PT655251E

PT655251E - Composicao farmaceutica para a profilaxia e o tratamento de fracturas

Info

Publication number: PT655251E
Application number: PT94117339T
Authority: PT
Inventors: Mikiko Takahashi; Kazuhiko Doi; Masayoshi Koyama
Original assignee: Hoechst Japan
Priority date: 1993-11-05
Filing date: 1994-11-02
Publication date: 2000-10-31
Also published as: JPH07126181A; EP0655251B1; AU7762594A; GR3034161T3; CA2135123A1; EP0655251A1; ATE193450T1; DE69424747T2; KR950013519A; KR100313980B1; DE69424747D1; ES2148268T3; DK0655251T3; US5622935A

Description

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DESCRIÇÃO

"COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA PARA A PROFILAXIA E O TRATAMENTO DE FRACTURAS"

Antecedentes da invenção 1. Domínio da invenção A presente invenção refere-se à utilização de factor de plaquetas 4 para a preparação de composições farmacêuticas para a profilaxia ou o tratamento de doenças relacionadas com a formação dos ossos, em particular de fracturas. 2. Descrição da técnica anterior

Os ossos mantêm uma função de apoio como endoesqueleto por absorção óssea local contínua e formação óssea para substituição dos ossos velhos por ossos novos e também contribuem para uma reactividade rápida a vários estímulos mecânicos e a alterações no equilíbrio mineral. Esta osteoanagénese é efectuada principalmente por células de absorção óssea tais como os osteoclastos e semelhantes e por células de formação óssea tais como os osteoblastos e semelhantes, com base no acoplamento destas duas categorias de células. Recentemente verificou-se que os osteoblastos não têm apenas a função da formação óssea, mas estão intimamente associados à diferenciação e à activação dos osteoclastos, de tal modo que pode existir uma possibilidade aumentada de que desempenhem um papel como centro de controlo na reconstrução celular óssea [Inoue, T., Mebio (1990), Special Version p. 2-7] . 0 factor de plaquetas 4 (FP4) é a proteína que é característica das plaquetas e pode ligar-se de modo específico 1

à heparina para neutralizar a actividade anticoagulante da heparina. Para além disso, sabe-se que o PF4 pode actuar como um factor quimiotáctico sobre os leucócitos, os monócitos e os fibroblastos e que apresenta uma actividade anti-colagenase para a protecção dos tecidos dos danos causados pela colagenase libertada a partir dos leucócitos (neutrófilos polinucleares) em lesões inflamatórias. Foi também elucidado que o FP4 humano bloqueia in vitro de modo reversível a libertação de 45Ca2+ estimulada pela hormona paratiróide (HPT) a parir do osso de ratos recém-nascidos [Horton, J.E., et al., Biochem. Biophys. Acta. (1980), vol. 630, p. 459-462]. Recentemente verificou-se que o FP4 humano inibe a proliferação das linhas de células de osteossarcoma humano Saos-2 e G-292, pelo que é de esperar o efeito antitumor [Tatakis, D.N., Biochem. Biophys. Res. Commun. (1992), vol. 187, p. 287-293].

Verificou-se que o FP4 humano é composto por 70 ácidos aminados e que o FP4 bovino é o polipeptídeo composto por 88 ácidos aminados, enquanto que as respectivas sequências foram determinadas [Hermodson, M., et al., J. Biol. Chem. (1987), vol. 252, p. 6276-6278; Ciaglowski, R.E., et al., Arch. Biochem. Biophys. (1986), vol. 250, p. 249-256]. 0 FP4 é libertado a partir das plaquetas na forma de ligação com proteoglicano, mas crê-se que o proteoglicano pode ser substituído por heparina. Recentemente foi investigada a determinação dos valores de FP4 no plasma por análise radio-imunológica. Detectou-se abundantemente actividade de FP4 na fracção que contém grânulos α que foram isolados pelo método de fraccionamento intracelular. O FP4 foi ainda detectado nas plaquetas e nos megacariócitos por técnicas de microscopia por imunofluorescência, tendo sido admitida a respectiva síntese em megacariócitos [Ginsberg, M.H., et al., Blood (1980), vol. 55, p. 661-668; Ryo, R., et al., Thromb. Res. (1980), vol. 17, p. 645-652].

Por outro lado, sabe-se que vários factores de formação 2

óssea podem participar no processo da formação dos ossos [Noda, M., BlOmedica (1993), vol. 8, p. 28-33]. Em particular, sabe-se que o estrogénio, a HPT e a hormona anabólica podem promover a formação óssea. Se bem que se saiba que o FP4 inibe a absorção óssea (Horton, J.E., et al., loc. cit.), nenhum relatório sugeriu que o FP4 possa também ser eficaz na formação óssea.

