HUT53937A - Process for producing human fibroblast growth factor derivatives - Google Patents
Process for producing human fibroblast growth factor derivatives Download PDFInfo
- Publication number
- HUT53937A HUT53937A HU895573A HU557389A HUT53937A HU T53937 A HUT53937 A HU T53937A HU 895573 A HU895573 A HU 895573A HU 557389 A HU557389 A HU 557389A HU T53937 A HUT53937 A HU T53937A
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- bfgf
- human
- bovine
- amino acids
- growth factor
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 37
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 title claims description 11
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 title claims description 11
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 title claims description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 title abstract description 13
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 claims abstract description 88
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 claims abstract description 77
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 23
- 101001051969 Bos taurus Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 12
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 11
- 101001052035 Homo sapiens Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 claims abstract description 8
- 230000002483 superagonistic effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 39
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 39
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 21
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 15
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 claims description 8
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 8
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 6
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 6
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 claims description 5
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000005747 tumor angiogenesis Effects 0.000 claims description 4
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 125000000896 monocarboxylic acid group Chemical group 0.000 claims description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 abstract description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 abstract description 9
- 230000002491 angiogenic effect Effects 0.000 abstract description 6
- 101150021185 FGF gene Proteins 0.000 description 35
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 29
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 21
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 19
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 11
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 10
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 7
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 7
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 7
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 6
- 102100021628 Histatin-3 Human genes 0.000 description 6
- 101000898505 Homo sapiens Histatin-3 Proteins 0.000 description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 6
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 5
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 5
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 5
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 5
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 4
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 4
- 210000003716 mesoderm Anatomy 0.000 description 4
- 210000001020 neural plate Anatomy 0.000 description 4
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 3
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 3
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 108010074415 Angiogenic Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000008076 Angiogenic Proteins Human genes 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 101100446506 Mus musculus Fgf3 gene Proteins 0.000 description 2
- 206010029113 Neovascularisation Diseases 0.000 description 2
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 2
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 2
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 2
- 239000002870 angiogenesis inducing agent Substances 0.000 description 2
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 2
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 2
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 2
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- -1 propylene glycol and Chemical compound 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 2
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 1
- BMYNFMYTOJXKLE-UHFFFAOYSA-N 3-azaniumyl-2-hydroxypropanoate Chemical compound NCC(O)C(O)=O BMYNFMYTOJXKLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 241000282994 Cervidae Species 0.000 description 1
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 229920002261 Corn starch Polymers 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N Elaidinsaeure-aethylester Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010041308 Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 1
- 241000701533 Escherichia virus T4 Species 0.000 description 1
- 206010017076 Fracture Diseases 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 208000010412 Glaucoma Diseases 0.000 description 1
- 102100021519 Hemoglobin subunit beta Human genes 0.000 description 1
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 102100031000 Hepatoma-derived growth factor Human genes 0.000 description 1
- 108091027305 Heteroduplex Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101001083798 Homo sapiens Hepatoma-derived growth factor Proteins 0.000 description 1
- 208000007766 Kaposi sarcoma Diseases 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 235000010643 Leucaena leucocephala Nutrition 0.000 description 1
- 240000007472 Leucaena leucocephala Species 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 241001625930 Luria Species 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 208000029549 Muscle injury Diseases 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 description 1
- BPQQTUXANYXVAA-UHFFFAOYSA-N Orthosilicate Chemical compound [O-][Si]([O-])([O-])[O-] BPQQTUXANYXVAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 208000037273 Pathologic Processes Diseases 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 208000004210 Pressure Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 1
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 1
- 208000017442 Retinal disease Diseases 0.000 description 1
- 206010038923 Retinopathy Diseases 0.000 description 1
- 206010039580 Scar Diseases 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010040943 Skin Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N Tartaric Acid Chemical class [H+].[H+].[O-]C(=O)C(O)C(O)C([O-])=O FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZKHQWZAMYRWXGA-KNYAHOBESA-N [[(2r,3s,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] dihydroxyphosphoryl hydrogen phosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)O[32P](O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KNYAHOBESA-N 0.000 description 1
- 235000011054 acetic acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 239000000783 alginic acid Substances 0.000 description 1
- 229960001126 alginic acid Drugs 0.000 description 1
- 150000004781 alginic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011319 anticancer therapy Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 235000010233 benzoic acid Nutrition 0.000 description 1
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid group Chemical group C(C1=CC=CC=C1)(=O)O WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- CJZGTCYPCWQAJB-UHFFFAOYSA-L calcium stearate Chemical compound [Ca+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O CJZGTCYPCWQAJB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000008116 calcium stearate Substances 0.000 description 1
- 235000013539 calcium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 230000009134 cell regulation Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 208000037976 chronic inflammation Diseases 0.000 description 1
- 230000006020 chronic inflammation Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000008120 corn starch Substances 0.000 description 1
- 210000004087 cornea Anatomy 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- MOTZDAYCYVMXPC-UHFFFAOYSA-N dodecyl hydrogen sulfate Chemical class CCCCCCCCCCCCOS(O)(=O)=O MOTZDAYCYVMXPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000001804 emulsifying effect Effects 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 210000003989 endothelium vascular Anatomy 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N ethyl oleate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N 0.000 description 1
- 229940093471 ethyl oleate Drugs 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000003889 eye drop Substances 0.000 description 1
- 229940012356 eye drops Drugs 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 101150045500 galK gene Proteins 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 150000002334 glycols Chemical class 0.000 description 1
- 210000003128 head Anatomy 0.000 description 1
- 230000009097 homeostatic mechanism Effects 0.000 description 1
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 1
- 230000002390 hyperplastic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 150000002505 iron Chemical class 0.000 description 1
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 1
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 1
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 1
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 229960004393 lidocaine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- YECIFGHRMFEPJK-UHFFFAOYSA-N lidocaine hydrochloride monohydrate Chemical compound O.[Cl-].CC[NH+](CC)CC(=O)NC1=C(C)C=CC=C1C YECIFGHRMFEPJK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Substances [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 150000002689 maleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010981 methylcellulose Nutrition 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 201000003142 neovascular glaucoma Diseases 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940124276 oligodeoxyribonucleotide Drugs 0.000 description 1
- 239000004006 olive oil Substances 0.000 description 1
- 235000008390 olive oil Nutrition 0.000 description 1
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 239000003973 paint Substances 0.000 description 1
- 239000006072 paste Substances 0.000 description 1
- 230000009054 pathological process Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 229940068965 polysorbates Drugs 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 229920001592 potato starch Polymers 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000026267 regulation of growth Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000033458 reproduction Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 208000017520 skin disease Diseases 0.000 description 1
- 231100000019 skin ulcer Toxicity 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 229940071117 starch glycolate Drugs 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 235000011044 succinic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 238000009495 sugar coating Methods 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N sulfuric acid group Chemical group S(O)(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000012222 talc Nutrition 0.000 description 1
- 235000002906 tartaric acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000005748 tumor development Effects 0.000 description 1
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/50—Fibroblast growth factor [FGF]
- C07K14/503—Fibroblast growth factor [FGF] basic FGF [bFGF]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Eye Examination Apparatus (AREA)
Description
ELJÁRÁS HUMÁN FIBROBLASZT NÖVEKEDÉSI FAKTOR SZÁRMAZÉKOK
ELŐÁLLÍTÁSÁRA
FARMITALIA Carlo Erba S.r.l., Milánó, Olaszország
Feltalálók:
BERGONZONI Laura, Milánó ISACCHI Antonella, Milánó
SARMIENTOS Paolo, Milánó
CAUET Gilles, Buccinasco
OLASZORSZÁG
A bejelentés napja: 13.?3,Ρί, l$~.
Elsőbbsége: 1988.09.16. (8821795.5) Nagy-Britannia
A nemzetközi bejelentés száma: PCT/EP89/01075
Pc efcxu<£v.· \X/ű cZSOO
69779-1679-GI » · · · • ·· « · · ···· • · ·· ······· ·
-2A találmány tárgya a bázikus fibroblaszt növekedési faktor (bGF) technikákkal, új származékai, előállításuk rekombináns DNS valamint a megfelelő plazmidok és DNS kódoló szekvenciák.
