PT98544B

PT98544B - Processo para a preparacao enzimatica do factor basico do crescimento de fibro-blastos

Info

Publication number: PT98544B
Application number: PT98544A
Authority: PT
Inventors: Paolo Sarmientos; Pierre Monsan; Francois Paul; Didier Betbeder
Original assignee: Erba Farmitalia
Priority date: 1990-08-02
Filing date: 1991-08-01
Publication date: 1999-01-29
Also published as: ATE152122T1; CA2066174A1; ES2103822T3; CZ286237B6; DE69125810T2; ZA916026B; YU131991A; JPH05501655A; AU8304491A; HU9201101D0; GB9017008D0; MY107334A; IE912729A1; DK0495049T3; KR920702371A; DE69125810D1; IL98988A; CN1058597A; NO921236L; CS236291A3

Description

PROCESSO PARA A PREPARAÇAO ENZIMATICA DO FACTOR BÁSICO DO CRESCIMENTO DE

FIBROBLASTOS

A presente invenção refere-se à preparação enzimática do factor, básico do crescimento de fibroblastos (bFGF).

O bFGF foi isolado originalmente a partir do cérebro e da pituitária sob a forma dum polipéptido de 146 aminoâcidos £ Esch et aJ., PNAS USA, 82 ( 1985) 6507-651 1 J. Clonou-se o gene de bFGF de bovino 7 Abraham et al., Science, 233 (1986) 545-548 7· ^A sequência nucleotídica preconizava bFGF como um produto de tradução de 155 aminoâcidos. Trabalhos posteriores demonstraram que se podia extrair um bFGF com 154 aminoâcidos conjuntamente com um bFGF com 146 aminoâcidos, a partir do tecido da pituitária normal após a adição de inibidores enzimáticos 7 Ueno et al., Biochem. Biophays. Res. Comm., 138 (1986) 580-588 7 e que as proteases ácidas no cérebro e nas células de hepatoma, clivavam bFGF C Klagsbrun, et aj_. , PNAS USA, 84 (1987) 1839-1843 7As técnicas para a produção de proteínas permitiram que se disponibi1izassem os factores do crescimento recombinantes para utilização terapêutica. No entanto, uma vez expressos, esses factores do crescimento podem ser processados numa mistura de formas diferentes. Os bFGF não constituem uma excepção

-2ς /

a este respeito C Barr et al., J.Biol. Chem., 263 (31) ( 1988) 16471-16478

A Requerente descobriu agora um processo para a preparação de um bFGF que é truncado na sua extremidade N. Pode aplicar-se este processo para se obter uma forma de bFGF com 146 aminoácidos, a partir de formas mais longas e de se produzir uma forma individual de bFGF a partir de uma mistura de bFGFs. A forma resultante é pura e não se encontra contaminada por outras formas de bFGF. De acordo com o anteriormente exposto, a presente invenção proporciona um processo para a preparação de um bFGF, sendo esse processo caracterizado por :

(i) formação de um produto de adição, entre heparina ou sulfato de heparano e um bFGF que possua a ligação Leu-Pro 9-10;

(ii) tratamento do produto de adição com pepsina A ou catepsina D clivando, deste modo, a referida ponte; e (iii) libertação do bFGF assim obtido, a partir do produto de adição.

Pode empregar-se no passo (i) uma mistura de dois ou mais bFGFs que possuam, individualmente, a ponte Leu-Pro 9-10, que possuam a mesma sequência de aminoácidos desde a posição 11 até à sua extremidade C e que possuam diferentes sequências de aminoácidos na extremidade N. As suas sequências de aminoácidos podem diferir apenas pelo facto de possuírem diferentes extremidades N. Habitualmente a única diferença entre as se

quências dos bFGFs reside no facto de o número de resíduos aminoácidos da extremidade N ser diferente. Um bFGF pode possuir um ou mais resíduos aminoácidos adicionais N-terminais em relação a outro bFGF. De um modo alternativo, as sequências de aminoácidos N-terminais que se encontram antes da posição 9 de cada bFGF podem ser constituídas por diferentes resíduos aminoácidos.

No entanto, é possível aplicar o presente processo a qualquer mistura de bFGF, desde que a sequência de aminoácidos de cada bFGF na mistura se inicie com o resíduo aminoácido N-terminal com uma numeração inferior a 9 e que os bFGFs possuam diferentes extremidades N. A mistura utilizada no passo (i) pode, contudo, ser constituída por bFGFs que possuam a seguinte fórmula geral:

NH₂-(AA)_x-Leu-Pro-Y-C00H na qual o símbolo AA representa qualquer resíduo aminoácido, o símbolo x representa zero ou um número inteiro e o símbolo Y representa a sequência de aminoácidos (11-155) de bFGF. 0 comprimento total de bFGF compreende 155 resíduos aminoácidos e pode ser designado por 155-bFGF ou bFGF (i-155). A sequência de aminoácidos de bFGF (1-155) humano encontra-se indicada pela SEQ ID N^Q1. Pode, no entanto, aplicar-se esta invenção a um ou a uma mistura de dois ou mais bFGFs (1-155) até bFGF (8-155), caso em que o símbolo x na fórmula anterior represenrs.

ta, respectivamente, um número inteiro de 8 a 1 e (AA) representa a sequência indicada em SEQ ID N⁹s 2 a 6, IleThrThr, ThrThr ou Thr. De um modo particular, a presente invenção pode aplicar-se a uma mistura de bFGF de 154 resíduos aminoácidos C bFGF (2-155) J e de bFGF de 153 resíduos aminoácidos C bFGF (3-155) J.

