PT99565B - Processo para a preparacao de factores de crescimento de fibroblastos quimerico s - Google Patents
Processo para a preparacao de factores de crescimento de fibroblastos quimerico s Download PDFInfo
- Publication number
- PT99565B PT99565B PT99565A PT9956591A PT99565B PT 99565 B PT99565 B PT 99565B PT 99565 A PT99565 A PT 99565A PT 9956591 A PT9956591 A PT 9956591A PT 99565 B PT99565 B PT 99565B
- Authority
- PT
- Portugal
- Prior art keywords
- growth factor
- fibroblast growth
- glu
- hbfgf
- serine
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 26
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 title claims description 25
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 81
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 claims abstract description 78
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 claims abstract description 76
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 claims abstract description 69
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims abstract description 40
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 39
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 30
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 claims abstract description 30
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims abstract description 27
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 claims abstract description 17
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims abstract description 15
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 13
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims abstract description 13
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims abstract description 13
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 claims abstract description 9
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims abstract description 7
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 74
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 claims description 58
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 44
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 38
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 28
- 229960001153 serine Drugs 0.000 claims description 28
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 21
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 19
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 19
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 17
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 17
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 claims description 15
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 15
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 claims description 15
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 13
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 claims description 12
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 12
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 11
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims description 11
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 10
- 229960003767 alanine Drugs 0.000 claims description 9
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 claims description 9
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 9
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical group NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 8
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 7
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 7
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 7
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 7
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical group CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 6
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical group CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 6
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 6
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 claims description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 6
- 239000004475 Arginine Chemical group 0.000 claims description 5
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical group NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 claims description 5
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 5
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 5
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical group NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 5
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical group CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 5
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Chemical group NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000004472 Lysine Chemical group 0.000 claims description 5
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Chemical group CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229960003121 arginine Drugs 0.000 claims description 5
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Chemical group OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229960005261 aspartic acid Drugs 0.000 claims description 5
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 claims description 5
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Chemical group OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229960002743 glutamine Drugs 0.000 claims description 5
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 claims description 5
- 229960003646 lysine Drugs 0.000 claims description 5
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 claims description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 5
- 235000014393 valine Nutrition 0.000 claims description 5
- 229960004295 valine Drugs 0.000 claims description 5
- 239000004474 valine Chemical group 0.000 claims description 5
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Chemical group OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000004471 Glycine Chemical group 0.000 claims description 4
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical group CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 4
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Chemical group CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Chemical group C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 claims description 4
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 claims description 4
- 229960002449 glycine Drugs 0.000 claims description 4
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Chemical group CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 235000014705 isoleucine Nutrition 0.000 claims description 4
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims description 4
- 235000005772 leucine Nutrition 0.000 claims description 4
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 claims description 4
- 229960004799 tryptophan Drugs 0.000 claims description 4
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 claims description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical group OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 3
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical group C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical group C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 claims description 3
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Chemical group OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Chemical group CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000004473 Threonine Chemical group 0.000 claims description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Chemical group OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 3
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Chemical group OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 claims description 3
- 229960002885 histidine Drugs 0.000 claims description 3
- 229960002429 proline Drugs 0.000 claims description 3
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 claims description 3
- 229960004441 tyrosine Drugs 0.000 claims description 3
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Chemical group OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims description 2
- 230000005257 nucleotidylation Effects 0.000 claims description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 claims 5
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 claims 2
- 229960005190 phenylalanine Drugs 0.000 claims 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Chemical group OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- GVNVAWHJIKLAGL-UHFFFAOYSA-N 2-(cyclohexen-1-yl)cyclohexan-1-one Chemical compound O=C1CCCCC1C1=CCCCC1 GVNVAWHJIKLAGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 101150065749 Churc1 gene Proteins 0.000 claims 1
- 102100038239 Protein Churchill Human genes 0.000 claims 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 claims 1
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 claims 1
- 238000009795 derivation Methods 0.000 claims 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 claims 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 claims 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 claims 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 18
- 230000002297 mitogenic effect Effects 0.000 abstract description 15
- 101150021185 FGF gene Proteins 0.000 abstract description 5
- 101000846416 Homo sapiens Fibroblast growth factor 1 Proteins 0.000 abstract description 2
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 51
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 26
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 22
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 19
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 19
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 19
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 19
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 16
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 15
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 15
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 13
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 12
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 11
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 11
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 10
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 10
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 9
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 9
- 241000894007 species Species 0.000 description 9
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 8
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 8
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 8
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 7
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 7
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108020005098 Anticodon Proteins 0.000 description 6
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 6
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 6
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 5
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 5
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 5
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 5
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 5
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 5
- 108090000386 Fibroblast Growth Factor 1 Proteins 0.000 description 4
- 102100031706 Fibroblast growth factor 1 Human genes 0.000 description 4
- FYYSIASRLDJUNP-WHFBIAKZSA-N Glu-Asp Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O FYYSIASRLDJUNP-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 4
- 101001052035 Homo sapiens Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 4
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 4
- 108010063718 gamma-glutamylaspartic acid Proteins 0.000 description 4
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 4
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 4
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 4
- 230000034005 thiol-disulfide exchange Effects 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 102100040706 Zinc finger protein 79 Human genes 0.000 description 3
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N iodoacetic acid Chemical class OC(=O)CI JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 4-Nitrophenyl Phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- FLYANDHDFRGGTM-PYJNHQTQSA-N Arg-Ile-His Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N FLYANDHDFRGGTM-PYJNHQTQSA-N 0.000 description 2
- CKAJHWFHHFSCDT-WHFBIAKZSA-N Asp-Glu Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O CKAJHWFHHFSCDT-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- UKGGPJNBONZZCM-WDSKDSINSA-N Asp-Pro Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O UKGGPJNBONZZCM-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- QTIZKMMLNUMHHU-DCAQKATOSA-N Asp-Pro-His Chemical compound C1C[C@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC(=O)O)N)C(=O)N[C@@H](CC2=CN=CN2)C(=O)O QTIZKMMLNUMHHU-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ILGFBUGLBSAQQB-GUBZILKMSA-N Glu-Glu-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O ILGFBUGLBSAQQB-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- SNFUTDLOCQQRQD-ZKWXMUAHSA-N Glu-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O SNFUTDLOCQQRQD-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- PWWVAXIEGOYWEE-UHFFFAOYSA-N Isophenergan Chemical compound C1=CC=C2N(CC(C)N(C)C)C3=CC=CC=C3SC2=C1 PWWVAXIEGOYWEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HFKJBCPRWWGPEY-BQBZGAKWSA-N L-arginyl-L-glutamic acid Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O HFKJBCPRWWGPEY-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 2
- 125000001176 L-lysyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C(N([H])[H])([H])[H] 0.000 description 2
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 241000220273 Pararge aegeria Species 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RWCOTTLHDJWHRS-YUMQZZPRSA-N Pro-Pro Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H]1NCCC1 RWCOTTLHDJWHRS-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 210000002376 aorta thoracic Anatomy 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 108010013835 arginine glutamate Proteins 0.000 description 2
- 239000012300 argon atmosphere Substances 0.000 description 2
- 108010093581 aspartyl-proline Proteins 0.000 description 2
- 108010038633 aspartylglutamate Proteins 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- -1 for example Chemical class 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 2
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 2
- 150000002334 glycols Chemical class 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 2
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 2
- 238000005462 in vivo assay Methods 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- NAHBVNMACPIHAH-HLICZWCASA-N p-ii Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H]2CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=3C=CC=CC=3)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N1)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(N)=O)=O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 NAHBVNMACPIHAH-HLICZWCASA-N 0.000 description 2
- QKFJKGMPGYROCL-UHFFFAOYSA-N phenyl isothiocyanate Chemical compound S=C=NC1=CC=CC=C1 QKFJKGMPGYROCL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 108010077112 prolyl-proline Proteins 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 2
- GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 1-prop-2-ynoxypropan-2-ol Chemical compound CC(O)COCC#C GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TZGPACAKMCUCKX-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxyacetamide Chemical compound NC(=O)CO TZGPACAKMCUCKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000013563 Acid Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108010051457 Acid Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 206010003210 Arteriosclerosis Diseases 0.000 description 1
- NPDLYUOYAGBHFB-WDSKDSINSA-N Asn-Arg Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N NPDLYUOYAGBHFB-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- RJUHZPRQRQLCFL-IMJSIDKUSA-N Asn-Asn Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O RJUHZPRQRQLCFL-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 101000846393 Bos taurus Fibroblast growth factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001051969 Bos taurus Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- XZMCDFZZKTWFGF-UHFFFAOYSA-N Cyanamide Chemical compound NC#N XZMCDFZZKTWFGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N Dodecane Natural products CCCCCCCCCCCC SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 241000701832 Enterobacteria phage T3 Species 0.000 description 1
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 description 1
- 108091008794 FGF receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000044168 Fibroblast Growth Factor Receptor Human genes 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- MPZWMIIOPAPAKE-BQBZGAKWSA-N Glu-Arg Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N MPZWMIIOPAPAKE-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- 241001622557 Hesperia Species 0.000 description 1
- 102100039064 Interleukin-3 Human genes 0.000 description 1
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 description 1
- WMIOEVKKYIMVKI-DCAQKATOSA-N Leu-Pro-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O WMIOEVKKYIMVKI-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 1
- ONGCSGVHCSAATF-CIUDSAMLSA-N Met-Ala-Glu Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O ONGCSGVHCSAATF-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 208000023178 Musculoskeletal disease Diseases 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 206010029240 Neuritis Diseases 0.000 description 1
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102000010780 Platelet-Derived Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010038512 Platelet-Derived Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 208000004210 Pressure Ulcer Diseases 0.000 description 1
- GLEOIKLQBZNKJZ-WDSKDSINSA-N Pro-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 GLEOIKLQBZNKJZ-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010040943 Skin Ulcer Diseases 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 208000002847 Surgical Wound Diseases 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 210000002556 adrenal cortex cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000002547 anomalous effect Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 150000001484 arginines Chemical class 0.000 description 1
- 208000011775 arteriosclerosis disease Diseases 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 150000001793 charged compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000035605 chemotaxis Effects 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- KAKKHKRHCKCAGH-UHFFFAOYSA-L disodium;(4-nitrophenyl) phosphate;hexahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.[Na+].[Na+].[O-][N+](=O)C1=CC=C(OP([O-])([O-])=O)C=C1 KAKKHKRHCKCAGH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 208000019622 heart disease Diseases 0.000 description 1
- 108010085325 histidylproline Proteins 0.000 description 1
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 210000003016 hypothalamus Anatomy 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- OOYGSFOGFJDDHP-KMCOLRRFSA-N kanamycin A sulfate Chemical compound OS(O)(=O)=O.O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N OOYGSFOGFJDDHP-KMCOLRRFSA-N 0.000 description 1
- 229960002064 kanamycin sulfate Drugs 0.000 description 1
- 108010057821 leucylproline Proteins 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 210000002752 melanocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003716 mesoderm Anatomy 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- OKSCSVIOPIVWTC-KRWDZBQOSA-N methyl (2s)-2-[[2-[4-[bis(2-chloroethyl)amino]phenyl]acetyl]amino]-3-(1h-imidazol-5-yl)propanoate Chemical compound C([C@@H](C(=O)OC)NC(=O)CC=1C=CC(=CC=1)N(CCCl)CCCl)C1=CN=CN1 OKSCSVIOPIVWTC-KRWDZBQOSA-N 0.000 description 1
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 1
- 230000008747 mitogenic response Effects 0.000 description 1
- 230000011278 mitosis Effects 0.000 description 1
- 210000003098 myoblast Anatomy 0.000 description 1
- 230000003680 myocardial damage Effects 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 230000005709 nerve cell growth Effects 0.000 description 1
- 210000001020 neural plate Anatomy 0.000 description 1
- 230000000626 neurodegenerative effect Effects 0.000 description 1
- 230000006576 neuronal survival Effects 0.000 description 1
- 230000005156 neurotropism Effects 0.000 description 1
- 230000000263 nonmitogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 210000004248 oligodendroglia Anatomy 0.000 description 1
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000006174 pH buffer Substances 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229940117953 phenylisothiocyanate Drugs 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 210000005267 prostate cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000001525 receptor binding assay Methods 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 239000012465 retentate Substances 0.000 description 1
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 description 1
- 230000000250 revascularization Effects 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 231100000019 skin ulcer Toxicity 0.000 description 1
- 210000000329 smooth muscle myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000012134 supernatant fraction Substances 0.000 description 1
- 239000010414 supernatant solution Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 1
- 125000000430 tryptophan group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C2=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C12 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/50—Fibroblast growth factor [FGF]
- C07K14/503—Fibroblast growth factor [FGF] basic FGF [bFGF]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
FUNDAMENTO DO INVENTO ' · · ·
O presente invento está relacionado com novos factores de crescimento de fibroblastos, básico, quimérico e com a produção melhorada de tais factores (bFGF).