Para além disso, o Pedido de Patente Internacional com a Publicação n.° WO-A-92 09301 dá a conhecer uma composição farmacêutica para utilização em medicina que compreende o factor de plaquetas 4 e um veiculo ou excipiente aceitável. No entanto, a WO-A-92 09301 não dá a conhecer nem sugere a capacidade do FP4 para promover a formação óssea.

Descrição pormenorizada da invenção

Um objecto da presente invenção é proporcionar a preparação de uma composição farmacêutica que pode ser aplicada como um agente terapêutico novo eficaz para a formação óssea. Mais especificamente, pretendeu-se um peptídeo que pode apresentar um efeito de promoção da formação óssea muito mais seguro do que os agentes anteriormente conhecidos tais como estrogénio, HPT ou hormona anabólica que apresentam efeitos secundários graves e que são necessários para uma observação completa do decurso com o respectivo efeito sugerido de promoção da formação óssea.

Agora os presentes inventores levaram a efeito vários estudos e verificaram que o FP4 bovino e o FP4 humano podem promover a formação óssea, tendo sido a presente invenção completada com base neste facto.

Crê-se que no sangue de fetos e em mamíferos recém--nascidos, incluindo os seres humanos se encontram vários factores de crescimento que poderiam promover o crescimento de vários tecidos celulares em fetos e recém-nascidos com um crescimento notável. Utilizando soro de bovino recém-nascido 3

facilmente disponível em quantidades como matéria prima, os presentes inventores tentaram a purificação e o isolamento do factor proteico que pode fazer aumentar uma actividade de fosfatase alcalina (FaseAL) em linhas de células de osteos-sarcomas semelhantes a osteoblastos.

As linhas de células de osteossarcomas semelhantes a osteoblastos aplicadas para a determinação da actividade de promoção de FaseAL utilizadas podem ser, por exemplo, linhas de células ROS 17/2.8. Considera-se um indício de formação óssea o aumento da actividade de FaseAL pela linha de células ROS 17/2.8 de osteossarcomas semelhantes a osteoblastos; por exemplo, provou-se que o factor β de crescimento transformante {TGF-β) aumenta a actividade de FaseAL [Pfleilschifter, J., et al., Endocrinology (1987), vol. 121, p. 212-218; Rodan, G.A., et al., Calcium regulating hormones and bone metabolism, Elsevier Science Publishers B.V., (1992), p. 183-196].

Uma vez que se sabe que vários factores de crescimento podem ligar-se facilmente à heparina, pode utilizar-se em primeiro lugar a cromatografia em coluna de afinidade de heparina a fim de isolar as fracções que ficam ligadas. Em seguida pode utilizar-se HPLC de fase inversa para fracções adicionais. Para cada fracção determinou-se a respectiva actividade de promoção de FaseAL. Como resultado, descobriu-se a fracção com capacidade de incrementar a actividade de FaseAL em células ROS 17/2.8. Determinou-se a sequência parcial de ácidos aminados desta fracção e investigou-se se podia ou não ser uma proteína conhecida por referência à base de dados de proteínas. Como resultado, a referida sequência estava em concordância com a bem conhecida sequência de ácidos aminados do FP4 bovino e deste modo assumiu-se que a fracção activa resultante era FP4. Do mesmo modo, uma investigação semelhante sobre um FP4 humano purificado disponível no comércio confirmou a respectiva actividade de incremento da FaseAL. Deste modo, a referida fracção activa foi identificada como sendo FP4, tendo--se assim completado a invenção. 4

A presente invenção refere-se à utilização de FP4 para a prep.aração de uma composição farmacêutica para a profilaxia ou o tratamento de fracturas que compreende uma quantidade eficaz de FP4 em combinação com um veículo ou excipiente farmaceutica-mente aceitável. 0 FP4 pode ser preparado por purificação a partir de plaquetas, por síntese do ADN que codifica para o FP4 com base em qualquer sequência de ácidos aminados conhecida ou por clonagem e expressão do gene de FP4 por manipulação genética bem conhecida dos especialistas na matéria. 0 FP4 pode ser utilizado como um agente terapêutico ou profilático para doenças relacionadas com osteoblastos. Em particular, é eficaz no tratamento das doenças que requerem a promoção de diferenciação e proliferação óssea tais como fracturas e outras com vista a promover a diferenciação dos osteoblastos.

