DE69424747T2 - Pharmazeutische Zusammensetzung zur Vorbeugung oder Behandlung von Knochenbrüchen - Google Patents

Description

Grundlage der Erfindung 1. Gebiet der Erfindung
• Die Erfindung betrifft die Verwendung von Plättchenfaktor 4 zur Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen zur Vorbeugung oder Behandlung von mit der Knochenbildung verbundenen Erkrankungen, insbesondere Brüchen.
2. Beschreibung des Standes der Technik
• Knochen halten eine tragende Funktion als Endoskelett durch die wiederholte lokale Knochenresorption und Knochenbildung zur Substitution von alten Knochen durch neue Knochen aufrecht und sie sind auch für eine schnelle Reaktivität gegenüber verschiedenen mechanischen Beanspruchungen und Änderungen im Mineralgleichgewicht vorbereitet. Diese Osteoanagenese wird überwiegend von Knochenresorptionszellen, wie Osteoklasten und dgl., und Knochenbildungszellen, wie Osteoblasten und dgl., aufgrund der Kupplung beider Zellen durchgeführt. Vor kurzem wurde von Osteoblasten berichtet, daß sie nicht nur die Funktion der Knochenbildung besitzen, sondern auch mit der Differenzierung und Aktivierung von Osteoklasten eng verbunden sind, sodaß eine erhöhte Möglichkeit dafür vorhanden sein kann, daß sie eine Rolle als regulierendes Zentrum in der zellularen Knochenrekonstruktion spielen [Inoue, T., Mebio (1990), Special Version S. 2-7].
• Der Plättchenfaktor 4 (PF4) ist das Protein, welches für Plättchen charakteristisch ist, und er kann spezifisch an Heparin gebunden sein, um die antikoagulierende Wirkung von Heparin zu neutralisieren. Darüber hinaus ist bekannt, daß PF4 als chemotaktischer Faktor bei Leukozyten, Monozyten und Fibroblasten wirken kann und eine Antikollagenaseaktivität zum Schutz von Geweben vor einer Beeinträchtigung zeigt, welche durch die aus Leukozyten (polynukleären Neutrophilen) bei entzündlichen Läsionen freigesetzte Kollagenase hervorgerufen wird. Es wurde auch angenommen, daß Human-PF4 die Parathyroidhormon (PTH)-stimulierte &sup4;&sup5;Ca²&spplus;-Freisetzung aus Rattenneugeborenenknochen in vitro reversibel blockiert [Horton, J. E., et al., Biochem. Biophys. Acta (1980), Bd. 630, S. 459-462]. Vor kurzem wurde festgestellt, daß Human-PF4 das Wachstum der Humanosteosarcomzelllinien Saos-2 und G-292 inhibiert, wovon eine Antitumorwirkung erwartet wird [Tatakis, D. N., Biochem. Biophys. Res. Commun. (1992), Bd. 187, S. 287-293].
• Von Human-PF4 wurde festgestellt, daß es aus 70 Aminosäuren zusammengesetzt ist, und von Rinder-PF4 wurde festgestellt, daß das Polypeptid aus 88 Aminosäuren zusammengesetzt ist, wobei die jeweiligen Sequenzen ermittelt wurden [Hermodson, M., et al., J. Biol. Chem. (1977), Bd. 252, S. 6276-6278; Ciaglowski, R. E., et al., Arch. Biochem. Biophys. (1986), Bd. 250, S. 249- 256].
• PF4 wird aus Plättchen in der bindenden Form mit Proteoglycan freigesetzt, aber es wird angenommen, daß Proteoglycan durch Heparin ersetzt werden kann. Vor kurzem wurde die Bestimmung von PF4-Werten im Plasma durch Radioimmunoassay untersucht. PF4-Aktivität wurde reichlich in der α-Körnchen enthaltenden Fraktion festgestellt, welche Körnchen durch die Intrazellularorganellenfraktionierungsmethode isoliert wurden. Darüber hinaus wurde PF4 in Plättchen und Megakaryozyten durch Immunofluoreszenzmikroskopietechnik festgestellt, während dessen Synthese in Megakaryozyten angenommen wurde [Ginsberg, M. H., et al., Blood (1980), Bd. 55, S. 661-668; Ryo, R., et al., Thromb. Res. (1980), Bd. 17, S. 645-652].
