ES2214624T3 - Procedimiento de activacion de proteina desnaturalizada. - Google Patents
Procedimiento de activacion de proteina desnaturalizada.Info
- Publication number
- ES2214624T3 ES2214624T3 ES97928173T ES97928173T ES2214624T3 ES 2214624 T3 ES2214624 T3 ES 2214624T3 ES 97928173 T ES97928173 T ES 97928173T ES 97928173 T ES97928173 T ES 97928173T ES 2214624 T3 ES2214624 T3 ES 2214624T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- protein
- mmol
- disulfide
- denaturing
- baselineskip
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
- C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
- C07K1/1133—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure by redox-reactions involving cystein/cystin side chains
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/48—Nerve growth factor [NGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Hematology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Abstract
UN PROCEDIMIENTO PARA LA OBTENCION DE DISULFUROS MEZCLADOS A PARTIR DE UNA PROTEINA Y UN COMPUESTO DE DISULFURO, CARACTERIZADO PORQUE LA PROTEINA ESTA EN UNA FORMA INACTIVA Y POCO SOLUBLE E INCUBADA CON UNA SOLUCION DE UN COMPUESTO DESNATURALIZANTE A UNA CONCENTRACION SUFICIENTE PARA DESNATURALIZARLA Y EN PRESENCIA DE UN COMPUESTO DE DISULFURO, DISUELTO Y CONVERTIDO EN UN DERIVADO; ESTE PROCEDIMIENTO ES APROPIADO PARA LA OBTENCION DE PROTEINAS RECOMBINANTES RENATURALIZADAS A PARTIR DE PROCARIONTES CON UN ELEVADO RENDIMIENTO.
Description
Procedimiento de activación de proteína
desnaturalizada.
La presente invención se refiere a un
procedimiento simplificado de solubilización y naturalización de
proteínas desnaturalizadas, en especial de proteínas
desnaturalizadas obtenidas por métodos recombinantes.
Durante la obtención de proteínas en células
procarióticas, p.ej. E. coli, se forman a menudo agregados
proteínicos inactivos difícilmente solubles (cuerpos de inclusión).
Para convertir estas proteínas en su forma activa es necesario
solubilizarlas y naturalizarlas. Estos procedimientos son conocidos
y se describen por ejemplo en los documentos
EP-A-0 361 475,
EP-A-0 114 506,
EP-A- 0 093 619,
EP-A-0 253 823, WO 87/02673,
EP-A-0 364 926 y
EP-A-0 241 022. Un factor crucial,
que limita el rendimiento en proteína naturalizada durante la
activación, es la reacción competidora entre la conversión de la
proteína naturalizada en el producto intermedio correcto de
plegamiento y la agregación de varias moléculas proteínicas. Por
este motivo, la concentración de proteínas naturalizadas en la
solución de naturalización es un parámetro esencial para el
rendimiento del proceso de naturalización. A medida que aumenta la
concentración de proteínas naturalizadas se favorece la agregación y
disminuye el rendimiento relativo de proteína naturalizada con la
conformación de proteína nativa (concentración crítica).
Para la fabricación industrial de proteínas
recombinantes, la cantidad de proteína a naturalizar es por lo
general mucho mayor que la concentración crítica. En el caso
frecuente de poco solubilidad de las proteínas en el tampón
utilizado para la activación surgen, por tanto, inconvenientes
considerables, como son bajo rendimiento, mucha dedicación de
tiempo y grandes volúmenes de tampón.
Por el documento WO 87/02673 se conoce un
procedimiento en el que la proteína inactiva soluble se solubiliza
con los agentes desnaturalizador y reductor, a continuación se
separa el reductor y después de las proteínas solubilizadas se
obtienen disulfuros heterólogos mixtos entre las proteínas y por
ejemplo la glutationa. Estos disulfuros mixtos son ventajosos para
la purificación y renaturalización posteriores, porque después de
la modificación de los grupos tiol la proteína queda protegida de
la oxidación del aire y, de este modo, es estable en un intervalo
más amplio de valores de pH. El cambio de la carga neta facilita
también la purificación, ya que con una cromatografía de
intercambio iónico se pueden separar las proteínas no
modificadas.
Para la formación de disulfuros mixtos se incuba
la proteína solubilizada, dializada, reducida y liberada de
reductores, con una solución que contiene un agente
desnaturalizador y un componente disulfuro para la derivatización
(p.ej. GSSG, cistina, cistamina). Una vez separado el componente
disulfuro se realiza una naturalización por el método habitual. Este
procedimiento es eficaz, pero exige la ejecución de un gran número
de etapas individuales, en especial para separar el reductor antes
de iniciar la derivatización.
Por el documento WO 93/19084 se conoce un
procedimiento de plegamiento y purificación del factor de
crecimiento I similar a la insulina. En él se disuelven los cuerpos
de inclusión en condiciones reductoras, a continuación se añade un
exceso de oxidante, sin separar el reductor. La naturalización se
inicia con la dilución posterior (sin diálisis) y la nueva adición
de reductor (para formar un sistema redox). En el documento WO
91/08762 se describe la obtención de un factor de crecimiento
biológicamente activo, derivado de plaquetas. Para ello se realiza
en primer lugar una solubilización a pH 3 sin reductor y después
una purificación en condiciones desnaturalizadoras. Solo entonces
se añade el oxidante para obtener un derivado. Según el documento
EP-A-0 450 386 se obtiene un
extracto de cuerpos de inclusión (proteína NGF disuelta en
condiciones desnaturalizadoras) por adición de tampón solubilizador
y posterior centrifugación. El extracto se trata seguidamente con el
reductor, se incuba y sin diálisis previa se oxida por adición del
oxidante. A continuación se efectúa la dilución y adición de otros
componentes para la naturalización. Es decir, en este procedimiento
se efectúa en primer lugar como etapa separada una solubilización,
sin añadir sustancias activas en procesos redox. Ninguno de estos
procedimientos es idóneo para una renaturalización por pulsos según
la patente
US-4 933 434.
US-4 933 434.
Se conocen otros procedimientos que permiten la
derivatización durante la misma solubilización. Se conoce desde
hace mucho tiempo el método de la sulfitolisis (ver p.ej. Bailey,
J.L., Cole, R.D. en J. Biol. Chem. 234,
1733-1739, 1959; Cole, R.D. en Meth. Enzymol.
11, 206-208, 1967; EP-0 114
507). En él se tratan los puentes disulfuro de las proteínas con
sales del ácido sulfuroso, con lo cual se forma un producto de
reacción que es una mezcla en cada caso del 50% de grupos SH
proteicos tiosulfonados (RS-SO_{3}^{-}) y
libres (RS^{-}). Los grupos SH libres citados en último lugar se
convierten de nuevo en disulfuros por reoxidación (p.ej. con iones
cobre, yodosobenzoato o con preferencia con tetrationato), estos
disulfuros en el curso de nuevos ciclos del proceso se convierten
de forma prácticamente total en el tiosulfonato. Este proceso es
relativamente sencillo y puede realizarse en condiciones suaves
(p.ej. pH neutro). Como ya se explica en J. Biol. Chem. 234,
1733, el conveniente estriba en que el tiosulfonato formado es
químicamente lábil, la finalización de la reacción no puede
comprobarse y, sobre todo, en que el reoxidante provoca la
destrucción parcial de los restos triptofano. Otro inconveniente
consiste en que es muy difícil conseguir la separación completa de
los productos secundarios provistos de grupos SH proteínicos y los
oxidantes así como el yodosobenzoato citado del producto final y la
detección analítica es muy laboriosa. Sin embargo, tal detección es
imprescindible en el caso de las proteínas destinadas a fines
terapéuticos, con el fin de poder descartar los posibles efectos
secundarios de un fármaco que ha sufrido modificaciones químicas y,
por lo tanto, distintas de las fisiológicas.
En el documento WO 95/30686 se describe también
una sulfitolisis de este tipo para la naturalización de factores
neurotróficos del grupo NGF-BDNF. Un procedimiento
similar para la naturalización de proinsulina humana se describe
por parte de R. Wetzel y col., en Gene 16,
63-71 (1981) y de W.F. Heath y col., en J. Biol.
Chem. 267, 419-425 (1992).
