KR100305341B1

KR100305341B1 - 변성된단백질의활성화방법

Info

Publication number: KR100305341B1
Application number: KR1019980710184A
Authority: KR
Inventors: 아델베르트 그로스만
Original assignee: 로셰 디아그노스틱스 게엠베하
Priority date: 1996-06-11
Filing date: 1997-06-11
Publication date: 2002-03-02
Also published as: JP3288720B2; CA2257122C; AU3257197A; ES2214624T3; WO1997047735A1; ATE260972T1; BR9709569B1; CA2257122A1; EP0904355A1; JPH11511759A; EP0904355B1; KR20000016588A; US6342585B1; DE59711375D1; TR199802584T2; AU714318B2; BR9709569A

Abstract

본 발명은 단백질 및 디술피드 성분으로 구성된 혼합된 디술피드의 제조방법에 관한 것으로, 이 방법은 비활성이고 불완전한 가용성 형태인 단백질을 디술피드 성분의 존재하에서 변성화에 충분한 농도의 변성제 용액으로 항온반응시키고, 용해시켜 유도체로 전환시키는 것을 특징으로 한다. 상기 방법은 원핵생물로 부터의 재생된 재조합 단백질의 고수율 제조방법으로 적합하다.

Description

변성된 단백질의 활성화 방법

재조합 단백질의 대량 생산에 있어서, 재생되는 단백질의 양은 대체적으로 임계 농도보다 훨씬 높다. 단백질은 사용되는 활성 완충액에 자주 낮은 용해도를 갖기 때문에, 이로 인해 낮은 수율, 장시간의 필요성 및 많은 부피의 완충액과 같은 상당한 단점을 나타낸다.

WO 87/02673 에, 불활성 가용성 단백질을 변성제 및 환원제와 용해시키고, 이어서 환원제를 분리한 다음 단백질과, 예를 들어, 글루타티온 사이의 이종 혼합된 디술피드가 가용화된 단백질로부터 제조되는 방법이 공지되어 있다. 상기 혼합된 디술피드는 티올기로의 수식후에 단백질이 공기 산화로부터 보호고 넓은 pH 범위에서 안정하기 때문에 정제 및 재생에 더욱 유리하다. 총 전하의 변화는 또한 비-수식된 단백질을 이온 교환 크로마토그래피에 의해 분리될 수 있도록 하기 때문에 정제를 용이하게 한다.

혼합된 디술피드를 형성하기 위해서, 환원제로 정제된 용해, 투석 및 환원된 단백질을 변성제 및 유도체화용 디술피드 성분 (예를 들어, GSSG, 시스틴, 시스타민) 을 함유하는 용액과 항온반응시킨다. 재생반응은 디술피드 성분의 분리후에 통상적인 방법으로 수행된다. 상기 반응이 효율적이라해도, 유도체화전에 특히 환원제의 분리를 위해 많은 개별적인 반응 단계를 필요로한다.

인슐린형 성장인자 I을 폴딩 및 정제하기 위한 방법이 WO 93/19084 에 공지되어 있다. 이에 따르면, 세포 봉입체를 환원 조건하에 용해시키고, 이어서 환원제를 분리하지 않고 과량의 산화제를 첨가한다. 재생화는 잇따른 희석 (투석없이) 및 (산화-환원계를 구축하는) 환원제의 새로운 첨가에 의해 개시된다. WO 91/08762 에는 생물학적 활성 혈소판 유래 성장인자의 제조방법이 기재되어 있다. 상기 방법에서, 용해화를 우선 환원제없이 pH 3에서 수행하고 이어서 변성 조건하에서 정제를 수해한다. 이후에 산화제를 첨가하여 유도체를 생성한다. EP-A 0 450 386 에 따르면, 세포 봉입체 (변성 용해된 NGF 단백질)의 추출은 용해 완충액을 첨가한 다음 원심분리하므로써 제조된다. 이어서, 추출물을 환원제로 처리하여, 항온 반응시키고, 사전 투석없이 산화제를 첨가하므로써 산화시킨다. 다음으로, 이를 희석하고 성분들을 변성을 위해 더 첨가한다. 그러므로, 상기 반응에서 용해화는 산화 환원 활성 물질을 첨가하지 않고 우선적으로 별도의 반응 단계로써 수행된다. 상기 반응들중 어느 것도 US 특허 4,933,434 호에 따른 펄스 재생화를 위해 적합하지 않다.

또한, 이미 용해화중에 유도체화시킬 수 있는 방법들이 공지되어 있다. 술피톨리시스 (sulfitolysis) 방법은 오래전부터 공지되어있다 [예를 들어, Bailey, J.L., Cole, R.D., 1959, J. Biol. Chem. 234, 1733-1739; Cole, R.D., 1967, In: Meth. Enzymol. 11, 206-208; EP 0 114 507]. 상기 방법에 있어서, 단백질내 디술피드 결합을 아황산염으로 처리하여 반응 생성물로써 50 % 티오-술폰화 (RS-SO^- ₃) 및 50 % 유리 (RS^-) 단백질-SH 기의 혼합물을 형성한다. 유리 SH 기는 산화환원반응 (예를 들어, 구리이온, 요오드벤조에이트, 바람직하게는 테트라티오네이트) 에 의해 디술피드로 차례로 전환되는데, 상기 방법을 반복적으로 수행하므로써 거의 완벽하게 티오술포네이트로 전환될 수 있다. 상기 방법은 비교적 간단하고 온화한 경계조건(예컨데, 중성 pH 값)하에서 수행될 수 있다. 문헌 [J. Biol. Chem. 234, 1733] 에 이미 기재된 바와 같이, 형성된 티오술포네이트가 화학적으로 불안정하고, 전환의 완료를 확인하는 것이 불가능하며, 상기 모든 트립토판 잔기들이 산화환원제에 의해 부분적으로 파괴된다는 단점이 있다. 더욱이, 최종 생성물내에서 티오술폰화 단백질-SH 기 및 상기 요오드벤조에이트와 같은 산화제를 함유하는 부생성물을 완전하게 분리하는 것이 매우 어렵고 이를 분석학적으로 확인하는 것이 극히 수고스럽다는 단점이 있다. 그러나, 이는 상기와 같은 비생리학적인 방법에 의해 화학적으로 변성되는 치료제의 가능한 부작용을 피하기 위해서 치료적 용도를 목적으로하는 단백질이 절대적으로 필요하다.

WO 95/30686 호에는 또한 NGF/BDNF 훼밀리의 신경영양성 인자를 재생하는 상기의 술피톨리시스가 기재되어있다. 인간 프로인슐린의 재생에 대한 유사한 방법이 문헌 [R. Wetzel et al., Gene 16 (1981) 63-71; W.F.Heath et al., J. Biol. Chem. 267 (1992) 419-425] 에 기재되어 있다.

측쇄를 손상시키는 산화환원 조건의 사용을 피하는 유사한 방법이 또한 공지되었고 (Thannhauser, T.W., Konishi, Y., Scheraga, H.A., 1984, Analyt. Biochem. 138, 181-188; Thannhauser, T.W., Scheraga, H.A., 1985, Biochemistry 24, 7681-7688); 상기 경우에 있어서, 산화환원반응 대신에, 디술피드 결합이 환원되는 경우에 수득되는 시스테인이 2-니트로-5-(술포티오)-벤조에이트와의 반응에 의해서 직접적으로 유도체화되고; 2-니트로-5-티오벤조에이트는 광도 측정될 수 있는 상기 방법으로 방출되므로 전환된 SH 기들을 정량할 수 있다. 상기 방법의 단점은 최종 생성물로부터 완전 분리하는 것이 매우 시간 소모적이고 확인이 어려운 복합 화학물질이 도입된다는 것이다. 더욱이, 저자 (Biochemistry 24, 7681) 는 수득된 티오술포네이트가 티올기가 완전히 없는 경우에만 안정하다는 것을 관찰하였다. 또한, 측쇄 변성이 또한 상기 경우 (아스파라긴의 탈아미노기 반응)에서 관찰된다.