A találmány szerinti új variánsok az angiogenikus folyamatban a vad agonistáiként és/vagy szuperagonistáiként találmány szövegében ismertetett eljárás molekuláknak, valamint a vad előállítására
Ξ. coli rekombináns humán és szarvasmarha ármazékait plazmidokkal transzformáltunk.
típu molekuláris bGF
| típusú | molekula |
| hatnak. | A jelen |
| ezeknek | az új |
| ú bGF- | nek az |
| ;seken | alapul, |
| bGF-et | valamint |
| hordozó | |
| fontos b | iológiai |
folyamatban végbemegy, akár fiziológiás folyamatban, például a sebek gyógyulása során, patológiás folyamatban.
például
3.S the vulnerable element
217-225 (1984); Hobson
B. and Denekamp J.: Endothelial proliferaticn in tumours and normál tissues: continous labelling studies Br. J. Cancer,
49. 405-413 (1984); Folkman J.: Tumour angiogenesis, Adv. Cancer Rés.’, 43, 175-203 (1985)].
Miközben a neovaszkularizáeióhoz vezető események sorrendjét morfológiailag jellemezték, a molekuláris mechanizmusok, amelyek révén ez a folyamat lejátszódik, még mindig kevéssé ismertek. A kapilláris endotéliumban lejátszódó növekedés szabályozása nagyon szigorúnak tűnik, mivel ezek a sejtek normális körülmények között statikus egysejt-réteget képeznek, amelyek szaporodását az • · · · angiogenikus folyamat indítja be [Folkman J.: Tumor angiogenesis, Adv. Cancer Rés., 43, 175-203 (1985); Joseph-Silverstein J. and Rifkin B.D.: Endothelial cell growth factors'and the véssél wall, Seminars in Thromb. and Hemost., 13, 504-513 (1987)].
Az endoteliális sejtek általában nyugodt természetét részben az endoteliális növekedési faktorok látszólagos endoteliális sejt-mitogének valójában nem jóllehet jelen vannak majdnem t anulmányozott szövet normális valamint rákos sejtvonalban
504-513 (1987); Folkman J.
and Klagsbrun M.: Angiogenic (1987)].
lojíál i s indukciója magában foglalhatja endoteliális sejt mitogének felszabadulását környezeti ingerekre adott válaszként.
polipeptid növekedési faktor család, beleértve az alap fibroblaszt növekedési faktort (bFGF), amelyet a heparinhoz való erős miatt heparinhoz kötődő növekedési faktorként is ismerünk [Thomas K.:
factors, FASEB J.,· 1, 434-440 (1987); Gospodarowicz D.,
Neufeld G. and Schweigerer L.: Fibroblast growth factor:
structural and biological properties, J.Cell. Physiol., 3,
15-26 (1987)].
-4Az alap FGF-et a legtöbb mezoderma- vagy neuroektoderma-eredetü szövetből vagy sejtekből izolálták.
A szerkezeti vizsgálatok kimutatták, hogy a bFGF egy 146 aminosavból álló egyláncú polipeptid, amely az NHs-végen csonkult formában is létezik, mikoris az első 10-20 aminosav hiányzik.
Az FGF csonka formái éppolyan hatékonyak mint a natív bFGF, amelyet radioreceptor kötéssel és biológiai vizsgálatokkal igazoltak [Gospodarovicz D., Neufeld G. and Schweigerer L.: Fibroblast growth factor, Mól. Cell. Endocrin., 46. 187-206 (.1986); Gospodarowicz D. , Neufeld G. and Schweigerer L.: Molecular and biological characterization of fibroblast growth factor: an angicgenic factor which alsó controls the proliferation and differentiation of mesoderm and neuroectoderm derived cells, Cell. Differ., 12, 1-17 (1986) ; Thomas K. and Gimenez-Gallego G.: Fibroblast growth factors: broad spectrum mitogens with potent angiogenic activity; Trends Biochem. Sci. 11. 81-84 (1986)].
Ezenkívül a tisztítási protokollok módosítása olymódon, hogy a homogenizált szövet semleges extrakcióját savas extrakcióval helyettesítjük, és proteáz inhibitorokat használunk, egy hosszabb, 154 aminosavból álló formát eredményezett [Ueno N., Baird A., Esch F., Ling N. and Guillemin R. : Iso'lation of an amino terminál extended form of basic fibroblast growth factor, Biochem. Biophys. Rés.
Commun., 138. 580-588 (1986); Story M.T., Esch.F., Shimasaki
S., Sasse J., Jacobs S.C. and Lawson R.K.: Aminoterminal sequence of a large form of basic fibroblast growth factor • · · · · · · isolated from humán benign prostatic hyperplastic tissue,
Biochem. Biophys.
Commun.
, 1A2, 702-709 (1937) ;
Klagsbrun M., Smith S., Sullivan R.
Shing Y., Davidson S.,
Smith J.A. and Sasse J.: Multiple forms of basic f ibroblast growth factor: amino-terminal cleavages by tumor cell- and brain-cell derived acid proteinsses, Proc. Natl.
Acad. Sci.
Az részben
1839-1343 (1937)].
legalábbis következménye, amely vagy in vivő történik, vagy tűnnek, valószínűleg fiziológiásán lényegtelen.
evolúció során.
am i n c s av j ukbó1 csak kettőben különböznek, ezzel egy 93.7 %-os átlagos aminosav-szekvencia homológiát mutatva and biological characterization of fibroblast growth factor:
an angiogenic factor which alsó controls the proliferation and differentiátion of mesoderm and neuroectoderm derived cells, Cell. Differ., IS, 1-17 (1986)].
A bFGF-fel rokon a savas FGF (aFGF), amely 55%-os szekvencia-homológiát mutat a bFGF-fel. A savas FGF egy 140 aminosavból álló polipeptid, amely az NH2-végen csonkított formában is létezhet, mikoris az első hat aminosav hiányzik [Gimenez-Gallego G., Conn G., Hatcher V.B. and Thomas K.A.: The complete amino acid sequence of humán brain-derived acidic fibroblast growth factor; Biochem. Biophys. Rés.
Commun., 133. 611-617 (1986)].
Az alap FGF és a savas FGF két potenciális heparin-kötö domént tartalmaz, az egyiket az NH2 terminálisukhoz közel, a másikat a COOH-terminálisukhoz közel. Mindkét dómén résztvehet az FGF erős heparin affinitásában [Gospodarovicz
D. , Neufeld G. and Sohweigerer L. : Fibroblast growth factor, Mól. Cell. Endocrin., 46. 187-206 (1986); Gospodarowicz D. , Neufeld G. and Schweigerer L.: Molecular and biological characterization of fibroblast growth factor: an angiogenic factor which alsó controls the proliferation and differentiation of mesoderm and neuroectoderm derived cells, Cell. Differ., 19. 1-17 (1986); Eaird A., Schubert D. , Ling N. and Guillemin R. : Receptor- and heparin heparin-binding domains of basic fibroblast growth factor; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 35, 2324-2328 (1988)].
Az aFGF és a bFGF homológiájának magas foka azt sugallja, hogy egyetlen közös ősi génből származnak. Nemrégiben az FGF géneket klónozták, és mind a bFGF mind az aFGF komplementer DNS szekvenciáját meghatározták [Abraham
J.A., Whang J.L., Tumolo A., Mergia A., Friedman J., Gospodarowicz D. and Fiddes J.C.: Humán basic fibroblast growth factor: nucleotide sequence and genomic organization; EMBO J., 5, 2523-2528 (1986); Abraham J.A., Mergia A., Whang
J.L., Tumolo A., Friedman J., Hjerrild K.A., Gospodarowicz D. and Fiddes J.C.: Nucleotide sequence of a bovine clone encoding the angiogenic protein, basic fibroblast growth factor; Science, 223. 545-548 (1986) ; Jaye M., Howk R., Burgess G.A., Ricca W., Chiu I.M., Ravera M.W., O'Brien
S.J., Módi W.S., Maciag T. and Drolian W.N.: Humán
-7« · · · « · · • ·· · · · ···· ·· · · ······· · endothelial cell growth factor: Cloning nucleotide sequence and chromosome localization; Science, 233. 541-545 (1986)].
A humán és szarvasmarha cDNS kiónok nukleotid szekvenciájának analízise azt sugallja, hogy az alap FGF elsődleges transzlációs terméke 155 aminosavból áll. Azonban újabban
Sommer és munkatársai egy új,
157 aminosavas formáját izolálták a humán alap amely az
NHa-terminálison két extra aminosavat tartalmaz [Sommer A.,
Brewer M.T., Thompson R.C., Moscatelli D.,
Présta M.
and
Rifkin D.B.: A form of humán basic fibroblast growth factor with an extended amino terminus; Biochem. Biophys. Rés. Commun., 144. 543-550 (1937)].
Érdekes, hogy ez a két aminosav megfelel az előzőleg leírt humán cDNS kiónban talált kodonoknak. Az első ábrn foglaljuk össze a mai napig izolált vagy a cDNS szekvenciából kikövetkeztetett alap FGF-ek különböző formáit. A 2. ábrán látható a 155 aminosavas forma elsődleges szerkezete.
