JP2888575B2 - ヒト／ウシ塩基性線維芽細胞成長因子の新規誘導体 - Google Patents

ヒト／ウシ塩基性線維芽細胞成長因子の新規誘導体

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、組換えDNA技術により製造するための塩基
性線維芽細胞成長因子（bFGF）の新規の分子物質誘導
体、関連する発現プラスミド及びDNAコード配列に関す
る。本発明の新規分子bFGF変形体は、血管形成過程（an
giogenic process）において野生型分子の拮抗物質及び
／又は超作働物質（superagonists）として利用し得
る。これらの新規分子及び野生型bFGFの製造に関する本
発明の明細書中に開示される方法は、ヒト及びウシbFGF
並びにそれらの誘導体をコードするヌクレオチド配列を
保有するプラスミドで形質転換されたE.coliの組換え株
に基づいている。
緒言 毛細血管形成は、多数の重要な生物学的過程、例えば
器官発生及び創傷治癒のような生理学的過程あるいは腫
瘍成長のような病理学的過程において起こる（Denekamp
J:腫瘍内で攻撃され易い要素としての血管内皮,Acta R
adiol.（oncol）23 p.217−225,1984;Hobson BとDeneka
mp J:腫瘍及び正常組織内の内皮増殖：連続的標識研究,
Br.J.Cancer49 p.405−413,1984;Folkman J:腫瘍血管形
成,Adv.Cancer Res.43 p.175−203,1985）。
血管新生に導く事象の順序は形態学的に特徴が明らか
にされているが、一方この過程が生じる分子機構は依然
としてよく分かっていない。毛細血管内皮における成長
の制御は、通常これらの細胞が血管形成過程で増殖を引
き金とする静止性単層（static monolayer）を形成する
ために、非常に厳重なものであると思われる（Folkman
J:腫瘍血管形成,Adv.Cancer Res.43 p.175−203,1985;J
oseph−Silverstein J.とRifkin B.D.:内皮細胞成長因
子と血管壁,Seminars in Thromb.and Hemost,13 p.504
−513,1987）。
内皮細胞の常態的静止性は、血漿中に内皮細胞因子が
明らかに欠如していることによって部分的に説明し得
る。事実、主な内皮細胞のミトゲン（有糸分裂促進物
質）は血漿中に見出されないが、それらのミトゲンは調
べたほとんどすべての組織の抽出物中、並びに多数の正
常及び腫瘍細胞系中に存在する（Joseph−Silverstein
J.とRifkin B.D.:内皮細胞成長因子と血管壁,Seminars
in Thromb.and Hemost.13 p.504−513,1987;Folkman J;
とKlagsbrun M.:血管形成因子,Science,235 p.442−44
7,1987）。
したがって、急速な内皮細胞増殖の限局性誘発は、環
境刺激に反応して細胞から内皮細胞ミトゲンを放出する
ことを伴う可能性がある。
内皮細胞ミトゲンを最もよく特徴づけるものは、塩基
性線維芽細胞成長因子（bFGF）を含むポリペプチド成長
因子のファミリーであって、これらはヘパリンに対する
高い親和性のためにヘパリン結合成長因子として公知で
ある（Thomas K.:線維芽細胞成長因子,FASEB J.,1 p.43
4−440,1987;Gospodarowicz D.,Neufeld G.及びSchweig
erer L.,線維芽細胞成長因子：構造的及び生物学的性
質,J.Gell.Physiol.,5 p.15−26,1987）。
塩基性FGFは、大半は、中胚葉又は神経外胚葉から誘
導された組織又は細胞から精製されてきた。構造研究か
ら、bFGFは146個のアミノ酸から成る一本鎖ポリペプチ
ドであって、最初の10〜20個のアミノ酸を欠いたNH2末
端切頭形態（NH2−terminally truncated forms）で存
在し得る。切頭形態のFGFは、放射標識レセプターの結
合及び生物学的アッセイによって立証されるように、無
傷のbFGFと同様の効力を有する（Gospodarowicz D.,Neu
feld G.及びSchweigerer L.:線維芽細胞成長因子,Mol.C
ell.Endocrin.46 p.187−206,1986;Gospodarowicz D.,N
eufeld G.及びSchweigerer L.:線維芽細胞成長因子の分
子的及び生物学的特徴：中胚葉及び神経外胚葉誘導細胞
の増殖と分化をも調節する血管形成因子,Cell.Differ.,
19 p.1−17,1986;Thomas K.とGimenez−Gallego G.:線
維芽細胞成長因子：強力な血管形成活性をもつ広範なス
ペクトルのミトゲン,Trends Biochem.Sci.11 p.81−84,
1986）。
さらに、プロテアーゼ阻害剤を包含させたホモジナイ
ズされた組織からの抽出物を酸性から中性に置換し精製
プロトコルを変更すると、より長い154残基の形態のも
のが生じた（Ueno N.,Baird A.,Esch F.,Ling N.及びCu
illemin R.:塩基性線維芽細胞成長因子のアミノ末端伸
長型の単離,Biochem.Biophys,Res.Commun.,138 p.580−
588,1986;Story M.T.Esch.F.,Shimasaki S.,Sasse J.,J
acobs S.C.及びLawson R.K.:ヒト前立腺肥大組織から単
離された大きい型の塩基性線維芽細胞成長因子のアミノ
末端配列,Biochem Biophys.Res.Commun.142, p.702−70
9,1987;Klagsbrun M.,Smith S.,Sullivan R.,SHing Y.,
Davidson S.,Smith J.A.及びSasse J.:多型塩基性線維
芽細胞成長因子：腫瘍細胞及び脳細胞から誘導された酸
性プロティナーゼによるアミノ末端開裂,Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA 84 p.1839−1843,1987）。
観察されたFGFの微小不均質性（microheterogeneit
y）は、少なくとも一部は、in vivoで又は精製中に起こ
るアミノ末端付近の部分的蛋白質分解によるものと思わ
れる。しかしながら、種々の型は同等に活性であると思