본 발명은 변성 단백질, 특히 재조합 생성된 변성 단백질의 용해화 및 재생을 위한 단순화된 방법에 관한 것이다.

단백질이 E. coli 와 같은 원핵세포에서 생성되는 경우 불완전 용해되고 불활성인 단백질 응집체 (세포 봉입체) 가 빈번히 형성된다. 상기 단백질을 그들의 활성 형태로 전환시키기 위해서, 상기 단백질을 용해하여 재생시킬 필요가 있다. 그러한 방법들이 공지되어 있는데, 예를들어 EP-A 0 361 475, EP-A 0 114 506, EP-A 0 093 619, EP-A 0 253 823, WO 87/02673, EP-A 0 364 926 및 EP-A 0 241 022 에 기재되어 있다. 재생 단백질의 수율을 제한하는 활성화에 있어서의 중요한 요인은 재생 단백질의 정확하게 폴딩된 중간체로의 전환과 몇몇 단백질 분자의 응집 사이에 경쟁 반응이다. 이러한 이유때문에, 재생화 용액중 재생된 단백질의 농도가 재생 반응의 수율에 대한 중요한 파라미터이다. 재생된 단백질의 농도가 증가함에 따라 응집이 우선되어 고유 단백질 형태를 가진 재생 단백질의 상대적인 수율이 감소된다 (임계 농도).

본 발명의 목적은 상기 방법들을 단순화 및 개량하고, SH 기가 유도체화되며 높은 수율로 재생될 수 있는 안정하고 저장가능한 단백질을 제공하는 것이다.

놀랍게도, 본 발명에 따른 방법이 용해화 및 유도체화가 사전에 환원을 수행하지 않고 단일 단계로 수행될 수 있도록 한다는 것을 발견하였다. 특히 놀라운 것은 유도체화가 산성 조건 (pH 값이 7.0 미만, 바람직하게는 pH 3 - 6.5) 하에서 바람직하게는 NGF와 같은 신경영양물질에 대해 일어날 수 있고 약 7 - 10 의 통상적인 pH 범위에서 티올 성분과의 반응과 비교하여 반응의 속도론 및 완료에 본질적인 영향없이 수행된다는 것이다. 상기 반응은 유리 티올레이트 음이온의 존재하에서만 수행될 수 있고; 이는 티올레이트 음이온의 약 9 의 높은 pK 값으로 인해 약 7 이상의 pH 값에서 효과적인 농도로 일어난다고 통상적으로 예측된다.

그러므로, 본 발명은, 비활성이고 불완전한 가용성 형태 (세포 봉입체) 인 단백질이 디술피드 성분 (단백질:디술피드 성분의 몰비가 1:1 내지 1:10000, 바람직하게는 1:1000)의 존재하에서 변성 농도인 변성제의 용액과 항온 반응하고, 용해시켜 유도체화하고, 이어서 디술피드 성분이 경우에 따라 제거될 수도 있다는 것을 특징으로 하는, 단백질 및 디술피드 성분으로 구성된 혼합 디술피드의 생성 방법에 관한 것이다. 디술피드 성분은 이어서 US 특허 4,944,434 호에 기재된 바와 같은 펄스 재생화를 수행하므로써 편의상 제거될 수 있다. 본 발명에 따른 유도체화된 단백질은 안정하고 그 이상의 가공전에 저장될 수 있다. 이는 유도체화된 단백질이 재생화와는 독립적으로 본 발명에 따른 방법에 의해 생성될 수 있기 때문에 특히 유리하다. 그러므로, 유도체화된 단백질은 수많은 재생 및 정제 방법 및/또는 제법에 대해 단리된 중간체 생성물로써 유용하다.

이와는 달리, 단백질을 유도체화하는 항온반응을 환원제 (예를 들어, DTT, DTE, GSH, 시스테인, 시스테아민, 아황산염) 의 존재하에서 수행한다. 이는 유도체화 수율을 증진시킬 수 있다. 상기 경우에 있어서, 디술피드 성분의 효과가 제한되지 않거나 또는 좁은 범위로 제한되도록 환원제의 농도를 선택하는 것이 편리하고; 디술피드 성분 농도의 20 몰 % 이하, 바람직하게는 10 % 이하인 환원제의 농도가 바람직한 것으로 판명되엇다.

바람직하게는 부가적인 시약을 첨가하여 유리 SH 기를 보호하므로써 중금속, 라디칼 또는 활성 산소류에 의한 상기 SH 기의 블로킹 또는 파괴를 부분적으로 또는 완전하게 예방할 수 있다. 상기 종류의 보호 시약으로는 예를 들어 0.1 내지 100 mmol/l 의 농도인 EDTA 또는 1 내지 1000 mmol/l 의 농도인 만니톨을 들 수 있다.

디술피드 성분은 디술피드 클래스, 예를 들어, GSSG, 시스타민 또는 시스틴으로부터 유래된 물질인 것으로 이해된다. 디술피드 성분은 디술피드 결합이 절단된 후 단백질내의 SH 기를 유도체화할 수 있다. 디술피드 성분은 바람직하게는 적어도 1 mmol/l 이상, 바람직하게는 1 - 1000 mmol/l, 특히 바람직하게는 10 - 200 mmol/l 의 농도로 사용된다.

변성제와 같은 산화 조건하에서 변성된 단백질을 용해시키기 위해 통상적으로 사용되는 변성제를 사용하는 것이 편리하다. 구아니디늄 히드로클로라이드 또는 예를 들어, 술페이트, 포스페이트 또는 티오시아네이트와 같은 기타 구아니디늄염 뿐 아니라 우레아 또는 그의 유도체를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 변성제의 혼합물을 사용하는 것이 또한 가능하다.

변성제의 농도는 변성제의 종류에 따라 다르고 당 분야의 숙련자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 변성제의 농도는 변성되고 불완전한 가용성 단백질의 완전한 용해화를 달성할 수 있는 농도가 적절하다. 구아니딘 히드로클로라이드의 경우에 있어서, 이의 농도는 통상적으로 3 - 8 mol/l, 바람직하게는 6 - 8 mol/l 이다. 우레아의 경우에 있어서는 농도가 통상적으로 6 - 10 mol/l 이다.

"비활성이고 불완전한 가용성 형태인 단백질" 이란 예컨데 원핵생물내에서 재조합 생성되어 형성된 단백질을 의미한다. 상기 단백질은 진핵생물 단백질이 원핵생물내에서 과발현되고 그 단백질이 활성 형태로써 주변 세포질 또는 세포 상청액으로 이동하지 못하는 경우에 통상적으로 형성된다. 상기 경우에 있어서, 재조합 생성된 단백질은 불용성 및 응집된 형태로 세포질 또는 주변 세포질에 잔존한다. 상기 응집물, 그의 분리 및 정제는 문헌 [Marston F.A.O., Biochem. J. 214 (1986) 1-12] 에 기재되어있다. 세포 봉입체를 단리하기 위해 원핵세포를 배양후 용균시킨다.