Os factores de crescimento polipeptídicos são moduladores da proliferação e diferenciação celulares do tipo hormona. Os factores de crescimento são responsáveis pela regulação de uma variedade de processos fisiológicos, incluindo o desenvolvimento, regeneração e reparação de feridas.
No decurso do estudo destes factores, foi identificada uma série com base na capacidade dos extractos de vários tecidos, tais como cérebro, pituitária e hipotálamo, para estimularem a mitose de células em cultura. Foram usadas numerosas designações para os factores activos nestes extractos, incluindo factor de crescimento epidérmico, factor de crescimento derivado de plaquetas, factor de crescimento de células nervosas, factor de crescimento hematopoiético e factor de crescimento de fibroblastos.
factor de crescimento de fibroblastos (FGF) foi primeiro descrito por Gospodarowicz em 1974 (Nature 249: 123-127) como derivado de tecido de cérebro bovino ou de tecido pituitário que se mostrou mitogénico para fibroblastos e células endoteliais. Observou-se mais tarde que o mitogénio primário derivado do cérebro era diferente do isolado a partir de pituitária. Estes dois factores foram designados FGF ácido e básico, respectivamente, pois apresentam actividades biológicas idênticas senão mesmo semelhantes mas diferem nos seus pontos isoeléctricos. Os factores de crescimento de fibroblastos ácido e básico (recentemente revisto por Burgess, W.H. e Maciag, T. Ann. Rev. Biochem. 58: 575-606 (1989)) parecem ser membros normais de uma família de
factores de crescimento que se ligam à hepârinà qúe influenciam a capacidade de proliferação geral da uma maioria de células derivadas da mesoderme e da neuroectoderme (Gospodarowicz, D., et al., Nat. Câncer Inst. Mon. 48:109-130 (1978)), incluindo células endoteliais, células do músculo liso, células do córtex adrenal, células da próstata e células epiteliais da retina, oligodendrócitos, crondócitos, mioblastos e osteoblastos (Burgess e Maciag, referido atrás na página 584). Se bem que os melanócitos humanos respondam às influências mitogénicas do factor de crescimento de fibroblastos básico mas não às do FGF ácido, a maior parte dos | tipos celulares aviários e de mamíferos respondem a ambos os polipeptídeos (ibid).
Para além de induzirem uma resposta mitogénica que estimula o crescimento celular, os factores de crescimento de fibroblastos podem estimular um grande número de tipos celulares para responderem de uma forma não mitogénica. Estas actividades incluem promoção da migração celular para áreas feridas (quimiotáxis), iniciação da formação de novos vasos sanguíneos (angiogénese) , modulação da regeneração de nervos (neurotropismo) e estimulação ou supressão da expressão de proteínas celulares específicas e sobrevivência celular importantes no processo de cicatrização (Burgess e Maciag, referido atrás, páginas 584 a ) 588).
Estas propriedades, juntamente com acção de promoção do crescimento celular, proporcionam uma base para a utilização de factores de crescimento de fibroblastos em abordagens terapêuticas para acelerar a cicatrização de feridas e na prevenção e aplicações terapêuticas para trombose, arteriosclerose e similares. Assim os factores de crescimento de fibroblastos foram sugeridos para a cicatrização de tecido sujeito a trauma (Davidson, J.M., et al., J. Cell Biol. 100:1219-1227 (1985)), para
minimizar danificação do miocãrdio em cirurgiãse doenças cardíacas (U.S. pat. N2 4,296,100 e 4,378,347 de Franco), e para aumentar a sobrevivência neuronal e extensão de neurites (Walicke, P. et al., Proc. Nat. acad. Sei. USA 83: 3012-3016 (1986)).
I Foram isolados e sequenciados clones de DNA complementar codificadores de factores de crescimento de fibroblastos básico humano e bovino e as sequências de aminoácidos previstas derivadas dos DNAs complementares estão de acordo com as estruturas ) determinadas pela análise de sequências proteicas (resumido por
Burgess e Maciag, referido atrás, nas páginas 580-581). Os resultados prevêm que o factor de crescimento de fibroblastos ácido (daqui em diante referido como aFGF) possua 155 aminoácidos (ibid). O gene para o factor de crescimento de fibroblastos básico (daqui em diante referido como bFGF) também codifica uma proteína de 155 resíduos. Tanto para aFGF como para bFGF as formas truncadas no extremo N que apresentam actividade biológica total incluindo um bFGF ãcido de 146 aminoácidos originalmente isolado e sequenciado (Esch, F., et al., Proc. Nat. Acad. Sei. USA 82:6507-6511 (1985)) e uma forma de 131 aminoácidos. A análise das estruturas demonstram uma identidade de 55% entre aFGF e bFGF (Burgess e Maciag, referido atrás na página 581).
)
O factor de crescimento de fibroblastos básico pode ser extraído de tecido de mamífero, mas isto requere vários passos mesmo quando se emprega cromatografia de afinidade ligada a heparina (Pat. U.S. N2 4,785,079 e 4,902,782 de Gospodarowicz, et al.) e a espécie de 146 aminoácidos é geralmente obtida se a extracção for feita na ausência de inibidores de proteases (ibid., coluna 9, linhas 29 a 32). cDNAs de factores de crescimento de fibroblastos básicos bovino e humano foram expressos em E. coli (iwane, M. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun.
146:470-477 (1987) e Squires, C.H., et ' ài'. z J. Biol. Chem. 263:16297-16302 (1988)) e 5. cerevisiae (Barr, P.J. et al., J. Biol. Chem. 263: 16471-16478 (1988)). No entanto, os rendimentos descritos do produto são baixos (ver Eur. Pat. Ap. Pub. N2 228,449 de Esch, et al., página 18) e factores recombinantes apresentam uma tendência marcada para sofrerem trocas internas tiol-dissulfureto promovidas pelos grupos tiol livres na proteína que resultam na formação de espécies com pontes dissulfureto ao acaso (Iwane, referido atrás).
Foi sugerido a existência de uma série de análogos do factor de crescimento de fibroblastos básico. Foi sugerido que muteínas de bFGF tendo eliminados, adicionados aminoácidos no extremo amina ou carboxilo, cisteina substituída com um aminoãcido neutro tal como serina ou ácido aspártico, arginina, glicina, serina ou valina substituídas por outros aminoácidos que aumentam a estabilidade (Pedido de Patente Europeia Publicação NS 281,822 de Seno et al., página 4, linhas 1 a 3 e página 6, linha 29 atê à página 7, linha 19), as muteínas compreendem duas ou três adições, deleções ou substituições, com substituição de serina por cisteina sendo a substituição mais preferida (página 7, linhas 18 a 23). Arakawa e Fox (Pedido de Patente Europeia Publicação Ns 320,148) sugeriram que a substituição de pelo menos uma e mais preferencialmente duas das cisteinas encontradas no bFGF natural com diferentes resíduos de aminoácidos dá um análogo mais estável (página 4, linhas 44 a 47); serina foi ilustrada nos Exemplos (página 13, linhas 22 a 23), mas alanina, ácido aspártico e asparagina foram também sugeridos (página 5, linha 26 e página 13, linha 25). De forma semelhante aFGFs recombinantes tendo cisteina formando ligações estranhas substituída com serina e cisteina susceptível â oxidação, metionina e triptofano substituidos com alanina, valina, leucina ou isoleucina, para dar factores tendo actividade biológica aumentada ou melhorada foi
-Ίtambém sugerido (Pedido de Patente Europeia Publicação N2 319,052 de Thomas Jnr e Linemeyer, página 17, linhas 8 a 20).
Uma muteina bFGF sem 7a 46 aminoácidos derivados do extremo carboxilo e, faeultativamente, tendo substituições de aminoácidos foi sugerido possuir maior estabilidade mantendo ao mesmo tempo actividade em Pedido de Patente Europeia Publicação Ns 298723) sugeriu gue a substituição de resíduos básicos ou carregados positivamemnte no domínio de ligação à heparina abrangendo os aminoácidos 128 a 138 com aminoácidos neutros ou carregados negativamente para produzir as formas de FGF tendo capacidade de ligação â heparina reduzida e maior potência (pagina 5, linha 45 e página 5, linha 54 até à página 6, linha 16). Bergonzoni, et al., sugeriram seis análogos: 1) Ml-bFGF, sem os resíduos 27 a 32: M2-bFGF, sem os resíduos 54 a 58; M3-bFGF, sem os resíduos 70 a 75; M4-bFGF, sem os resíduos 78 a 83; M5-bFGF sem os resíduos 110 a 120; M5a-bFGF, tendo a posição 128 lisina e a posição 129 arginina substituídas com resíduos glutamina; e M6b-FGF, tendo as posições 119 e 128 lisina e as posições 118 e 129 argininas substituídas por resíduos de glutamina (Pedido de Patente Europeia Publicação N2 363,675, coluna 6, linha 48 até à coluna 7 linha 13).
No entanto, são cada vez mais solicitadas as novas formas estáveis e activas dos factores de crescimento de fibroblastos para usar em terapias indicadas atrás.
SUMÁRIO DO INVENTO
O presente invento está relacionado com novos genes do factor de crescimento de fibroblastos básico humano de tamanho completo (codificador de 155 aminoácidos) e proteínas que possuem o resíduo alanina na posição 3 e o resíduo serina na posição 5 do bFGF nativo substituido com ácido glutâmicoí’Glu3'5hbFGF deste invento partilham identidade de sequências com FGF ácido humano nos 8 aminoácidos -terminais e podem portanto ser considerado nm FGF quimérico. Mais especificamente, estes factores são de FGf humano mas outras FGFs de outras espécies de mamíferos podem ser conseguidas através deste invento.
factor de crescimento de fibroblastos quimérico
5 glu ' tem as propriedades mitogénicas do bFGF derivado de tecido, mas a expressão em E. eoli é significativamente superior à da sequência nativa. Assim, este invento proporciona novo FGF biologicamente activo e um método para a sua preparação com rendimento elevado.
Os mesmos resultado foi observado relativamente às . 3 5 novas variantes de glu ' ghbFGF. Por exemplo, uma versão estabilizada do factor de crescimento foi preparada susbstituindo cisteina 78 e cisteína 96 com aminoácidos que eliminam as trocas tiol-dissuldureto (formação ao acaso de dissulfureto) tais como serina. Assim, este invento não só modifica hbFGF (1-155) para aumentar significativamente o rendimento do factor expresso em E. eoli como também facilita a purificação e aumenta a estabilidade.
Portanto, este invento proporciona novos factores de crescimento de fibroblastos biologicamente activos e métodos de preparação destes numa escala preparativa. Numa realização preferida, o DNA codificador do novo FGF deste invento é inserido em plasmídeos ou vectores, os quais podem ser convencional e eficazmente conservados, guardados ou transportados, caso se pretenda. Os plasmídeos ou vectores são então usados para transformar ou transfectar microorganismos, e.g. E. eoli, que igualmente podem ser usados para conservar, guardar ou transportar, caso se pretenda o material genómico codificador do novo FGF
\ \7
-9deste invento. A cultura destes microorganismos ém condições que expressam os factores dão os polipeptídeos em abundância.
Uma vez que, como descrito atrás, os factores de crescimento libertados em áreas traumatizadas aceleram o processo de cicatrização normal, os novos factores de crescimento de fibroblastos deste invento possuem aplicações terapêuticas para cicatrização de queimaduras, incisões cirúrgicas e outras feridas; para o tratamento de úlceras da pele, incluindo escaras e similares; para condições cardiovasculares e e recomeço do fluxo sanguíneo após ataques cardíacos através da revascularização do tecido danificado; para aumentar a reparação de ossos e tratamento de perturbações músculo-esqueleto; e em doenças neurodegenerativas e outras.
DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO *3 pr o O /C
Figura 1. Construção de cDNA de Glu ' , Ser ' hbFGF.