Para o tratamento de fracturas, pode-se adoptar de preferência uma administração em que o FP4 é aplicado por via tópica ou directamente na parte afectada após mistura com uma base de gel adequada. O FP4 pode por outro lado ser administrado por via sistémica utilizando as suas injecções aquosas tendo em conta a sua elevada solubilidade em água, e também pode ser administrado por via nasal ou por inalação sob a forma de aerossóis de partículas finas. A dose pode ser de 1 a 100 μρ/ρ3Γΐβ aplicada/pessoa/dia para a aplicação tópica e 0,1 a 10 mg/kg/dia para aplicação sistémica. A invenção será explicada por meio dos exemplos que se seguem. 5

Exemplo 1 Purificação de FP4 a partir de soro de bovino recém-nascido 1) Purificação parcial por cromatografia de afinidade em heparina A 1 litro de soro de bovino recém-nascido (adquirido a GIBCO Laboratories Inc.) adicionaram-se 20,5 g de cloreto de sódio. O soro salgado foi desenvolvido com uma coluna Toyopearl de heparina (um diâmetro de 5 cm x um comprimento de 5,5 cm, comercializada por TOSOH CORPORATION), que tinha sido equilibrada com tampão de tris A (tris-HCl 20 mM, pH 7,5, NaCl 0,5 M) com um caudal de 3 ml/minuto. Em seguida a coluna foi lavada intensamente com tampão de tris A.

Após lavagem, os peptideos ou as proteínas adsorvidas na coluna de Toyopearl de heparina foram eluídos com tampão de tris B (tris-HCl 20 mM, pH 7,5, NaCl 1,0 M). Os eluídos foram monitorizados pela a absorvância a 280 nm utilizando um fotómetro e verificou-se que cerca de 300 ml de fracções apresentavam uma absorvância superior. 2) Purificação por HPLC de fase inversa O eluído obtido pelo procedimento 1) anterior foi desenvolvido com uma coluna de Cosmosil 5Cis-300 (um diâmetro de 4,6 mm x um comprimento de 250 mm, comercializada por Nakarai Tesuku K.K.), que tinha sido equilibrada com água que continha 0,1 % de ácido trifluoroacético (ATFA) e a coluna foi lavada intensamente com água que continha 0,1 % de ATFA. Em seguida, os peptideos ou as proteínas foram eluídos com um gradiente linear de 0 a 80 % de acetonitrilo que continha 0,1 % de ATFA. Os eluídos foram monitorizados pela absorvância a 214 nm a fim de recolher todos os picos. 0 padrão de eluição é apresentado na Fig. 1. 6

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Exemplo 2 Determinação de actividade de promoção de FaseAL em todos os picos

Depositou-se a linha de células de osteossarcoma semelhante a osteoblastos ROS 17/2.8 numa placa de cultura de 24 alvéolos a 2 x 104 células/alvéolo em 1 ml de meio F12 que continha 5 % de soro de bovino recém-nascido e efectuou-se a incubação num incubador de CO2 a 37 °C durante 3 dias. Em seguida, removeu-se o meio de cultura, lavaram-se as células uma vez com meio F12, incubou-se novamente com 1 ml de meio isento de soro (meio F12 que continha 0,2 % de albumina de soro de bovino) que continha cada fracção dos picos obtida pelo procedimento 2) e continuou-se a incubação durante mais 2 dias. Em seguida removeu-se o meio de cultura, lavaram-se as células três vezes com PBS Dulbecco (adquirido a GIBCO Laboratories Inc.) e adicionaram-se 200 μΐ de uma solução que continha 0,2 % de Nonidet P-40 e 0,9 % de cloreto de sódio. Deixou-se a mistura resultante em repouso à temperatura ambiente durante uma hora a fim de deixar dissolver as células. Efectuou-se uma centrifugação subsequente utilizando uma centrífuga de Eppendorf durante 5 minutos a fim de recolher o sobrenadante. A 20 μΐ do sobrenadante adicionou-se uma solução, a fim de tornar 10 mM em fosfato de p-nitrofenilo em glicina 0,1 Μ, 1 mM em ZnCl2, 1 mM em MgCl2 e pH 10,4 e, após agitação, deixou-se a reacção prosseguir a 37 °C durante 20 minutos. Monitorou-se a reacção por medida da absorvância a 420 nm. Os resultados da determinação do efeito do pico 1 tal como apresentado na Fig. 1 sobre a actividade de promoção da Fase AL nas células. ROS 17/2.8 são apresentados no Quadro 1, em que dose representa uma concentração de proteína na fracção do pico e cada valor para a actividade de Fase AL representa uma média ± o desvio padrão em cada grupo. 7 1