세포 용균은 통상적인 방법, 예를 들어, 초음파, 고압분산 또는 리소좀에 의해 수행될 수 있다. 현탁 매질로, 예컨데 0.1 mol/l 트리스-HCl 과 같이, 중성 내지 약산성 pH 로 조정하는데 적합한 완충용액내에서 수행하는 것이 바람직하다. 세포 용균후 불용성 성분 (세포 봉입체)을 단백질에 영향을 주지않으면서 가능한한 완벽하게 외래 세포단백질을 용해시키는 제제, 예를 들어, 경우에 따라 Brij (상품명) 과 같은 온화한 세제가 첨가된 물 또는 포스페이트 완충액으로 세척한 후, 임의 바람직한 방법, 바람직하게는 원심분리 또는 여과시키므로써 분리한다. 다음으로, 침전물 (펠렛) 로 용해화 및 유도체화를 위한 본 발명에 따른 방법을 수행한다.

본 발명에 따른 방법은 중성 내지 알칼리성 pH, 바람직하게는 pH 6 내지 10, 특히 바람직하게는 7 내지 8 의 pH 범위에서 수행된다. 모든 일반적인 완충액이 완충 용액으로 적합하고; 구아니디늄 히드로클로라이드가 변성제로 사용되는 경우에는 그의 완충 작용이 있기 때문에 완충액을 첨가할 필요가 없다. 당 분야의 숙련자에게 공지된 완충액으로는 예를 들어, 트리스 또는 포스페이트가 바람직하게는 사용된다. 놀랍게도 본 발명에 따른 방법은 또한 산성 조건 (pH 3 - 6.5) 하에서조차 신경영양물질에 대해 특히 유리하게 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 방법은 디술피드 성분을 첨가하여 수행된다. 바람직한 디술피드 성분은, 예를 들어, GSSG, 시스타민 및 시스틴이다. 유도체화 반응은, 티올 형태인 단백질과 디술피드 성분사이의 평형반응, 또는 단백질과 디술피드 성분으로 구성된 혼합 디술피드와, 한편으로는 유리 티올 성분, 예를 들어, 잔존하는 단백질 티올기 및 다른 한편으로는 티올 형태인 단백질과의 반응에 의해 디술피드 성분으로부터 방출된 티올 성분 사이의 평형반응이므로, 목적하는 유도체화 반응은 상당히 과량의 디술피드 성분에 의해서 수행되어야한다. 이를 위해 필요한 조건은 단백질에 따라 매우 상이하다. 10 mmol/l 내지 포화 한계선 (예를 들어, 제조물의 pH 값에 따라 GSSG 의 경우에는 약 200 - 300 mmol/l, 시스타민의 경우에는 약 700 mmol/l) 의 디술피드 성분의 농도 범위를 사용하는 것이 바람직하고, 특히 바람직하게는 농도 범위가 디술피드 성분의 포화 농도의 50 - 100 % 이다.

본 발명의 방법에 있어서 환원제를 첨가하는 것이 또한 바람직하다. 메르캅탄기 유래의 환원제로는 0.01 - 50 mmol/l, 바람직하게는 0.1 - 10 mmol/l 의 농도인 환원된 글루타티온 (GSH) 또는 2-메르캅토에탄올, 디티오에리트리톨 (DTE) 또는 디티오트레이톨 (DTT) 이 특히 바람직하다. 아황산염, 예를 들어, 아황산나트륨과 같은 환원제가 또한 바람직하다. 상기 환원제중 하나의 첨가가 반응을 성공적으로 수행하기 위해 필수적이지는 않지만, 그러나 상기 첨가는 단백질이 처리된 단백질에 따라 재활성화되는 경우에 수율의 향상을 유도할 수 있다.

본 발명에 따른 방법은 실온에서 0.1 - 100 시간, 바람직하게는 1 - 24 시간, 특히 바람직하게는 2 - 4 시간동안 수행되는 것이 바람직하다. 그러나, 약 60 ℃ 로의 가열와 같은 기타 조건 또는 약 0 ℃ 로의 냉각을 수반하는 방법이 또한 적합하다. 대기중의 산소에 의한 환원제의 산화를 예방하고 유리 SH 기를 보호하기 위해서, 바람직하게는 1 - 100 mmol/l, 특히 바람직하게는 약 10 mmol/l 의 양으로 EDTA를 첨가하는 것이 적절하다. 예를 들어 특히 비교적 높은 pH 값에서 티올을 함유하는 용액중에서 일어날 수 있는 라디칼 부반응을 억제하기 위해서, 예를 들어, 1 내지 1000 mmol/l 의 농도, 바람직하게는 20 내지 200 mmol/l 의 농도, 특히 바람직기하게는 50 mmol/l 의 농도인 만니톨과 같은, 라디칼 차단제 (quencher)를 단백질의 재생 및/또는 가공중에 첨가하는 것이 또한 적절하다.

용해화/유도체화 후, 티술피드 성분 및 경우에 따라서 첨가된 환원제를 제거하기 위해서 변성제를 변성 농도로 함유하는 용액을 투석시키는 것이 바람직하다. 투석 용액은 변성/유도체화 용액에서와 동일한 농도의 변성제를 함유하는 것이 유래하다. 이는 또한 동몰 농도의 다른 변성제, 예를 들어, 약 1 mmol/l 의 HCl 또는 묽은 아세트산에 대해 투석하는 것이 바람직할 수 있다. 더욱이, 디술피드 성분을 완전히 분리하지 않는 것이 바람직한 것으로 판명되었으며; 이미 설명된 바와 같이, 유도체화 반응은 유리 티올 성분과 (경우에 따라 혼합된) 디술피드 성분과의 평형반응이다. 단백질 티올기 모두가 완전히 유도체화되지 않는다면, 디술피드 성분의 분리후에 남아있는 유리 티올 성분이 존재하는 혼합된 디술피드에 대해 환원효과를 가지므로 이어서 유도체화 수율이 유도체화된 단백질의 저장중에 감소될 위험이 있다. 그러므로, 처리된 단백질의 유도체화 정도는 단백질 티올기를 산화 및 유사한 파괴성 부반응에 대해 보호하려는 유도체화의 의도하는 목적을 위해서 가능한한 안정하고 높아야한다. 이는 디술피드 성분의 농도가 적합한 농도 이하로 떨어지기전에 미리 투석을 끝내므로써 달성되거나 또는 요구되는 농도로 디술피드 성분을 함유하는 투석 완충액에 대한 투석방법으로 투석시키므로써 달성될 수 있다. 유도체화된 단백질의 보관중에 유도체화도를 유지하기 위해 필요한 농도는 각각 처리된 단백질에 따라서, 특히 처리된 단백질의 시스테인 함량에 따라서 다르며 0 - 100 mmol/l 의 농도 범위일 수 있다. 재활성 반응을 위한 유도체화된 단백질의 또 다른 용도에 관하여는, 재활성 공정중에 디술피드 성분의 도입이 분자간 또는 분자내 디술피드 결합의 바람직한 산화성 결합을 위해 상기 경우에 사용되는 조건에 대해 영향이 없거나 무시할 수 있는 정도라는 것을 유의해야한다. 이러한 이유로 인해 유도체화된 단백질내 디술피드 성분의 잔류 농도는 약 1 - 10 mmol/l 이 바람직한 것으로 증명되었다.

본 발명의 또 다른 주제는 원핵생물에서의 재조합 생산후 수득가능한 비활성 불완전한 가용성 형태로부터 재생된 단백질을 생성하는 방법에 관한 것으로, 그의 비활성 불완전한 가용성 형태인 단백질을 디술피드 성분 (단백질:디술피드 성분의 몰비 1:1 내지 1:10000, 바람직하게는 1:1000) 의 존재하에서 변성 농도인 변성제의 용액과 항온반응, 용해 및 유도체화시키고, 강한 변성 용액을 약- 또는 비-변성 용액으로 변화시키므로써 디술피드 성분과의 디술피드 결합이 산화환원계의 첨가에 의해 끊어지고, 단백질내 분자간에 새로운 디술피드 결합이 생성되어 용해된 단백질이 그의 특징적인 생물학적 활성을 갖는 형태를 채택하므로 용해된 단백질이 생물학적 활성 구조를 갖는 것을 특징으로 한다.

