に行った、すなわち、フコシダーゼのインキュベートがまだ活性がある間に、ガラクトシダーゼが存在した。さらに、ガラクトシダーゼ及びフコシダーゼが活性を失ってからＧｌｃＮＡｃ−アーゼ処理を行った。

図２３にガラクトシダーゼ処理について結果を提示する。この図では、５％以上高い相対強度（すなわち、全ピークをまとめた高さで割ったピークの高さ）有するスペクトル中の全ピークのｍ／ｚ値及び相対強度を示す。提案するグリカン構造も同様に示す。ガラクトシル化構造に割り当てられたピークは、ガラクトシダーゼ処理の後、必ずしも完全であるとは限らないが、移動した。隣接するＧｌｃＮＡｃ残基上にフコースが存在する場合、ガラクトシダーゼはガラクトースを放出しないことが判った。ガラクトシダーゼ処理の後、幾つかの３アンテナ型グリカンが出現すると思われた（ｍ／ｚ１６８９）。これは、標準グリカンを用いたガラクトシダーゼの調製物で存在することが実証されたＧｌｃＮＡｃ−アーゼの混入によって誘発された（データは示さず）。

次いで、ガラクトシダーゼ処理したグリカンをフコシダーゼに処理にかけた（図２４及び２６）。ウシ腎臓のフコシダーゼの場合、これは結果として、スペクトルにおける全ピークの１４６Ｄａの移動という結果となった。これはフコース残基の質量である。このフコシダーゼはα１−６結合したフコース残基を優先的に切断し、全ピークが１４６Ｄａ単位のみを失うので、このことは、グリカンがすべて核フコースを含有することを示している。

続いてアーモンドミールのフコシダーゼとインキュベートしたガラクトシダーゼ処理したグリカンのプールは、相対的に単純なスペクトルを示した（図２５及び２６）。たった１つ（核）フコシル化したグリカンを残して、フコース残基はすべてアンテナから外れた。フコシダーゼのインキュベート中、ガラクトシダーゼは依然として活性があるので、残っている末端ガラクトースも外された。脱フコシル化されたグリカンをＧｌｃＮＡｃ−アーゼ処理した後、たった４つのピークが残った。主なピークはｍ／ｚ１０７９に認められ、フコシル化されたトリマンノシル核を表す。ｍ／ｚ１４８５及びｍ／ｚ１８９１におけるピークは、この残基がＧｌｃＮＡｃ−アーゼによって外れないので、ＧａｌＮＡｃ残基の存在を裏付けている。ｍ／ｚ１４４４におけるピークは、ラクトサミンの繰り返しの存在を証明しており：ガラクトースはガラクトシダーゼ処理の間、ＧｌｃＮＡｃにより遮蔽されたにちがいない。

〔表の簡単な説明〕
〔表Ｉ〕 細胞を特徴付けるのに使用することができるマーカー蛋白質の概要。
〔表ＩＩ〕 表Ｉで示したマーカー蛋白質の一部に使用することができる陽性対照の組織。
〔表ＩＩＩ〕 ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞株を特徴付けるのに使用したマーカー蛋白質に向けられた抗体の詳細情報（供給業者及びカタログ番号）。
〔表ＩＶ〕 ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）におけるマーカー蛋白質の存在のスコア。
〔表Ｖ〕 ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯ及びエプレックスのＮ−結合型の糖の単糖類組成。
〔表ＶＩ〕 ＥＰＯを産生するＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）クローンＰ７によりＤＭＥＭ中に産生されたＥＰＯからＮ−グリカナーゼＦによって放出された、脱シアリル化されたＮ−グリカンの分子イオンで観察されたＭＳピークの割り当て。エプレックスにも見い出される質量（ｍ／ｚ）値を持つピークに下線を引き太字で示す。
〔表ＶＩＩ〕 ＥＰＯを産生するＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）クローンＰ８によりＤＭＥＭ中に産生されたＥＰＯからＮ−グリカナーゼＦによって放出された脱シアリル化されたＮ−グリカンの分子イオンで観察されたＭＳピークの割り当て。エプレックスにも見い出される質量（ｍ／ｚ）値を持つピークに下線を引き太字で示す。
〔表ＶＩＩＩ〕 ＣＨＯ細胞及びＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞におけるＦＵＴ活性。
〔表ＩＸ〕 高いフコース含量及び低いフコース含量を選択するための、ＡＡＬカラムで分画したＥＰＯからＮ−グリカナーゼＦによって放出された脱シアリル化されたＮ−グリカンの分子イオンで観察されたＭＳピークの割り当て。
〔表Ｘ〕 ＥＰＯを産生するＥ１Ａ．ＥＰＯ及びＥ１Ａ．Ｅ１Ｂ．ＥＰＯ−ＨＴ１０８０クローンの相対的なＥ１Ａの発現及び形態。Ｅ１Ａの発現量はウエスタンブロット解析により評価した。ＥＰＯ産生アッセイには＊で印を付けたクローンを選択した。
〔表ＸＩ〕 ＨＴ１０８０／ＥＰＯクローン０３３、ＨＴ１０８０／Ｅ１Ａ−ＥＰＯクローン００８及びＨＴ１０８０／Ｅ１Ａ．Ｅ１Ｂ−ＥＰＯクローン０７２から得たＮ−結合型の糖の質量プロフィールの相対的存在。ＥｘＰＡｓｙのコンピュータープログラムを用いて糖の組成を予測した。グリカンのアンテナに存在するヘキソサミン、ヘキソース及びデオキシヘキソースの数及び提案された構造を表中に示す。