われるため、微小不均質性はおそらく生理学的には無関
係であると考えられる。
塩基性FGFは、進化によって非常によく保存されてき
た。例えば、ウシ及びヒトbFGFは、その146個のアミノ
酸のうち２つだけが異なり、98.7％の全アミノ酸配列相
同性を示す（Gospodarowicz D.,Neufeld G.及びSchweig
erer L.:線維芽細胞成長因子の分子的及び生物学的特
徴：中胚葉及び神経外胚葉誘導細胞の増殖と分化をも調
節する血管形成因子,Cell.Differ.,19 p.1−17,198
6）。
bFGFに関連するものは酸性FGF（aFGF）であるが、こ
れはbFGFと55％の全配列相同性を共有する。酸性FGF
は、最初の６個のアミノ酸を欠いたNH2末端切頭形態で
も存在し得る140個のアミノ酸からなるポリペプチドで
ある（Gimenez−Gallego G.,Conn G.,Hatcher V.B.及び
Thomas K.A.:ヒト脳誘導酸性線維芽細胞成長因子の完全
アミノ酸配列,Biochem.Biophys.Res.Commun,138, p.611
−617,1986）。
塩基性FGF及び酸性FGFは、ヘパリンに対する２つの可
能な結合ドメインを有するが、その一方はNH2末端付近
に、他方はCOOH末端付近に位置する。両ドメインとも、
ヘパリンに対するFGFの強い親和性と関係している（Gos
podarowicz D.,Neufeld G.及びSchweigerer L.:線維芽
細胞成長因子,Mol.Cell.Endocrin.46 p.187−206,1986;
Gospodarowicz D.,Neufeld G.及びSchweigerer L.:線維
芽細胞成長因子の分子的及び生物学的特徴：中胚葉及び
神経外胚葉誘導細胞の増殖と分化をも調節する血管形成
因子,Cell.Differ.,19 p.1−17,1986;Baird A.,Schuber
t D.,Ling N.,及びGullemin R.,塩基性線維芽細胞成長
因子のレセプター−及びヘパリン−結合ドメイン,Proc.
Natl.Acad.Sci.U.S.A.85,p.2324−2328,1988）。
aFGFとbFGFとの間の高い相同性は、それらが単一祖先
の遺伝子に由来することを示唆している。近年、FGF遺
伝子がクローン化され、bFGF及びaFGFの両方の相補性DN
A配列が決定された（Abraham J.A.Whang J,L.Tumolo
A.,Mergia A.,Friedman J.,Gospodarowicz D.及びFidde
s J.C.:ヒト塩基性線維芽細胞成長因子：ヌクレオチド
配列とゲノム構成,EMBO J.,5p.2523−2528,1986;Abraha
m J.A.,Mergia A.,Whang J.L.Tumolo A.,Friedam J.,Hj
errild K.A.,Gospodarowicz D.及びFiddes J.C.:血管形
成タンパク質塩基性線維芽細胞成長因子をコードするウ
シクローンのヌクレオチド配列,Science233,p545−548,
1986;Jaye M.,Howk R.,Burgess G.A.,Ricca W.,Chiu I.
M.,Ravera M.W.,O′Brien S.J.,Modi W.S.,Maciag T.及
びDrolian W.N.:ヒト内皮細胞成長因子：クローニン
グ，ヌクレオチド配列及び染色体上の位置,Science233,
p.541−545,1986）。
ヒト及びウシcDNAクローンのヌクレオチド配列の分析
から、塩基性FGFに関する一次翻訳物質が155個のアミノ
酸から成ることが示唆される。しかしながら、近年、So
mmerらは、NH2末端に２個の余分なアミノ酸を有する新
規の157個のアミノ酸からなる型（157アミノ酸型）のヒ
ト塩基性FGFを単離した（Sommer A.,Brewer M.T,Thomps
on R.C.,Moscatelli D.,Presta M.及びRifkin D.B.:伸
長されたアミノ末端をもつ型のヒト線維芽細胞成長因
子,Biochem Biophys.Res.Commun.,144 p.543−550,198
7）。
興味深いことに、これら２つのアミノ酸は、前記のヒ
トcDNAクローンにおいて判明したコドンに対応する。第
１図は、今日までに単離された、もしくはcDNA配列によ
り推定された種々の型の塩基性FGFを要約して示してい
る。第２図は、155アミノ酸型の一次構造を示す。
上述のように、本発明はヒト塩基性FGFの分子変形体
に関する。これまで天然で見出されたことのないこれら
新規分子物質は、155アミノ酸型をコードする遺伝子の
特定部位の突然変異誘発によって得られた。
しかしながら、塩基性FGFのアミノ末端の微小不均質
性とそれが生理学的関係をもたないこととは、155アミ
ノ酸型に関して本発明に開示し且つ記載した変更が、お
そらくは他の型のFGFに関して得られる同一の変更と等
しいことを示す（以下参照）。
発明の背景 すでに指摘した通り、血管形成（angiogenesis）は、
それが充実性腫瘍（solid tumor）の発症に関与する病
理学的意味を仮定し得る厳密に制御された過程である。
血管形成におけるbFGFの重要な役割に顧みて、一方では
生物学的に不活性である、内因性FGFと競合できるこの
分子の変形体は、抗癌療法における有用な道具となり得
る。
一方、新しい毛細血管成長は再生、成長及び発達の基
礎となる正常な恒常性機構を根拠にしている。その結果
として、生物学的活性が増大したbFGFの類似体は、火
傷、創傷（角膜を含む）、及び外科的切開の治癒；褥瘡
を含む皮膚潰瘍の治癒；損傷組織の血管再生による、心
臓発作後の血流再開；並びにある種の骨格筋損傷の治療
のような多くの可能な適用が広範に考えられる。
したがって、本発明の目的は、改変された生物学的活
性を有する塩基性FGFの組換え類似体の設計及び製造で
ある。塩基性FGFのアミノ酸配列の変化がその機能特性
に影響を及ぼし得ることを理解するために、塩基性FGF
と非常に高い相同性を有する多数の関連蛋白質を考える
ことができる。このファミリーの蛋白質としては、酸性
FGF、並びに最近発見された２つの腫瘍遺伝子産物であ
るhst及びint−２が挙げられる（Yoshida T.,Miyagawa
K.,Odagiri H.,Sakamoto H.,Little P.F.R.,Terada M.