상기 약변성 조건은 예를 들어 바람직하게는 환원제의 존재하에서 희석 또는 투석에 의해 이루어질 수 있다. 약변성 조건은, 강변성 조건과는 대조적으로, 단백질이 그의 활성 형태를 채택할 수 있고 이러한 형태로 안정할 수 있는 조건이다. 강변성 조건하에서는 단백질이 상기 형태로는 불안정하며 변성, 즉, 그의 안정한 3차원 구조 및 에너지적으로 바람직한 디술피드 결합을 잃어버리는 경향이 있다. 강변성 조건은 예를 들어 4 - 9 mol/l 구아니딘 히드로클로라이드의 용액이다. 약변성 조건은 예를 들어 0.1 - 2 mol/l 구아니딘 히드로클로라이드이다. 이는 또한 재생중에 0.1 내지 1 mol/l 의 농도로 아르기닌을 첨가하는 것이 적합하다.

단백질의 활성은 단백질의 생물학적 활성을 의미한다. 천연 발생 단백질 또는 천연 단백질의 유도체인 경우는, 그의 생물학적 활성을 단백질의 면역학적, 세포-생물학적 또는 촉매적 성질로 결정할 수 있다.

활성화 (재생화) 는 바람직하게는 변성제없이 또는 비변성 농도의 변성제하에서 0.1 - 20 mmol/l 의 GSH 농도, 0.01 - 10 mmol/l 의 GSSG 농도로 수행되고, 재활성화는 바람직하게는 1 - 300 시간에 걸쳐 수행된다. 상기 경우에 있어서, GSH 농도는 0.5 - 10 mmol/l 이 바람직하고 및/또는 GSSG 농도는 0.1 - 10 mmol/l 이 바람직하다.

본 발명에 따른 방법은 많은 변성 단백질, 특히 재조합 생성된 변성 단백질을 재생시키는데 적합하다. 그러한 단백질로는 예를 들어, 프로테아제, 성장인자, 단백질 호르몬, 시토키닌, 플라스미노겐 활성화제, 인자 Xa 및 특히 신경영양물질을 들 수 있다. 신경영양물질은 특히 신경 세포에서 발견되는 단백질로 신경 세포의 분화 및 생존을 유지한다. 신경영양물질 (예를 들어, NGF, 뇌유래 신경 성장 인자 (BDNF), 뉴로트로핀 3, 4/5, 6) 은 그러므로 다가신경병증, 알쯔하이머병 또는 뇌와 척수의 상해와 같은 신경변성 질병의 치료에 유용한 세포 치료제이다.

인간 신경 성장 인자 (NGF) 는 2 개의 서브유니트 (호모다이머)로 구성된 단백질이다. β 유니트는 감각신경 및 교감신경의 성장에 영향을 줄 수 있는 것으로 밝혀졌다. 성숙 NGF 는 118 개의 아미노산으로 구성되고, 3 개의 디술피드 결합을 함유하며 글리코실화되지않는다. 생물학적 활성 NGF 는 다이머로써 존재한다. NGF 의 DNA 및 아미노산 서열은 EP-B 0 121 338 (USP 5,169,762) 에 기재되어있다. 그러나, 상기 방법으로 활성 단백질을 수득하는 것은 불가능하다. 활성 재조합 NGF 의 생성은 예를 들어 EP-A 0 329 175, EP-A 0 370 171, 문헌 [Biochem. Biophys. Res. Commun. 171 (1990) 116-122], EP-A 0 414 151, 문헌 [Gene 70 (1988) 57-65], EP-A 0 450 386 및 문헌 [Gene 85 (1989), 109-114] 에 기재되어있다.

뇌유래 신경영양 인자 (BDNF) 는 문헌 [Leibrock et al., Nature 341 (1989) 149-152] 에 기재되어있다. BDNF 는 중추신경계에서 감각신경의 생존을 지지하며 파킨슨씨병의 치료에 성공적인 것으로 보인다. 재조합 BDNF 는 예를 들어 WO 91/03568 에 따르면 CHO 세포에서 생산될 수 있고 WO 92/22665 에 따르면 원핵생물에서 생산될 수 있다.

하기의 실시예, 공보 및 서열 프로토콜은 또한 본 발명의 특허 청구항의 보호범위를 분명하게 나타낸다. 기재된 방법들은 변성된 경우에 대해서도 본 발명의 주요 내용을 기재하는 실시예로써 설명될 것이다.

실시예 1

E. coli 에서의 NGF 의 발현

a) 발현 플라스미드

성숙 부분을 코드하는 NGF 유전자를 문헌 [Ullrich et al., Nature 303: 821, 1983] 에 공표된 서열을 토대로 하여 특히 5' 부분을 변형시켜 합성한다. 문헌 [Beattie 및 Fowle, 1991, Nature 352; 548-549] 에 기재된 방법이 여기에서 사용된다. 클로닝이 용이하도록, 제한효소 EcoRI 의 절단 위치를 5' 말단에 삽입하고, 제한효소 HindIII 의 절단 위치를 3' 말단에 삽입한다. 합성된 핵산을 효소 EcoRI 및 HindIII 로 절단하여, 미리 EcoRI 로 절단하고 HindIII 로는 부분적으로 절단된 발현 벡터 pA27fd (EP-A 0 382 174 에 기재) 와 결찰시킨다. 결찰 제조물을 헬퍼 플라스미드 pUBS520 (Brinkmann et al., Gene 85 (1989), 109-114) 와 함께 E. coli 로 형질전환시킨다.

클론을 플라스미드-매개된 앰피실린 및 카나마이신 내성을 이용하여 선별한다. 수득된 플라스미드 pNGF23fd 는 약 400 bp 크기의 출발 플라스미드 pA27fd 보다 더 작은 EcoRI/HindIII 단편을 함유한다.

b) E. coli 내에서의 발현

발현 생산량을 조사하기 위해서, 플라스미드 pNGF23fd 및 pUBS520 으로 형질전환된 E.coli 균주를 앰피실린 및 카나마이신 (각각 최종농도 50 μg/ml) 가 존재하는 LB 배지 (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor)에서 550 nm 의 OD 까지 배양한다. 발현은 5 mM IPTG 의 첨가에 의해 개시된다. 배양액을 4 시간 더 항온배양한다. 다음으로, E. coli를 원심분리하여 수합하고 완충액 (50 mM 트리스-HCl pH 8, 50 mM EDTA) 에 재현탁시키고; E. coli를 초음파로 용균시킨다. 불용성 단백질 분획을 다시 원심분리하여 수합하고 상기 완충액에 초음파로 재현탁시킨다. 1/4 부피의 응용 완충액 (250 mM 트리스-HCl pH 6.8, 0.01 M EDTA, 5 % SDS, 5 % 메르캅토에탄올, 50 % 글리세롤 및 0.005 % 브로모페놀 블루)를 현탁액에 첨가하고 12.5 % SDS 폴리아크릴아미드겔을 이용하여 분석한다. IPTG 가 첨가되지 않은 E. coli (pNGF23fd, pUBS520) 의 배양액을 이용한 동일한 제조를 대조군으로서 수행하고 폴리아크릴아미드겔에 적용시킨다. IPTG-유도 배양 제조물에 있어서, 약 14 kD 의 분자량 (Biorad "H+L" 의 표준 단백질 혼합물과 비교)을 갖는 클리어 밴드가 0.2 % 코마씨블루 R250 (30 % 메탄올 및 10 % 아세트산중에 용해) 으로 염색한 후 나타난다. 이 밴드는 비유도된 E. coli 세포의 제조물에서는 나타나지 않는다.

