PT99566A - Processo para a preparacao de fragmentos do factor de crescimento de fibroblastos - Google Patents

Description

FUNDAMENTO DO INVENTO i O presente invento está relacionado com novos fragmentos activos de factores de crescimento básicos de fibroblastos (bFGF). Os factores de crescimento de fibroblastos (FGF) são mitogénios polipeptídicos multifuncionais que apresentam uma especificidade larga de células alvo (1) . No decurso do estudo destes factores, identificou-se uma série com base com base na capacidade dos extractos de vários tecidos, tais como cérebro, pituitária e hipotãlamo, para estimularem a mitose de células em cultura. Foram dados numerosas designações aos factores activos nestes extractos, incluindo factor de crescimento epidérmico, factor de crescimento derivado de plaquetas, factor de crescimento de células nervosas, dactor de crescimento hematopoiético e factor de crescimento de fibroblastos.

e 0 factor de crescimento de fibroblastos (FGF) foi primeiro descrito por Gospodarowicz em 1974 (2) como derivado de tecido de cérebro bovino ou de pituitária o qual se mostrou mitogénico para fibroblastos e células endoteliais. Observou-se mais tarde que o mitogénio primário derivado de cérebro era diferente do isolado a partir de pituitária. Estes dois factores foram designados FGF ácido e básico, respectivamente, pois possuem actividades biológicas semelhantes senão mesmo idênticas mas diferem nos seus pontos isoeléctricos. Os factores de crescimento ácido e básico de fibroblastos (recentemente revisto por Burgess, W.H. e Maciag (3) parecem ser membros normais de uma família de factores de crescimento que se ligam à heparina que influenciam a capacidade proliferativa geral de uma maioria das células derivadas da mesoderme e e da neuroectoderme (4), incluindo células endoteliais, células do músculo liso, células do córtex adrenal, células epiteliais da próstata e da retina, oligodendrócitos, astrócitos, crondôcitos, mioblastos 3 - 1

osteoblastos (Burgess e Maciag, referido atras na página 584) (3) . Se bem que os melanócitos humanos respondam a influências mitogénicas do factor de crescimento básico de fibroblastos mas não FGF ácido, a maior parte dos tipos de células de mamífero respondem a ambos os polipeptídeos (ibid.)· (3).

Para além de induzir uma resposta mitogénica que estimula o crescimento celular, os factores de crescimento de fibroblastos podem estimular um grande número de tipos celulares para responderem de forma não mitogénica. Estas actividades incluem a promoção da migração celular para áreas feridas (quimiotáxis), iniciação da formulação de novos vasos sanguíneos (angiogénese), modulação da regeneração dos nervos (neurotropis-mo) e estimulação ou supressão da expressão proteica celular específica, produção da matrix extracelular e sobrevivência celular importante nos processos de cicatrização (Burgess e Maciag, referido atrás, páginas 584 a 588) (3).

Estas propriedades, juntamente com acção de promoção do crescimento celular, proporciona uma base para usar factores de crescimento de fibroblastos em abordagens terapêuticas para acelerar a cicatrização de feridas e na prevenção e apliações terapêuticas de trombose, arteriosclerose e similares. Assim, foi sugerido que os factores de crescimento de fibroblastos promovem a cicatrização do tecido sujeito a trauma (5), para minimizar a danificação do miocárdio em doenças do coração e cirúrgia (6 e 7) e para aumentar a sobrevivência dos neurões e extensão de neuri-tes (8).

Clones de DNA complementares codificadores de factores de crescimento básicos de fibroblastos humano e bovino foram isolados e sequenciados e as sequências de aminoãcidos previstas derivadas de DNAs complementares estão de acordo com as f

estruturas determinadas por análise de sequeWciação de proteína (resumido por Burgess e Maciag, referido atrás, nas páginas 580-581) (3). Os resultados prevêm que o factor de crescimento ácido de fibroblastos (daqui em diante referido como aFGF) possuam 155 aminoácidos (ibid) (3). O gene para o factor de crescimento básico de fibroblastos (aqui referido como bFGF) também codifica uma proteína de 155 resíduos. Para aFGF e bFGF existem formas truncadas no extremo N que apresentam actividade biológica completa, incluindo o bFGF de 146 aminoácidos originalmente isolado e sequenciado (9) e uma forma de 131 aminoácidos. A análise das estruturas demonstra uma identidade de 55% entre aFGF e bFGF (Burgess e Maciag, referido atrás na página 581) (3).

O factor de crescimento básico de fibroblastos pode ser extraído a partir de tecido de mamífero, mas este requere vários passos mesmo quando se emprega cromatografia de afinidade ligada a heparina (Pat U.S. Nos. 4,785,079 e 4,902,782 de Gospodarowitcz, et al.,) (10 e 11) e a espécie de 146 aminoácidos é geralmente obtida se a extracção for feita na ausência de inibidores de proteases (ibid., coluna 9, linhas 29 a 32). O cDNA do factor de crescimento básico de fibroblastos bovino e humano foi expresso em E.- coli (12 e 13) e S. cereviasiae (36). No entanto, os rendimentos do produto descritos são baixos (15) e os factores recombinantes apresentam uma tendência marcada para sofrerem trocas tiol-dissulfureto promovidas pelos grupos tiol livres na proteína que resultam na formação de espécies com ligações dissulfureto constituídas ao acaso (12).

Foi sugerida uma série de análogos do factor de crescimento básico de fibroblastos. As muteínas do bFGF tendo eliminados ou adicionados aminoácidos do extremo amina ou carboxilo, císteina substituída por um aminoácido neutro como seja a serina ou ácido aspártic, arginina, glicina, serina ou valina f

substituídos por outros ácidos foi sugerido qiié ahmenta a estabilidade (16). As muteínas compreendem duas ou três adições, deleções ou substituições, sendo a substituição de serina por císteina a substituição mais preferida (16). Arakawa e Fox (17) sugeriram a substituição de pelo menos uma, mais preferencialmente duas das císteinas encontradas no bFGF natural com um resíduo de aminoãcido diferente para dar um análogo mais estável (página 4, linhas 44 a 47); serina foi ilustrada nos Exemplos (página 13, linhas 22 a 23). De forma semelhante, aFGFs recombinantes tendo císteina formando ligações estranhas substituídas com serina e cístena, metionina e triptofano susceptíveis à oxidação substituídas com alanina, valina, leucina ou isoleucina, para dar factores tendo actividade biológica aumentada ou melhorada também foi sugerido (18).

Uma muteína bFGF sem 7 a 46 aminoácidos do extremo carbonilo e, facultativamente, tendo substituições de aminoácidos foi sugerido como tendo uma maior estabilidade retendo ao mesmo tempo a actividade no Pedido de Patente Europeia Publicação Ns 326,907 de Seno, et al., (página 2, linha 50 até à página 3, linha 4) (19). Fiddes et al., (Pedido de Patente Europeia Publicação Ns 298723) (20) sugeriu a substituição de resíduos básicos ou carregados positivamente no domínio de ligação à heparina abrangendo os resíduos 128 a 138 com aminoácidos neutros ou com carga positiva para produzir formas de FGF tendo capacidade de ligação à heparina reduzida e maior potência (página 5, linha 45 e página 5 linha 54 atá à página 6, linha 16). Bergonzoni, et al., (21), sugeriu seis análogos: 1) Ml-bFGF, sem os resíduos 27 a 32; M2-bFGF, sem os resíduos 54 a 58; M3-bFGF, sem os resíduos 70 a 75; M4-bFGF, sem os resíduos 78 a 83; M5-bFGF, sem os resíduos 110 a 120; M5a-bFGF, tendo na posição 128 lisina e na posição 129 arginina substituídas por resíduos de glutamina; e

M6b-FGF, tendo nas posições 119 e 128 lisinas 'è nãs posições 118 e 129 argininas substituídas por resíduos de glutamina.

