PT86558B - Processo para a preparacao de factores de desenvolvimento de fibroblastos basicos - Google Patents
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Description
PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE FACTORES DE DESENVOLVIMENTO
DE FIBROBLASTOS BÁSICOS
A presente invenção diz respeito a um método para a preparação de factor de desenvolvimento de fibroblastos básicos recombinante numa estirpe hospedeira de Ελ Coli. Em especial, a presente invenção refere-se a um método para a produção de factor de desenvolvimento de fibroblastos básicos humano recombinante (r-bFGF humano) numa estirpe hospedeira de E. Coli e a polinucleotidos que codificam esses factores.
Antecedentes da Invenção factor de desenvolvimento de fibroblasto (FGF) foi de_s crito primeiramente por GOSPODAROWICZ, Nature 249; 123 (1974) como uma actividade proveniente de cérebro bovino ou de tecido de pituitária bovina que era mitogenico para fibroblastos e para células endoteliais. Mais tarde, verificou-se que o principal mitogénio do cérebro era diferente do isolado da pituitária . Estes dois factores foram nomeados FGF ácidos e FGF básicos porque exibiam actividades biológicas semelhantes senão iguais , mas que eram diferentes no seu ponto isoeiéctrico. Subsequentemente, outros mitogenes de células endoteliais foram isolados de numeroro tecidos e de tumores que eram muito semelhantes ou idênticos ao FGF básico. Tais factores incluem, por exemplo , o factor de desenvolvimento derivado de hepatoma (Klagsbrun, et al., PNAS, 83, 2448-2452 (1986) e Lobb et al., J. Biol. Chem., 2· 7 {
23, 6295-6299 (1984) , factor de crescimento derivado do condrossarcoma (Shing et al., Science, 223, 1296-1299 (1984) , factor de crescimento derivado de retina (Baird et al., Biochemistry, 24 , 7855-7860 (1985) factor de desenvolvimento derivado de cartila gem (Sullivan and Klagsbrun, J. Biol. Chem. , 260, 2399-2403 (1985) , factor 2 de desenvolvimento astroglial (Pettman et al.,
FEBS Lett., 189, 102-108), factor de desenvolvimento derivado dos olhos (Courty et al., Biochimie, 67 , 265-2698 (1985) , fac.
tor de desenvolvimento de derivado do hipotalamo cationico Klagsbrun e Sching, PNAS, 82, 805-809 (1985) , factores de desenvolvimento ligados a heparina da classe 2 e heparina (Lobb and Fett, Biochemistry, 23, 6265-6299 (1984) ; Lobb et al., Biochem.,
24, 4969-4973 (1985); Lobb et al., BBRC, 131, 586-592 (1985) ;
Lobb et al., Y. Biol. Chem., 261 , 1924-1928 (1986) , e um compo^ nente de factor de desenvolvimento derivado de macrófagos (Baird et al., BBRC, 126, 358-364 (1985) .
Todos os factores referidos anteriormente partilham uma propriedade de FGF básico de ligação forte com heparina e com to das as proteínas básicas. Porém, foi descoberto um grupo idênti_ co de factores de ligação com heparina designado por FGF ácido . Estas moléculas eluem da heparina para uma concentração de clore to de sódio inferior e têm pontos isoelêctricos na zona ácida. A propriedade da ligação a heparina destes factores tem facilitado a sua purificação permitindo isolamento de proteínas suficientes para a análise de sequências aminoacidas em diversos casos.
Ainda que a utilização de heparina tenha permitido a pjj rificação de FGF, o uso da heparina em grande escala dos processos de purificação ê indesejável devido ao grande custo, possi
IW'
vel contaminação do produto com heparina e baixo rendimento devido à ligação irreversível a heparina.
Os GFG básico e ácido são provavelmente derivados do mesmo gene ancestral e são homólogos em 50% na sequência de aminoácidos e possuem a mesma estrutura de intrão/exão.
Experiências de marcação de Southern sugerem que existe apenas um gene para cada FGF ácido e básico. Diferenças entre as moléculas isoladas de diversos tecidos são provavelmente devidas a processamentos post-trans1 acionais . A escala de actividades biológicas das duas classes apresenta-se como idêntica ai_n da que o FGF básico seja cerca de 10 vezes mais potente que o FGF ácido, na maior parte dos sistemas de bio-ensaio.
FGF básico e uma cadeia simples de proteínas não g1ico sadas com um peso molecular de aproximadamente 16.500. 0 FGF básico contem quatro resíduos de cisteína, mas o numero de ligações de dissulfureto, se existe algum, é desconhecido. Foi proposto um produto de tradução principal possuindo cento e cinquenta e cinco aminoácidos para o FGF básico mas a forma principal encoji trada no tecido da pituitária possui 146 aminoácidos. Formas com diversos pesos molecular , diferindo no comprimento do N-termj_ nal, tem sido isoladas a partir de diferentes tecidos, as quais se apresentam todas como retendo actividade biológica. 0 FGF e uma proteína acentuadamente básica com ponto isoelêctrico de 9,6. 0 FGF básico liga-se avidamente ã heparina eluindo de colunas de sefaro. se heparinizada em cloreto de sódio a cerca de 1,6 Μ. A actividade biológica de FGF foi destruída pelo calor a 70°C ou por agen tes detergentes. A proteína apresenta-se estãyel a temperatura de 37°C durante longos períodos. No genoma, sequências que co
di ficam para este produto de tradução, são interrompidas por dois intrões ; o primeiro divide o codão 60 e o segundo separa os codões 94 e 95. A dimensão da região codificadora genõmica completa não é conhecida, mas possui, pelo menos, 34 Kb de comprimento .
gene para o FGF básico está localizado no cromossoma 4.
Os primeiros dados da sequência para FGF básico foram publicados por BOHLEN et al, PNAS, 81, 5364-5368 (1984) que de terminou os quinze aminoacidos do N-terminal de material purifi_ cado de tecido te pituitária bovina. Subsequentemente, ESCH et al., PNAS, 82, 6507-6511, (1985) referiu a sequência completa de FGF básico de pituitária bovina e simultaneamente comparou-o com a sequência amino-terminal do FGF ácido. 0 pedido de patente de invenção PCT WO 86/07595 descreve a produção de bFGF em E. Coli. Contudo, os rendimentos registados desse produto são extremamente baixos. A clonagem do gene para FGF básico bovino foi primeiramente referida por ABRAHAM et al, Science, 233, 545-548 e posteriormente uma publicação dos mesmos autores descreyeu a sequência nucleotTdica e a organização genõmica do FGF bá sico humano (EMBO Journal , 5 , 2523-2528 (1 986) .
Sabe-se que os FGF básico humano e o boyino diferem ap£ nas de dois aminoácidos.
Ainda que preparações altamente purificadas de FGF bãsj_ co tenham sido obtidas apenas recentemente para investigação , têm sido publicados muitos estudos in vitro que utilizam material de vários estados de pureza. Nestes estudos descobriu-se que o FGF ê um potente mitogeno para uma grande variedade de células de origem mesodermica e pode ser quimio-tactico para células eji doteliais e fibroblastos. Além disso o FGF de ocorrência natu
-5ral e FGF básico recombinante derivado de tecidos, parecem induzir neovascularização na cornea do coelho e nos ensaios da membrana corioalantoica de frango, portanto o FGF pode ser utilizado na aceleração da cicatrização de feridas. Fourtanier et al., J. Inv. Derm., 87, 76-80 (1986), descreve que uma preparação proveniente de retina bovina era capaz de estimular a neovascularização e re-epitelização e promover a cicatrização de feridas num mo delo de vesículas de cobaias. Davidson et al., J. Cell. Biols., 100, 1219-1227 (1985) demonstraram que pode ser induzida a aceleração da cicatrização das feridas acompanhada por um aumento do tecido de granulação e de acumulação de colagéneo por factor derivado de cartilagem bovina no sistema de experimentação em feridas de ratos.BUNTROCK e colaboradores Exp. Path., 21, 46-53, and Exp. Path., 21, 62-67 (1982) também descreveram aumentos nos tecidos de granulação e neovascularização acompanhada com cicatrização acelerada das feridas em ratos utilizando um extracto de tecido do cérebro bovino.
Resumo da Invenção
A presente invenção descreve um processo para a produção dum polipeptido que possui uma parte ou toda a configuração estru tural principal e uma ou mais propriedades biológicas do factor de desenvolvimento de fibroblastos básicos humano o qual consiste em:
1) Desenvolver, sob condições nutrientes apropriadas céljj las hospedeiras de £. Coli transformadas com o vector plasmidico de DNA em que o vector plasmidico de DNA incorpora uma sequência de DNA que codifica para a expre£
-6- / são do hospedeiro de E. Coli de um polipeptido que possui uma parte de toda a configuração de estrutura principal de uma e/ou mais propriedades biológicas do factor de desenvolvimento de fibroblastos básicos humano , uma sequência de um promotor regulada e um gene de controlo do numero de copias induzidas pela tem peratura;
2) isolar os produtos de polipeptidos desejados da expre^s são de sequências de DNA no referido vector;
3) purificar o produto de polipeptido desejado.
A presente invenção também se refere a um método para a p£ rificação do factor de desenvolvimento de fibroblastos básicos r_e combinantes derivado de E^. Col i utilizando um sistema cromatografico que ê isento de heparina.
