PT89081B

PT89081B - Processo para a producao de analogos do factor de crescimento de fibroblastos

Info

Publication number: PT89081B
Application number: PT89081A
Authority: PT
Inventors: Tsutomu Arakawa; Gary M Fox
Original assignee: Amgen Inc
Priority date: 1987-11-24
Filing date: 1988-11-24
Publication date: 1993-09-30
Also published as: JPH02504468A; PT89081A; KR890701607A; DK362989A; NZ227057A; DK362989D0; AU2818189A; EP0320148A1; FI893530A0; WO1989004832A1; FI893530A; AU638402B2

Description

A presente invenção refere-se a análogos do factor de criscimento de fibroblastos. Em especial, a presen te invenção refere-se a análogos do factor de crescimento de fibroblastos básicos recombinantes (r-bFGF) em um hospedeiro de estirpe E. Coli, (Escherichia Coli) e a polinucleótidos que codificam esses factores.

A numenclatura utilizada é a seguinte:

FGF = factor de crescimento de fibroblastos, aFGF = factor de crescimento de fibroblastos ácido, n-FGF = FGF natural ou de ocorrência natural, h-FGF = FGF humano, b-FGF = FGF bovino, h-bFGF = FGF básico humano, b-bFGF = FGF básico bovino, r-bFGF = FGF básico recombinante, rh-bFGF = FGF básico humano recombinante, rb-bFGF = FGF básico bovino recombinante

Antecedentes factor de crescimento de fibroblastos (FGF), foi primeiro descoberto por Gospodarov/icz, Nature, 249, 1974, p. 123, sob a forma de uma actividade derivada de tecido do cérebro bovino ou de pituitária que era mitogénica para fibroblastos e células endozeliais. Verificou-se mais tarde que o mitogéno principal do cérebro é diferente do isolado da pituitária. Estes dois factores foram designados por FGF básico e ácido porque apresentam actividades biológicas similares mas não idênticas pois diferem no seu ponto isoeléctrico.

Subsequentemente isolaram-se outros mitogénos de células endoteliais, a partir de um certo número de tecidos e de tumores que eram muito similares ou idênticos ao FGF básico. Estes factores incluem, por exemplo, o factor de crescimento derivado de hepatoma (KIAGS brun et al, PNAS, 83, 1986 p. 2448-2452, e Lobb et al; J. Biol. Chem. 23, 1984 p. 6295-6299), factor de crescimento derivado de condrossarcoma (Shing et al, Science, 223, 1984, p. 1296-1299), factor de crescimento derivado de beta retina (Baird et al, Biochemistry, 24, 1985 p. 7855-7860), factor de crescimento derivado de cartilagem (Sullivan e Klagsbrun; J. Biol Chem., 260, 1985, p. 2399-2403), factor 2 de cre_s cimento astroglial (Pettman et al, FEBS Lett.; 189, p. 102-108) factor de crescimento derivado do olho (Courty et al, Biochimie, 67, 1985, p. 265-2698) factor de crescimen to derivado de hipotálamo catiónico (Klagsbrun e Shing, PNAS, 82, 1985,p. 805-809), factores de crescimento da

classe 2 e de ligação à beta heparina (Lobb e Fett, Blochemistry, 23, 1984, p, 6265-6299; Lobb et al Biochem., 24, 1985, p. 4969-4973; Lobb et al; BBRC, 131, 1985 p. 586-592; Lobb et al, ”J, Biol. Chem, 261, 1986 p. 1924-1928) e um componente de factor de crescimento derivado de macrófagos (Bair et al, BBRC, 126, 1985, p. 358-364).

Todos os factores acima referidos partilham a propriedade de bFGF de ligação estreita com a heparina e todos são protéinas básicas. Também se descobriu um grupo similar de factores que se ligam à heparina tipificados por aFGF. Estas moléculas eluem da heparina a uma baixa concentração de cloreto de sódio e têm pontos isoeléctricos na região ácida. A propriedade de ligação à heparina destes factores facilita a sua purificação permitindo o isolamento de protéina suficiente para a análise da sequência de aminoáci. dos em diversos casos. Ainda que a utilização da heparina tenha facilitado a purificação de FGF, a utilização de heparina em processos de purificação em larga escala não é desejável porque é despendiosa, é possível a contaminação do produto com heparina e a perda de rendimento devida à li. gação irreversível com a heparina .

Os FGF básico e ácido são provávelmente derivados do mesmo gene ancestral e são 55% homólogos na sequência de aminoácidos tendo a mesma estrutura de introns/ exonos.

As experiências de manchas de Southem sugerem que existe apenas um gene para cada um dos FGF básico e ácido; as diferênças entre as moléculas isoladas de diferen tes tecidos são provavelmente devidas a processos de post-

-translação. A escala de actividades biológicas das duas cla_s ses apresenta-se idêntica ainda que o bFGF seja cerca de dez vezes mais potente do que o aFGF na maior parte dos si.s temas de bioensaio.

FGF básico consiste em uma protéina de cadeia simples, não glicosilada, com um peso molecular de aproximadamente 16 500. 0 FGF básico contém quatro resíduos de cisteína mas desconhece-se o número de ligações de disulfureto se é que existe alguma. Um produto de tradução primá ria com 155 aminoácidos foi proposto para bFGF mas a maior parte da que foi encontrada no tecido pituitário tem 146 aminoácidos.

Foram isolados dos diferentes tecidos diversas formas de peso molecular diferindo no comprimento no N-termínal, todas apresentando-se como retentoras de actividade biológica.

FGF básico é uma proteína extremamente básica com um ponto isoeléctrico de 9,6. 0 FGF básico liga-se ávidamente à heparina eluíndo de colunas de sefarose da heparina no cloreto de sódio a cerca de 1,6 M..A actividade biológica de bFGF é destruída pelo aquecimento a 70°C ou pe. los detergentes. No genoma as sequências que codificam este produto de tradução são interrompidas por dois introns; a primeira imerge do codão 60 e a segunda separa os codões 94 e 95. A dimensão da região codificadora genómica completa não é conhecida mas possui pelo menos 34Kb de comprimento. 0 gene para bFGF está localizado no cromossoma 4.

Os dados da primeira sequência para bFGF foram publicados por Bohlen et al, PNAS, 81, 1984; p. 5364-

-5368, que determinaram os 15 aminoácidos no N-terminal de material purificado proveniente de tecido de pituitária bovina. Subsequêntemente, Esch et al; PNAS, 82, 1985 p. 6507-6511, . Referiu a sequência completa de bFGF de pituitária bovina e comparou-a, ao mesmo tempo, com a sequência do terminal amina de aFGF. 0 pedido de patente de invenção PCT WO 86/07595 descreve a produção de bFGF em E. Coli. Contudo, o rendimento referido do produto é extremamente baixo. A clonagem do gene para b-bFGF foi descrita em primeiro lugar por Abraham et al; Science; 233, p.545-548 e, posteriormente, os mesmos autores descrevem a sequência nucleôtídica e a organização genómica de h-bFGF em (ΞΜΒΟ Jour nal”, 5, 1986 p. 2523-2528). Os bFGF humano e de bovino diferem apenas de dois aminoácidos.

Embora preparações de grande pureza de bFGF tenham sido recentemente tornado disponiveis para ensaios, muitos estudos in vitro têm sido publicados utilizando material com diversos níveis de pureza. Nestes estudos, o bFGF tem sido descrito como possuindo uma actividade mitogénica potente para uma grande variedade de células de origem mesodérmica podendo ser quimiotáctico para as células endoteliais e para fibroblastos. Além disso, 0 r-bFGF derivado de tecido e de ocorrência natural parece induzir à neo-vascularização na córnea do coelho e em ensaios sobre a membrana corioalantoideia do frango, portanto podendo apresentar-se utilizável para acelarar a cicatrização de feridas, Fourtanier et al, J. Inv. Derm., 87, 1986 p.76-80, referiu que a preparação derivada de retina bovina ê capaz de estimular a neo-vascularização e a re-epitelização e promover a cicatrização de feridas numa experiência em vesículas de co

baia. Davidson et al; J. Cell. Biol.; 100, 1985, p. 1219

-1227, demonstraram que a cicatrização acelarada de feridas acompanhada por aumento de tecido granuloso e de acumulação de colagénio pode ser induzida pelo factor derivado de cartilagem bovina, em um sistema experimental de feridas no ra to. Buntrock e colaboradores; ”Exp. Path.; 21, p.46-53 e Exp. Path.” 21, 1982, p. 62-67, também referiram o aumento do tecido granuloso e neo-vascularização durante a cicatrização acelarada de feridas em ratos utilizando um extracto de tecido de cérebro bovino.

Sumário da Invenção

A presente invenção refere-se a análogos de bFGF que são mais estáveis do que o bFGF de ocorrência natural e que facilitam a purificação de r-bFGF. Proporciona-se um análogo de bFGF que comporta uma sequência de aminoácidos que incorpora resíduos de cisteína em que, pelo menos um, de preferência dois dos referidos resíduos de cisteína, é/são substituído(s) por um resíduo de aminoácido diferente.

A presente invenção também se refere a um pro cesso preferido para a produção de análogos de bFGF, o qual consiste em:

1) desenvolver em condições nutrientes apropriadas, células hospedeiras de E. Coli, transformadas com um vector plasmídico de ADN, em que esse vector comporta uma sequência de ADN codificadora para expressão no hospedeiro de Ξ. Coli de um análogo de bFGF comportando uma parte ou o total da conformação estrutural primária de bFGF e uma ou mais das propriedades biológicas do factor de crescimento de fibroblastos básicos humanos em que pelo menos um resíduo de cisterna é substituído por um resíduo de um aminoácido diferente (referido aqui como análogos de bFGF), uma sequência do promotor regulada e um gene de controlo do número de cópias induzível pela temperatura;

2) isolar os análogos de bFGF desejados, da expressão das sequências de ADN no referido vector; e

3) purificar os análogos de bFGF desejados.

A presente invenção também se refere a métodos de purificação de análogos de r-bFGF derivados de E. Coli, utilizando sistemas cromatográficos que não contenham heparina.

Também são proporcionadas as sequências codi ficadoras de ADN para todos ou para parte de análogos de rh-bFGF. Estas sequências podem incluir, preferivelmente:

1- A incorporação dos codões preferidos para a expressão por estirpes hospedeiras de E. Coli seleccionadas, (codões de expressão de E. Coli).

2- A preparação de locais de clivagem por enzimas de endonuclease de restrição; e/ou

3- A preparação de sequências de ADN intermédias, terminais ou iniciais que facilitam a construção de vectores expre^s sados fácilmente.

As novas sequências de ADN da presente inven ção incluem sequências utilizáveis na expressão segura em células hospedeiras de B. Coli de análogos de bFGF.

As sequências de ADN da presente invenção incluem especificamente:

a) sequências de ADN representadas na fig. 2 em que, pelo menos um codão que codifica um resíduo de cisteína, é substituído por um codão que codifica um resíduo de aminoácido diferente, (.referidas como sequências análogas);

b) uma sequência de ADN que hibridiza com uma das sequênc_i as análogas ou com os seus fragmentos;

c) uma sequência de ADN que hibridiza com uma das sequênc_i as análogas mas sem desgenerescência do código genético.

Mais especificamente, entende-se na parte c) que são sequências de ADN preparadas que codificam análogos de bFGF as quais podem incorporar codões que facilitam a tradução do ADN mensageiro nos hospedeiros microbianos preferidos. Estas sequências preparadas podem ser facilmente construidas de acordo com os métodos de Alton et al, PCT-p£ dido de patente de invenção no WO 83/04053.

Descrevem-se a seguir os análogos de bFGF isolados e purificados que possuem uma ou mais das propriedades biológicas (p/ex: propriedades imunológicas e actividade biológica in vitró) e propriedades físicas (por exem pio, peso molécular) de bFGF de ocorrência natural, inluin do as suas variantes aléticas.

Estes análogos de bFGF também podem ser carac

terizados por serem o produto de expressão em hospedeiras de E. Coli de sequências de ADN exógenas. Os análogos de bFGF da presente invenção, que são expressos por células hospedeiras de E. Coli podem incluir um resíduo do aminoácido metionina inicial, na posição 1 como se mostra no fig. 2. Alternativamente, um ou mais dos resíduos dos aminoácidos terminais podem ser retirados da sequência de ADN, mantendo a actividade biológica de bFGF de ocorrência natural como é sabido pelos técnicos desta matéria.

Também estão incluídos no âmbito da presente invenção diversos veículos de olonagem replicáveis, veículos de expressão e culturas de E. Coli transformadas, comportando todos a informação genetica alterada necessária pa ra efectuar a produção de análogos de bFGF derivados de

E. Coli.

Pode utilizar-se a mutagénese de local dirigido para converter o gene para b-bFGF num codificador para rh-bFGF. Também se pode modificar o gene bovino e o gene humano por mutage'nese de sítio-dirigido, para converter pelo menos um dos resíduos de cistéina.