Obtêm-se geralmente o bFGF ou a mistura de bFGFs de acordo com técnicas de ADN recombinantes. Obtêm-se formas de bFGF nessas misturas devido ao processamento do produto de tradução nas suas extremidades N. 0 bFGF ou cada um dos bFGFs pode ser bFGF humano, de murino ou de roedor.

Pode formar-se o produto de adição entre um agente protector de bFGF selecionado entre heparina e sulfato de heparano e sulfato de heparano e a mistura de bFGFs de qualquer modo que se considere conveniente. Tanto os bFGFs como o agente protector são tipicamente proporcionados em solução aquosa.

Esta solução pode ser tamponada. A solução pode conter um antioxidante, tal como o ditiotreitol, para evitar a oxidação das proteínas. A relação bFGF/agente protector pode estar compreendida entre 0,5:1 e 10:1 (p/p), por exemplo, entre 1:1 e 5:1 (p/p). A protecção dos bFGFs sob a forma de produtos de adição evita hidrólises indesejadas subsequentes, quando se adiciona pepsina A.

Em seguida, faz-se contactar a pepsina A (EC 3.4.23.1) ou a catepsina D (EC 3.4.23,5) com o produto de adição. Este procedimento origina a clivagem especifica da ponte Leu-Pro 9-10 r - ¢* nos bFGFs suportados pelo composto de adição. No entanto, pode adicionar-se o enzima a uma solução de bFGFs e do agente protector. 0 enzima é geralmente proporcionado numa solução cujo pH foi ajustado para um vapor compreendido entre 4 e 6.

Incuba-se a solução, por exemplo no caso da pepsina A, durante 30 minutos a 10 horas, por exemplo, durante 1 a 8 horas. No caso da catepsina D, o período de incubação é habitualmente mais longo, por exemplo, 90 a 130 horas, e de um modo mais adequado durante cerca de 110 horas. A temperatura de incubação pode estar compreendida entre 5°C e a temperatura ambiente, por exemplo, cerca de 10°C. Efectua-se a incubação até a reacção se encontrar completa.

Em alternativa pode imobilizar-se o agente protector num suporte para formar uma coluna de afinidade. Pode utilizar-se qualquer suporte adequado, tal como gel de agarose ou pérolas de gel de dextrano reticulado (por exemplo, Sepharose). Verte-se uma solução de bFGF na coluna. Os bFGFs ligam-se ao agente protector e ficam retidos na coluna. Pode depois passar-se uma solução de enzima através da coluna. Finalmente, pode diluir-se a partir da coluna a forma individual truncada de bFGF. Pode conseguir-se esta eluição com um gradiente linear de solução aquosa de cloreto de sódio.

Pode obter-se uma forma pura de bFGF através da presente invenção. Pode obter-se, em particular, a forma de 146 aminoácidos de bFGF, designada por bFGF(10-155). Pode utilizar-se o bFGF obtido, por exemplo, para o tratamento de ferimentos e de ⁶ c ,

queimaduras. Pode aplicar-se bFGF num ferimento ou numa queimadura em qualquer formulação adequada. Estas formulações englobam, normalmente, um veículo ou diluente fisiológicamente aceitáveis.

Os exemplos que se seguem ilustram a presente invenção Apresentam-se um Exemplo de Preparação e Exemplos Comparativos.

Exemplos de Preparação: Preparação da forma 154/153 de bFGF

Efectuou-se a construção da sequência de ADN de síntese para b-FGF e para o plasmídeo de expressão portador dessa sequência, de acordo com o procedimento descrito na patente de invenção europeia Ν² A-363675. Efectuou-se o processo de fermentação e de purificação conforme se segue:

(a) Processo de fermentação

Transformou-se uma estirpe bacteriana. E. col i tipo B, obtida no Institut Pasteur, com um plasmídeo que transportava o gene humano que codificava bFGF e o gene que codificava a resistência à tetraciclina. Utilizou-se esta estirpe transformada para a produção de h-bFGF (bFGF humano) não glicosilado recombinante. Preparou-se um Banco Principal de Células (15 frascos-ampolas 1iofi1izados) e um Banco de Processamento de Células (W.C.B.) (70 frascos-ampolas armazenados em azoto lí-7 c

quido a -190°C) desta estirpe. Utilizou-se o conteúdo de um frasco-ampola de W.C.B. como o inoculo para a fase de fermentação.

Efectuou-se o processo de fermentação em fermentadores de 10 litros cheios com 4 litros de meio de cultura. Adicionou-se cloridrato de tetraciclina ao meio para manter as condições de selecção de estirpe. Decorridas 20 horas de crescimento a 37°C a biomassa final era de 42 + 2 g/litro, peso seco, e a produção de bFGF era de 2500 ± 500 mg/litro de acordo com a medição efectuada por electroforese comparativa em gel.

Foi necessário fazer-se o enriquecimento em oxigénio puro durante a fase de fermentação para permitir um grande crescimento bacteriano.