5
Usando o plasmídeo de expressão pT7 preparou-se glu ’ hbFGF no 78 78 96
Exemplo 2 como um molde, as mutações cis para ser e cis ,
para ser foram dirigidas usando as misturas de reacção em cadeia com polimerase seguintes: (1) iniciadores codificadores de T7 mais anticodão ser ; e (2) iniciadores anticodão de T7 mais codificadores de ser . A reacção em cadeia com polimerase foi então realizada a partir de (1) e (2) usando iniciadores codificadores e anti-codão de T7 como descrito no Exemplo 3.
Figura 2. HPLC em heparina do hbFGF Natural. hbFGF ligado (contendo 154 aminoácidos) foi eluido de uma coluna de heparina-sefarose usando um gradiente linear de 0,6 a 3,0 M NaCl a 0,7 ml/min. e controlado a 280 nm como descrito no Exemplo 5.
-10<?/
Figura 3. HPLC em Heparina de ' hbFGF recombinante Reduzido. Um perfil de eluição de HPLC em heparina de uma fracção do material reunido da cromatografia em heparina-sefarose que foi reduzido com ditiotreitol como descrito no Exemplo 6.
Figura 4. HPLC em Fase Reversa de Glu3',Ser78'96hbFGF. Uma amostra de HPLC em heparina (8pg) foi aplicado numa coluna Vydac C^ e eluido a 0,7 ml/min usando um sistema solvente 0,1% ácido trifluoroacético/acetonitrilo (0 a 28% de acetonitrilo em 15 minutos, 28 a 60% em 99 minutos e 60 a 80% em 10 minutos) como descrito no Exemplo 6.
Figura 5. Comparação dos Bioensaios de bFGF nativo com bFGF recombinante. A actividade mitogénica de bFGF isolado a partir de cérebro bovino foi comparado com bFGFs recombinantes humanos na proliferação de células endoteliais vasculares dos arcos aórticos bovinos como descrito no Exemplo 7. As células foram cultivadas na presença de diferentes quantidades de bFGF bovino (10-155) (“A”)i sequência natural de hbFGF recombinante (-·-), e glu ' hbFGF (-o-) (determinado por análise de aminoácidos) como indicado.Após 4 dia, determinou-se a 405 nm a actividade de fosfatase ácida equivalente ao número de células na gama de densidade celular examinada.
Figura 6. Comparação por Bioensaio do FGF nativocom bFGFs Quiméricos. A actividade mitogénica de bFGF de cérebro bovino (10-155) (-o-) e glu3 ' , ser^' ^^hbFGF (-·-) foi comparada usando células mantidas na presença de diferentes quantidades (determinado por análise de aminoácidos) dos factores de crescimento como indicado durante 5 dias e determinado o número de células como descrito no Exemplo 7.
DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO ':‘
O presente invento está relacionado com a produção e estabilização aumentadas de novos factores de crescimento básicos de fibroblastos tendo cerca de 155 aminoácidos. Apesar do exemplo do recombinante humano aqui dado, o FGF do presente invento é aplicável a outras espécies de mamíferos. Um novo hbFGF recombinante deste invento foi preparado substituindo alanina 3 e serina por ácido glutâmico no factor de crescimento de fibroblastos . 3 5 ...
básico humano de tamanho completo. Glu ' hbFGF partilha identidade de sequências com aFGF humano nos 8 aminoácidos do extremo N e é considerado um análogo quimérico de haFGF e de hbFGF. Esta mutação aumenta significativamente o rendimento da proteína expressa em Escherichia coli comparado com a sequência nativa de bFGF.
5
Tanto bFGF nativo recombinante como glu ' hbFGF apresentam micro-heterogeneidade em cromatografia líquida de alta resolução em heparina e em fase reversa. Se bem que pretendamos estar vinculados a qualquer teoria, esta micro-heterogeneidade parece ser devido a trocas internas tiol-dissulfureto (formação de ligações dissulfureto ao acaso) devido a poder ser eliminada por tratamento dos factores de crescimento com um agente redutor antes da cromatografia. A geração de uma versão estabilizada do factor de crescimento e eliminação das formas misturadas de dissulfureto foi conseguido por substituição da císteina 78 e císteina 96 com serina por mutagénse dirigida. Uma proteína é aqui definida como FGF básico se apresenta actividade de FGF em ensaios in vitro e in vivo (resumido por Burgess e Maciag, referido atrás, páginas 584 a 586); liga-se a heparina; e é eluido da heparina-sefarose a 1,5-1,7 M NaCl; e reage imunologicamente com anticorpos preparados usando FGF básico humano ou bovino ou seus peptídeos sintéticos ou nativos ou com análogos de
-12χ -Y?
sequências de bFGF conjugadas com albumina”*: âêrica bovina. Uma proteína é aqui definida como FGF ácido se apresenta actividade de FGF em ensaios in vitro e in vivo; liga-se a heparina; e é eluido a 1,0-1,2 M NaCl da heparina-sefarose; e é imunologicamente reactivo com anticorpos preparados contra aFGF hmpanp ou bovino ou contra seus peptídeos sintéticos ou nativos. Um factor de crescimento de fibroblastos quimérico partilha a sequência de ambos os tipos. Qualquer tipo de factor de crescimento de fibroblastos de mamífero é englobado no presente invento, particularmente o factor de crescimento de fibroblastos humano.
>
Os factores de crescimento de fibroblastos quiméricos deste invento incluem glu3'5hbFGF e glu3'5,ser78'96hbFGF tendo cerca de 155 aminoácidos e formas truncadas tendo cerca de 154 aminoácidos (e.g., as que não possuem metionina N-terminal; ver
Exemplo 6 (b)). este invento também engloba análogos de
5 . .
glu ' hbFGF tendo os resíduos cisteína nas posições 78 e 96 substituídos por outroa aminoácidos, tais como, por exemplo alanina, glicina, arginina, triptofano, lisina, ácido aspãrtico, ãcido glutâmico, asparagina, glutamina, histidina, isoleucina, leucina, valina, fenilallanina, tirosina, metionina, serina, treonina ou prolina. ainda, os derivados de FGF deste invento não são específicos de espécie e incluem por exemplo, contrapartes de FGF bovino e outros que partilham homologia de sequências semelhante com hbFGF.
Os novos factores de crescimento de fibroblastos deste invento podem ser preparados por montagem dos polipeptídeos a partir dos aminoácidos constituintes ou a partir de aminoácidos ou peptídeos e polipeptídeos usando meios químicos ou bioquímicos conhecidos dos familiarizados com a matéria, tais como, por exemplo, adição sequenciada de aminoácidos ao extremo N de formas mais pequenas de factor de crescimento de fibroblastos. Como
alternativa, os novos factores de crescimento de fibroblastos deste invento podem ser preparados por síntese de proteínas recombinantes envolvendo preparação de quimérico, inserção do DNA num vector, células hospedeiras e isolamento do produzido.
DNA codificador de FGF expressão do vector nas FGF recombinante assim
DNA codificador de FGF deste invento pode ser preparado por alteração de um gene do factor de crescimento de fibroblastos básico humano ou bovino por deleções de nucleótidos, adições de nucleótidos ou mutações pontuais produzidas usando meios convencionais. Uma ilustração está estabelecida no Exemplo 1. Devido à degenerescência do código genético, pode ser seleccionada uma variedade de combinações de trocas de codões para formar DNA que codifica o FGF deste invento, de forma que quaisquer deleções, adições ou mutações pontuais que resultem num DNA codificador de FGF quimérico estão englobados no presente invento. Uma vez que certos codões são mais eficazes para a expressão de polipeptídeos em certos tipos de organismos, a selecção de alterações no gene de fibroblastos para dar material de DNA que codifique o FGF deste invento são preferencialmente os que dão a expressão mais eficaz no tipo de organismo que vai servir como hospedeiro do vector recombinante. A selecção de codões alterados pode também depender das considerações na construção de vectores.
O material de partida do DNA do factor de crescimento de fibroblastos que pode ser alterado para formar DNA quimérico pode ser natural, recombinante ou sintético. Assim, o DNA material de partida pode ser isolado a partir de tecido ou de cultura de tecidos, construído a partir de oligonucleótidos usando métodos convencionais, obtido comercialmente ou preparado por isolamento de RNA codificador de bFGF de fibroblastos, usando este RNA para sintetizar cDNA de cadeia simples que pode ser —14 — usado como molde para a síntese do correspondente DNA de cadeia dupla.
Ilustrando o presente invento foram clonadas sequências de DNA complementares definindo sequências polipeptídicas de fibroblastos quiméricas tais como as construídas nos Exemplos 2 e
3. Também estão englobadas sequências de DNA homólogas ou estreitamente relacionadas com DNA complementar descrito aqui, nomeadamente sequências de DNA que hibridam, particularmente em condições restringentes, com cDNA quimérico de fibroblastos e RNA correspondente. Para além das sequências quiméricas codificadoras de FGF, o DNA englobado por este invento pode conter sequências adicionais, dependendo das sequências de construção do vector, que facilitem a expressão do gene.
DNA codificador de factores de crescimento quiméricos deste invento ou RNA correspondente, foram então inserido num vector, e.g. um plasmídeo da série pBR, pUC, pUB ou pET e o vector recombinante usado para transformar organismos hospedeiros microbianos. Organismos hospedeiros podem ser bacterianos (e.g.,
E. coli ou B. subtilis), levedura (e.g., S. cerevisiae) ou de mamíferos (e.g., fibroblastos de murganho). Este invento também proporciona novos vectores de RNA e DNA, plasmídeos circulares e virais funcionais incorporando sequências de RNA e DNA descrevendo os factores de crescimento quiméricos gerados por meios convencionais. A cultura dos organismos hospedeiros estavelmente transformados ou transfectados com tais vectores em condições que facilitem a expressão em larga escala das sequências de DNA ou RNA inseridas no vector e isolamento dos polipeptídeos pretendidos a partir do meio de crescimento, lisados celulares ou fracções de membranas celulares dá os produtos pretendidos. Um exemplo da expressão de mutantes de hbFGF em E. coli é dado no Exemplo 4.
-150 presente invento proporciona a manufactura total e ou parcial de sequências de DNA codificadoras de glu3/5hbFGF, glu3ser78'^8hbFGF e outros glu3'^hbFGF tendo císteinas nas posições 78 e 96 substituídas com outros aminoácidos que eliminam a formação de pontes dissulfureto ao acaso e incluindo características vantajosas tais como incorporação de codões preferidos para a expressão por hospedeiros não mamíferos seleccionados, produção de sítios de clivagem de restrição por enzimas endonucleases e produção de mais sequências de DNA iniciais, terminais ou intermédias que facilitem a construção de vectores facilmente expressáveis. Assim, o presente invento proporciona a produção (e desenvolvimento por mutagénese dirigida de cDNA e DNA genómico) de sequências de DNA codificadoras de expressão microbiana do factor de crescimento de fibroblastos quimérico que difere das formas especificamente descritas aqui em termos de identidade ou de localização de um ou mais resíduos de aminoácidos (i.e., análogos de deleção contendo menos de todos os resíduos especificados para hbFGF, e/ou análogos de substituição em que um ou mais resíduos estão substituídos e/ou análogos de adição em que um ou mais resíduos são adicionados a uma fracção terminal ou mediana do polipeptídeo) e que partilham as propriedades biológicas de glu3'5hbFGF e glu3'5,ser78'96hbFGF.
As sequências de DNA (e RNA) deste invento codificam todas as sequências úteis na expressão para assegurar a expressão em células procariõticas ou eucarióticas de produtos polipeptídicos tendo pelo menos uma parte da conformação estrutural primária e uma ou mais das propriedades biológicas do factor de crescimento de fibroblastos quimérico que incluem: (a) o DNA sequenciado codificador de glu3'5hbFGF e glu3'5ser78'96hbFGF como descrito aqui ou cadeias complementares; (b) sequências de DNA que hibridam (em condições de hibridação como descrito aqui ou condições mais restringentes) com sequências de DNA definidas em (a) ou
seus fragmentos; e (c) sequências de DNA que, excepto para a degenerescência do código genético, hibridariam com o DNA sequenciado definido em (a) e (b) atrás. Estão especificamente incluídos DNA genómicos sequenciados codificadores de formas variantes alélicas de factores de crescimento de fibroblastos quiméricos incluídas aqu e sequências codificadoras de RNA do factor de crescimento de fibroblastos quiméricos, seus fragmentos e análogos em gue o RNA ou DNA sequenciado pode incorporar codões que facilitem a transcrição ou replicação de RNA mensageiro em hospedeiros não vertebrados.
isolamento e purificação de polipeptídeos expressos por microorganismos proporcionados pelo invento podem ser realizados por métodos convencionais incluindo por exemplo, separações cromatográficas preparativas tais como as ilustradas nas Figuras 2 e 3 e separações imunológicas, incluindo preparações de anticorpos monoclonais e/ou policlonais, i.e. um exemplo de purificação é dado no Exemplo 5.