Amint az előzőkben említettük, a jelen találmány tárgya a humán alap FGF-ek molekuláris variánsai. Ezeket az új molekulákat, amelyek azelőtt nem léteztek a természetben, a 155 aminosavas formát kódoló gén helyspecifikus mutagenezisével állítjuk elő.
Azonban az alap FGF-ek . amino-t^rminálisának mikroheterogenitásá, és ezek elhanyagolható fiziológiai hatása azt mutatja, hogy a jelen találmányban a 155 aminosavas formára leírt és közölt módosítások azonos értékűek azokkal, amelyeket elő lehet állítani az FGF egyéb formáival (lásd az alábbiakban).
·*·· ·· · ·· ·
-8• · · · · · · • · · · · ···· ·· · · ······« ·
Amint arra az előzőkben rámutattunk, az angiogenezis egy szigorúan szabályozott folyamat, amely patológiai jelentőséget tételez fel, mivel hozzájárul a szilárd daganatok kifejlődéséhez. Figyelembe véve a bFGF kulcsszerepét az angiogenezisben, ennek a molekulának a variánsai, amelyek az endogén FGF-fel versenghetnek miközben biológiailag inaktívak, hasznos eszközei lehetnek a rákellenes terápiának.
Másrészről, az új kapilláris növekedés alapja a normális homeosztatikus mechanizmusoknak, amelyek támogatják a reprodukciót, növekedést és fejlődést. Ennek következtében a megnőtt biológiai aktivitással rendelkező bFGF analógok számos különböző esetben nyerhetnek alkalmazást, például égések, sebek (beleértve a szaruhártyáét) és sebészeti vágások gyógyításában; börfekélyek, beleértve a felfekvéseket, kezelésében; szívrohamok után a véráramlásújraindításában, a roncsolt szövetben újra létrehozva az ereket; valamint bizonyos vázizom sérülések kezelésében.
A jelen találmány tárgya tehát módosított biológiai aktivitással rendelkező alap FGF rekombináns analógok tervezése és előállítása.
Ahhoz hogy megértsük, az alap FGF aminosav szekvenciájának milyen megváltoztatása érinti funkcionális tulajdonságait, számos rokon fehérjét vizsgálhatunk meg, amelyek nagyon erősen homológok az alap FGF-fel. Ebbe a fehérjecsaládba tartozik a savas FGF, valamint a hst és int-2, két újabban felfedezett onkogén termék [Yoshida T., Miyagawa K., Odagiri H., Sakamoto H., Little P.F.R., Terada M. and Sugimura T.: Genomic sequence of hst, a transforming
-9gene encoding a protein homologous to fibroblast growth factors and the int-2-encoded protein; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84. 7305-7309 (1987) ; Delli Bovi P., Curatola A.M., Kern.F.G., Greco A., Ittman M. and Easilico C. : An oncogene isolated by transfection of kaposi's sarcoma DNA encodes a growth factor that is a member of the FGF family; Cell, 50, 729-737 (1937)].
t Az Összes ilyen molekula, beleértve a bFGF-et, egy olyan családba tartozik, amely résztvesz a sejt-növekedésben és szabályozásban. Ezeknek a fehérjéknek az elsődleges szekvenciáját a 3. ábrán hasonlítjuk össze.
Ha vizsgáljuk a homológiát ezek között a fehérjék között, akkor az elsődleges szerkezetben erősen konzerválódott régiókat figyelhetünk meg. Ezeknek a Jemeneknek a megörzödése nemcsak szerkezeti, hanem bizonyos funkcionális homológiát is mutat ezek között a fehérjék között.
Valóban,az összes ilyen fehérje erős affinitást mutat a heparinhoz, és úgy tűnik, hogy fontos szerepet játszik az érképzödési folyamatokban, valószínűleg ideértve a daganat kifejlődést támogató új kapilláris proliferációt.
Ha a konzervált domének lehetnek a felelősek ezeknek a fehérjéknek a közös tulajdonságaiért, akkor az erősen eltérő szekvenciák lehetnek az okai ezeknek a faktoroknak a különböző biológiai szerepéért. Tehát bármely ilyen régióban végzett változtatás drasztikusan befolyásolja az alap FGF biológiai aktivitását.
Ezeknek a megfontolásoknak az alapján a jelen találmány szerzői génsebészeti technikák felhasználásával humán és ··· ···· • · ···· szarvasmarha alap FGF új származékait hozták létre, amelyek egyes esetekben a bFGF molekula különböző régióiban aminosav deléciót szenvedtek, más esetekben bizonyos pozíciókban aminosav helyettesítést szenvedtek. A módosításokat számos ismert növekedési faktor homológiái és különbségei alapján határoztuk meg. A mutánsok molekuláris jellemzőit az alábbiakban írjuk le.
Analógokat rekombináns fehérjék formájában kaphatunk egy kiválasztott expressziős rendszerben.
A kívánt változtatásokat úgy érhetjük el hogy génsebészeti technikákkal módosítjuk a szervezetben expresszáljuk.
A bFGF gén alatt cDNS könyvtárból olyan DNS szekvenciát értünk, amelyet klónozva, vagy szintetikus oligonukleotidok összerakásával kapunk [Maniatis T. , Fritsch S.F. and Sambrook J.: líolecular cloning. A laboratory manual; Goid Spring Harbour Laboratory; Cold Spring Harbour, NY (1982 ) ].
A találmány tárgya továbbá rekombináns DNS módszer bFGF és származékai előállítására.
A mutánsok molekuláris jellemzése
A jelen találmány során az analógok, mutánsok, vagy származékok kifejezések alatt olyan bFGF molekulákat értünk, amelyeknek megváltozott az aminosav sorrendje. A mai napig izolált és ' a bevezetésben leírt összes természetes bFGF-et meg lehet változtatni, azonos értékű analógokat állítva elő. A választott analógok a 155 aminosavat tartalmazó mutánsok. A jelen találmány során mind a humán mind a szarvasmarha szekvenciákat megváltoztattuk. Az új ·*···· · ·· ·
-11• * · · · · · • · · · · · ···♦ • · «· ······* · bFGF származékokat helyspecifikus oligonukleotid műtagenezissei állítottuk elő.
Lényegében az oligonukleotidokat úgy terveztük és szintetizáltuk, hogy a humán és szarvasmarha bFGF gének kódoló régióiban deléciókat okozzanak. A mutánsok előállítására használt mutagenezis technikát részletesen a Módszerek című részben írjuk le.
A mutált géneket ezután E.coli expressziós vektorokba építjük be, amelyek képesek az új bFGF származékok szintézisét szabályozni. A rekombináns molekulákat ezután tisztítjuk, jellemezzük és végül nagy mennyiségben előállítjuk.
Az új bFGF származékokat, amelyek a jelen találmány tárgyát képezik, a továbbiakban részletesen ismertetjük és általánosan illusztráljuk a 4. ábrán. Az aminosavak számozása megfelel a 155 aminosavas formának, a metionin az 1-es számú csoport, a szerin a 155-ös számú csoport. Azonban az összes leírt bFGF forma megváltoztatható hogy ugyanolyan deléciókat kapjunk. Továbbá mind a szarvasmarha mind a humán forma felhasználható a mutánsok előállítására.
A kiválasztott bFGF származékok az alábbiak:
az ΜΙ-bFGF az a bFGF származék, amelynél a 27-32 sorszámú csoportok hiányoznak (Lys-Asp-Pro-Lys-Arg-Leu) az aminosav szekvenciából;
az M2-bFGF az a bFGF származék, amelynél az 54-58 sorszámú csoportok hiányoznak (Glu-Lys-Ser-Asp-Pro) az aminosav szekvenciából;
···· ·· · ·· ·
-12• · · · · « · • ·* · · · ···· ·· ·· ······« · az M3-bFGF az a bFGF származék, amelynél a 70-75 sorszámú csoportok hiányoznak (Gly-Val-Val-Ser-Ile-Lys) az aminosav szekvenciából;
az M4-bFGF az a bFGF származék, amelynél a 78-83 sorszámú csoportok hiányoznak (Cys-Ala-Asn-Arg-Tyr-Leu) az aminosav szekvenciából;
az M5-bFGF az a bFGF származék, amelynél a 110-120 sorszámú csoportok hiányoznak (Asn-Asn-Tyr-Asn-Thr-Tyr-Arg-Ser-Arg-Lys-Tyr) az aminosav szekvenciából;
az M6a-bFGF az a bFGF származék, amelynél a 119-es sorszámú lizin illetve a 129-es sorszámú arginin csoportokat glutamin csoport helyettesíti;
az M6b-bFGF az a bFGF származék, amelynél a 119-es és 128-as sorszámú lizin illetve a 118-as és 129-es sorszámú arginin csoportokat glutamin csoport helyettesíti;
A mutánsok részletes aminosav szekvenciáját az 5. ábrán mutatjuk be.