(b) Purificação inicial

Separaram-se por centrifugação as células (microrganismos) a partir do caldo de fermentação total. Efectuou-se a suspensão do resíduo resultante num tampão de fosfato de sódio contendo cloreto de sódio. Foram necessárias, no mínimo, três passagens através de um homogeneizador de alta pressão para se obter uma rotura eficaz das células. Clarificou-se por centrifugação o lisado celular resultante e recolheu-se o sobrenadante para subsequente processamento.

-8(c) Purificação

Verteu-se o sobrenadante clarificado numa coluna de Sepharose (marca registada) S de fluxo rápido (permitador de catiões) e eluiu-se o produto desta coluna utilizando um gradiente de concentrações crescentes de cloreto de sódio num tampão de fosfato. Purificou-se subsequentemente o produto numa coluna de Heparina-Sepharose 6 B eluindo com um gradiente de concentração crescente de cloreto de sódio num tampão de fosfato. Finalmente, preparou-se um tampão permuta numa coluna de resina G 25 Sephadex (Marca Registada) para se obter o produto no volume do tampão (fosfato de sódio-EDTA).

(d) Limpeza da coluna

Limparam-se colunas Sepharose S de fluxo rápido e Sephadex G25, lavando-as com soluções de hidróxido de sódio.

Lavou-se a coluna de Heparina-Sepharose alternativamente com soluções a pH 8,5 e pH 5,5 contendo cloreto de sódio 3M.

Obteve-se, deste modo, bFGF na sua forma 154/153. Esta forma consistia numa mistura de aproximadamente 50:50 de:

- bFGF humano de 154 aminoácidos C bFGF (2-155) ] que possui uma sequência de aminoácidos na forma de 155 aminoácidos que foi referida por Abraham et al., e indicada em SEQ ID N⁹1 mas sem o resíduo Met N-terminal; e

- bFGF humano de 153 aminoácidos Γ bFGF (3-155)7 que consistia na forma de 155 aminoácidos de bFGF indicada em SEQ ID N⁵1 mas sem os resíduos Met e Ala N-terminais.

Exemplo 1: Sulfato de heparano como agente protector: pepsina A

1. Preparação da amostra da proteína:

Proporcionou-se a forma 154/153 de bFGF do Exemplo de Preparação a uma concentração de 1,8 mg/ml numa solução tampão :

- fosfato mono-sódico 10 mM,

- Sal de dissódio de EDTA 0,1 mM,

- pH 6,0,

Para evitar a oxidação das proteínas durante a hidrólise controlada, adicionaram-se 20 mg de ditiotreitol a 1,8 mg de bFGF.

2. Hidrólise enzimática de bFGF:

a) Solução normalizada do agente protector

Solução 1: 20 mg de agente protector em 1 ml de água

b) Preparação da solução de bFGF e do agente protector

- 100 ul de amostra de proteína,

- 9	jil de solução 1,
- 3	jil de citrato de sódio 1M, pH 3,0.
- 70	jil de água,
- 18	pg (18 yul) de pepsina A de mucosa intestinal de suíno

- Volume final: 200 jjl agente protector foi o sulfato de heparano e a relação bFGF/agente protector foi de 1:1 (p/p). Adicionou-se pepsina A (EC: 3.4.23.1) à solução de bFGF e do agente protector, a pH 4,0, e incubou-se a 10°C durante 1 hora.

3. Efeitos Cinéticos de Hidrólise Enzimática:

Ao procedimento de hidrólise anteriormente referido seguiu-se em diferentes alturas e análise SDS-PAGE. Analisaram-se por SDS-PAGE amostras da mistura digerida, após 1, 20, 40 e 60 minutos. Conseguiu-se separar a forma bFGF-154/153 da forma bFGF-146 na análise SDS-PAGE utilizando Phast System (marca comercial Pharmacia).

No que se refere ao tampão de amostra, definiram-se como se descreve a seguir as condições de preparação de amostra conforme se descreve a seguir, para evitar a precipitação da proteína da amostra na zona de acumulação de densidade elevada de gel rápido:

- 15 γΛ de solução de proteína,

- 10 ul de Tris/HCl 40 mM, EDTA 4 mM, SDS a 10%, mercaptoeta-11nol a 20%, pH 8,0.

- 3 jil de DMSO (dimeti1sulfóxido) e

- 1 jil de azul de bromofenol (0,3 %).

Efectuou-se a desnaturação da amostra por aquecimento da amostra à temperatura de 100°C durante 5 minutos. A análise das amostras demonstrou que na amostra tomada a partir da mistura de digestão, decorrida uma hora, o fragmento da forma 154/153 de bFGF tinha desaparecido completamente. Obteve-se um fragmento maior que correspondia exactamente ao fragmento recombinante de bFGF-146 que se utilizou como referência.

4. Purificação de sangue

Verteu-se a mistura reaccional directamente numa coluna de heparina-agarose previamente equilibrada com tampão Tris 10mM, pH 8,0, NaCl 0,5M. Eluiu-se bFGF em NaCl 1,5M utilizando um gradiente de NaCl de 0,5M até 3M. Determinou-se a concentração das proteínas de acordo com o método de Bradford, utilizando como referência bFGF 154/153.

5. Electro-mancha da forma 146 de bFGF procedimento utilizado nesta análise por electro-mancha foi semelhante ao descrito por Ploug et al., Ç Anal. Biochem, 181 ( 1989) 33-39 J. A membrana utilizada foi Immobilon PVDF

-12¢(Mi 11ipore).