Conforme resumido atrás e descrito detalhadamente nos Exemplos abaixo um exemplo do factor de crescimento de fibroblastos quimérico deste invento é o factor de crescimento de fibroblastos básico recombinante humano de tamanho completo (155 aminoácidos) tendo alanina 3 e serina 5 substituídos por ácido glutâmico, usando o sistema de expressão da RNA-polimerase de T7, em E. coli. (A numeração para bFGF adoptada aqui é para a forma de 155 aminoácidos como descrito em Abraham et al., 1986 e refere-se ao codão meitonina como posição 1). Tanto bFGF nativo 3 5 recombinante como glu ' hbFGF apresentam micro-heterogeneidade extensa em RPLC com heparina e de fase reversa (Figura 2) que é eliminada por tratamento do factor de crescimento com um agente redutor como seja ditiotreitol antes da cromatografia (Figura 3). A geração de uma versão estabilizada do factor de crescimento e
eliminação de formas com pontes dissulfureto formadas ao acaso é conseguido por substituição da cisteina 78 e da cisteina 96 por serina por mutagénese dirigida (Exemplo 3).
rendimento de glu3,5hbFGF e de glu3,5,ser78,96hbFGF neste sistema de expressão . tal como o cDNA de aFGF, é 10 vezes mais elevado do que o do cDNA de bFGF parental (Exemplo 5) .
*5 C O C 7<5
Glu 'hbFGF e glu ' , ser ' hbFGF partilham identidade de sequências com haFGF nos 8 aminoácidos N-terminais. Assim, estes derivados são quiméricos. Os polipeptídeos deste invento retêm a actividade biológica como factores de crescimento de fibroblastos. Por exemplo, quando as propriedades mitogénicas do hbFGF recombinante e das proteínas mutantes são comparadas com bFGF (10-155) originalmente isolado a partir de cérebro bovino (Exempio 7), bFGF humano recombinante e glur3,5hbFGF mo£tra u]na estimulação dependente de dose do crescimento de células endoteliais que foi essencialmente idêntico ao do bFGF de cérebro bovino (Figura 5). A substituição de cisteina 78 e 96 por serina para dar glu ' ,ser' ' “hbFGF não teve efeito na potência mitogenética e deu uma curva de dose resposta indistinta da determinada para bFGF bovino derivado de tecido (Figura 6).
As modificações de hbFGF aqui descritas aumentam significativamente o rendimento do factor de crescimento expresso, facilitam a sua purificação, elimina a micro-heterogeneidade devido à formação ao acaso de pontes dissulfureto e aumenta a estabilidade ao mesmo tempo que retem actividade biológica total.
-18EXEMPLOS
Os exemplos que se seguem são apresentados para descrever e explicar melhor o presente invento e as técnicas de caracterização empregues e não deve ser tomado como limitante em qualquer aspecto. A menos que de outra forma seja indicado, todas as partes e percentagens são por peso na fase particular do processamento a ser descrita.
EXEMPLO 1
CONSTRUÇÃO DE UM PLASMÍDEO DE EXPRESSÃO
Um gene sintético codificador da forma de 155 aminoácidos do bFGF humano (Abraham, J.A., et al., EMBO J. 5: 2523-2528 (1986)) clonado em pUC18 foi adquirido à British Bio-technology, Oxford, UK. A destruição do sítio de restrição interno Ncoi nas posições -2 a 3, que inclui o codão da metionina N-terminal do cDNA de bFGF e introdução de um sítio único Ndel como se segue. A sequência de nucleótidos (-12 a 36) a ser alterada (a, abaixo) foi retirada de pUC 18 com HindIII e BspMII e um fragmento sintético (b, abaixo) contendo um sítio Ndel interno clonado em pUC18. Esta clonagem resulta numa construção que contem uma deleção de 4 nucleótidos na região não codificadora a montante comparado com a construção original (ver abaixo). Esta deleção não tem efeito nos rendimentos relativos da proteína do bFGF usando o sistema de expressão descrito abaixo.
5' AGCTTACCTGCCATGGCAGCCGGGAGCATCACCACGCTGCCCGCCCTT 3' (a)
5' AGCTTCATATGGCAGCCGGGAGCATCACCACGCTGCCCGCCCTT 3 ’ (b)
Apenas as cadeias codificadoras estão'apresentadas para os fragmentos original (a) e modificado (b), respectivamente. 0 codão sublinhado indica a posição do codão de iniciação metionina.
cDNA codificador de bFGF foi então retirado de pUC18 com Ndel e BamHI e clonado nos sítios Ndel e BamHI do vector de expressão pT7 Kan5, derivado de pET-3a (plasmídeo para a expressão pelo bacteriófago T7, conforme definido em Rosenberg, A., et al., Gene 56:125-135 (1987) na página 128) contendo o promotor de T7 para a RNA-polimerase.
EXEMPLO 2
CONSTRUÇÃO DE GLU3,5hbFGF
5 protocolo para a construção de glu ' hbFGF foi idêntico ao descrito atrás para a introdução de um sítio de restrição Ndel excepto a região codificadora dos 5 primeiros aminoácidos de FGF básico (c) ter sido alterada para codificar os de FGF ácido (d):
5' AGCTTCATATGGCAGCCGGGAGCATCACCACGCTGCCCGCCCTT 3' (c)
5' AGCTTCATATGGCTGAAGGGGAAATCACCACGCTGCCCGCCCTT 3' (d)
Apenas as cadeias codificadoras estão apresentadas para os fragmentos original (c) e modificado (d), respectivamente. Os codões sublinhados indicam os alterados para codificarem ácido glutâmico nas posições 3 e 5.
EXEMPLO 3
CONSTRUÇÃO DE Glu3'5Ser78/96hbFGF
5
O plasmídeo de expressão pT/ glu ' hbFGF foi usado como molde para a mutagénese dirigida. Projectaram-se dois oligonucleótidos iniciadores mutagénicos para alterar os codões cisteina nas posições 78 e 96 para codões serina. O iniciador para serina na posição 96 ê para ser cadeia codificadora (60-meros; 238-297) enquanto que para serina na posição 78 é para ser cadeia anti-codão (30-meros; 251-222). Para além destes iniciadores mutagénicos foram projectados os iniciadores para o promotor T7 (nucleótido -12 a +13) e regiões terminadoras (nucleótido -75 a -54) (19).
A mutação do gene FGF modificado foi conseguida pela utilização de uma reacção em cadeia com polimerase (PCR). Duas misturas de reacção contendo DNA de plasmídeo cortado com HindIII foram preparadas como se mostra esquematicamente na Figura 1: (i) iniciadores codão de T7 mais anti-codão de Ser 78 para dar um produto esperado de 319 pares de bases e (ii) iniciadores anti-codão T7 mais codão Ser 96 para produzir um produto esperado de 294 pb. As misturas de PCR foram preparadas de acordo com as instruções do fabricante (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT). Fez-se PCR usando polimerase Taq durante 30 ciclos de amplificação cada um de 92°C durante 1 minuto, 50°C durante 5 segundos e 72°C durante 1 minuto e os produtos foram analisados por electroforese em gel de agarose.
Os iniciadores em excesso foram separados a partir dos fragmentos de DNA amplificados por 3 ciclos sucessivos de concentração e diálise usando microconcentradores Millipore com uma exclusão de 30000 de peso molecular. As fracções de retentato
-21C'·
X foram combinadas e amplificadas usando o PCR como descrito atrás excepto os iniciadores usados corresponderem às regiões do promotor de T7 (codão) e terminador de T7 (anti-codão). Ver Figura 1. 0 produto de PCR de 599 pares de bases foi então tratado com Ndel e BamHI e purificado por electroforese em gel de agarose. O fragmento purificado foi então clonado no vector de expressão de T7, pET-3a(M13), um derivado de pET-3a.
EXEMPLO 4
EXPRESSÃO DA SEQUÊNCIA NATURAL DE hbFGF E DE MUTANTES DE hbFGF
Após verificação da sequência (Sanger, F., et al., Proc. Nat. Acad. Sei.74:5463-5467 (1977)), os genes codificadores dos mutante de bFGF foram usados para transformar células competentes BL21 pLysS. As células de E. coli portadoras dos plasmídeos foram cultivadas em caldo de Luria contendo sulfato de canamicina (50 gg/ml ou ampicilina (100 gg/ml) para o plasmídeo glu 'ser ' °hbFGF e cloranfenicol (34 gg/ml a 37°C até cerca de 0,6 unidades de absorvância a 600 nm. A síntese de bFGF foi induzida pela adição de isopropil-beta-D-tiogalactopiranósido (1 mM). Duas horas pós-indução, as células foram então colhidas por centrifugação a 4°C.
EXEMPLO 5
PURIFICAÇÃO DE MUTANTES DE hbFGF
Os sedimentos de células derivados de 1 litro de cultura foram ressuspensos em 30 ml de tampão 50 mM Tris, 0,1 mM EDTA, pH 7,6 e lisados por três ciclos rápidos de congelação descongelação. O lisado foi então tratado com DNase I (20 gg/ml) na presença de 5mM MgCl durante 20 minutos a 4°C e centrifugado
-22a 10000 xg durante 20 minutos para remover detritos celulares. A actividade de bFGF foi encontrada igualmente distribuída nas fracções do sedimento e do sobrenadante.
bFGF foi purificado a partir da solução de sobrenadante por cromatografia em coluna de heparina-sefarose como descrito por Gospodarowicz, D., et al., Proc. Nat. Acad. Sei. USA 81:6963-6967 (1984) e eluindo com um gradiente linear salino de 0,6 a 3,0 M NaCl. As fracções contendo factor de crescimento foram reunidas e diluídas com tampão Tris 10 mM, pH 7,6 para dar uma concentração final de NaCl de aproximadamente 0,6M.
Isto foi aplicado numa coluna de 0,75 x 7,5 cm de TSK Heparin-5PW (TosoHaas, Philadelphia, PA) equilibrada com 10 mM Tris pH 7,6, 0,6 M NaCl. A eluição do material ligado foi controlada a 280 nm e foi conseguida usando um gradiente salino linear (0,6 a 3,0M NaCl em 60 minutos) a um fluxo de 0,7 ml/minuto.
Usando o sistema de expressão de T7 descrito no Exemplo
4, o rendimento da sequência nativa de hbFGF (2-155) foi cerca de
0,8 mg/1 de cultura bacteriana. Com a sequência nativa de haFGF 3 5 obteve-se um rendimento de 6 a 8 mg/litro. Glu ' hbFGF expresso no mesmo sistema dá 8 a 10 mg/litro de factor purificado.
>
A fermentação em larga escala (10 1) de E. coli conten35 78 96 do o plasmideo pT7 glu ' , ser ' dá cerca de 1 mg de factor de crescimento purificado por g de pasta celular. O rendimento de proteina da variante quimérica ser ' e distribuição da proteína nas fracções sobrenadante e do sedimento do extracto bacteria3 5 no são semelhantes ao observado para glu ' hbFGF.
EXEMPLO 6
CARACTERIZAÇÃO DE hbFGF E DE MUTANTES DE hbFGF (a) Comportamento cromatográfico bFGFs purificados por HPLC em heparina foram analisados por cromatografia líquida de alta resolução em fase reversa (C4, Vydac, The Separation Group, Hesperia, CA) usando um gradiente de 0,1% de ácido trifluoroacético/acetonitrilo (0 a 28% de CH3CN em 15 minutos, 28-60% em 99 minutos e 60 a 30% em 10 minutos) num fluxo de 0,7 ml/min. A eluição do material ligado foi controlada a 210 nm.
O perfil de eluição da cromatografia em heparina-sefarose de um homogenato celular bruto contendo a sequência nativa de hbFGF (2-155) mostra dois picos principais de proteína ambos possuindo actividade mitogénica e contendo uma espécie proteica principal de PM 17000 por electroforese em gel de dodecilsulfato de sódio-poliacrilamida (SDS-PAGE). A cromatografia líquida de alta resolução em fase reversa (RP-HPLC) C^ do material de cada um dos dois picos obtidos a partir do paso de heparina-sefarose seguido de análise da sequência N-terminal dos componentes resolvidos identificou pelo menos três formas distintas de bFGF.