De acordo com a presente invenção são proporcionadas as sequências de DNA que codificam para toda ou parte do factor de d£ senvolvimento de fibroblastos básicos humano . Tais sequências de preferência podem incluir a incorporação de codões preferidos para a expressão por meio de estirpes hospedeiras de E. Coli escolhidas (codões de expressão Coli) e a previsão de sítios de clivagem por endonuclease por restrição; e o suprimento de sequejn cias de DNA adicionais, iniciais, terminais ou intermediárias que facilitam a construção de vectores que se exprimem faciImente.As novas sequências de DNA desta invenção incluem sequências úteis para garantir a expressão em células hospedeiras de £. Coli de produtos pol i peptfdi cos que possuem pelo menos uma parte da configuração estrutural principal e uma ou mais propriedades biológicas do factor de desenvolvimento de fibroblastos básicos de ocorrência
natural. As sequências de DNA desta invenção são especificamente aptas para compreenderem:
a) Uma sequência de DNA representada no quadro II ou as cadeias complementares;
b) uma sequência de DNA que hibridiza sob condições de hi_ bridação como as aqui referidas ou condições mais restritas) com as sequências de DNA representadas no qu£ dro II ou com os seus fragnmentos; e
c) uma sequência de DNA que, excepto para a degenerescência do código genético, hibridaria com a sequência de DNA representada no quadro VII.
Especificamente abrangido pela alínea c) são as sequências de DNA preparadas que codificam factor de desenyolvi mento de fibroblastos básicos os quais podem incorporar codões que facilitam a tradução do RNA mensageiro no hospedeiro microbiano. Estas sequências preparadas podem ser construídas facilmente de acordo com os métodos de Alton, et al., pedido de patente de invenção PCT publicado WO 83/04053.
A presente invenção proporciona produtos polipeptidicos isolados e purificados que possuem parte ou toda a configuração de estrutura principal, isto Ó, sequência contínua de resíduos de amj_ noacidos e uma ou mais das propriedades biológicas (p. ex. proprie dades imunolÓgicas e actividade biológica in vitro ) e propriedades físicas, (p. ex. , peso molecular), do factor de desenvolvimeji to fibroblasto básicos natural que inclui as suas variantes alêlicas.
Estes polipeptidos também são caracterizados como sendo o
PF1'
produto da expressão do hospedeiro de JE. Co 1 i de sequências de DNA exógenas obtidas por síntese genética. Os produtos polipeptídicos da presente invenção expressos nas células hospedeiras de _E. Coli são isentos de associação com quaisquer proteínas de mamífero . Além disso, os polipéptidos da presente invenção podem também incluir um resíduo de aminoácido metionina inicial (na po. si ção 1 da fi gura 2).
A presente invenção também abrange vários veículos de cio nagem replicáveis, veículos de expressão e culturas de £. Coli., transformado, todos exibindo a necesssária informação genética mo dificada para realizar de preferencia a produção de factor de desenvolvimento de fibroblastos básicos recombinante derivado de E. Col i .
Numerosos aspectos e vantagens-da presente invenção tornar -se-ão evidentes aos técnicos nesta matéria considerando a descri, ção detalhada que se segue, a qual proporciona o esclarecimento dentro da prática da presente invenção nos seus aspectos presente^ mente preferidos.
Breve Descrição dos Desenhos
A Fig. 1 é uma representação em diagrama do conjunto de genes de bFGF e clonagem.
A Fig. 2 representa as sequências nucleotídicas e de aminoácidos de bFGFs recombinantes. Os rectángulos desenhados a cheio representam os nucleõtidos e as alterações de aminoãcidos resultantes que foram produzidas por mutagénese de sítio dirigido afim de se converter o gene bovino num que codifica para bFGF humano.
A Fig. 3 representa um gráfico da actividade mitogénica
-9de bFGFs em células NIH3T3. 0 efeito mitogenico de bFGF humano (e) e bFGF bovino (o) em células NIH3T3 está ali representado.
A dose de bFGF é representada em relação a percentagem de estimulação máxima da síntese de DNA medida como a absorção de timidina 3H para aquela dose.
Descrição Detalhada da Presente Invenção
Tal como aqui é utilizada a designação factor de desenvolvimento de fibroblastos básico derivado de tecido refere-se ao factor de desenvolvimento dos fibroblastos básico, derivado de tumores, células eucariotidas mantidas em cultura, de tecidos nor mais e de equivalentes.
Tal como aqui se utiliza o termo preparado quando aplicado a uma sequência de DNA ou a um gene quer designar um prodji to sintetizado na sua totalidade por via química mediante reunião de bases nucleotídicas ou derivado de replicação biológica de um produto sintetizado quimicamente. Como tal o termo e exclusivo de produtos sintetizados por métodos de cDNA de metodologias de clonagem genomica que envolvem materiais iniciais que são inicialmente de origem biológica.
Tal como aqui ê utilizado a designação versões alelicas refere-se a modificações de um ou mais aminoacidos na sequência dos análogos do bFGF da presente invenção sem se alterar a actividade biológica dos análogos. Estas versões alelicas são avalia, das rapidamente por um técnico nesta matéria.
FGF básico recombinate derivado de _E. Col i foi produzido de acordo com o processo geral seguinte:
- a sequência de aminoácidos de FGF básico bovino publi cada por Esch et al PANS, 82, 6507-6511 (1985) foi utilizada C£ mo base para a síntese do gene de bFGF preparado para a expressão em _E. Coli . A sequência nucleotidica deste gene construído inclui codões, na sua maior parte utilizados frequentemente por Ek Coli e a inclusão de sítios de restrição convenientes para serem utili_ zados na clonagem.
Exemplos de genes construídos incluem o gene representado nos quadros I e 11 .
quadro I representa um gene construído para bFGF bovino e no quadro II representa-se um gene construído para bFGF humano.
Sintetizaram-se oligonucleÕtidos que correspondem a ambas as cadeias do gene, em secções sobrepostas e reuniram-se em duas secções maiores por meio de hibridação e subsequente ligação.Duas secções maiores, foram, em seguida, clonadas num vector fagico apropriado (isto é, M 13 mp 18) para análise de sequência núcleo, tidica. Estes vectores fagicos são rapidamente reconhecidos por um técnico nesta matéria. ApÕs verificação da sequência correcta ambas as secções foram excisadas por meio de digestão de endonuclease de restrição, o gel isolado e ligado num vector de expressão apropriado. A expressão do gene de bFGF codificado no plasmí deo é regulada por uma sequência de promotor regulada e o genes de controlo do numero de copias induziveis da temperatura localizados no vector de expressão.
A designação promotor regulado aqui utilizada refere-se a promotores P^ e ao promotor P^ encurtado (foreshortened). Os vectores de expressão que contem estes promotores regulados e os genes de controlo do numero de copias induzíveis da temperatura são descritos no pedido de patente de invenção europeu n?136.490.
-110 desenvolvimento deste plasmideo numa estirpe hospedeira de E_. Col i gera o produto polipeptTdico da presente invenção. Quando as células que contem bFGF são lisadas e submetidas a ceji trifugação de baixa velocidade, encontra-se no sobrenadante cerca de 70% de FGF sob uma forma solúvel. A purificação utilizando sis temas cromatograf i cos que não contem heparina, isto é, cromatogra_ fia de afinidade, resulta num produto pol i peptidi co que se estima possuir, pelo menos, 95% de pureza determinada por electroforese de gel de poliacri1amida e que virtualmente não contém endotoxina ou qualquer contaminação com DNA. A utilização de um sistema cro matogrãfico isento de heparina na purificação de bFGF permite, po£ tanto o aumento do rendimento e elimina a contaminação com produtos possíveis devido a heparina.
Quadro 1
Factor de desenvolviraento de fibroblastos básicos bovino/gene construído
3050
CTAGAAGGAGGAATAACATATGCCAGCTCTGCCAGAAGATGGTGGATCCGGTGCTTTCCC
GATCTTCCTCCTTATTGTATACGGTCGAGACGGTCTTCTACCACCTAGGCCACGAAAGGG
90110
GCCAGGTCATTTCAAAGATCCGAAACGTCTGTACTGCAAAAACGGTGGTTTTTTCCTGCG
CGGTCCAGTAAAGTTTCTAGGCTTTGCAGACATGACGTTTTTGCCACCAAAAAAGGACGC
130 150170
TATCCATCCGGATGGTCGTGTTGATGGTGTACGTGAGAAACTTGATCCGCATATCAAACT
ATAGGTAGGCCTACCAGCACAACTACCACATGCACTCTTTAGACTAGGCGTATAGTTTGA
190 210230
GCAGCTGCAAGCTGAAGAGCGTGGTGTAGTTTCTATTAAAGGTGTATGGTCTAACCGGTA
CGTCGACGTTCGACTTCTCGCACCACATCAAAGATAATTTCCACATACACGATTGGCCAT
250 270290
CCTGGCTATGAAAGAAGACGGTCGTCTGCTGGCTTCTAAGTGTGTTACTGACGAATGTTT
GGACCGATACTTTCTTCTGCCAGCAGACGACCGAAGATTCACACAATGACTGCTTACAAA
310 330350
CTTTTTCGAACGTCTGGAACTTAACAACTACAACACTTACAGACTTCGTAAATACTCTTC
GAAAAAGCTTGCAGACCTTAGATTGTTGATGTTGTGAATGTCTAGAGCATTTATGAGAAG
370 390410
CTGGTATGTAGCTCTGAAACGTACTGGTCAGTACAAACTGGGTCCGAAGACTGGTCCGGG
GACCATACATCGAGACTTTGCATGACCAGTCATGTTTGACCCAGGCTTCTGACCAGGCCC
430 450470
TCAGAAAGCTATCCTGTTTCTGCCGATGTCTGCTAAACTTTAATAGCTCGAGAAGCTT
AGTCTTTCGATAGGACAAAGACGGCTACAGACGATTTAGAATTATCGAGCTCTTCGAA
-!3Λ /
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Quadro II
Factor de desenvolvimento de fibrobastos básicos humano/gene construído
3050
CTAGAAGGAGGAATAACATATGCCAGCTCTGCCAGAAGATGGTGGATCCGGTGCTTTCCC
GATCTTCCTCCTTATTGTATACGGTCGAGACGGTCTTCTACCACCTAGGCCACCAAAGGG
90110
GCCAGGTCATTTCAAAGATCCGAAACGTCTGTACTGCAAAAACGGTGGTTTTTTCCTGCG
CGGTCCAGTAAAGTTTCTAGGCTTTGCAGACATGACGTTTTTGCCACCAAAAAAGGACGC
130 150170
TATCCATCCGGATGGTCGTGTTGATGGTGTACGTGAGAAATCTGATCCGCATATCAAACT
ATAGGTAGGCCTACCAGCACAACTACCACATGCACTCTTTAGACTAGGCGTATAGTTTGA
190 210230
GCAGCTGCAAGCTGAAGAGCGTGGTGTAGTTTCTATTAAAGGTGTATGTGCTAACCGGTA
CGTCGACGTTCGACTTCTCGCACCACATCAAAGATAATTTCCACATACACGATTGGCCAT
250 270290
CCTGGCTATGAAAGAAGACGCTCGTCTGCTGGCTTCTAAGTGTGTTACTGACGAATGTTT
GGACCGATACTTTCTTCTGCCAGCAGACGACCGAAGATTCACACAATGACTGCTTACAAA
I
310 330350
CTTTTTCGAACGTCTGGAATCTAACAACTACAACACTTACAGATCTCGTAAATACACTTC
GAAAAAGCTTGCAGACCTTAGATTGTTGATGTTGTGAATGTCTAGAGCATTTATGTGAAG
370 390410
CTGGTATGTAGCTCTGAAACGTACTGGTCAGTACAAACTGGGTTCGAAGACTGGTCCGGG
GACCATACATCGAGACTTTGCATGACCAGTCATGTTTGACCCAAGCTTCTGACCAGGCCC
430 450470
TCAGAAAGCTATCCTGTTTCTGCCGATGTCTGCTAAATCTTAATAGCTCGAGAACCTT
AGTCTTTCGATAGGACAAAGACGGCTACAGACGATTTAGAATTATCGAGCTCTTCGAA
polipeptído de r-bFGF expresso por Col1i e purificado utilizando-se um sistema cromatogrãfico que não pode contar com a heparina para apoio para a ligação do FGF. De preferência o r-bFGF derivado de £. Col1i é purificado utilizando-se uma co luna de cromatografia de afinidade isenta de heparina.