Numerosos aspectos e vantagens da presente invenção serão evidentes para os técnicos após consideração da descrição detalhada que se segue e que proporciona a exem plificação da prática da presente invenção nos seus aspectos presentemente preferidos.

Breve descrição das figuras

A fig. 1 é a representação esquemática da reu nião e clonagem do gene de bFGF.

A fig. 2 representa sequências nucleotídicas e de aminoácidos de r-bFGFs. As caixas a cheio representam as alterações dos nucleotidos e dos aminoácidos resultantes que são produzidas pela mutagénese de sítio-dirigido, a fim converter o gene bovino num codificador de rh-bFGF, As caixas a ponteado representam as alterações feitas para conver ter o gene de bFGF em um codificador para análogos de bFGF da presente invenção.

A fig. 3 representa um gráfico da actividade mitogénica de r-bFGFs em células NIH3T3. 0 efeito mitogénico de rh-bFGF (.) e rb-bFGF (o) e bFGF humano recombinante (ser-70.80) (x) em células NIH3T3. A dose de r-bFGF está de. senhada em função da percentagem de estimulação máxima da síntese de ADN avaliada por absorção, nessa dose, de, ¾ timidina.

A fig. 4 representa a fotografia de uma coloração com prata de uma electrofurese sobre gel de poliacrilamida-dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) de r-bFGFs purificados;

A fig. 5 representa o perfil obtido por cromatografia líquida de alta resolução de rb-bFGF S-carboximetilado natural digerido com tripsina (topo do painel). As setas indicam os péptidos que exibem as diferenças principais no tempo de retenção após a S-carboximetilação.

A fig. 6 representa um espectro dicroico circular de rb-bFGF nas regiões de U.V. longíqua (esquerda) e próxima (direita).

A fig. 7 representa um gráfico da actividade mitogénica do análogo bFGF de Ser-26,70,88,93 em células

ΝΙΗ3Τ3. A dose de r-bFGF estâ registada em função da percentagem de estimulação máxima da síntese de ADN, medida pela ~ 3 absorçao de H-timidina nessa dose.

A fig. 8 representa um diagrama de um estudo e observação in vivo de um ferimento numa orelha de rato do exemplo 16.

Descrição detalhada

Proporcionam-se novos análogos de bFGF de acordo com a presente invenção, os quais incorporam pelo me nos um, de preferência dois, dos resíduos de cisteína que se encontram em bFGF natural substituídos por um resíduo de aminoácido diferente. Verificou-se que estes análogos exibem uma estabilidade surpreendente, acentuadamente aumentada em relação ao bFGF natural. Acredita-se que os análogos de bFGF mais estáveis da presente invenção podem também aumentar a eficácia de bFGF nos tratamentos de cicatrização de feridas e em cirurgia.

A presente invenção também proporciona genes manufacturados ou sintéticos capazes de síntese directa em hospedeiros microbianos seleccionados, (por exemplo, bactérias, leveduras e células de mamíferos em cultura), de análogos de bFGF.

Também são abrangidas pela presente invenção as composições farmacêuticas que incorporam quantidades efi_ cazes de bFGF da presente invenção em conjunto com diluentes agentes adjuvantes e/ou véiculos apropriados úteis na cicatrização de feridas e em aplicações cirúrgicas, incluindo, mas não limitando a cicatrização de feridas superficiais, ( ' cicatrização óssea, angogenese (formação de vasos sanguíneos, especialmente importante para a cicatrização de feridas profundas), regeneração de nervos e formação e regeneração de orgãos.

Tal como aqui se utiliza, a designação factor de crescimento do fibroblasto básico derivado de tecido refere-se a factores de crescimento de fibroblastos básicos derivados de tumores, de células eucarióticas mantidas em cultura, tecidos normais e outros similares.

Tal como aqui se utiliza, o termo manufactú rado aplicado a uma sequência de ADI’ ou a um gene designa um produto sintetizado quimicamente na sua totalidade, por reunião de bases nucleotldicas ou derivado da replicação biológica sintetizado quimicamente. Como tal, a designação é exclusiva de produtos sintetizados por métodos de ADN de clonagem genómica, os quais envolvem materiais iniciais ori_ ginalmente de origem biológica.

Tal como aqui se utiliza, o termo sintetizado refere-se a mutagénese de sitio-dirigido ou outra alteração de um gene manufacturado préviamente.

Como aqui se descreve, a designação resíduos de cisteína que existem sob a forma de . sulfidrilos livres refere-se a resíduos de cisteína que não involvem a formação de ligações de di-sulfureto.

bFGF recombinante derivado de E. Coli foi produzido de acordo com o seguinte processo geral:

A sequência de aminoácidos de bFGF publicada por Esch et al; PNAS, 82, 1985, p. 6507-6511, foi utilizada como base para a produção do gene de bFGF para expres- 13 são em E. Coli. A sequência nucleotídica para este gene manufacturado inclui codões utilizados muito frequentemente pela E. Coli e locais de restrição apropriados para serem utilizados em clonagem. Representativo de um gene manufacturado é o gene apresentado no quadro I.

quadro I representa um gene manufacturado para b-bFGF, enquanto que o quadro II representa um gene sintético para h-bFGF.

A sequência nucleotídica do gene manufactura do para b-bFGF e a sequência de aminoácidos a partir da qual este é derivado estão representadas na fig. 2. As caixas a cheio indicam as alterações nucleotídicas e de aminoácidos resultantes que foram produzidas pela mutagénese de sítio-dirigido afim de se converter o gene bovino manufacturado em um gene sintético que codifica para h-bFGF. As caixas com linhas ponteadas indicam as alterações subsequentes rea lizadas para converter o gene sintético de h-bFGF em sequên cias nas quais um ou mais dos resíduos de cisteína estão substituídos por resíduos de serina. Aceita-se que a mutagénese de sítio-dirigido pode ser utilizada para gerar outros análogos de b-bFGF. Por outras palavras, podem utilizar-se outros aminoácidos para substituir os resíduos de ciste_í na. Geralmente o aminoácido escolhido como substituto do re. síduo de cisteína é escolhido com base na sua capacidade para criar um análogo que retenha uma estrutura similar mas que impeça a formação de dímeros.

Exemplos destes aminoácidos incluem a serina, a alamina, o ácido aspártico e a asparagina. Outros aminoácidos que podem substituir a cisteína serão reconhecidos pelos técnicos nesta matéria.

Foram manufacturados oligonucleotidos que correspondem a ambas as cadeias do gene de b-FGF nas secções de sobreposição e reunião em duas secções maiores por hibridização e subsequente ligação.

As duas secções maiores foram clonadas depois por meio de um vector fágico apropriado (por exemplo, M13mpl8) para análise da sequência nucleotídica. Estes vectores fágicos são fácilmente determinados pelos técnicos da matéria. Apôs verificação da sequência correcta, excisam-se ambas as secções por digestão com endonucleases de restrição, isoladas sobre gel e ligadas por meio de um vector de expressão apropriado. A expressão do gene de bFGF codificada no vector de expressão é regulada por uma sequência promotora regulada e os genes de controlo do núir.ero de cópias induziveis pela temperatura localizados no vector de expre^s são.

termo promotores regulados é utilizado para referir os promotores P^, (por exemplo, promotores derivados do fago//iamed§7) e, para abreviar, o promotor P_L. Os vectores de expressão que contêm estes promotores regulados e os genes de controlo do número de cópias induziveis pela temperatura, estão descritos no pedido de patente de invenção europeia N2 136,490. 0 desenvolvimento do vector de expressão que contêm o gene de bFGF numa estirpe de E. Coli hospedeira apropriada, produz o rb-bFGF. Quando se lisaram as células que continham o rb-bFGF e se submeteram a centrifugação a velocidade baixa, encontrou-se de cerca de 30% até cerca de 70% de rb-bFGF sob a forma solúvel na frac ção sobrenadante. A purificação utilizando sistemas cromatográficos isentos de heparina, isto é, cromatografia de afinidade, forneceu um produto polipeptídico que se verificou ser pelo menos 95% puro, através de electroforese em gel de poliacrilamida e que, virtualmente, não continha endotoxinas ou contaminação por ADN.

Quadro I

Factor de crescimento de fibroblasto de bovino básico/gene manufacturado

CTAGAAGGAGGAATAACATATGCCAGCTCTGCCAGAAGATGGTGGATCCGGTGCTTTCCC

GATCTTCCTCCTTATTGTATACGGTCGAGACGGTCTTCTACCACCTAGGCCACGAAAGGG

90 110

GCCAGGTCATTTCAAAGATCCGAAACGTCTGTACTGCAAAAACGGTGGTTTTTTCCTGCG

CGGTCCAGTAAAGTTTCTAGGCTTTGCAGACATGACGTTTTTGCCACCAAAAAAGGACGC

130 150 170

TATCCATCCGGATGGTCGTGTTGATGGTGTACGTGAGAAATCTGATCCGCATATCAAACT

ATAGGTAGGCCTACCAGCACAACTACCACATGCACTCTTTAGACTAGGCGTATAGTTTGA

190 210 230

GCAGCTGCAAGCTGAAGAGCGTGGTGTAGTTTCTATTAAAGGTGTATGTGCTAACCGGTA

CGTCGACGTTCGACTTCTCGCACCACATCAAAGATAATTTCCACATACACGATTGGCCAT

250 270290

CCTGGCTATGAAAGAAGACGGTCGTCTGCTGGCTTCTAAGTGTGTTACTGACGAATGTTT

GGACCGATACTTTCTTCTGCCAGCAGACGACCGAAGATTCACACAATGACTGCTTAOAAA

310 330350

CTTTTTCGAACGTCTGGAATCTAACAACTACAACACTTACAGATCTCGTAAATACTCTTC

GAAAAAGCTTGCAGACCTTAGATTGTTGATGTTGTGAATGTCTAGAGCATTTATGAGAAG

370 390410

CTGGTATGTAGCTGTGAAACGTACTGGTCAGTACAAACTGGGTCCGAAGACTGGTCCGGG

GACCATACATCGAGACTTTGCATGACCAGTCATGTTTGACCCAGGCTTCTGACCAGGCCC

430 450470

TCAGAAAGCTATCCTGTTTCTGCCGATGTCTGCTAAATCTTAATAGCTCGAGAAGCTT

AGTCTTTCGATAGGAACAAGACGGCTACAGACGATTTAGAATTATCGAGCTCTTCGAA

Quadro II

Factor de crescimento de fibroblasto básico humano/gene sintético

30 50

CTAGAAGGAGGAATAACATATGCCAGCTCTGCCAGAAGATGGTGGATCCGGTGCTTTCCC

GATCTTCCTCCTTATTGTATACGGTCGAGACGGTCTTCTACGAGCTAGGCCAGGAAAGGG

90 110

GCCAGGTCATTTCAAAGATCCGAAACGTCTGTACTGCAAAAACGGTGGTTTTTTCCTGCG

CGGTCCAGTAAAGTTTCTAGGCTTTGCAGACATGACGTTTTTGCCACCAAAAAAGGACGC

130 150 170

TATCCATCCGGATGGTCGTGTTGATGGTGTACGTGAGAAATCTGATCCGCATATCAAACT

ATAGGTAGGCCTACCAGCACAACTACCACATGCACTCTTTAGACTAGGCGTATAGTTTGA

190 210 230

GCAGCTGCAAGCTGAAGAGCGTGGTGTAGTTTCTATTAAAGGTGTATGTGCTAACCGGTA

CGTCGACGTTCGACTTCTCGCACCACATCAAAGATAATTTCCACATACACGATTGGCCAT

250 270290

CCTGGCTATGAAAGAAGACGGTCGTCTGCTGGCTTCTAAGTGTGTTACTGACGAATGTTT

GGACCGATACTTTCTTCTGCCAGCAGACGACCGAAGATTCACACAATGACTGCTTACAAA

310 330350

GTTTTTCGAACGTCTGGAATCTAACAACTACAACACTTACAGATCTCGTAAATACACTTC

GAAAAAGCTTGCAGACCTTAGATTGTTGATGTTGTGAATGTCTAGAGCATTTATGTGAAG

370 390410

CTGGTATGTAGCTCTGAAACGTACTGGTCAGTACAAACTGGGTTCGAAGACTGGTCCGGG

GACCATACATCGAGACTTTGCATGACCAGTCATGTTTGACCCAAGCTTCTGACCAGGCCC

430 450470

TCAGAAAGCTATCCTGTTTCTGCCGATGTCTGCTAAATCTTAATAGCTCGAGAAGCTT

AGTCTTTCGATAGGACAAAGACGGCTACAGACGATTTAGAATTATCGAGCTCTTCGAA

Utilizou-se a mutagenese de sitio-dirigido para converter o gene de bovino em um codificador para o bFGF humano. Utilizou-se o mesmo esquema de purificação para rb-bFGF que se utilizou para purificar o rb-bFGF.

Avaliou-se a actividade mitogénica de rb-bFGF, rh-bFGF e análogos de FGF, da presente invenção derivados de E. Coli, utilizando um ensaio mitogénico in vitro que se baseia no aumento da absorção de timidina rádio-marcada por células 3T3 de murganho que acompanham a síntese de ADN aumentada durante a divisão celular.