Como uma primeira abordagem para analisar esta aparente micro-heterogeneidade, a contribuição da troca interna tiol-dissulfureto (formação de ligações dissulfureto ao acaso) na geração de espécies cromatográficamente distintas foi testado por tratamento com um agente redutor. A incubação de uma fracção do bFGF purificado por heparina-sefarose com ditiotreitol (2 mM) durante 10 minutos a 37°C seguido de análise por RP-HPLC mostra que os
picos previamente identificados como espécies dè bFGF são eluidas essencialmente como um pico único.
HPLC de alta resolução em TSK Heparin dos dois picos proteicos contendo FGF derivado do passo de heparina-sefarose revela 4 componentes proteicos principais que eluem numa gama de 1,6 a 2,3 M NaCl (Figura 2). A análise por SDS-PAGE destes picos mostra que P-I, P-II e P-IV contem uma única banda proteica que migra com uma Mr de 17000 consistente com hbFGF(2-155), enquanto que PII apresenta uma Mr de aproximadamente 22000 e foi identificada por análise de sequências N-terminais como um contaminante. 0 tratamento de uma fracção do material reunido derivado da cromatografia em heparina-sefarose com ditiotreitol (5 mM) durante 10 minutos à temperatura ambiente seguido de HPLC em heparina mostra um aumento na quantidade de P-I, uma redução na de P-III e o desaparecimento de P-IV; a posição e a intensidade de P-II contendo a impureza de Mr 22000 não foi afectada por este tratamento (Figura 3).
5 comportamento cromatográfico do glu ' hbFGF na presença e ausência de ditiotreitol na heparina e RP-HPLC é semelhante ao observado para a sequência nativa do hbFGF. A mutação de císteina para serina facilita grandemente a purificação deste análogo uma vez que que se comporta como uma só espécie em heparina- e C^ RP-HPLC (Figura 4) e portanto elimina a necessidade do tratamento com ditiotreitol durante a purificação.
(b) Análises das sequências
As análises de sequências N-terminais das proteínas purificadas em fase reversa foram realizadas num sequenciador de fase líquida com pulsos modelo 477A (da Applied Biosystems, CA) equipado com um analisador de feniltio-hidantoína-aminoácidos (modelo 12 OA, Applied Biosystems, CA). As composições de aminoácidos foram determinadas após hidrólise em fase gasosa com HCl (5,7 M HCl/0,1% fenol; 24 h a 110°C) usando um derivatizador de fenilisotiocianato modelo 42OA equipado com um sistema de separação modelo 13OA em linha (Applied Biosystems, CA).
A análise da sequência N-terminal do material isolado a partir de HPLC com heparina dá uma só sequência consistente com 3 5 glu ' hbFGF (2-155) indicando remoção completa da metionina N-terminal.
(c) Pesos moleculares
As determinações dos pesos moleculares foram realizadas num gradiente de 10 a 15% em géis de poliacrilamida homogéneos de 20% na presença de dodecilsulfato de sódio (SDS-PAGE) usando um sistema de detecção por coloração com prata (Phastgel System, Pharmacia/LKB).
hbFGF (2-155) migra com uma M de 17000 comparado com r 3 5 um valor de Mr de aproximadamente 19000 para glu ' hbFGF. Os pesos moleculares calculados a partir dos dados de sequências de aminoãcidos para hbFGF e a versão quimérica são 1124 e 17224 respectivamente. Para resolver a discrepância aparente dos pesois 3 5 moleculares, uma amostra de glu ' hbFGF foi analisado por espectrometria liquida de massa iónica secundária e dá um ião molecular de massa 17365. Este valor está, dentro do erro experimental, consistente com o previsto a partir dos dados de sequenciação. Se bem que não pretendamos estar vinculados a qualquer teoria, a 3 5 .
migração anómala de glu ' em géis de poliacrilamida em condições desnaturantes é provavelmente devido a interferência de interacções proteína-SDS derivada de cadeias laterais glutamilo nas posições 3 e 5.
-263 5 78 96
Em SDS-PAGE glu ' , ser ' hbFGF também migra com uma
M de 19000 e não com uma espécie prevista de M de 17000· esta observação é consistente com a migração aberrante observada para glu3,5hbFGF.
EXEMPLO 7
BIOENSAIO DE hbFGF NATIVO E DE DERIVADOS MUTANTES
A actividade mitogénica de hbFGF sequência nativa e mutantes foi determinado usando células vasculares endoteliais bovinas derivadas de arcos aórticos adultos como descrito por
Esch, et al., Proc. Nat. Acad. Sei. USA 82: 6507-6511 (1985). As . 4 células foram semeadas numa densidade inicial de 0,8 x 10 células por placa de 24 cavidades em 0,5ml de meio de Eagle modificação de Dulbecco (DMEM) contendo 10% de soro de vitela (Hyclone, Logan, UT) suplementado com penicilina (100 unidades/ml) , estreptomicina (100 μg/ml) e L-glutamina (2 mM). Duas horas após sementeira adicionou-se quantidades de 20 μΐ das diluições adequadas (0,001 a 100 ng/ml) de bFGF em DMEM contendo 0,5% de albumina sérica bovina (BSA). Após 5 dias em cultura, placas em duplicado foram tripsinizadas e as densidades celulares determinadas contando num contador Coulter.
Como alternativa, foram determinadas curvas de crescimento na presença e ausência de bFGF medindo os níveis de fosfatase acida após lise celular usando p-nitrofenilfosfato como substrato (Connolly, D.T., et al., Anal. Biochem. 152:136-140 (1986), página 137). As células foram semeadas numa densidade celular inicial de 1000 a 1200 células por cavidade (placas de 96 . 2 cavidades de fundo plano de 0,32 cm , 0,64 cm de diâmetro) em 0,25 ml de DMEM contendo 10% de soro de vitela, antibióticos e L-glutamina. Após sementeira, adicionou-se quantidades de 10 μΐ
-27das diluições adequadas do factor de crescimento (0,001 a 100 ng/ml) em DMEM contendo 0,5% BSA.
Após 4 a 5 dias em cultura, cada uma das cavidades foi lavada e adicionado a cada uma das cavidades 100 μΐ de tampão pH
5,5 contendo acetato de sódio 0,lM, 0,1% Triton X-100 e 10 mM p-nitrofenilfosfato (substrato de fosfatases Sigma 104). As placas foram incubadas a 37°C durante 2 horas, a reacção parou pela adição de 10 μΐ de hidróxido de sódio IN e o desenvolvimento de cor determinado a 405 nm contra um branco de tampão incubado sem células usando um leitor de microplacas de UV (Molecular Devices, CA). As determinações foram feitas em triplicado, ambos os métodos dão curvas de dose resposta indistintas.
Quando as propriedades mitogénicas do hbFGF recombinante e das proteínas mutantes são comparadas com as de bFGf (10-155) originalmente isolado a partir de cérebro bovino, bFGF . 3 5 recombinante humano e glu ’ hbFGF mostram uma estimulação dependente de dose do crescimento das células endoteliais que é essencialmente idêntico ao de bFGF de cérebro bovino (Figura 5) e apresentam doses para metade da estimulação máxima (dose máxima eficaz, ED^q) de 0,3 a 1,0 ng/ml e uma estimulação máxima entre 3 e 10 ng/ml. A substituição de cisteina 78 e 96 com serina para 35 7896 dar glu5' , ser ' nbFGF não tem efeito na potência mitogénica e dá uma curva de dose resposta que é indistinta da determinada para bFGF bovino derivado de tecido (Figura 6).
A descrição acima tem a finalidade de ensinar aos familiarizados com a matéria como realizar o presente invento e não se destina a detalhar todas as modificações óbvias e variações que serão aparentes para os familiarizados com a matéria quando da leitura da descrição. Pretende-se no entanto que tais
modificações e variações óbvias sejam incluídas dentro do âmbito do presente invento como definido nas reivindicações apensas.
As sequências de DNA, plasmídeos e/ou microorganismos depositados em ligação com o presente pedido de patente, excepto sempre que especificado em contrário, foram depositados na colecção de culturas da American Cyanamid Company em Pearl River, New York e estão disponíveis ao público quando legalmente adequado para o fazer. Ainda, o que se segue foi depositado adicionaimente na American Type Culture Collection (ATCC) em Rockville, k Maryland 20952, U.S.A. na data indicada com os números de acesso F indicados:
*5 pr *7 Q Q íí
BL21 lys/pET glu 'ser ' depositado em 13 de Novembro, 1990 com ATCC NS 68478
5
BL21 lys/pET glu ' hbFGF depositado em 13 de Novembro, 1990 com ATCC NS 68477.
Os dois acima contêm o DNA de glu^’^ser^'^^hbFGF e
5 . .
glu ' hbFGF como aqui descrito.
EXEMPLO 8
DERIVADOS COM COMPOSTOS mEo-pecr
5 . .
Glu · hbFGF (2-155) foi preparado como descrito atras.
Iodoacetatos de polietilenoglicl (meO-PEG-! 5000) e iodoacetamida (MeO-PEG-NHCDCHf2 ' dos como descrito atrás.
I; PM=2000 e zforam preparaGlu^'5hbFGF (5 mg/ml) em tampão 0,lM Tris pH 8,6 contendo 2 mM EDTA foi reduzido pela adição de ditiotreitol (5 mM) e incubado durante 1 hora à temperatura ambiente numa
atmosfera de argon. MeO-PEG-O2-CCH2I (PM=2000 pu =5000) MeO-PEG-NHCOCH2I (PM=5000) foi adicionado para dar uma concentração final de 25-50 mM e a mistura de reacção foi então dialisada contra tampão de fosfatos salino (PBS) a 4°C durante 12 horas.
EXEMPLO 9
FGF DERIVATIZADO
5
Glu ' hbFGF (5 mg/ml em tampao tris pH 7,4 contendo 1,5 M NaCl foi reduzido pela adição de ditiotreitol (5 mM) e incubado durante 0,5-1 h à temperatura ambiente numa atmosfera de árgon. Adicionou-se então ácido iodoacético 0,4M em tampão Tris 1M pH 8,5) para dar uma concentração final de 50 mM a mistura de reacção incubada no escuro durante 2 horas â temperatura ambiente. A solução foi então dialisada contra tampão Tris 10 mM (pH 7,0) contendo 0,5M NaCl durante 12 horas.
Tanto o derivado de polietllenoglicol de bFGF como bFGF carboximetilado foram testados como descrito atrás.
EXEMPLO 10
FGF Carboximetilado
5 bFGF carboximetilado: Tratamento de Glu ' hbFGF (2-155) com ácido iodoacético em condições não desnaturantes resulta na carboximetilação de 2 dos 4 resíduos císteina de bFGF. As posições das císteinas modificadas foram identificadas como císteina 78 e 96 por mapeamento de peptídeos de um produto de digestão com endoproteinase Glu-C de bFGf carboximetilado marcado com ^^C. A modificação de císteina 78 e 96 não teve efeito na afinidade de bFGF para heparina. A actividade mitogénica e as propriedades de
7896 ligação ao receptor de Glu ' CMCys ' hbFGF são indistintos das 3 5.
de Glu ' hbFGF (Figura 1) enquanto que bFGF carboximetilado não . . 3 5 parece activo. Ao contrario de bFGF,Glu ’ hbFGF não modificado tem uma semi-vida a pH 4 de cerca de 5 minutos enquanto que para Glu3/5CMCys78,96hbFGF é > 60 minutos (ver Figura 2).
Ésteres de polietilenoglicol do bFGF: Os derivados de
PEG-2000 e -5000 de Glu ' hbFGF são totalmente activos em ensaios mitogénicos com células endoteliais bovinas (Figura 3) e ligam-se à heparina. Os derivados de ésteres de PEG sofrem hidrólise para κ dar bFGF carboximetilado, um análogo estabilizado e totalmente .7 activo (ver Exemplo 28), o que pode ser controlado pelo apareci35 7896 mento de uma proteína de 18 KD (glu ' CMCys ' hbFGF) em géis de dodecilsulfato de sódio e poliacrilamida.
Amida de polietilenoglicol de bFGF: 0 derivado de 3 5
PEG-5000 de glu ' hbFGF ao contrário dos ésteres de PEG de bFGF são estáveis. Eles são totalmente activos em ensaios de mitogénese de fibroblastos 3T3 de BalbC e competem tão eficazmente quanto glu ' hbFGF não modificado nos ensaios de ligação a receptores de FGF.