Se conoce también un método similar que evita el
uso de condiciones de reoxidación que puedan dañar las cadenas
laterales (Thannhauser, T.W., Konishi, Y., Scheraga, H.A. en
Analyt. Biochem. 138, 181-188, 1984;
Thannhauser, T.W., Scheraga, H.A., en Biochemistry 24,
7681-7688, 1985): en este caso en lugar de una
reoxidación se realiza la derivatización directa de la cisteína,
obtenida por reducción de los puentes disulfuro, por reacción con el
2-nitro-5-(sulfotio)-benzoato;
en ella se libera el
2-nitro-5-tiobenzoato
que puede determinarse fotométricamente, permitiendo de este modo
la cuantificación de los grupos SH reaccionados. El inconveniente
de este método estriba en que se introduce una sustancia
químicamente compleja que resulta muy laborioso separar del
producto final y comprobar que se ha separado. Por otro lado, los
autores (Biochemistry 24, 7681) han observado que el
tiosulfonato obtenido solamente es estable en caso de ausencia
total de grupos tiol. Por otro lado, en este caso se observa
también una modificación de las cadenas laterales (desamidación de
la asparagina).
El objetivo de la presente invención consiste en
simplificar y mejorar estos procedimientos y obtener proteínas
derivatizadas en los grupos SH que sean estables al almacenaje y
que puedan naturalizarse con gran rendimiento.
Se ha encontrado, de modo sorprendente, que según
el procedimiento de la invención pueden realizarse en una sola
etapa la solubilización y la derivatización, sin necesidad de
realizar la reducción previa. Es sorprendente en especial que la
derivatización pueda llevarse a cabo también en condiciones ácidas
(pH inferior a 7,0, con preferencia pH entre 3 y 6,5), sobre todo
para las neurotrofinas, como el NGF, y ello sin incidencia
importante en la cinética y en la realización completa, si se
compara con una reacción con componentes tiol en el intervalo
habitual de pH, por ejemplo entre 7 y 10. Por lo general se suponía
que tales reacciones solamente eran viables en presencia del anión
tiolato libre; debido a que los aniones tiolato, en una
concentración eficaz, tienen un pH alto, situado en torno a 9, lo
dicho no se cumple hasta que el pH es igual o superior a 7.
Es, pues, objeto de la presente invención un
procedimiento para la obtención de disulfuros mixtos a partir de
una proteína y un componente disulfuro, que está caracterizado
porque la proteína en forma inactiva y difícilmente soluble (cuerpos
de inclusión) se incuba, se disuelve y se derivatiza con una
solución de una agente desnaturalizador en un concentración
desnaturalizadora y en presencia de un componente disulfuro (la
proporción molar entre proteína y componente disulfuro es de 1:1 a
1:10000, con preferencia hasta 1:1000) y después se elimina
eventualmente el componente disulfuro. La eliminación del
componente disulfuro puede realizarse de modo conveniente cuando
después se realice una naturalización por pulsos, descrita por
ejemplo en la patente US-4 933 434. La proteína
derivatizada de la presente invención es estable y puede
almacenarse antes de los procesos ulteriores. Esto es
particularmente ventajoso porque, en aplicación del procedimiento de
la presente invención, la obtención de la proteína derivatizada
puede tener lugar con independencia de la naturalización. De este
modo se dispone de la proteína derivatizada en forma de producto
intermedio aislado, que puede someterse a un gran número de
procedimientos y/o partidas de naturalización y de purificación.
Como alternativa, la incubación para la
derivatización de la proteína se realiza en presencia de un
reductor (p.ej. DTT, DTE, GSH, cisteína, cistamina, sales del ácido
sulfuroso). Con ello puede mejorarse el rendimiento de la
derivatización. La concentración del reductor se elige de modo
conveniente de forma que se no se restrinja o se restrinja poco la
eficacia del componente disulfuro; han dado buenos resultados las
concentraciones de reductor situadas como máximo en el 20% molar,
con preferencia como máximo en el 10% molar de la concentración del
componente disulfuro.
Para proteger los grupos SH libres se pueden
añadir con preferencia otros reactivos que puedan impedir total o
parcialmente el bloqueo o la destrucción de estos grupos SH por
parte de metales pesados, radicales o especies activas de oxígeno. A
este grupo de reactivos protectores pertenecen por ejemplo el EDTA
en una concentración de 0,1 a
100 mmoles/l o la manita en una concentración de 1 a 1000 mmoles/l.
100 mmoles/l o la manita en una concentración de 1 a 1000 mmoles/l.
Se entienden por componentes disulfuro las
sustancias del grupo de los disulfuros, p.ej. GSSG, cistamina o
cistina. Los componentes disulfuro son capaces de derivatizarse en
grupos SH después de la rotura de un puente disulfuro de las
proteínas. El componente disulfuro se utiliza con preferencia en una
concentración por lo menos de 1 mmol/l o mayor, con preferencia de 1
- 1000 mmoles/l, con preferencia especial de 10 a 200 mmoles/l.
Como agente desnaturalizador se emplea de modo
conveniente un desnaturalizador empleado habitualmente para la
solubilización de proteína desnaturalizada en condiciones
oxidantes. Se utilizan con preferencia el clorhidrato de guanidinio
u otras sales de guanidinio, p.ej. el sulfato, el fosfato o el
tiocianato, así como urea o sus derivados. Pueden utilizarse
también mezclas de estos desnaturalizadores.
La concentración del desnaturalizador dependerá
del tipo del desnaturalizador y el experto en la materia la podrá
determinar sin más. La concentración del desnaturalizador será
suficiente cuando se puede lograr la solubilización completa de la
proteína desnaturalizada difícilmente soluble. Para el clorhidrato
de guanidinio, estas concentraciones se sitúan habitualmente entre
3 y 8 moles/l, con preferencia entre 6 y 8 moles/l. Para la urea,
las concentraciones se sitúan normalmente entre 6 y 10 moles/l.
Se entiende por "proteína en una forma inactiva
difícilmente soluble" aquella proteína que se forma en
procariotas después de la obtención recombinante. Tales proteínas
se forman habitualmente cuando tiene lugar una sobreexpresión de
proteínas eucarióticas en procariotas y la proteína no se expulsa en
forma activa al periplasma o al líquido sobrenadante celular. De
este modo, la proteína obtenida por método recombinante permanece
en forma insoluble o agregada en el citoplasma o periplasma. Tales
agregados, su aislamiento y su purificación se describen por ejemplo
en Marston F.A.O., Biochem. J. 214, 1-12,
1986. Para obtener cuerpos de inclusión se disgregan las células
procariotas después de la fermentación.
La disgregación celular puede efectuarse por los
métodos habituales, p.ej. por ultrasonidos, dispersión de alta
presión o lisozima. La disgregación se realiza con preferencia en
una solución tampón idónea para ajustar el pH a un valor entre
neutro y ligeramente ácido, que actúa como medio de suspensión,
p.ej. 0,1 moles/l de Tris-HCl. Después de la
disgregación celular se separan los componentes insolubles (cuerpos
de inclusión) por cualquier método, con preferencia por
centrifugación o por filtración después del lavado con agentes que
no interfieran con las proteínas, pero a ser posible disuelvan las
proteínas celulares, p.ej. agua o tampón fosfato, añadiendo
eventualmente detergentes suaves, p.ej. Brij®. A continuación se
somete el precipitado (perdigón o pellet) al procedimiento de
solubilización y derivatización de la presente invención.
El procedimiento de la invención se lleva a cabo
en un intervalo neutro o alcalino del pH, con preferencia a un pH
entre 6 y 10, con preferencia especial a un pH entre 7 y 8. Son
idóneas como solubles tampón todos los tampones habituales; la
adición de tampones no es necesaria en el caso de usar el
clorhidrato de guanidinio como desnaturalizador, porque este tiene
efecto tampón. Se utilizan con preferencia tampones ya conocidos
del experto en la materia, p.ej. Tris o fosfato. De modo
sorprendente, el procedimiento de la invención puede llevarse a
cabo con ventaja especial en el caso de las neurotrofinas incluso
en condiciones ácidas (pH 3-6,5).
El procedimiento de la invención se lleva a cabo
con adición de un componente disulfuro. Los componentes disulfuro
preferidos son p.ej. GSSG, cistamina y cistina. Dado que la
reacción de derivatización constituye una reacción de equilibrio
entre por un lado la proteína en la forma tiol y el componente
disulfuro o entre el disulfuro mixto de la proteína y del componente
disulfuro y por otro lado los componentes tiol, es decir los grupos
proteína-tiol restantes, así como los componentes
tiol liberados de los componentes disulfuro por reacción con la
proteína en forma tiol, la reacción de derivatización deseada
tendrá que forzarse con un gran exceso del componente disulfuro.
Las condiciones requeridas para ello son muy diferentes de una
proteína a otra. Se trabaja con preferencia en un intervalo de
concentraciones del componente disulfuro de 10 mmoles/l hasta el
límite de saturación (para el GSSG p.ej. en función del pH de la
partida: de 200 a 300 mmoles/l; para la cistamina: aprox. 700
mmoles/l), el intervalo de concentraciones se situará con
preferencia especial entre el 50 y el 100% de la concentración de
saturación del componente disulfuro.