• Andererseits ist es bekannt, daß eine Vielzahl von Knochenbildungsfaktoren an der Knochenbildung teilnehmen können [Noda, M., BIOmedica (1993), Bd. 8, S. 28-33]. Insbesondere ist es bekannt, daß Östrogen, PTH und anabolisches Hormon die Knochenbildung fördern können. Obwohl von PF4 bekannt ist, daß es die Knochenresorption verhindert (Horton, J. E. et al., ibid.), wurde in keinem Bericht vorgeschlagen, daß PF4 auch bei der Knochenbildung wirksam sein kann.
• Zusätzlich ist in der internationalen Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer WO-A-92 09301 eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung in der Medizin beschrieben, welche Zusammensetzung Plättchenfaktor 4 und einen annehmbaren Träger oder ein annehmbares Exzipiens umfaßt. In der WO-A- 92 09301 ist die Eignung von PF4 zur Förderung der Knochenbildung jedoch nicht beschrieben oder vorgeschlagen.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
• Ein Ziel der Erfindung ist die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, welche als neues, für die Knochenbildung wirksames therapeutisches Mittel angewandt werden kann. Spezieller wurde ein Peptid gewünscht, welches eine bei weitem sicherere, die Knochenbildung fördernde Wirkung zeigen kann als die zuvor bekannten Mittel, wie Östrogen, PTH oder anabolisches Hormon, die starke Nebenwirkungen zeigen und für eine vollständige Beobachtung selbstverständlich mit ihrer vorgeschlagenen, die Knochenbildung fördernden Wirkung erforderlich sind.
• Die Erfinder haben verschiedene Studien durchgeführt und festgestellt, daß Rinder-PF4 und Human-PF4 die Knochenbildung fördern können, wonach diese Erfindung abgeschlossen wurde.
• Es wird angenommen, daß im Blut von Föten und neugeborenen Säugetieren, einschließlich Menschen, verschiedene Wachstumsfaktoren festgestellt würden, welche das Wachstum verschiedener Zellgewebe in den beachtlich wachsenden Föten und Neugeborenen fördern könnten. Unter Verwendung von Serum von neugeborenen Rindern, welches leicht in Mengen als Ausgangsmaterial verfügbar ist, versuchten die Erfinder eine Reinigung und Isolierung des Proteinfaktors, welcher die Aktivität alkalischer Phosphatase (ALPase) in Osteoblasten-artigen Osteosarcomzelllinien erhöhen kann.
• Als Osteoblasten-ähnliche Osteosarcomzelllinien, welche für die Ermittlung der ALPase fördernden Aktivität angewandt werden können, können beispielsweise ROS 17/2.8-Zeillinien verwendet werden. Es wird als Hinweis für die Knochenbildung angesehen, daß die Osteoblasten-artige Osteosarcomzelllinie ROS 17/2.8 die ALPase-Aktivität erhöhte; beispielsweise wurde bewiesen, daß der transformierende Wachstumsfaktor-β (TGF-β) die ALPase- Aktivität erhöht. [Pfeilschifter, J., et al., Endocrinology (1987), Bd. 121, S. 212-218; Rodan, G. A., et al., Calcium regulating hormones and bone metabolism, Elsevier Science Publishers B. V., (1992), S. 183-196].