Felizmente a afinidade para heparina também proporciona um método selectivo para o isolamento e purificação de duas formas de FGF, ácido e básico (22). Os FGFs são estruturalmente sensíveis mas podem ser protegidos da inactivação pelo calor ou pH baixo por associação com heparina (23). Os complexos de heparina-FGF também são altamente resistentes à degradação proteolítica (24). A heparina através de um mecanismo provavelmente relacionado com uma maior estabilidade ao factor de crescimento de fibroblastos pode potenciar as propriedades biológicas de FGF ácido e básico (23 e 25). FGFs não possui uma sequência de peptídeo sinal clássica que possa dirigir a secreção do FGf para o espaço extracelular (26). No entanto, quantidades consideráveis de fFGF foram detectadas e isoladas a partir da matrix extracelular (ECM) tanto in vitro como in vivo (28). Isto, portanto, levanta a questão de como a secreção de FGF ocorre e sugere a possível utilização de uma proteína veículo ou proteoglicano. bFGF associado a ECM liga-se ao sulfato de heparina (HS) proteo-glicanos (29 e 31) e mais provavelmente é libertado de forma controlada como um complexo FGF-HS (31). Assim, uma hipótese corrente (1) respeitante ao mecanismo de regulação da actividade mitogénica de FGF é que FGF seja sequestrado no ECM como um complexo biologicamente inactivo de FGF-heparina. Em seguida, FGF ligado a ECM pode ser mobilizado por sianis celulres específicos que activam, por exemplo, sistemas enzimáticos degradadores de matrix tais como sistemas enzimáticos da cascada de activação do plasminogénio (31) e endo-beta-D-glucuronidases específicas de heparano sulfato (32 e 33).

Como tal, parece que a localização dos domínios funcionais em bFGF deverão envolver a revisão desta interação

função-estrutura com heparina e o receptor de FGF. De facto, os estudos de estrutura-função com fragmentos de peptídeos sintéticos do bFGF sugere a existência de dois domínios funcionais, correspondendo aos resíduos 33-77 e 112-155 (A numeração de bFGF adoptada aqui é para a forma de 155 aminoácidos como descrito em (26) e refere-se ao codão de iniciação da metionina na posição 1. Usando este sistema o resíduo prolilo N-terminal da forma de bFGF derivada do factor tipo tecido de 146 aminoácidos sequenciado corresponde à posição de codão 10 e é assim identificado como bFGF (10-155)). Os domínios de ligação a heparina e ao receptor foram identificados pela capacidade dos peptídeos sintéticos relacionados com sequências de FGF para competirem com bFGF para o seu receptor, para se ligar a heparina marcada radioactivamente e para modular a resposta mitogénica de FGF (34). De uma destas regiões contendo um domínio funcional, 112-155 (34).

Seno et al. (35) proporcionam uma outra série de fragmentos para estudar as propriedades mitogénica e de ligação à heparina de uma série de bFGFs truncados no extremo C (10-155) produzido em E. coli. À medida que o grau de truncagem do extremo C excede 6 resíduos, a afinidade para a heparina foi marcadamente diminuída. No mesmo estudo, duas formas truncadas no extremo N de bFGF, 23-155 e 50-155, foram também analisadas. Quando comparado com bFGF nativo (10-155), bFGF (23-155) e (50-155) não apresentou alterações na afinidade para heparina mas apresentou um decréscimo de cerca de 2 a 50 vezes na actividade mitogénica, respectiva-mente.

0 presente invento tira partido da interacção especifica significativa entre heparina e bFGF para definir mais estreitamente os domínios estruturais do factor de crescimento que interactuam com heparina e o receptor de bFGF para dar uma resposta mitogénica. O mutante bFGF humano glu ' , ser ' bFGF foi usado nestes estudos pelas seguintes razões: (a) bFGF e os mutantes são equipotentes; (b) as mutações dos residuos 3 e 5 dá consideravelmente mais expressão do que a proteína parental no sistema de exressão deste invento; e (c) as mutações dos resíduos de císteina 78 e 96 para serinas elimina os problemas de estabilidade relacionados com formação de ligações dissulfureto ao acaso com as preparações recombinantes do bFGF parental, particularmente quando expresso com rendimento elevado. Estes análogos do bFGF estão descritos mais detalhadamente no pedido de patente copendente para para cartas de estados limitados Patente N2 de Série -, entregue simultaneamente. A digestão proteolítica de hFGF(1-155) glu3'5, ser78'96 ligada a heparina-sefarose, dá dois fragmentos peptídicos que são eluidos da heparina-sefarose nas mesmas condições usadas para eluir bFGF intacto. Assim, estes produtos peptídicos bFGF são fragmentos de ligação a heparina (HBF), uma vez que estão protegidos da degradação proteolítia devido à sua interacção específica com heparina. Os 2 fragmentos peptídicos foram designados

TO Q C HBF-1 (bFGF 27-69) e HBF-2 (ser ' bFGF (70-155)). Em HPLC de afinidade com heparina a mistura de HBF-1 e HBF-2 não é resolvida e os dois fragmentos coeluem com um tempo de reacção idêntico ao do bFGF intacto. Assumiu-se portanto que ambos os fragmentos possuem iguais afinidades para heparina; no entanto também existe a possibilidade de eles serem ligados covalentemente ou associados não covalentemente para formar um complexo. É interessante que HBF-1 e HBF-2 contêm cada um um só resíduo de císteina correspondendo âs posições 34 e 101 em glu ' ,ser ' -155) que se pensa estarem ligados por pontes dissulfureto na estrutura inactiva (35). HBF-1 e HBF-2 são no entanto eficazmente resolvidos por RPLC na ausência de um agente redutor de tiol. 0 facto de a análise da sequência N-terminal de HBFs purificados por RPLC não indicar sequências secundárias argumenta contra HBF-1 e HBF-2 estarem ligados covalentemente.

Assim, HBF-1 foi sujeito a S-piridiletilação (37) em condições não redutoras, seguido de análise da sequência N-termi-nal. Este processo dá uma reacção quantitativa com vinilpiridina e liberta o derivado de S-piridiletilcisteína no 82 ciclo do sequenciador, enquanto uma testemunha tratada de forma semelhante, somatostatina-28 (Bachem Bioscience), no qual as clsteinas 17 e 28 estão ligadas por ligações dissulfureto, não dá derivado de fenil-hidantoína-cisteina detectável no sequenciador ciclo 17.Assim, os dados suportam a presença de um grupo sulfidrilo livre em HBF-1 e por analogia também em HBF-2, Isto implica que as císteinas 34 e 101 podem não estar estavelmente ligadas em glu3'5,ser7 6'9 6-bFGF.

Como alternativa, existe a possibilidade de interacções não covalentes entre os 2 peptídeos. A evidência indirecta para uma associação entre HBF-1 e -2 vem da incapacidade da cromato-grafia de permuta catiónica, apesar das diferenças marcadas na carga dos peptídeos e ausência de ligação dissulfureto, para resolver os 2 fragmentos. Também o seu comportamento em cromato-grafias de heparina e de permuta catiónica não se distingue do de bFGF. Isto pode implicar que no estado nativo ou quando ligado a heparina, as regiões de bFGF contidas nas sequências 27-69 e 70-155 interactuam para dar uma única estrutura tridimensional que é necessária para ligação de alta afinidade a heparina. suporte adicional para isto vem da observação de que bFGF purificado por RPLC, HBF-1 e HBF-2 não retêm a sua afinidade para heparina, mesmo apõs remoção dos solventes de HPLC, mas bFGF e HBF-2 purificados por RPLC apresentam actividades biológicas.