En el procedimiento de la invención es preferida
además la adición de un reductor. Son preferidos en especial los
reductores del grupo de los mercaptanos, por ejemplo la glutationa
reducida (GSH) o el 2-mercaptoetanol, la
ditioeritrita (DTE) o la ditiotreita (DTT), en una concentración de
0,01 a 50 mmoles/l, con preferencia de 0,1 a 10 mmoles/l. Son
también preferidos los reductores tales como p.ej. las sales del
ácido sulfuroso, p.ej. el sulfito sódico. La adición de uno de
estos reductores no es un requisito imprescindible para que tenga
éxito la ejecución de la reacción, pero en función de la proteína
tratada esta adición puede traducirse en un mejor rendimiento en la
activación de la proteína.
El procedimiento de la invención se lleva a cabo
de modo conveniente a temperatura ambiente, durante un período de
0,1 a 100 horas, con preferencia de 1 a 24 horas, con preferencia
especial de 2 a 4 horas. Otras condiciones, p.ej. el calentamiento
hasta 60ºC o la ejecución de un enfriamiento hasta 0ºC, pueden ser
también apropiadas. Para evitar la oxidación del reductor por acción
del oxígeno del aire y para proteger los grupos SH libres es
conveniente añadir EDTA con preferencia en una cantidad de 1 a 100
mmoles/l, con preferencia especial de 10 mmoles/l. Igualmente
conveniente para reprimir las reacciones secundarias por radicales,
que pueden transcurrir por ejemplo en soluciones que contienen
tioles sobre todo en valores altos del pH, es ventajoso añadir
capturadores de radicales ("extintores"), p.ej. manita, en una
concentración de 1 a 1000 mmoles/l, con preferencia en una
concentración de 20 a 200 mmoles/l, con preferencia especial en una
concentración de 50 mmoles/l, durante la naturalización y/o
purificación de las proteínas.
Después de la solubilización/derivatización se
dializa con preferencia frente a una solución que contenga un
desnaturalizador en una concentración desnaturalizadora, para
eliminar el componente disulfuro y el reductor eventualmente
utilizado. La solución, frente a la cual se dializa, contiene de
modo conveniente el desnaturalizador en la misma concentración que
la solución de desnaturalización/derivatización. Es también
preferido dializar frente a otros agentes desnaturalizadores de
igual concentración molar, contra 1 mmol/l de HCl o de ácido
acético diluido. Se constatado además que es conveniente no separar
por completo los componentes disulfuro; tal como se ha indicado
antes, la reacción de derivatización es una reacción de equilibrio
entre los componentes tiol libres y los componentes disulfuro
(eventualmente mixtos). Si no se realiza la derivatización completa
de todos los grupos tiol de las proteínas, se corre el peligro
después de la separación del componente disulfuro de que el
componente tiol libre restante tenga un efecto reductor en los
disulfuros mixtos presentes y por ello pueda darse un retroceso
posterior del rendimiento en derivatización durante el almacenaje
de la proteína derivatizada. Con vistas a la protección perseguida
con la derivatización de los grupos tiol de las proteínas contra la
oxidación y otras reacciones secundarias destructivas, el grado de
derivatización de la proteína tratada tendrá que ser por lo tanto
lo más alto posible y tendrá que ser estable. Esto puede lograrse
interrumpiendo la diálisis en estado prematuro, antes de que la
concentración del componente disulfuro se sitúe por debajo de la
concentración idónea, o bien dializando frente a un tampón de
diálisis que contenga el componente disulfuro precisamente en la
concentración requerida. La concentración requerida para mantener
el grado de derivatización durante el almacenaje de la proteína
derivatizada dependerá de la proteína tratada en cuestión y en
especial del contenido en cisteína de la proteína tratada y puede
situarse en un intervalo de concentraciones de 0 a 100 mmoles/l.
Para el uso ulterior de la proteína derivatizada en la reacción de
reactivación habrá que tener en cuenta que con la introducción del
componente disulfuro en el proceso de reactivación no se influya o
por lo menos no se influya de modo importante en las condiciones
aplicadas para la deseada unión oxidante de los puentes disulfuro
inter- o intramoleculares. Por este motivo se considera favorable
una concentración residual de componente disulfuro de 1 a 10
mmoles/l en la proteína derivatizada.
Otro objeto de la invención es un procedimiento
de obtención de una proteína naturalizada a partir de su forma
inactiva, difícilmente soluble, que puede obtenerse por un método
recombinante en procariotas, caracterizado porque la proteína en su
forma inactiva difícilmente soluble se incuba, disuelve y
derivatiza en una solución de un agente desnaturalizador en una
concentración desnaturalizadora y en presencia de un componente
disulfuro (la proporción molar entre proteína y componente
disulfuro se sitúa entre 1:1 y 1:10000, con preferencia hasta
1:1000) y la proteína disuelta adopta una configuración
biológicamente activa por conversión de la solución intensamente
desnaturalizadora en una solución no desnaturalizadora o débilmente
desnaturalizadora, para ello por adición de un sistema redox se
rompen los enlaces disulfuro con el componente disulfuro y pueden
volver a formarse en la proteína a nivel intramolecular de modo que
la proteína adopte una conformación, en la que posee su actividad
biológica característica.
Estas condiciones desnaturalizadoras débiles
pueden ajustarse por ejemplo por dilución o diálisis, con
preferencia en presencia de un reductor. A diferencia de las
condiciones intensamente desnaturalizadoras, las condiciones
desnaturalizadoras débiles son aquellas en las que la proteína es
capaz de adoptar su conformación activa y permanecer estable en
esta conformación. En condiciones intensamente desnaturalizadoras,
la proteína es inestable en esta forma y tiende a desnaturalizarse,
es decir a perder su estructura tridimensional estable y su enlace
disulfuro más favorable en el sentido energético. Se dan las
condiciones intensamente desnaturalizadoras por ejemplo en
soluciones de 4-9 moles/l de clorhidrato de
guanidina. Se dan las condiciones débilmente desnaturalizadores por
ejemplo entre 0,1 y 2 moles/l de clorhidrato de guanidina. Para la
naturalización se utiliza de modo conveniente la arginina también
en concentraciones de 0,1 a 1 mol/l.
Se entiende por actividad de la proteína una
actividad biológica de la misma. En el supuesto de ser una proteína
de origen natural o un derivado de una proteína natural, la
actividad biológica de la proteína podrá determinarse mediante sus
propiedades inmunológicas, de biología celular o catalíticas.
Para la activación (naturalización) es preferido
trabajar en una concentración de GSH de 0,1 a 20 mmoles/l, una
concentración de GSSG de 0,01 a 10 mmoles/l sin agente
desnaturalizador o bien en una concentración no desnaturalizadora
del agente desnaturalizador y llevar a cabo la reactivación en un
período de tiempo de 1 a 300 horas. La concentración de GSH se sitúa
con preferencia especial entre 0,5 y 10 mmoles/l y/o la
concentración de GSSG se situará entre 0,1 y 10 mmoles/l.
El procedimiento de la invención es idóneo para
la naturalización de un gran número de proteínas desnaturalizadas,
en especial las proteínas desnaturalizadas obtenidas por métodos
recombinantes. Tales proteínas son por ejemplo las proteasas, los
factores de crecimiento, las proteíno-hormonas, las
citocinas, los activadores de plasminógeno, el factor Xa y en
especial las neurotrofinas. Las neurotrofinas son proteínas que se
localizan sobre todo en las células nerviosas y favorecen la
diferenciación y la supervivencia de las células nerviosas. Las
neurotrofinas (p.ej. el NGF, el "brain derived nerve growth
factor" (BDNF), las neurotrofinas 3, 4/5, 6) son, por lo tanto,
agentes terapéuticos celulares valiosos para el tratamiento de
enfermedades neurodegenerativas, por ejemplo las polineuropatías,
la enfermedad de Alzheimer o las lesiones cerebrales o de la médula
espinal.
El factor de crecimiento nervioso (NGF) humano es
una proteína que consta de dos subunidades (homodímero). La
capacidad de operar el crecimiento de las neuronas sensoras y las
neuronas simpáticas se atribuye a la unidad \beta. El NGF maduro
consta de 118 aminoácidos, contiene tres puentes disulfuro y no
esta glicolizado. El NGF biológicamente activo está en forma de
dímero. El DNA y la secuencia de aminoácidos del NGF se describe en
el documento
EP-B-0 121 338 (patente US-5 169 762). Sin embargo, la proteína activa no se ha podido obtener según este documento. La obtención del NGF recombinante activo se describe por ejemplo en los documentos EP-A-0 329 175,
EP-A-0 370 171, en Biochem. Biophys. Res. Commun. 171, 116-122 (1990); EP-A-0 414 151; Gene 70, 57-65 (1988); EP-A-0 450 386 y Gene 85, 109-114 (1989).