Como referido anteriormente, o bFGF humano difere do bovi_ no apenas em dois aminoacidos. Foi utilizada mutagenese de sitio dirigido por converter o gene bovino num gene que codifica para bFGF humano. Uma vez que o gene bovino e o gene humano estão re lacionados de um modo tão próximo ao esquema de purificação deseni volvido parabFGF bovino pode ser directamente aplicável ã proteína humana.
A actividade mitogénica de r-bFGF derivado de L· Col1i da presente invenção, foi medida utilizando-se um ensaio mitogênico fundamentado no aumento da absorção de timidina radiomarcada por células de murganho 3T3 que acompanham a síntese de DNA aumentada durante a divisão celular. A actividade angiogênica de FGF recom binante derivado de £. Co11i foi medida utilizando-se um ensaio com membrana corioalantõica de frango.
Os resultados destas experiências demonstraram que 1 yig de r-bFGF bovino derivado de £. Col l i da presente invenção coji juntamente com meti 1-celulose a 0,45% e seca, não exibe activida_ de angiogênica detectavel no ensaio com membrana corioalantõica de frango. 0 b-FGF de ocorrência natural numa composição idêntj_ ca e na mesma dose, exibiu actividade angiogênica no ensaio com membrana corioalantõica de frango. Contudo o r-bFGF bovino derivado de £. Col 1 i incluído do mesmo modo na mesma dose retém actividade mitogénica potente nas células endoteliais de capilares
tal como o factor de desenvolvimento de fibroblastos básicos natu rais. Este resultado surpreendente pode ser devido a diversos factores. 0 polipeptido de r-FGF derivado de _E. Col1i pode ser dobrado de um modo tal que habilite o polipêptido a reter actividade mitogenica, mas não actividade angiogenica. Alem disso, pre parações de FGF derivado de tecido podem conter agentes contaminan_ tes que foram responsáveis pelas propriedades angiogenicas assinaladas de FGFs derivados de tecido. Uma terceira possibilidade coji siste no facto de algum fragmento do produto de tradução de FGF principal ser o responsável por a sua actividade angiogenica. E pouco provável que qualquer agente contaminante responsável por angiogenese possa ser descoberto exactamente na mesma escala de tecidos e possa copurificar em todos os casos a menos que ele seja um fragmento proveniente da molécula original.
Os exemplos que se seguem servem para esclarecer os aspe£ tos da presente invenção.
Exemplo 1
Preparação de um gene de construção que codifica FGF básico bovino
Este exemplo refere-se ã preparação dum gene construído que codifica bFGF bovino em que estão incluídos de preferencia co dões de expressão de Ελ Col1i. 0 protocolo utilizado para preparar o gene de construção que codifica um produto FGF recombinante está descrito de um modo geral na memória descritiva de Alton et al., PCT.» publicada ηθ W083/04053 que aqui se inclui como referência. Designaram-se os genes por reunião inicial de oligonucleotidos componentes em pares múltiplos que, por sua vez, foram reunidos em duas secções discretas. Estas secções foram designa-
das para amplificação rapida e apos remoção do sistema de amplificação podem ser reunidas sequencialmente ou através da ligação de um fragmento múltiplo num vector de expressão apropriado.
Conjunto da Secção I do factor de desenvolvimento de fibroblastos:
200 pm de cada 16 oligÔmeros necessários para o conjunto da secção I representada no quadro III foram medidos em tubos e£ pendorf e secos sob uma bomba de vácuo. Prepararam-se 320 jj 1 de uma mistura de quinase que continha 32 jul de 10 x de tampão de ligação (50 M hepes, pH 7,6), 0,7 jlj 1 de ATP 10 mM, 1 jul de ATP radiomarcado de 3xl07 contagens por minuto e por mililitro e 266 jil de agua. Os reagentes foram reunidos num tubo de quinase de Boecji ringer Mannheim que continh ^1 de enzima quinase com uma conceji traçao de uni da de s/p1.
Esta mistura de quinase foi dividida em alíquotas para cada um dos tubos de dois a quinze contendooligonucleotidos de dois a quinze respectivamente
Os tubos que continham oligonucleotidos 1 e 16 receberam apenas o tampão de ligação. Os tubos de 2 a 15 foram incubados ã temperatura de 37°C durante 45 minutos. No fim deste período de tempo, alíquotas de 1/4 de ^il de cada tubo foram colocadas em tiras DE81 eluídas com formato de amónio 0,35 M e analisados num contador de cintilação de líqui_ do. A anãlise da cintilação do líquido mostrou que mais de metade das contagens eram originais , portanto foram adicionados 2 jil de
ATP de 10 mM a cada um dos tubos que continha os oligonucleotidos de 2 a 15 e em seguida os tubos foram incubados novamente mais mia a temperatura de 37°C. No fim deste tempo, todos os tubos foram submetidos a ebulição durante 10 min. e em seguida centrifugados e reunidos aos pares. Esta reunião foi realizada median te a adição do tubo 9 ao tubo 1 ( par ηθ 1), do tubo 10 ao tubo
-172 (par ηθ 2), do tubo 11 ao tubo 3 (par n?3) , do tubo 12 ao tubo (par ηθ 4), do tubo 13 ao tubo 5 (par ηθ 5), do tubo 14 ao tubo 6 (par ηθ 6), do tubo 15 ao tubo 7 (par ηθ 7), e do tubo 16 ao tubo 8 (par ηθ 8).
Estas oito misturas de ol i gonucl eo^i dos foram em seguida submetidas ã ebulição e arrefecidas lentamente ate ã temperatura ambiente para permitir a formação dos pares (duplexes). Os pares foram em seguida reunidos de modo que o 1 e o 2 formaram o tetramero 1+2 , os pares 3 e 4 o tetramero 3+4, os pares 5 e 6 o tetramero 5+6, e finalmente os duplex 7 e 8 o tetramero 7+8. A cada um destes tubos, contendo agora tetrâmeros, foram adicionados 2 jjl de ATP 10 mM e 2 jul de T 4 DNA ligase, fornecida pela Boehringer Mannheim. Estas misturas de ligação foram em seguida incubadas durante 10 minutos a temperatura de 37°C e em seguida ã temperatura ambiente durante 1 hora. Nesta altura as mistura tetraméricas foram reunidas novamente de modo que se combinaram os tetrâmeros 1+2 e 3+4 e combinaram-se os tetrâmeros 5+6 e 7+8, também. A cada duas mis_ turas de ligação resultantes foi adicionada uma quantidade de 2 ^1 de ATP a 10 mM e 2 jjl de T4 DNA ligase suplementar. As misturas foram incubadas durante 10 min. a temperatura de 37°C e depois a temperatura ambiente durante uma hora. Finalmente a ligação com pleta foi reunida conjuntamente, isto é, ambos os tubos foram ad^ cionados um ao outro e em seguida adicionados com uma quantidade suplementar de 8 jjl de ligase à mistura de ligação e incubou-se durante 10 minutos a 37° e em seguida durante a noite a temperatura de 4o. A ligação realizada durante a noite foi seguida de uma analise de uma alíquota 10 ji 1 em gel de poliacri1amida a 8% construído com ureia 7 M. Pode visualizar-se uma banda adjacente ao marcador Hpa II de 242 pares de base que indicava que a li-18/ gação estava completada. Preparou-se um gel de poliacri1amida a 8% que também continha ureia 7M. A mistura de ligação foi precipi_ tada com etanol, secagem seguida recuperada em 80 jj 1 de formamida a 80%. Metade desta mistura de ligação foi em seguida colocai da no gel preparativo adjacente a banda que continha Hpa II com marcadores PBR322. 0 gel foi submetido a desenvolvimento até que o marcador corado xileno cianol alcançou o fundo do gel. 0 gel foi em seguida removido do aparelho de electroforese e colocado numa cassette com uma película Kodak X-Ray. As bandas foram visualizadas por meio do desenvolvimento da película e remoyeu-se a banda imediatamente acima do marcador 242 de Hpa II na baji da adjacente com a banda de 244 pares de bases necessária para ligar completamente a secção I do factor de desenvolvimento de fíbroblastos. Esta tira do gel foi retirada por meio de uma seringa para um tubo de eppendorf e coberta com solução de Elui_ ção de Gel de Maxam Gilbert e incubada durante a noite a 37°. Os conteúdos do tubo foram em seguida filtrados através de um filtro de fibra de vidro colocado numa seringa e a fracção sobrenja dante foi extraída três vezes com N-butanol e precipitada com eta_ nol.