及びSugimura T.:hstのゲノム配列、線維芽細胞成長因
子に相同なタンパク質をコードする形質転換遺伝子、お
よびint−２をコードするタンパク質,Proc.Natl.Acad.S
ci.USA.84 p.7305−7309,1987;Delli Bovi P.,Curatola
A.M.,Kern F.G.,Greco A.,Ittmann M.及びBasilico
C.:カポジ肉腫DNAのトランスフェクションにより単離さ
れた腫瘍遺伝子はFGFファミリーの一員である成長因子
をコードする,Cell50 p.729−737,1987）。
bFGFを含むこれらの分子は全て、細胞の成長及び調節
に関与する因子のファミリーを構成する。これら蛋白質
の一次構造を第３図で比較する。
これらの蛋白質間の相同性を考慮した場合、一次構造
中に高度に保存された領域が観察される。このようなド
メインの保存は、これら蛋白質間の構造的相同性のみな
らず何らかの機能的相同性をも意味する。
事実、これらの蛋白質は全て、ヘパリンに対する強力
な親和性を共有しており、おそらくは腫瘍発症を支持す
る新しい毛細血管増殖を含むものと思われる血管形成過
程において重要な役割を演じると考えられる。
保存領域がこれらの蛋白質の共通の特性に関与してい
る場合には、非常に多種類の配列がこれらの因子の異な
る生物学的役割を説明し得る。その結果、これらの領域
の何れかにおける変化は、塩基性FGFの生物学的活性に
劇的に影響する。
これらを考慮して、本発明の発明者らは、遺伝子操作
技術により、ヒト及びウシ塩基性FGFの新規誘導体を構
築したが、これらは、ある場合にはbFGF分子の異なる領
域内でアミノ酸配列を喪失し、またある場合には特定位
置でアミノ酸置換が生じていた。その改変は、いくつか
の公知の成長因子間の相同性及び差異に従って選択し
た。突然変異体の分子特性を以下に記す。類似体は、選
択された発現系中で組換え蛋白質として得ることができ
る。
所望の変化は、適切な生物内での発現に先立って、bF
GF遺伝子を遺伝子工学技術により改変して達成し得る。
bFGF遺伝子というのは、cDNAライブラリーからクローニ
ングすることにより、又は合成オリゴヌクレオチドを組
合せることによって得られるDNA配列を意味する（Mania
tis T.,Frisch E.F.及びSambrook J.:分子クローニング
／実験室指針,Cold Spring Harbour Laboratory,Cold s
pring Harbour,NY,1982）。
本発明はまた、bFGF及びその誘導体を製造するための
組換えDNA法にも関する。
突然変異体の分子特性 本発明においては、「類似体」、「突然変異体」、又
は「誘導体」という用語は、変化したアミノ酸配列を有
するbFGF分子を意味する。これまでに単離され且つ緒言
に記載されている天然型のbFGFは全て、等価な類似体を
得るために変えることができる。好ましい類似体は、15
5アミノ酸からなる型の突然変異体である。ヒト及びウ
シの配列はともに、本発明において改変された。新規の
bFGF誘導体は、特定オリゴヌクレオチドの突然変異誘発
により構築された。
特に、オリゴヌクレオチドは、ヒト及びウシbFGF遺伝
子内のコード領域の欠失を引き起こすために、設計し合
成された。突然変異体を得るために用いる突然変異誘発
法は、『方法』の項に記載する。
次に、突然変異させた遺伝子を、新規のbFGF誘導体の
合成に導くことが可能なE.coli発現ベクター内に挿入す
る。次に組換え分子を精製し、特性を決定し、最後に大
量に製造する。
本発明の目的の１つである新規のbFGF誘導体について
は、詳細に後述するが、第４図にその概略を図示した。
アミノ酸番号は155アミノ酸型に対応しており、メチオ
ニンは残基番号１であり、セリンは残基番号155であ
る。しかしながら、記載した全てのbFGFは、同一欠損体
を得るために変化させることが可能である。さらに、ウ
シ型及びヒト型の両方が突然変異体の構築に使用し得
る。好ましいbFGF誘導体として以下のものが挙げられ
る： M1−bFGFはアミノ酸配列の残基27〜32（Lys−Asp−Pro
−Lys−Arg−Leu）を欠いたbFGF誘導体である； M2−bFGFはアミノ酸配列の残基54−58（Glu−Lys−Ser
−Asp−Pro）を欠いたbFGF誘導体である； M3−bFGFはアミノ酸配列の残基70〜75（Gly−Val−Val
−Ser−Ile−Lys）を欠いたbFGF誘導体である； M4−bFGFはアミノ酸配列の残基78〜83（Cys−Ala−Asn
−Arg−Tyr−Leu）を欠いたbFGF誘導体である； M5−bFGFはアミノ酸配列の残基110〜120（Asn−Asn−Ty
r−Asn−Thr−Tyr−Arg−Ser−Arg−Lys−Tyr）を欠い
たbFGF誘導体である； M6a−bFGFはそれぞれ128位及び129位のリシン及びアル
ギニン残基がグルタミン残基によって置換されたbFGF誘
導体である； M6b−bFGFは119位及び128位のリシン残基、並びに118位
及び129位のアルギニン残基が全てグルタミン残基によ
って置換されたbFGF誘導体である。
突然変異体の詳細なアミノ酸配列を第５図に示す。
さらに別のアミノ酸配列をNH2末端か又はCOOH末端、