Utilizou-se a mutagénese de sitio-dirigido oligonucleotídica para modificar o gene de rh-bFGF de modo a que as sequências que codificam para uma parte ou para o total dos resíduos de cisteína codificarão então para resíduos de’aminoácidos diferentes. Os análogos de bFGF da presente invenção demonstraram de um modo surpreendente possuir uma estabilidade acentuadamente superior á da molécula de bFGF ainda que não desprovida da actividade da bFGF.

Os exemplos que se seguem servem para uma melhor compreensão dos vários aspectos da presente invenção. A designação D.O., tal como é utilizada nestes exemplos refere-se a unidades de Densidade optica a 600 nm.

EXEMPLO 1

Preparação de um gene manufacturado de codificação de b-bFGF.

Este exemplo· refere-se à preparação de um gene manufacturado que codifica b-bFGF em que, de preferência, são incluídos codões de expressão em E. Coli. 0 protocolo utilizado para preparar o gene manufacturado que codi fica o produto de b-bFGF está descrito de forma geral por Alton et al. na publicação PCT N2 WO 83/04053 que aqui está incorporada como referência. Os genes foram designados para reunião inicial dos oligonucleotidos componentes em duplexes múltiplos que por sua vez foram reunidos em duas secções discretas. Estas secções foram concebidas para rápida ampli ficação e/ após a remoção do sistema de amplificação poderam ser sequêncialmente reunidas ou através da ligação de fragmentos múltiplos num vector de expressão apropriado.

Reunião do sector I do factor de crescimento de fibroblastos.

Mediram-se 200 pm de cada um dos 16 oligómeros necessários à reunião da secção I, representada no quadro III, em tubos de eppendorf e secaram-se em vácuo. Prepararam-se 320 /11 de uma mistura de quináse que continha 32 jul de uma solução tampão de ligação 10 x (50 M HEPES, ph 7,6), 0,7 /11 de ATP (adenosina trifosfato) 10 mM 1 /il de 3 x 10^ contagem/minuto//il de ATP rádio-marcado e 266/11 de água.

Reuniram-se os reagentes num tubo de quinase (Boehringer Mannheim, Ingelheim, Alemanha Ocidental), que continha 20 /11 de enzima quinase com uma concentração de 10 unidade//il. Dividiu-se esta mistura de quinase em partes alíquotas por cada um dos tubos de 2 a 15 contendo, respectivamente, 2 a 15 oligonucleotidos. Os tubos que continham os oligonucleotidos 1 e 16 receberam apenas a solução tampão de ligação. Fez-se uma incubação dos tubos que continham os nucleotidos 2 a 15, à temperatura de 37°C durante 45 minutos, tempo ao fim do qual se retiraram alíquotas de, 1/4 de /il de cada tubo, e se colocaram sobre tiras de papel para

- 20 - / cromatografia DS81 (Whatman, Maidstone, K.U.) utilizando como agente de eluição o formato de amónio O,35M e analizaram-se num contador de cintilação de líquido. A análise de cin tilação de líquido mostrou que mais de metade das contagens estavam na origem

Quadro III

OLIGOKEROS FGF, DE SECÇÃO I

1)	5’	CTAGAAGGAGGAATAACATATGCCAGCTCT	3’
2)	5»	GCCAGAAGATGGTGGATCCGGTGCTTTCCC	3’
3)	5’	GCCAGGTCATTTCAAAGATCCGAAACGTCTG	3’
4)	5*	TACTGCAAAAACGGTGGTTTTTTCCTGCGTA	3’
5)	5*	TCCATCCGGATGGTCGTGTTGATGGTGTAC	3’
6)	5’	GTGAGAAATCTGATCCGCATATCAAACTGCA	3’
7)	5’	GCTCAAGCTGAAGAGCGTGGTGTAGTTT 3’
8)	5’	CTATTAAAGGTGTATGTGCTAACCGGTACCTG	3’
9)	5’	CTGGCAGAGCTGGCATATGTTATTCCTCCTT	3’
10)	5*	TGGCGGGAAAGCACCGGATCCACCATCTT 3	9
11)	5’	AGTACAGAGACGTTTCGGATCTTTGAAATGACC 3 ’
12)	5’	AT GGATAC GC AGGAAAAAAC CACCGTTTTTGC	3’
13)	5’	TCACGTACACCATCAACACGACCATCCGG 3	9
14)	5’	CAGCTGCAGTTTGATATGCGGATCAGATTTC	3’
15)	5’	ATAGAAACTACACCACGCTCTTCAGCTTG 3	9
16)	5*	AATTCAGGTACCGGTTAGCACATACACCTTTA	3’

Daqui resultou a incubação adicional dos tubos durante mais 45 minutos a 37°C depois de se adicionar pl de ATP 10 mM a cada um dos tubos que continham 2 a 15 oligonucleotidos.

Ao final deste tempo, todos os tubos foram submetidos a ebulição durante 10 minutos, depois foram centrifugados e reunidos em duplexes. Isto foi realizado mediante adição do conteúdo do tubo 1 (duplex N^ 1), do tubo 10 ao tubo 2 (duplex N5 2), do tubo 11 ao tubo 3 (duplex N° 3), do tubo 12 ao tubo 4 (duplex N9 4), do tubo 13 ao tubo 5 (duplex N5 5), do tubo 14 ao tubo 6 (duplex N°6), do tubo 15 ao tubo 7 (duplex N^ γ) θ do tubo 16 ao tubo 8 (duplex N28). Estas oito misturas de oligonucleotidos foram seguidamente submetidas a ebulição, arrefecidas lentamente até à temperatura ambiente para permitir a formação dos duplexes. Reuniram-se os duplexes de forma a combinar os duplexes N²s 1 e 2 (tetrâmero 1 + 2), os duplexes 11¾ 3 e 4 (formando o tetrâmero 3 + 4), os duplexes NAa 5 e 6 (tetrâmero 5+6), e finalmente os duplexes N937 θ g (tetrâmero 7 + 8). A cada um destes tubos, agora contendo tetrâmeros adicionou-se 2 μΐ de ATP 10 mM e 2 jil de ligase T4 ADN (Boehringer Mannheim).

Incubaram-se estas misturas de ligação â tem peratura de 37°C durante 10 minutos depois durante 1 hora, à temperatura ambiente.

Nesta altura reuniram-se as misturas tetraméricas mais uma vez, de modo a que os tetrâmeros 1 + 2 e + 4 se combinassem conjuntamente e os tetrâmeros 5 + 6 e 7 + 8 se conbinassem de igual modo. A cada uma destas duas misturas de ligação resultantes adicionaram-se mais 2 μΐ de

ΑΤΡ 10 mM e 2 μΐ de ligase de T4 ADN. As misturas foram incubadas durante 10 minutos à temperatura de 37°C e em seguida à temperatura ambiente durante 1 hora.

Finalmente a ligação total foi reunida, isto é, o conteúdo de ambos os tubos foi adicionado em conjunto e em seguida a 8 μΐ de ligase e a totalidade da mistura foi incubada durante 10 minutos á temperatura de 37°C e em seguida toda a noite â temperatura de 4°C.

A seguir à ligação durante a noite analizou-se uma alíquota de 10 μΐ sobre gel de poliacrilamida a 8% com ureia 7M. Pôde visualizar-se uma banda adjacente ao par de bases 242 do marcador Hpall, que indicava que a ligação estava completa. Preparou-se um gel de poliacrilamida a 8% contendo ureia 7M. A mistura de ligação foi precipitada com etanol. Secou-se e extraíu-se com 80 μΐ de formamida a 80%. Carregou-se metade desta mistura de ligação num gel preparativo adjacente a uma camada que continha Hpall preparada com marcadores PBR332. Deixou-se o corante marcador de xileno-cianol alcançar a base do gel. Em seguida retirou-se o gel do aparelho de electroforese e colocou-se numa cassete de filme junto a uma peça de filme Kodak de raio-x. Visualizaram-se as bandas mediante a revelação dó filme e retirou-se uma tira de gel exactamente acima do marcador Hpall 242 na camada adjacente.

Esta tira continha uma banda de 244 pares de bases como se esperava, para a secção I completamente ligada do factor do crescimento de fibroblasto. Fez-se a extrusão desta tira de gel com uma seringa para um tubo de eppendorf, cobriu-se com uma solução de eluição de gel de Maxam Gilbert e incubou-se durante a noite à temperatura de 37°C, Filtrou-se em seguida o conteúdo do tubo através de um filtro de fibra de vidro, colocado numa seringa e extraíu-se o sobre nadante três vezes com N-butanol e precipitou no seio de etanol. Extraíu-se em seguida o grânulo seco com 200 μΐ de uma solução 10 ml/ de Tris-HCl e ácido etileno-diaraino-tetraacético (EDTA) 1 ml»í, e precipitou-se novamente no seio de etanol após a eliminação do resíduo de poliacrilamida que se centrifugou no fundo do tubo. A amostra precipitada no seio de etanol continha cerca de 37 mil contagem/minuto que correspondiam a cerca de 1,5 pM de duplex com base na radioactividade que correspondia aos oligoméros necessários a esta ligação. Dissolveram-se em seguida estes 1,5 pM em 20 μΐ de tampao de ligaçao contendo 3 x 10 contangens/minuto de ATP rádiomarcado. Retirou-se uma amostra alíquota de 1/4 de ^ul e colocou-se em uma tira de D381. Em seguida adicionou-se 1 μΐ de quináse e incubou-se o tubo á temperatura de 37°C durante 45 minutos.

QUADRO IV

OLIGOlúBROS DE FGF, SECÇÃO II

17)	5*	AATTCGGTACCTGGCTATGAAAGAAGACGGTCGTCTGCTGG	3’
18)	5’	CTTCTAAGTGTGTTACTGACGAATGTTTCTTTTTCGAACG	3’
19)	5’	TCTGGAATCTAACAACTACAACACTTACAGATCTCGTAAA	3*
20)	5’	TACTCTTCCTGGTATGTAGCTCTGAAACGTACTGGTCAGT	3’
21)	5*	ACAAACTGGGTCCGAAGACTGGTCCGGGTCAGAAAGCTATCC	3*
22)	5*	TGTTTCTGCCGATGTCTGCTAAATCTTAATAGCTCGAGA 3	♦
23)	5’	GAAGCCAGCAGACGACCGTCTTCTTTCATAGCCAGGTACCG	3’
24)	5’	CAGACGTTCCAAAAAGAAACATTCGTCAGTAACACACTTA	3*
25)	5’	ATGATTTACGAGATCTGTAAGTGTTGTAGTTGTTAGATTC	3’
26)	5’	TTGTACTGACCAGTACGTTTCAGAGCTACATACCAGGAAG	y
27)	5*	AAACAGGATAGCTTTCTGACCCGGACCAGTCTTCGGACCCAGT 3’
28)	5’	AGCTTCTCGAGCTATTAAGATTTAGCAGACATCQGCAG 3’

Nesta fase retirou-se 1/4 )al do tubo e colocou-se em uma segunda tira de DE81. Eluiram-se ambas as tiras com formato de amónio 0,35 M e em seguida cortaram-se em secções e contaram-se em um contador de cintilação de líquido. Ambas as tiras, anterior e posterior, demonstraram com evidência que as contagens foram incorporadas na origem, portanto a reacção de quinação realizou-se até estar completa com a adição de 1 μΐ de ATP 10 mm e incubação durante mais 30 minutos à temperatura de 37°C. Em seguida aqueceu-se a mistura de quinação à temperatura de ebulição durante 5 mi26 nutos e deixou-se arrefecer lentamente até à temperatura ambiente.

Reunião da secção II do factor de crescimento de fibroblasto.

A reunião da secção II do factor de crescimen to de fibroblasto foi feita de um modo idêntico. Mediram-se 200 pM de cada um dos 12 oligonucleotidos representados no quadro IV em tubos de eppendorf e secaram-se no vácuo. Repetiu-se a secagem com 10 μΐ de etanol a 30%. Preparou-se uma mistura de quinase contendo 24 μΐ de 10 x tampão de ligação, γ μΐ de ATP rádiomarcado (1,5 x 10 contagens/minuto/jil), 0,5 μΐ de ATP 10 mM, 20 μΐ de quinase e 193 μΐ de água, obtendo-se o volume total de 240 μΐ na mistura de quinase. Adi. cionaram-se 20 μΐ desta mistura a cada um dos tubos contendo os oligonucleotidos de 18 a 27, respectivamente, para serem submetidos à acção da quinase. Aos tubos que continham os oligonuleotidos 17 e 28 apenas se adicionou tampão de ligação. Em seguida incubaram-se os tubos durante 45 minutos à temperatura de 37°C retirando-se então aliquotas de 1/4 de μΐ de cada tubo e se colocaram em tiras de DE81. Em segui da as tiras de ΌΞ81 foram eluidas com formato de amónio O,35M e analisaram-se com um contador de cintilação de líquidos para determinar o número de contagens na origem. A análise mostrou o prosseguimento da reacção de fosforilação. Neste momento, adicionou-se 1 μΐ de ATP lOmF.I a cada tubo e incubaram-se estes durante mais 45 minutos à temperatura de 37°C.