grânulo seco foi em seguida extraído com 200 yjl de TE, precipitado de novo com etanol apos remoção do resíduo de poliacrilamida que foi centrifugado no fundo do tubo. A amostra precipitada com etanol continha cerca de 37.000 contagens por minuto o que correspondia a cerca de 1,5 pm de pares baseados naradioa£ tividade que correspondia aos oligómeros requeridos para esta lj_ gação. Esta fracção de 1,5 pm foi em seguida dissolvida em 200 jul de tampão de ligação que continha 3x10? contagens por minuto de ATP radiomarcado. Uma alíquota de 1/4 de ul foi removida e
-19colocada numa tira DE81. Em seguida adicionou-se 1 jjI de quinase ao tubo que foi incubado a temperatura de 37°C durante 45 minutos. Nesta altura retirou-se 1/4 de jul do tubo e colocou-se numa segunda tira DE81 . Eluiram-se depois ambas as tiras com formato de amonio 0,35 M e cortaram-se em secções que se submeteram a contagem com um contador de cintilação de lfquido. As tiras anterior e posterior indicaram claramente que as contagens foram incorporadas na origem, portanto concluiu-se a reacção de quinação mediante adição de 1 ^il de 10 mm de ATP e incubação durante 30 minutos ã temperatura de 37°. Apôs a quinação submeteu-se a ebulição durante 5 minutos e arrefeceu-se lentamente ate a tempe ratura ambiente.
A Secção II do Factor de desenvolvimento de Fibroblastos foi reunida de um modo idêntico. Mediram-se 200 m de cada um de 12 oligonulceõtidos representados no quadro IV em tubos de eppendorf e centrifugados sob vácuo até ã secura. Repetiu-se a secagem com 100 jil de etanol a 80%. Preparou-se uma mistura de quinase que continha 24 jj! de 10 x tampão de ligação, 2 jj 1 de ATP radiomarcado (1,5x10? contagens por minuto/jjl), 0,5 jj! de ATP 10 mM, 20 jjI de quinase e 193 jul de água perfazendo um volume to tal de 240 jjI para a mistura de quinase. Adicionaram-se 20 ^jl a esta mistura em cada um dos tubos que continham oligonucleotidos de 18 a 27 respectivamente para serem tratados com quinase. Aos tubos que continham oligonucleotidos 17 e 28 apenas se adicionou tampão de ligação. Em seguida os tubos foram incubados durante 45 m. a temperatura de 37°, momento em que aliquotas de 1/4 de jjl foram retiradas de cada tubo e colocadas em tiras DE81 . As tiras DE81 foram em seguida eluidas com formato de amonio 0,35 M e analisadas com um contador de cintilação de liquido para determi_
-20nar o numero de contagens da origem. 0 contador indicou que a quinação fora processada e portanto adicionou-se 1 jul de ATP lOmM a cada tubo para se incubarem em seguida mais 45 minutos a tempe^ ratura de 37°C. Os tubos foram submetidos a ebulição durante 5 minutos e em seguida centrifugados e combinados para formar pares. 0 oligonucleotido 23 foi combinado com o 7 (par n? 17), o n924 com o n<? 18 (par n<? 18), o 25 com o 19 (par n9 19), o 26 com o 20 (par nQ 20), o 27 com o n<? 21 (par n? 21) e o 28 com o 22 (par n? 22). Estas misturas foram em seguida submetidas a ebulição e arrefecidas lentamente ate ã temperatura ambiente durante o período de uma hora. Os pares (duplexes) foram em seguida reunidos para formarem tetrâmeros. Os duplexes 17+18 foram reunidos e formaram o tetrâmero 17; o 19+20 formaram o tetrâmero 19 e o 21+22, foram combinados para formar o tetrâmero 21.
Estes foram aquecidos à temperatura de 37°C durante 10 minutos. A cada mistura tetramêrica adicionaram-se 2 jil de ATP 10 mM e 2 jul de T4 DNA ligase. As três ligações foram incubadas durante a noite ã temperatura de 4o. Então, retiraram-se aliquotas de 4 jul de cada um dos três tubos que continham os tetrâmeros e ensaiaram-se num gel de poliacri1amida a 10% com ureia 7M. A auto-radiografia do gel mostrou que se tinha processado a ligação. Os tetrameros 17 e 19 foram reunidos e adicionados com 4 jul de ligase e 4 jul de ATP 10 mM. As oito peças de ligação foram em seguida incubadas ã temperatura de 37° durante 15 minutos e depois ã temperatura de 4o durante 6 horas antes de se adiconar o último tetrâmero a esta mistura de ligação. Neste momento o tetramero 21 foi adicionado a mistura de ligação octamêrica e esta mistura de ligação total foi incubada a temperatura de 37° duraji te 15 minutos. Adicionaram-se 5 ul de ligase e 5 jul de ATP 10 mM
ã mistura de ligação e a mistura total foi incubada durante a noite ã temperatura de 4o. A verificação da ligação completa em gel de poliacri1amida a 10% preparado com ureia 7 M mostrou uma banda evidente com 242 pares de bases como se esperava. A roistjj ra de ligação foi extraída com fenol e precipitada com etanol aji tes de se colocar em gel preparativo. Metade da mistura de 1 iga_ ção foi colocada no gel a 8% com ureia 7 M e o produto com 242 pares de bases foi visualizado com auto-radiografia e retirado.
22Quadro III
FGF OLIGOMERS, SECTION I
CTAGAAGGAGGAATAACATATGCCAGCTCT1
GCCAGAAGATGGTGGATCCGGTGCTTTCCC2
GCCAGGTCATTTCAAAGATCCGAAACGTCTG3
TACTGCAAAAACGGTGGTTTTTTCCTGCGTA4
TCCATCCGGATGGTCGTGTTGATGGTGTAC5
GTGAGAAATCTGATCCGCATATCAAACTGCA6
GCTGCAAGCTGAAGAGCGTGGTGTAGTTT7
CTATTAAAGGTGTATGTGCTAACCGGTACCTG8
CTGGCAGAGCTGGCATATGTTATTCCTCCTT9
TGGCGGGAAAGCACCGGATCCACCATCTT10
AGTACAGACGTTTCGGATCTTTGAAATGACC11
ATGGATACGCAGGAAAAAACCACCGTTTTTGC12
TCACGTACACCATCAACACGACCATCCGG13
CAGCTGCAGTTTGATATGCGGATCAGATTTC14
ATAGAAACTACACCACGCTCTTCAGCTTG15
AATTCAGGTACCGGTTAGCACATACACCTTTA16
-23Quadro IV
FGF OLIGOMERS, SECTION II
AATTCGGTACCTGGCTATGAAAGAAGACGGTCGTCTGCTGG17
CTTCTAAGTGTGTTACTGACGAATGTTTCTTTTTCGAACG18
TCTGGAATCTAACAACTACAACACTTACAGATCTCGTAAA19
TACTCTTCCTGGTATGTAGCTCTGAAACGTACTGGTCAGT20
ACAAACTGGGTCCGAAGACTGGTCCGGGTCAGAAAGCTATCC21
TGTTTCTGCCGATGTCTGCTAAATCTTAATAGCTCGAGA22
GAAGCCAGCAGACGACCGTCTTCTTTCATAGCCAGGTACCG23
CAGACGTTCGAAAAAGAAACATTCGTCAGTAACACACTTA24
AGTATTTACGAGATCTGTAAGTGTTGTAGTTGTTAGATTC25 ‘TTGTACTGACCAGTACGTTTCAGAGCTACATACCAGGAAG26
AAACAGGATAGCTTTCTGACCCGGACCAGTCTTCGGACCCAGT27
AGCTTCTCGAGCTATTAAGATTTAGCAGACATCGGCAG28
Exemplo 2
Clonagem e Expressão do Factor de Desenvolvimento
Fibroblastos básicos bovino gene de bFGF bovino foi sintetizado em duas secções c£ mo se descreveu no exemplo 1. Cada Secção foi clonada em M13mpl8 para verificação da sequência antes de se reunir num vector de expressão pCFM1156. Na preparação para a clonagem da Secção I , M13mpl8 foi digerido com um excesso triplo de EcoRI e Xbal duraji te duas horas. Completou-se a reacção por extracção com igual volume de fenol seguida da extracção com clorofórmio e precipitei ção com dois volumes e meio de etanol. 0 granulo de DNA foi la. vado com etanol seco sob vácuo e dissolvido em 10 mM de Tris 0,1 mM de EDTA, pH 7,4. A ligação foi realizada por incubação de 0,06 pmole do vector M13mpl8 preparado como se descreveu, com 0,3 pmole de secção I de FGF sintético em 50 mM Tris (pH=7,4) , mM de MgC^, 10 mM de DTT, 1 mM de espermidina, 1 mM de ATP , 100 jjg/ml de BSA e uma unidade de T4 ligase durante 4 h. ã temp£
I ratura de 14°C. As células hospedeiras JM109 foram tornadas com petentes por meio de centrifugação das células na fase de desenvolvimento exponencial da cultura, suspensão em 50 mM de CaC^ ar refecido em gelo com uma concentração de 1,2 de DO/ml durante 20 minutos seguida de recentrifugação e ressuspensão das células na mesma solução com uma concentração de D012ml . Foram adicionadas alTquotas da mistura de ligação (0,1-10 jjl) a alTquotas de 200 jul das células hospedeiras competentes e deixaram-se repousar sobre gelo durante 40 minutos. Os conteúdos de cada tubo foram em seguida adicionados a 200 jjI de células JM109 frescas, 3 ml de caldo de agar L-top que continha 10 jj 1 de IPTG 100 ml e 50 jil
de X-Gal a 2%. Esta mistura foi colocada numa placa em L e inc£ bada durante a noite a temperatura de 37°. Recolheram-se quatro das placas límpidas resultantes e desenvolveram-se em 10 ml de cultura, utilizando-se células JM109 como estirpe hospedeira. A partir destas culturas foi preparado DNA fãgico de cadeia simples e sequenciado pelo método de didesoxi utilizando-se o iniciador universal M13. Uma daquelas quatro tinha a sequência desejada e foi separada para reunião do gene de FGF no vector de expressão.