Quadro

Dose Actividade de FaseAL

Composto adicionado (μς/ιαΐ) (mU*/mg de proteína integral) Controlo 0 49, 6 ± 16, 8 Pico 5, 0 271,7 ± 15,1 * 1U = p-nitrofenol libertado (μιηοΐ) /minuto Exemplo 3 Determinação peptídeos no das propriedades físico-químicas dos pico 1 da Fig. 1 1) Identificação por análise de sequência de ácidos aminados

Submeteu-se o peptideo na fracção que se confirmou ser activo no Exemplo 2 a uma análise habitual para a sequência terminal N utilizando um sequenciador de ácidos aminados modelo 477A/120A (comercializado por Applied Biosystems Inc.), mas não foi possivel determinar a sequência. Assumiu-se que a extremidade terminal N da proteína se encontrava bloqueada. Como consequência, fraccionou-se o peptideo activo a fim de efectuar a determinação da sua sequência parcial de ácidos aminados. Secou-se cerca de 1 nM da proteína do pico activo (determinada por análise de ácidos aminados) por meio de um concentrador de tipo speedback (SAVANT Inc.) e dissolveu-se em 200 μΐ de uma solução de guanidina-HCl 6 M, tris-HCl 0,2 M e EDTA 2 mM (pH 8,0). Em seguida adicionaram-se 20 nmol de ditiotreitol (comercializado por Nakarai Tesuku K.K.) e deixou--se a reacção prosseguir a 37 °C durante 1,5 horas. Adicionaram-se à mistura reaccional 100 nmol de 4-vinilpiridina (comercializada por Aldrich Chemical Co., Inc.) e deixou-se novamente a reacção continuar a 37 °C durante 1,5 horas. Esta mistura reaccional foi desenvolvida através de uma coluna de Cosmosil 5Ci8-3oo (um diâmetro de 4,6 mm x um comprimento de 250 mm, comercializada por Nakarai Tesuku K.K.), que tinha sido equilibrada com água que continha 0,1 % de ATFA e lavou-se a coluna intensamente com água que continha 0,1 % de ATFA. Em 8

seguida os peptídeos ou as proteínas absorvidos foram eluídos com um gradiente linear de 0 a 80 % de acetonitrilo que continha 0,1 % de ATFA. Os eluídos foram monitorizados no que se refere à absorvância a 214 nm a fim de recolher todos os picos em que se obteve proteína piridinaetilada. A proteína obtida do modo descrito foi seca por meio de um concentrador speedback e foi dissolvida em 500 μΐ de tampão de tris-HCl 20 mM, 0,1 M em NaCl a pH 8,5. Adicionou-se à solução anterior a endopeptidase de lisilo (protease de Achromobacter I (EC 3.4.21.50)) (comercializada por Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) dissolvida em tampão de tris-HCl 20 mM 0,1 M em NaCl a pH 8,5 de tal modo que resultou uma proporção enzima / substrato (proporção molar) de 1/200. Deixou-se prosseguir a reacção a 30 °C durante 16 horas para efectuar a digestão. A solução que continha os peptídeos resultantes foi separada com uma coluna de Cosmosil 5Ci8-3oo (um diâmetro de 4,5 mm x um comprimento de 250 mm, comercializada por Nakarai Tesuku K.K.) a fim de recolher a fracção de cada pico. A sequência de ácidos aminados das duas fracções de entre as obtidas foi determinada por meio de um sequenciador modelo 477A/120A.

Efectuou-se uma busca para determinar se existia ou não qualquer sequência idêntica à sequência de ácidos aminados resultante na base de dados de proteínas a fim de confirmar que esta era o FP4 bovino (Ciaglowski, R.E., et al., loc. cit.). A sequência de ácidos aminados resultante é apresentada como SEQ ID No.: 1 na Listagem de Sequências. 2) Análise por electroforese O peso molecular do peptídeo no pico 1 conforme apresentado na Fig. 1 foi confirmado por electroforese de SDS sob condições redutoras, tendo-se verificado que o peso molecular aparente era de cerca de 11.000 a 14.000. Este peso molecular está em concordância com o peso molecular descrito para o FP4 bovino (Ciaglowski, R.E., et al., loc. cit.). 9