Baird et al., (34) usando fragmentos sintéticos de bFGF identificaram 2 regiões de peptídeos, resíduos 33-77 e 109-129 em bFGF, que se ligam à heparina e apresentam actividades 10

J

antagonistas parciais fracas em ensaios biológicos. HBF-2 (ser78'96bFGF(70-155)) contem a sequência de bFGF 109-129.

Uma comparação das potências das sequências de FGF relativamente ao bFGF intacto (Tabela 2) mostra que a actividade de HBF-2 é -3-4 . ... pelo menos 10 -10 vezes maior do que o peptideo sintético mais activo conhecido (bFGF (112-155)) (34). Recentemente, Seno et al. (35) expressaram e examinaram as propriedades de uma série de versões truncadas de bFGF. Estes estudos concluem que elementos essenciais para a ligação ao receptor estão contidos na sequência 50-109 e para a ligação à heparina na sequência 110-150; no entanto, são possíveis outras interpretações. Seno et al., também descreveu uma forma truncada no extremo N de bFGF (50-155) que retem afinidade total para a ligação à heparina e apresenta cerca

de 2% da actividade mitogénica de bFGF (10-155) . Uma vez que bFGF (50-155) e HBF-2 (70-155) parecem equipotentes (Tabela 2), a sequência de FGF 50-69 pode assim ser eliminada como contribuindo significativamente para o reconhecimento do receptor resposta mitogénica. 0 presente invento proporciona fragmentos de FGF obtidos por degradação proteolítica de bFGF ligado a heparina ou heparina-sefarose e inclui fragmentos que imobilizam análogos de heparina-sefarose imobilizados ou análogos de heparina, incluindo os que possuem actividade mitogénica. Este invento também inclui análogos tendo os resíduos de císteina nas posições 78 e 96 substituídos por outros aminoácidos tais como por exemplo alani-na, glicina, arginina, triptofano, lisina, ácido aspártico, ácido glutâmico, asparagina, glutamina, histidina, isoleucina, leucina, valina, fenilalanina, tirosina, metionina, serina, treonina ou prolina. Ainda, os fragmentos bFGF do presente invento não são específicos de espécie e incluem por exemplo os bovino, ovino, porcino e outros que partilham homologias de sequências similares com bFGF humano.

Os novos fragmentos de bFGF do presente invento também podem ser preparados por síntese de proteínas recombinantes envolvendo a preparação de DNA codificador dos fragmentos de bFGF, inserção do DNA num vector, expressão do vector em células hospedeiras e isolamento dos fragmentos bFGF recombinantes assim produzidos.

Devido à degenerescência do código genético, pode ser seleccionada uma variedade de combinações dos fragmentos bFGF do presente invento, de tal forma que quaisquer deleções, adições ou mutações pontuais de nucleótidos que resultem num DNA codificador dos fragmentos bFGF aqui tratados são englobadas por este invento. Uma vez que certos codões são mais eficazes para a expressão de polipeptídeos em certos tipos de organismos, a seleção das alterações do gene para dar material de DNA que codifique os fragmentos de bFGF do presente invento são preferencialmente os que dão a expressão mais eficaz no tipo de organismo que tem de sobreviver como hospedeiro do vector recombinante. A seleção de codões pode também depender das considerações quando da construção do vector. 0 material de partida DNA que pode ser alterado para formar o DNA do presente invento pode ser natural (isolado a partir de tecido), recombinante ou sintético. Assim, o material de partida DNA pode ser isolado a partir de tecido ou de cultura de tecidos construído a partir de oligonucleõtidos usando métodos convencionais, obtido comercialmente ou preparado por isolamento de RNA codificador de bFGF a partir de fibroblastos, usando este RNA para sintetizar cDNA de cadeia simples que pode ser usado como molde para sintetizar o correspondente DNA de cadeia dupla. Conforme aqui apontado, a degradação proteolítica do bFGF nativo ligado a heparina ou heparina imobilizada pode gerar também os fragmentos. 12

Também estão englobadas as sequências-de DNA homólogas ou estreitamente relacionadas com o DNA complementar aqui descrito, nomeadamente sequências de DNA que hibridem, particularmente em condições restringentes com o cDNA aqui descrito e correspondente RNA.

0 DNA codificador dos fragmentos bFGF do presente invento ou DNA correspondente pode então ser inserido num vector, e.g. um plasmídeo da série pBR, pUC, pUB ou pET e o vector recombinante usado para transformar organismos hospedeiros microbianos. Organismos hospedeiros podem ser bacterianos (e.g., E. coli ou B. subtilis. levedura (e.g., S. cerevisiae) ou mamífero (e.g., fibroblastos de murganho). A cultura dos organismos hospedeiros estavelmente transformados ou transfectados com tais vectores em condições facilitativas ou expressão em larga escala das sequências de DNA ou RNA exógeno inserido no vector e isolamento dos polipeptídeos pretendidos a partir do meio de crescimento, lisados celulares ou fracções de membrana celular dá os produtos pretendidos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS FIGURA 1: Purificacãopor RPLC de HBF-1 e HBF-2

Uma fracção (3 /zg) do eluente de NaCl 3M da heparina--sefarose foi sujeita a HPLC de fase reversa numa coluna Vydac como descrito. ) 13

FIGURA 2: O efeito da mistura de HBF-1 e HBF-2 éluida a partir da heparina-sefarose na proliferação de células endoteliais dos arcos aôrticos bovinos A proteína no eluato de NaCl 3M da heparina-sefarose foi determinado por análise de aminoácidos e amostras, após diluição adequada em DMEM/BSA foram adicionadas às células para ensaio da actividade mitogénica; o crescimento celular foi testado por contagem das células, como descrito. FIGURA 3: O efeito de HBF-1. HBF-2 e qlu3'5. ser78,96 bFGF na proliferação de células endoteliais dos arcos aôrticos bovinos

Amostras de bFGF mutante (- -) , HBF-1 (-o-) , HBF-2 (- -), apropriadamente diluidos (em DMEM/BSA), foram adicionadas âs células e o crescimento foi determinado usando o ensaio de fosfatase ácida.

SUMÁRIO DO INVENTO

O presente invento está relacionado com novos fragmentos de bFGF. Os fragmentos de bFGF são obtidos por degradação proteolítica do bFGF nativo ou seus análogos e resulta em fragmentos que se ligam à heparina ou heparina-sefarose sozinha ou em combinação com outros fragmentos de bFGF que se ligam a heparina ou heparina-sefarose. Mais especificamente, os fragmentos do presente invento contêm por volta dos aminoácidos 27 a 69 e por volta dos aminoácidos 70 a 155 do bFGF nativo ou seus análogos que se ligam a heparina ou que imobilizam heparina ou heparina--sefarose. Inesperadamente encontrou-se que os polipeptídeos do presente invento, os possuidores dos aminoácidos á volta de 70 a 155, apresentam uma actividade mitogénica muito superior â dos peptídeos anteriormente gerados (34 e 35).

Como tal, é um objectivo do presente invento proporcionar fragmentos de bFGF biologicamente activos, os quais se ligam, sózinhos ou em combinação com outros fragmentos de bFGF a hepari-na. Ainda, o fragmento 70-155 também apresenta actividade mitogé-nica. Constitui ainda um objectivo do invento proporcionar um método para gerar os referidos fragmentos de peptídicos. Também, estes fragmentos são úteis no tratamento de animais e doentes para regenerar mais rapidamente tecidos danificados ou destruídos como anteriormente discutido. Estes e outros objectivos do presente invento serão mais aparentes pela descrição mais detalhada do invento proporcionada abaixo.