A Secção II do gene FGF construído foi clonada em M13mpl8 para sequenciação utilizando-se o mesmo método que para a Secção
I. Neste caso, o vector M13mpl8 foi digerido com EcoRI e HindIII (em excesso triplo) a fim de adaptar as extremidades coesivas da Secção II. Para a ligação misturou-se 0,025pmole de vector M13mpl8 com 0,75 pmole de a Secção II de FGF sintética fosforilada e incubou-se durante 4 horas ã temperatura de 14°C, como anteriormeji te. A transformação utilizando-se o mesmo método do CaC^ resuj_ tou em placas claras como para a Secção I mas uma vez que estava presente uma quantidade elevada de placas límpidas nas placas de controlo realizou-se uma selecção posterior por hibridação. Desen. volveram-se diversas placas em hospedeiras JM109 como descrito a_n teriormente e as fracções sobrenadantes que continham o DNA fãgico foram coradas em filtro de nitroceiulose. Os oligonucleotidos 18 e 24 utilizados na Secção II foram radiomarcados com fósforo 32 do ATP utilizando-se polinucleotido quinase e serviram como sondas destes filtros. Escolheram-se dois clones positivos e sequenciaram-se como anteriormente. Um desses clones possuía a sequência esperada e foi utilizado na reunião do gene no pCFM1156.
Exemplo 3
Reunião de um gene bFGF bovino no vector de expressão pCFM1156
Preparou-se DNA sob a forma replicãvel de cadeia dupla para clones M13 de Secção I e da Secção II. Desenvolveram-se culturas de 500 ml de cada fago em hospedeiros JM109 e recolheram-se as células por centrifugação. Em seguida fez-se de novo a suspensão das células em sacarose a 15%, 0,05 M de Tris, 0,05M de EDTA, e 1 mg/ml de lisozima e incubadas no gelo durante 25 minutos .
Adicionou-se RNAse a 0,1 mg/ml e continuou-se a incubação sobre o gelo por mais 10 minutos. Adicionou-se igual volume de Triton X-100 a 0,1%, 50 mM de Tris, 50 mM de EDTA e continuou-se a incubação sobre o gelo durante mais 10 minutos. Estes lisados foram em seguida centrifugados durante 60 minutos a 39.000 xg e separou-se a fracção sobrenadante clara. Adicionou-se brometo de etidio a 1 mg/ml e cloreto de césio para se obter uma densidade de 1,55 g/ml. Esta solução foi centrifugada durante 18 horas a 45.000 rotações por minuto num rot.or Vti-50 a fim de se alcançar o equilíbrio. A banda de DNA superenrolado em cada tubo foi visualizada por luz UV e recolhida com uma seringa. 0 brometo de etidio foi rapidamente eliminado por extracção com butanol e o CsCl foi removido por dialise prolongada com 10 mM de Tris, 0,1 mM de EDTA. Reservas de DNA preparadas deste modo foram utilizadas para clonagem posterior. Embora, numerosos vectores possam ser utilizados para exprimir este DNA, refere-se um vector de expressão possuindo um promotor regulado e um gene de controlo do nume-
ro de copias induzivel da temperatura a fim de maximizar o rendimento do produto. 0 plasmidio de expressão pCFMl156 utilizado neste exemplo pode ser construído facilmente a partir do plasmidio pCFM836, a construção do qual esta descrita no pedido de patente de invenção europeu publicado, n9 136,490.
pCFM836 e primeiramente cortado com Ndel e em seguida as extremidades tornadas coincidentes com polimerase T4 de tal nw do que ambos os sítios em Ndel são destruídos. A seguir o vector é digerido com Clal e SaciI para eliminar o poliligante existente antes da ligação a um poliligante substituinte como representado no quadro V. Este poliligante substituinte pode ser construído de acordo com o processo de Alton et al., supra. 0 controlo de ex pressão no plasmidio pCFM1156 de expressão efectua-se por meio de um promotor lambda encurtado o qual pode estar sob o contrc) lo dum gene repressor C-jg^y (tal como e fornecido na estirpe de E. Coli K12ÁHtrp).
Digeriu-se o vector de expressão pCFM 1156 (excesso duplo) com Xbal e HindIII na preparação para a ligação com FGF secções I e II. Digeriram-se as reservas de DNA da secção I e II, prepara, das como anteriormente, (excesso duplo) ou com Xbal e Kpnl (se£ ção I) ou com Kpnl e HindIII (secção II). Colocaram-se todos e£ tes três digeridos numa placa de gel de agarose a 1,2% feita com 50 mM Tris acetato e submetido a electroforese durante 3 horas a 60 volts. 0 gel foi corado com 1 jjg/ml duma solução de brometo de etidio e as bandas visualizadas com luz ultravioleta. A banda do vector linearizado e as bandas da secção I e II foram excisadas do gel com escalpelo, colocadas em tubos preparados e fundidas a temperatura de 70° C durante 15 minutos. Adicionaram-se cinco microlitros do gel fundido contendo vector linearizado a
yjl de cada tira que continha as secções I e II e equilibrou-se a mistura a temperatura de 37°C. 0 gel liquido foi misturado rapidamente com igual volume de tampão de 2X ligase arrefeci, do em gelo contendo 2 mM ATP e 0,5 unidades de T4 ligase e incubado durante a noite ã temperatura de 14°C. Transformaram-se aljT quotas desta mistura de ligação em estirpes hospedeiras FMG compe tentes congeladas utilizando-se um protocolo de transformação des. cri to por Hanahan, J. Mol. Biol. 166, 557-580 ( 1983), cresceram durante duas horas para permitir a expressão da resistência a ca_ namicina e colocadas em placas-L contendo 20 jjg/ml de canamicina.
Incubaram-se as placas a 28°C durante a noite. Replicaram-se as colónias em filtros de nitroceiulose e separou-se a pia ca principal. As colónias dos filtros desenvolveram-se com o diã metro de cerca de 1 mm ã temperatura de 28° e em seguida foram cr locadas ã temperatura de 37° durante a noite para aumentar o nume ro de cópias pl asmídi cas .Os filtros foram sondados por hibridação com o oligonucleõtido 18 radiomarcado (do gene de síntese) ã temperatura de 65°C em tampão 6X SSC. Obtiveram-se 25 clones positivos, 4 dos quais foram recolhidos e desenvolveram-se em 500 ml de cultura Preparou-se o DNA replicativo como descrito para a secção I e II utilizando-se um processo de lisado límpido seguido por centrifugação de gradiente de densidade de equilíbrio de CsCl. Sequenciji ram-se quatro destes clones directamente utilizando-se vector de expressão de cadeia dupla com uma matriz para as reacções de sequenciação didesoxi e verificou-se que os quatro possuiam a se^ quência correcta. Um destes, foi escolhido para ser utilizado na expressão de bFGF bovino e ê aqui referido como pCFMl156/bFGF. A sequência de DNA para o gene de bFGF de bovino construída des-29te modo no vector pCFMl156/bFGF esta representada no quadro I.
Quadro V
ATCGATTTGATTCTAGAAGGAGGAATAACATATGGTTAACGCGTTGGAATTCGGTacCAT
TAGCTAAACTAAGATCTTCCTCCTTATTGTATACCAATTGCGCAACCTTAAGCCATGGTA
Cia 1 , 12 Xbal, 29 Ndel , 35 Hincl1 , Hpal , 39 ΜΊui, 47 EcorI1 , 53 Hgi C1 Kpnl, 57 Ncol Styl,
GGAAGCTTACTCGAGGATCCGCGGATAAATAAGTAACGATCC
CCTTCGAATGAGCTCCTAGGCGCCTATTTATTCATTGCTAGG
Hindlll 9 70 Aval Xhol , 75 BamHI Xho2, 79 Sac2,
Exemplo 4
Expressão e purificação de bFGB bovino
Expressão
Uma cultura de uma noite da estirpe de produção desenvolveu-se ã temperatura de 28°C em caldo-L contendo 20 ug/mg de canamicina e utilizaou-se para inocular um lote de fermentação de 8 litros. 0 meio do lote de 8 litros continha 40 g. de extracto de levedura, 40 g, de glicose, 10 g, de cloreto de sodio e tampão com sais apropriados, solução de vitaminas e oligoelementos. Utilizou-se um protocolo de alimentação binário. A alimentação inicial (1 litro) continha 450 g. de glicose, mais sais e vitaminas nece£ sãrios. ApÕs o desenvolvimento a 20 D0 (unidades de densidade óptica a 600 nm) iniciou-se uma segunda alimentação com uma taxa de 200 ml/hora e manteve-se a temperatura a 42°C. Esta solução de alimentação continha 200 g/litro de bactotriptona, 100 g/litro de extracto de levedura e 100 g/litro de glicose. 0 desenvolvimento continua durante 6 horas a temperatura de 42°C com uma concentração celular que alcançou uma D0 de 50 no momento da colheita.