• Da es bekannt war, daß verschiedene Wachstumsfaktoren leicht an Heparin gebunden werden können, kann zuerst eine Heparinaffinitätssäulenchromatographie angewandt werden, um die gebundenen Fraktionen zu isolieren. Anschließend kann eine Umkehrphasen- HPLC für weitere Fraktionen angewandt werden. Jede Fraktion wurde hinsichtlich ihrer ALPase fördernden Aktivität untersucht. Als Ergebnis davon, wurde die Fraktion ermittelt, welche zur Erhöhung der ALPase-Aktivität in ROS 17/2.8-Zellen fähig war. Die Fraktion wurde hinsichtlich ihrer Teilaminosäuresequenz untersucht und unter Bezugnahme auf die Proteindatenbank dahingehend überprüft, ob sie irgendein bekanntes oder kein bekanntes Protein sein kann. Das Ergebnis war eine Übereinstimmung der genannten Sequenz mit der gut bekannten Aminosäuresequenz von Rinder-PF4 und es wurde daher angenommen, daß die resultierende aktive Fraktion PF4 ist. Eine ähnliche Untersuchung von kommerziell verfügbarem, gereinigtem Human-PF4 hat danach dessen ALPase-erhöhende Aktivität bestätigt. Die genannte aktive Fraktion wurde somit als PF4 identifiziert, wonach die Erfindung abgeschlossen wurde.
• Diese Erfindung betrifft die Verwendung von PF4 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Vorbeugung oder Behandlung von Brüchen, welche Zusammensetzung eine wirksame Menge von PF4 in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Exzipiens umfaßt.
• PF4 kann durch Reinigung aus Plättchen, durch Synthese der für PF4 codierenden DNA, basierend auf jeder beliebigen bekannten Aminosäuresequenz, oder durch Klonieren und Exprimieren des PF4-Gens mittels Gentechnologie, wie sie den Fachleuten gut bekannt ist, hergestellt werden.
• PF4 kann als ein therapeutisches oder prophylaktisches Mittel für mit Osteoblasten in Verbindung stehende Erkrankungen verwendet werden. Insbesondere ist es zur Behandlung jener Erkrankungen wirksam, welche die Förderung einer Knochendifferenzierung und des -wachstums erfordern, wie Brüche und dgl. im Hinblick auf die geförderte Differenzierung von Osteoblasten.
• Zur Behandlung von Brüchen kann man am stärksten bevorzugt eine Verabreichung anwenden, worin PF4 topisch oder direkt auf den betroffenen Teil nach Vermischen mit einer geeigneten Gelgrundlage aufgebracht wird. PF4 kann in anderer Weise über den systemischen Weg im Hinblick auf dessen hohe Wasserlöslichkeit unter Verwendung von wäßrigen Injektionen desselben und auch über den nasalen Weg oder über den Weg einer Inhalation in Form von Feinteilchenaerosolen verabreicht werden.
• Die Dosis kann 1 bis 100 ug/aufgebrachter Teil/Person/Tag für die topische Aufbringung und 0,1 bis 10 mg/kg/Tag für die systemische Verabreichung betragen.
• Diese Erfindung wird durch die folgenden Beispiele erläutert werden.
Beispiel 1 Reinigung von PF4 aus dem Serum neugeborener Rinder 1) Teilweise Reinigung durch Heparinaffinitätschromatographie
• Zu 1 l Serum neugeborener Rinder (bezogen von GIBCO Laboratories Inc.) wurden 20,5 g Natriumchlorid zugesetzt. Das gesalzene Serum wurde mit einer Heparin-Toyopearl-Säule (Durchmesser von 5 cm · Länge von 5,5 cm, erhältlich von der TOSOH Corporation), welche mit Tris-Puffer A (20 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5, 0,5 M NaCl) äquilibriert wurde, bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 3 ml/min entwickelt. Danach wurde die Säule innig mit dem Tris-Puffer A gewaschen.
• Nach dem Waschen wurden die auf der Heparin-Toyopearl-Säule adsorbierten Peptide oder Proteine mit Tris-Puffer B (20 mM Tris- HCl, pH-Wert 7,5, 1,0 M NaCl) eluiert. Die Eluate wurden hinsichtlich des Absorptionsvermögens bei 280 nm unter Verwendung eines Photometers überwacht und etwa 300 ml der Fraktionen wiesen ein höheres Absorptionsvermögen auf.