EP-B-0 121 338 (patente US-5 169 762). Sin embargo, la proteína activa no se ha podido obtener según este documento. La obtención del NGF recombinante activo se describe por ejemplo en los documentos EP-A-0 329 175,
EP-A-0 370 171, en Biochem. Biophys. Res. Commun. 171, 116-122 (1990); EP-A-0 414 151; Gene 70, 57-65 (1988); EP-A-0 450 386 y Gene 85, 109-114 (1989).
El "brain derived neurotrophic factor "
(BDNF) se ha descrito por Leibrock y col. en Nature 341,
149-152 (1989). El BDNF favorece la supervivencia
de las neuronas sensoras del sistema nervioso central y parece
tener éxito en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson. El BDNF
recombinante puede obtenerse por ejemplo según lo descrito en el
documento WO 91/03568 en células CHO y según WO 92/22665 en
procariotas.
Los siguientes ejemplos, publicaciones y
protocolo de secuencia ilustran la invención con mayor detalle,
cuyo alcance se define en las reivindicaciones. Los procedimientos
descritos se deberán considerar como ejemplos, que incluso después
de sufrir modificaciones describen el objeto de la invención.
Sobre la base de la secuencia publicada por
Ullrich y col. (Nature 303, 821, 1983) e introduciendo
algunas modificaciones, en especial en la porción situada en 5', se
obtuvo por vía sintética el gen NGF (SEQ ID NO: 4), que codifica la
parte madura. Para ello se aplicó el método de Beattie y Fowle
(Nature 352, 548-549, 1991). Para facilitar
la clonación se añadió al extremo 5' un sitio de corte para la
enzima de restricción EcoRI y al extremo 3' un sitio de corte para
la enzima de restricción HindIII. El ácido nucleico sintetizado se
restringió con las enzimas EcoRI y HindIII y se ligó con el vector
de expresión pA27fd (descrito en el documento
EP-A-0 382 174), digerido
previamente con EcoRI y parcialmente con HindIII. El añadido de
ligación se transformó junto con el plásmido auxiliar pUBS520 en
E. coli (Brinkmann y col., Gene 85,
109-114, 1989).
La selección de los clones se realizó a través de
la resistencia a la ampicilina y a la canamicina conferida por los
plásmidos. El plásmido obtenido pNGF23fd contiene un fragmento
EcoRI/HindIII, de un tamaño de 400 bp, que es menor que el plásmido
pA27fd de partida.
Para comprobar la capacidad de expresión se
cultivó una cepa de E. coli transformada con los plásmidos
pNGF23fd y pUBS520 en el medio LB (Sambrook y col., Molecular
Cloning, Cold Spring Harbor 1989) en presencia de ampicilina y
canamicina (en cada caso en una concentración final de 50
\mug/ml) hasta una densidad óptica (OD) de 550 nm. Se inició la
expresión por adición de 5 mM de IPTG. El cultivo se incubó durante
4 horas más. A continuación se recogieron las E. coli por
centrifugación y se resuspendieron en un tampón (50 mM
Tris-HCl de pH 8,50; 50 mM EDTA); por tratamiento
con ultrasonidos se provocó la lisis de las E. coli. Con otra
centrifugación se recogieron las fracciones insolubles de proteína y
se volvieron a suspender en el tampón recién mencionados por
tratamiento con ultrasonidos. Se añadió a la suspensión 1/4 de
volumen de tampón de extensión (250 mM Tris-HCl, pH
6,8; 0,01 mEDTA, 5% SDS, 5% mercaptoetanol, 50% glicerina y 0,005%
azul de bromofenol) y se analizó con SDS al 12,5% en gel de
poliacrilamida. Como control se realizó la misma preparación con un
cultivo de E. coli (pNGF23fd, pUBS520) al que no se añadió
el IPTG y se extendió sobre el gel de poliacrilamida. En la
preparación del cultivo inducido con IPTG y después de colorear el
gel con un 0,2% de Coomassie-Blue R250 (disuelto en
un 30% de metanol y un 10% de ácido acético) se puede observar una
banda clara con un peso molecular (comparada con la mezcla de
proteínas estándar de Biorad "H+L") de unos 14 kD. Esta banda
no aparece en la preparación de las células de E. coli no
inducidas.
Para la preparación de IB que contengan NGF
recomb. se fermentó la cepa de expresión de E. coli descrita
en el ejemplo 1 en un fermentador de 10 l durante 8 horas. La
inducción de la expresión del NGF se llevó a cabo por adición de
IPTG en la fase de crecimiento logarítmico aprox. 4 horas después
del inicio de la fermentación.
Se recolectaron por centrifugación 690 g de
biomasa después de 8 horas de fermentación. Se suspendió la biomasa
en 3,5 l de Tris-HCl 0,1 mol/l, pH 7, y después de
añadir 0,7 g de lisozima, 7 mg de DNasa y 0,4 mmol/l de MgSO_{4}
se incubó a 0ºC durante 20 min. A continuación se realizó la
disgregación celular total por dispersión de alta presión a 1000
bar. A la solución de disgregación se le añadieron de nuevo la
DNasa hasta 0,1 mg/ml y el MgSO_{2} hasta 2 mmol/l y se incubó la
solución a 20ºC durante 30 minutos. Después del tratamiento con la
DNasa se diluyó la solución con un volumen mitad de un 6% de Brij
35, 1,5 moles/l de NaCl, 60 mmoles/l de EDTA, pH 7,0, y se incubó
en un baño de hielo durante 20 minutos. Seguidamente se separaron
por centrifugación los componentes insolubles (IB). Se suspendió el
precipitado en un volumen 3 veces mayor de 0,1 mol/l de
Tris-HCl, 20 mmoles/l de EDTA, pH 6,5 (tampón TE).
Después de una incubación de 30 minutos a 20ºC se recolectaron los
IB por nueva centrifugación. La siguiente resuspensión del
precipitado se realizó en un volumen 3 veces mayor de tampón TE.
Después de una incubación de 30 minutos a 20ºC se obtuvieron los IB
por nueva centrifugación del precipitado.
Para determinar la porción de
rh-NGF en los IB se completaron 500 mg de IB (peso
húmedo) con una solución de 7,5 moles/l de
guanidio-HCl (GdmHCl) y 10 mmoles/l de EDTA, pH
6,0, hasta 10 ml y se suspendieron durante 2 horas. Se determinó el
contenido de proteína de la solución mediante la determinación del
biuret (Boehringer Mannheim, artículo nº 124281). La porción de
rh-NGF dentro de las proteínas totales en los IB
disueltos se determinó después de separar las proteínas
desnaturalizadas con SDS y las proteínas reducidas con DTE mediante
electroforesis capilar de SDS por comparación de la superficie de
los picos con el NGF patrón (p.ej. Boehringer Mannheim, artículo nº
1457616) o por separación de las proteínas mediante electroforesis
a través de gel SDS por determinación densitométrica de las cintas
de las muestras. Los IB aislados a partir de 10 l de caldo de
fermentación contenían unos 6 g de rh-NGF.
Se suspenden los cuerpos de inclusión (IB) en una
solución de 7,5 moles/l de GdmHCl, 0,1 mol/l de
Tris-HCl, 10 mmoles/l de EDTA y 0,1 mol/l de DTT, pH
8,5, hasta una concentración de 20 a 200 g de IB/l y se agita a
20-25ºC durante 2 horas. A continuación se ajusta
el pH a 3 añadiendo una solución de HCl del 25% y se enfría a 4ºC.
Se diafiltra el solubilizado así obtenido a 4ºC en una máquina de
filtración Crossflow a través de una membrana de ultrafiltración con
límite de exclusión de 10 kDa frente a 6-10
volúmenes de 7,5 moles/l de GdmHCl, 10 mmoles/l de EDTA, pH 3, o
bien se dializa en el tubo flexible de diálisis varias veces frente
al mismo tampón.
Al solubilizado dializado, libre de DTT, obtenido
en el ejemplo 3a, se le añaden 20 mmoles/l de GSSG y se ajusta a pH
7,5 por valoración con una solución de 1 mol/l de Tris. Se incuba
la mezcla resultante a 20-25ºC durante 2 horas y
después se ajusta el pH a 6 por adición de HCl del 25% y se enfría a
4ºC. Se diafiltra el derivado así obtenido a 4ºC en una máquina de
filtración Crossflow a través de una membrana de ultrafiltración
con límite de exclusión de 10 kDa frente a 6-10
volúmenes de GdmHCl 7,5 M, 10 mmoles/l de EDTA, pH 6, o bien se
dializa en el tubo flexible de diálisis varias veces frente al mismo
tampón.