Purificação
Agregaram-se células de E. Coli em agua num homogenizador de Gaulin e centrifugaram-se em 4,2K durante 40 minutos numa centrifugadora J6B. Quando analisado por SDS-PAGE, o FGF estava presente quer nos grânulos quer na fracção sobrenadante, sendo a pro teina no sobrenadante na ordem dos 60-70%. Os grânulos foram portanto retirados e o sobrenadante foi purificado utilizando-se uma cromatografia por permuta iõnica. A fracção sobrenadante após
-31titulação a um pH 7,4 com tris-base, foi corrigido para 1
DTT e misturado com resina de Sefarose-CM equilibrada com
Tris-HC/1 mM, DTT/pH 7,4. a mesma solução
A resina foi lavada em seguida
so vez com tampão e eluida em coluna com gradi ejn te de NaCl de zero até 0,7
M. Detectou-se um uni co pi co para es ta solução acerca de
0,5 M por análise de
SDS-PAGE. A solução foi titulada com Tris base a pH 8,2, diluída três vezes com agua arrefecida com gelo e introduzida em sefarose CM em 40 mM Tris-HC1/1 mMDTT/pH 8,2.
A coluna foi lavada com NaCl 0,15
M e elui da com gradiente de NaCl linear de 0,15 a 0,5 M.
Detectou-se um pico principal entre dois pequenos picos e verificou-se ser aproximadamente 95% puro com uma pequena quan tidade de dimero quando se analisou sob condições de não redução por SDS-PAGE. 0 rendimento foi aproximadamente de 90%.
conjunto foi imediatamente titulado a pH aproximadameji te de 5 com NaOAc 1M de pH4 para impedir que o produto de bFGF bovino sofresse a oxidação e em seguida directamente colocado n£ ma coluna de Sfadex G-75 em citrato de sodio 20 mM/0,1 M NaCl/pH5 resultando na eluição de um único pico entre uma plataforma (correspondente ao dTmero) e um pico para pequenos compostos (tais como DTT). As fracções do pico foram reunidas e armazenadas as temperaturas de 4 C, -20°C ou 1iofi1izados. 0 rendimento deste no gel de filtração foi aproximadamente 100%. Obtiveram-se ce£ ca de 400 mg de bFGF bovino preparado a partir de uma pasta celij lar de 560 g.
Exemplo 5
Preparação de bFGF humano processo utilizado neste θχθπιρίο e uma modificação do
-32processo de Gilliam et. al., Gene 12, p. 129-137 (1980). 0 bFGF humano difere do FGF bovino apenas em dois aminoácidos nas posições 113 (thr em vez de ser) e 129 (ser em vez de pro).
A conversão do gene de bFGF bovino preparado no exemplo num gene preparado no exemplo 1 num gene que codifica para bFGF humano necessita apenas de alteração de dois nucleotidos. Esta a_l_ teração foi realizada no clone da secção II de M13mpl8/bFGF por mutagenese de sítio dirigido, utilizando-se os seguintes iniciadores
96-15) 5' GACCAGTCTTCGAACCCAGTTTGTA 3'
96-16) 5' CATACCAGGAAGTGTATTTACGAGA 3'
Dez pmoles de cada indicador universal Ml3 e dos iniciadores acima referidos, foram fosforilados por meio de incubação com um mM de ATP e 10 unidades de polinucleotidos quinase em 10 jul de 70 mM tris, 10 mM MgCl2» 5 mM DTT durante 30 minutos ã temperatura de 37°C.
Cinco pmole de cada oligonutleotido fosforilado foi misturado com cerca de 0,5 jjg de M13mpl8/bFGF de cadeia simples aqu£ eidos ã temperatura de ’65°C e deixados reconstituir mediante arre fecimento a temperatura ambiente.
A esta mistura matriz-iniciaodor foi em seguida adiciona do 1 yil de uma solução de 25 mM de dATP, dCTP, dGTP e TTP, 1 y 1 de ATP 100 mM, duas unidades de ligase T4 e 8 unidades de um fra_g mento grande de DNA Pol I (Klenow). Esta mistura foi incubada à temperatura de 14°C durante 4 horas. Alíquotas da mistura de ligação foram transformadas em JM101 como se descreveu anteriorme£
te e colocadas em agar-L a 0,7%. Nas placas que resultaram límpidas colocram-se filtros de nitroceiulose e sondaram-se por hibrida_ ção com oligonucleÕtidos 96-15 e 96-16 radiomarcados. Obtiveram-se diversos positivos utilizando-se cada uma das sondas mas nenhum para ambas as sondas. Um destes positivos do oligonucleotido 96-15 foi escolhido para preparar DNA de cadeia simples e seguiu-se o processo como anteriormente excepto na utilização do oligonucleÓtido 96-16 como um iniciador de mutagenese. Esta experiência produziu varias placas que hibridizaram com os oligonucleq tidos 96-15 e 96-16. Recolheram-se quatro destes e desenvolveu-se DNA de cadeia simples para sequenciação; todos os quatro clones continham a sequência correcta. A sequência de DNA do gene do bFGF humano preparada deste modo esta representada no quadro II . 0 bFGF recombinante humano derivado de E. Coli pode ser expressado e purificaod de acordo com o processo descrito no exemplo 4. A sequência dos ami noaci dos para o bFGF recombinante humano esta representada no quadro IV.
QUADPO VI
Factor de crescimento de Fibrolasto bãsico humano
10 20
MetProAlaLeuProGluAspGlyGlySerGlyAlaPheProProGlyHisPheLysAsp
3040
ProLysArgLeuTyrCysLysAsnGlyGlyPhePh.eLeuArgIleHisProAspGlyArg
5060
ValAspGlyValArgGluLysSerAspProHisIleLysLeuGlnLeuGlnAlaGluGlu
7080
ArgGlyValValSerlleLysGlyValCysAlaAsnArgTyrLeuAlaMetLysGluAsp
90100
GlyArgLeuLeuAlaSerLysCysValThrAspGluCysPhePhePheGluArgLeuGlu
110120
SerAsnAsnTyrAsnThrTyrArgSerArgLysTyrThrSerTrpTyrValAlaLeuLys
130140
ArgThrGlyGlnTyrLysLeuGlySerLysThrGlyProGlyGlnLysAlalleLeuPhe
146
LeuProMetSerAlaLysSer
Exemplo 6
Caracterização do bFGF bovino
Actividade: A actividade do bFGF bovino foi examinada com a incorporação de timidina [3^] em células 2T3. Todas as preparações armazenadas a 4°C, e -20°C e liofilizadas apresentaram uma actividade dependente da dose com uma concentração de proteína compreendida entre 20 e 210 pg/ml para metade da actividade maxima que depende da estirpe particular de células 3T3 utilizada no en saio.
Caracteri sti cas gerais do produto final
Proporção 260/280
-2,0
LAL <0,6UE/ml (0,623 FGF mg)
DNA <20 pg/ml (0,623 FGF mg)
Coeficiente de extinção
1,3 para 0,1% proteína
Pureza > 95%
Es tabi1i da de
Quando uma preparação de bFGF bovina foi incubada ã temperatura de 4°C a um pH diferente o bFGF bovino exibiu a formação de polímeros constituídos por mais do que uma molécula de bFGF a um pH <. a 5,9 devido as ligações de dissulfureto entre a cadeia e degradação a um pH < a 4,0 devido a instabilidade do acido da ligação Asp-Pro. Baseado nesta informação escolheu-se um tampão pH 5. Estes dados de estabilidade sugeriram que grupos SH livres presentes no produto final tendiam a formar ligações de dissulfjj reto inter-cadeias de preferência a intra-cadeias. A preparação de bFGF boyino é aparentemente monomerica quando determinada por filtração sobre gel de Sefadex G-75.
Exemplo 7
Bioensaio HUV--EC para FGF
Células endoteliais HUV utilizadas nesta experiência, fo ram isoladas por Judith A. Berliner pelo método de Gimbrone et al. (Gimbrone, MA, Cotran, R. S., Folkman, J. Human Vascular Eii dothelial Cells in Culture. The Journal of Cell Biology. 1974 vol. 60 pgs. 673-684). As células foram mantidas por subcultura
X' em frascos de cultura cobertas com gelatina a 0,1°/ em solução de cloreto de sodio tamponada com fosfato e em meio de 10 ^jg/ml de fibrorectina (Boehringer Mannheim sem soro fetal bovino durante 30 min. cada, consecutivamente. As células foram libertadas com tripsina a 0,0125%-EDTA a 0,005% e lavadas com 1:2 ou 1:3 uma vez por semana. 0 meio de manutenção foi MCDB105 (Irvine Scientific) com 10 unidades/ml de penicilina G, lOjjg/ml de estreptomi ci na , soro fetal bovino (hiclone 20%), L-glutamina (2 mM) , 1 mM de pirjj vato de sodio heparina (40 jjg/ml , 170 unidades/mg) e suplemento de células endoteliais (ECGS, 40 jjg/ml Col 1 aborative Research) .
As células desenvolveram-se no incubador com COg a 2%.
A experiência que se segue foi realizada para comparar o desenvolvimento contínuo e as actividades mitogénicas de 3 formas diferentes de FGF em células endoteliais HUV.
1) FGF bãsico bovino recombinante derivado de £. Coli (rbFGF) ;
2) FGF ácido bovino ( a FGF, especialmente purificado de cérebro de bovino);
3) FGF bãsico bovino (n - bFGF purificado de glândulas pituitárias de bovino, Sigma).