Az akár az NH2, akár a COOH véghez, vagy mindkettőhöz hozzáadott plusz aminosavakat tartalmazó fehérjék is a jelen találmány oltalmi körébe tartoznak. Az ilyen hozzáadások technikai okokból lehetnek szükségesek a mutánsok rekombináns DNS technikával való expresszálása során [Courtney Μ., Jallat S., Tessier L.H., Benavente A. and Crystal R.G.: Synthesis in E.coli pf alfal-antitrypsin variants of therapeutic potential fór emphysema and thrombosis; Natúré, 313. 149-151 (1985); Nagai K. and Thogersen H.C.: Generation of β-globin by sequence specific proteolysis of a hybrid protein produced in E.coli; Natúré, 302, 810-812 (1984)].
···« c
-13Egy másik módszer szerint a hozzáadott aminosavak célja az, hogy megnöveljék a mutánsok farmakológiai hatékonyságát, olymódon például, hogy megnövelik keringési fél-életidejüket a plazmában.
A mutánsok előállítására kifejlesztett eljárás részletei
Az új bFGF származékok hatékony előállítása céljából rekombináns DNS eljárást fejlesztettünk ki, amely lehetővé teszi laboratóriumi és kísérleti üzemi méretekben a különböző molekulák szükséges mennyiségének előállítását biológiai és klinikai értékelésük céljára.
A jelen eljárás génsebészeti módszerekkel úgy módosított
E.coli törzsek fermentálásán alapszik, hogy a törzsek magas szinten expresszálják a mutált géneket.
A termelési eljárás részletei az alábbiak:
1.) bFGF-t kódoló szintetikus DNS szekvencia előállítása
A vad típusú alap FGF és származékai expresszálására használt összes szekvenciát szintetikusan állítjuk elő. Ezt úgy végezzük, hogy átlapoló szekvenciákat tartalmazó oligonukleotidokat szintetizálunk egy automatikus DNS szintetizátoron, például az Applied Biosystems Inc. 380B modellen [Caruthers M.H.: Gene synthesis machines; DNA chemistry and its uses; Science, 230. 281-285 (1985)].
Az átlapoló oligonukleotidokat úgy illesztjük össze, hogy kétszálú DNS lánc keletkezzen, a hiányokat DNS polimerázzal és T4 DNS ligázzal töltjük fel.
-14• ·· · »4
Az FGF-et kódoló szekvencia kódoló szálán közvetlenül az 5' véghez egy ATG start-jelet illesztünk. A bFGF 155 aminosavas formája esetében start ködönként használhatjuk az első ködönként a természetben előforduló, metionint kódoló ATG-t, tehát nincs szükség arra hogy az expresszált polipeptid N-terminálisára extra aminosavat tegyünk [Abraham J.A., Whang J.L., Tumolo A., Mergia A., Friedman J., Gospodarowicz D. and Fiddes J.C.: Humán basic fibroblast growt’n factor: nucleotide sequence and genomic organization; ΞΜΒΟ J., 5, 2523-2523 (1986); Abraham J.A., Mergia A., Whang •J.L., Tumolo A., Friedman J., Hjerrild K.A., Gospodarowicz D. and Fiddes J.C.: Nucleotide sequence of a bovine clone encoding the angiogenic protein, basic fibroblast growth factor; Science, 22J2, 545-548 (1936)].
Egy másik módszer szerint az FGF E.coli-ban való expressziéjának növelésére megváltoztatjuk a gén 5' végét, anélkül, hogy megváltoztatnánk a fehérje primer szerkezetét. Részletesebben, a nukleotid szekvenciát a 6. ábrán leírt módon változtatjuk meg.
2) A bFGF származékok mutált szekvenciáinak előállítása
A jelen találmányban leírt mutánsok előállítása céljából a vad típusú bFGF szekvenciát megváltoztatjuk a kívánt deléciók előállítása céljából. Ezt úgy érjük el, hogy a gént helyspecifikus mutagenezissel módosítjuk [Norris K., Norris
F., Christiansen L. and Fiil N.: Efficient site-directed mutagenesis by simultaneous use of two primers; Nucleic Acid Research, H, 5103-5112 (1983)].
·-··« • · ·· · *
Ennek a módszernek az az alapja, hogy a bFGF gént olyan vektorban szubklónozzuk, amely egyszálú formában is elöálítható, például az M13 fágvektorban.
A rekombináns egyszálú fágot egy olyan komplementer szintetikus oligodezoxiribonukleotiddal illesztjük, amely a kívánt változtatásokat kódolja. Ezután a DNS polimerázt és ligást, használjuk az új szál meghosszabbítására és cirkuláris formában való ligálására. Az újonnan előállított heteroduplex DNS-t használjuk egy olyan sejtvonal transzformálására, amelyben képes replikálódni és olyan leszármazottakat eredményez, amelyekben a vad típusú gént valamint a kívánt deléciót tartalmazó gént tartalmazó fágok két különböző molekulatípusra szegregálódnak.
A kiinduláshoz használt mutagén oligonukleotidot lehet ezután próbaként használni a mutált gének felismerésére. A helyspecifikus mutagenezis technikát részletesen a Módszerek részben írjuk le.
Részletesebben, a vad típusú bFGF-et kódoló szintetikus szekvenciát, akár szarvasmarha, akár humán szekvenciát egy M13 vektorba építjük be, és a kapott egyszálú DNS-t használjuk mutagenezis templátként [Norris K., Norris F., Christiansen L. and Fiil N.: Efficient site-directed mutagenesis by simultaneous use of two primers; Nucleic Acid Research, 11, 5103-5112 (1983)].
3-l_A vad típusú bFGF valamint származékai expressziója
A vad típusú bFGF és mutált származékai expresszálása céljából rekombináns E.coli törzsekben ezeket a szekvenciákat olyan expressziós plazmidokba építjük be, ····
amelyek az új gének transzkripciójáért és transzlációjáért felelős szekvenciákat tartalmazzák. Részletesebben, szabályozó szekvenciaként az E.coli triptofán promoterét használjuk, a riboszómális kötőhelyet a lambda CII proteinből vesszük [Hendrix R.W., Roberts J.W., Stahl F.W. and Weisberg R.A.: Lambda II Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, N.Y. (1983)].
A Ptrp triptofán promotert a kereskedelmi forgalomban levő pDR720 plazmidból (Pharmacia) nyertük ki. A CII Shine-Dalgarno szekvenciát kémiailag szintetizáljuk, a publikált szekvencia alapján [Hendrix R.W., Roberts J.W., Stahl F.W. and Weisberg R.A.: Lambda II Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, N.Y. (1983)].
A vad típusú bFGF és származékai expresszálására használt tipikus expressziós vektort a 7. ábrán mutatjuk be. Részletesebben a következő fragmentumok összeállításával állítjuk elő:
a) a pDS20 plazmid nagy EcoRI-BamHI fragmentje [Duester
G., Elford R.M., Holmes W.N.: Fusion of the Escherichia coli leucyl transfer RNS-I promoter to the gal-K gene. Analysis of sequences necessary fór growth rate dependent regulátion; Cell, 3Q, 855-964 (1982)];
b) egy EcoRI-Sall fragmant a pDR720 plazmidból (Pharmacia, Svédország), amely a triptofán promotert tartalmazza;
c) a cll riboszómális kötőhelyet kódoló szintetikus Sall-Ndel oligonukleotid;
d) a bFGF és származékai vad típusú vagy mutált szekvenciáját tartalmazó szintetikus Ndel-XhoII (BamHI
4· · kompatibilis) fragment.
A vad típusú bFGF választott szekvenciáját a 6. ábrán mutatjuk be. A bFGF analógok kiválasztott szekvenciái ennek a szekvenciának a módosításai, az 5. ábrán bemutatott mutációk szerint.
Az új gének expressziójának indukcióját és a keletkező rekombináns fehérjék elemzését a 'Módszerek' részben leírtak szerint hajtjuk végre.
4J__Δ__rekombináns molekulák__tisztítása.__ás—biológiai vizsgálata
A rekombináns mutánsokat baktérium lizátumokból lehet tisztítani, biológiai jellemzőik a vad típusú bFGF-fel összehasonlítva vizsgálhatók.