Após a electroforese equilibrou-se o gel num tampão de transferência 7 CAPS 10 mM (ácido 3-7 ciclo-hexilamino 7-1-propanossulfónico), pH 11,0, 20% de Metanol 7 durante 10 minutos. Inicialmente humedeceu-se o Immobilion PVDF com metanol puro e depois equilibrou-se em tampão de transferência antes de se utilizar. Utilizou-se um conjunto para manchar semi-seco 7 Kyhse-Andersen, J. Biochem. Biophys. Methods, 10(1984) 203-2097· Efectuou-se a electro-transferência durante 2 horas a 0,2 mA/cm^.

Lavou-se a membrana PVDF com água e depois corou-se com azul brilhante de Coomassie, R-250, a 0,1% (p/v) em 50% (v/v) de metanol, durante 1 minuto. Removeu-se o excesso de corante mediante uma breve lavagem com água, seguida de descoloração em 40% de metanol (v/v) englobando 10% (v/v) de ácido acético, durante 5-10 minutos. Lavou-se depois, cuidadosamente, a membrana PVDF, com água, antes de se efectuar a sequenciação.

6. Análise Sequencial Amino-terminal

Colocaram-se os cortes de membrana PVDF contendo a proteína corada, numa única camada no topo de um filtro condicionado de polibreno. Efectuou-se a sequênciação num Sequenciador dos Applied Biosystems, Modelo 470 A, equipado com analisador PTH-aminoácidos, em linha, Modelo 120 A.

Os primeiros três aminoâcidos da parte terminal

-139 da proteína, determinados nestas condições, foram:

Pro- Ala -Leu

Estes aminoácidos correspondem aos três aminoácidos da extremidade amino da forma bFGF-154.

7. Análise densitométrica por varrimento com um laser

Esta análise foi efectuada com o objectivo de determinar a percentagem de bFGF-146 produzido após 1 hora de hidrólise da forma 154/153 de bFGF por pepsina A. Decorrida 1 hora, misturaram-se 50 jjl da mistura reaccional com 50 ^il de tampão de desnaturação SDS. Nas mesmas condições, desnaturaram-se por SDS amostras de bFGF com diferentes concentrações de proteína. Separam-se estas amostras por electroforese num gel PAA 4/30 (pharmácia). Analisou-se a densitometria de cada um dos picos utilizando um integrador de registos LKB BROMA 2220. Utilizando a curva padrão obtida nestas condições descobriu-se que a concentração da forma bFGF-146 correspondia a 91% da concentração inicial de bFGF-154/153.

8. Rendimento de bFGF-146 depois de se efectuar a purificação

Por afinidade rendimento da reacção de hidrólise enzimática também foi

determinado após a purificação da forma bFGF-146 sobre uma coluna de heparina-agarose. Verteu-se 1,64 mg da mistura reaccional do ponto 2 sobre uma coluna de heparina-agarose previamente equilibrada com Tris 10 mM, a pH 8, e NaCl 0,5 Μ. A pH e a pepsina A não apresenta qualquer actividade e o complexo entre o sulfato de heparano e o bFGF não é estável o que permite a absorção de bFGF sobre a heparina-agarose presente. Eluiu-se bFGF com NaCl 1,5 M. Recuperou-se 1,14 mg da forma bFGF-146. 0 rendimento total da obtenção da forma do aminoácido bFGF-146 após hidrólise controlada utilizando sulfato de heparano como agente protector e purificação em coluna de afinidade foi de 73%.

Exemplo 2: Heparina como agente protector: pepsina A

Repetiu-se o procedimento do Exemplo 1 com a excepção do agente protector ser a heparina e a relação bFGF-heparina ser de 5:1 (p/p); analisaram-se alíquotas da mistura de digestão decorridos 2 minutos, 4, 6 e 8 horas e o tempo total de incubação foi de 8 horas. A solução de bFGF e de heparina era constituída por:

- 100 p1 de amostra de proteína,

- 18 de solução 2, yul de citrato de sódio 1M, pH 3,0, yil de água, jug de pepsina A,

- volume final: 200 jil.

A solução 2 era constituída por 100 ^ul de solução 1 e 900 ^il de água. Sob estas condições apenas se obteve um fragmento. Após 8 horas de incubação. Este fragmento possuia um peso molecular aparente de 16200 tal como foi determinado por análise SDS-PAGE.

De acordo com a análise sequencial amino-terminal obtiveram-se os mesmos três aminoácidos N-terminais, tal como no Exemplo 1:

Pro - Ala - Leu

Exemplo 3: A heparina como agente protector, pepsina A

Após purificação do fragmento bFGF-146 sobre uma coluna de heparina-agarose determinou-se também o rendimento da hidrólise controlada de bFGF protegido por heparina. Decorridas 7 horas de hidrólise, nas mesmas condições referidas no Exemplo 2, verteu-se o meio de reacção contendo 1,54 mg de bFGF sobre uma coluna de heparina-agarose previamente equilibrada com tampão de fosfato de sódio 10 mM a pH 8,0, e NaCl 0,5 M. Eluiu-se 1,02 mg de bFGF-146 a NaCl 1,5 M.

rendimento total de obtenção da forma do aminoácido bFGF-146 após purificação em coluna de afinidade utilizando heparina como agente protector foi de 69%.