あるいはその両方に付加したポリペプチドは、本発明に
含まれるものとする。このような伸長は、組換えDNA技
術による突然変異体の発現においては、技術的理由のた
めに必要である（Courtney M.,Jallat S.,Tessier L.H.
Benavente A.及びCrystal R.G.:気腫及び血栓症の治療
を可能とするアルファル（alfal）−抗トリプシン変形
体の、E.coli内での合成,Nature,313,p.149−151,1985,
Nagai K.とThogersen H.C.:E.coli内で産生されるハイ
ブリッドタンパク質の配列特異的タンパク質分解による
β−グロビンの生成,Nature,309,p.810−812,1984）。
或いは、さらに別の残基を用いて、例えば血漿中の突
然変異体の循環半減期を延長することにより、突然変異
体の薬理学的効能を増強してもよい。
突然変異体製造のために開発された手法の詳細 新規のbFGF誘導体を効率よく製造するために、異なる
分子の生物学的及び臨床的評価のための必要量の、実験
室及びパイロットスケールでの製剤を供給する組換えDN
A法を開発した。
この手法は、遺伝子工学技術により高レベルで突然変
異遺伝子を発現するように改変されたE.coli株の発酵に
基づいている。
製造方法の詳細を以下に示す： １）bFGF用の合成DNA配列の構築 野生型塩基性FGF及びその誘導体の発現のために用い
た配列は全て合成により構築した。これは、Applied Bi
osystem Inc.380Bモデルのような自動DNAシンセサイザ
ー上で重複配列をもつオリゴヌクレオチドを合成するこ
とにより行った（Caruthera M.H.:遺伝子合成機;DNA化
学とその用途,Science,230,p.281−285,1985）。
重複しているオリゴヌクレオチドを結合させて二本鎖
DNAを形成し、そのギャップをDNAポリメラーゼ及びT4リ
ガーゼを用いて充填した。
センス鎖内のFGFコード配列の５′に直ちに、ATG開始
信号が付加された。155アミノ酸型のbFGFの場合、最初
の残基として自然に生起しているメチオニンをコードす
るATGを開始コマンドとして用い得ることができるの
で、発現されるポリペプチドのＮ末端に余分のアミノ酸
を付加することはない（Abraham J.A.,Whang J.L.,Tumo
lo A.,Mergia A.,Friedman J.,Gospodarowicz D.及びFi
ddes J.C.:ヒト塩基性線維芽細胞成長因子：ヌクレオチ
ド配列とゲノム構成,EMBO J.,5,p.2523−2528,1986;Abr
aham J.A.,Mergia A.,Whang J.L.,Tumolo A.,Friedman
J.,Hjerrild K.A.,Gospodsrowicz D.及びFiddes J.C.:
血管形成タンパク質塩基性線維芽細胞成長因子をコード
するウシクローンのヌクレオチド配列,Science233,p545
−548,1986）。
或いは、E.coli内でのFGFの発現を増大させるため
に、この蛋白質の一次構造を変えることなく、その５′
−端配列を変えた。さらに、ヌクレオチド配列を、第６
図に示すと同様に改変した。
２）bFGF誘導体に対する突然変異配列の構築 本発明に記載の突然変異体を得るために、野生型bFGF
配列を変えて所望の欠失を達成した。これは、特定部位
の突然変異誘発により遺伝子を改変して達成した（Norr
is K.,Norris F.,Christiansen L.及びFiil N.:2個のプ
ライマーの同時使用による効率的な特定部位の突然変異
誘発,Nucleic Acid Research,11,5103−5112,1983）。
この方法の原理は、ファージベクターM13のような、
一本鎖型で得ることができるベクター中にbFGF遺伝子を
サブクローン化することである。組換え一本鎖を、所望
の変形体をコードする相補的合成オリゴデオキシリボヌ
クレオチドでアニールする。次にDNAポリメラーゼ及び
リガーゼを用いて新しい鎖を伸長し、それを環状型に連
結する。新たに作製されたヘテロ二重鎖DNAを用いて、
子孫を複製し、産生し得る細胞系を形質転換するが、こ
の場合、野生型遺伝子又は所望の欠失を有する遺伝子を
保持するファージは２つの異なる分子種に分離する。
次に、出発突然変異誘発性オリゴヌクレオチドをプロ
ーブとして用いて突然変異遺伝子を認識することができ
る。特定部位の突然変異誘発法は、『方法』の項に詳細
に記載する。
特に、択一的にウシ又はヒト野生型bFGFに対する合成
配列をM13ベクター内に挿入し、得られた一本鎖を突然
変異誘発鋳型として用いた（Norris K.,Norris F.,Chri
stiansen L.及びFiil N.:2個のプラマーの同時使用によ
る効率的な特定部位の突然変異誘発,Nucleic Acid Rese
arch,11,5103−5112,1983）。
３）野生型bFGF及びその誘導体の発現 E.coliの組換え株中でbFGFの野生型配列及び突然変異
配列を発現させるために、これらの配列を、新規遺伝子
の転写及び翻訳に関与する配列を保有する発現プラスミ
ドに挿入した。より詳しくは、調節シグナルとして、E.