Se suspenden los IB en una solución de 7,5
moles/l de GdmHCl, 0,1 mol/l de Tris, 10-200
mmoles/l de GSSG, 10 mmoles/l de EDTA, pH 6, hasta una
concentración de 20 a 200 g de IB/l y se agita a
20-25ºC durante 3 horas. Se diafiltra el derivado
así obtenido a 4ºC en una máquina de filtración Crossflow a través
de una membrana de ultrafiltración con límite de exclusión de 10
kDa frente a 6-10 volúmenes de 7,5 moles/l de
GdmHCl, 10 mmoles/l de EDTA, pH 6, o bien se dializa en el tubo
flexible de diálisis varias veces frente al mismo tampón.
La derivatización directa de los IB se realiza de
igual manera en un valor de pH de 3 a 10 para la derivatización y
pH 6 para la diafiltración, el valor del pH se ajusta a 6 antes de
la diálisis añadiendo NaOH o bien HCl. Para valores de pH
inferiores a 6 se aumenta la concentración de GSSG hasta 300
mmoles/l. El GSSG eventualmente sin disolver se elimina por
centrifugación antes de iniciar la derivatización.
La comprobación (detección) de la derivatización
realizada se realiza mediante electroforesis a través de gel SDS y
por espectroscopía de masas (MALDI-EM). Se observa
que, con independencia del pH existente durante la derivatización,
el grado de derivatización del ejemplo 3c se sitúa en valores
claramente superiores a los de la derivatización efectuada con
arreglo al estado de la técnica (ejemplo 3b).
Se estudia el comportamiento de naturalización
del derivado y del solubilizado con material fresco y con material
almacenado a 4ºC (ver detalles en ejemplo 4). Los derivados
obtenidos según 3c, con independencia del pH de la obtención,
presentan un comportamiento de naturalización invariable al cabo de
4 semanas (rendimiento: aprox. 100% del valor inicial), mientras que
el rendimiento de la naturalización del solubilizado (3a) se reduce
al 60% y del derivado (3b) obtenido según el estado de la técnica,
al 80%. Esto guarda buena relación con los datos
MALDI-EM, es decir, la estabilidad del derivado es
independiente del grado de derivatización, como era de esperar.
Para la obtención del rh-NGF
biológicamente activo a partir de los solubilizados/derivados
obtenidos en el ejemplo 3 se diluyen a 4ºC las soluciones que
contienen los rh-NGF en forma inactiva, soluble, de
20 a 500 veces en el tampón de naturalización, que se compone de 1
mol/l de Tris-HCl, 0,5 mol/l de arginina, 1 mmol/l
de EDTA, 1 mmol/l de GSH, pH 9,1.
Para detectar los rh-NGF
naturalizados se cuantifican las mezclas después de un período de
incubación de 24 h mediante cromatografía en fase inversa en una
columna POROS R1/H (2,1 x 100 mm, Perseptive Biosystems, Friburgo,
Alemania). Como tampón inicial se utiliza un 5% de acetonitrilo en
H_{2}O (0,1% de TFA), la elución se realiza con un gradiente de
hasta el 80% de acetonitrilo en H_{2}O (0,1% de TFA) durante 20
min y un caudal de
1 ml/min. Se identifica el NGF nativo evaluando las fracciones de líquido eluido en un bioensayo (ver más abajo).
1 ml/min. Se identifica el NGF nativo evaluando las fracciones de líquido eluido en un bioensayo (ver más abajo).
Para determinar las concentraciones de
rh-NGF naturalizado, biológicamente activo, de las
fracciones de HPLC o directamente de las soluciones de
naturalización se emplea la estimulabilidad provocada por el
rh-NGF en las neuronas sensoras de ganglios de la
raíz dorsal disociada de embriones de pollo (día embrionario: 8)
para impulsar la formación de dendritas (= ensayo DRG = dorsal root
ganglion assay, Levi-Montalcini, R., Meyer, H. y
Hamburger, H, Cancer Res. 14, 49-57, 1954;
Varón, S., Nomura, J., Pérez-Polo, J.R. y Shooter,
E.M., Meth. in Neurochemistry 3, 203-229,
1972; EP-A-0 335 673, pp.
14-15, ejemplo C).
Se ensayan las fracciones HPLC en una serie de
diluciones en concentraciones de c = 100 ng/ml hasta c = 100 pg/ml
en etapa de dilución 1:2 en placas de 48 hoyos. Para ello, en
placas de cultivo celular de la empresa Falcon se mezclan 300
\mul de medio (medio F14; Coon, M.G. y Wei\beta, M.G., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 62, 852-859, 1969) y 100
\mul de la suspensión celular más 100 \mul de las diluciones
recién indicadas (= concentraciones finales de c = 20 ng/ml hasta c
= 20 pg/ml) y se incuban a 37ºC con un 3,5% de CO_{2} durante 48
horas. Como indicativo de la actividad biológica se cuantifica el
número de células con dendritas formadas. Como referencia se
utiliza una solución de concentración conocida de 2,5 S de NGF de
las glándulas submaxilares de ratón (empresa Boehringer Mannheim).
De modo similar se investigan las mezclas de naturalización después
de centrifugarlas y event. prediluirlas con medio F14.
(Plásmido: pFX-CD)
Métodos
Para la manipulación del DNA se emplean métodos
estándar, p.ej. los descritos por Sambrook, J. y col. en: Molecular
cloning: A laboratory manual, editorial Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York 1989. Los
reactivos de biología molecular empleados se utilizan siguiendo las
instrucciones del fabricante.
Se halla la concentración de proteínas de la
variante de proteasa
rFX-EGF2-AP-CD por
determinación de la densidad óptica (OD) a 280 nm empleando el
coeficiente de extinción molar calculado a partir de la secuencia de
aminoácidos (\varepsilon = 43490 cm^{2}/mol).
El vector para la expresión de las variantes de
proteasa de coagulación de la sangre se basa en el vector de
expresión pSAM-CORE de
"core-estreptavidina". Los detalles de
obtención y la descripción del plásmido pSAM-CORE
se encontrarán en el documento WO 93/09144 de Kopetzki, E. y
col.
El gen "core-estreptavidina"
se sustituye por el gen deseado de variante de proteasa en el
vector pSAM-CORE.
Se amplifica el FX cDNA de la posición Bp
649-1362, que codifica a los dominios de proteasa
FX de la posición de aminoácidos 217-454 (la
numeración de la secuencia del cDNA y de la secuencia de
aminoácidos se da con arreglo a la publicación de Kaul, R.K. y col.,
en Gene 41, 311-314, 1986) en una
"reacción en cadena de polimerasa" (PCR) según el método de
Mullis, K.B. y Faloona, F.A. (Methods Enzymol. 155,
350-355, 1987), empleando los cebadores N1 de PCR
(SEQ ID NO: 1) y N2 (SEQ ID NO: 2)
EcoRI BspHI
N1:
5'-AAAAAAGAATTCTCATGATCGTGGGAGGCCAGGAATGCAAG-3'
HindIII
N2:
5'-AAAAAAAAGCTTCATTACTTGGCCTTGGGCAAGCCCCTGGT-3'
y un banco de genes cDNA de hígado humano,
producto comercial (vector: Lamba ZAP® II) de la empresa Stragagene
(La Jolla, CA., EE.UU.) como DNA molde. Mediante los cebadores PCR
se introduce en el extremo 5' de la región codificadora un sitio de
corte singular BspHI y un codón de inicio ATG y en el extremo 3' de
la región codificadora un sitio de corte singular HindIII.
El producto de la PCR tiene una longitud de 740
pares de bases (Bp) y se digiere con las endonucleasas de
restricción BspHI e HindIII y el fragmento
BspHI/HindIII-FX, que tiene una longitud de 725 Bp,
se purifica por electroforesis a través de gel de agarosa y se liga
al fragmento del vector
NcI/HindIII-pSAM-CORE, que tiene una
longitud de 2,55 kBp. El plásmido deseado pFX-CD se
identifica por mapeado de restricción y se comprueba la secuencia FX
cDNA, aislada por PCR, mediante secuenciación de DNA.
Se amplifica el FX cDNA de la posición Bp
322-1362, que codifica a los dominios de proteasa
FX de la posición de aminoácidos 108-454 mediante
una PCR empleando los cebadores N3 de PCR (SEQ ID NO: 3) y N2 (SEQ
ID NO: 2)
EcoRI
N3:
5'-AAAAAAGAATCCATTAAAGAGGAGAAATTAAAATGCGGAAGCTCTGCAGCCTGGACAAC-3'
y un banco de genes cDNA de hígado humano,
producto comercial (vector: Lamba ZAP® II) de la empresa Stragagene
(La Jolla, CA., EE.UU.) como DNA molde. Mediante los cebadores PCR
se introduce en el extremo 5' de la región codificadora un codón de
inicio ATG y un sitio de corte singular EcoRI y en el extremo 3' de
la región codificadora un sitio de corte singular HindIII.