Exemplo 4: Heparina imobilizada sobre agarose como agente protector: pepsina A

1.Procedimento de hidrólise enzimática de bFGF

Equilibrou-se uma coluna de heparina-agarose (7 ml de gel contendo 5,6 mg de heparina) com monofosfato de sódio 10 mM. EDTA 0,1 mM, NaCl 0,5 M, a pH 8,0, a 10°C. Verteu-se sobre a coluna de afinidade bFGF-154/153. Depois, verteu-se no topo da coluna 0,18 mg de pepsina A diluída na mesma solução de fosfato. Reciclou-se o enzima através da coluna com um caudal de

0,5 ml/minuto durante 6 horas.

A t=6 horas, lavou-se a coluna com tampão de fosfato de sódio 10 mM, a pH 7,0, EDTA 0,1 mM, NaCl 0,5 M, (3 volumes), e depois com um gradiente de 0,5 M até 3 M de NaCl. Eluiu-se o bFGF a 1,5 M de NaCl.

2. Análise sequencial amlno-terrninal

Apôs a electroforese electromanchou-se o gel sobre Immobilon PVDF utilizando um conjunto para manchar semi-seco, tal como se descreveu no Exemplo 1. Colocaram-se os cortes da membrana de PVDF contendo a proteína manchada, em uma única camada no topo de um filtro condicionado com polibreno. Os três primeiros aminoácidos da parte NH₂-terminal da proteína que foram determinados sob essas condições foram:

rí

Pro - Ala - Leu

Estes aminoácidos correspondem aos três aminoácidos da porção amino-terminal da forma bFGF-146.

3. Rendimento de recuperação de bFGF-146

Determinou-se o rendimento da reacção de hidrólise, após a determinação quantitativa do bFGF-146 que se lavou a partir da coluna de heparina-agarose. Recuperou-se 1,28 mg de bFGF-146. 0 rendimento total da forma do aminoácido bFGF-146 (peso molecular=16 200 após a hidrólise controlada sobre uma coluna de heparina-agarose foi de 81%.

Exemplo 5: Heparina como agente protector:

1. Procedimento de hidrólise enzimática de bFGF com catepsina D

Repetiu-se o Exemplo 2 com a excepção de se utilizar catepsina D proveniente de baço de bovino, em vez de pepsina A, de o período de incubação ter sido de 110 horas.

2. Cinética da reacção aparecimento do fragmento bFGF-146 durante a hidrólise enzimática foi muito baixo mas foi detectado por análise SDS-18-PAGE ao fim de 1 hora. Decorridas 72 horas, a hidrólise de bFGF-154/153 não se encontrava completa e adicionaram-se 36 ^ig de catepsina D ao meio de reacção. Decorridas 40 horas, a reacção encontrava-se completa. Este facto deveu-se à baixa actividade da catepsina D (10 unidades/mg).

1. Análise sequencial amino-terminal

Após a electroforese, electromanchou-se o gel sobre Immobilon PVDF utilizando um conjunto para manchar semi-seco, tal como se descreveu no Exemplo 1. As áreas excisadas da membrana PVDF contendo as proteínas manchadas foram colocadas em uma única camada no topo dum filtro condicionado de polibreno. Efectuou-se a sequenciação num analisador sequêncial de Applied Biosystems, Modelo 470A equipado com um analisador de aminoácidos PTH, Modelo 120A, em linha. Os primeiros três aminoácidos da porção Nl^-terminal da proteína determinados nestas condições foram:

Pro - Ala - Leu

Exemplo Comparativo 1: Pepsina A sem agente protector

Repetiu-se o Exemplo 1, sem utilizar qualquer agente protector. A forma 154/153 de bFGF foi completamente digerida pela pepsina A num intervalo de poucos minutos.

Exemplo Comparativo 2: Catepsina D sem agente protector

Repetiu-se o Exemplo 5 sem utilizar qualquer agente protector. A forma 154/153 de bFGF foi completamente digerida pela catepsina D ao fim de poucos minutos.

Exemplo Comparativo 3: -quimiotripsina

Repetiu-se o Exemplo 1 com a diferença de se ter utilizado -quimiotripsina em vez de pepsina A e não se ter usado qualquer agente protector. A forma 154/153 de bFGF foi completamente digerida pela -quimiotripsina dentro de poucos minutos.

Ensaiaram-se depois diferentes compostos aniónicos para determinar a sua capacidade de proteger bFGF de -quimiotripsina:

1. Heparina 3000 (Sigma. H 7516)

- relação bFGF/agente protector = 1

- temperatura: 10°C

- pH 7,5

- tempo de incubação : 4 horas

Utilizando heparina 3000 como agente protector, obteve-se principalmente um fragmento de peso molecular aparente de

-2014000 e alguns outros fragmentos de peso molecular inferior, tal como se determinou por análise SDS-PAGE.

2. Heparina (Sigma. H 3125)

- relação bFGF/agente protector (p/p) = 5

- temperatura : 10°C

- pH 7,5

- tempo de incubação : 4 horas

Utilizando este tipo de heparina como agente protector a protecção não se mostrou adequada e obtiveram-se muitos fragmentos.

3. Sulfato de Condroitina

- relação bFGF/agente protector (p/p) = 1

- temperatura : 10°C

- pH 7,5

- tempo de incubação : 2 horas

A protecção não foi adequada e obtiveram-se muitos fragmentos.