coliのトリプトファンプロモーター及びラムダCII蛋白
質のリボソーム結合部位領域を用いた（Hendrix R.W.,R
oberts J.W.,Stahl F.W.及びWeisberg R.A.:ラムダII,C
old Spring Harbour Laboratory,Cold Spring Harbour,
N.Y.1983）。
プロモーターPtrpは、市販のプラスミドpDR720（Phar
macia）から得られた。Shine−Dalgarno CII配列は、公
表された配列に従って化学合成により得られた（Hendri
x R.W.,Roberts J.W.,Stahl F.W.,及びWeisberg R.A.:
ラムダII,Cold Spring Harbour Laboratory,Cold Sprin
g Harbour,N.Y.1983）。
野生型bFGF及びその誘導体用の典型的な発現ベクター
を第７図に示す。より詳しくは、それは、以下の断片を
組合せて構築した： ａ）プラスミドpDS20の大きなEcoRI−BamHI断片（Duest
er G.,Elford R.M.及びHolmes W.N.:gal−κ遺伝子への
大腸菌ロイシルトランスファーRNA−Ｉプロモーターの
融合／増殖速度依存性制御に必要な配列の分析,Cell 3
0,p.855−964,1982）； ｂ）トリプトファンプロモーターを保持する、プラスミ
ドpDR720（Pharmacia,スウェーデン）から得られるEcoR
I−SalI断片； ｃ）cIIリポソーム結合部位をコードする合成SalI−Nde
Iオリゴヌクレオチド； ｄ）bFGF及びその誘導体に対する野生型配列又は突然変
異配列を保持する合成NdeI−XhoII（BamHI−適合性）断
片。
野生型bFGFに対する好ましい配列を第６図に示す。bF
GF類似体に対する好ましい配列、第５図に示した突然変
異に従ってこの配列を改変したものである。
新規遺伝子の発現誘発、及び得られた組換え蛋白質の
分析は、『方法』の項に記載したようにして実施した。
４）組換え分子の精製及び生物学的アッセイ 組換え突然変異体は、細菌溶解物から精製し、野生型
bFGFと比較してそれらの生物学的特性を調べることがで
きる。
典型的な精製方法は以下の通りである：細胞を超音波
処理により破砕し、遠心分離して、その上清をイオン交
換Ｓ−セファロースカラムに載せる。蛋白質を塩化ナト
リウム勾配により溶出し、直接、ヘパリン−セファロー
スアフィニティカラムに載せる。
蛋白質を塩化ナトリウム勾配により溶出し、ゲル過
により脱塩し、凍結乾燥する。精製類似体を、引き続い
て、その生物学的活性に関して調べることができる。
突然変異体の性質、その用途及び投与 本発明の新規分子は、野生型bFGF分子の拮抗薬及び／
又は超作働薬として作用し得る。
bFGF作働活性は、例えばPrestaら（Moleular and Cel
lular Biol.6,p.4060,1986）が記載したものと類似の試
験手順に従って、内皮細胞の増殖を増大させる能力に基
づいて評価された。bFGF拮抗活性は、例えばBairdら（P
roc.Natl.Acad.Sci.USA.85,p.2324,1988）が記載したも
のと類似の試験手順に従って、125I−bFGFの結合阻害に
基づいて評価された。
したがって、例えば略号M6bとして識別される本発明
の化合物は、1ng/mlの用量で内皮細胞増殖を50％増大さ
せることが判明したが、これは特にかなりのbFGF作働活
性を示す。
さらに、例えばM3−bFGF及びM6aとして識別される本
発明の化合物は、300ng/mlの突然変異体の存在下で、そ
れぞれ約20％及び約70％の125I−bFGF（3ng/ml）結合阻
害を生じさせることが判明したが、これはbFGF拮抗活性
を示す。
bFGF超作働薬として、本発明の化合物は、血管形成、
細胞成長、又は細胞生存のプロモーターとして作用し得
るし、したがって、例えば、組織修復、例えば虚血及び
心筋梗塞の間の組織修復を含む、創傷、火傷、骨折、外
科的剥離、潰瘍の治癒に適用できる。
bFGFの拮抗薬として、本発明の化合物は血管形成阻害
剤として作用し、したがって、血管新生が主因である疾
患、例えば眼の網膜症；血管新生緑内障；例えば乾癬、
慢性炎症のような皮膚疾患；リュウマチ性関節炎の治療
に、並びに既に前記したように、ある種の腫瘍、特に血
管形成新生物の治療に腫瘍性血管形成を阻害するための
有用な道具として用いてもよい。
本発明の化合物は、１種以上の医薬上許容可能な担体
及び／又は希釈剤と組み合わせて医薬組成物を形成し
て、ヒトを含む哺乳動物に投与し得る。
活性物質の必要投与量は、治療を受ける患者の年齢、
体重、及び症状に応じて、並びに投与経路、及び所望の
治療の継続期間に応じて変わる。
例えば局所適用、点眼、経口投与、静注、皮下投与、
又は筋注される医薬組成物は、慣用の賦形剤を用いて、
慣用的方法で製造し得る。例えばクリーム、ローショ
ン、又はペーストのような局所適用のための組成物は、
例えば活性成分を慣用の油性又は乳状化賦形剤と混合し
て製造することができる。局所適用ローションは、例え
ば10mg/ml〜100mg/mlの活性物質を含有してもよく、作