>
31BIBLIOGRAFIA
1. Abraham, J.A., et al., EMBO J. 5: 2523-2528 (1986).
2. Arakawa, T. and Fox G.M., Eur. Pat. Ap. No. 320,148 (1989) .
3. Barr, P.J., et'al.,. Biol. chem. 263: 16471-16478 (1988) .
4. Bergonzoni, L., et al., Eur. Pat. Ap. Pub. No. 363,675 (1989).
5. Burgess, W.H., and Maciag, T., Ann. Rev. Biochem. 8: 575-606 (1989).
6. Connolly, D.T., et al., Anal. Biochem. 152: 136-140 (1986) .
7. Davidson, J.M., et al., J. Cell Bio. 100: 1219-1227 (1985) .
8. Esch, F., et al., Proc. Nat. Acad. Sei. USA 82: 6507-6511 (1985).
9. Esch, F., et al., Eur. Pat. Ap. Pub. 228,449 (1986).
10. Fiddes, J.C., et al., Eur. Pat. Ap. Pub. No. 298,723 (1989) .
11. Franco, W.P., U.S. Pat. No. 4,296,100 (1981).
12. Franco, W.P., U.S. Pat. No. 4,378,347 (1983).
| 13. Gospodarowicz. | D., | Nature 249:123 | -127 | (1974) . | |
| 14. Gospodarowicz. | D., | et | al., Nat. | Câncer Insti. Mon. | |
| 48: 109-130 (1978).' | |||||
| 15. Gospodarowicz, | D., | et | al., Proc. | Nat. | Acad. Sei. USA |
| 81: 6963-6967 (1984) | • | ||||
| 16. Gospodarowicz, (1988) . | D. | et | al., U.S. | Pat | NO. 4,785,079 |
| 17. Gospodarowicz. | d. | et | al., U.s. | Pat | No. 4,902,782 |
(1990) .
18. Iwane, M., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 146: 470-477 (1987).
19. Rosenberg, A., et al., Gene 56: 125-135 (1987).
20. Sanger, F., et al., Proc Nat. Acad. Sei. 74: 5463-5467 (1977).
21. Seno, Μ., et al., Eur. Pat. Ap. Publ. No. 281,822 (1988) .
22. Seno, Μ., et al., Eur. Pat. Ap. Pub. No. 326,907 (1989) .
I (
23. Squires, C.H., et al., J. Biol. Chem. 263: ΐ16297-16302 (1988).
j
24. Thomas Jnr. K.A. and Linemeyer, D.L., Eur. Pat. Ap. Pub. No. 319,052 (1989).
-3325. Walicke, Ρ., et al., Proc. Nat. acad. Sei. USA 83: 3012-3016 (1986).
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL:
(i) REQUERENTE: Andrew P. Seddon, Peter Bohlen e
Yakov Gluzman (ii) TÍTULO DO INVENTO: Factores de Crescimento de Fibroblastos Quiméricos (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 2 (iv) ENDEREÇO PARA CORRESPONDÊNCIA:
(A) AO CUIDADO DE: Dr. Estelle J. Tsevdos, American Cyanamid Company (B) RUA: 1937 West Main Street, P.O. Box 60 (C) CIDADE: Stamford (D) ESTADO: Connecticut (E) PAÍS: Estados Unidos da América (F) CÓDIGO: 06904-0060 (V) FORMA LEGÍVEL EM COMPUTADOR:
(A) TIPO MÉDIO: Disco Floppy (B) COMPUTADOR: IBM PC AT
-35do (C) SISTEMA OPERATIVO: MS-DOS (D) SOFTWARE: ASCII convertido
Displaywrite IBM (vi) DADOS DO PRESENTE PEDIDO DE PATENTE:
(A) NÚMERO DO PEDIDO:
(B) DATA DA ENTREGA:
I (C) CLASSIFICAÇÃO:
(vii) DADOS DE PEDIDOS DE PATENTE ANTERIORES:
(A) NÚMERO DO PEDIDO DE PATENTE:
(B) DATA DE ENTREGA:
(viii) INFORMAÇÃO SOBRE PROCURADOR/AGENTE:
(A) NOME: Tsevdos, Estelle J., Dr.
(B) NÚMERO DE REGISTO: 31145 (C) NÚMERO DO DOCUMENTO/SUMÁRIO: 31219-01 (ix) INFORMAÇÃO SOBRE TELECOMUNICAÇÃO:
(A) TELEFONE: 203 321 2756 (B) TELEFAX: 203 321 2971
(C) TELEX: 710 474 4059 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:
(A) COMPRIMENTO: 465 PARES DE BASES (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iii) HIPOTÉTICO:
(iv) ANTI-CODÃO:
(v) TIPO DE FRAGMENTO:
(vi) FONTE ORIGINAL:
(A) ORGANISMO:
(B) ESTIRPE:
(C) ISOLADO INDIVIDUAL:
(D) DASE DO DESENVOLVIMENTO:
(E) HAPLÓTIPO:
-37(F) TIPO DE TECIDO:
(G) TIPO DE CÉLULA:
(H) LINHA CELULAR:
(I) ORGANELO:
(vii) FONTE IMEDIATA:
(A) BIBLIOTECA:
(B) CLONE:
(viii) POSIÇÃO NO GENOMA:
(A) CROMOSSOMA/SEGMENTO:
(B) POSIÇÃO NO MAPA:
(C) UNIDADES:
(ÍX) CARACTERÍSTICA:
(A) NOME/CHAVE:
(B) LOCALIZAÇÃO:
(C) MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO:
(D) OUTRA INFORMAÇÃO:
(X) INFORMAÇÃO SOBRE A PUBLICAÇÃO:
—38—
(A) AUTORES:
(Β) TÍTULO:
(C) REVISTA:
(D) VOLUME:
(E) NÚMERO:
(F) PÁGINAS:
(G) DATA:
(H) NÚMERO DO DOCUMENTO:
(I) DATA DA ENTREGA:
(J) DATA DA PUBLICAÇÃO:
(K) RESÍDUOS IMPORTANTES:
(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA
SEQ ID NO: 1:
| ATG | GCT | GAA | GGG | GAA | ATC | ACC | ACG | CTG | CCC | GCC | CTT | CCG |
| Met | Ala | Glu | Gli | Glu | Ile | Tre | Tre | Leu | Pro | Ala | Leu | Pro |
| 1 | 5 | 10 |
| GAG | GAT | GGC | GGC | AGC | GGC | GCC | TTC | CCG | CCC | GGG | CAC | TTC |
| GlU | Asp | Gli | Gli | Ser | Gli | Ala | Fen | Pro | Pro | Gli | His | Fen |
| 15 | 20 | 25 |
AAG GAC CCC AAG CGG CTG TAC TGC AAA AAC GGG GGC TTC
| Lis Asp Pro Lis Arg Leu Tir Cis Lis Asn Gli Gli | Fen | |||||||||||
| 30 | 35 | |||||||||||
| TTC | CTG | CGC | ATC | CAC | CCC | GAC | GGC | CGA | GTT | GAC | GGG | GTC |
| Fen | Leu | Arg | Ile | His | Pro | Asp | Gli | Arg | Vai | Asp | Gli | Vai |
| 40 | 45 | 50 | ||||||||||
| CGG | GAG | AAG | AGC | GAC | CCT | CAC | ATC | AAG | CTA | CAA | CTT | CAA |
| Arg | Glu | Lis | Ser | Asp | Pro | His | Ile | Lis | Leu | Gin | Leu | Gin |
| 55 | ||||||||||||
| GCA | GAA | GAG | AGA | GGA | GTT | GTG | TCT | ATC | AAA | GGA | GTG | TGT |
| Ala | Glu | GlU | Arg | Gli | Vai | Vai | Ser | Ile | Lis | Gli | Vai | Cis |
| 70 | 75 | |||||||||||
| GCT | AAC | CGG | TAC | CTG | GCT | ATG | AAG | GAA | GAT | GGA | AGA | TTA |
| Ala | Asn | Arg | Tir | Leu | Ala | Met | Lis | Glu | Asp | Gli | Arg | Leu |
| 80 | 85 | 90 | ||||||||||
| CTG | GCT | TCT | AAA | TGT | GTT | ACG | GAT | GAG | TGT | TTC | TTT | TTT |
| Leu | Ala | Ser | Lis | Cis | Vai | Tre | Asp | Glu | Cis | Fen | Fen | Fen |
| 95 | 100 | |||||||||||
| GAA | CGA | TTG | GAA | TCT | AAT | AAC | TAC | AAT | ACT | TAC | CGG | TCT |
| Glu | Arg | Leu | Glu | Ser | Asn | Asn | Tir | Asn | Tre | Tir | Arg | Ser |
| 105 | 110 | 115 | ||||||||||
| AGA | AAA | TAC | ACC | AGT | TGG | TAT | GTG | GCA | TTG | AAA | CGA | ACT |
| Arg | Lis | Tir | Tre | Ser | Trp | Tir | Vai | Ala | Leu | Lis | Arg | Tre |
| 120 | 125 | 130 |
GGG CAG TAT AAA CTT GGT TCC AAA ACA GGA CCT GGG CAG
| Gli | Gin | Tir | Lis | Leu 135 | Gli |
| AAA | GCT | ATA | CTT | TTT | CTT |
| Lis | Ala 145 | Ile | Leu | Fen | Leu |
| Ser Lis Tre Gli | Pro Gli | ||||
| 140 | |||||
| CCA | ATG | TCT | GCT | AAG | AGC |
| Pro | Met | Ser | Ala | Lis | Ser |
| 150 | 155 |
(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:
(A) COMPRIMENTO: 465 PARES DE BASES (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iii) HIPOTÉTICO:
(iv) ANTI-CODÃO:
(V) TIPO DE FRAGMENTO:
(vi) FONTE ORIGINAL:
(A) ORGANISMO:
(B) ESTIRPE
(C) ISOLADO INDIVIDUAL:
(D) DASE DO DESENVOLVIMENTO:
(E) HAPLÓTIPO:
(F) TIPO DE TECIDO:
(G) TIPO DE CÉLULA:
(H) LINHA CELULAR:
(I) ORGANELO:
(vii) FONTE IMEDIATA:
(A) BIBLIOTECA:
(B) CLONE:
(viii) POSIÇÃO NO GENOMA:
(A) CROMOSSOMA/SEGMENTO:
(B) POSIÇÃO NO MAPA:
(C) UNIDADES:
(ix) CARACTERÍSTICA:
(A) NOME/CHAVE:
(B) LOCALIZAÇÃO:
(C) MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO:
(D) OUTRA INFORMAÇÃO:
(X) INFORMAÇÃO SOBRE A PUBLICAÇÃO:
(A) AUTORES:
(B) TÍTULO:
(C) REVISTA:
(D) VOLUME:
(E) NÚMERO:
(F) PÁGINAS:
(G) DATA:
(H) NÚMERO DO DOCUMENTO:
(I) DATA DA ENTREGA:
(J) DATA DA PUBLICAÇÃO:
(K) RESÍDUOS IMPORTANTES:
(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 2:
ATG GCT GAA GGG GAA ATC ACC ACG CTG CCC GCC CTT CCG Met Ala Glu Gli Glu Ile Tre Tre Leu Pro Ala Leu Pro
| GAG | GAT | GGC | GGC | AGC | GGC | GCC | TTC | CCG | CCC | GGG | CAC | TTC |
| Glu | Asp 15 | Gli | Gli | Ser | Gli | Ala 20 | Fen | Pró | Pro | Gli | His 25 | Fen |
| AAG | GAC | CCC | AAG | CGG | CTG | TAC | TGC | AAA | AAC | GGG | GGC | TTC |
| Lis | Asp | Pro | Lis 30 | Arg | Leu | Tir | Cis | Lis 35 | Asn | Gli | Gli | Fen |
| TTC | CTG | CGC | ATC | CAC | CCC | GAC | GGC | CGA | GTT | GAC | GGG | GTC |
| Fen 40 | Leu | Arg | Ile | His 45 | Pro | Asp | Gli | Arg | Vai 50 | Asp | Gli | Vai |
| CGG | GAG | AAG | AGC | GAC | CCT | CAC | ATC | AAG | CTA | CAA | CTT | CAA |
| Arg | Glu | Lis 55 | Ser | Asp | Pro | His | Ile | Lis | Leu | Gin | Leu | Gin |
| GCA | GAA | GAG | AGA | GGA | GTT | GTG | TCT | ATC | AAA | GGA | GTG | TCT |
| Ala | Glu | Glu | Arg | Gli 70 | Vai | Vai | Ser | Ile | Lis 75 | Gli | Vai | Ser |
| GCT | AAC | CGG | TAC | CTG | GCT | ATG | AAG | GAA | GAT | GGA | AGA | TTA |
| Ala | Asn 80 | Arg | Tir | Leu | Ala | Met 85 | Lis | GlU | Asp | Gli | Arg 90 | Leu |
| CTG | GCT | TCT | AAA | TCT | GTT | ACG | GAT | GAG | TGT | TTC | TTT | TTT |
| Leu | Ala | Ser | Lis 95 | Ser | Vai | Tre | Asp | Glu 100 | Cis | Fen | Fen | Fen |
| GAA | CGA | TTG | GAA | TCT | AAT | AAC | TAC | AAT | ACT | TAC | CGG | TCT |
| Glu 105 | Arg | Leu | Glu | Ser | Asn 110 | Asn | Tir | Asn | Tre | Tir 115 | Arg | Ser |
AGA ΑΑΑ TAC ACC AGT TGG TAT GTG GCA TTG AAA CGA ACT
| Arg | LÍS | Tir | Tre | Ser | Trp | Tir | Vai | Ala | Leu | Lis | Arg | Tre |
| 120 | 125 | 130 | ||||||||||
| GGG | CAG | TAT | AAA | CTT | GGT | TCC | AAA | ACA | GGA | CCT | GGG | CAG |
| Gli | Gin | Tir | Lis | Leu | Gli | Ser | LÍS | Tre | Gli | Pro | Gli | Gin |
| 135 | 140 | |||||||||||
| AAA | GCT | ATA | CTT | TTT | CTT | CCA | ATG | TCT | GCT | AAG | AGC | |
| LÍS | Ala | Ile | Leu | Fen | Leu | Pro | Met | Ser | Ala | LÍS | Ser | |
| 145 | 150 | 155 |
Claims (17)
- lâ. - Processo para a preparação de um factor de crescimento de fibroblastos básico (FGF) seleccionado de entre o grupo constituído por:(a) um factor de crescimento de fibroblastos básico tendo cerca de 155 aminoácidos em que a alanina na posição 3 e a serina na posição 5 são substituídas por ácido glutâmico;(b) um factor de crescimento de fibroblastos básico tendo cerca de 155 aminoácidos em que a alanina na posição 3 e a serina na posição 5 são substituídas com ãcido glutâmcio e as císteinas na posição 78 e 96 são substituídas com os aminoácidos que eliminam as ligações dissulfureto formadas ao acaso; e (c) formas truncadas de (a) e (b) não tendo metionina no extremo N;caracterizado por compreender a propagação de células hospedeiras transformadas ou transfectadas com uma sequência de DA purificada e isolada codificadora de um FGF em meio de cultura durante um tempo e em condições suficientes para que as referidas células hospedeiras expressem o referido factor de crescimento e a partir delas recuperação do factor de crescimento a partir de materiais seleccionados do grupo constituído pelo referido meio de cultura, lisados das referidas células hospedeiras e fracções membranares das referidas células hospedeiras.