4. Sulfato de Dermatano

- relação bFGF/agente protector (p/p) = 1

- temperatura : 10°C

- pH 7,5

- tempo de incubação : 2 horas

A protecção não foi adequada e obtiveram-se muitos fragmentos.

5. Acido Poliaspártico

- relação bFGF/agente protector (p/p) = 1

- temperatura : 10°C

- pH 7,5

- tempo de incubação : 2 horas

Utilizando ácido poliaspártico como agente protector, a protecção não foi adequada e obtiveram-se muitos fragmentos.

Exemplo 6: Heparina ou sulfato de heparano como agentes protectores; pepsina A ou catepsina D.

1. Protocolo Experimental

Tratamento proteolítico de complexos solúveis de bFGF-heparina e de bFGF-sulfato de heparano, em solução

Complexaram-se 1,6 mg da forma aminoácida 154/153 de bFGF

-22com 1,6 de heparina ou de sulfato de heparano em tampão de citrato-fosfato 10 mM, a pH 4,0, a 10°C. Após 1 hora de incubação, adicionaram-se à solução 160 jig de pepsina A (Sigma P-6887, 3200-4500 unidades/mg de proteína). Tomaram-se amostras do meio reaccional em tempos diferentes e verteram-se directamente sobre uma coluna de heparina-sepharose previamente equilibrada com tampão de fosfato 10 mM a pH 8,0 NaCl 0,5 M, a 4°C. Lavou-se depois a coluna intensamente com o mesmo tampão e eluiu-se bFGF com NaCl 3M em tampão de fosfato 10 mM, a pH 8,0. Dessalinizaram-se as fracções agregadas sobre uma coluna Sephadex G25, previamente equilibrada em tampão de fosfato 10 mM, a pH 6,0, e submeteu-se a anãlise SDS-PAGE. Utilizando sulfato de heparano como agente protector obteve-se bFGF-146 com um rendimento quantitativo, decorrida 1 hora. 0 tratamento com pepsina do complexo bFGF-heparina conduziu ao mesmo rendimento quantitativo exactamente num período de incubação 6,5 horas.

Tratamento com pepsina A, de bFGF ligado a uma coluna de heparina-Sepharose

Verteu-se 50 mg de bFGF ( 154/153) com um caudal de 25 ml/minuto sobre uma coluna de heparina-Sepharose (Pharmacia) (2,6 x 22,5 cm) previamente equilibrada em tampão de citrato 25 mM, a pH 4,0/NaCl 0,5 M, a 4°C. Reciclou-se continuamente uma solução de 680 unidades/ml de pepsina A de suíno (Sigma) em tam-23-

pão de citrato-fosfato, através da coluna com um caudal de 2,5 ml/minuto durante 3 horas, a 4°C. Lavou-se depois intensamente a coluna com tampão de fosfato 25 mM, a pH 8,0/NaCl 8,5 M para se inactivar e eliminar o enzima. Eluiu-se bFGF por passos com NaCl 3M em tampão de fosfato 25 mM, pH 8,0. Agregaram-se as fracções contendo bFGF, concentraram-se por ultrafiltração numa membrana Amicon PM 10 e dessalinizou-se numa coluna de Sephadex G25 (Pharmacia) previamente equilibrada em tampão de fosfato 10 mM, a pH 6,0.

Análise da seqiência N-terminal

Efectuou-se a análise automática da sequência N-terminal automática, num sequenciador de impulsos de fase líquida, Modelo 477A (Applied Biosystems. CA, USA) com um analisador PTH, Modelo 120A, em linha.

Utilizou-se um programa normal-1 com pequenas modificações. Todos os materiais de sequênciação e reagentes foram adquiridos a Applied Biosystems.

Análise da sequência C-terminal

Efectuou-se o estudo da digestão de bFGF pela carboxipeptidase P, à temperatura ambiente, em tampão de acetato de sódio 10 mM, pH 3,8/0,05% de Brij-35, utilizando uma relação enzima/substrato de aproximadamente 1:100 sem (p/p) £fLu et al.,

F

J. Chromatogr., 477 (1988) 351-364 7.

Efectuaram-se digestões de 0,5-1 nmole de proteína durante 2 horas com 0,1-0,2 ^ig de CpP (Borhringer): adicionou-se N-Leucina como padrão interno. Retiraram-se, em tempos diferentes, alíquotas de 10/100 ^ul e submeteram-se a análise de aminoãcidos após derivação automática com PITC num derivador Modelo 420A (Aplied Biosystems) e injectaram-se subsequentemente numa coluna RP-HPLC com um analisador, Modelo 130A, em linha. Efectuou-se a separação dos aminoácidos derivados de PTC numa coluna PTC-C8 (P/N 071 1-0204, 220 x 2,1 mm, 5 jl Applied Biosystems).