用部位に１日７回まで適用し得る。
緩衝液又は生理的食塩水、あるいはその他の適当な賦
形剤に溶解した処方物は、点眼用処方物として適してい
る。
例えば錠剤又はカプセルのような経口投与用処方物
は、活性化合物とともに、希釈剤、例えばラクトース、
デキストロース、サッカロース、セルロース、コーンス
ターチ又はジャガイモデンプン；研磨剤、例えばシリ
カ、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム
もしくはステアリン酸カルシウム、及び／又はポリエチ
レングリコール；結合剤、例えばデンプン、アラビアゴ
ム、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセ
ルロース又はポリビニルピロリドン；分解剤、例えばデ
ンプン、アルギン酸、アルギン酸塩又はナトリウムスタ
ーチグリコレート；起泡混合物；染料；甘味料；レシチ
ン、ポリソルベート、ラウリスルフェートのような湿潤
剤；並びに一般に、医薬処方物中に用いられる無毒性及
び薬理学的に不活性な物質を含有してもよい。上記の医
薬製剤は、例えば混合、顆粒化、錠剤化、糖衣化又は薄
膜被覆法のような公知の方法で製造してもよい。
筋注用の懸濁液又は溶液は、活性成分とともに、医薬
上許容可能な担体、例えば滅菌水、オリーブ油、オレイ
ン酸エチル、例えばプロピレングリコールのようなグリ
コール、及び所望により、適量の塩酸リドカインを含有
してもよい。
静注又は注入用溶液は、担体として、例えば滅菌水を
含有してもよいし、好ましくは、滅菌、水性、等張の食
塩水溶液の形態であってもよい。
本発明の化合物は、医薬上許容可能な塩又は錯体の形
態で投与してもよい。塩の具体例は、塩酸、臭化水素
酸、硫酸及び燐酸のような無機酸、並びにマレイン酸、
クエン酸、酢酸、安息香酸、コハク酸、アルコルビン酸
及び酒石酸のような有機酸を用いた酸付加塩である。
錯体の具体例としては、例えば亜鉛又は鉄錯体があ
る。
方法 １）プラスミドの構築 自動DNAシンセサイザーApplied Biosystem 380Bモデ
ル上で重複配列（overlapping sequences）を用いてオ
リゴヌクレオチドを合成することにより、合成DNA断片
を得た。断片をM13ベクター中にサブクローニングした
後、ジデオキシ法によりヌクレオチド配列を決定した
（Messing J.:Methods Enzymol,101,p.20〜78,1983）。
制限酵素、リガーゼ及びポリメラーゼは、メーカーの
指示通りに使用し、標準手法に従って、E.coli細胞を形
質転換した（Maniatis T.,Frisch E.F.及びSambrook
J.:分子クローニング／実験室指針,Cold Spring Harbou
r Laboratory,Cold Spring Harbour,NY 1982）。
２）突然変異誘発 ヒト又はウシ型の野生型bFGFに対する合成配列を、M1
3ファージベクター中でサブクローン化した。一本鎖型
の組換えファージベクターを、公表された方法に従って
増殖させた（Messing J.:Methods Enzymol.101,p.20〜7
8,1983）。
これらのM13一本鎖DNAs20ngを10mMトリス−HClpH7.5,
0.1mM EDTA,50mM NaCl中で95℃で５分間加熱し、段階的
に室温まで冷却して好都合なオリゴヌクレオチドにアニ
ールした。引き続いて、以下の成分：最終濃度0.4mMと
なるようにATPを;0.12mMとなるようにdCTP,dGTP,dTTP
を;0.04mMとなるようにdATPを；E.coliDNAポリメラーゼ
ＩのKlenow断片１単位及びT4DNAリガーゼ0.5単位（Boeh
ringer Mannheim）を加えた。最終容量は、35mMトリス
−HClpH.75,0.1mM EDTA、GmM MgCl2、0.006mM DTT中50
μｌであった。35mM 15℃で12時間インキュベーション
した後、DNAを用いて、公表された手法に従って、E.col
i JM101細胞をトランスフェクションした（Maniatis
T.,Frisch E.F.及びSambrook J.:分子クローニング／実
験室指針,Cold Spring Harbour Laboratory,Cold Sprin
g Harbour,NY 1982）。
所望の突然変異を誘発するために用いられるオリゴヌ
クレオチドを、10mM MgCl2、5mM DTT及び10単位のT4ポ
リヌクレオチドキナーゼ（Boehringer Mannheim）を含
有する70mMトリス−HCl緩衝液pH8に溶解した150μCi
（γ−32P）ATP（New England Nuclear,6000Ci/mmol）
の反応混合液50μｌを用いて37℃で30分間インキュベー
ションして、放射標識した。次に、標識オリゴヌクレオ
チドを用いて、突然変異誘発されるファージDNAsとプラ
ークハブリダイゼーションを行なった。
ハイブリダイゼーションは、３×SSC、0.1％SDS、10
×Denhardt及び0.2mg/ml変性サケ精子DNAを含有する10m
Mトリス−HCl pH8中で65℃で一晩進行させた。ニトロセ
ルロースフィターを、0.4×SSC、0.1％SDS中で65℃で30