실시예 2

세포 봉입체 (=IBs) 의 제조

재조합 NGF를 함유하는 IBs를 제조하기 위해서, 실시예 1 에 기재된 E. coli 발현 균주를 10 l 발효기내에서 8 시간 동안 발효시켰다. NGF 발현은 발효시작 4 시간 후인 대수성장기에 IPTG를 첨가하므로써 유도되었다.

발효 8 시간 후 원심분리하여 690 g 의 생물량을 수득하였다. 수득된 생물량을 3.5 l 의 0.1 mol/l 트리스-HCl, pH 7 에 현탁시키고, 0.7 g 의 리소자임, 7 mg DAase 및 0.4 mmol/l MgSO₄의 첨가 후, 0 ℃ 에서 20 분간 항온배양시킨다. 이어서 1000 바의 고압 분산을 이용하여 세포를 완전히 용균시킨다. DNase를 다시 용균 용액에 최종 농도 0.1 mg/ml 으로 첨가하고 최종 농도 2 mmol/l 의 MgSO₄를 첨가한 다음 용액을 20 ℃에서 30 분간 항온배양시킨다. DNase 처리후, 용액을 1/2 부피의 6 % Brij 35, 1.5 mol/l NaCl, 60 mmol/l EDTA, pH 7.0 으로 희석하고, 냉욕내에서 20 분간 항온배양시킨다. 불용성 성분 (IBs)을 이어서 원심분리로 분리시킨다. 침전물을 3 배 부피의 0.1 mol/l 트리스-HCl, 20 mmol/l EDTA, pH 6.5 (TE 완충액) 으로 현탁시킨다. 20 ℃ 로 30 분간 항온배양후, 다시 원심분리하여 IBs를 수합한다. 침전물의 다음 재현탁은 3 배 부피의 TE 완충액으로 수행한다. 20 ℃에서 30 분간 항온배양후, 추가적인 원심분리에 의해 침전물내에서 IBs를 수득한다.

IBs 내의 rh-NGF 의 양을 측정하기 위해서, 500 mg IBs (습중량)을 7.5 mol/l 구아니디늄-HCl (GdmHCl) 및 10 mmol/l EDTA, pH 6.0 의 용액으로 10 ml을 만든다음 2 시간 동안 현탁시킨다. 용액의 단백질 함량을 뷰우렛 단백질 결정법 (Boehringer Mannheim, Order No. 124281) 로 결정한다. 용해된 IBs 내에서 SDS 로 변성되고 DTE 로 환원된 단백질을 SDS 모세관 전기영동으로 분리한 후, 총 단백질 함량에 대한 rh-NGF 의 양을 그의 피크면적과 표준 NGF (예를 들어, Boehringer Mannheim, order No. 1457616) 의 피크면적을 비교하여 결정하거나 또는 SDS 겔 전기영동에 의한 단백질 분리후 시료 레인의 농도계측에 의해 결정한다. 10 리터의 발효 배양액으로부터 분리된 IBs 는 약 6 g rh-NGF를 함유한다.

실시예 3

rh-NGF 의 용해화 및 유도체화

a) 가용화물의 제조

IBs를 7.5 mol/l GdmHCl, 0.1 mol/l 트리스-HCl, 10 mmol/l EDTA 및 0.1 mol/l DTT, pH 8.5 의 용액에 20 내지 200 g 의 IBs/l 의 농도로 현탁시키고 20 ∼ 25 ℃에서 2 시간 동안 교반시켰다. 다음으로, 용액을 25 % HCl을 이용하여 pH 3 으로 조정하고 약 4 ℃ 로 냉각하였다. 상기 방법으로 수득된 가용화물을 6 내지 10 배 부피의 7.5 mol/l GdmHCl, 10 mmol/l EDTA, pH 3 으로 10 kDa 의 배타 한도를 갖는 초여과막상에서의 크로스플로우 여과 장치를 이용하여 약 4 ℃에서 투석여과 (diafiltrate) 시키거나 또는 투석 튜브내에서 동일한 완충액에 대해 수차례 투석시켰다.

b) 가용화물로 부터의 유도체 제조 (공지 기술)

실시예 3a에서 수득된 DTT-유리 투석된 가용화물을 20 mmol/l GSSG 와 부가혼합시키고 1 mol/l 트리스 용액으로 적정하여 pH 7.5 로 조정한다. 수득된 혼합물을 약 20 - 25 ℃에서 2 시간 동안 항온반응시킨 다음 25 % HCl 로 pH 6 으로 조절한 다음 약 4 ℃ 로 냉각시켰다. 상기 방법으로 수득된 유도체를 6 내지 10 배 부피의 7.5 mol/l GdmHCl, 10 mmol/l EDTA, pH 6 으로 10 kDa 의 배타 한도를 갖는 초여과막상에서의 크로스플로우 여과 장치를 이용하여 약 4 ℃에서 투석여과시키거나 또는 투석 튜브내에서 동일한 완충액에 대해 수차례 투석시켰다.

c) IBs 로부터 직접 유래된 유도체의 제조 (본 발명의 방법)

IBs를 7.5 mol/l GdmHCl, 0.1 mol/l 트리스-HCl, 10 - 200 mmol/l GSSG, 10 mmol/l EDTA, pH 6 의 용액에 20 내지 200 g 의 IBs/l 의 농도로 현탁시키고 20 ∼ 25 ℃에서 3 시간 동안 교반시켰다. 다음으로, 상기 방법으로 수득된 가용화물을 6 내지 10 배 부피의 7.5 mol/l GdmHCl, 10 mmol/l EDTA, pH 6 으로 10 kDa 의 배타 한도를 갖는 초여과막상에서의 크로스플로우 여과 장치를 이용하여 약 4 ℃에서 투석여과시키거나 또는 투석 튜브내에서 동일한 완충액에 대해 수차례 투석시켰다.

IBs 의 직접 유도체화를 유도체화중 pH 3 - 10, 및 투석여과중 pH 6 인 pH 값에서 유사한 방법으로 수행하고, pH 값을 NaOH 또는 HCl 로 투석전에 6 으로 조정한다. 6 이하인 pH 값의 경우에 있어서, GSSG 농도를 300 mmol/l 로 증가시킨다. 존재할 수 있는 용해되지 않은 GSSG를 유도체화 개시전에 원심분리하여 제거하였다.

완료된 유도체화의 확인을 SDS 겔 전기영동 및 중량 분광분석법 (MALDI-MS) 로 수행한다. 이는 실시예 3c에서 수득된 유도체화도가 유도체화중에 pH 값과는 독립적인 선행 기술 (실시예 3b) 에 따라 수행된 유도체화보다 상당히 높다는 것을 나타낸다.

유도체 및 가용화물의 재생화를 새로운 물질 및 4 ℃에서 보관된 물질로 조사한다 (상세한 것은 실시예 4 참조). 3c 에 따라 제조된 유도체가 생성중에 pH 값과는 독립적으로 4 주후에 불변한 재생화를 나타내는 반면, 가용화물 (3a) 의 재생 수율은 약 60 % 로 감소되고 선행기술에 따라 제조된 유도체 (3b) 는 약 80 % 로 감소되었다. 이는 예측한 바대로 MALDI-MS 데이터에 상응하고, 유도체의 안정성은 유도체화도에 따라 다르다.

실시예 4

rh-NGF 의 재생

실시예 3에서 제조된 가용화물/유도체로부터 생물학적 활성 rh-NGF를 제조하기 위해서, 비활성 가용성 형태인 rh-NGF를 함유하는 용액을 1 mol/l 트리스-HCl, 0.5 mol/l 아르기닌, 1 mmol/l EDTA, 1mmol/l GSH, pH 9.1 로 구성된 재생 완충액중에 약 4 ℃에서 20- 내지 500-배 희석한다.