El producto de la PCR tiene una longitud de 1,09
kBp y se digiere con las endonucleasas de restricción EcoRI y
BstEII y el fragmento EcoRI/BstEII-FX, que tiene
una longitud de 1,02 kBp, se purifica por electroforesis a través de
gel de agarosa y se liga al fragmento del vector
EcoRI/BstEII-pFX-CD, que tiene una
longitud de 2,58 kBp (ejemplo 5). El plásmido deseado
pFX-EGF2-AP-CD se
identifica por mapeado de restricción y se comprueba la secuencia FX
cDNA, aislada por PCR, mediante secuenciación de DNA.
Para la expresión del gen de proteasa
FX-EGF2-AP-CD se
transforma una cepa K12 de E. coli (p.ej. UT5600, Grodberg,
J. y Dunn, J.J., en J. Bacteriol. 170,
1245-1253, 1988) con el plásmido de expresión
pFX-EGF2-AP-CD
(resistencia a la ampicilina) descrito en el ejemplo 6 y el plásmido
represor lacl^{q}, el pUBS520 (resistencia a la canamicina,
obtención y descripción: Brinkmann, U. y col., Gene 85,
109-114, 1989).
Se cultivan a 37ºC las células transformadas
UT5600/
pUBS520/pFX-EGF2-AP-CD
en un cultivo agitado en medio DYT (1% (p/v) de extracto de
levadura, 1% (p/v) de Bacto Tryptone, Difco, y 0,5% de NaCl) con
50-100 mg/l de ampicilina y 50 mg/l de canamicina
hasta alcanzar una densidad óptica a 550 nm (OD_{550}) de
0,6-0,9 y después se inducen con IPTG (concentración
final: 1-5 mmoles/l). Después de la fase de
inducción de 4-8 horas a 37ºC se recolectan las
células por centrifugación (centrífuga Sorvall
RC-5B, rotor GS3, 6000 rpm, 15 min), se lavan con
50 mmoles/l de tampón Tris-HCl, pH 7,2, y se
almacenan a -20ºC hasta el momento de su procesado ulterior. El
rendimiento celular de 1 litro de cultivo agitado es de
4-5 g (peso húmedo).
Los perdigones (pellets) celulares obtenidos en
cada caso de 1 ml de medio de cultivo separado por centrifugación
(células
UT5600/pUBS520/pFX-EGF2-AP-CD)
se resuspenden en 0,25 ml de 10 mmol/l de Tris-HCl,
pH 7,2, y se disgregan las células por ultrasonidos (2 pulsos a 30 s
con una intensidad del 50%) mediante un aparato Sonifier® Cell
Disruptor B 15 de la empresa Branson (Heusenstamm, RFA). Se
sedimentan los componentes celulares insolubles (centrífuga
Eppendorf 5415, 14000 rpm, 5 min) y al líquido sobrenadante se le
añaden 1/5 de volumen de 5xSDS-tampón de muestra
(1xSDS-tampón de muestra: 50 mmol/l de
Tris-HCl, pH 6,8, 1% de SDS, 1% de mercaptoetanol,
10% de glicerina, 0,001% de azul de bromofenol). La fracción de
restos celulares insolubles (perdigón) se resuspende en 0,3 ml de
1xSDS-tampón de muestra con 6-8
mol/l de urea, se incuban las muestras a 95ºC durante 5 min y se
vuelve a centrifugar. A continuación se separan las proteínas por
electroforesis a través de gel de SDS-poliacrilamida
(PAGE) (Laemmli, U.U., Nature 227, 680-685,
1970) y se colorean con el colorante azul Coomassie Brilliant Blue
R.
La variante de proteasa
FX-EGF2-AP-CD
sintetizada en E. coli es homogénea y se halla
exclusivamente en la fracción de restos celulares insolubles
("cuerpos de inclusión", IB). El grado de expresión se sitúa en
el 50%, referido a la proteína total de E. coli.
El perdigón celular de 3 litros de cultivo
agitado (aprox. 15 g de peso húmedo) se resuspende en 75 ml de 50
mmoles/l de Tris-HCl, pH 7,2. A esta suspensión se
le añaden 0,25 mg/ml de lisozima y se incuba a 0ºC durante 30 min.
Se añaden 2 mmoles/l de MgCl_{2} y 10 \mug/ml de DNasa
(Boeheringer Mannheim GmbH, nº de cat. 104159) y se disgregan las
células mecánicamente mediante dispersión de alta presión con una
prensa French® de la empresa SLM Amico (Urbana, IL, EE.UU.).
Después se digieren los DNA a temperatura ambiente (RT) durante 30
min. A esta mezcla se le añaden 37,5 ml de 50 mmoles/l de
Tris-HCl, pH 7,2, 60 mmoles/l de EDTA, 1,5 moles/l
de NaCl, 6% de Brij X-100, se incuba a RT durante
30 min más y se centrifuga en una centrífuga Sorvall
RC-5B (rotor GSA, 12000 rpm, 15 min). Se desecha el
líquido sobrenadante, al perdigón se le añaden 100 ml de 50
mmoles/l de Tris-HCl, pH 7,2, 20 mmoles/l de EDTA,
se incuba a 4ºC con agitación durante 30 min y se sedimenta de
nuevo. Se repite la última etapa de lavado. Los IB purificados
(1,5-2,0 g de peso húmedo, 25-30% de
masa seca, 100-150 mg de proteasa) se almacenan a
-20ºC hasta el momento de su proceso ulterior.
Se suspenden los IB purificados en una
concentración de 100 mg de perdigón de IB (peso húmedo)/ml
equivalentes a 5-10 mg/ml de proteína en 6 moles/l
de guanidinio-HCl, 100 mmoles/l de
Tris-HCl, 20 mmoles/l de EDTA, pH 8,0, y se
disuelven partes alícuotas en presencia de 200 mmoles/l de GSSG o de
200 mmoles/l de GSH a RT y con agitación durante
1-3 horas. A continuación se ajusta el pH a 5,0 y
los componentes insolubles se separan por centrifugación
(centrífuga Sorvall RC-5B, rotor SS34, 16000 rpm, 15
min) y se dializan frente a 6 moles/l de
guanidinio-HCl, pH 5,0, a 4ºC durante 24 h. La
derivatización se detecta mediante SDS-PAGE.
La naturalización de la variante de proteasa
FX-EGF2-AP-CD
solubilizada en 6 moles/l de guanidinio-HCl y
reducida con 100 mmoles/l de DTE, o derivatizada con diversas
concentraciones de GSSG/GSH se realiza a 4ºC por la adición única
en cada caso de 50 \mul de solubilizado/derivado de IB a 5 ml del
tampón de naturalización (50 mmoles/l de
Tris-HCl/0,6 moles/l de arginina/10 mmoles/l de
CaCl_{2}/2 mmoles/l de EDTA/2 mmoles/l de GSH/0,5 mmoles/l de
GSSG, pH 8,5).
Se dializa la proteína naturalizada dos veces en
cada caso frente a 100 vol. de 50 mmoles/l de
Tris-HCl, 150 mmoles/l de NaCl, 5 mmoles/l de
CaCl_{2}, 0,1% de polietilenglicol 8000 (PEG 8000), pH 8,0, a 4ºC
durante 8-16 h. Se separa la proteína precipitada
por centrifugación (centrífuga Eppendorf 5415, 14000 rpm, 5 min) y
se utiliza el líquido sobrenadante transparente para la
activación.
En cada caso a 1 ml de las muestras de
rFX-EGF2-AP-CD
naturalizadas y dializadas se les añaden 10 \mul de una solución
de "Russels viper venom" (RVV) (1 mg/ml de liofilizado
disuelto en 20 mmoles/l de Tris-HCl, pH 7,6) de la
empresa Sigma Aldrich Chemie GmbH (Deisenhofen, RFA) y se incuba a
37ºC durante 1-2 días. El curso temporal de la
activación enzimática de la
rFX-EGF2-AP-CD se
sigue con el sustrato peptídico cromógeno X (ver ejemplo 12) hasta
la digestión total (meseta, activación máxima). Para ello se toman
de la mezcla reaccionante muestras (20 \mul) a intervalos de
4-6 horas y se determina la actividad de FXa
generada.
Se determina la actividad de la
rFXa-EGF2-AP-CD
naturalizada y activada con el sustrato cromógeno Chromozym X de la
empresa Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, RFA, nº de cat.