Os tubos foram submetidos a ebulição durante minutos e foram em seguida centrifugados e reunidos de mo do a fornar duplexes. Reuniu-se o oligonucleotido N² 23 com o oligonuceotido N² 17 (duplex 17), o N² 24 com o N² 18 (duplex 18), ο N² 25 com o N2 19 (duplex 19), o N² 26 com o N²20 (duplex 20), o N² 27 com o N² 21 (duplex 21) e o N² 28 com o N² 22 (duplex 22). Submeteve-se as misturas de duplex a ebulição e deixaram-se arrefecer lentamente até à tempera tura ambiente por um período superior a 1 hora. Reuniram-se os duplexes para formarem tetrâmeros.

Reuniram-se duplexes Ui 17 e 18 para formar o tetrâmero 17, os duplexes N2sl9 θ 20 para formar o tetrâmero 19, e os duplexes 1153 21 e 22 para formar o tetrâmero

21. Estes foram circularizados à temperatura de 37°C durante 10 minutos. A cada mistura tetrâmeoca adicionaram-se 2 μΐ de ATP 10 mM e 2 μΐ de ligase de T4 ADN .

Incubaram-se as três ligações durante a noite à temperatura de 4°C. Nesta altura retiraram-se alíquotas de 4 μΐ de cada um dos três tubos que continham os tetrâmeros e passaram-se no gel de poliacrilamida a 10% e eluíu-se com ureia 7M.

A autoradiografia do gel mostrou que a ligação se tinha processado. Reuniram-se os tetrâmeros 17 e 19 e adicionou-se 4 p.1 deligase e depois 4 μΐ de ATP 10 mM.

As 8 partes de ligação foram em seguida incubadas à temperatura de 37°C durante 15 minutos e depois à temperatura de 4°C durante 6 horas antes de se adicionar o último tetrâmero à mistura de ligação. Então adicionou-se o tetrâmero 21 à mistura de ligação octamérica e incubou-se a totalidade da mistura de ligação à temperatura de 37°C durante 15 minutos. Adicionaram-se 5 μΐ de ligase e 5 μΐ de

ΑΤΡ 10 mM e incubou-se a mistura resultante à temperatura de 37°C durante 15 minutos. Mais uma vez se adicionaram 5 pl de ligase e 5 pl de ATP 10 mM à mistura de ligação e incubou-se a totalidade da mistura de ligação durante a noite à tem peratura de 4°C . Fez-se uma verificação de ligação completa em gel de poliacrilamida a 8% com incorporação de ureia 7M_Zcue mostrou uma banda evidente com 242 pares de bases como se esperava. Extraiu-se a mistura de ligação com fenol, precipitou-se no seio de etanol antes de se carregar num gel preparativo carregou-se metade da mistura de ligação em gel com 7 mM ureia a 8% e visualizou-se o produto de 242 pares de bases por autoradiografia. Removeu-se e purificou-se o produto como se descreveu para a secção I para bFGF.

EXEMPLO 2

Clonagem e expressão de rb~bFGF

Sintetizou-se gene de b-bPGF em duas secções, como se descreveu no Exemplo 1. Cloncu-se cada secção no M13mpl8 para verificação de sequência antes da reunião no vector de expressão pCFM1156. Na preparação da clonagem para a secção I, o M13mpl8 foi digérido com um excesso triplo de enzimas de restrição EcoRI e Xbal durante duas horas .

A reacção terminou por extracção com igual volume de fenol, seguida de extracção com. clorofórmio e precipitação com 2,5 volumes de etanol. Lavou-se o grânulo de ADN com etanol, secou-se no vácuo e dissolveu-se em tris 10 mM, EDTA 0,1 mM, a um pH 7,4. A ligação realizou-se por incubação de 0,06 pmole do vector M13mpl8 preparado como já descrito, com 0,3 pmole de FGF sintetico-secção I em tris 50 m?í, a um pH 7,4, MgC12 10 mM, ditiotreitol (DTT) 10 mh, espermidina lmM ATP 1 nf.í 100pg/ml de albumina de soro bovina (ASB) e 1 unidade de T4 ligase, durante 4 horas à temperatura de 14°C.

Modificaram-se as células hospedeiras de S. Coli JM109 para se tornarem competentes, por centrifugação das células no seio de uma cúltura em desenvolvimento exponencial, suspensão em Ca_Cl₂ 50 mH arrefecido em gelo a uma concentração de 1,2 D.O./ml, durante 20 minutos, seguida de recentrifugação e re-suspenção das células na mesma solução com uma concentração de 12 D.O./ml.

Adicionaram-se as alíquotas da mistura de ligação (0,1-10 μΐ) a 200 pl de alíquotas das células hospedei, ras competentes e deixou-se em repouso sobre gelo durante 40 minutos . Adicionou-se em seguida o conteúdo de cada tubo a 200 pl de E. Coli JT.1109 recente, 3 ml de agar de Lúria fundido a 0,7% contendo 10 pl de isopropil-^-D-tio-galactopiranosido (IPTG) 100 mM e 50 μΐ de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-^-D-galactopiranosido (x - gal) a 2%. Colocou-se esta mistura numa placa de luria e incubou-se durante toda a noi. te à temperatura de 37°C.

Retiraram-se quatro das placas límpidas resultantes e incubaram-se em culturas de 10 ml utilizarão como estirpe hospedeira JM109. Preparou-se o ADN fágico de cadeia simples a partir destas culturas e fez-se a sua sequên cia pelo método de didesoxi utilizando o iniciador universal M13. Um destes quatro ADN tinha a sequência desejada e foi recuperado para reunião do gene de rb-bFGF no vector de ex

- 30 pressão.

A secção II do gene b-bFGF manufacturado foi clonada no M13mpl8 para sequênciação utilizando-se o mesmo método que se descreveu para a secção I. Neste caso o vector I.íl3mpl8 foi dissolvido com FcoRI e com HindIII ( 3 vezes em excesso) afim de se adaptarem as extremidades viscosas da secção II. Para a ligação misturaram-se 0,025 pmole do vector M13mpl8 com 0,075 pmole da secção II de FGF sintético fosforilado e incubou-se durante 4 horas a temperatura de 14°C como havia sido feito anteriormente.

A transformação que utilizou o mesmo método de CaC12 resultou em placas límpidas como para a secção I mas, uma vez que um elevado substracto das placas límpidas estava presente nas placas de controlo, realizou-se uma selecção posterior por hibridização. Diversas placas desenvolveram-se utilizando o hospedeiro JM109 como foi descrito anteriormente e os sobrenadantes que continham o ADN fágico foram colocados em filtros de nitrocelulose.

Fez-se uma radiomarcação dos oligonucleotidos N2sl8 e 24 utilizados na sintese da secção II com -^^p-ATP utilizando quinase polinucleotídica para servir de sonda nestes filtros. Seleccionaram-se dois clones avaliados como positivos e sequenciaram-se como anteriormente. Um destes clones apresentava a sequência esperada e foi utilizado para a reunião do gene no pCFM115ó.

EXEMPLO 3

Reunião do gene de rb-bFGF no vector de expressão pCFM1156.

Prepararam-se clones Ϊ.Ι13 e ADN sob a forma / replicativa de dupla cadeia para as secções I e II. Desenvolveram-se 500 ml de cultura de cada fago no hospedeiro JM1O9 e recolheram-rse as células por centrifugação. Em seguida as células foram resuspensas em sacarose a 15%, tris 0,05NI, EDTA 0,05M e 1 mg/ml de lisozima e incubaram-se em gelo durante 25 minutos. Adicionou-se RITAse a 0,1 mg/ml e continuou-se a incubação sobre gelo durante mais 10 minutos. Adicionou-se um volume igual de triton x-100 a 0,1%, tris 50 mM, EDTA 50 ml.T e continou-se a incubação sobre gelo durante mais 10 minutos. Estes lisatos foram em seguida centrifugados durante 1 hora a 39.OOOG e guardou-se o sobrenadante transparente. Adicionou-se brometo de etfdio a 1 mg/ml e cloreto de céssio para se obter uma densidade de 1,55 g/ml. Centrifugou-se esta solução durante 18 horas a 45.OOOR.p.M. em um rotor VTi-50 afim de se alcançar 0 equilíbrio. Visualizou-se a ban da de ADN em super-hélice de cada tubo por U.V. e recolheu-se com uma seringa. 0 brometo de etídio foi fácilmente eliminado por extracção com butanol e o cloreto de céssio foi retirado por diálise extensa tris 10 mV e EDTA 0,1 mil. Os stocks de ADN preparados por via foram utilizados para posterior formação de clones.

Ainda que se possam utilizar numerosos vectores para exprimir este ADN, o vector de expressão que possui um promotor regulado e um gene de controlo do número de cópias induzivel pela temperatura é o preferido, permitindo máximizar 0 rendimento do produto.

plasmídio de expressão pCFM115õ utilizado neste exemplo pode ser fácilmente construído a partir do pla_s mídio pCFM836, construção esta que está descrita no pedido { de patente de invenção europeia N2 136.490, publicado. Conta-se primeiro o vector pC?M83ó com Ndel e em seguida as extremidades são partidas com T4 polimerase de forma a que selam destruídos ambos os sítios de Ndel. Sm seguida dissolve-se o vector com Ciai e SacII para retirar o poli-adaptador existente antes da ligação com o poli-adaptador substituído como está representado no quadro V. Este poli-adaptador subs tituto pode ser construído de acordo com a metologia de Alton et al, supra.

controlo de expressão no plasmídio de expre£ são pCFM1156 faz-se por meio de um promotor P^ lambda encurtado que está ele próprio sob o controlo de um gene repressor Cj-g^y, como é proporcionado através da estirpe de S. Coli K12 Δ Htrp.

Dissolveu-se o vector de expressão pCFM1156 com um excesso duplo de Xbal e de HindIII na preparação da ligação com as secções I e II de FGF. Os stocks de ADN das secções I e II, preparados como foi descrito anteriormente, dissolveram-se com um excesso de duas vezes quer de Xbal quer de Kpnl (secção I) ou Kpnl e HindIII (secção II). Impregaram-se as três soluções resultantes da diluição num gel de agarose de baixo ponto de fusão , fusão a 1,2% preparado com tris-acetato 50 mM e submetidos a electroforese durante 3 horas a 60 volts. Corou-se o gel com 1 pg/ml de uma solução de brometo de etídio e visualizaram-se as bandas por

U.V..

A banda de vector linearizado e as bandas das secções I e II de FGF foram excisadas. do gel com um escalpelo colocadas em tubos separados e fundidas à temperatura de

70°C durante 15 minutos . Adicionou-se 5 microlitros do gel fundido que continha o vector linearizado a 10 pl de cada uma das secções I e II contidas no gel fundido e e-uilibrou-se a mistura a 37°C. I.Iisturou-se rapidamente o gel fundido com igual volume de 2x tampão de ligase arrefecido em gelo contendo ATP 2 mlvl e 0,5 unidades de T4 ligase e incubou-se durante toda a noite â temperatura de 14°C. Transformaram-se as alíquotas desta mistura de ligação em a estirpe hospedeira E. Coli PM6 competente congelada, utilizando o protocolo de transformação descrito por Hanahan; J. Mol. Biol'.' 166, 1933, p. 557-580, desenvolvidas durante 2,5 horas para permitir a expressão da resistência à canamicina e colocaram-se em placas de Lúria contendo 20 jug/ml de canamicina. Incubaram-se placas durante a noite à temperatura de 28°C. As colonias foram novamente colocadas em placas em filtros de nitrocelulose e reservou-se a placa principal. As colónias nos filtros desenvolveram-se até cerca de 1 mm de diâmetro à temperatura de 28°C e em seguida, colocaram-se durante a noite, à temperatura de 37°C para aumentar o número de cópias do plasmídio. Os filtros foram sondados por hibridização com 0 oligonucleotido 18 radiomarcado (da sintese do gene) à temperatura de 65°C em 6x tampão de citrato e solução de cloreto de sódio padrão (SSC, MaCl 0,15 citrato de sódio 0,015 M).

Seleccionaram-se 4 dos 25 clones positivos obtidos e desenvolveram-se em culturas de 500 ml. Preparou-se 0 ADN de forma replicativa como foi já descrito para as secções I e II utilizado o precesso de lisados purificados seguido de centrifugação em gradiente de densidade de equilí brio de cloreto de césio. 3eque::ciaram-se estes 4 clones directamente utilizando vectores de expressão de dupla cadeia como matriz para as reacções de sequenciação de didesoxi e verificou-se que os 4 clones tinham a sequência correcta.