재생된 rh-NGF를 확인하기 위해서, 혼합물을 24 시간 항온반응시킨 후 POROS R1/H 칼럼 (2.1×100mm, Perseptive Biosystems, Freiburg, Germany) 상의 역상 크로마토그래피에 의해서 정량한다. H₂O (0.1 % TFA) 중 5 % 아세토니트릴을 개시 완충액으로 사용하고, H₂O (0.1 % TFA) 중 80 % 이하의 아세토니트릴 농도구배를 이용하여 20 분간 1 ml/분의 유속으로 용출시킨다. 생물학적 검정법 (하기 참조) 으로 용출 분획을 평가하여 천연 NGF를 확인한다.

닭의 배 (8 일된 배) 의 분리된 배근신경절로부터 감각신경을 자극하여 수상돌기 (=DRG 테스트 = 배근신경절 검정법, Levi-Montalcini, R., Meyer, H. 및 Hamburger, V. 1954, Cancer Res. 14, 49-57; Varon, S., Nomura, J., Perez-Polo, J.R. 및 Shooter, E.M., 1972, Meth. in Neurochemistry 3, 203-229; EP-A 0335673, p14-15, example C) 를 생성할 수 있는 rh-NGF를 사용하여 HPLC 분획에서 또는 직접적으로 재생 용액에서의 재생된 생물학적 활성 rh-NGF 의 농도를 측정하였다.

HPLC 분획을 48-웰 플레이트에서 1:2 희석 단계로 c=100 ng/ml 내지 c=100 pg/ml 의 농도로 연속 희석하여 시험하였다. 상기 방법에 있어서, 상기 기술된 희석액 (= 최종 농도 c=20 ng/ml 내지 c=20 pg/ml) 100 μl 에 더하여 300 μl 배지 (F14 배지; Coon, M.G. 및 Weiβ, M.G., 1969, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 62, 852-859) 및 100 μl 세포 현탁액을 세포 배양 플레이트 (Falcon Co. 사제)에서 혼합하여 37 ℃, 3.5 % CO₂하에서 48 시간 동안 항온배양시켰다. 형성된 수상돌기를 갖는 세포수를 생물학적 활성을 측정하므로써 정량하였다. 마우스의 악하선으로 부터의 공지된 농도의 2.5 S NGF 의 용액 (Boehringer Mannheim Co.)을 참조용으로 사용하였다. 재생 제제를 원심분리 및 경우에 따라 F14 배지로의 예비희석후에 유사하게 조사하였다.

실시예 5

FX 프로테아제 유전자의 촉매 도메인의 클로닝

(플라스미드: pFX-CD)

방법

재조합 DNA 기술

문헌 [Sambrook, J. et al. (1989) In: Molecular cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York] 에 기재된 기본적인 방법을 사용하여 DNA를 조작한다. 제조자의 지시에 따라서 분자생물학적 시약을 사용한다.

단백질 결정

프로테아제 변이체 fFX-EGF2-AP-CD 의 단백질 농도를 아미노산 서열을 기준으로 계산된 몰 흡광도 계수 (ε=43490 cm²/mol) 를 이용하여 280 nm에서 광학 밀도 (OD)를 측정하므로써 결정된다.

발현 벡터

혈액 응집 프로테아제 변이체의 발현을 위한 벡터는 발현벡터 코어-스트렙트아비딘에 대한 pSAM-CORE를 근간으로한다. 플라스미드 p-SAM-CORE 의 제조 및 설명은 WO 93/09144 (Kopetzki, E. et al.) 에 기재되어있다.

코어-스트렙토아비딘 유전자를 pSAM-CORE 벡터에서의 목적하는 프로테아제 변이 유전자로 치환시킨다.

클로닝

아미노산 서열 위치 217 내지 454 의 FX 프로테아제 도메인을 코드하는 염기서열 위치 649 내지 1362의 FX cDNA (cDNA 서열 및 아미노산 서열은 문헌 (Kaul, R.K. et al., Gene 41 (1986) 311-314) 에 따라 번호화한다)를 PCR 프라이머 N1 (서열번호 1) 및 N2 (서열번호 2) 및 주형 DNA 로서 시판되는 사람 간 cDNA 유전자 은행 (벡터: Lambda ZAP II(상품명); Stratagene Company, La Jolla, CA, U.S.A) 를 이용한 문헌 [Mullis, K.B. 및 Faloona, F.A., Methods Enzymol. 155, (1987) 350-355] 에 기재된 방법에 따른 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 으로 증폭시킨다.

N1:

N2:

PCR 프라이머는 코딩 영역의 5' 말단에서 ATG 개시코돈 및 단일 BspHI 절단 위치 및 코딩 영역의 3' 말단에서 단일 HindIII 절단 위치에 도입된다.

약 740 bp 길이의 PCR 산물을 제한 효소 BspHI 및 HindIII로 절단하고, 약 725 bp 길이의 BspHI/HindII-FX 단편을 아가로스겔 전기영동에 의해 정제된 약 2.55 kbp 길이의 NcoI/HindIII-pSAM-CORE 벡터에 결찰시킨다. 목적하는 플라스미드 pFX-CD를 제한효소 지도화하여 밝히고 PCR 에 의해 단리된 FX cDNA 서열을 DNA 서열분석으로 확인한다.

실시예 6

EGF2 도메인, 활성 펩티드 및 촉매 도메인을 갖는 FX 프로테아제 유전자의 클로닝 (플라스미드: pFX-EGF2-AP-CD)

아미노산 서열 위치 108 내지 454 인 EGF2 도메인, 활성 펩티드 및 촉매 도메인을 코딩하는 염기서열 위치 322 내지 1362 인 FX cDNA를 PCR 프라이머 N3 (서열번호 3) 및 N2 (서열번호 2) 및 주형 DNA 로써 시판되는 사람 간 cDNA 유전자 은행 (벡터: Lambda ZAP II(상품명); Stratagene Company, La Jolla, CA, U.S.A) 를 이용하여 PCR 에 의해 증폭시킨다.

N3:

PCR 프라이머는 코딩 영역의 5' 말단에서 ATG 개시코돈 및 단일 EcoRI 절단 위치 및 코딩 영역의 3' 말단에서 단일 HindIII 절단 위치에 도입된다.

약 1.09 bp 길이의 PCR 산물을 제한 효소 EcoRI 및 BstEII로 절단하고, 약 1.02 kbp 길이의 EcoRI/BstEII-FX 단편을 아가로스겔 전기영동에 의해 정제된 약 2.58 kbp 길이의 EcoRI/BstEII-pFX-CD 벡터 단편 (실시예 5) 결찰시킨다. 목적하는 플라스미드 pFX-EGF2-AP-CD를 제한효소 지도화하여 밝히고 PCR 에 의해 단리된 FX cDNA 서열을 DNA 서열분석으로 확인한다.

실시예 7

a) E. coli 내에서 프로테아제 유전자의 발현

프로테아제 유전자를 발현하기 위해서 E. coli K12 균주 (예를 들어, UT5600 Grodberg, J. 및 Dunn, J.J. Bacteriol. 170 (1988) 1245-1253)를 실시예 6 에 기재된 발현 플라스미드 pFX-EGF2-AP-CD (앰피실린 내성) 및 억제 플라스미드 pUBS520 (카나마이신 내성, 제법 및 설명은 문헌 (Brinkmann, U. et al., Gene 85 (1989) 109-114) 에 기재) 으로 형질전환시킨다.