分間洗浄するといくつかの変化が認められたが、これを
一晩、Ｘ線フィルムに感光した。陽性ハイブリダイゼー
ションを示すプラークは、Amersham M13シーケンシング
キットを用いて、Sangerジデオキシヌクレオチド配列決
定のために選択した。
３）遺伝子発現の誘発及び分析 テトラサイクリン（３μg/ml）を含むLuriaブロスを
用いて、プラスミド保持細胞を増殖させた。0.4％グル
コース、0.4％カザミノ酸、及び10mg/mlチアミンを補充
したMg培地を用いて、トリプトファンプロモーター存在
下で遺伝子発現を誘発した。
トリプトファンを含まないM9倍地中で６時間増殖した
後、遠心分離により細胞を採取した。細菌培養物のアリ
コートをペレット化し、サンプルを入れた緩衝液と一緒
にして再懸濁し、Laemmli（Laemmli U.K.:バクテリオフ
ァージT4頭部のアッセンブリー間の構造タンパク質の開
裂,Nature227,p.680−685,1970）に従ってSDS−PAGEに
より分析した。
或いは、細胞をリゾチームを用いて、又は超音波処理
により破壊し、遠心分離により分離した可溶性画分及び
不溶性画分を別々に分析した。電気泳動後、ゲルをCoom
assieブルーで処理し全細胞蛋白質を染色した。
bFGF由来の配列を有する合成ペプチドに対するポリク
ローナルウサギ抗血清で、ウェスタンブロッティングを
プローブした。第二抗体としてビオチニル化ヤギ抗ウサ
ギIgGを含有するVectastain ABCキット（Vector Labora
tories,米国カリフォルニア州）は、メーカーの指示通
りに用いた。
図面の説明 第１図：これまでに単離された異なる天然型塩基性FGF
の概略図。155アミノ酸型はcDNAヌクレオチド配列から
推定された。
第２図：ヒト又はウシFGFのアミノ酸配列を示す。２つ
の配列は121位及び137位で異なっている。ウシ型に対応
するアミノ酸は下側の残基で示される。
第３図：この図面は既に公表済みである（Yoshida T.,M
iyaga K.,Odagiri H.,Sakamoto H.,Little P.F.R.,Tera
da M.及びSugimura T.:hstのゲノム配列、線維芽細胞成
長因子に相同なタンパク質をコードする形質転換遺伝
子、及びint−２をコードするタンパク質,Porc.Natl.Ac
ad.Sci.USA84p.7305−7309,1987）。
hst蛋白質、ヒト塩基性FGF（hbFGF）、ヒト酸性FGF
（haFGF）、及びマウスint−２蛋白質の全アミノ酸配列
を並べ、比較している。ダッシュは最適配列のために挿
入されるギャップを示す。hst配列と等しい残基をボッ
クスで囲んでいる。配列上の数字はhst残基についての
ものである。
第４図：塩基性FGF誘導体の概略図。数字は155アミノ酸
からなる型についてのものである。黒く塗りつぶした領
域は欠損アミノ酸配列を示す。黒点は単一アミノ酸の置
換を示す。
第５図：ヒトbFGF及びその突然変異体の全アミノ酸配
列を示す。ダッシュは欠損アミノ酸を示す。星印は単一
アミノ酸の置換を示す。
第６図：ヒト又はウシbFGFのヌクレオチド配列。この配
列を合成により再構築し、bFGF発現に用いた。星印で示
した最初の20個のアミノ酸に対するコドンは、対応する
アミノ酸残基を変えずに改変された。ウシ配列において
異なる２つのアミノ酸をコードするコドンは下側に示し
た。
第７図:pDS20は、bFGF発現プラスミドの構築に用いられ
た通常のプラスミドバックグラウンドを示す。gal K遺
伝子のbFGF遺伝子による置換、並びにファージラムダか
らの発現信号Ptrp及びShine−Dalgarno配列『cII』の挿
入によりpFC80を構築する。
考察及び結論 本発明は、塩基性FGFの新規の分子誘導体の単離に関
する。参照の塩基性FGF分子は、ヒト又はウシ起源のも
のである。
組換えDNA技術によって得られるこれらの新規誘導体
は、155アミノ酸型のbFGFの欠損又は置換突然変異体で
ある。ヒト又はウシの塩基性FGFは、唯一の差異がNH2末
端伸長分の長さである異なる型として単離し得ることが
文献から公知である。特に126アミノ酸型と同程度に短
いbFGF、又は/157アミノ酸型と同程度に長いbFGFは同等
に活性であると思われる。
本発明の発明者らは、この異質のNH2末端ドメインと
は明らかに異なるbFGF分子の領域で突然変異を起こし
た。本発明者らは、例えば155アミノ酸からなる型を用
いた。したがって、本発明の目的を示す改変は、bFGFの
別の型、例えば126〜157アミノ酸からなる型のもので行
うこともできる。
前述の通り、本発明の新規分子は、野生型bFGF分子の
拮抗薬及び／又は超過作働薬として作用し得る。前記既
述の通り、bFGFの拮抗薬は、特に、腫瘍性血管形成阻害
のための有用な道具である。bFGFの超作働薬は、天然型
の配列に比して、改良された薬理学的性質を示す。
本発明の化合物の生物学的活性の評価により、bFGFの
生物学的及び生化学的性質に関して特に重要であると思
われるbFGF分子のいくつかの領域を区別することができ
た。
このような領域、特に誘導体M1−bFGF、M2−bFGF及び