Egy tipikus tisztítási eljárás a következő: a sejteket ultrahangos besugárzással feltárjuk, centrifugáljuk, majd a kapott felülúszőt ioncserélő S-Sepharose oszlopra visszük. A fehérjét nátrium-klorid gradienssel eluáljuk, majd közvetlenül heparin-Sepharose affinitás-oszlopra visszük.
A fehérjét nátrium-klorid gradienssel eluáljuk, majd gélszüréssel sőtalanitjuk liofilezés előtt.
A tisztított analógoknak ezután megvizsgálhatjuk a biológiai aktivitását.
A mutánsok tulajdonságai, alkalmazásuk és adagolásuk
A jelen találmány szerinti új molekulák a vad típusú bFGF antagonistájaként és vagy szuperagonistájaként hathatnak.
-18A bFGF agonista aktivitást vizsgálhatjuk például azon az alapon, hogy képes-e megnövelni az endoteliális sejtek szaporodását egy olyan tesztben, amely analóg a Presta és munkatársai által leírttal [Molecular and Cellular Bioi., β, 4060 (1986)].
A bFGF antagonista aktivitást vizsgálhatjuk például azon az alapon, hogy gátolja az I125-bFGF kötődését egy olyan tesztben, amely analóg a Baird és munkatársai által leírtakkal [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 2324 (1988)].
így például a találmány szerinti, M6b jelzésű anyagról kiderült, hogy 50%-kal megnöveli az endoteliális sejtek szaporodási sebességét 1 ng/ml dózisban, ami azt jelzi, hogy meglehetősen elfogadható bFGF agonista aktivitással rendelkezik.
Ismét egy példa, a találmány szerinti M3-bFGF ' és M6a jelzésű anyagokról kiderült, hogy körülbelül 20, illetve 50%-ban gátolják az I125-bFGF kötődését, ha 300 ng/ml koncentrációban vannak jelen, ami a bFGF antagonista aktivitás jele.
bFGF szuperagonistaként a találmány szerinti vegyületek hathatnak a vaszkularizáció, sejt-növekedés vagy sejt-túlélés elösegítöjeként és így alkalmazást találhatnak például a szövetek regenerálásában, úgymint a sebek, égések, csonttörések, sebészeti hegek, fekélyek gyógyításában, beleértve a szövetek regenerálását ischemia és szívinfarktus esetében.
bFGF antagonistaként a találmány szerinti vegyületek hathatnak angiogenezis inhibitorokként és ezáltal használhatók lehetnek például olyan betegségek kezelésében,
-19ahol a neovaszkularizáció a domináns patológia, például a a szem retinopátiája, neovaszkuláris glaukóma; börrendellenességek, például pszoriázis; krónikus gyulladás; reumatoid artrítisz; valamint, amint azt az előzőkben említettük, bizonyos neoplazmák főleg az angiogén neoplazmák kezelésében, a daganatos angiogenezis gátlásának hasznos eszközeként.
A találmány szerinti vegyületeketet beadhatjuk emlősöknek, beleértve az embereket is, kombinálva egy vagy több gyógyászatilag elfogadható hordozóval és/vagy higítóanyaggal, így állítva elő gyógyászati készítményt.
A hatóanyag megkívánt dózisa függ a kezelendő beteg életkorától, testsúlyától és állapotától, valamint az adagolás módjától és a kívánt kezelés időtartamától.
A gyógyászati készítményeket, amelyek például lokális, szem, orális, intravénás, szubkután kezelésre alkalmasak, szokásos módon állíthatjuk elő a szokásos adalékanyagok felhasználásával.
A lokális kezelésre alkalmas készítményeket, például a krémeket, borogatóvizeket vagy pasztákat úgy állíthatjuk elő, hogy az aktív adalékanyagot szokásos olajos vagy emulgeáló töltőanyagokkal keverjük össze. A lokális kezelésre használt borogatóvizek tartalmazhatnak például 10-100 mg/ml aktív adalékanyagot, és akár hétszer is alkalmazhatók egy nap az érintett területen.
Pufferben vagy fiziológiás sóoldatban vagy más megfelelő hordozóanyagban levő készítmények használhatók szemcseppekként.
• · · • · 9 ·* ··
A szájon át való adagolásra használt készítmények, azaz a tabletták vagy kapszulák a hatóanyag mellett tartalmazhatnak higítőanyagokat, például laktózt, dextrózt, szacharózt, cellulózt, kukoricakeményítöt vagy burgonyakeményítöt; csúsztatószereket, például szilikátot, talkumot, szt-ear insavat, magnézium- vagy kalcium-sztearátot és/vagy polietilén-glikolt; kötőanyagokat, például keményítőket, arabikumokat, zselatint, metil-cellulőzt, karboximeti1-cellulózt vagy polivinil-pirrolidont; dezaggregáló anyagokat, például keményítőt, alginsavat, alginátokat vagy keményítö-glikolát-nátriumsckat; pezsgő anyagokat; festékeket; édesítőszereket; nedvesítő anyagokat, például lecitint,poliszorbátokat, laurilszulfátokat; és általában nem-toxikus, farmakológiailag inaktív vegyületeket használnak a gyógyászati készítményekben. Az említett gyógyászati készítményeket szokott módon lehet előállítani, például keveréssel, granulálással, tablettázással, cukorbevonással vagy filmképző eljárásokkal.
Az intramuszkuláris injekciók szuszpenziói vagy oldatai a hatóanyaggal együtt tartalmazhatnak egy győgyászatilag elfogadható hordozóanyagot, például steril vizet, olívaolajat, etil-oleátot, glikolokat, pl. propilén-glikolt, és ha szükséges, akkor megfelelő mennyiségű lidokain-hidrokloridot.
Az intravénás injekciók vagy infúziók hordozóként tartalmazhatnak például steril vizet, vagy előnyösebben, egy steril, vizes, izotóniás sóoldat formájában lehetnek.
A találmány szerinti hatóanyagokat beadhatjuk mind győgyászatilag elfogadható sók, mind komplexek formájában.
-21A savak közé tartoznak a savaddíciós sók, mind a szervetlen kénsav és maleinsav, sók, azaz foszforsav citromsav, például a sósav, hidrogén-bromid, valamint a szerves savak, azaz a ecetsav, benzoesav borostyánkösav, aszkorbinsav és borkösav.
A komplexek lehetnek például cink vagy vas komplexek.
MMsz.erek
1) A plazmidok előállítása
A szintetikus fragmenteket úgy állítjuk elő, hogy átlapoló szekvenciájú oligonukleotidokat szintetizálunk egy Applied Biosystem 380B modell automata DNS szintetizátorral. A nukleotid szekvenciákat a didezoxi szekvenálási módszerrel határozzuk meg, miután a fragmenteket M13 vektorba szubklónoztuk [Messing J.: Methods Enzymol, JLQ1, 20-78 (1983)].
A restrikciós enzimeket a ligázt és a polimerázt a gyártók előírása szerint használjuk, az E.coli sejteket az ismert módszerekkel transzformáljuk [Maniatis T., Fritsch E.F. and Sambrook J.: Molecular cloning. A laboratory manual; Cold Spring Harbour Laboratory; Cold Spring Harbour, NY (1982)].
2) Mutagenezis
A vad típusú bFGF szintetikus szekvenciát, akár humán akár szarvasmarha fehérjét kódol, M13 fágvektorba klónozzuk. A rekombináns fágvektorok egyszálú formáját az ismertetett módszerek szerint növesztjük [Messing J. : MJethods Enzymol,
1Ö1, 20-78 (1983)].
Ezekből az egyszálú M13 melegítünk 10 mmól TRIS-HC1 NaCl összetételű oldatban oligonukleotidokkal szobahőmérsékletre hűtve, komponenseket adjuk hozzá: 0.12 mmól; dATP 0.04 mmól Klenow fragment és 0.5 egység végtérfogat 6 mmól MgC12, órán át E.coli JM szerint Molecular
Laboratory;
A
DNS-ekböl 20 (pH=7.5), 0.1 mmól percig, majd hibridizáljuk Ezt követően (az E.coli
T4 DNS ligáz ni 35 mmól TRIS-HC1
0.006 mmől DTT összetételű ng-ot 95°C-ra EDTA, 50 mmól a megfelelő lépésenként a következő dCTP, dGTP, dTTP végkoncentrációban, 1 egység DNS polimeráz nagy fragmentje), (Boehringer Mannheim). A (pH=7.5), 0.1 mmól EDTA, oldatban. Miután 12
DNS oldatot használjuk az ismert eljárás and Sambrook J.: Cold Spring Harbour
NY (1982)].
oligonukleotidok radioaktivan
15°C-on inkubáltuk, ezt a
101 sejtek transzfekciójára, [Maniatis T., Fritsch E.F. cloning. A laboratory manual;
Cold
Spring Harbour kívánt mutációkat okozó jelzettek, a jelzéshez 150 nCi (gamma-32 P) ATP-t (New England Nuclear 6000 Ci/mmól) használunk 70 mmólos TRIS-HC1 pufferben (pH=8), amely 50 pl reakcióelegyben 10 mmól MgCls-ot, 5 mmól DTT-t és 10 egység T4 polinukleotid kinázt tartalmaz, az elegyet 30 percig 37°C-on inkubálva. Ezután a jelzett oligonukleotidokat használjuk tarfolt hibridizáláshoz, a ’mutagenizált fág DNS-ek kimutatására.