2) Reinigung durch Umkehrphasen-HPLC
• Das durch das vorstehende Verfahren 1) erhaltene Eluat wurde auf einer Cosmosil 5C&sub1;&sub8;&submin;&sub3;&sub0;&sub0;-Säule (Durchmesser von 4,6 mm · Länge von 250 mm, erhältlich von Nakarai Tesuku K. K.) entwickelt, welche mit 0,1% Trifluoressigsäure (TFA) enthaltendem Wasser äquilibriert worden war, und die Säule wurde mit 0,1% TFA-enthaltendem Wasser gründlich gewaschen. Danach wurden die adsorbierten Peptide oder Proteine mit einem linearen Gradienten von 0 bis 80% Acetonitril, welches 0,1% TFA enthielt, eluiert. Die Eluate wurden hinsichtlich des Absorptionsvermögens bei 214 nm überwacht, um jeden Peak zu sammeln. Das Elutionsmuster ist in Fig. 1 gezeigt.
Beispiel 2 Bestimmung der ALPase-fördernden Aktivität bei jedem Peak
• Die Osteoblasten-artige Osteosarcomzelllinie ROS 17/2.8 wurde in eine 24 Vertiefungen aufweisende Kulturplatte mit 2 · 10&sup4; Zellen/Vertiefung in 1 ml von 5% Serum neugeborener Rinderenthaltendem F12-Medium eingebracht und die Inkubation wurde in einem CO&sub2;-Inkubator bei 37ºC während 3 Tage durchgeführt. Anschließend wurde das Kulturmedium entfernt und die Zellen wurden einmal mit dem F12-Medium gewaschen und mit 1 ml Serumfreiem Medium (0,2% Rinderserumalbumin enthaltendes F12-Medium) weiter inkubiert, welches jede Peakfraktion, die durch das Verfahren 2) erhalten wurde, enthielt, und die Inkubation wurde während weiterer 2 Tage fortgesetzt. Danach wurde das Kulturmedium entfernt, die Zellen wurden dreimal mit Dulbecco PBS (bezogen von GIBCO Laboratories Inc.) gewaschen und 200 ul einer 0,2% Nonidet P-40 und 0,9% Natriumchlorid enthaltenden Lösung wurden zugesetzt. Das entstehende Gemisch wurde bei Raumtemperatur während 1 Stunde zur Auflösung der Zellen stehen gelassen. Darauffolgend wurde mittels einer Eppendorf-Zentrifuge während 5 Minuten zentrifugiert, um den Überstand zu sammeln. Zu 20 ul des Überstandes wurde eine Lösung zugesetzt, um 10 mM p-Nitrophenylphosphat in 0,1 M Glycin, 1 mM ZnCl&sub2;, 1 mM MgCl&sub2;, pH-Wert 10,4, herzustellen und nach dem Rühren wurde die Reaktion bei 37ºC während 20 Minuten fortschreiten gelassen. Die Reaktion wurde durch Messen des Absorptionsvermögens bei 420 nm überwacht. Die Ergebnisse der Bestimmung der Wirkung des in Fig. 1 gezeigten Peaks 1 auf die ALPase-fördernde Aktivität in den ROS 17/2.8-Zellen ist in Tabelle 1 gezeigt, worin Dosis eine Proteinkonzentration in der Peakfraktion darstellt und jeder Wert für die ALPase-Aktivität den Mittelwert ± die Standardabweichung in jeder Gruppe darstellt. Tabelle 1
• * 1U = freigesetztes p-Nitrophenol (uMol)/min
Beispiel 3 Bestimmung der physiko-chemischen Eigenschaften der Peptide im Peak 1 in Fig. 1 1) Identifizierung durch Aminosäuresequenzanalyse