DESCRICÃO DETALHADA DO INVENTO 0 presente invento é exemplificado pelos exemplos que se seguem, os quais são ilustrativos e não limitantes. EXEMPLO 1

Construção do Plasmídeo de Expressão

Um gene sintético codificador da forma de 155 aminoáci-dos do FGF básico humano (26) clonado em pUC 18 foi adquirido à British Bio-technology, Oxford, UK. Para facilitar as manipulações, o sítio de restrição interno Ncol, que inclui o codão da metionina N-terminal do cDNA de bFGF, foi destruído e substituído por um sítio único Ndel. Isto foi conseguido por excisão da sequência de nucleótidos (-12 a 36) com HindIII e BspMII e clonagem de um fragmento sintético contendo um sítio Ndel interno 'em pUC18. 0 cDNA codificador de bFGF foi então excisado a partir de pUC18 com Ndel e BamHI e clonado nos sítios Ndel e BamHI do vector de expressão pT7 Kan 5, um derivado de pET-3a contendo o promotor de T7 de RNA polimerase (38). EXEMPLO 2

Construção de um Gene Sintético Correspondendo ao Análogo de bFGF Humano glu1 2'3,ser78'96bFGF 3 5

Num primeiro passo, glu ' -bFGF um bFGF quimérico foi construído usando um protocolo que é idêntico ao descrito para a introdução do sítio de restrição Ndel excepto os codões para alanina e serina nas posições 3 e 5, respectivamente, (a)são alterados para codificarem ácido glutâmico (b); 5' AGCTTCATATGGCAGCCGGGAGCATCACCACGCTGCCCGCCCTT 3' (a) 5' AGCTTCATATGGCTGAAGGGGAAATCACCACGCTGCCCGCCCTT 3' (b)

Apenas as cadeias codificadoras estão apresentadas para os fragmentos original (a) e modificado (b), respectivamente. Os codões sublinhados indicam os alterados para codificarem ácido glutâmico nas posições 3 e 5. 1 5 2 0 plasmídeo de expressão ,pT7 glu ' -hFGF, foi então usado como molde para mutagénese dirigida com oligonucleótidos. Projectaram-se dois oligonucleótidos iniciadores mutagénicos para alterar codões císteina nas posições 78 e 96 para codões serina. O iniciador para serina na posição 96 é para a cadeia codificadora (60-meros; 238-297) enquanto que para a serina na posição 96 é para a cadeia anti-codão (30-meros; 251-222). Para além destes iniciadores mutagénicos, foram projectados os iniciadores para o promotor de T7 (nucleõtidos -12 a +13) e regiões terminadoras 3

(nucleótidos -75 a -51) (38). A mutação do gene FGF modificado foi conseguida pela utilização de Reacção em Cadeia com Polime-rase (PCR). Prepararam-se duas misturas de reacção contendo DNA de plasmídeo cortado com HindIII; iniciadores codificadores de T7 mais anti-codão Ser para dar um produto esperado de 319 pb e (ii) iniciadores anti-codão de T7 mais codificadores de Ser 96 para produzir um produto esperado de 294 pb. As misturas de PCR foram preparados de acordo com instruções convencionais. Realizou-se PCR usando polimerase Taq para 30 ciclos de amplificação cada um de 92°c durante 1 min, 50°c durante 5 seg, 72°G durante 1 min e os produtos analisados por electroforese em gel de agarose. Os iniciadores em excesso foram separados dos fragmentos de DNA amplificados por três ciclos sucessivos de concentração e diálise usando microconcentradores com uma exclusão de 30000 (Millipore). Fracções dos retentatos foram combinadas e amplificadas usando o PCR como descrito acima excepto os iniciadores usados corresponderem às regiões do promotor de T7 (codão) e do terminador de T7 (anticodão). 0 produto de PCR de 599 pb foi então tratado com Ndel e BamHI e purificado por electroforese em gel de agarose. O fragmento purificado foi então clonado no vector de expressão de T7, pET-3a(M-13), um derivado de pET-3a. EXEMPLO 3 O C *70 Q/r

Expressão de glu' , ser ' bFGF

Após verificação da sequência (39), o gene codificador do mutante bFGF foi usado para transformar células competentes BL21 plys s. As células de E. coli (estirpe de E. coli que contem a lisozima do plasmídeo "s") portadoras do plasmídeo são crescidas em caldo Luria contendo ampicilina (100 μg/ml) e cloranfeni-col (34 μg/ml) a 37°C até cerca de 0,6 unidades de absorvância a 600 nm e a síntese de bFGF foi induzida pela adição de isopropil--beta-tiogalactopiranósido (IPTG, 1 mM). As células foram então colhidas 2 horas após infecção por centrifugação a 4°C. 17 17

EXEMPLO 4 ο κ 7 8 Q £

Purificação de qlu ' , ser ' bFGF

Sedimentos de células de culturas de 1 litro foram ressuspensos em tampão 50 mM Tris, 0,1 iM EDTA (pH 7,6; 30 ml) e lisadas por 3 ciclos rápidos de congelação e descongelação. O lisado foi então tratado com DNase I (20 μg/ml) na presença de 5 mM MgCl2 durante 20 minutos a 4°C e centrifugado para remover os detritos celulares (10000 xg; 20 minutos). bFGF foi purificado a partir da soução de sobrenadante por cromatografia de afinidade em heparina-sefarose essencialmente como descrito (22) usando um gradiente linear salino de 0,6-3,0M NaCl. As fracções contendo o factor de crescimento foram reunidas, diluídas com tampão Tris (10 mM; pH 7,6) para dar uma concentração final de NaCl de cerca de 0,6 M e aplicadas numa coluna de TSK Heparin-5PW (0,75 x 7,5 cm; TosoHaas, Philadelphia, PA) equilibrado com 10 mM Tris, 0,6M NaCl (pH 7,6). A eluição do material ligado foi controlada a 280 nm e conseguida usando um gradiente salino linear (0,6-3,0 M NaCl em 60 minutos) num fluxo de 0,7 ml/min. 0 factor de crescimento purificado desta forma foi analisado relativamente à homogeneidade usando HPLC em fase reversa, controlando a eluição a 210 nm, (C4, Vydac; The Separations Group, Hesperia, CA) num gradiente de acetonitrilo (0-28% CH.jCN em 15 minutos; 28-26% C^CN em 90 min) em 0,1% de ácido trifluoroacético a um fluxo de 0,7 ml/min, análise da sequência N-terminal e electroforese em gel de dodecil-sulfato de sódio-poliacrilamida (SDS-PAGE) num gradiente de 10-15% e géis homogéneos de 20% usando um sistema de detecção por coloração com prata (Phastgel System, Pharmacia/LKB). EXEMPLO 5 35 7896

Digestão proteolítica de glu ' .ser ' bFGF 35 7896

Uma solução contendo glu ' , ser ' bFGF (712 μg em 0,475 ml) foi adicionado a uma pasta escorrida (0,2 ml) de heparina-Sepharose (Pharmacia/LKB, Uppsala, Sweden), previamente equilibrada com tampão Tris-HCl (50 mM; pH 7,6) misturado e incubado a 4°C. Após 60 minutos a solução de sobrenadante foi removida e o gel lavado com 50 mM Tris-HCl pH 7,6 (0,4 ml). A pasta de gel foi ressuspensa em tampão Tris-HCl (0,2 ml) e pronase (Sigma Chemical Co; Type XXV) foi adicionado para dar uma proporção de bFGF para pronase de 0,75:1,0 (p/p). A mistura foi então incubada a 37°C com agitação. Após 24 horas a mistura de gel foi centrifugada, o sobrenadante foi centrifugado, a solução de sobrenadante removida e o gel lavado com tampão tris 10 mM (pH 7,6; 3 x 0,4 ml) e tampão Tris contendo 0,6 M NaCl (2 x 0,4) ml para remover os produtos proteolíticos inespecificamente ligados. A eluição do material ligado foi efectuada por lavagem do gel de heparina-Sepharose duas vezes com tampão Tris contendo 3M NaCl. EXEMPLO 6 3 5 78 96