Um destes clones foi escolhido para ser útilizado na expressão de rb-bFGF e posteriormente referido como pCFM1156/bFGF. a sequência de ADN para o gene de rb-bFGF construída deste modo em um vector pCFM1156/bFGF encontra-se representado no quadro I

Quadro V

ATCGATTTGATTCTAGAAGGAGGAATAACATATGGTTAACGCGTTGGAATTCGGTACCAT

TAGCTAAACTAAGATCTTCCTCCTTATTGTATACCAATTGCGCAACCTTAAGCCATGGTA

Clal, 12 Xbal. 29 Ndel, 35 Hincll, Hpal, 39 Mlul,

EcoRIl. 53 HgiCl Kpnl, 57 Ncol Styl,

GGAAGCTTACTCGAGGATCCGCGGATAAATAAGTAACGATCC

CC TTC GAATGAGC TC C TAGGC GC C TATTTATTCATT GC TAGG

Hindlll. 70 Aval Xhol. 75 BamHI Xho2, 79 Sac2

EXEMPLO 4

Expressão e purificação de rb-bFGF.

Expressão

Uma cultura de toda uma noite da estirpe de produção desenvolveu-se à temperatura de 28°C em caldo de Lúria (caldo de Luria: bactotriptona 10 g/1; extracto de levedura 5 g/1; MaCl 5 g/1) contendo 20 yug/ml de canamicina que se utilizou para inoculação de um lote de fermentação de 8 1. 0 meio do lote de 8 1 continha 40 g de extracto de levedura, 40 g de glicose, 10 g de cloreto de sódio e sais de tampão apropriados, solução de vitaminas e oligoelementos. Utilizou-se um protocolo de alimentação duplo. A carga inicial (11) continha 450 g de glicose mais os sais e vitaminas apropriados. Após o desenvolvimento para uma D.0. = 20 iníciou-se uma segunda carga com um débito d'~^; ordem dos 200 ml/ hora e a temperatura foi alterada para 42°C. Esta solução de carga continha 200 g/1 de bacto-triptona, 100 g/1 de extracto de levedura e 100 g/1 de glicose. 0 desenvolvimento foi prolongado durante 6 horas à temperatura de 42°C até ser alcançada uma concentração celular atingindo uma D.0. = 50 no momento na recolha.

Purificação

Desagregaram-se células de Ξ. Coli em água por meio de um homogeneizador de Gaulin e centrifugaram-se a 4,2 k durante 40 minutos com uma centrifugadora J.6 B.«

Quando se fez a análise por SDS-PAGE, apare ceu quer no centrifugado quer no sobrenadante rb-bFGF, sendo a proteína presente no sobre-nadante da ordem dos 60% a 70% . 0 centrifugado foi portanto retirado e purificou-se o sobrenadante por cromatografia de permuta ionica. Após a correcção do pH para 7,4 com tris-r-base, adicionou-se DTT ImM ao sobrenadante e misturou-se com uma resina de carboximetil celulose-SehparosJ^ (CM-Sehparose®, Pharmacia, Uppsala, Suécia), equilibrada com 40 mM tris-HCl/1 mM DTT/pH 7,4. Em seguida lavou-se a resina com porções mesmo tampão e eluiu-se a coluna com gradiente de NaCl linear desde 0 a 0,7 M.

Por análise SDS-PAGE reuniu-se um único pico com cerca de 0,5 M. Titulou-se para um pH 3,2 com tris-base, diluiu-se três vezes com água arrefecida e colocou-se sobre uma coluna de CM-Sepharose

Lavou-se a'coluna com NaCl de NaCl linear de 0,15 Lí a

0,15 Μ e eluiu-se com gradiente

0,5 M. Reuniu-se entre dois peque nos picos o pico principal e encontrou-se aproximadamente

95% de pureza com uma pequena quantidade de dímero analisou por SDS-PAGE não redutora

Titulou-se imediatamente o conjunto pH de aproximadamente 5 com acetato de sódio lií/pH quando se para um para impedir que o produto de rb-bPGF fosse oxidado e em seguida colocou-se em uma coluna de Sephadex G-75 e eluiu-se coffi citrato de sódio 20 mM/NaCl 0,LY/pH 5, fornecendo um único pico durante a eluição entre um patamar (que corresponde ao dímero) e um pequeno pico dos compostos menores tal como o DTT. Reuniram-se as fracções do máximo e conservaram-se à temperatura de 4°C, -20°C ou liofilizaram-se. 0 rendimento nesta filtração em gel foi de cerca de 100%. Obteve-se aproximadamente 160 mg de rb-bFGF a partir de 560 g da pasta celular.

- 38 Quadro VI

Factor do crescimento de fibroblastobásico humano/sequência peptídica

10 20

MetProAlaLeuProGluAspGlyGlySerGlyAlaPheProProGlyHisPheLysAsp

3040

ProLysArgLeuTryCysLysAsnGlyGlyPhePheLeuArglleHisProAspGlyArg

5060

ValAspGlyV alArgGlulysSerAspProHisIleLysLeuGlnleuGlnAlaGluGlu

80

ArgG1yValValSerl1eLysGlyVa10ysA1aAsnArgTyrLeuA1aMetLysGluAsp

90100

GlyArgLeuLeuAlaSerLysCysValThrAspGluCysPhePhePheGluArgLeuGlu

110120

S e rA snA snT y rA snT hrT y rArgS e rAr gL y sT y rT hrS e rT rpT y rV alA 1 aL euLy s

130140

ArgThrGlyGlnTyrLysLeuGlySerLysThrGlyProGlyGlnljysAlalleLeuPhe

146

LeuProMetSerAlaLysSer

EXEMPLO 5

Caracterização do rb-bFGF,

Examinou-se a actividade do rb-bFGF mediante a incorporação de ^H-timidina em células 3T3 . Todas as preparações, conservadas à temperatura de 4°C, e -20°C e liofilizadas exibiram uma actividade dependente da dose, com a concentração de proteína compreendida entre 20 e 210 pg/ir.l para uma actividade semi-máxima dependente da estirpe particular de células 3T3 utilizadas no ensaio.

Características gerais do produto final

Relação 280/260 — /*/2,0 ensaio de endotoxina LAL — ^0,6 Ul/ml (0,623 FGFmg)

ADN — <20 pg/ml (0,623 FGF mg) coeficiente de extinção (278 nm)— 1,3 para proteína a 0,1% pureza — 0 95%

Estabilidade

Quando se incubou uma preparação de rb-bFGF à temperatura de 4°C a diferentes valores de pH_; o rb-bFGF exibiu a formação de polímeros compostos por mais de uma molécula de bFGF a um pH — 6,0 devido ás ligações disulfureto inter-cadeia e à degradação a um pH — 4,0 devido á instabilidade ácido da ligação Asp-Pro.

Baseado nesta informação, escolheu-se um tampão de pH 5. Bstes dados de estabilidade sugeriram que os grupos sulfidrilo livres presentes no produto final tendem a formar, de preferência, inter-cadeias em vez de intra-cadei as, de ligações di-sulfureto. A preparação de rb-bFGF é aparentemente monomêrica quando determinada por meio de filtração em gel de Sephadex G-75·

EXEMPLO 6

Caracterização estrutural de rb-bFGF

Examinou-se a proteína rb-bFGF purificada, preparada como se encontra descrito no Exemplo 4, para a análise conformacional, utilizando a titulação do sulfidrilo dicroismo circular (D.C.) e filtração por gel. Também se estudaram os resíduos de cisteína na molécula através do mapa peptídico e da análise da sequência.

Métodos

Obteve-se ureia ultra-pura da Scharz/Mann (Cleveland, Ohio) e ácido 5,5*-ditiobis-(2-nitrobenzoico) (DTNB) da Sigma Chemical Company (St Louis, Missouri). Purificou-se o b-bFGF recombinante a partir de células E.Coli como se descreveu no Exemplo 4.

Em 12 ml de rb-bFGF a 0,626 mg/ml em citrato de sódio 20 mM, NaCl 0,1 M, a um pH 5 adicionou-se 1,5 ml de ácido iodoacetoacético 0,5 M em tris-HCl 1 M, a um pH 8,2 (55 mM final) e em seguida acertou-se para um pH 8,2 com tris-base saturado. Deixou-se a mistura em repouso durante 12 horas à temperatura ambiente e em seguida foi dialisada contra citrato de sódio 20 mM arrefecido e NaCl 0,1 M, a um pH 5,0. Após diálise exaustiva, concentrou-se a solução de proteína e centrifugou-se para eliminar vestígios de precipitado. Realizou-se a titulação dos grupos sulfidrilo utili- 41 zando DTNB essencialmente de acordo com Habeeb, A.F.S.A.;

Methods. Bnzymol. p. 457-465, 1972,

A filtração por gel foi realizada em uma coluna de -Sephade^ G-75 (2,5 cm x 10 cm, Pharmacia, Uppsala,

Suécia) e usou-se como eluente citrato de sódio 20 ml·, HaCl 0,1 M, a um pH 5,0 com um débito de 1 ml/minuto. Calibrou-se a coluna com mioglobina (17.000) e albumina de soro bo vino (63.000).

Determinou-se a concentração proteica por espectrofotomeiria.

espectro de absorção no U.V. foi determinado em um espectrofetómetro de díodo de Heulett-Packard modelo 8451A.

Determinaram-se os espectros dicroicos circulares à temperatura ambiente em um espectropolarímetro Jasco ambiente com modelo J.-500C, equipado com um computador OKi If 800 modelo 800. As medições realizaram-se à. temperatura pectivamente. Os dados foram expressos sob a forma da pticidade residual média calculada utilizando o elipeso residual médio de 112 para bFGF

Realizarara-se dissoluções com tripsina te 4 horas à temperatura de 37°C em carbonato de hidrogénio durane amónio 0,1 M, a um pH 8,0, utilizando tripsina tratada com tosilfenilalanil-clorometil-cetona (Cooper Biomedical, Líalvern, Pennsylvania). A concentração de rb-bFGF era de 0,5 mg/ml, com uma relação enzima substracto de 1:50.

Construiu-se o mapa peptídico por cromatografia liquida de fase inversa de alta resolução utilizando

Hesperia, Califórnia) com um débito de

0,8 ml/minuto de ácido trifluoroacético /27/7/água) gradiente variou de

0%	de t
a	50%
um	.-->_aísi. a·^

iente linear de minutos. Injectaram-se as amostras sob o controlo de um auto-analisador 7/is^ (7/aters Corporation, Milford, Massachu setts). Recolheram-se as fracções por detecção automática do máximo controlada a 220 nm.

Realizou-se a análise da sequência em instrumentos da Applied Biosystems (Foster City, CA) modelos 47OA e 477A. No instrumento 47OA utilizou-se um reagente modificado R2 (Lai; Anal. Chim. Acta'.’; 163; 1984; p. 243-248).

Resultados

As titulações do sulfidrilo realizaram-se utilizando uma preparação de rb-bFGF purificado. Quando se titulou com DTNB uma amostra obtida por diálise de rb-bFGF mistura exibiu uma dispersão de luz que tornou as medições de absorção impossíveis. Por isso dilúíu-se a amostra de rb-bFGF dialisada com quatro volumes de cloridrato de guan_i dínio 6M (GctnHCl) em tris-HCl 0,1 M, 3DTA 1,5 mM, a um pH

8,0, imediatamente seguido de titulação com DTNB. A titula ção desta amostra demonstrou a existência de aprozimadamenAs experiências de titulação com DTNB foram também realizadas com o rb-bFGF reduzido. Assim, realizou-se primeiro o rb-bFGF em tris-HCl 0,1 M, BDTA 1,5 mM, a um pH 8,0 com DTT 50 irJ,·. Apôs 2 horas de incubação, o rb-bFC-F

reduzido precipitou com ácido trifluoroacético a 5% (TCA) e lavou-se o grânulo resultante três vezes com TCA a 5%. Lavou

-se o grânulo final com uma pequena quantidade de água e so lubilizou-se a proteína com GdnHCl 6M em tris-HCl 0,1 M, EDTA 1,5 mil, a um pH 8,0, seguido imediatamente de titulação com DT?IB. Isto resultou na detecção de aproximadamente 4 moles de sulfidrilo livre por cada molécula de rb-bFGF reduzido. Este resultado associado com cerca de dois grupos de sul fidrilo livres detectaveis na amostra não reduzida sugeriu que a preparação de rb-bFGF tem dois grupos sulfidrilo livres e que as outras cisteínas formam uma ligação disulfureto que pode ser rapidamente clivada sem desnaturantes.

As titulações de sulfidrilo também se realizaram com rb-bFGF S-carboximetilado (S-CM). A amostra de rb-bFGF 3-CLÍ foi dialisada vs. tris-HCl 40 mTA, a um pH 7,5 e tratada com DTT 100 ml! durante a noite. 0 rb-bFGF S-CM dia lisado com TCA a 5% analisado para detecção dos grupos de sulfidrilo, livres como já foi descrito. Os resultados mostram 2 moléculas de sulfidrilo livres por cada molécula de rb-bFGF S-CM indicando que este tem dois grupos sulfidrilo livres após redução. Isto sugere que o rb-bFGF tem dois grupos sulfidrilo livres que tinham sido carboximetilados.