エプレックス、Ｐ７−ＥＰＯ（プールＡ、Ｂ及びＣ）及びＰ８−ＥＰＯ（プールＡ、Ｂ及びＣ）のＮ−結合型の糖の質量スペクトル。（Ａ）エプレックス；（Ｂ）Ｐ７、プールＡ；（Ｃ）Ｐ７、プールＢ；（Ｄ）Ｐ７、プールＣ；（Ｅ）Ｐ８、プールＡ；（Ｆ）Ｐ８、プールＢ；及び（Ｇ）Ｐ８、プールＣ。 ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯ及びＣＨＯ−ＥＰＯのシアル酸含量。 ＰＥＲ．Ｃ６−ＥＰＯ上に存在するルイスＸグリカンの構造。 ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞表面におけるルイスＸ構造の発現。 ルイスＸ構造及びシアリルルイスＸ構造の模式的表示。 生体内における赤血球生成に対するＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯ及びエプレックスの影響。 再潅流の開始後２４時間で生じたＡＤＣ地図（図７Ａ）及びＴ２地図（図７Ｂ）に基づいた、無処置のラット（対照）、エプレックス及びＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯで処置したラットにおける、ＭＲＩを用いた梗塞容積。 ３匹の動物に１５０ｅＵのエプレックスを単回ｉ．ｖ．注射した後、示した時点でのエプレックスの濃度。 高いフコース含量及び低いフコース含量を選択するためにＡＡＬカラムで分画したＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）ＥＰＯのクロマトグラム。 Ａ）ＡＡＬカラムの画分１〜４におけるＮ−結合型の糖の質量スペクトル。Ｂ）独立した実験におけるＡＡＬカラムの画分４におけるＮ−結合型の糖の質量スペクトル。 ＨＴ１０８０／ＥＰＯクローン０３３（Ａ）、並びにＨＴ１０８０／Ｅ１Ａ．Ｅ１Ｂ．ＥＰＯクローン０５８（Ｂ）及びクローン０２６（Ｃ）の写真。それらのＥ１Ａの発現をウエスタンブロット解析で示す（Ｄ）。Ｅ１Ａを発現しているクローンは平坦な形態を有する。 ＨＴ１０８０／ＥＰＯクローン０３３及びＨＴ１０８０／Ｅ１Ａ．Ｅ１Ｂクローン０７２により産生されたＥＰＯから放出されたＮ−グリカンのＨＰＡＥＣ−ＰＡＤのプロフィール。下の線は、無電荷（０）、単電荷、２電荷、３電荷及び４電荷（それぞれ１〜４）のグリカンの溶出を示す。クローン０７２の荷電が少ないＮ−結合型グリカンへのシフトに注目のこと。 ３種の異なったクローンにより産生されたＥＰＯのＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析（Ａ）。ＨＴ１０８０／ＥＰＯクローン０３３、ＨＴ１０８０／Ｅ１Ａ−ＥＰＯクローン００８及びＨＴ１０８０／Ｅ１Ａ．Ｅ１Ｂ−ＥＰＯクローン０７２。後者の２種のクローンはさらに複雑なプロフィールを示す。 ＨＴ１０８０／ＥＰＯクローン０３３、ＨＴ１０８０／Ｅ１Ａ−ＥＰＯクローン００８及びＨＴ１０８０／Ｅ１Ａ．Ｅ１Ｂ−ＥＰＯクローン０７２のＮ−結合型グリカンの単糖類分析から得られたプロフィール。示した単糖類（Ｆｕｃ＝フコース、ＧａｌＮ＝Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、ＧｌｃＮａｃ＝Ｎ−アセチル−グルコサミン、Ｇａｌ＝ガラクトース、Ｍａｎ＝マンノース）の比は、マンノースに対して基準化した。 α−フコシダーゼで処理した（Ｂ、Ｄ）又は処理しない（Ａ、Ｃ）ＨＴ１０８０／ＥＰＯクローン０３３（Ａ、Ｂ）及びＨＴ１０８０／Ｅ１Ａ．Ｅ１Ｂ−ＥＰＯクローン０７２（Ｃ、Ｄ）により産生されたＥＰＯのＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析。唯一の差異はクローン０７２に由来するＥＰＯのグリカンのプロフィールに認められた。〜２０３９、〜２１８５及び〜１８９２のｍ／ｚ値を持つピークの明瞭な変化が見られ（Ｃ及びＤ）、それらは、アンテナ部のデオキシヘキソースを含有する提案した構造の減少を表す可能性が最も高い。 ＩＥＦにより分離した様々なＥＰＯの調製物の種々のアイソフォーム。ＥＰＯアイソフォームは分子当たり０〜１４のシアル酸を含有する。以下の試料をかけた（ストリップ当たり２０００ｅＵ）：エプレックス（Ａ）；ノイラミノダーゼ処理したエプレックス（Ｂ）；ＣＨＯ−ＥＰＯ、全生成物（Ｃ）；ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯ、クローン０２２（Ｄ）；ｆｒＣＨＯ−ＥＰＯ（Ｅ）。 ５０００ｅＵ／ｋｇのエプレックス、ｆｒＣＨＯ−ＥＰＯ、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯ又は希釈緩衝液（対照）を注射したラットのヘマトクリット（ＨＣＲ、体積パーセント）。ＥＰＯ処置したラットは、対照、ｆｒＣＨＯ−ＥＰＯ、及びＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯに比べて有意に高いＨＣＲを示した（ｐ＜０．