• Das Peptid in der Fraktion, von welcher im Beispiel 2 bestätigt wurde, daß es aktiv ist, wurde einer üblichen Analyse der N- terminalen Sequenz unter Verwendung eines Aminosäure-Sequenzers, Modell 477A/120A (erhältlich von Applied Biosystems Inc.), unterworfen, aber die Sequenz konnte nicht bestimmt werden. Es wurde angenommen, daß der N-Terminus des Proteins blockiert war. Das aktive Peptid wurde daher fraktioniert, um die Bestimmung von dessen Teilaminosäuresequenz durchzuführen. Etwa 1 nM des aktiven Peakproteins (bestimmt durch Aminosäureanalyse) wurde mittels eines Speedback-Konzentrators (SAVANT Inc.) getrocknet und in 200 ul einer Lösung von 6 M Guanidin- HCl, 0,2 M Tris-HCl und 2 mM EDTA (pH-Wert 8,0) gelöst. Anschließend wurden 20 nMol Dithiothreitol (erhältlich von Nakarai Tesuku K. K.) zugesetzt und die Reaktion wurde bei 37ºC während 1,5 Stunden fortschreiten gelassen. Zum Reaktionsgemisch wurden 100 nMol 4-Vinylpyridin (erhältlich von Aldrich Chemical Co., Inc.) zugesetzt und die Reaktion wurde bei 37ºC während 1,5 Stunden weiter fortschreiten gelassen. Dieses Reaktionsgemisch wurde über eine Cosmosil 5C&sub1;&sub8;&submin;&sub3;&sub0;&sub0;-Säule (Durchmesser von 4,6 mm · Länge von 250 mm, erhältlich von Nakarai Tesuku K. K.) entwickelt, welche mit 0,1% TFA-enthaltendem Wasser äquilibriert worden war, und die Säule wurde mit 0,1% TFA-enthaltendem Wasser gründlich gewaschen. Anschließend wurden die adsorbierten Peptide oder Proteine mit einem linearen Gradienten von 0 bis 80% Acetonitril, welches 0,1% TFA enthielt, eluiert. Die Eluate wurden hinsichtlich des Absorptionsvermögens bei 214 nm überwacht, um jeden Peak zu sammeln, wodurch das Pyridin-ethylierte Protein erhalten wurde.
• Das so erhaltene Protein wurde mittels eines Speedback-Konzentrators getrocknet und in 500 ul 20 mM Tris-HCl-Puffer, 0,1 M NaCl mit pH-Wert 8,5 gelöst. Die Lysylendopeptidase (Achromobacter-Protease I (EC 3.4.21.50)) (erhältlich von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), gelöst in 20 mM Tris-HCl- Puffer, 0,1 M NaCl mit pH-Wert 8,5, wurde dazu zugesetzt, um ein Enzym/Substrat-Verhältnis (molares Verhältnis) von 1/200 zu erhalten. Die Reaktion wurde bei 30ºC während 16 Stunden fortschreiten gelassen, um eine Verdauung durchzuführen. Die Lösung, welche die entstandenen Peptide enthielt, wurde mittels einer Cosmosil 5C&sub1;&sub8;&submin;&sub3;&sub0;&sub0;-Säule (Durchmesser von 4,6 mm · Länge von 250 mm, erhältlich von Nakarai Tesuku K. K.) aufgetrennt, um die Fraktion an jedem Peak zu sammeln. Die Aminosäuresequenz der zwei Fraktionen der erhaltenen wurde durch einen Aminosäuresequenzer, Modell 477A/120A bestimmt.
• Zu der erhaltenen Aminosäuresequenz wurde mittels der Proteindatenbank zur Bestätigung, daß es sich um Rinder-PF4 handelt, das Vorhandensein oder das Fehlen einer identischen Sequenz überprüft (Ciaglowski, R. E., et al., ibid.). Die erhaltene Aminosäuresequenz ist als SEQ ID No.: 1 in der Sequenzliste gezeigt.