Utilizou-se o desenho do mapa peptídico para investigar se as duas cisteínas estavam envolvidas em uma ligação dissulfureto e se ambas estavam num estado reduzido livre. A dissolução com tripsina foi utilizada para isolar as cisteínas dos três péptidos: 24-27 que continham cis-26; 68-73 que continham cis-70; e 88-98 que continham cis-88 e

I cis-93.

A assimilação com tripsina foi realizada sobre rb-bFGF natural não reduzido e sobre S-CM rb-bFGF não reduzido. A seguir à digestão os péptidos produzidos foram separados por IIPLC de fase inversa e compararam-se cs mapas peptídicos (fig. 5). A introdução do grupo acetato num péptido que continha cisteína previu-se que tornaria o péptido mais hidrofílico e que eluíria mais rápidamente num gradien te de HPLC de fase inversa.

Na fig. 5 observa-se que os dois picos de pé2 tido estão alterados pura tempos de eluição menores no S-CM rb-bFGF relativo ao rb-bFGF natural. Um pico alterou-se de 25 minutos para 16 minuto e o outro 57 minutos para 53 minutos. Estes picos foram recolhidos e identificados por análise de sequência. A sequência do péptido eluíu aos 25 minutos, foi determinada e verificou-se que correspondia ao péptido tríptico 68 a 73. Este péptido continha cis-70. Uma vez que este péptido forneceu um único pico, presumiu-se ser uma das cisteínas que não estavam envolvidas na ligação de dissulfureto.

A sequência do péptido eluíu aos 53 minutos e forneceu duas sequências. Dado que um único pico nesta região alterada na carboximetilação e que o péptido contido nesta região originou duas sequências, considerou-se este como sendo o péptido que continha a ligação di-sulfureto. A comparação das duas sequências obtidas dó pico aos 53 minutos com a sequência de FGF completa indicou que estas duas sequências constituintes correspondiam aos péptidos de 24 a e de 88 a 98.

Existem três cisteínas nestes dois péptidos.

A identificação da carboximetilcisteína feniltiohidantoína no primeiro ciclo sequência indicou cis-88 como sendo a outra cisteína e sugeriu ..ue existia uma ligaçao di-sulfureto entre a cisteína 26 e a cisteína 93.

3-Cí;i rb-bFGF foi analisado em células 3'2 3 tal como se encontra descrito no Exemplo 8.

Os resultados mostraram que o S-CLi rb-bFGF exibe uma actividade comparável à da molécula natural demonstrando que os grupos sulfidrilo livres na molécula não são necessários à actividade mitogénica nas células 3T3Os espectros dicroicos circulares foram obtidos com rb-bFGF em citrato de sódio 20 mM, cloreto de sódio 0,1 M, a um pH 5,0.

Os resultados encontram-se representados na fig. 6. 0 DG no U.V. próximo mostra elipticidades negativas intensas com uma quantidade de máximos. Estes máximos a 262 e 269 nm são devidos a resíduos de fenilalanina e o máximo a 275 nm provém provavelmente da absorção da tirosina (Strickland, 2d CRC Crit. Rev. Biochem. p. 113-175, 1974). Uma elipticidade negativa larga pode ser observada de 306 nm até 290 nm a qual se sobrepõe então ao DC aromático. Esta banda de DC é provavelmente devida a um diasulfureto que o DC do U.V. próximo observado de rb-b?GF pode ser caracterizado como um largo

DC de diasulfureto negativo e diversos sinais de DC aromático.

Estes resultados síduos aromáticos estão nas proximidades das e que 0 rb-bFGF possui uma estrutura terciária. (Timasheff,

- 46 Vol. II In the Enzymes, Boyer (ed.) p. 371-443, 1970).

S-CL.Í rb-bFGF foi também observado por DC. Os resultados mostraram que os espectros de U.V. próximo e U.V. afastado são idênticos aos da proteína natural indican do que a S-carboximetilação dos dois grupos sulfidrilo livres não afecta, aparentemente. As estruturas secundária e terciária da proteína. Este facto é consistente com a observação de que a S-carboximetilação não afecta a actividade da proteína.

DC no U.V. distante, representado na fig.

6, exibe um espectro típico para a estrutura não ordenada (Greenfield and Fasman, Biochemistry 8, 1969; p. 4108-4116). 0 espectro exibe um pico negativo a 202 nm e um pico largo positivo a cerca de 225 nm. 0 pico a 202 nm e a maior parte das elipticidades não negativas entre 205 e 220 nm são características típicas de estruturas secindárias não ordenadas. O pico positivo a 225 nm é devido provavelmen te à contribuição das p -rotações (Chang et al, Anal. Biochem., 91; 1978, p. 13-31). Portanto o polipêptido de rb-bFGF parece desordenado mas dobrado em uma estrutura terciária distinta com β-rotações.

A filtração no gel de rb-bFGF em citrato de sódio 20 mLT, NaCl 0,LM, a um pH 5,0 mostrou que a proteína elui com o mesmo volume de eluição da mioglubina (17000).

Uma vez que o peso molecular de bFGF (16.000) é menor do que o da mioglubina o resultado da filtração no gel sugere uma conformação ligeiramente assimétrica da proteína.

brone et al; Human Vascular Endothelial Cells in Culture;

EXEMPLO 7

Bioensaio HUV-EC para rb-b?GF

J. Cell. Biol. 60, 1974,

p. 673-584, células endoteliais da veia umbilical humana (3VUH) , que foram utilizadas nesta experiência

Mantiveram-se as células por sub-caltura em frascos de cultura cobertos com de cloreto de sódio tamponado com fosfato e 10 pg/ml de fibronec tina (Boehringer Mannheim, Ingelheim, Alemanha Ocidental) em meio de soro bovino fetal minos, durante 30 minutos cada consecutivamente. As células

0,0125% passadas 1:2 ou 1:3 uma semana. 0 meio de manutenç o utilizado foi MCB105 (Irvine (10 unidades/ml) estreptomicina (1 jag/ml), soro bovino fetal (20% hyclone) L-glutamina (2 mf.I) , piruvato de sódio (1 mV), volvimento de célula endotelial (SDCE, 40 jig/ml Collabora tive Research). As células desenvolveram-se numa incubadora com 2% de COg .

A seguinte experiência foi realizada para comparar a manutenção do crescimento e actividades mitogénicas destas três diferentes formas de FGF em células endoteliais HUV i

1) Ξ. Coli proveniente de FGF básicos de bovino recombinante (rb-bFGF);

2) FGF ácido de bovino (b-aFGP, especialmente purificado proveniente de cérebro de bovino); e

3) FGF básico natural de bovino (b?G? purificado, proveniente dé glândulas pituitárias de bovino, Sigma Chemical Company, St Louis, Y.issouri)·

Colocou-se numa placa uma centena de células por cavidade em oito cavidades centrais em placa3 de 24 cavidades. Adicionou-se um destes três factores de desenvolvimento de fibroblastos anteriormente já identificado, a cada cavidade, excepto âs cavidades de controlo às quais não se adicionou qualquer factor de crescimento. As células foram alimentadas aos três e seis dias após o início da sementeira com o mesmo factor de crescimento. Dez dias após a sementeira analizaram-se as culturas por coloração com violeta de cristal.

Os resultados, representados no quadro VII, demonstraram que existiam 20% e 32% mais colónias nas oito cavidades que continham rb-bFGF do que nas cavidades que con tinham quer aFGF quer bFGF natural respectivamente. Também tem interesse o facto de que 75% do total das colónias que cresceram na cultura com rb-bFGF eram de 0,5 mm ou maiores, enquanto que apenas 55% e 51% das colónias desenvolvidas com aFGF e com η-bFGF respectivamente apresentavam aquele tamanho.

Quadro VII

Factor de	IT2 , de colónias/	N2	. de colónias >.0,5mm/
crescimento	/3 cavidades	/3	cavidades
rb-bFGF	351		2ó5
aFGF	293		160
bFGF natural	265		134
Controlo	8		0
EXEMPLO 8
Bio-ensaio de	rb-bFGF em células NIH	3T3
	As células utilizadas	para	este ensaio foram

as NIH 3T3 da ATCC. As células desenvolveram-se em um meio D';3 com penicilina G (10 pg/ml), estreptomicina (10 jig/ml) e com soro de vitela (10%).

As células foram passadas 1:40, duas vezes por semana. No 1- dia do ensaio juntou-se tripsina às culturas sub-confluentes dispersara.?.-se e colocou-se em placas

Λ de 24 cavidades com uma concentração de 2 x 10^ células por ml, 1 ml por cavidade no meio de crescimento referido antes.

No 5- dia substituiu-se o meio por DLTE conten do penicilina, estreptomicina e 5% de plasma humano pobre em plaquetas (soro heparinizado límpido),q ml por cavidade. No 62 dia adicionaram-se as amostras de experiência e de con trolo de FGF ao meio em volumes inferiores a 100 μΐ.

Dezoito horas depois, passaram-se as células durante 1 hora com 1 ml de DME contendo 5% de soro de vitelo e 2 pCi de ^H-Me-timidina à temperatura de 37°C. Lavaram50

-se em seguida as células uma vez com 1 ml de tampão de cloreto de sódio tamponado com fosfato (PBS) e ácido tricloroacético a 5% ambos a temperatura de 4°C. Deixaram-se as placas a secar ao ar durante 30 minutos, após o que se adicionou a cada cavidade 1 ml de hidróxido de sódio 0,25 Após uma hora à temperatura ambiente, transferiu-se o conteúdo de cada cavidade para uma ampola de contagem separada ccnten do 10 ml de AquasoP* 11 (Ne-.v England Nuclear, Boston, Massachusetts). As amostras foram contadas durante 1 minuto através de u: a janela 0-397 de um contador de cintilação Beckman LS 7,500 (Beckman Instruments, Inc. Fullerton, Califórnia).

Os padrões de b-bFGF recombinante foram preparados a partir de um stock com uma concentração de 600 pg/ /ml em um tampão de citrato de sódio de pH 5.

A escala de padrões utilizada foi desde 5 pg até 1.000 pg por ml. 0 padrão de menor concentração que apresentou a absorção de ^H-timidina máxima era de 500 pg. Uma média entre 140 e 200 pg exibiu a incorporação semi-máxima de timidina marcada.

EXEMPLO 9

Contruçao do gene de rh~b?GF

A conversão do gene de bovino bFGF preparada de acordo com o 'Exemplo 1, para um gene que codifica para h-bFGF foi realizada por oligo-mutagénese de sítio dirigido.

segmento a ser modificado foi primeiramente clonado no vector fágico M13mpl8 e transformado na Ξ. Coli JmlOl para desenvolvimento e preparação de ADN fágico de ca- 51 deia simples (messing; J. Vol. 9, Kucl. Acid. Res.; 1981,

p. 309-321).

Misturou-se aproximadamente 0,5pg da matriz de ADN com 5 pmoles de sequenciador de iniciação de L'13 universal e 5 pmoles de cada iniciador mutagénico e aqueceu-se até á temperatura de 65°C durante 3 minutos e deixou-se arrefecer lentamente. Misturou-se depois a matriz-iniciadora circulerizada com ATP, uma mistura de desoxinucleotido-trifosfato (dLTP), ADN polimeráse I (ADN Poli) em fragmentos gran des (fragmento de Klenov) e ligase, seguido de incubação a 15°C durante 4 horas.

As aliquotas desta mistura reaccional foram transformadas nas células de 3. Coli JM101 competentes e colocadas em placas de agar Lúria a 0,7%.

As placas ,ue continham o fage mutante foram seleccionadas por hibridização de filtros de nitrocelulose com iniciador mutagénico marcado com p^>_. Preparou-se o ADN de cadeia simples a partir de placas de sondagem positiva e verificou-se a sua sequência utilizando o método de terminação de cadeia didesoxi. As alterações de aminoácido feitas e os iniciadores mutagénicos correspondentes utilizados foram:

pro-129 a ser-129) 5’ GACCAGTCTTCGAACCCAGTTTGTA 3’ ser-113 a thr-113) 5’ CATACCAGGAAGTGTATTTACGAGA 3’

Os iniciadores correspondiam à cadeia de sentido contrário á do gene de bFGP.