Exemplo 4 Determinação da actividade de promoção da FaseAL do FP4 humano

Purificou-se FP4 humano adquirido a Calbiochem Inc. para se utilizar. Para este fim desenvolveu-se através de uma coluna de Cosmosil 5Cie-3oo (um diâmetro de 4,6 mm x um comprimento de 250 mm, comercializada por Nakarai Tesuku K.K.), que tinha sido equilibrada com água que continha 0,1 % de ATFA e a coluna foi lavada intensamente com água que continha 0,1 % de ATFA. Em seguida, os peptídeos ou as proteínas foram eluídos com um gradiente linear de 0 a 80 % de acetonitrilo que continha 0,1 % de ATFA. Os eluídos foram monitorizados pela absorvância a 214 nm a fim de recolher as fracções de todos os picos. O padrão de eluição é apresentado na Fig. 2. O efeito destas fracções sobre a actividade de promoção de FaseAL em células ROS 17/2.8 foi determinado de modo idêntico ao descrito no Exemplo 2 a fim de determinar a pico 1 como a fracção activa. Os resultados por determinação do efeito do pico 1 sobre a actividade de promoção de FaseAL em células ROS 17/2.8 são apresentados no Quadro 2. A sequência de ácidos aminados do FP4 humano é apresentada como SEQ ID No.: 2.

Quadro 2

Dose

Composto adicionado (μς/ιηΐ)

Actividade de FaseAL (mU*/mg de proteína integral)

Controlo 0 49, 6 ± 16, 8 FP4 humano 0,1 92,2 ± 12,4 0, 3 88,5 ± 23,0 1,0 139,6 ± 3,7 3,0 331,4 ± 86,9 * 1U = p-nitrofenol libertado (μιηοΐ) /minuto 10

Breve explicação dos desenhos A Fig. 1 apresenta o padrão em que as fracções ligadas na cromatografia de afinidade a heparina e eluidas foram depois desenvolvidas utilizando HPLC de fase inversa e em que as flechas indicam a fracção activa (pico 1) que contém o FP4 bovino. A Fig. 2 apresenta o padrão em que o FP4 humano parcialmente purificado foi desenvolvido por HPLC de fase inversa e em que a flecha indica a fracção activa (pico 1) que contém o FP4 humano.

[Listagem de Sequências] SEQ ID No.:1

Comprimento da sequência:88 ácidos aminados

Tipo de sequência: ácidos aminados

Topologia: linear

Tipo de molécula: peptideo

Tipo de fragmento:

Fonte Original:

Organismo :bovino (Bos taulus)

Estirpe: soro Caracteristicas:

Localização:

Outra informação: o l.° Xaa representa Pyro-Gln or Glu, o 20.° Xaa representa Asp ou Ser, o 49.° Xaa representa Thr ou Leu, o 57.° Xaa representa Leu ou Ile e o 72.° Xaa representa Arg ou Asn. 11

Descrição da sequência: SEQ ID No.:1 Xaa Ser Ser Phe Pro Ala Thr Phe Vai Pro Leu Pro Ala Asp Ser 1 5 10 15 Glu Gly Gly Glu Xaa Glu Asp Leu Gin Cys Vai Cys Leu Lys Thr 16 20 25 30 Thr Ser Gly Ile Asn Pro Arg His Ile Ser Ser Leu Glu Vai Ile 3.1 35 40 45 Gly Ala Gly Xaa His Cys Pro Ser Pro Gin Leu Xaa Ala Thr Lys 46 50 55 60 Lys Thr Gly Arg Lys Ile Cys Leu Asp Gin Gin Xaa Pro Lys Tyr 61 65 70 75 Lys Lys Ile Leu Lys Lys Leu Leu Asp Gly Asp Glu Ser 76 80 85 SEQ ID No.:2

Comprimento da sequência:70 ácidos aminados

Tipo de sequência: ácidos aminados

Topologia: linear

Tipo de molécula: peptideo

Tipo de fragmento:

Fonte Original:

Organismo : humano (Homo sapiens)

Estirpe: soro

Descrição da sequência: SEQ ID No. :2:

Glu Ala Glu Glu Asp Gly Asp Leu Gin Cys Leu Cys Vai Lys Thr 15 10 15

Thr Ser Gin Vai Arg Pro Arg His Ile Thr Ser Leu Glu Vai Ile 16 20 25 30 12

Lys Ala Gly Pro His Cys Pro Thr Ala Gin Leu Ile Ala Thr Leu 31 35 40 45

Lys Asn Gly Arg Lys Ile Cys Leu Asp Leu Gin Ala Pro Lei Tyr 46 50 55 60

Lys Ile Ile Lys Lys Leu Leu Glu Ser 61 65 70

Lisboa, 27 de Julho de 2000

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Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de um factor de plaquetas 4 para a preparação de uma composição farmacêutica para a profilaxia ou o tratamento de fracturas ósseas.
2. Utilização de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o factor de plaquetas ser de origem humana ou bovina. Lisboa, 27 de Julho de 2000

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