형질전환된 UT5600/pUBS520/pFX-EGF2-AP-CD 세포를 50 - 100 mg/l 앰피실린 및 50 mg/l 카나마이신을 함유하는 DYT 배지 (1 %(w/v) 효모 추출물, 1 % (w/v) 박토 트립톤 (Difco 사제) 및 0.5 % NaCl)에서 37 ℃ 로 550 nm 에서의 광학밀도 (OD₅₅₀)가 0.6-0.9 일 때 까지 진탕 배양기로 배양하고 이어서 IPTG (최종 농도 1 - 5 mmol/l)로 유도한다. 유도후 37 ℃에서 4-8 시간 배양한 후, 세포를 원심분리 (Sorvall RC-5B 원심분리기, GS3 rotor, 6000 rpm, 15 분) 하여 수합하고, 50 mmol/l 트리스-HCl 완충액 pH 7.2 로 세척한 다음 가공시까지 -20 ℃에서 보관한다. 1 리터 진탕 배양액으로 부터의 세포 수율은 4-5 g (습중량) 이다.

b) 발현 분석

각 경우의 배양 배지 (UT5600/pUBS520/pFX-EGF2-AP-CD 세포) 1 ml을 원심분리하여 수득된 세포 펠렛을 0.25 ml 10 mmol/l 트리스-HCl, pH 7.2 중에 재현탁시키고, Sonifier (상품명) 세포 파쇄기 B15 (Branson Company 사제, Heusenstamm, Germany)를 사용하여 초음파 처리 (50 % 강도로 30 초간 2 회 펄스) 하여 세포를 용균시킨다. 불용성 세포 성분들을 침강시키고 (Eppendorf 5415 centrifuge, 14000 rpm, 5 분), 1/5 부피의 5 × SDS 시료 완충액 (1×SDS 시료 완충액: 50 mmol/l 트리스-HCl, pH 6.8, 1 % SDS, 1 % 메르캅토에탄올, 10 % 글리세롤, 0.001 % 브로모페놀 블루)을 상청액에 첨가한다. 불용성 세포 파편 분획 (펠렛)을 6-8 M 우레아를 함유하는 1×SDS 시료 완충액 3 ml 중에 재현탁시키고, 시료를 95 ℃에서 5 분간 항온배양시킨 다음 다시 원심분리한다. 다음으로, 단백질을 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (PAGE) (Laemmli, U.K., Nature 227 (1970) 680-685) 으로 분리하고 코마씨 브릴리언트 블루 R 염료로 염색시킨다.

E. coli에서 합성된 FX-EGF2-AP-CD 프로테아제 변이체는 균질하고 오로지 불용성 세포 파편 분획 (세포 봉입체, IBs)에서만 발견된다. 발현 수율은 총 E. coli 단백질에 대해서 약 50 % 이다.

실시예 8

세포 용균, 세포 봉입체 (IBs) 의 용해화 및 제조

3 리터 진탕 배양액 (약 15 g 습중량) 으로 부터의 세포 펠렛을 75 ml 의 50 mmol/l 트리스-HCl, pH 7.2 중에 재현탁시킨다. 현탁액에 0.25 mg/ml 리소자임을 부가 첨가하고, 0 ℃에서 30 분간 항온배양시킨다. 2 mmol/l MgCl 및 10 μg/ml DNase I (Boehringer Mannheim GmbH, catalogue No. 104159)를 첨가한 후, 프렌치 프레스 (상품명; SLM Amico Company사제, Urbana, IL, USA)를 이용하여 고압 분산시켜 세포를 기계적으로 파쇄한다. 다음으로, DNA를 실온에서 30 분간 절단시킨다. 37.5 ml 50 mmol/l 트리스-HCl, pH 7.2, 60 mmol/l EDTA, 1.5 mol/l NaCl, 6 % Brij X-100을 제조물에 첨가하고, 실온에서 30 분 더 항온배양시키고 Sorvall RC-5B 원심분리기 (GSA Rotor, 12000 rpm, 15분) 으로 원심분리한다. 상청액을 버리고, 100 ml 50 mmol/l 트리스-HCl, pH 7.2, 20 mmol/l EDTA를 펠렛에 첨가하고, 4 ℃에서 30 분간 교반하면서 항온배양하고 다시 침강시킨다. 최종 세척 단계를 반복한다. 정제된 IBs (1.5-2.0 g 습중량, 25-30 % 건조중량, 100-150 mg 프로테아제)를 가공시까지 -20 ℃에서 보관한다.

실시예 9

IBs 의 용해화 및 환원/유도체화

정제된 IBs를 6 mol/l 구아니디늄-HCl, 100 mmol/l 트리스-HCl, 20 mmol/l EDTA, pH 8.0 중의 5-10 mg/ml 단백질에 해당하는 100 mg IB 펠렛 (습중량)/ml 의 농도로 현탁시키고, 200 mmol/l GSSG 또는 200 mmol/l GSH 의 존재하에 실온에서 1 내지 3 시간 동안 교반하면서 분취량을 용해시킨다. 이후, pH를 pH 5.0 으로 조정하고 불용성 성분들을 원심분리 (Sorvall RC-5B centrifuge, SS34 rotor, 16000 rpm, 15분) 하여 분리하고 6 mol/l 구아니디늄-HCl pH 5.0 에 대해서 4 ℃에서 24 시간 동안 투석시킨다. 유도체화를 SDS-PAGE를 이용하여 확인한다.

실시예 10

환원/유도체화에 대한 FX-EGF2-AP-CD 재생의 의존성

6 mol/l 구아니디늄-HCl 중에 용해화되고, 100 mmol/l DTE 로 환원되거나 또는 상이한 농도의 GSSG/GSH로 유도체화된 FX-EGF2-AP-CD 프로테아제 변이체를, 각 경우에 있어서 50 μl IB 가용화물/유도체를 5 ml 의 재생 완충액 (50 mmol/l 트리스-HCl, 0.6 mol/l 아르기닌/ 10 mmol/l CaCl₂/ 2 mmol/l EDTA/ 2 mmol/l GSH/ 0.5 mmol/l GSSG, pH 8.5) 중에 단일 첨가하여 4 ℃에서 재생시킨다.

재생된 단백질을 100 배 부피의 50 mmol/l 트리스-HCl, 150 mmol/l NaCl, 5 mmol/l CaCl₂, 0.1 % 폴리에틸렌 글리콜 8000 (PEG 8000), pH 8.0 에 대해 4 ℃에서 8 내지 16 시간 동안 2 회 투석시킨다. 침전된 단백질을 원심분리 (Eppendorf 5415 centrifuge, 14000 rpm, 5 분) 하여 분리하고, 투명한 상청액을 활성화에 사용한다.

실시예 11

RVV-X를 갖는 rFX-EGF2-AP-CD 프로테아제의 활성화

각 경우에 있어서 1 ml 의 재생되고 투석된 rFIX-EGF2-AP-CD 시료에 10 μl 의 러쎌 바이퍼 베놈 (RVV) 용액 (20 mmol/l 트리스-HCl, pH 7.6 중에 용해된 1 mg/ml 동결건조물; Sigma Aldrich Chemie GmbH Co.사제, Deisenhofen, GFR)을 부가 혼합시키고 37 ℃에서 1 - 2 일간 항온배양시킨다. 효소적 rFX-EGF2-AP-CD 활성화의 경과 시간을 절단의 완료 (플래토 부분, 최대 활성화) 시 까지 색소원 펩티드 기질 크로모자임 X (실시예 12 참조)를 이용하여 모니터한다. 상기에 대해서 시료 (20 μl)를 4-6 시간 간격으로 반응 혼합물로부터 채취하여 발생된 FXa 활성을 확인한다.