EXEMPLO 10

Purificação de rh-bFGF

Desenvolveram-se células de Ξ. Coli que continham os genes de h-bFGP sintéticos em pCFM1156, como se descreveu anteriormente no Exemplo 4. Após fragmentação das células e centrifugação a baixa velocidade, encontrou-se nas fracções de sobrenadante e de centrifugado o rh-bFGF resultante (Quadro VI). A purificação do centrifugado requeria a solúbilização por agentes desnaturantes seguida de reconverção para se obter o material activo. Estas fases podem ser evitadas através da purificação da fracção sobrenadante como se descreve a seguir. Aplicou-se esta fracção a uma coluna de CM-sefarose em tris-HCl 40 mH, pH 7,4 e eluíu-se com gradiente de cloreto de sódio linear. As fracções que continham rh-bFGF foram em seguida ligadas à mesma resina, mas em tris-HC1 40 mM, pH 8,2 e outra vez eluídas com gradiente de NaCl linear. Nestas duas cromatografias incluiu-se DTT 1 mM para impedir a oxidação que de outra forma resultaria na formação de pontes dissulfureto intermoléculares. Λ proteína foi ainda purificada por filtração em gel utilizando uma coluna de Sephade^ G-75 (Pharmacia, Uppsala, Suécia) em citrato de sódio, 20mM, NaCl 0,1 M, pH 5,0. As tentativas iniciais para purificar rb-bFGF a partir de células de Ξ. Coli mostraram que o dímero se formaria fácilmente quando não se incluía DTT 1 mM durante o processo de purificação. A purificação de bFGF humano realizou-se essencialmente do mesmo modo, como se realizou para o material bovino, tal como foi indicado no Exemplo 4. Não se notou diferença alguma entre rh-bFGF em qualquer das fases de purificação. Quando examinado em

SD3-PAG3, ea condições redutoras o rb-bFGF forneceu uma banda principal de 16.500 daltons que correspondia ao peso molecular monoraérico e bandas correspondentes a pesos m.olécu-

lares mais elevados, os quais provavelmente representavam formas diméricas e tetramêricas (ver fig· 4)· Quando se ensaiou em condições não redutoras, apresentou-se uma maior con taminação por bandas de peso molecular mais elevado. A análise de sequência de aminoácidos do rli-bFGP purificado, re velou que a metionina tinha sido separada da maior parte do material fornecendo 70% de prolina, 13% de alanina e apenas 17% de metionina no N-terminal.

Tal como o bFGF natural, o rh-bFGF exibe uma acentuada afinidade para a heparina 'que eluía das colunas de sepharose com heparina no NaCl aproximadamente de 1,5 a 2,0 molar (dados não representados).

EXEMPLO 11

Caracterização do rh-bFGF

Examinou-se a actividade do rh-bFGF pela incorporação de H-timidina em células 3T3, como se encontra descrito no Exemplo 8. Tal como se representa na fig. 3, o rh-bFGF mostrou uma potência essêncialmente idêntica, neste ensaio, ã do rb-bFGF, produzindo uma semi-estimulação máxima da síntese de ADN a uma dose de cerca de 150-200 pg/ml.

EXEMPLO 12

Bio-ensaio de HUV-EC para rh-bFGF ensaio de células EVUH está descrito no

Exemplo 7, com alterações menores no que respeita à colocação em placas e ao tempo de ensaio. A adição de rh-b?GP resultou em uma extensa proliferação celular em comparação com os controlos que não continham o factor de crescimento. Não se observaram quaisquer diferenças significativas entre o bFGF bovino recoir.binante e o bFGF humano.

Quadro VIII

Factor de crescimento	Total de colónias	Colónias grandes
rh-bFGF	76	22
rb-bFGF	68	19
controlo	23	0

Todos os factores do crescimento de fibroblas^ tos foram adicionados com uma concentração de 10 ng/ml no momento em que se colocaram em placas e nos dias 3 e 6 após essa colocação. Coraram-se as células e contaram-se no 9²dia. Registaram-se as clónias maiores do que 0,5 mm de diâmetro como colónias grandes.

EXEMPLO 13

Preparação de análogos de rh-bFG?

A fim de melhorar a estabilidade e facilitar a purificação de rh-bFG?, utilizou-se a mutagénese de sitio-dirigido oligonucleótidica para modificar o gene de bFGF humano de forma a que as sequências que.codificam para alguns ou todos os resíduos de cisteína codificassem em subs tituição para a serina. Reconheceu-se que o genedébFGF de bo55 vino pode ser modificado de modo idêntico e cue as sequênci-

as que codificam para um ou para todos os resíduos de cis como ala teína podem codificar para outros aminoácidos tais

oligonucleótidos sendo cada um deles designado como se mostra no quadro a seguir;

Quadro IX

Oligonucleótido	Sequênc ia
102-21	5’ ACCGTTTTTGGAGTACAGACG 3’
102-22	5’ CCGGTTAGCAGATACACCTTT 3’
102-23	5’ GTCAGTAACAGACTTAGAAGC 3’
102-24	5’ GAAAAAGAAAGATTCGTCAGT 3’

/.Iteração do código

de	CIS	para	SER	na	posição	26
de	CIS	para	SER	na	posição	70
de	CIS	para	SER	na	posição	83
de	CIS	para	SER	na	posição	93

A primeira mutagénese utilizou os oligonucleótidos 102-22 e 102-23 para converter as cisteinas das posições 70 e 80 em serina. Subsequentemente construíram-se os genes em que todos os seis pares possíveis de cisteinas foram substituídos por serinas e uma em cada quatro cisteinas foi substituída por serinas. Os oligonucleotidos utilizados na construção deste genes mutantes estão indicados a seguir.

Quadro X

Análogo oligonucleotidos utilizados para mutagénese

Serina	70,83	102-22,	102-23
Serina	26,93	102-21,	102-24
Serina	26,70	102-21,	102-22
Serina	26,88	102-21,	102-23
Serina	70,93	102-22,	102-24
Serina	88,93	102-23,	102-24
Serina	26,70,88,93	102-21,	102-22, 102-23, 102-24

As reacções de mutagénese foram todas realizadas de um modo essencialmente idêntico, diferindo apenas nos oligonucleotidos utilizados para a reacção e para a sôndagem das placas resultantes por hibridização. Dez pmoles de cada iniciador universal M13 e dos iniciadores já referidos antes, foram fosforiladas por incubação com ATP 1 mM e 10 unidades de polinucleótido-quinase em 10 μΐ de tris 70 mM,MgClg 10 mM, DTT 5 mM, durante 30 minutos à temperatura de 37°C. Misturou-se cinco pmoles de cada oligonucleótido fosforilado com cerca de 0,5 pg de M13mpl3 de cadeia simples/ /rb-bPGP, aqueceu-se à temperatura de 60°C e deixou-se retomar a sua forma natural através de arrefecimento até à temperatura ambiente. A esta mistura de matriz/iniciador adicio. nou-se em seguida 1 μΐ de uma solução com 25 mM de cada: cLATP, dCTP e TTP, 1 pl de ATP 100 mM, 2 unidades de T4 ligase e 8 unidades de fragmento grande de ADN Poli . Incubou-se esta mistura à temperatura de 14°C durante 4 horas trans (

formaram-se as	alíquotas da mistura de	ligação em	E. Coli
Ji.1101 tornadas	competentes por meio de	tratamento	co.m CaClp
50 mM e colocar	am-se as placas em agar	de Lúria a	0,7% em
placas em que p	reviamente se verteu ag.	ar de Lúria	a 1,5%.

Retiraram-se por via de filtros de nitrocelulose das placas resultantes e os filtros foram sondados por hibridização com oligonucleótidos rádio marcados apropriados.

Em cada sonda utilizada obtiveram-se diversos positivos. Retomaram-se placas positivas e preparou-se um ADN de cadeia simples para utilizar como matriz na segunda parte da mutagênese. Quando se obteve a construção desejada, purificou-se o ADN de forma replicativa por lise celular e obtenção de banda em gradiente de densidade de cloreto de césio. Transferiram-se em seguida os genes modificados para o vector plasmídico pCF?,11156 para expressão em E. Coli. 0 gene modificado foi excisado do vector L113 por clivagem com Xbal/Hind III e purificado por electroforese em gel de agarose. Este fragmento purificado foi em seguida ligado em Xbal/Hind III e cortado com pCFI.11156.

Transformaram-se as novas construções na estirpe de Ξ. Coli FT.T5 para expressão.

Transferiram-se os análogos de serina 70,88 e de serina 26,93 para o vector de expressão.

crescimento da estirpe de produção e purificação subsequente do análogo de serina 70,38 realizou-se tal como para o rb-bFGF e para rh-bFGF, tal como se encontra descrito no Exemplo 4» com a única excepção de ter sido omitido o DTT em todas as fases de purificação. Esta omissão de DTT foi possível porque os resíduos de cistelna responsá veis pela dimerização de bFGF durante a purificação tinham sido eliminados. Assim, o análogo de serina 70,88 representa um significativo melhoramento do r-bFGF com a sequência natural uma vez que este não contém impureza dimérica detectável e não tende, com o tempo, a formar dímeros porque é isento de grupos sulfidrilo livres. Além disso, uma vez oue a necessidade de adicionar um agente de redução é eliminada, os problemas de formulação possíveis podem ser evitados.

análogo de serina 26,93 não se comporta de forma idêntica à do bFGF recombinante de bovino ou humano e à das moléculas de serina 70,80; provavelmente porque não possui a estrutura da dissulfureto de bFGF natural. Durante a purificação uma fracção significativa do análogo de serina 26,93 degrada-se. Tal degradação também acorreu quando se fizeram tentativas para purificar o rb-bFGF na presença de ureia 7M a qual desnatura a estrutura terceária das moléculas. Ainda que o análogo de serina 26,93 não pareça possuir a mesma actividade biológica dos análogos de serina 70,88 quando purificados do sobre-nadante, como se encontra especificado nos Exemplos 4 e 11, os análogos inativos podem encon trar aplicação como antagonistas ou como moléculas bloqueadoras.

EXEMPLO 14

Purificação de um análo ;o de serina-26,70,88,93 a partir de corpos de inclusão

Descubriu-se de modo surpreendente que quando os análogos de serinu 26,70,88,93 eram purificados a par tir de corpos de inclusão, preferentenente do -.ue a oartir de sobrenadantes, obtinha-se um análogo activo, apesar da alteração de sulfidrilos aparentemente não livres.

Utilizando uma oligo-mutagenese de sítio-di-

cado, C0...0 se descreve no Exemplo 9, para substituir os quatro codões de cisteína com nucleôtidos que codificam para resíduos de serina.

As proteínas correspondentes foram expressas em E. Coli e purificadas a partir de corpos de inclusão por solubilização em ureia seguidas de uma série de cromatografias em coluna e de uma fase de dobragem.

A proteína resultante, isenta de resíduos de cisteína, era incapaz de formar ligações dissulfureto intra moleculares ou intermoleculares. No entanto, verificou-se que esta proteína análoga exibia actividade mitogénica sobre células NIH 3'13 não distinguíveis da exibida pela sequên cia natural.

Cli.go mutagénese de sítio-dirigido

Construíu-se préviamente um gene do análogo do bFGF em que os codões para as cisteínas 70 e 33 tinham sido convertidos em codões de serina, o qual se utilizou como matriz inicial para a mutagénese. ?.íisturou-se aproximadamente 0,5 p<g de ADN matriz com 5 pmoles de iniciador de se^uênciação :.:13 universal e 5 pmoles de cada iniciador mutagénico, aqueceu-se â temperatura de 65°C durante 3 minutos e deixou-se arrefecer lentamente.

Sm seguida misturou-se o iniciador-matriz circularizado com ATP, uma mistura de dNTP, fragmento grande de ADN Poli e ligase, seguido de incubação a 15°C durante toda a noite. As aliquotas desta mistura reaccional foram transformadas em células JM101 e postas em placas de agar de Lúria a 0,7%. As placas que continham o fage mutante foram seleccionadas por hibridização em filtros de nitrocelulose de replicação contendo cada um um iniciador mutagénicô marcado com p . Preparou-se ADN de cadeia simples a partir das placas que foram positivas em ambas as sondagens de hibridização. A selecção da sequência desejada foi verificada utilizando-se o método de sequênciação de ADN de terminação de cadeia didesoxi.

As alterações de aminoácidos feitas e os iniciadores mutagénicos correspondentes utilizados foram:

de cis-26 a ser-26 5’ ACCGTTTTTGGAGTACAGACG 3* de cis-93 a ser-95 5’ GAAAAAGAAAGATTCGTCAGT 3*

Ambos os iniciadores correspondiam à cadeia anti-sentido do gene de bFGF.

Expressão e Purificação

Desenvolveram-se células de E. Coli transportando o plasmídio que continha o gene de bFGF mutante em 2 caldos de Lúria ã temperatura de 30°C para aproximadamente 0,5 a 600; que depois se alterou para a temperatura de 42°C para induzir a expressão de bFGF.

Apôs o desenvolvimento durante a noite, recolheram-se as células por centrifugação e lisaram-se mediante três passagens através de uma French Press a 10.000 psi.

material insolúvel que continha o bFGF capturado nos corpos de inclusão foi recolhido por centrifugação a baixa velocidade. Os corpos de inclusão foram solubilizados em ureia, submetidos a cromatografia de permuta catiónica e de coluna de sílica. 0 análogo parcialmente purificado foi recuperado por diluição e em seguida purificado até quase á homogeneidade por cromatografia em coluna de per muta catiónica.

Purificou-se o bFGF humano de sequência natural recombinante a partir da fracção solúvel de células de E, Coli lisadas por uma série de fases cromatográficas.