Análise dos Fragmentos Proteolíticos de glu ' ser ' bFGF

Os fragmentos proteolíticos do bFGF que se ligam a heparina foram analisados em condições redutoras em géis de 20% de poliacrilamida na presença de dodecil-sulfato de sódio (SDS--PAGE) usando um sistema de detecção por coloração com prata (Phastgel System, Pharmacia/LKB). Os fragmentos peptídicos foram resolvidos por HPLC de fase reversa (C4, Vydac, Hesperia, CA) usando um gradiente de acetonitrilo em 0,1% de ácido trifluoro-acético com um fluxo de 0,7 ml/min. A eluição do material ligado x‘ X - foi controlada a 210 nm. As análises de sequências N-terrainais dos peptídeos purificados por fase reversa foram rtealizadas num sequenciador em fase líquida por pulsos modelo 477A (Applied Biosystems, CA) equipado com uma análise de derivados PTH em linha (Modelo 120A, Applied Biosystems). As composições de aminoácidos foram determinadas após hidrólise em fase gasosa com HC1 (5,7M HC1 10,1% de fenol; 24 horas a 110|°C) usando um derivatizador de fenilisotiocianato modelo 420A equipado com um sistema de separação em linha modelo 130A (Applied Biosystems). A menos que de outra forma seja estabelecido os processos foram realizados de acordo com os protocolos do fabricante. A análise por SDS-PAGE dos fragmentos proteolíticos de hbFGF que se ligam a heparina apresentam digestão completa da banda de 18KD correspondendo ao glu3'5,ser78'96-bFGF e a oração de dois peptídeos de peso molecular mais baixo que migram como espécies de 11 KD e 9 KD. RPLC do produto de digestão do factor de crescimento eluido da heparina-Sepharose com 3M NaCl revela dois picos principais, designados fragmento-1 e -2 de ligação à heparina (HBF-1 e HBF-2) (Figura 1) . O fragmento que elui em primeiro lugar, HBF-1, foi identificado por SDS-PAGE como a espécie de 9 KD presente no material eluido a partir da hepari-na-sefarose enquanto que o fragmento mais retardado HBF-2 migra numa posição idêntica à do fragmento de 11 KD. A análise de de sequências N-terminais dos 2 fragmentos purificados por RPLC dá sequências únicas consistente com as regiões peptídicas que começam no resíduo 27 e no resíduo 70 de glu ' ,ser ' bFGF para HBF-1 e HBF-2 (Tabela 1) correspondem, dentro do erro experimen-tal às regiões da sequência glu ' , ser ' -bFGF dos resíduos 27-69 e 70-155 respectivamente. 'í'" X* TABELA 1

MOLE DE AMINOÁCIDO/MOLE DE PEPTÍDEO HBF -1 HBF-2 Aminoácido Encontrado Teórico Encontrado Teórico Asx 4,87 5 6,04 6 Glx 5,02 5 5,76 6 Ser 1,23 1 7,56 10 Gli 4,44 4 7,64 7 His 2,15 2 0,00 0 Arg 5,01 5 6,79 6 Tre 0,00 0 5,71 5 Ala 0,99 1 6,16 6 Pro 2,99 3 2,38 2 Tir 1,00 1 5,82 6 Vai 2,07 2 4,84 5 Met 0,00 0 1,86 2 Cis N.D. 1 N.D. 1 Ile 1,87 2 2,43 2 Leu 3,93 4 8,38 8 Fen 2,28 2 4,30 4 Trp N.D. 0 N.D. 1 Lis 4,73 5 8,32 9 Total 43 86 Composições em aminoãcidos de HBF-1 e HBF-2 AS análises dos aminoãcidos de HBF-1 (45 pmoles) e HBF-2 (25 pmoles) foram realizadas em triplicado. Os desvios padrão relativos são 21 \ inferiores a 10% (N.D., não determinado). EXEMPLO 7

BIOENSAIO

As amostras purificadas por HPLC de fase reversa foram imediatamente diluidas (1:5) em meio de Eagle modificação de Dulbecco (DMEM) contendo 1% de albumina sérica bovina (BSA). As actividades mitogénicas do bFGF e fragmentos peptídicos de bFGF foram determinadas usando células endoteliais vasculares bovinas derivadas de arcos aórticos adultos como descrito (22). Resumidamente, as células foram semeadas numa densidade inicial de 0,8 x 4 10 células por placa de 24 cavidades em 0,5 ml de DMEM/10% soro de vitela (Hyclone, Logan, UT), penicilina (100 unidades/ml), estreptomicina (100 μg/ml) e L-glutamina (2 mM). Duas horas após a sementeira, adicionaram-se amostras de 20 μΐ das diluições adequadas de bFGF em DMEM contendo 0,5% BSA. Após 5 dias em cultura, placas em duplicado foram tripsinizadas e as densidades celulares determinadas por contagem de células num contador Coulter. Como alternativa, curvas de crescimento na presença e ausência de bFGF foram determinadas medindo os níveis de fosfa-tase ácida após lise celular (40). As células foram semeadas a uma densidade celular inicial de 1000-1200 células por cavidade • 2 (placas de 96 cavidades de fundo plano de 0,32 cm ) em 0,25 ml de DMEM/10% de soro fetal contendo antibióticos e L-glutamina (ver atrás). Após sementeira das células, adicionaram-se amostras de 10 μΐ das diluições adequadas do factor de crescimento e fragmentos peptídicos em DMEM/0,5% BSA.

Após 4-5 dias, o crescimento celular foi avaliado em cada cavidade medindo os níveis de fosfatase ácida após lise celular usando p-nitrofenil-fosfato como substrato (40). A absorvância a 405 nm para cada uma das amostras foi determinada usando um leitor de

microplacas de ELISA (Molecular Devices). Âs determinações foram feitas em triplicado. Não foram observadas diferenças significativas na forma das curvas de dose resposta ou nas concentrações do bFGF necessário para estimulação máxima e metade da máxima do crescimento celular quando o crescimento celular é determinado por qualquer um dos métodos.