Colocou-se uma centena de células em cada cavidade de p 1 a_ cas de 24 cavidades utilizando-se apenas as oito cavidades centrais. As células em cada placa das 24 cavidades desenvolveram-se apenas na presença de um dos factores de desenvolvimento referidos antes ou na ausência de qualquer factor de desenvolyiroento em vez de η-bFGF no meio de manutenção referido anteriormente.
As células foram alimentadas tres e seis dias apos a sementeira inicial com o seu factor de desenvolvimento proprio.Dez
-3 7-
dias após a sementeira, as culturas foram analisadas por meio de coloração com violeta de cristal.
Os resultados apresentados no Quadro VII demonstram que havia mais colónias, entre 20 a 32%, nas cavidades que continham o rbFGF do que nas cavidades que continham o aFGF ou η-bFGF respectivamente. Também tem interesse o facto de que 75% das colónias totais que apareceram nas culturas com rbFF eram 0,5 mm maiq res, enquanto que apenas 55% e 51% das colónias desenvolvidas com aFGF e η-bFGF respectivamente possuiam aquela dimensão.
Estes resultados indicam que o rBFGF parece ser um factor de desenvolvimento e de proliferação melhor de que qualquer dos aFGF ou η-bFGF para as células endoteliais HUV. Um controlo que não continha qualquer factor de desenvolvimento também foi avalia, do.
Quadro VII # de Colónias
Factor de Desenvolvimento /8 cavidades
Colónias >0;5mm/8 cavidades
| rbFGF | 351 | 265 |
| aFGF | 293 | 160 |
| n-BFGF | 265 | 134 |
Controlo
Exemplo 8
Bio-ensaio FGF em células 3T3 NIH
Utilizaram-se para este ensaio células 3T3 NIH de ATCC . As células desenvolveram-se em meio DME com penicilina G, 10 yjg/ /ml, 10 jig/ml es treptomi ci na e 10% de soro de vitela. As células foram tratadas com 1:40 duas vezes por semana. No dia um do ensaio as culturas subconf1uentes foram dispersas com tripsina e co locadas em placas de 24 cavidades com uma concentração de 2x10 células por ml., 1 ml por cavidade no meio de desenvolvimento re ferido antes.
No dia ccinco, o meio foi substituído com DME com penicilina estreptomicina e plasma humano deficiente em plaquetas a 5% (soro heparinizado clarificado), 1 ml/cavidade.
As células deviam ser confluentes neste ponto. No dia seis as amostras de experiência de controlo de FGF foram adicionadas ao meio em volumes não superiores a 100 jj!.
Dezoito horas decorridas as células foram agitadas durante uma hora com 1 ml de DME com 5% de soro de vitela e 2 / Ci de ti_ midina 3H-Me ã temperatura de 37°C. As células foram em seguida lavadas uma vez com 1 ml de PBS e acido tricloro-acetico a 5%, am bos a 4°C. As placas foram deixadas secar ao ar durante 30 minutos, apos o que se adicionou um ml. de NaOH a 0,25 M em cada cavidade. Decorrida uma hora, a temperatura ambiente, os conteúdos de cada cavidade foram transferidos para ampolas de contagem sepa_ radas que continham 10 ml de aquasol II. As amostras foram conta_ das durante 1 minuto através de uma janela de 0 a 397 de um conta_ dor de cintilação LS 7.500.
Os padrões de FGF foram constituídos por uma reserva com
a concentração de 600 yjg/ml em tampão de citrato de sódio de pH5. A escala de padrões utilizada foi de 5 pg a 1000 pg por ml. Opa drão de concentração mais baixa que deu a absorção máxima de 3H-timidina era de 500 pg. Uma media de 140-210 pg deu em metade da incorporação maxima da timidina marcada.
Controlos: 50 jjl de solvente sem adições
Duplicatos de 50 jjI cada
Solvente = DMEM + 0,1% BSA (Miles) + 0,01% de NP40 + Pen/ /strep. + L-glutamina (2 mM)
1/2 max. foi 140-210 pg
Exemplo 9
Construção do gene de bGFG humano
A conversão do gene de bFGF bovino preparado no Exemplo
I para 1 gene que codifica para bFGF humano foi realizado por mjj tagenese de oligo sitio dirigida.
segmento a ser modificado foi primeiramente clonado no vector do fago Ml 3mpl8 e transformado em E. Coli ΥΜΊ01 para desenvolvimento e preparação de DNA fagico de cadeia simples (Messing, J. et al.,vol. 9, Nucl. Acid. Res. pp. 309-321 (1981). Misturou-se aproximadamente 0,5 jjg de DNA-matriz com 5 pmole de iniciador de sequenciação M13 universal e 5 pmoles de cada iniciador mutageni_ co, aqueceu-se a 65° durante 3 minutos e deixou-se arrefecer 1 ejn tamente. 0 iniciador-matriz circul arizado foi em seguida misturado com ATP, uma mistura de dNTP, fragmento maior de Vol I DNA e ligase seguido por incubação a 15° durante 4 horas.
Transformaram-se aliquotas desta mistura de reacção em
cêlulas JM101 competentes e colocou-se /
em L-agar a 0,7%. As placas que continham o fago mutante foram de filtros de nitroceiulose de réplica marcado com 32P. Preparou-se o DNA de sondadas como positivas e verificou-se escolhidas por hibridação com iniciador mutagénico cadeia simples de placas a sua sequência utilizando-se um método de terminação de cadeia didesoxi. As alterações feitas dos aminoacidos e os iniciadores mutagenicos correspondeji tes utilizados foram:
ser-113 a thr-113) 5' GACCAGTCTTCGAACCCAGTTTGTA 3'
Os iniciadores correspondem a cadeia de anti-sentido do gene bFGF.
Exemplo 10
Produção de FGF por fermentação
A produção de fermentação de FGF foi como se segue:
- uma ampola de cultura foi retirada de uma cultura arma, zenada a -70°C. A ampola foi descongelada ate a tempera tura ambiente e inoculada numa câmara de ar laminar em frascos Fernbach, contendo cada um caldo Luria (caldo Luria: 10 g/1 de bactotriptona, 5 g/1 de extracto de gordura, 5 g/1 de NaCl).
Os frascos inoculados foram em seguida agitados durante a 16 horas a uma temperatura aproximada a 28°C. Um fermentador contendo um meio (quadro VIII) que tinha sido esterilizado de acordo com o processo habitual descrito, foi inoculado por transferêji cia asséptica do conteúdo dos frascos Fernbach. 0 grau de agitação, temperatura, pH e oxigénio dissolvido forammarcados como es.
pecificado na fórmula de preparação. 0 pH foi mantido automaticamente com acido fosfórico e hidróxido de amónio. 0 oxigénio dissolvido foi mantido no grau especificado por aumento da taxa de agitação do débito do ar e/ou da pressão.
As amostras foram retiradas assepticamente para medição da densidade celular em intervalos estipulados. 0 meio de alimeji tação nQ 1 (Quadro VIII) foi fornecido durante o tempo com débito especificado de acordo coro a densidade celular. A uma densidade celular especificada, a temperatura foi aumentada para aproximad_a mente 42°C para induzir a síntese do produto. 0 meio de alimentação ηθ 1 foi imediatamente substituído com um meio de aliment£ ção ηθ 2 (Quadro I). 0 meio de alimentação ηθ 2 foi mantido numa taxa dealimentação específica ate ao fim da fermentação. Apr£ ximadamente 6 horas depois de se aumentar a temperatura o fermeji tador foi arrefecido e as células foram colhidas por centrifugação .
Quadro VIII
| Meio de | Meio de | ||
| Batch | alimentação | alimentação | |
| medi o | nQl | nQ2 | |
| Substâncias Químicas | |||
| Bactotri ptona | 200 g/L | 200 g/L | |
| Extracto de levedura | 5 g/L | 100 g/L | 100 g/L |
| (NH4)2so4 | 3.75 g/L | ||
| K2HP04 | 7 g/L | ||
| kh2po4 | 8 g/L | ||
| NaCl | 1.25 g/L | ||
| G1ucose | 5 g/L | 25 g/L | 50 g/L |
| MgS04 -7H20 (1 M) | 4 ml/L |
| Soluçao | de | o 1 i g o e 1 e - | ||
| mento | 2 | ml/L | ||
| Solução | de | vitami nas | 2 | ml /L |
| Solução | de | citrato- | ||
| -FeCl3 | 6 | ml/L |
Exemplo 11
Purificação de bFGF humano
Células de E. Coli que continham o genes de bFGF sintéticos no pCFMl156 desenvolveram-se como se descreveu antes no exemplo 4 . Após a desagregação das células e centrifugação em pequena velocidade descobriu-se que o bFGF estava presente na fracção sobrenadante e na fracção centrifugada. A purificação do centrifugado requereu a solubi1ização com solventes seguido de repetição
para se obter material activo. Estas fases podem ser evitadas por purificação da fracção sobrenadante como se descreve a seguir. Es. ta fracção foi aplicada a uma coluna de Sefarose-CM em 40 mM Tris-HC1 , pH7,4 e eluida com um gradiente de NaCl linear. As fracções que continham bFGF foram em seguida ligadas a mesma resina, mas em 40 mM de Tris-HCl, pH8,2 e outra vez eluidas com gradiente de NaCl linear. Nestas duas cromatografias, inclufu-se 1 mM de DTT para impedir a oxidação.que doutro modo resultaria na formação de ligações de dissulfureto intermoleculares. A proteína foi em seguida purificada por filtração de gel utilizando-se uma coluna de Sefadex G-75 em citrato de sodio 20 mM, NaCl 0,1 M pH5,0. As te£ tativas iniciais para purificar FGF de células de E. Coli mostraram que o dímero se forma rapidamente quando não se inclui 1 mM de DTT durante o processo de purificação. A purificação de bFGF humano foi realizada essencialmente do mesmo modo como se descreyeu para o material bovino no exemplo 4. Não se notou diferença entre o bFGF humano e o bovino em qualquer das fases da purificação. Quando examinado por SDS-PAGE sob condições de redução o bFGF for neceu uma banda principal a 16.500 daltons que correspondia ao peso molecular monomérico e bandas menores de pesos moleculares mais elevados que provavelmente representam as formas dimérica e tretamerica. Quando ensaiado sob condições de produção, evidenciou-se maior contaminação por bandas de peso molecular mais ele vado. A analise da sequência de aminoácidos do bFGF purificada revelou que a metionina tinha sido clivada na maior parte do mat£ rial, fornecendo 70% de prolina, 13% de alanina e apenas 17% de metionina no N-terminal. Como acontece com o material natural o bFGF recombinante exibe uma afinidade acentuada para a heparina eluindo das colunas de sefarose heparinadas no CINa aproximadameni
-4 4-
te a 1,5-2,0 (dados não representados).