Ensaios Biológicos

Utilizou-se uma estirpe de células endoteliais proveniente da aorta de bovino (BAEC) para estudar a resposta proliferativa induzida por bFGF. Colocaram-se as células a 2500 celulas/cavidade em placas de microtitulação de 96 cavidades em meio completo, constituído por meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) enriquecido com soro de feto de bovino a 13% (FBS) (Gibco UK). Após ligação, substituiu-se o meio completo por meio experimental, constituído por DMEM enriquecido com soro de feto de vitela a 0,5% (FBS), albumina de soro de bovino a 0,1% (BSA) (SIGMA USA) e com as concentrações desejadas de bFGF (Erbamont). Incubaram-se as culturas durante 3 dias, tempo ao fim do qual se fixaram com formalina e se coraram com

violeta cristalino a 0,5%. Após a coloração, lavaram-se cuidadosamente os tubos para remover o corante não incorporado. Adicionou-se metanol (95%; 0,1 ml/cavidade a cada uma das cavidades para extrair o corante numa extensão proporcional à quantidade de células desenvolvidas por cavidade. Transferiram-se as placas, para leitura automática, para um leitor de microplacas espectrofotométrico, equipado com um filtro de 540 nm.

Para a sintese do activador do plasminogénio, fez-se uma sementeira de BAEC (3 x 10⁴ células em 0,2 ml/cavidade, em placas de microtitulação de 96 cavidades em meio de desenvolvimento completo que se substituiu após a ligação por meio DMEM enriquecido com 0,5% de FBS, 0,1% de BSA e as concentrações de ensaio de bFGF. Após a incubação durante um período de 28 horas, lavaram-se as culturas e fez-se a lise das células com uma solução que continha 0,5% de Triton x-100.

Ensaiaram-se alíquotas de lisados celulares para verificar a actividade do activador do plasminogénio utilizando um substrato cromogénico (Spectrozyme PL) e plasminogénio (sendo ambos os reagentes do American Diagnostica Inc.) para se efectuar o ensaio amidolítico.

2. Resultados

Processamento enzimático controlado de bFGF

Incubou-se a mistura recombinante purificada de 154/153 com duas proteases aspárticas diferentes: pepsina A e catepsi-

na D. Tomaram-se alíquotas da mistura reaccional em diversos intervalos de tempo e submeteram-se a análise SDS-PAGE, o que demonstrou que na ausência de qualquer agente protector o bFGF era rápidamente digerido em pequenos pêptidos. Pelo contrário, o tratamento de bFGF (154/153) com pepsina A (10:1 p/p; pH 4,0 10°C) na presença de heparina ou de sulfato de heparano (1:1 p/p) originava a conversão progressiva e completa das formas aminoácidas 154/153 numa forma de peso molecular inferior que migrava simultaneamente com a forma aminoácida padrão 146/145.

Após a electromancha de uma membrana PDVF submeteu-se a faixa de baixo peso molecular originada a partir da digestão enzimática, a uma análise sequêncial N-terminal automática no sequenciador de impulsos de fase líquida. Os primeiros três ciclos originaram uma única sequência homogénea Pro-Ala-Leu, que correspondia à extremidade N-terminal intacta da forma aminoácida conhecida 146. Não se detectaram outras sequências que demonstrassem que apesar da presença dos três sítios LeuPro da molécula de bFGF, quando se complexaram as formas alongadas de bFGF com a heparina ou com sulfato de heparano, a digestão com pepsina A clivou especificamente e apenas o péptido LeUg-Pro^Q se ligou.

Conseguiu-se uma clivagem proteolítica controlada da molécula de bFGF NH₂-estendida e protegida por heparina, tal como se obteve com a pepsina A. Após a digestão com catepsina D, apesar de ser necessário um tempo de incubação mais prolongado para esta reacção proteolítica, devido possivelmente à

-27£ *

menor actividade específica da preparação enzimática utilizada. Quando se adicionou a quimiotripsina sob condições idênticas, mas a um pH de 7,5, detectou-se um único polipéptido de aproximadamente 14000 dalton após a electroforese sobre gel desta mistura de incubação sem qualquer evidência da presença de uma forma 146 aminoácidos.

Processamento enzimático em larga escala de bFGF sobre uma coluna de heparina-Sepharose

Os resultados obtidos em solução e em reacções de pequenos lotes foram verificados num processo em maior escala com uma mistura 154/153 de bFGF alongados, ligados a uma coluna de heparina-Sepharose. De acordo com o anteriormente exposto, verteram-se 50 mg de bFGF (154/153) sobre uma coluna de heparina-Sepharose previamente equilibrada com tampão de citrato•fosfato, a pH 4,0. Fez-se reciclar continuamente através da coluna, durante 3 horas a 4°C, uma solução de pepsina A. Lavou-se, depois a coluna com tampão fosfato a pH alcalino para inactivar e para eliminar o enzima. Eluiu-se o polipéptido resultante da coluna com NaCl 2 M em tampão fosfato a pH 8,0. Recolheram-se as fracções contendo bFGF e dessalinizaram-se numa coluna Sephadex G25.

Analisaram-se as fracções agregadas por análise SDS-PAGE, o que demonstrou uma única banda com um peso molecular correspondente ao da forma padrão bFGF-146/145. A análise HPLC de jFfc

-28fase inversa originou também um pico único. A análise da sequência N-terminal proporcionou uma sequência única que correspondia à extremidade N-terminal correctá e intacta da forma de 146 aminoácidos, isto é, Pro-Ala-Leu-. A análise da sequência C-terminal demonstrou a extremidade earboxi-terminal esperada da molécula de bFGF, isto é, -Ala-Lys-Ser. Deste modo, também quando bFGF se encontrava ligado à resina heparina-Sepharose, foi possível a pepsina A clivar especificamente a molécula na ponte Leug-Pro^ originando uma forma homogénea de 146 aminoácidos.