789763). A 20 \mul de muestra se les añaden a RT 180 \mul de 50
mmoles/l de Tris-HCl, 150 mmoles/l de NaCl, 5
mmoles/l de CaCl_{2}, 0,1% de PEG 8000, pH 8,0, y 20 \mul de 4
mmoles/l de Chromozym X en una placa de microvaloración y se
determina la velocidad inicial lineal (\DeltaE/min) por medición
de la extinción a una longitud de onda de 405 nm con un lector
ELISA.
Principio del ensayo:
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{ \+ rFXa-EGF2-AP-CD\+\cr MOC-D-NleGlyArg-pNa \+ - - - - - - - - - - - - - - - - - > \+ MOC-D-NleGlyArg + pNA\cr}
Señal medida: pNA
(p-nitroanilina)
Sustrato FX:
MOC-D-NLeGlyArg-pNa
(Chromozym X)
- Mezcla del ensayo:
- 180 \mul de tampón
- +20 \mul de sustrato (Chromozym X, 4 mmoles/l)
- +20 \mul de muestra rFXa-EGF2-AP-CD
Para calcular la eficacia de la naturalización se
emplea la actividad generada de la
rFXa-EGF2-AP-CC
(valor de meseta). El valor máximo dentro de la serie de valores
medidos se toma como magnitud de referencia, que se coloca en el
100%.
La proteína reducida proporciona un rendimiento
de naturalización del 60% con respecto a la proteína
derivatizada.
Bailey, J.L., Cole; R.D., J.
Biol. Chem. 234 (1959) 1733-1739.
Beattie and Fowle, Nature
352 (1991) 548 - 549
Biochem. Biophys. Res. Commun. 171
(1990) 116 - 122
Brinkmann et al., Gene 85
(1989) 109 -114
Cole, R.D., Meth. Enzymol. 11
(1967) 206-208.
Coon, M.G. und WeiB, M.G., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 62 (1969),
852-859
EP-A 0 093 619
EP-A 0 114 506
EP-A 0 114 507
EP-A 0 241 022
EP-A 0 253 823
EP-A 0 329 175
EP-A 0 335 673
EP-A 0 361 475
EP-A 0 364 926
EP-A 0 370 171
EP-A 0 382 174
EP-A 0 414 151
EP-A 0 450 386
EP-B 0 121 338 (USP
5,169,762)
Gene 70 (1988) 57 - 65
Grodberg, J.; Dunn, J.J.: J.
Bacteriol. 170 (1988) 1245-1253
Heath, W.F. et al., J. Biol. Chem.
267 (1992) 419 - 425
Kaul, R.K.; Hildebrand, B.;
Roberts, S.; Jagadeeswaran, P., Gene 41
(1986) 311- 314
Laemmli, U.K., Nature 227
(1970) 680-685.
Leibrock et al., Nature 341
(1989) 149 – 152 Levi-Montalcini, R.,
Meyer, H. und Hamburger, V., Cancer Res. 14
(1954) 49-57
Marston F.A.O., Biochem. J. 214
(1986) 1 - 12
Mullis, K.B.; Faloona, F.A,
Methods Enzymol. 155 (1987)
350-355
Sambrook, J.; Fritsch, E.F.;
Maniatis,T.: Molecular cloning: A laboratory manual. Cold
Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York,
(1989).
Thannhauser, T.W., Konishi, Y.,
Scheraga, H.A., Analyt. Biochem 138 (1984)
181-188.
Thannhauser, T.W., Scheraga, H.A.,
Biochemistry 24 (1985) 7681-7688.
Ullrich et al., Nature 303
(1983) 821 - 825
US-Patent 4,933,434
Varon, S., Nomura, J.,
Perez-Polo, J.R. und Shooter, E.M.,
Meth. in Neurochemistry 3 (1972)
203-229
Wetzel, R et al., Gene 16
(1981) 63 - 71
WO 87/02673
WO 91/03568
WO 91/08762
W0 92/22665
WO 93/09144
WO 93/19084
WO 95/30686
(1) DATOS GENERALES
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: BOEHERINGER MANNHEIM GmbH
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Sandhofer Str. 116
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Mannheim
\vskip0.333000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Alemania
\vskip0.333000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: D-68305
\vskip0.333000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: +49 8856-60 3446
\vskip0.333000\baselineskip
- (H)
- TELEFAX: +49 8856-60 3451
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Procedimiento de activación de proteína desnaturalizada
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 4
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- VERSIÓN COMPUTERIZADA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- SOPORTE DE DATOS: disquete (floppy disk)
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM o compatible
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA: PatentIn Release #1.0, versión #1.30B (EPA)
\vskip0.666000\baselineskip
(2) DATOS DE LA SEQ ID NO: 1:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 41 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE HEBRA: monohebra
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULAR: ácidos nucleicos diversos
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc. = cebador ("primer")
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAAAAAAGAAT TCTCATGATC GTGGGAGGCC AGGAATGCAA G
\hfill41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) DATOS DE LA SEQ ID NO: 2:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 41 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE HEBRA: monohebra
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULAR: ácidos nucleicos diversos
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc. = cebador ("primer")
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAAAAAAAAGC TTCATTACTT GGCCTTGGGC AAGCCCCTGG T
\hfill41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) DATOS DE LA SEQ ID NO: 3:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 59 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE HEBRA: monohebra
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULAR: ácidos nucleicos diversos
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc. = cebador ("primer")
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SEQ ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAAAAAAGAAT CCATTAAAGA GGAGAAATTA AAATGCGGAA GCTCTGCAGC CTGGACAAC
\hfill59
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) DATOS DE LA SEQ ID NO: 4:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 394 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE HEBRA: doble hebra
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULAR: cDNA
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SEQ ID NO: 4:
Claims (8)
1. Procedimiento para la obtención de disulfuros
mixtos a partir de una proteína y un componente disulfuro,
caracterizado porque la proteína se incuba, se disuelve y se
derivatiza en forma inactiva, difícilmente soluble, con una
solución de un agente desnaturalizador en una concentración
desnaturalizadora y en presencia de un componente disulfuro.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque después de la derivatización se separa
el componente disulfuro.
3. Procedimiento según las reivindicaciones 1 ó
2, caracterizado porque la derivatización se realiza en
condiciones ácidas.
4. Procedimiento según las reivindicaciones
1-3, caracterizado porque los grupos SH
libres de la proteína se protegen por adición de EDTA.
5. Procedimiento según las reivindicaciones
1-4, caracterizado porque en calidad de
componente disulfuro se utiliza el GSSG, la cistamina o la
cistina.
6. Procedimiento según las reivindicaciones
1-5, caracterizado porque el componente
disulfuro se utiliza en una concentración por lo menos de 1
mmol/l.
7. Procedimiento de fabricación de una proteína
biológicamente activa a partir de su forma inactiva, difícilmente
soluble, que puede obtenerse por métodos recombinantes en
procariotas, caracterizado porque la proteína en su forma
inactiva, difícilmente soluble, se disuelve con una solución de un
agente desnaturalizador en una concentración desnaturalizadora y en
presencia de un componente disulfuro, la proteína disuelta por
modificación debida a la solución intensamente desnaturalizadora en
una solución no desnaturalizadora o débilmente desnaturalizadora
adopta una conformación biológicamente activa, los enlaces
disulfuro se rompen con el componente disulfuro y se vuelven a
formar en la proteína a nivel intramolecular de modo que la
proteína adopta una formación que le permite desplegar una
actividad biológica.
8. Procedimiento según la reivindicación 7,
caracterizado porque la proteína naturalizada es una
proteasa, un factor de crecimiento, una hormona proteica, una
neurotrofina o una citocina.