O eluato de 3M NaCl da heparina-sefarose contendo uma mistura aproximadamente equimolar de HBF-1 e de HBF-2 foi examinado relativamente a actividade mitogénica. A mistura induz uma proliferação dependente da dose de células endoteliais bovinas com a dose para a estimulação metade do máximo do crescimento sendo aproximadamente 10 vezes superior comparado com bFGF intacto (Figura 2). Para determinar as propriedades mitogénicas de cada um dos componentes, foi feita uma tentativa para resolver os 2 fragmentos mutantes de FGF. Inesperadamente, os comportamentos cromatográficos de HBF-1 e de HBF-2 em permuta catiõnica Mono-S e HPLC em TSK heparina numa variedade de condições, são idênticos aos do bFGF intacto e não dão resolução de HBF-1 e de HBF-2. No entanto, uma vez que RPLC dá uma separação eficaz dos 2 componentes (Figura 1) as propriedades mitogénicas de HPF-1 e HPF-2 purificadas por RPLC foram comparadas com as de bFGF purificado por RPLC. Sabe-se que estas condições reduzem a actividade mitogénica do bFGF em 10-20 vezes, presumivelmente como consequência da desnaturação de proteína. Na presente experiência bFGF purificador por RPLC tem 1/10 da actividade de bFGF. HBF-1 purificado por RPLC não parece afectar o crescimento celular, enquanto que HBF-2 apresenta uma resposta estimuladora dependente da dose (Figura 3) com uma potência que é 25-50 vezes mais baixa do que a de glu ' ,ser ' -bFGF purificado por RPLC (ED50 de HBF-2 purificado por RPLC e de glu^^ser^^-bFGF são 23 23 ι cerca de 3 e 0,1 pmoles/ml, respectivamente). Assumindo que a actividade mitogénica de HBF-2 é reduzida pelo mesmo grau de bFGF nas condições de RPLC, então cerca de 150-300 fmoles/ml podem ser previstas para HBF-2 nativo. Este cálculo é consistente com um ED50 de aproximadamente 150 fmoles/ml obtido a partir dos resultados apresentados na Figura 2 para a mistura contendo HBF-1 e HBF-2 eluido da heparina-sefarose. No nosso ensaio, a potência do bFGF intacto ou do glu ' ,ser ' -bFGF é aproximadamente 17 fmoles/ml. Assim HBF-2 com uma conformação intacta é cerca de 10 vezes menos potente do que bFGF intacto.

J 24 24

TABELA 2 PEPTÍDEO MASSA ACTIVIDADE MITOGÉNICA REF bFGF(2-155) 17,2 1,00 (14) bFGF(10-155) 16,4 1,00 (35) bFGF(23-155) 15,2 0,68 (35) bFGF(50-155) 12,1 0,02 (35) bFGF(70-155) 9,5 0,04-0,02 HBF-2 bFGF(112-155) 5,0 io"5-io~6 (34) bFGF(33-77) 5,0 10~5-10~6 (34) bFGF(109-129) 2,7 io_5-io"6 (34)

Actividades mitoqénicas relativas dos fragmentos peptídicos de

As actividades mitogénicas para cada um dos peptídeos foi calculada a partir de dados publicados conforme indicado e foram expressas relativamente aos valores de ED5Q para bFGF(2- -155) ou bFGF(10-155). As potências mitogénicas relativas tiradas de (34) foram calculadas a partir de dados incompletos. Os valores descritos para HBF-2 são relativos aos valores de ED..- 50 determinados para bFGF purificado por RPLC. Valores semelhantes podem ser obtidos por comparação do valor de ED5Q para bFGF com o da mistura contendo HBF-l e HBF-2 eluido a partir de heparina--sefarose (ver texto).

As sequências de DNA, plasmídeos e/ou microorganismos depositados em relação com o presente pedido de patente, excepto quando especificado em contrário, foram depositados na colecção de culturas da American Cyanamid Company em Pearl River, New York e estão disponíveis ao público quando legalmente adequado para o fazer. Ainda, depositou-se o que se segue na American Type Culture Collection (ATCC) em Rockville, Maryland 20952, U.S.A. na data indicada com os números de acesso ATCC indicados: 3 5 78 96 BL21 lysS/pET glu ' ser ' depositado em 13 de Novembro, 1990 com ο NS ATCC 68478. 3 5 BL21 lysS/pET glu ' hBFGF depositado em 13 de Novembro, 1990 com O NS ATCC 68477. 3 5 78 96

Os dois acima contem o DNA de glu ' ser ' hbFGF e 3 5 glu ' hBFGF como aqui descrito.

RTRT.TOGRAFIA 1. Baird, A. and Bohlen, P. (1990) in "Peptide Growth

Factors and their Receptors" (Sporn, M. and Roberts, A., Eds) Handbook of Exp. Pharmacol. 95(1). pp369-418,

Springer. 2. Gospodarowicz, D., Nature 249:123-127 (1974). 3. Burgess, W,H. and Maciag, T., Ann Rev. Biochem 8:575-606 (1989). 4. Gospodarowicz D., et al., Nat. Câncer Insti. Mon. 48:109-130 (1978). 5. Davidson, J.M., et al., J. Cell Bio.100: 1219-1227 (1985) . 6. U. Franco, W. P., U. S. Pat. No. 4,296,100 (1981). 7. U. Franco, W. P., U.S. Pat. No. 4,378,347 (1983) 8. Walicke, P., Et al., Proc. Nat. Acac. Sei. USA 83: 3012-3016 (1986) 9. Esch, F., et al., Proc. Nat. Acad. Sei USA 82: 6507-6511 (1985) 10. Gospodarowicz, D. et al., U. S. Pat. No. 4,785,079 (1988). 11. Gospodarowicz, D. et al, U. S. Pat. No. 4,902782 (1990). 12. Iwane, M., et al., Biochem.' Biophys. Res. Commun. 146:470-477 (1987). 13. Squires, C.H., et al., J. Biol. Chem. 263: 16297-16302 (1988). 14. Barr, P.J., et al., Biol. Chem. 263:16471-16478 (1988). 15. Esch., F., et al., Eur. Pat. Appl. Pub. 281,822 (1988). 16. Seno, M., et al., Eur. Pat. Appl. Pub. 281,822 (1988) . 17. Arakawa, T. and Fox, G.M., Eur. Pat. Appl. Pub. 320,148. 18. Thomas and Linemeyer, Eur. Pat. Appl. Pub. 319,052 (1989) . 19. Seno, M., et al., Eur. Pat Appl. Pub. 326,907 (1989). 20. Fiddes, J. C., et al., Eur. Pat. Appl. Pub. 298,723 (1989) . 21. Bergonzoni, L., et al., Eur. Pat Appl. Pub. 3 63,67 5 (1989) / A. , 81, 22. Gospodarowicz, D., Cheng, J., Lui, G., Baird and Bohlen, P. (1984) Proc. Natl. Acad. Sei. 6963-6967. X . X / 23. Gospodarowicz. D. and Cheng, J. (1986) J. Cell. Physiol. 128, 475-484. 24. Sommer, A. and Rifkin, D.B. (1989) J. Cell. Physiol. 138. 215-220. 25. Damon, D.H. Lobb, R. R., D'Amore, P.A. , and Wagner, J.A. (1989) J. Cell. Physiol 138, 221-226. 26. Abraham, J.A., Whang, J. L., Tumolo, A., Mergia, A., Friedman, J., Gospodarowicz. D., and Fiddes, J.C. (1986) EMBO J. 5., 2523-2528. 27. Vlodavsky, I., Folkman, J., Sullivan, R., Fridman, R., Ishai-Michaeli, R., Sasse, J., and Klagsbrun, M. (1987) Proc. Natl. Acad. Sei. 84., 2292-2296. 28. Folkman, J., Klagsbrun, M., Sasse, J., Wadzinski, M.