- 2a. - Processo de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por as referidas células hospedeiras serem células de E. coli.
- 3a. - Processo de acordo com a Reivindicação 2, caracterizado por o referido FGF ser seleccionado de entre o grupo constituído por glu3,5hbFGF e glu3/5,ser78'96hbFGF.
- 4a. - Processo de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por se preparar um factor de crescimento de fibroblastos básico, em que o referido factor de crescimento de fibroblastos básico é recombinante.
- 5a. - Processo de acordo com a Reivindicação 4, caracterizado por se preparar um factor de crescimento de fibroblastos básico recombinante, em que as císteinas nas posições 78 e 96 são substituídas com serina, lisina, ácido aspártico, ácido glutâmico, asparagina, glutamina, histidina,isoleucina, leucina, valina, fenilalanina, tirosna, metionina, treonina, prolina, alanina, glicina, arginina ou triptofano.
- 6â. - Processo de acordo com a Reivindicação 5, caracterizado por se preparar um factor de crescimento de fibroblastos básico recombinante, em que as císteinas nas posições 78 e 96 são substituídas com serina.
- 7a. - Processo de acordo com a Reivindicação 4, caracterizado por se preparar um factor de crescimento de fibroblastos3 5 básico recombinante compreendendo glu ' hbFGF.
- 8a. - Processo de acordo com a Reivindicação 6, caracterizado por se preparar um factor de crescimento de fibroblastos3 5 78 96 básico recombinante compreendendo glu ' , ser ' hbFGF.
- 9a. - Plasmídeo circular biologicamente funcional ou vector de DNA virai, caracterizado por compreender uma sequência de DNA codificadora de um factor de crescimento de acordo com a Reivindicação 4.
- 10a. - Vector de acordo com a Reivindicação 9, caracterizado por compreender um derivado do pET-3a.lia. - Vector de acordo com a Reivindicação 10, caracterizado por ser seleccionado de entre o grupo constituído por pT7 Kan5 contendo o promotor de T7 da RNA polimerase e pET-3a(M13).122. - Célula hospedeira procariótica ou eucariótica, caracterizada por ter sido transformada ou transfectada com o vector da Reivindicação 9 de forma a permitir que a célula hospedeira expresse o referido factor.
- 13â. - Célula de acordo com a Reivindicação 12, caracterizada por compreender E. coli.
- 14â. - processo para a preparação de uma sequência de DNA seleccionada de entre o grupo constituído por:(a) sequências de DNA que codificam um factor de crescimento de fibroblastos recombinante humano tendo cerca de 155 aminoácidos em que a alanina na posição 3 e a serina na posição 5 são substituídas com ácido glutâmico;(b) sequências de DNA que codificam um factor de crescimento de fibroblastos recombinante humano tendo cerca de 155 aminoácidos em que a alanina na posição 3 e a serina na posição 5 são substituídas com ãcido glutâmico e as císteinas nas posições 78 e 96 são substituídas com aminoácidos que eliminam a formação de ligações dissulfureto ao acaso; e-48X' (c) sequências de DNA que hibridarão en condições restringentes com o DNA descrito em (a) ou (b) ;caracterizado por se proceder à alteração de um gene do factor de crescimento de fibroblastos básico humano ou bovino através de deleções de nucleotídeos, adições de nucleotídeos, ou mutações pontuais que são produzidas por métodos padrão.
- 15a. - Plasmídeo circular biologicamente funcional ou vector de DNA virai, caracterizado por compreender uma sequência de DNA preparada de acordo com a Reivindicação 14.
- 16a. - vector de acordo com a Reivindicação 15, caracterizado por o referido vector ser um derivado do pET-3a seleccionado de antre o grupo consistindo em pT7 Kan5 contendo o promotor de T7 para a RNA-polimerase e pET-3a(ml3).
- 17a. - Célula hospedeira procariótica ou eucariótica, caracterizada por ter sido transformada ou transfectada com uma sequência de DNA de acordo com a Reivindicação 14 de forma a permitir que a célula hospedeira expresse um factor de crescimento de fibroblastos.
- 18a. - Célula de E. coli. caracterizada por ter sido transformada com o DNA codificado num vector de acordo com a Reivindicação 15 de forma a permitir que a referida célula de E. coli expresse o factor de crescimento de fibroblastos.acordo com a Reivindicação 1, factor de crescimento de fibro(menos a metionina número 1) ou a serina na
- 19a. - Processo de caracterizado por se preparar o blastos básico humano tendo 154155 aminoácidos em que a alanina na posição 3 e posição 5 são substituídos com ácido glutâmico.-4920a. - Processo de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por se preparar o factor de crescimento de fibroblastos básico humano tendo 154 (menos a metionina número 1) ou 155 aminoácidos em que a alanina na posição 3 e a serina na posição 5 são substituídas com ácido glutâmico e as císteinas nas posições 78 e 96 são substituídas com serina, lisina, ácido aspártico, ácido glutâmico, asparagina, glutamina, histidina, isoleucina, leucina, valina, fenilalanina, tirosina, metionina, treonina, prolina, alanina, glicina, arginina ou triptofano.2is. - Processo de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por se preparar o factor de crescimento de fibroblastos básico recombinante humano tendo 154 ou 155 aminoácidos em que a alanina na posição 3 e a serina na posição 5 são substituídas com ácido glutâmico e as císteinas nas posições 78 e 96 são substituídas com serina.222. - Processo para a produção de células procarióticas ou eucarióticas capazes de expressar um factor de crescimento de fibroblastos básico recombinante humano, caracterizado por compreender a transfecção ou transformação de células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas com sequência de DNA codificadora de um FGF de acordo com a Reivindicação 4 de modo a permitir que as referidas células hospedeiras expressem o polipeptídeo codificado pelo referido DNA.232. - Processo de acordo com a Reivindicação 22, caracterizado por as referidas células serem células de E. coli.242. - Processo de acordo com a Reivindicação 23, caracterizado por o referido FGF ser seleccionado de entre o 35 35 78 Qfí grupo constituído por glu ' hbFGF e glu ' , ser ' hbFGF.-5025a. - processo de acordo com a Reivindicação 4, oaracterizado por se preparar um factor de crescimento de fibroblastos básico, em que pelo menos 2 dos 4 resíduos cisteina são sujeitos a derivação com substituintes seleccionados de entre (ch2cooh); [ch(co2h) (ch2)xco2h], (ch2 conr3r4), (R5), [(CH2)nSO3], (CHCH2 CONR3CO [(CH2)m NR^], (C^OCOCH^] OU (SR6); em que R3 e R4 são H, [ (¾)xrC02H], [(CH(CO2H) (CH2)xCO2H], alquilo facultativamente substituído com 0 a 2 grupos hidroxilo, ou polietilenoglicol; R5 é alquilo C^-Cg, alcoxi-C1-C4-metilo e Rg é alquilo C^-C^, polietilenoglicol ou fenilo facultativamente substituído com um ou dois grupos de ãcido carboxílico ou ácido sulfúrico; n é um inteiro de 0 a 4; m é um inteiro de 2 a4; exéum inteiro entre 1 e 3.263. - Processo de acordo com a Reivindicação 25, caracterízado por se preparar um factor de crescimento básico de fibroblastos, em que o referido factor de crescimento de fibroblastos básico é factor de crescimento de fibroblastos carboximetilado.273. - Processo de acordo com a Reivindicação 26, caracterízado por se preparar um factor de crescimento de fibroblastos básico, em que o referido factor de crescimento de fibroblastos é glu3,5hbFGF.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US61520290A | 1990-11-23 | 1990-11-23 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PT99565A PT99565A (pt) | 1992-10-30 |
| PT99565B true PT99565B (pt) | 1999-04-30 |
Family
ID=24464425
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PT99565A PT99565B (pt) | 1990-11-23 | 1991-11-21 | Processo para a preparacao de factores de crescimento de fibroblastos quimerico s |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US5310883A (pt) |
| EP (1) | EP0486862B1 (pt) |
| JP (1) | JP3205578B2 (pt) |
| KR (1) | KR100205078B1 (pt) |
| AT (1) | ATE138687T1 (pt) |
| AU (1) | AU646514B2 (pt) |
| CA (1) | CA2055963C (pt) |
| DE (1) | DE69119869T2 (pt) |
| DK (1) | DK0486862T3 (pt) |
| ES (1) | ES2087207T3 (pt) |
| GR (1) | GR3020237T3 (pt) |
| IE (1) | IE74956B1 (pt) |
| IL (1) | IL99984A (pt) |
| NZ (1) | NZ240622A (pt) |
| PT (1) | PT99565B (pt) |
| ZA (1) | ZA919260B (pt) |
Families Citing this family (41)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7252929B2 (en) | 1989-02-09 | 2007-08-07 | United States Of America, As Represented By The Secretary, Dept Of Health & Human Services | Methods for identifying alpha PDGFR agonists and antagonists |
| US5951972A (en) * | 1990-05-04 | 1999-09-14 | American Cyanamid Company | Stabilization of somatotropins and other proteins by modification of cysteine residues |
| US5206354A (en) * | 1990-11-23 | 1993-04-27 | American Cyanamid Company | Dna sequence encoding active fragment of fibroblast growth factor, hbf-2 |
| DE69119869T2 (de) * | 1990-11-23 | 1996-12-12 | American Cyanamid Co | Chimeres Fibroblasten-Wachstumsfaktor |
| KR100374310B1 (ko) * | 1995-02-14 | 2003-05-22 | 주식회사 엘지생명과학 | 변형된인간염기성섬유아세포성장인자및이의생산방법 |
| EP0880598A4 (en) * | 1996-01-23 | 2005-02-23 | Affymetrix Inc | RAPID EVALUATION OF NUCLEIC ACID ABUNDANCE DIFFERENCE, WITH A HIGH-DENSITY OLIGONUCLEOTIDE SYSTEM |
| WO1997029701A1 (en) | 1996-02-15 | 1997-08-21 | Biosense Inc. | Catheter based surgery |
| US6927287B1 (en) * | 1996-06-03 | 2005-08-09 | United States Surgical Corporation | Nucleic acid encoding extracellular matrix protein or fragment thereof |
| US6492508B1 (en) * | 1996-06-03 | 2002-12-10 | United States Surgical Corp. A Division Of Tyco Healthcare Group | Nucleic acids encoding extracellular matrix proteins |
| US6443974B1 (en) * | 1996-07-28 | 2002-09-03 | Biosense, Inc. | Electromagnetic cardiac biostimulation |
| US20030144202A1 (en) * | 1996-10-15 | 2003-07-31 | Amgen Inc. | Uses of keratinocyte growth factor-2 |