A hibridizálást éjszakán át 65°C-on végezzük 10 mmól TRIS-HCl-ben (pH=8.0), amely 3x SSC-t, 0.1% SDS-t lOx Denhardt oldatot és 0.2 mg/ml denaturált lazac-sperma DNS-t tartalmaz.
-23A nitrocellulóz szürölapokat 30 percig 0.4x SSC, 0.1% SDS összetételű oldatban mossuk 65°C-on, az oldatot többször cserélve, majd éjszakán át röntgrn filmre helyezve exponáljuk. A pozitív hibridizációt mutató tarfoltokat kiválasztjuk és Sanger didezoxinukleotidős módszerével szekvenáljuk, az Amersham M13 szekvenáló kit felhasználásával.
ug/ml tetraciklint tartalmazó Luria táptalajt
0.4% glükózzal, 0.4% 1 azé es mögött levő gén expressziójának indukciójára.
táptalajban, a sejteket centrifugálással kinyerjük. A baktérium-tenyészetek alikvot részeit minta-felvivö pufferben szuszpendáljuk, majd SDS-PAGE módszerrel vizsgáljuk Laemmli módszervei [Laemmli U.K.:
Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4; Natúré, 22Z, 680-685 (1985)].
Egy másik módszer szerint a sejteket lizozimmal vagy ultrahangos kezeléssel feltárjuk, majd az oldható és oldhatatlan frakciókat centrifugálással való elválasztás után külön vizsgáljuk.
Elektroforézis után a géleket
Coomassie blue festékkel festve megfestjük az összes sejtfehérjét.
Western biottot csinálunk olyan poliklonális nyúl antiszérummal, amely bFGF eredetű szintetikus peptidek ellen • · · · • ·
-24készült. Második antitestként biotinilezett kecske anti-nyúl IgG-t tartalmazó Vectastatin ABC kiteket (Vector Laboratories, Ca. USA) használunk a gyártó előírásai szerint.
Aa ábrák magyarázata
1. ábra: Az alap FGF mai napig izolált különböző természetes formáinak sematikus bemutatása. A 155 aminosavas formát a cDNS nukleotid szekvenciájából következtették ki.
2. ábra: A humán és szarvasmarga FGF aminosav szekvenciáját mutatja be. A két szekvencia a 121-es és 137-es halyen tér el egymástól. A szarvasmarha formának megfelelő aminosavakat kiemelt karakterekkel mutatjuk be.
3. ábra: Ezt az ábrát már publikálták [Yoshida T., Miyagawa
K., Odagiri H. , Sakamoto H., Little P.F.R., Terada M. and Sugimura T.: Genomic sequence of hst, a transforming gene encoding a protein homologous to fibroblast growth factors and the int-2-encoded protein; Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
7305-7309 (1987)].
A hst fehérje, a humán alap FGF (hbFGF) a humán savas FGF (haFGF) és az egér int-2 fehérje teljes aminosav-szekvenciája szerepel egymás mellett és van összehasonlítva. A kötőjelek az optimális illesztéés céljából bevitt hiányokat mutatják. A hst szekvenciával azonos csoportok be vannak keretezve. A szekvencia sorok feletti számok a hst csoportoknak felelnek meg.
4. ábra: Az alap FGF származékok sematikus bemutatása. A számok a 155 aminosavas formának felelnek meg. A kitöltött • · ·· • · ·· ······♦ · régiók a kiesett aminosav szekvenciáknak felelnek meg. A fekete pontok az egyes aminosav helyettesítéseknek felelnek meg.
5. ábra: A humán bFGF és mutánsai teljes aminosav szekvenciáját mutatja egymáshoz illesztve. A kötőjelek a kihagyott aminosavaknak felelnek meg. A csillagok az egyes aminosav cseréket mutatják.
6. ábra: A humán és szarvasmarha bFGF nukleotid szekvenciája. Ezt a szekvenciát szintetikusan állítottuk elő és használtuk a bFGF expresszálására. Az első 20 aminosav
| kodonját, | amelyeket csillag jelöl, módosítottuk, anélkül |
| hogy a megí | felelő aminosav sorrendet megváltoztattuk volna. |
| Azokat a | kodonokat, amelyek a szarvasmarha szekvenciában a |
| két eltérő | aminosavat kódolják, aláhúztuk. |
| 7. ábra: A | pDS20 az az általános plazmid háttér, amelyet a |
bFGF expressziős plazmidok készítésénél felhasználtunk. A galK gént a bFGF génnel helyettesítve és a Ptrp expressziós szignál, valamint a lambda fág cll Shine-Dalgarno szekvencia beépítésével kapjuk a pFC80 szerkezetet.
A jelen találmány tárgya az alap FGF új származékainak előállítása. A kiindulási alap FGF molekula lehet akár humán vagy szarvasmarha eredetű.
Ezek az új, rekombináns DNS technikával előállított származékok a bFGF 155 aminosavas formájának deléciős vagy szubsztitúciós mutánsai. A szakirodalomból ismert, hogy a humán és a szarvasmarha alap FGF különböző formákban izolálható, amelyek között a különbség csak az NHz végi meghosszabbításban van. Pontosabban, úgy látszik, hogy a 126
aminosav hosszúságú, valamint a 157 aminosav hosszúságú forma egyformán aktív.
A jelen találmány végrehajtása során mutációkat vittünk be a bFGF molekula különböző régióiba, amelyek elég messze vannak ettől a heterogén NHz-terminális doméntöl. Példaként használtuk a 155 aminosavas formát. Az nyilvánvaló tehát, hogy a jelen találmány tárgyát képező módosításokat a bFGF más formáin is végre lehet hajtani, például a 126-157 aminosavas formák bármelyikén
Amint azt a korábbiakban kijelentettük, a találmány szerinti új molekulák a vad típusú bFGF molekula antagonistáiként és/vagy szuperagonistáiként működhetnek. Amint azt korábban említettük, a bFGF antagonisták részben értékes eszközök lehetnek a daganatos angiogenezis gátlásában. A bFGF szuperagonistái a natív szekvenciához képest értékesebb farmakolőgiai tulajdonságokkal rendelkezhetnek.
A jelen találmány szerinti vegyületek biológiai aktivitásának értékelése lehetővé tette hogy megkülönböztessük a bFGF molekula egyes régióit, amelyek különösen fontosnak tűnnek a bFGF biológiai és biokémiai tulajdonságai szempontjából.
Az ilyen régiók, pontosabban az ΜΙ-bFGF, M2-bFGF és M3-bFGF származékokból kihagyott régiók azonosítása azt sugallja, hogy további mutációk (szubsztitúciók, deléciók vagy módosítások) ugyanabban a régióban, megnövekedett gyógyászati értékű bFGF származékokhoz vezetnek.
A jelen találmány oltalmi körébe ezek a további mutációk is beletartoznak.
···· ·· · ·· ·
-27• · · · · · · • · · · · · ···· ·· ·· ·»···*· ·
Amint azt már említettük, a jelen találmány tárgya továbbá rekombináns DNS eljárás ezeknek az új molekuláknak az előállítására. Érdekes módon ez az eljárás sikeresen alkalmazható a vad-típusú bFGF előállítására is. Ismételten, az összes említett megfontolás egyformán érvényes a humán és szarvasmarha alap FGF szekvenciákra is.
A jelen találmány szövegében ismertetett rekombináns DNS eljárás a kívánt FGF molekulát kódoló gént tartalmazó plazmid DNS-sel transzformált E.coli baktérium törzseken alapul. A jelen találmány szerzői természetesen tudják, hogy más rekombináns DNS is közöltek már [Iwane M., Kurokawa T., Sasada R. , Seno M., Nakagawa S., Igarashi K.: Ezpressicn of cDNS encoding humán basic fibroblast growth factor in E.coli; Biochem. Biophys. Rés. Commun., 146. 470-477 (1987)].