실시예 12

FXa 활성 시험

재생 및 활성화된 rFXa-EGF2-AP-CD 의 활성화를 색소원 기질 크로모자임 X (Boehringer Mannheim GmbH사제, Mannheim, GFR, cat.No. 789763)을 이용하여 확인한다. 20 μl 의 시료에 180 μl 의 50 mmol/l 트리스-HCl, 150 mmol/l NaCl, 5 mml/l CaCl₂, 0.1% PEG 8000, pH 8.0 및 20 μl 의 4 mmol/l 크로모자임 X를 실온, 미소적정 플레이트상에서 부가혼합하고, ELISA 판독기를 이용하여 405 nm 파장에서 흡광도를 측정하여 직선의 초기 기울기(ΔA/분)를 측정한다.

시험 원리:

측정 시그날: pNA (p-니트로아닐린)

FXa 기질: MOC-D-NleGlyArg-pNA (크로모자임 X)

시험 혼합물: 180 μl 완충액

+ 20 μl 기질 (크로모자임 X, 4 mmol/l)

+ 20 μl rFXa-EGF2-AP-CD 시료

실시예 13

재생 효율의 확인

생성된 rFXa-EGF2-AP-CD 활성 (플래토 부분)을 사용하여 재생 효율을 계산한다. 일련의 측정에 있어서 최고값을 100 % 로 한다.

환원된 단백질은 유도체화된 단백질과 비교하여 약 60 % 의 재생 수율을 나타낸다.

[참고도서 목록]

Bailey, J.L., Cole, R.D., J. Biol. Chem. 234 (1959) 1733-1739

Beattie 및 Fowle, Nature 352 (1991) 548-549

Biochem. Biophys. Res. Commun. 171 (1990) 116-122

Brinkmann et al., Gene 85 (1989) 109-114

Cole, R.D., Meth. Enzymol. 11 (1967) 206-208

Coon, M.G. 및 Weiβ, M.G., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 62 (1969) 852-859

EP-A 0 093 619

EP-A 0 114 506

EP-A 0 114 507

EP-A 0 241 022

EP-A 0 253 823

EP-A 0 329 175

EP-A 0 335 673

EP-A 0 361 475

EP-A 0 364 926

EP-A 0 370 171

EP-A 0 382 174

EP-A 0 414 151

EP-A 0 450 386

EP-A 0 121 338 (USP 5,169,762)

Gene 70 (1988) 57-65

Grodberg, J.; Dunn, J.J.: J. Bacteriol. 170 (1988) 1245-1253

Heath, W.F. et al., J. Biol. Chem. 267 (1992) 419-425

Kaul, R.K., Hildebrand, B.; Roberts, S.; Jagadeeswaran, P.,

Gene 41 (1986) 311-314

Laemmli, U.K., Nature 227 (1970) 680-685

Leibrock et al., Nature 341 (1989) 149-152 Levi-Montalcini,

R., Meyer, H. 및 Hamburger, V., Cancer Res. 14 (1954) 49-57

Marston F.A.O., Biochem. J. 214 (1986) 1-12

Mullis, K.B.; Faloona, F.A., Methods Enzymol. 155 (1987) 350-355

Sambrook, J.; Fritsch, E.F.; Maniatis, T.: Molecular Cloning: A Laboratory manual. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York, (1989)

Thannhauser, T.W., Konishi, Y., Sheraga, H.A., Analyt. Biochem 138 (1984)

181-188

Thannhauser, T.W., Scheraga, H.A., Biochemistry 24 (1985) 7681-7688

Ullrich et al., Nature 303 (1983) 821-825

US Patent 4,933,434

Varon, S., Nomura, J., Perez-Polo, J.R. 및 Shooter, E.M.,

Meth. in Neurochemistry 3 (1972) 203-229

Wetzel, R. et al., Gene 16 (1981) 63-71

WO 87/02673

WO 91/03568

WO 91/08762

WO 92/22665

WO 93/09144

WO 93/19084

WO 95/30686

[서열표]

(1) 일반정보:

(i) 출원인:

(A) 명칭: 베링거 만하임 게엠베하

(B) 거리: 잔트호퍼 슈트라쎄 116

(C) 도시: 만하임

(E) 국가: 독일

(F) 우편번호 (ZIP): D-68305

(G) 전화번호: 08856/60-3446

(H) 팩스번호: 08856/60-3451

(ii) 발명의 명칭: 변성된 단백질의 활성화 방법

(iii) 서열의 수 : 4

(iv) 컴퓨터 판독형태:

(A) 매체형태: 플로피 디스크

(B) 컴퓨터: IBM PC 호환가능

(C) 작동 시스템: PC-DOS/MS-DOS

(D) 소프트웨어: PatentIn Release #1.0, Version #1.30B (EPO)

(2) 서열번호 1 의 정보:

(i) 서열의 특징:

(A) 길이: 41 염기쌍

(B) 형태: 뉴클레오티드

(C) 가닥: 단일 가닥

(D) 토폴로지: 직선형

(ii) 분자형태: 기타 핵산

(A) 설명: /desc = "프라이머"

(xi) 서열 기재: 서열번호 1

(2) 서열번호 2 의 정보:

(i) 서열의 특징:

(A) 길이: 41 염기쌍

(B) 형태: 뉴클레오티드

(C) 가닥: 단일 가닥

(D) 토폴로지: 직선형

(ii) 분자형태: 기타 핵산

(A) 설명: /desc = "프라이머"

(xi) 서열 기재: 서열번호 2

(2) 서열번호 3 의 정보:

(i) 서열의 특징:

(A) 길이: 59 염기쌍

(B) 형태: 뉴클레오티드

(C) 가닥: 단일 가닥

(D) 토폴로지: 직선형

(ii) 분자형태: 기타 핵산

(A) 설명: /desc = "프라이머"

(xi) 서열 기재: 서열번호 3

(2) 서열번호 4 의 정보:

(i) 서열의 특징:

(A) 길이: 394 염기쌍

(B) 형태: 뉴클레오티드

(C) 가닥: 이중 가닥

(D) 토폴로지: 직선형

(ii) 분자형태: cDNA

(xi) 서열 기재: 서열번호 4

Claims

비활성이고 불완전한 가용성 형태인 단백질을 디술피드 성분의 존재하에서 변성 농도의 변성제 용액으로 항온반응, 용해 및 유도체화시키는 것을 특징으로 하는, 단백질 및 디술피드 성분으로 구성된 혼합된 디술피드의 제조방법.
제 1 항에 있어서, 디술피드 성분이 유도체화후에 제거되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 유도체화가 산성 조건하에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질상에서의 유리 SH 기가 EDTA 의 첨가에 의해 보호되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, GSSG, 시스타민 또는 시스틴이 디술피드 성분으로 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 디술피드 성분이 1 mmol/l 이상의 농도로 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
원핵생물에서 재조합 생성후에 수득될 수 있는 비활성이고 불완전한 가용성 형태로부터 생물학적 활성 단백질의 제조방법으로, 비활성, 불완전한 가용성 형태인 단백질을 디술피드 성분의 존재하에 변성 농도의 변성제 용액중에 용해시키고, 강 변성 용액을 비- 또는 약-변성 용액으로 변화시키므로써 디술피드 성분간의 디술피드 결합이 끊어지고, 단백질중 분자내에 새로운 디술피드 결합이 생성되므로 단백질이 생물학적 활성을 갖는 형태를 채택하는 방식으로 용해된 단백질이 생물학적 활성 구조를 갖게되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 7 항에 있어서, 재생된 단백질이 프로테아제, 성장인자, 단백질 호르몬, 신경영양물질 또는 시토킨인 것을 특징으로 하는 방법.