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Wittwer, A.J. and Feder, J., (1986) Anal. Biochem 152, 136-140. 30

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTE: Andrew P. Seddon e Peter Bohlen (ii) TÍTULO DO INVENTO: Fragmentos Activos do Factor de Crescimento de Fibroblastos (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 3

(iv) ENDEREÇO DA CORRESPONDÊNCIA: (A) ENDEREÇADO A: Dr. Estelle J. Tsevdos, American Cyanamid Company (B) RUA: 1937 West Main Street, P.O. Box 60 (C) CIDADE: Stamford (D) ESTADO: Connecticut

(E) PAÍS: Estados Unidos da América (F) CÓDIGO: 06904-0060 (V) FORMA LEGÍVEL NO COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: Disco Flexível

(B) COMPUTADOR: IBM PC AT

(C) SISTEMA OPERATIVO: MS-DOS

(D) SOFTWARE: ASCII convertido a partir do Displaywrite 4 da IBM (vi) DADOS CONVENCIONAIS DO PEDIDO DE PATENTE: (A) NÚMERO DO PEDIDO: (B) DATA DE ENTREGA:

(vii) INFORMAÇÃO SOBRE O PROCURADOR/AGENTE (A) NOME: Dr. Tsevdos, Estelle J. (B) NÚMERO DE REGISTO: 31,145 (C) REFERÊNCIA/NÚMERO DO RESUMO: 31,309-00 (ix) INFORMAÇÃO PARA TELECOMUNICAÇÃO: (A) TELEFONE: 203 321 2756 (B) TELEFAX: 203 321 2971 (C) TELEX: 710 474 4059 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 132 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico

(C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iii) HIPOTÉTICO: (iv) ANTI-CODÃO: (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: (B) ESTIRPE: (C) ISOLADO INDIVIDUAL: (D) FASE DO DESENVOLVIMENTO: (E) HAPLÓTIPO: (F) TIPO DE TECIDO: (H) LINHA CELULAR: (I) ORGANELO: (vii) FONTE IMEDIATA: (A) BIBLIOTECA: (B) CLONE: (viii) POSIÇÃO NO GENOMA: (A) CROMOSSOMA/SEGMENTO: (B) POSIÇÃO NO MAPA: (C) UNIDADES: (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: (B) LOCALIZAÇÃO: (C) MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO: (D) OUTRA INFORMAÇÃO: (X) INFORMAÇÃO SOBRE A PUBLICAÇÃO: (A) AUTORES: (B) TÍTULO: (C) REVISTA: (D) VOLUME: (E) NÚMERO: (F) DATA: 34

34 J

(H) NÚMERO DO DOCUMENTO: (I) DATA DE ENTREGA: (J) DATA DE PUBLICAÇÃO: (K) RESÍDUOS IMPORTANTES: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 1 AAG GAC CCC AAG CGG CTG TAC TGC AAA AAC GGG GGC TTC Lis asp Pro Lis Arg Leu Tir Cis Lis Asn Gli Gli Fen 30 35 TTC CTG CGC ATC CAC CCC GAC GGC CGA GTT GAC GGG GTC Fen Leu Arg Ile His Pro Asp Gli Arg Vai Asp Gli Vai 40 45 50 CGG GAG AAG AGC GAC CCT CAC ATC AAG CTA CAA CTT CAA Arg Glu Lis Ser Asp Pro HÍS Ile Lis Leu Gin Leu Gin 55 60 GCA GAA GAG AGA Ala Glu Glu Arg 65 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 258 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples

(D) TOPOLOGIA: linear (XX) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (iii) HIPOTÉTICO: (iv) ANTI-CODÃO: (V) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: (B) ESTIRPE: (C) ISOLADO INDIVIDUAL: (D) FASE DO DESENVOLVIMENTO: (E) HAPLÓTIPO: (F) TIPO DE TECIDO: (G) TIPO DE CÉLULA: (H) LINHA CELULAR: (I) ORGANELO: 36

X (vii) FONTE IMEDIATA: (A) BIBLIOTECA: (B) CLONE: (viii) POSIÇÃO NO GENOMA: (A) CROMOSSOMA/SEGMENTO:

(B) POSIÇÃO NO MAPA: (C) UNIDADES: (ÍX) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: (B) LOCALIZAÇÃO: (C) MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO:

(D) OUTRA INFORMAÇÃO: (X) INFORMAÇÃO SOBRE A PUBLICAÇÃO: (A) AUTORES: (B) TÍTULO: (C) REVISTA: (D) VOLUME: 37

(E) NÚMERO: (F) DATA: (H) NÚMERO DO DOCUMENTO: (I) DATA DE ENTREGA: (J) DATA DE PUBLICAÇÃO:

I (K) RESÍDUOS IMPORTANTES: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 2:

38

GGA GTT GTG TCT ATC AAA GGA GTG TGT GCT AAC CGG TAC Gli Vai Vai Ser Ile Lis Gli Vai Cis Ala Asn Arg Tir 70 75 80 CTG GCT ATG AAG GAA GAT GGA AGA TTA CTG GCT TCT AAA Leu Ala Met Lis Glu Asp Gli Arg Leu Leu Ala Ser Lis 85 90 95 TGT GTT ACG GAT GAG TGT TTC TTT TTT GAA CGA TTG GAA Cis Vai Tre Asp GlU Cis Fen Fen Fen Glu Arg Leu Glu 100 105 TCT AAT AAC TAC AAT ACT TAC CGG TCT AGA AAA TAC ACC Ser Asn Asn Tir Asn Tre Tir Arg Ser Arg Lis Tir Tre 110 115 120 AGT TGG TAT GTG GCA TTG AAA CGA ACT GGG CAG TAT AAA Ser trp Tir Vai Ala Leu Lis Arg Tre Gli Gin Tir Lis 125 130 CTT GGT TCC AAA ACA GGA CCT GGG CAG AAA GCT ATA CTT Leu Gli Ser Lis Tre Gli Pro Gli Gin Lis Ala Ile Leu 135 140 145 TTT CTT CCA ATG TCT GCT AAG AGC Fen Leu Pro met Ser Ala Lis Ser 150 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 3:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA 39 *>

(A) COMPRIMENTO: 258 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA

(iii) HIPOTÉTICO: (iv) ANTI-CODÃO: (V) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: (B) ESTIRPE: (C) ISOLADO INDIVIDUAL:

J (D) FASE DO DESENVOLVIMENTO: (E) HAPLÓTIPO: (F) TIPO DE TECIDO: (G) TIPO DE CÉLULA:

(H) LINHA CELULAR 40 ·«?

'w·

I

(I) ORGANELO: (vii) FONTE IMEDIATA: (A) BIBLIOTECA: (B) CLONE: (viii) POSIÇÃO NO GENOMA: (A) CROMOSSOMA/SEGMENTO: (B) POSIÇÃO NO MAPA: (C) UNIDADES: (ÍX) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: (B) LOCALIZAÇÃO: (C) MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO: (D) OUTRA INFORMAÇÃO: (x) INFORMAÇÃO SOBRE A PUBLICAÇÃO: (A) AUTORES: (B) TÍTULO: (C) REVISTA:

(D) VOLUME (E) NÚMERO: (F) DATA: (H) NÚMERO DO DOCUMENTO: (I) DATA DE ENTREGA: (J) DATA DE PUBLICAÇÃO: (K) RESÍDUOS IMPORTANTES: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 3 » ( )

GGA GTT GTG TCT ATC AAA GGA GTG TCT GCT AAC CGG TAC Gli Vai Vai Ser Ile Lis Gli Vai Ser Ala Asn Arg Tir 70 75 80 CTG GCT ATG AAG GAA GAT GGA AGA TTA CTG GCT TCT AAA Leu Ala met Lis Glu Asp Gli Arg Leu Leu Ala Ser Lis 85 90 95 TGT GTT ACG GAT GAG TGT TTC TTT TTT GAA CGA TTG GAA Cis Vai Tre Asp Glu Cis Fen Fen Fen Glu Arg Leu Glu 100 105 TCT AAT AAC TAC AAT ACT TAC CGG TCT AGA AAA TAC ACC Ser Asn Asn Tir Asn Tre Tir Arg Ser Arg Lis Tir Tre 110 115 120 AGT TGG TAT GTG GCA TTG AAA CGA ACT GGG CAG TAT AAA Ser Trp Tir Vai Ala Leu Lis Arg Tre Gli Gin Tir Lis 125 130 CTT GGT TCC AAA ACA GGA CCT GGG CAG AAA GCT ATA CTT Leu Gli Ser Lis Tre Gli Pro Gli Gin Lis Ala Ile Leu 135 140 145 TTT CTT CCA ATG TCT GCT AAG AGC Fen Leu Pro Met Ser Ala Lis Ser 150 155