| US6743422B1 (en) | 1996-10-15 | 2004-06-01 | Amgen, Inc. | Keratinocyte growth factor-2 products |
| US6274712B1 (en) | 1997-12-23 | 2001-08-14 | 3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc. | Analogs of human basic fibroblast growth factor mutated at one or more of the positions glutamute 89, aspartate 101 or leucine 137 |
| US20030129750A1 (en) * | 1998-02-05 | 2003-07-10 | Yitzhack Schwartz | Homing of donor cells to a target zone in tissue using active therapeutics or substances |
| US20030113303A1 (en) * | 1998-02-05 | 2003-06-19 | Yitzhack Schwartz | Homing of embryonic stem cells to a target zone in tissue using active therapeutics or substances |
| ES2293473T3 (es) | 1998-02-05 | 2008-03-16 | Biosense Webster, Inc. | Administracion intracardiaca de farmaco. |
| BR9909717A (pt) * | 1998-04-17 | 2000-12-26 | Angiogenix Inc | Fatores angiogênicos terapêuticos e métodos para seu uso |
| US7022683B1 (en) * | 1998-05-13 | 2006-04-04 | Carrington Laboratories, Inc. | Pharmacological compositions comprising pectins having high molecular weights and low degrees of methoxylation |
| US5929051A (en) * | 1998-05-13 | 1999-07-27 | Carrington Laboratories, Inc. | Aloe pectins |
| US6313103B1 (en) | 1998-05-13 | 2001-11-06 | Carrington Laboratories, Inc. | Pectic substance as a growth factor stabilizer |
| US8618052B2 (en) | 1998-10-13 | 2013-12-31 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Method of treating coronary artery disease by administering FGF-5 |
| JP2002527401A (ja) | 1998-10-13 | 2002-08-27 | カイロン コーポレイション | Ｆｇｆの脈管形成的に有効な単位用量および投与方法 |
| US20030166550A1 (en) | 1999-08-27 | 2003-09-04 | Chiron Corporation | Angiogenically effective unit dose of FGF-2 and method of use |
| US20020072489A1 (en) * | 1998-10-13 | 2002-06-13 | Whitehouse Martha J. | Angiogenically effective unit dose of FGF-2 and method of use |
| US6440934B1 (en) | 1998-10-13 | 2002-08-27 | Chiron Corporation | Angiogenically effective unit dose of FGF-2 and method of use |
| WO2001013031A2 (en) * | 1999-08-13 | 2001-02-22 | Chiron Corporation | Dose of an angiogenic factor and method of administering to improve myocardial blood flow |
| US7494669B2 (en) | 2001-02-28 | 2009-02-24 | Carrington Laboratories, Inc. | Delivery of physiological agents with in-situ gels comprising anionic polysaccharides |
| IL149562A0 (en) | 2002-05-09 | 2002-11-10 | Prochon Ltd | Fgf variants and methods for use thereof |
| US7067123B2 (en) | 2003-04-29 | 2006-06-27 | Musculoskeletal Transplant Foundation | Glue for cartilage repair |
| US7901457B2 (en) | 2003-05-16 | 2011-03-08 | Musculoskeletal Transplant Foundation | Cartilage allograft plug |
| US7837740B2 (en) | 2007-01-24 | 2010-11-23 | Musculoskeletal Transplant Foundation | Two piece cancellous construct for cartilage repair |
| US20090319045A1 (en) | 2004-10-12 | 2009-12-24 | Truncale Katherine G | Cancellous constructs, cartilage particles and combinations of cancellous constructs and cartilage particles |
| US7815926B2 (en) | 2005-07-11 | 2010-10-19 | Musculoskeletal Transplant Foundation | Implant for articular cartilage repair |
| WO2007035778A2 (en) | 2005-09-19 | 2007-03-29 | Histogenics Corporation | Cell-support matrix and a method for preparation thereof |
| US8435551B2 (en) | 2007-03-06 | 2013-05-07 | Musculoskeletal Transplant Foundation | Cancellous construct with support ring for repair of osteochondral defects |
| US20090054984A1 (en) | 2007-08-20 | 2009-02-26 | Histogenics Corporation | Method For Use Of A Double-Structured Tissue Implant For Treatment Of Tissue Defects |
| US8685107B2 (en) | 2007-07-03 | 2014-04-01 | Histogenics Corporation | Double-structured tissue implant and a method for preparation and use thereof |
| EP2310039B1 (en) * | 2008-05-02 | 2014-07-16 | University Of Western Ontario | Fgf-9 and its use relating to blood vessels |
| US9169309B2 (en) * | 2011-03-01 | 2015-10-27 | Humanzyme Inc. | Thermostable variants of fibroblast growth factors |
| US10077420B2 (en) | 2014-12-02 | 2018-09-18 | Histogenics Corporation | Cell and tissue culture container |
| CN105859892A (zh) * | 2016-06-08 | 2016-08-17 | 浙江大学 | 一种类胶原蛋白-人碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白及其制备方法 |
Family Cites Families (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4378347A (en) * | 1980-06-30 | 1983-03-29 | Franco Wayne P | Composition for treating the heart for myocardial infarction |
| US4296100A (en) * | 1980-06-30 | 1981-10-20 | Franco Wayne P | Method of treating the heart for myocardial infarction |
| US4588585A (en) * | 1982-10-19 | 1986-05-13 | Cetus Corporation | Human recombinant cysteine depleted interferon-β muteins |
| US4518584A (en) * | 1983-04-15 | 1985-05-21 | Cetus Corporation | Human recombinant interleukin-2 muteins |
| US4785079A (en) * | 1984-11-09 | 1988-11-15 | The Salk Institute For Biological Studies | Isolation of fibroblast growth factor |
| US4956455A (en) * | 1984-03-05 | 1990-09-11 | The Salk Institute For Biological Studies | Bovine fibroblast growth factor |
| US4959314A (en) * | 1984-11-09 | 1990-09-25 | Cetus Corporation | Cysteine-depleted muteins of biologically active proteins |
| US4902782A (en) * | 1986-12-10 | 1990-02-20 | The Salk Institute For Biological Studies | Isolation of fibroblast growth factor |
| EP0377579A1 (en) * | 1987-07-07 | 1990-07-18 | California Biotechnology, Inc. | Recombinant fibroblast growth factors |
| AU638402B2 (en) * | 1987-11-24 | 1993-07-01 | Amgen, Inc. | Analogs of fibroblast growth factor |
| US5130418A (en) * | 1989-05-02 | 1992-07-14 | California Biotechnology Inc. | Method to stabilize basic fibroblast growth factor |
| DE69119869T2 (de) * | 1990-11-23 | 1996-12-12 | American Cyanamid Co | Chimeres Fibroblasten-Wachstumsfaktor |
| WO1998000198A1 (de) * | 1996-06-29 | 1998-01-08 | Mueller Dieter | Pharmazeutische darreichungsform |
-
1991
- 1991-11-04 DE DE69119869T patent/DE69119869T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1991-11-04 EP EP91118725A patent/EP0486862B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-11-04 ES ES91118725T patent/ES2087207T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-11-04 DK DK91118725.0T patent/DK0486862T3/da active
- 1991-11-04 AT AT91118725T patent/ATE138687T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-11-04 US US07/783,694 patent/US5310883A/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-11-07 IL IL9998491A patent/IL99984A/en active IP Right Grant
- 1991-11-18 NZ NZ240622A patent/NZ240622A/en not_active IP Right Cessation
- 1991-11-21 PT PT99565A patent/PT99565B/pt not_active IP Right Cessation
- 1991-11-21 JP JP33156891A patent/JP3205578B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1991-11-21 CA CA002055963A patent/CA2055963C/en not_active Expired - Fee Related
- 1991-11-22 AU AU88062/91A patent/AU646514B2/en not_active Ceased
- 1991-11-22 IE IE406891A patent/IE74956B1/en not_active IP Right Cessation
- 1991-11-22 ZA ZA919260A patent/ZA919260B/xx unknown
- 1991-11-22 KR KR1019910021053A patent/KR100205078B1/ko not_active IP Right Cessation
-
1993
- 1993-02-26 US US08/023,757 patent/US5302702A/en not_active Expired - Lifetime
-
1994
- 1994-01-05 US US08/177,502 patent/US5371206A/en not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-06-17 GR GR950403456T patent/GR3020237T3/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NZ240622A (en) | 1994-08-26 |
| US5310883A (en) | 1994-05-10 |
| DE69119869D1 (de) | 1996-07-04 |
| IE74956B1 (en) | 1997-08-13 |
| US5302702A (en) | 1994-04-12 |
| ZA919260B (en) | 1992-08-26 |
| DE69119869T2 (de) | 1996-12-12 |
| AU8806291A (en) | 1992-05-28 |
| IL99984A0 (en) | 1992-08-18 |
| JPH04330097A (ja) | 1992-11-18 |
| ATE138687T1 (de) | 1996-06-15 |
| ES2087207T3 (es) | 1996-07-16 |
| CA2055963C (en) | 2002-11-12 |
| IE914068A1 (en) | 1992-06-03 |
| EP0486862B1 (en) | 1996-05-29 |
| DK0486862T3 (da) | 1996-06-24 |
| IL99984A (en) | 1998-12-06 |
| US5371206A (en) | 1994-12-06 |
| GR3020237T3 (en) | 1996-09-30 |
| KR920009848A (ko) | 1992-06-25 |
| AU646514B2 (en) | 1994-02-24 |
| PT99565A (pt) | 1992-10-30 |
| EP0486862A1 (en) | 1992-05-27 |
| KR100205078B1 (ko) | 1999-06-15 |
| CA2055963A1 (en) | 1992-05-24 |
| JP3205578B2 (ja) | 2001-09-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| PT99565B (pt) | Processo para a preparacao de factores de crescimento de fibroblastos quimerico s | |
| PT99566A (pt) | Processo para a preparacao de fragmentos do factor de crescimento de fibroblastos | |
| WO1989004832A1 (en) | Analogs of fibroblast growth factor | |
| US5223483A (en) | Cysteine-modified acidic fibroblast growth factor | |
| EP0785950A2 (en) | Keratinocyte growth factor analogs | |
| PT88824B (pt) | Processo para a producao de mutante do factor de crescimento acido de fibroblastos | |
| AU2003234066B2 (en) | Muteins of placental growth factor type 1, preparation method and application thereof | |
| JPH10507929A (ja) | 高い安定性と生物活性をもつ酸性繊維芽細胞増殖因子の類似体 | |
| US20080200378A1 (en) | KGF polypeptide compositions | |
| EP0241136A2 (en) | Human class 1 heparin-binding growth factor | |
| AU2002326742A1 (en) | KGF polypeptide compositions | |
| EP0494664A1 (en) | Human bFGF derivatives, their analogs and process for their production | |
| AU2007214362B2 (en) | KGF polypeptide compositions | |
| CA2079291A1 (en) | Activities of heparin binding neurite-outgrowth promoting factor |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| BB1A | Laying open of patent application |
Effective date: 19920601 |
|
| FG3A | Patent granted, date of granting |
Effective date: 19990129 |
|
| PD3A | Change of proprietorship |
Free format text: WYETH HOLDINGS CORPORATION US Effective date: 20031117 |
|
| TE3A | Change of address (patent) |
Free format text: AMERICAN CYANAMID COMPANY US Effective date: 20031117 |
|
| MM3A | Annulment or lapse |
Effective date: 20060731 |