Azonban az itt ismertetett eljárás új jellemzőkkel bír és nagymennyiségű rekombináns bFGF-et eredményez, amelyet eddig még nem írtak le.
Ennek az eljárásnak egyik fő jellemzője az alap FGF termelésében gazdaként alkalmazott E.coli törzs típusa. Tény, hogy az ismert, hogy a törzs típusa az egyik fö paraméter, amely befolyásolja a heterológ génexpressziót E.coli-ban [Harris T.J.R. and Emtage J.S.: Expression of heterologous genes in E.coli; Microbiological Sciences, 3, 28-31 (1986)].
A jelen találmány szerint a B típusú E.coli törzsek nagyon hatékony gazdaszervezetek a rekombináns bFGF, valamint a bFGF származékok termelésére. Valóban, ha ugyanazt a bFGF expressziós vektort egy másik E.coli törzsbe • · ·
-28építjük be (például K-12, C, stb. típusúba), akkor nem keletkezik annyi bFGF.
A jelen eljárás egy másik jellemzője néhány optimizált kodon beépítése a különböző bFGF molekulákat kódoló génekbe. A szerzők úgy találták, hogy szükséges volt bizonyos számú DNS kodont módosítani az aminosav-sorrend megtartása mellett, hogy megnöveljék az expresszió szintjét. A választott DNS kódoló szekvenciát a jelen találmány szövegében közöljük (lásd 6. ábra).
Ez a két jellemző, a gazdaszervezetként használt törzs típusa, és az optimalizált kodonok, az újdonság a jelen, a bFGF és mutánsai előállítására használt rekombináns DNS eljárásban. Ezt a két szempontot a mai napig nem említették vagy publikálták a szakirodalomban az alap bFGF-re vonatkoztatva.
Claims (22)
1. Egy humán vagy szarvasmarha alap fibroblaszt növekedési faktor, azzal jellemezve, hogy a 27-32 sorszámú aminosavak (Lys-Asp-Pro-Lys-Arg-Leu) hiányoznak belőle, a fenti aminosavak számozása megfelel a humán vagy szarvasmarha
FGF 155 aminosavas formájának.
faktor.
azzal jellemezve, hogy az 54-58 sorszámú (Glu-Lys-Ser-Asp-Pro) hiányoznak belőle, a fenti aminosavak számozása megfelel a humán vagy szarvasmarha alap FGF 155 aminosavas formájának.
3. Egy humán vagy szarvasmarha alap fibroblaszt növekedési faktor, azzal jellemezve, hogy a 70-75 sorszámú aminosavak (Gly-Val-Val-Ser-Ile-Lys) hiányoznak belőle, a fenti aminosavak számozása megfelel a humán vagy szarvasmarha alap FGF 155 aminosavas formájának.
4. Egy humán vagy szarvasmarha alap fibroblaszt növekedési faktor, azzal jellemezve, hogy a 78-83 sorszámú aminosavak (Cys-Ala-Asn-Arg-Tyr-Leu) hiányoznak belőle, a fenti aminosavak számozása megfelel a humán vagy szarvasmarha alap FGF 155 aminosavas formájának.
·«· ····
-30•
5. Egy humán vagy szarvasmarha alap fibroblaszt növekedési faktor, azzal jellemezve, hogy a 110-120 sorszámú aminosavak (Asn-Asn-Tyr-Asn-Thr-Tyr-Arg-Ser-Arg-Lys-Tyr) hiányoznak belőle, a fenti aminosavak számozása megfelel a humán vagy szarvasmarha alap FGF 155 aminosavas formájának.
6. Egy humán vagy szarvasmarha alap fibroblaszt növekedési faktor, azzal Jellemezve, hogy a 128-as sorszámú aminosavat (Lys) és a 129-es sorszámú aminosavat (Arg) glutaminnal (Gin) helyettesítjük, a fenti aminosavak számozása megfelel a humán vagy szarvasmarha alap FGF 155 aminosavas formájának.
7. Egy humán vagy szarvasmarha alap fibroblaszt növekedési faktor, azzal jellemezve, hogy mind a 118-as (Arg), mind a 119-es (Lys), mind a 123-as (Lys) és a 129-es sorszámú aminosavat (Arg) glutaminnal (Gin) helyettesítjük, a fenti aminosavak számozása megfelel a humán vagy szarvasmarha alap FGF 155 aminosavas formájának.
8. Egy humán vagy szarvasmarha alap fibroblaszt növekedési faktor származék, azzal jellemezve, hogy a humán vagy szarvasmarha bFGF bármely természetes formáját tartalmazza, az előző igénypontok bármelyike szerinti mutációkkal.
9. Az előző igénypontok bármelyike szerinti bFGF származék, azzal jellemezve, hogy az NH2 és/vagy a COOH terminálison további aminosavakat tartalmaz.
10.
Az előző igénypontok bármelyike szerinti bFGF származék, azzal jellemezve, hogy tartalmaz vagy nem tartalmaz glikozidos oldalláncokat.
11.
igénypontok bármelyike szerinti bFGF származék, aZZc.1 hogy bFGF szuperagonistaként használják.
12. Az előző igénypontok bármelyike szerinti bFGF származék, azzal jellemezve, hogy bFGF antagonistaként használják.
13. A 12. igénypont szerinti bFGF származék, daganatos angiogenezis gátlására.
14. Rekombináns DNS eljárás, az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti alap fibroblaszt növekedési faktor származék előállítására.
15. A pFCSO expressziós plazmid, azzal jellemezve, hogy természetes vagy módosított, humán vagy szarvasmarha bFGF aminosav szekvenciát kódoló genomiális DNS, cDNS, szintetikus vagy módosított gén expresszálására használják.
16. A 15. igénypont szerinti expressziós plazmid, azzal jellemezve, hogy legalább egy olyan gént tartalmaz, amely antibiotikum rezisztenciát, vagy bármely más szelektálható markert kódol.
17. A 15. vagy 16. expressziős plazmid, igénypontok bármelyike szerinti azzal jellemezve, hogy az 1-10.
-32igénypontok bármelyike szerinti származékot kódoló gén expresszálására használják.
18. B típusú E.coli törzsek alkalmazása humán vagy szarvasmarha bFGF rekombináns származékok előállítására.
19. B típusú E.coli törzsek alkalmazása az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns származékok előállítására.
20. A 15. vagy 16. igénypont szerinti plazmid és egy B típusú E.ooli törzs alkalmazása az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti származékok előállítására.
21. A 6. ábra szerinti DNS szekvencia.
22. B típusú E.coli törzsek és a 6. ábra szerinti DNS szekvencia kombinált alkalmazása rekombináns humán vagy szarvasmarha bFGF előállítására.