2) Analyse durch Elektrophorese
• Das Molekulargewicht des Peptids im in Fig. 1 gezeigten Peak 1 wurde durch SDS-Elektrophorese unter reduzierten Bedingungen bestätigt, um ein scheinbares Molekulargewicht von etwa 11.000 bis 14.000 zu zeigen. Dieses Molekulargewicht stimmt mit dem für Rinder-PF4 angegebenen Molekulargewicht überein (Ciaglowski, R. E., et al., ibid.).
Beispiel 4 Ermittlung der ALPase fördernden Aktivität von Human-PF4
• Human-PF4, welches von Calbiochem. Inc. erhältlich ist, wurde zur Verwendung gereinigt. Es wurde über eine Cosmosil 5C&sub1;&sub8;&submin;&sub3;&sub0;&sub0;- Säule (Durchmesser von 4,6 mm · Länge von 250 mm, erhältlich von Nakarai Tesuku K. K.) entwickelt, welche mit 0,1% TFA- enthaltendem Wasser äquilibriert worden war, und die Säule wurde mit 0,1% TFA-enthaltendem Wasser gründlich gewaschen. Danach wurden die adsorbierten Peptide oder Proteine mit einem linearen Gradienten von 0 bis 80% Acetonitril, welches 0,1% TFA enthielt, eluiert. Die Eluate wurden hinsichtlich des Absorptionsvermögens bei 214 nm überwacht, um die Fraktionen an jedem Peak zu sammeln. Das Elutionsmuster ist in Fig. 2 gezeigt. Die Wirkung dieser Fraktionen auf die ALPase-fördernde Aktivität in ROS 17/2.8-Zellen wurde auf die gleiche Weise bestimmt, wie es in Beispiel 2 zur Bestimmung des Peaks 1 als aktive Fraktion beschrieben ist. Die Ergebnisse nach Bestimmung der Wirkung des Peaks 1 auf die ALPase-fördernde Aktivität in ROS 17/2.8-Zellen sind in Tabelle 2 gezeigt. Die Aminosäuresequenz von Human-PF4 ist in SEQ ID No.: 2 gezeigt. Tabelle 2
• * 1U = freigesetztes p-Nitrophenol (uMol)/min
Kurze Erläuterung der Zeichnungen
• Fig. 1 zeigt das Muster, worin die durch Heparinaffinitätschromatographie gebundenen und eluierten Fraktionen ferner unter Verwendung von Umkehrphasen-HPLC entwickelt wurden und worin der Pfeil die aktive Fraktion (Peak 1) anzeigt, welche Rinder- PF4 enthält.
• Fig. 2 zeigt das Muster, worin das zum Teil gereinigte Human- PF4 durch Umkehrphasen-HPLC entwickelt wurde und worin der Pfeil die aktive Fraktion (Peak 1), welche Human-PF4 enthält, anzeigt.
[Sequenzliste]
• SEQ ID No.: 1
• Sequenzlänge: 88 Aminosäuren
• Sequenztyp: Aminosäure
• Topologie: linear
• Molekültyp: Peptid
• Fragmenttyp:
• Originalquelle:
• Organismus: Rind (Bos taulus)
• Stamm: Serum
• Merkmale:
• Lage:
• Weitere Information: das 1. Xaa stellt Pyro-Gln oder Glu dar, das 20. Xaa stellt Asp oder Ser dar, das 49. Xaa stellt Thr oder Leu dar, das 57. Xaa stellt Leu oder Ile dar und das 72. Xaa stellt Arg oder Asn dar. Sequenzbeschreibung: SEQ ID No.: 1
• SEQ ID No.: 2
• Sequenzlänge: 70 Aminosäuren
• Sequenztyp: Aminosäure
• Topologie: linear
• Molekültyp: Peptid
• Fragmenttyp:
• Originalquelle:
• Organismus: Mensch (Homo sapiens)
• Stamm: Serum Sequenzbeschreibung: SEQ ID No.: 2

Claims (2)

1. Verwendung von einem Plättchenfaktor 4 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Vorbeugung oder Behandlung von Knochenbrüchen.

2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Plättchenfaktor vom Menschen oder von Rindern stammt.