００１）。 ５０００ｅＵ／ｋｇのエプレックス、ｆｒＣＨＯ−ＥＰＯ、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯ又は希釈緩衝液（対照）を注射したラットの血液における網状赤血球の比率。ＥＰＯ処置したラットは、対照に比べて有意に高い網状赤血球の比率を示した（ｐ＜０．００１）。エプレックス及びｆｒＣＨＯ−ＥＰＯで処置したラット双方の網状赤血球の比率は、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯに比べて有意に高かった（ｐ＜０．００１）。 ５０００ｅＵ／ｋｇのエプレックス、ｆｒＣＨＯ−ＥＰＯ、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯ又は希釈緩衝液（対照）を注射した４日後の全網状赤血球集団における未熟網状赤血球の比率。エプレックス処置したラットは、対照、ｆｒＣＨＯ−ＥＰＯ、及びＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯに比べて有意に高い％未熟網状赤血球を示した（ｐ＜０．００１）。 ＰＮＧアーゼ（Ｆで印す）及びエンドグリコシダーゼＦ２（Ｆ２で印す）の切断部位。 ＰＮＧアーゼ（Ａ）及びエンドグリコシダーゼＦ２（Ｂ）により放出されたＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯグリカンのＭＡＬＤＩスペクトル。両者のスペクトルにおける相当するピークが互いに真上にあるような方法で下のスペクトルのＸ軸を合わせた（３４９Ｄａの差異、本文を参照のこと）。 Ｎ−末端グリカンの幾つかの単糖類結合。 スキームの上部は、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯから放出された脱シアリル化されたグリカンを示し；下部の値は、ガラクトシダーゼ処理後のスペクトルで検出される。括弧間でスペクトルの合計比率が所与の構造に反映した。図２６のスペクトル。 スキームの上部は、ガラクトシダーゼと共にインキュベートしたＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯから放出された脱シアリル化されたグリカンを示し；真ん中部分の値は、ウシ腎臓のフコシダーゼ処理後のスペクトルにおいて検出され、及び下の値は、ＧｌｃＮＡｃアーゼとのインキュベーション後に得られる。括弧間でスペクトルの合計比率が所与の構造に反映した。図２６のスペクトル。 スキームの上部は、ガラクトシダーゼと共にインキュベートしたＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯから放出された脱シアリル化されたグリカンを示し；真ん中部分の値は、アーモンドミールフコシダーゼ処理後のスペクトルにおいて検出され、及び下の値は、ＧｌｃＮＡｃアーゼとのインキュベーション後に得られる。括弧間でスペクトルの合計比率が所与の構造に反映した。図２７のスペクトル。 ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯのＮ−結合型グリカンのエキソグリコシダーゼ処理のＭＡＬＤＩスペクトル。Ａ．）ＰＮＧアーゼＦ及びノイラミニダーゼと共にインキュベートしたＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯ。Ｂ．）ＰＮＧアーゼＦ、ノイラミニダーゼ及びガラクトシダーゼと共にインキュベートしたＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯ。Ｃ．）ＰＮＧアーゼＦ及びノイラミニダーゼと共にインキュベートし、その後ガラクトシダーゼ及びウシ腎臓のフコシダーゼで処理したＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯ。Ｄ．）ＰＮＧアーゼＦ及びノイラミニダーゼと共にインキュベートし、その後ガラクトシダーゼ、ウシ腎臓のフコシダーゼ及びＧｌｃＮＡｃアーゼで処理したＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯ。Ｅ．）ＰＮＧアーゼＦ及びノイラミニダーゼと共にインキュベートし、その後ガラクトシダーゼ及びアーモンドミールフコシダーゼで処理したＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯ。Ｆ．）ＰＮＧアーゼＦ及びノイラミニダーゼと共にインキュベートし、その後ガラクトシダーゼ、アーモンドミールフコシダーゼ及びＧｌｃＮＡｃアーゼで処理したＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＥＰＯ。