Ensaios biológicos In vitro da forma de bFGF

A actividade biológica da mistura da forma de 154/153 aminoácidos foi comparada à forma de 146 aminoácidos homogénea obtida de acordo com o processo proteolítico descrito. Estudaram-se duas actividades, a indução duma resposta proliferante e a síntese do activador do plasminogénio, em células endoteliais da aorta de bovino (BAEC). Ambos os ensaios confirmaram a equivalência biológica in vitro da forma de 154/153 aminoácidos em comparação com a forma de 146 aminoácidos obtida pelo processo enzimático.

LISTA DE SEQUENCIAS (1) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:1:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUENCIA:

(A) COMPRIMENTO: 155 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUENCIA: SEQ ID NO:1:

Met

Ala

Gly

Ser

Ile

Thr

Leu

Pro

Ala

Leu

Pro

Glu

Asp

Gly

1

5

10

15

Gly

Ser

Gly

Ala

Phe

Pro

Gly

His

Phe

Lys

Asp

Pro

Lys

Arg

Leu

20

25

30

Tyr

Cys

Lys

Asn

Gly

Phe

Leu

Arg

Ile

His

Pro

Asp

Gly

Arg

35

40

45

Vai

Asp

Gly

Vai

Arg

Glu

Lys

Ser

Asp

Pro

His

Ile

Lys

Leu

Gin

Leu

50

55

60

Gin

Ala

Glu

Arg

Gly

Vai

Ser

Ile

Lys

Gly

Vai

Cys

Ala

Asn

65

70

75

80

Arg

Tyr

Leu

Ala

Met

Lys

Glu

Asp

Gly

Arg

Leu

Ala

Ser

Lys

Cys

85

90

95

Vai

Thr

Asp

Glu

Cys

Phe

Glu

Arg

Leu

Glu

Ser

Asn

Tyr

100

105

110

JF-30-

Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tys Thr Ser Trp Tyr Vai Ala Leu Lys 115 120 125

Arg Thr Gly Gin Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gin Gin Lys 130 135 140

Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Lys Ser 145 150 155 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N0:2:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUENCIA:

(A) COMPRIMENTO: 8 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0:2:

Met Ala Ala Gly Ser Ile Thr Thr

5 (3) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID M0:3:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUENCIA:

(A) COMPRIMENTO: 7 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (C) CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear

-31(ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0:3:

Ala	Ala Gly Ser Ile	Thr	Thr
1	5
	INFORMAÇÃO PARA	A	SEQ ID N0:4:
(i)	CARACTERISTICAS	DA	SEQUENCIA:
	(A) COMPRIMENTO:	6	aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido (C) CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0:4: Ala Gly Ser Ile Thr Thr

5 (5) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:5:

(i) CARACTERISTICAS DA SEQUENCIA:

(A) COMPRIMENTO: 5 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (C) CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUENCIA: SEQ ID N0:5: Gly Ser Ile Thr Thr

5 (6) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:6:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUENCIA:

(A) COMPRIMENTO: 4 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (C) CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUENCIA: SEQ IN NO:6: Ser Ile Thr Thr

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. - Processo para a preparação do factor básico do crescimento de fibroplastos (bFGF), caracterizado por:

i) se formar um produto de adição entre heparina ou sulfato de (

heparano e um bFGF que possua a ligação Leu-Pro de 9-10;

ii) se tratar o produto de adição com pepsina A ou catepsina D, clivando, deste modo, a referida ligação; e iii) se libertar, a partir do produto de adição, o bFGF assim obtido.
2. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se utilizar no passo i) uma mistura constituída por dois ou mais dos referidos bFGFs, cujas sequências de aminoãcidos diferem apenas pelo facto de possuírem diferentes extremidades N.
3. - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de a referida mistura ser constituída por bFGFs que possuem a fórmula geral:

NH_Q-(AA) -Leu-Pro-Y-COOH l X na qual o símbolo AA representa um resíduo aminoácido, o símbolo x representa zero ou um número inteiro e o símbolo Y representa a-sequência de aminoácidos (11-155) de bFGF.
4. - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de (AA) representar a sequência indicada numa das

Λ

SEQ ID com os números de 2 a 6, IleThrThr, ThrThr ou Thr.
5. '- Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de a referida mistura ser constituída por bFGF (2-155) e bFGF (3-155) .
6. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de os bFGFs consistirem individualmente em bFGF de ser humano, de murino ou roedores.
7. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de se proporcionar a heparina ou o sulfato de heparano e/ou cada um dos bFGFs em uma solução aquosa tamponada, no passo i) e de se adicionar a pepsina A ou a catepsina D â solução resultante no passo ii).
8. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo facto de a heparina ou o sulfato de

I heparano se encontrar imobilizado num suporte para formar uma coluna de afinidade, se carregar a coluna com uma solução dos referidos bFGFs, no passo i), se fazer passar uma solução de pepsina A ou de catapsina D através da coluna carregada deste mo do no passo ii) e se eluir a forma simples truncada do bFGF assim obtido, a partir da coluna no passo iii).
9. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de se proporcionar uma formulação constituída pela forma simples de bFGF assim obtido com um veículo ou diluente aceitáveis sob o ponto de vista fisiológico,