23. B típusú E.coli törzsek és a 6. ábra szerinti DNS szekvencia kombinált alkalmazása az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns származék előállítására.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB888821795A GB8821795D0 (en) | 1988-09-16 | 1988-09-16 | New derivatives of human/bovine basic fibroplast growth factor |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU895573D0 HU895573D0 (en) | 1990-11-28 |
| HUT53937A true HUT53937A (en) | 1990-12-28 |
Family
ID=10643728
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU895573A HUT53937A (en) | 1988-09-16 | 1989-09-16 | Process for producing human fibroblast growth factor derivatives |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (2) | EP0396664A1 (hu) |
| JP (1) | JP2888575B2 (hu) |
| KR (1) | KR900702027A (hu) |
| CN (1) | CN1041181A (hu) |
| AT (1) | ATE98693T1 (hu) |
| AU (1) | AU620925B2 (hu) |
| CA (1) | CA1340834C (hu) |
| DE (1) | DE68911461T2 (hu) |
| DK (1) | DK120290A (hu) |
| ES (1) | ES2061855T3 (hu) |
| FI (1) | FI902391A0 (hu) |
| GB (1) | GB8821795D0 (hu) |
| HU (1) | HUT53937A (hu) |
| IL (1) | IL91615A0 (hu) |
| MY (1) | MY104910A (hu) |
| NO (1) | NO902176L (hu) |
| NZ (1) | NZ230621A (hu) |
| PT (1) | PT91719B (hu) |
| WO (1) | WO1990002800A1 (hu) |
| YU (1) | YU179489A (hu) |
| ZA (1) | ZA897020B (hu) |
Families Citing this family (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5143829A (en) * | 1990-03-29 | 1992-09-01 | California Biotechnology Inc. | High level expression of basic fibroblast growth factor having a homogeneous n-terminus |
| US5478804A (en) * | 1990-09-19 | 1995-12-26 | The Salk Institute For Biological Studies | Treatment of tumorigenic pathophysiological conditions with FGF-cytoxic conjugates |
| US6833354B1 (en) | 1990-12-19 | 2004-12-21 | Kaken Pharmaceutical Co., Ltd. | Agent for the treatment of bone diseases |
| JP3135138B2 (ja) * | 1990-12-19 | 2001-02-13 | 科研製薬株式会社 | 骨疾患治療剤 |
| DE69205466T2 (de) * | 1991-03-21 | 1996-05-30 | Procter & Gamble | Mittel zur Kontrolle von Hautfalten, die die Arg-Ser-Arg-Lys-Sequenzen enthalten. |
| JP3303211B2 (ja) * | 1991-04-26 | 2002-07-15 | 武田薬品工業株式会社 | ｂＦＧＦムテインおよびその製造法 |
| TW275068B (hu) * | 1993-09-24 | 1996-05-01 | American Cyanamid Co | |
| AUPO247496A0 (en) | 1996-09-23 | 1996-10-17 | Resmed Limited | Assisted ventilation to match patient respiratory need |
| US6214795B1 (en) | 1996-11-12 | 2001-04-10 | Praecis Pharmaceuticals, Inc. | Peptide compounds useful for modulating FGF receptor activity |
| US6274712B1 (en) | 1997-12-23 | 2001-08-14 | 3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc. | Analogs of human basic fibroblast growth factor mutated at one or more of the positions glutamute 89, aspartate 101 or leucine 137 |
| FR2780416B1 (fr) * | 1998-06-10 | 2002-12-20 | Rhone Poulenc Nutrition Animal | Procede industriel de production de proteines heterologues chez e. coli et souches utiles pour le procede |
| WO2001013031A2 (en) | 1999-08-13 | 2001-02-22 | Chiron Corporation | Dose of an angiogenic factor and method of administering to improve myocardial blood flow |
| DE69933057T2 (de) * | 1999-12-22 | 2007-03-15 | Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. | Analoge des humanen basischen fibroblasten-wachstumsfactors |
| CA2430112C (en) | 2000-11-27 | 2010-07-27 | Dnavec Research Inc. | Paramyxovirus vector encoding angiogenesis gene and use thereof |
| US8772460B2 (en) * | 2011-12-16 | 2014-07-08 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Thermostable FGF-2 mutant having enhanced stability |
| CN106957359B (zh) * | 2016-08-31 | 2020-04-24 | 黄志锋 | Fgf1突变体及其医药应用 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK122687A (da) * | 1986-03-14 | 1987-09-15 | Takeda Chemical Industries Ltd | Polypeptid, dna og anvendelse deraf |
| JPH01501840A (ja) * | 1987-01-16 | 1989-06-29 | アムジエン・インコーポレーテツド | 繊維芽細胞成長因子の産生 |
| JP2526965B2 (ja) * | 1987-02-24 | 1996-08-21 | 武田薬品工業株式会社 | ムテイン，ｄｎａおよびその用途 |
| EP0377579A1 (en) * | 1987-07-07 | 1990-07-18 | California Biotechnology, Inc. | Recombinant fibroblast growth factors |
| EP0326907A1 (en) * | 1988-01-26 | 1989-08-09 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Polypeptide, DNA and its use |
-
1988
- 1988-09-16 GB GB888821795A patent/GB8821795D0/en active Pending
-
1989
- 1989-09-12 IL IL91615A patent/IL91615A0/xx unknown
- 1989-09-12 NZ NZ230621A patent/NZ230621A/en unknown
- 1989-09-14 ZA ZA897020A patent/ZA897020B/xx unknown
- 1989-09-14 CN CN89107069A patent/CN1041181A/zh active Pending
- 1989-09-14 MY MYPI89001258A patent/MY104910A/en unknown
- 1989-09-14 PT PT91719A patent/PT91719B/pt not_active IP Right Cessation
- 1989-09-14 CA CA000611335A patent/CA1340834C/en not_active Expired - Fee Related
- 1989-09-15 EP EP89910440A patent/EP0396664A1/en active Pending
- 1989-09-15 WO PCT/EP1989/001075 patent/WO1990002800A1/en not_active Application Discontinuation
- 1989-09-15 AU AU43171/89A patent/AU620925B2/en not_active Ceased
- 1989-09-15 YU YU01794/89A patent/YU179489A/xx unknown
- 1989-09-15 DE DE68911461T patent/DE68911461T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1989-09-15 ES ES89117112T patent/ES2061855T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1989-09-15 JP JP1509755A patent/JP2888575B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1989-09-15 AT AT89117112T patent/ATE98693T1/de not_active IP Right Cessation
- 1989-09-15 EP EP89117112A patent/EP0363675B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-09-16 HU HU895573A patent/HUT53937A/hu unknown
-
1990
- 1990-05-14 FI FI902391A patent/FI902391A0/fi not_active IP Right Cessation
- 1990-05-15 NO NO90902176A patent/NO902176L/no unknown
- 1990-05-15 DK DK120290A patent/DK120290A/da not_active Application Discontinuation
- 1990-05-16 KR KR1019900701019A patent/KR900702027A/ko not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| MY104910A (en) | 1994-06-30 |
| PT91719B (pt) | 1995-05-31 |
| DK120290A (da) | 1990-07-16 |
| CA1340834C (en) | 1999-11-30 |
| NO902176D0 (no) | 1990-05-15 |
| ATE98693T1 (de) | 1994-01-15 |
| DK120290D0 (da) | 1990-05-15 |
| EP0363675A1 (en) | 1990-04-18 |
| AU620925B2 (en) | 1992-02-27 |
| DE68911461T2 (de) | 1994-05-19 |
| PT91719A (pt) | 1990-03-30 |
| JPH03501855A (ja) | 1991-04-25 |
| IL91615A0 (en) | 1990-04-29 |
| AU4317189A (en) | 1990-04-02 |
| ZA897020B (en) | 1990-08-29 |
| WO1990002800A1 (en) | 1990-03-22 |
| NO902176L (no) | 1990-07-13 |
| HU895573D0 (en) | 1990-11-28 |
| NZ230621A (en) | 1992-06-25 |
| FI902391A0 (fi) | 1990-05-14 |
| KR900702027A (ko) | 1990-12-05 |
| GB8821795D0 (en) | 1988-10-19 |
| ES2061855T3 (es) | 1994-12-16 |
| JP2888575B2 (ja) | 1999-05-10 |
| EP0396664A1 (en) | 1990-11-14 |
| EP0363675B1 (en) | 1993-12-15 |
| CN1041181A (zh) | 1990-04-11 |
| YU179489A (en) | 1991-10-31 |
| DE68911461D1 (de) | 1994-01-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HUT53937A (en) | Process for producing human fibroblast growth factor derivatives | |
| US6737404B2 (en) | Methods of using analogs of human basic fibroblast growth factor mutated at one or more of the positions glutamate 89, aspartate 101 or leucine 137 | |
| FI96316C (fi) | bFGF:n muteiinia koodaava DNA, mainittua DNA:ta sisältävä transformoitu bakteeri ja menetelmä muteiinin tuottamiseksi | |
| US5352589A (en) | Deletion mutant of basic fibroblast growth factor and production thereof | |
| US5223483A (en) | Cysteine-modified acidic fibroblast growth factor | |
| JP4280786B2 (ja) | 同一のｎ末端を有する塩基性繊維芽細胞増殖因子の高レベル発現 | |
| NZ245047A (en) | Hybrid transforming growth factor and recombinant dna encoding such a hybrid | |
| US20240182521A1 (en) | Cell-penetrating peptide variant and use thereof | |
| DK174961B1 (da) | Fibroblast-vækstfaktor, nucleotidsekvens kodende derfor, præparat indeholdende faktoren og fremgangsmåde til fremstilling deraf | |
| EP1248844B1 (en) | Analogs of human basic fibroblast growth factor | |
| CZ98097A3 (en) | Acid fibroblast growth factor analogs exhibiting increased stability and biological activity | |
| US5312911A (en) | Cysteine-modified acidic fibroblast growth factor | |
| EP0421455B1 (en) | A mutein of HST-1 and production thereof | |
| EP0613946B1 (en) | hst-2 Mutein, DNA coding for the same and preparation thereof | |
| RU2454425C2 (ru) | Производные метастина и их применение | |
| JP3127246B2 (ja) | ポリペプチド，ｄｎａおよびその用途 | |
| JPH07126293A (ja) | ｈｓｔ−２ムテイン、その製造法および用途 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| DFC9 | Refusal of application |