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP96109288 | 1996-06-11 | ||
EP96109288 | 1996-06-11 | ||
EP96110109 | 1996-06-22 | ||
EP96110109 | 1996-06-22 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2214624T3 true ES2214624T3 (es) | 2004-09-16 |
Family
ID=26141986
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES97928173T Expired - Lifetime ES2214624T3 (es) | 1996-06-11 | 1997-06-11 | Procedimiento de activacion de proteina desnaturalizada. |
Country Status (12)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US6342585B1 (es) |
EP (1) | EP0904355B1 (es) |
JP (1) | JP3288720B2 (es) |
KR (1) | KR100305341B1 (es) |
AT (1) | ATE260972T1 (es) |
AU (1) | AU714318B2 (es) |
BR (1) | BR9709569B1 (es) |
CA (1) | CA2257122C (es) |
DE (1) | DE59711375D1 (es) |
ES (1) | ES2214624T3 (es) |
TR (1) | TR199802584T2 (es) |
WO (1) | WO1997047735A1 (es) |
Families Citing this family (16)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0994188B1 (de) | 1998-10-09 | 2004-01-07 | Scil proteins GmbH | Verfahren zur Gewinnung von aktivem Beta-NGF |
DE19957904A1 (de) * | 1999-12-01 | 2001-06-07 | Merck Patent Gmbh | Insektengift-Allergene mit verminderter IgE-Reaktivität und Verfahren zu ihrer Herstellung |
US20040223967A1 (en) * | 2000-05-24 | 2004-11-11 | Riken | Blood coagulation factor-activating protein and antibody thereto |
AU2001273348A1 (en) * | 2000-07-10 | 2002-01-21 | Diosynth Rtp, Inc. | Purification of human troponin i |
US7112570B2 (en) * | 2000-08-24 | 2006-09-26 | Neuren Pharmaceuticals, Ltd. | GPE analogs |
DE10105912A1 (de) * | 2001-02-09 | 2002-08-14 | Roche Diagnostics Gmbh | Rekombinante Proteinase K |
US7714020B2 (en) * | 2001-05-24 | 2010-05-11 | Neuren Pharmaceuticals Limited | Treatment of non-convulsive seizures in brain injury using G-2-methyl-prolyl glutamate |
EP1401808B1 (en) | 2001-05-24 | 2009-07-08 | Neuren Pharmaceuticals Limited | Gpe analogs and peptidomimetics |
US20070004641A1 (en) * | 2001-05-24 | 2007-01-04 | Neuren Pharmaceuticals Limited | Cognitive enhancement and cognitive therapy using glycyl-L-2-methylprolyl-L-glutamate |
US7605177B2 (en) * | 2001-05-24 | 2009-10-20 | Neuren Pharmaceuticals Limited | Effects of glycyl-2 methyl prolyl glutamate on neurodegeneration |
AU2002354363A1 (en) * | 2001-12-04 | 2003-06-17 | Mitsubishi Pharma Corporation | Method of activating protein |
DE10224111A1 (de) * | 2002-05-29 | 2003-12-18 | November Ag Molekulare Medizin | Verfahren zum Assemblieren von Untereinheiten zu Kapsoiden |
AU2003259846A1 (en) * | 2002-08-16 | 2004-03-03 | The General Hospital Corporation | Non-invasive functional imaging of peripheral nervous system activation in humans and animals |
JPWO2004056872A1 (ja) * | 2002-12-20 | 2006-04-20 | 三菱ウェルファーマ株式会社 | タンパク質のチオール基を保護する方法 |
US20080131500A1 (en) * | 2006-12-04 | 2008-06-05 | The Board Of Regents Of The University Of Texas System | Methods and compositions for rapid inactivation of proteins |
MX2014010092A (es) * | 2012-02-29 | 2014-09-16 | Hoffmann La Roche | Escision enzimatica en columna. |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU141204B (en) | 1904-08-30 | 1905-07-18 | William Trewiiella | Improved pawl and ratchet mechanism |
GR79124B (es) * | 1982-12-22 | 1984-10-02 | Genentech Inc | |
US4923767A (en) * | 1985-06-18 | 1990-05-08 | International Fuel Cells | Fuel cell power plants employing an aqueous solution |
DE3537708A1 (de) * | 1985-10-23 | 1987-04-23 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur aktivierung von t-pa nach expression in prokaryonten |
US4766205A (en) * | 1985-11-13 | 1988-08-23 | Beatrice Companies, Inc. | Method for isolation of recombinant polypeptides in biologically active forms |
EP0301835A1 (en) | 1987-07-29 | 1989-02-01 | Schering Biotech Corporation | Purification of human interleukin-4 expressed in Escherichia Coli |
DE3832898A1 (de) * | 1988-09-28 | 1990-04-12 | Boehringer Mannheim Gmbh | Praeparat von in prokaryonten exprimiertem plasminogenaktivator |
US5235043A (en) * | 1990-04-06 | 1993-08-10 | Synergen, Inc. | Production of biologically active, recombinant members of the ngf/bdnf family of neurotrophic proteins |
-
1997
- 1997-06-11 CA CA002257122A patent/CA2257122C/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-06-11 AT AT97928173T patent/ATE260972T1/de active
- 1997-06-11 BR BRPI9709569-9A patent/BR9709569B1/pt not_active IP Right Cessation
- 1997-06-11 TR TR1998/02584T patent/TR199802584T2/xx unknown
- 1997-06-11 ES ES97928173T patent/ES2214624T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-06-11 AU AU32571/97A patent/AU714318B2/en not_active Expired
- 1997-06-11 DE DE59711375T patent/DE59711375D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-06-11 EP EP97928173A patent/EP0904355B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-06-11 KR KR1019980710184A patent/KR100305341B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1997-06-11 JP JP50095798A patent/JP3288720B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1997-06-11 US US09/202,206 patent/US6342585B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-06-11 WO PCT/EP1997/003026 patent/WO1997047735A1/de active IP Right Grant
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP0904355B1 (de) | 2004-03-03 |
JPH11511759A (ja) | 1999-10-12 |
DE59711375D1 (de) | 2004-04-08 |
KR100305341B1 (ko) | 2002-03-02 |
KR20000016588A (ko) | 2000-03-25 |
AU3257197A (en) | 1998-01-07 |
JP3288720B2 (ja) | 2002-06-04 |
BR9709569B1 (pt) | 2010-05-18 |
AU714318B2 (en) | 2000-01-06 |
TR199802584T2 (xx) | 1999-03-22 |
CA2257122A1 (en) | 1997-12-18 |
CA2257122C (en) | 2004-04-06 |
EP0904355A1 (de) | 1999-03-31 |
ATE260972T1 (de) | 2004-03-15 |
US6342585B1 (en) | 2002-01-29 |
BR9709569A (pt) | 1999-08-10 |
WO1997047735A1 (de) | 1997-12-18 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ES2214624T3 (es) | Procedimiento de activacion de proteina desnaturalizada. | |
ES2199959T3 (es) | Procedimiento mejorado para el replegamiento de proteinas. | |
Kruijer et al. | Structure and organization of the gene coding for the DNA binding protein of adenovirus type 5 | |
Riggs | Expression and purification of recombinant proteins by fusion to maltose-binding protein | |
Patra et al. | Optimization of inclusion body solubilization and renaturation of recombinant human growth hormone from Escherichia coli | |
Singh et al. | Definition of structural elements in Plasmodium vivax and P. knowlesi Duffy-binding domains necessary for erythrocyte invasion | |
Kwon et al. | Single amino acid substitutions of alpha 1-antitrypsin that confer enhancement in thermal stability | |
Efimov et al. | The thrombospondin-like chains of cartilage oligomeric matrix protein are assembled by a five-stranded α-helical bundle between residues 20 and 83 | |
RU2275377C2 (ru) | Способ пространственной упаковки химически синтезированных полипептидов | |
Sawano et al. | Efficient in vitro folding of the three-disulfide derivatives of hen lysozyme in the presence of glycerol | |
Lee et al. | Strong inhibition of fibrinogen binding to platelet receptor αIIbβ3 by RGD sequences installed into a presentation scaffold | |
PT98544B (pt) | Processo para a preparacao enzimatica do factor basico do crescimento de fibro-blastos | |
KR20120109500A (ko) | 폴리펩티드 안정성 및 활성을 증가시키는 조성물 및 관련된 방법 | |
ES2213861T3 (es) | Procedimiento de obtencion de ngf-beta activa. | |
JPS63267296A (ja) | インタ−フエロン結合体およびその製造方法 | |
ES2081442T5 (es) | Proteasa de bacillus licheniformis. | |
WO2000040706A1 (fr) | Procede de production de transglutaminase | |
ES2317665T3 (es) | Proteina quimerica que contiene una secuencia de tipo chaperona intramolecular y su aplicacion a la produccion de insulina. | |
Moser et al. | Expression of the synthetic gene of an artificial DDT-binding polypeptide in Escherichia coli | |
Terashima et al. | Effective refolding of fully reduced lysozyme with a flow-type reactor | |
PT94776B (pt) | Plasmideos, sua producao e sua utilizacao na obtencao de um activador de plasminogenio | |
Frech et al. | Influence of protein conformation on disulfide bond formation in the oxidative folding of ribonuclease T1 | |
Holtet et al. | Receptor‐binding domain of human α2‐macroglobulin Expression, folding and biochemical characterization of a high‐affinity recombinant derivative | |
Liao et al. | Characterization, cloning, and expression of porcine αB crystallin | |
Kanaya et al. | Effect of mutagenesis at each of five histidine residues on enzymatic activity and stability of ribonuclease H from Escherichia coli |