Exemplo 12
Caracterização de bFGF humano
A actividade de bFGF humano foi examinada com incorporação de
L\ J timidina em células 3T3 como se descreveu no exemplo 8. As células 3T3 NIH foram obtidas da ATCC. As células desenvolve ram-se em DME suplementado com 10% de soro de vitela, 10 jcrg/ml de penicilina e 10 /ig/ml de estreptomi ci na.
Trataram-se as células com 1:40 duas vezes por semana. No dia um do ensaio as culturas subconfluentes foram dispersas com tripsina e colocadas em placas de 24 cavidades, com uma concentração de 20.000 células/ml, 1 ml/cavidade e no meio referido anteriormente. No dia cinco, o meio foi substituído com DME que continha p£ nicilina, estreptomicina e plasma deficiente de plaquetas humano a 5% 1 ml/cavidade. No dia seis as amostras da experiência foram adicionadas ao meio em volumes não superiores a 100 jul .
Dezoito horas mais tarde, as células foram agitadas durante uma hora com um mililitro de DME que continha 5% de soro de vitela e 2 juCi de timidina tritiada a 37°. As células foram em seguida lavadasuir vez com 1 ml de PBS e ácido tricloroacetico a 5%, ambos a 4o. As placas foram deixadas secar ao ar durante 30 minutos e em seguida adicionou-se um mililitro de NaOH 0,25M deixou-se descansar djj rante 1 hora a temperatura ambiente. 0 conteúdo de cada cavidade foi em seguida transferido para uma ampola separada que continha 10 ml de Aquasol II e contado num contador de cintilação líquido. Como se mostra na figura 3 o bFGF humano recombinante mostrou uma potência essenci al mente idêntica neste ensaio do bFGF recombinain
te bovino que produz metade da estimulação máxima da síntese de
DNA numa dose de cerca de 150-200 pg/ml.
Exemplo 13
Bio-ensaio de FGF/humano em HUV-EC ensaio em células HUVE esta descrito noexemplo 7. Células endoteliais da veia umbilical humana utilizadas nesta experiêq cia foram fornecidas graciosamente por Dr. Judith A. Berliner . As células desenvolveram-se em frascos preparados cobertos com gelatina a 0,1% em solução de cloreto de sodio tamponada com fosfato durante 30 minutos, seguida de meio de fibronectina 10 ug/ml isanto de soro fetal bovino (FBS) durante 30 minutos. 0 meio de manutenção utilizado foi MCDB 105 (Irvine Scientific) suplementado com 10 ug/ml penicilina G, 10 ug/ml de estreptomicina, 20% de FBS, L-glutamina 2 mM, piruvato de sodio 1 mM, 40 ug/ml de hepan na (170 U/mg), e 40 ug/ml de suplemento de crescimento de células endoteliais (ECGS, Collaborative Research). As células foram colocadas em placas de 24 cavidades, desenvolveram-se em meio de ma_ nutenção que continha ECGS, ou no mesmo meio com bFGF humano recombinante ou sem qualquer factor de desenvolvimento substituindo o ECGS. As células foram alimentadas três a seis dias apos o inicio da sementeira e adicionou-se factor de desenvolvimento frejs co em cada momento. Dez dias apôs a sementeira, as células foram coradas com violeta de cristal e contadas. A adição de FGF humano recombinante resultou numa extensa proliferação celular em comparação com os controlos que não continham qualquer factor de desenvolvimento. Não se observou diferenças significativas entre o
bFGF humano e o bovino. Aceitam-se as numerosas modificações e variantes na pratica da presente invenção que ocorram aos técnicos nesta matéria, após a leitura atenta dos exemplos ilustrativos descritos. Consequentemente, a presente invenção deve ser considerada como limitada apenas na extensão que reflecte as reivindicações apensas.
-4Π-
Claims (7)
1.- Processo para a preparação de uma sequência de DNA para utilização na expressão correcta em uma célula hospedeira de E. coli de um produto polipeptídico possuindo Delo menos uma parte da configuração estrutural primária e uma ou mais das propriedades biológicas de factor de desenvolvimento de fibroblastos básicos humanos de ocorrência natural, sendo a referida sequência de DNA escolhida no grupo de sequências que consiste em:
(a) a sequência de DNA ou as suas cadeias complementares seguintes:
10 3050
CTAGAACGAGGAATAACATATCCCAGCTCTGCCAGAAGATGGTCGATCCGGTCCTITCCC
GATCrrCCTCCTTATTGTATACGGTCGAGACGGTCTTCTACCACCTAGGCCACCAAAGCG
70 90110
GCCAGGTCATTTCAMGATCCGAAACGTCTGTACTGCAAAAACGGTGGTITTTTCCTGCG
CGGTCCAGTAAAGTITCTAGGCnTGCAGACATGACGnnTGCCACCAAAAAAGGACGC
130 150170
TATCCATCCGGATGGTCGTGTrGATGGTGTACGTGAGAAATCTGATCCGCATATCAAACT
ATAGGTAGGCCTACCAGCACAACTACCACATGCACTCTTTAGACTAGGCGTATAGTTTGA
190 210230
GCAGCTGCAAGCTGAAGAGCCTGGTGTAGTTTCTATTAAAGGTGTATGTGCTAACCGGTA
CGTCGACGTrCGACTrCTCGCACCACATCAAAGATAATTTCCACATACACGATTGGCCAT
250 270290
CCTGGCTATGAAAGAAGACGCTCGTCTGCTGGCTrCTAAGTGTGTTACTGACGAATGTTr
GGACCGATACTTTCTTCTGCCAGCAGACGACCGAAGATTCACACAATCACTGCTTACAAA
310 330350
CITTITCGAACGTCTGGAATCTAACAACTACAACACTTACAGATCTCGTAAATACACTTC
GAAAAACCTrGCAGACCTTAGATTGTTGATGTTGTGAATGTCTAGAGCATrTATGTCAAG
370 390410
CTGGTATGTAGCTCTGAAACGTACTGGTCAGTACAAACTGGGTrCCAAGACTGGTCCGGG GACCATACATCGAGACTTTGCATGACCAGTCATGITTGACCCAAGCxTCTGACCAGGCCC
430 450470
TCAGAAAGCTATCCTGmCTGCCGATGTCTGCTAAATCTTAATAGCTCGAGAACCTT
AGTCmCGATAGGACAAACACCGCTACAGACGATTTAGAATTATCGAGCTCTrCGAA (b) as sequências de DNa que hibridam com as sequências de DNA definidas em (a) ou com os seus fragmentos; e (c) as sequências de DNA que, se não fosse por degeneração do código genético, hibridariam com as sequências de DNA, definidas em (a) e (b), caracterizado pelo facto:
(a) de se desenvolverem células hospedeiras de E. coli sob condições nutrientes apropriadas e de se transformarem com um vector de DNA plasmídico, o qual incorpora uma sequência de DNA que codifica para o hospedeiro de E. coli a expressão de um polipeptido que possui parte ou toda a configuração de estrutura primária e uma ou mais das propriedades biológicas de factor de desenvolvimento de fibroblastos básicos, uma sequência de promotor regulada e um gene de controlo do número de cópias induzível pela temperatura;
(b) de se isolar os produtos polipeptídicos desejados da expressão da sequência de DNA no referido vector; e (c) de se purificar o produto polipeptídico desejado.
2.- Processo para a preparação de uma célula hospedeira de E. coli, caracterizado pelo facto de se utilizar uma sequência de DNA de acordo com a reivindicação 1 para a transformar e permitir que a referida célula hospedeira exprima o produto polipeptídico referido.
-50·
3. - Processo para a preparação de um plasmídeo biologicamente funcional ou vector de DNA virai, caracterizado pelo facto de se incluir uma sequência de DNA de acordo com a reivindicação 1.
4. - processo para a preparação de uma célula hospedeira de E. coli transformada de um modo estável, caracterizado pelo facto de se utilizar um vector de DNA de acordo com a reivindicação 3.
5. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se purificar o produto polipeptídico desejado utilizando um sistema cromatogrãfico isento de heparina.
6. - Vector de DNA plasmídico, caracterizado pelo facto de conter uma sequência de DNA que codifica para a expressão de uma célula hospedeira de E, coli de um polipeptido que possui parte ou toda a configuração estrutural primária e uma ou mais das propriedades biológicas do factor de desenvolvimento de fibroblastos básicos humanos, uma sequência de promotor regulada e um gene de controlo do número de cópias induzíveis pela temperatura.
7. - Processo para a purificação de factores de desenvolvimento de fibroblastos básicos recombinantes expressos por uma estirpe hospedeira de E. coli que incorpora um plasmídeo que codifica para o factor de desenvolvimento de fibroblastos básicos, caracterizado pelo facto de se cromatografar os factores de desenvolvimento de
-5:
fibroblastos básicos recombinantes e de se isolarem em seguida da estirpe hospedeira de E. coli, mediante utilização de uma coluna cromatográfica isenta de heparina,
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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| FG3A | Patent granted, date of granting |
Effective date: 19920127 |