M3−bFGFにおいて欠損している領域の確認は、同一領域
におけるさらなる突然変異（置換、欠損又は修飾）が治
療上改良されたbFGF誘導体を生じ得ることを示唆する。
本発明は、これらのさらなる突然変異もその範囲内に
含む。
上記の通り、本発明はまた、これらの新規分子物質の
製造のための組換えDNA法に関する。興味深いことに、
この方法は、野生型bFGFの製造にも首尾よく適用でき
る。さらに、これらの考察は全て、ヒト及びウシ塩基性
FGF配列に対して妥当である。
本発明の本文中に開示される組換えDNA法は、所望のF
GF分子をコードする遺伝子を保有するプラスミドDNAで
形質転換されたE.coli細菌株に基づくものである。もち
ろん、本発明の発明者らは、他の組換えDNA法が既に開
示され、公表されているという事実を知っている（Iwan
e M.,Kurokawa T.,Sasada R.,Seno M.,Nakagawa S.及び
Igarashi K.:ヒト塩基性線維芽細胞成長因子をコードす
るcDNAのE.coli内での発現,Biochem.BIophis.Res.Commu
n.146 p.470−477,1987）。
しかしながら、本明細書に記載の手法は、以前に記載
されたことのない組換えbFGFの新規性及び収量に特徴を
示す。
この手法の主な特徴の１つは、塩基性FGFの製造のた
めの宿主として使用するE.coli株の種類にある。実際、
株の種類がE.coli内での異種遺伝子発現に影響を及ぼす
主要なパラメーの１つであることは公知である（Harris
T.J.R.とEmtage J.S.:E.coli内での異種遺伝子の発現,
Microbiological Sciences3,p.28−31,1986）。
本発明によれば、Ｂ型のE.coli株が、組換えbFGF及び
bFGF誘導体の産生のための非常に有効な宿主であること
が判明している。事実、他のE.coli株（Ｋ−12型、Ｃ型
等）に挿入した場合、同一bFGF発現ベクターは同量のbF
GFを産生しない。
本手法の第２の特徴は、異なるbFGF分子をコードする
遺伝子内にいくつかの『最適なコドン』を導入すること
である。本発明者らは、実際、発現レベルを増大するた
めには、同一アミノ酸配列を保持しながら一定数のDNA
コドンを改変する必要があることを見出した。好ましい
DNAコード配列は、本発明の明細書中に開示されている
（第６図参照）。
これらの２つの特徴、即ち宿主として用いる株の種類
と最適コドンは、bFGF及びその突然変異体の製造のため
の本組換えDNA法の新規性の態様を構成する。塩基性FGF
に適用されるこれら２つの態様は、今日まで科学文献に
は記載も公表もされていない。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 38/22 ＡＤＴ Ａ６１Ｋ 37/24 ＡＤＡ ＡＤＵ ＡＤＴ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 カウエト，ジツレス イタリー国、ブツチナスコ（ミラン）、 ビアレ・ロンバルデイア、22 (56)参考文献 欧州公開237966（ＥＰ，Ａ１) 欧州公開281822（ＥＰ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C07K 14/50 C12N 15/00 C12N 1/21 C12P 21/02 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (9)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】アミノ酸残基27〜32（Lys−Asp−Pro−Lys
    −Arg−Leu）の欠損を特徴とするヒト又はウシ塩基性線
    維芽細胞成長因子誘導体であって、上記アミノ酸残基の
    数字がヒト又はウシ塩基性FGFの155アミノ酸型に対応す
    る誘導体。
  2. 【請求項２】ヒト又はウシ塩基性線維芽細胞成長因子に
    天然に生じる小異質性Ｎ末端から選択されたＮ末端を有
    する、請求項１に記載のヒト又はウシ塩基性線維芽細胞
    成長因子誘導体。
  3. 【請求項３】bFGF拮抗薬として使用するための請求項１
    記載のbFGF誘導体。
  4. 【請求項４】腫瘍血管形成を阻害するための請求項３記
    載のbFGF誘導体。
  5. 【請求項５】請求項１又は２記載の塩基性線維芽細胞成
    長因子誘導体の製造のための組換えDNA法。
  6. 【請求項６】請求項１又は２記載の誘導体をコードする
    遺伝子を有する発現プラスミド。
  7. 【請求項７】抗生物質に又は他の選択マーカーに対する
    耐性を授ける少なくとも一つの遺伝子を含む請求項６記
    載の発現プラスミド。
  8. 【請求項８】請求項１又は２記載の誘導体の製造のため
    の、請求項６または７記載の発現プラスミドで形質転換
    された組換えＢ型E.coli株。
  9. 【請求項９】請求項１のbFGF誘導体をコードするDNA。
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