Claims (6)

1. REIVINDICAÇÕES: ia. - Processo para a preparação de um fragmento de factor de crescimento de fibroblastos (bFGF) básico que se liga â heparina, heparina-Sepharose ou análogos de cada um deles, sozinho ou em combinação com outros fragmentos de FGF, caracteri-zado por compreender uma síntese de proteínas recombinante que envolve a preparação de DNA que codifica os fragmentos de bFGF, a inserção do DNA num vector, a expressão do vector em células hospedeiras, e o isolamento dos fragmentos de bFGF recombinante assim produzidos. 2ã. - Processo de acordo com a Reivindicação 1, carac-terizado por se preparar um fragmento de factor de crescimento de fibroblastos básico, em que o referido fragmento compreende aproximadamente os aminoácidos 27 a 69 do factor de crescimento de fibroblastos básico ou aproximadamente os aminoácidos 70 a 155 do factor de crescimento de fibroblastos básico.
2. 33. - Processo de acordo com a Reivindicação 1, carac-terizado por se preparar um fragmento de factor de crescimento de fibroblastos básico, em que o referido fragmento é mitogénico.
3. 48. - Processo de acordo com a Reivindicação 3, carac-terizado por se preparar um fragmento do factor de crescimento de fibroblastos básico, em que o referido fragmento compreende aproximadamente os aminoácidos 70 a 155.
4. 58. - Processo de acordo com a Reivindicação 1, carac-terizado por se preparar um fragmento do factor de crescimento de fibroblastos básico, em que as císteinas nas posições 78 e 96 são substituídas por alanina, glicina, arginina, triptofano, lisina, ácido aspártico, ácido glutâmico, asparagina, glutamina, histidi-na, isoleucina, leucina, valina, fenilalanina, tirosina, metioni-na, serina, treonina ou prolina. 6â. - Processo de acordo com a Reivindicação 5, carac-terizado por se preparar um fragmento do factor de crescimento de fibroblastos básico, em que as císteinas nas posições 78 e 96 são substituídas por serina. 7â. - processo de acordo com a Reivindicação 2, carac-terizado por se preparar um fragmento do factor de crescimento de fibroblastos básico, em que as císteinas nas posições 78 e 96 são substituídas por alanina, glicina, arginina, triptofano, lisina, ácido aspártico, ácido glutâmico, asparagina, glutamina, histidi-na, isoleucina, leucina, valina, fenilalanina, tirosina, metioni-na, serina, treonina ou prolina. 8a. - Processo de acordo com a Reivindicação 7, carácter izado por se preparar um fragmento do factor de crescimento de fibroblastos básico, em que as císteinas nas posições 78 e 96 são substituídas por serina. 9â. - processo para a preparação de uma sequência de DNA que codifica um fragmento de um factor de crescimento de fibroblastos básico, em que o referido fragmento se liga à heparina, heparina-Sepharose ou análogos de cada um deles, sozinho ou em combinação com outros fragmentos do factor de crescimento de fibroblastos básico e uma sequência de DNA que hibridará em condições restringentes com uma sequência de DNA que codifica um factor de crescimento básico de fibroblastos recombi-nante, em que o referido fragmento se liga à heparina, heparina--Sepharose ou seus análogos, caracterizado por se proceder a alterações no cõdigo genético de uma sequência de DNA de partida, 45

   por meio de deleção de nucleotideos, adição de nuclotídeos ou mutações pontuais, as quais são produzidas utilizando métodos padrão. I I 10a. - Processo de acordo com a Reivindicação 9, caracterizado por se preparar uma sequência de DNA, em que a referida sequência de DNA codifica um fragmento de factor de crescimento de fibroblastos básico tendo aproximadamente os aminoácidos 26 a 69 ou aproximadamente os aminoácidos 70 a 155 do factor de crescimento de fibroblastos básico. li a. - Processo de acordo com a Reivindicação 9, caracterizado por se preparar uma sequência de DNA, em que a referida sequência de DNA codifica um fragmento do factor de crescimento de fibroblastos básico, sendo o referido fragmento mitogénico. 12a. - Processo de acordo com a Reivindicação 11, caracterizado por se preparar uma sequência de DNA, em que a referida sequência de DNA codifica um fragmento do factor de crescimento de fibroblastos básico tendo aproximadamente os aminoácidos 70 a 155 do factor de crescimento de fibroblastos básico. I 13a. - Processo de acordo com a Reivindicação 9, caracterizado por se preparar uma sequência de DNA, em que a referida sequência de DNA codificadora das cisteinas nas posições 78 e 96 é substituída por uma sequência de DNA codificadora de J alanina, glicina, arginina, triptofano, lisina, ácido aspártico, ácido glutâmico, asparagina, glutamina, histidina, isoleucina, leucina, valina, fenilalanina, tirosina, metionina, serina, treonina ouprolina. 14a. - processo de acordo com à Reivindicação 13, caracterizado por se preparar uma sequência de DNA, em que as referidas posições do DNA 78 e 96 são substituídas por uma sequência de DNA codificadora de serina. 15 ã. - Processo de acordo com a Reivindicação 10, caracterizado por se preparar uma sequência de DNA, em que a referida sequência de DNA codificadora das císteinas nas posições 78 e 96 é substituída por uma sequência de DNA codificadora de alanina, glicina, arginina, triptofano, lisina, ácido aspártico, ácido glutâmico, asparagina, glutamina, histidina, isoleucina, leucina, valina, fenilalnina, tirosina, metionona, serina, treonina ou prolina. 16a. - Processo de acordo com a Reivindicação 15, caracterizaodo por se preparar uma sequência de DNA de acordo com a Reivindicação 15, em que a referida sequência de DNA codificadora de císteinas nas posições 78 e 96 é substituída por uma sequência de DNA codificadora de serina. 3. - Processo de acordo com a Reivindicação 11, caracterizado por se preparar uma sequência de DNA, em que a referida sequência de DNA codificadora de císteinas nas posições 78 e 96 é substituída por uma sequência de DNA codificadora de alanina, glicina, arginina, triptofano, lisina, ácido aspártico, ácido glutâmico, asparagina, glutamina, histidina, isoleucina, leucina, valina, fenilalanina, tirosina, metionina, serina, treonina ou prolina. 18a. - Processo de acordo com a Reivindicação 17, caracterizado por se preparar uma sequência de DNA, em que a referida sequência de DNA codificadora de císteinas nas posições 47

   78 e 96 é substituída por uma sequência de DNA codificadora de serina. i
5. 193. - Processo de acordo com a Reivindicação 12, caracterizado por se preparar uma sequência de DNA, em que a referida sequência de DNA codificadora das císteinas nas posições 78 e 96 é substituída por uma sequência de DNA codificadora de alanina, glicina, arginina, triptofano, lisina, ácido aspártico, ácido glutâmico, asparagina, glutamina, histidina, isoleucina, leucina, valina, fenilalanina, tirosina, metionina, serina, treonina ou prolina.
6. 203. - Processo de acordo com a Reivindicação 19, caracterizado por se preparar uma sequência de DNA, em que a referida sequência de DNA codificadora de císteinas na posição 78 e 96 é substituída por uma sequência de DNA codificadora de serina. Lisboa, 21 de Novembro de 1991

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