〔参考文献〕

Claims (11)

1. Ｎ結合型グリカンを含む複数のエリスロポエチン分子を備える組成物であって、エリスロポエチン分子当たりのＮ結合型グリカン上の平均ルイスＸ構造数が少なくとも２．７であることを特徴とする組成物。
2. エリスロポエチン分子当たりのＮ結合型グリカン上の平均ルイスＸ構造数が少なくとも３．６であることを特徴とする請求項１に従う組成物。
3. エリスロポエチン分子当たりのＮ結合型グリカン上の平均ルイスＸ構造数が少なくとも４．１であることを特徴とする請求項１に従う組成物。
4. エリスロポエチン分子当たりのＮ結合型グリカン上の平均ルイスＸ構造数が少なくとも５．７であることを特徴とする請求項１に従う組成物。
5. 前記エリスロポエチン分子上のＮ−結合型グリカンが主として２アンテナ型（二分岐の）構造である請求項１〜４のいずれか１項に従う組成物。
6. Ｎ結合型グリカンを含む複数のエリスロポエチン分子の組成物を備える製薬上の調製物であって、前記エリスロポエチン分子の組成物が、エリスロポエチン分子当たりのＮ結合型グリカン上の平均ルイスＸ構造数が少なくとも２．７であることを特徴とする調製物。
7. 薬として使用するための請求項１〜５のいずれか１項に従う組成物。
8. 請求項１〜５及び７のいずれか１項記載の組成物の使用であって、虚血、再潅流障害、低酸素が誘発する障害、炎症性疾患、神経変性疾患、及び中枢性又は末梢性の神経系への急性の損傷より成る群から選択された障害の治療のために薬を調製するための使用。
9. エリスロポエチン分子当たりのＮ結合型グリカン上の平均ルイスＸ構造数が少なくとも３．６である請求項６に従う調製物。
10. エリスロポエチン分子当たりのＮ結合型グリカン上の平均ルイスＸ構造数が少なくとも４．１である請求項６に従う調製物。
11. エリスロポエチン分子当たりのＮ結合型グリカン上の平均ルイスＸ構造数が少なくとも５．７である請求項６に従う調製物。

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