Ensaio de mitogénese em células NIH 3^3

A actividade biológica do bFGF análogo foi testada de acordo com a sua capacidade para estimular a re~ 3 absorçao de H-timidina em culturas confluentes de células NIH 3T3, tal como se encontra descrito no Exemplo 7. A fig.

mostra a dependência da actividade mitogénica da concentra ção para o análogo de, serina 26,70,88,93 e para h-bFGF de sequência natural. Dentro do erro experimental, os dois perfis são indistintos com o efeito mitogénico semi-máximo observado a uma dose de cerca de 150 pg/ml. Estes resultados indicam que a conformação necessária para a actividade mitogénica mediada pelos receptores não é alterada pela substituição dos quatro resíduos de cisteína, pelo menos quando o análogo é purificado a partir de corpos de inclusão de preferência em vez do sobrenadahte.

EXEMPLO 15

Bio-actividade de análogos de rh-bFGF

Caracterizou-se a actividade biológica de análogos de rh-bFGF como foi já descrito para a forma bovina nos Exemplos 7 e 8. A actividade semi-máxima dos análogos de rh-bFGF serina 70,88 no ensaio mitogênico sobre células NIH 3T3 (Exemplo 8) é idêntica à de rb-bFGF e de rh-bFGF, como se representa na fig. 3.

análogo de serina 26,93 não mostrou actividade neste ensaio como se admitira já.

análogo de serina 70,88 também foi testado sobre a sua capacidade como suporte de desenvolvimento de células EVUH, como se encontra descrito no Exemplo 7. 0 análogo rh-bFGF serina 70,88 foi tão eficaz quanto o rb-bFGF e o rh-bFGF na promoção do desenvolvimento de células EVUH em cultura

Quadro XI

Factor do crescimento Total de colónias Colónias grandes

Ser-70,88 rh-bFGF	84	24
rh-bFGF	76	22
rb-bFGF	68	19
controlo	23	0

- 63 EXEMPLO 16

Estudo in vivo cia eficácia do análogo de serina 70,88

Preparação pré-operatória

Anestesiou-se coelhos brancos da Nova Zelândia, pesando aproximadamente 3Kg cada um, utilizando 5 mg/kg de Rompurr^ (Farbenfabriken, Bayer, Alemanha Ocidental) como sedativo, seguido de aproximadamente 50-60 mg/kg de cetamina, aplicado cerca de 10 minutos depois, ambos por via intramuscular mediu-se e registou-se o peso de cada um dos coelhos. Introduziu-se uma pequena porção de algodão ou de gase em ambas as orelhas de cada um dos coelhos após o que se raspou as superfícies interiores e as superfícies externas de ambas as orelhas, utilizando um tosquiador de animais com lâmina N5 40. Em seguida aplicou-se um creme depilatório comercializado sob a marca Nee nas superfícies interiores de cada orelha durante 10 minutos após o que se removeu o creme com uma gase seca. Limparam-se então as superfícies interiores das orelhas com gase embebida em solução de cloreto de sódio e em seguida com uma solução alcoólica a 70%. Branqueou-se a derme da superfície interior de uma das orelhas de cada coelho mediante infiltração de uma solução de xilocaína a 2% contendo 1:1000 de epinefrina, o que requer de 1,5 a 3 cm de volume total, utilizando uma agulha de calibre 30. Em seguida aplicou-se sobre a área infiltrada 3 ciclos de Betadine seguido de solução alcoólica a 70%.

Quando necessário, substituí-se nesta altura os tampões das orelhas por tampões secos.

Os coelhos foram então transferidos para uma

área cirúrgica estéril. Imobilizou-se a orelha branqueada em uma prancha de plexiglass (ear board-Washington University Medicai Center, Division of Technical Services) que utiliza duas barras fixadoras, uma no topo e outra na base da orelha do animal, para se conseguir estabilizar a orelha do coelho sem comprometer o fluxo sanguíneo. Tapou-se o animal e pulverizou-se o campo cirúrgico, isto é, a superfície interior da orelha, com Betadine e deixou-se secar durante cerca de 3 a 5 minutos.

Ferimento

Utilizou-se uma técnica estéril para se proceder aos ferimentos. A superfície interior da orelha foi sulcada cuidadosamente com uma agulha de biópsia por punção de 6 mm e limpou-se o local da biópsia de todos os tecidos e fibras, incluindo a membrana periosteal, até ao nível da cartilagem, utilizando um fórceps de micro-cirurgia, tesouras para tenotómia, um elevadorperiosteal de Lempert com 2 mm de lâmina e aplicadores de algodão estéril.

As biopsias em que a cartilagem completamente cortada através do punção não foram utilizadas nas experiências. Contudo, os cortes parciais da espessura da cartilagem foram considerádos aceitáveis. A localização de cortes ou buracos naturais na cartilagem foi cuidadosamente anotada com referência de registo ao dia da colheita. 0 sangue foi retirado do local da biópsia com aplicadores de algodão estéril para evitar um excesso de sangue na ferida. Tendo a biópsia sido terminada, cobriu-se com uma pequena peça de gase embebida em solução de cloreto de sódio.

- 65 -/

Quatro biópsias viáveis foram colocadas em cada uma das orelhas feridas, duas de cada lado da linha mé dia definida pela dobra da orelha quando se estabilizara na prancha. Em qualquer dos casos não se fizeram mais de cinco biósias em cada orelha. As biópsias foram colocadas a um mínimo de 1 cm de distância.

Após se completar o processo para uma orelha, cobriu-se esta com uma gase embebida em uma solução de cloreto de sódio e em seguida cobriu-se em volta da gase para se reter a humidade até à aplicação de FGF. Em seguida branqueou-se a segunda orelha escarificou-se, imobilizou-se e fez-se a ferida de forma idêntica à utilizada para a primeira orelha. Retirou-se o sangue do local da biópsia de cada uma das segundas orelhas e quando se terminou cada uma das biópsia colocou-se a peça com uma pequena peça de gase embebida em solução de cloreto de sódio. Após terminar o processo para a segunda orelha, esta foi também coberta com uma gase humedecida em solução de cloreto de sódio até à aplicação de FGF.

Quando algum dos coelhos mostrou sinais de estar recuperando da anestesia antes de se atingir este ponto do processo, foi reanestesíado com 25 mg/kg de cetamina, administrada por via intramuscular.

Aplicação das preparações de FGF

FGF foi primeiramente aplicado na primeira orelha ferida, com a gase húmida da primeira orelha e as superfícies não feridas da orelha foram cuidadosamente limpas com gase. Todas as biópsias foram cuidadosamente limpas de sangue e/ou de excesso de fluído com tamponetes de algodão esterilizado. As superfícies não feridas da . orelha foram pintadas com um composto de tintura de benzoim, evitando cuidadosamente atingir as biópsias, e deixando-as secar ao ar durante 3 a 5 minutos.

Aplicaram-se 5 pg de rb-bFGF ou de ser-70,88 rh-bFGF em Zydern^ (Collagen Corporation) a cada uma das biópsias utilizando uma agulha nentemente numa seringa de 0,5 kinson) ou numa micropipeta. A de calibre 26 montada perma3 3 cm ou de 1 cnr (Becton-Dicde acomodar um máximo de 0,025 bFGF-Zyderr^. Após a aplicação biópsia estava em condições cm^ da preparação viscosa de de FGF a uma biópsia, esta foi imediatamente coberta por uma gase oclusiva Tegaderr^ (3M Corporation, Minneapolis, Minnesota), tendo o cuidado de não se deixar formar bolhas de ar ou rugas em torno local da biópsia. A Tegaderr^ fora préviamente cortada do com um tamanho aproximado de 2 cm . Repetiu-se este do f ican processo para cada uma das biópsias na orelha. Qualquer biópsia

a fim de minimizar falhada foi também coberta com Te os riscos de infecção. Após se terminar o processo com a primeira orelha, foi retirada a gase húmida da outra orelha e o processo foi repetido tendo o cuidado de assegurar uma limpeza completa de todas as biópsias, de qualquer sangue ou/e excesso de liquido com tamponetes de algodão estéril.

Deixou-se os coelhos recuperarem da anestesia sob observação dos investigadores que realizaram a intervenção cirúrgica. Após a recuperação, colocou-se em volta do pescoço de cada um dos coelhos um colar de plástico com cerca de 15 a 25 cm de largura para impedir que o coelho

provocasse qualquer ruptura nas feridas ou nas compressas.

Os coelhos foram reconduzidos às gaiolas de isolamento onde se mantiveram até à recolha.

As feridas dos coelhos que conseguiram remo

ver os seus colares e qualquer ferida da qual o Te tenha sido alvo de ruptura de qualquer modo antes da data da colheita, foram re-examinados logo que foi detectado o problema e inutilizado para análise se as feridas se apresentavam danificadas.

Colheita

No sétimo dia depois da intervenção cirúrgica, anestesiaram-se os coelhos da mesma forma que se descreveu para a preparação da operação.

Cada coelho foi pesado e registado o respectivo peso e a descrição qialitativa da condição das feridas, notando-se especialmente a presença ou ausência da TegaderJf^ e de qualquer excesso de fluido sob a compressa. Os coelhos foram sacrificados por meio de uma embolia provocada com 50 cc/kg de ar administrada por injecção intra-cardiaca; foram amputadas ambas as orelhas utilizando-se um bisturi cirúrgico N5 15.

Cada biópsia com aproximadamente 5 mm de tecido circundante em qualquer dos lados e o Tegaden^ ainda intacto foi retirada da orelha e 0 local da biópsia foi medido afim de se cortar exactamente na linha média tomando como referência as notas registadas no dia da intervenção cirúrgica para impedir a bissecção através de buracos ou cortes naturais da cartilagem.

A biópsia foi cuidadosamente bissectada com uma lâmina de fio simples aplicando-se um único movimento descendente para evitar a ruptura da orientação da ferida. As biópsias bissectadas foram imediatamente colocadas em cassetes rotuladas com o número de identificação do coelho e colocadas em um fixador adequado para processamento histológico e análise quantitativa subsequente.

Análise histológica quantitativa

As secções cortadas, orientadas cuidadosamen te através das feridas bissectadas foram, embebidas, 'seccionadas e coradas utilizando-se uma mistura de Hematoxilina e Eosina ou Trichomo. Evitou-se ao mínimo o corte grossei_ ro da secção afim de se obter uma secção através do verdadei ro centro da ferida. As medições feitas incluíam o espaço de re-epitelialização (EG) através da ferida, a altura máxima (MH) do tecido de granulação da ferida nas extremidades (a média de ambos os lados) e o espaço de tecido de gra nulação (GTG) através da ferida, como está representado na fig. 8. As medidas foram realizadas às cegas em lâminas pré-codificados por dois observadores independentes utilizando-se um micrómetro de lentes calibradas e convertendo para milímetros (mm).

Calculou-se a média das determinções de ambos os observadores após o que o código foi aberto e os dados analisados estatisticamente. Se a diferença entre as medições dos dois observadores era superior a 10%, re-examinava-se a lâmina.

Os dados resultantes estão representados ·

- 69 no Quadro XII.

Quadro XII rb-bFGF

Controlo rb-bFGF

N5. de feridas

Frequência de re-epitelialização total

24%

50%

GTG

4,68+0,12

4,66+0,13

MH do tecido de granulação novo (mm)

0,76+0,03

0,79+0,02

Análogo de SER-70, 88 rh-bFGF

N2 de feridas

Frequência de re-epitelialização total

SER(70,88)

Controlo	rh-bFGF
126	13
22%	69%

4,41+0,09

3,85+0,14

GTG

MH do tecido de granulação novo (mm)

0,60+0,01

0,74+0,04

Os dados apresentados constituem a média + o erro padrão.

Ambas as preparações de rb-bFGF e de SER-70,88 rh-bFGF em

exibiram um significativo efeito positivo na re-epitelialização ainda que o efeito com SER

-70,88 rh-bFGF fosse ligeiramente superior. Contudo, a formulação de tecido de granulação novo foi significativamente afectada por SER-70,88 rh-bFGF, enquanto que o rb-bFGF se apresentou como não produzindo qualquer efeito.

Uma explicação possível para esta diferença reside na estabilidade reforçada do análogo SER-70,88 rh-bFGF com o material de sequência natural. Uma vez que o FGF é sómente aplicado uma vez neste estudo, isto é, no momento d.0 ferimento, a estabilidade em colagene Zyderi^ pode ser crítica para a produção de um efeito positivo na formação de tecido de granulação.

Outras aplicações para cicatrização de feridas e para cirúrgia utilizando análogos de bFGF da presente invenção serão evidentes para os técnicos nesta matéria.

Numerosas modificações e variações na prática da invenção também se tornarão evidentes para os técnicos, após a consideração dos Exemplos elucidativos anteriores. Consequentemente, a presente invenção deve ser considerada como limitada apenas pela extenção reflectida pelas reivindicações anexas.

r71-

Claims

1. - Processo para a produção de um análogo do factor de crescimento de fibroblastos básico, o qual difere do factor de crescimento de fibroblastos básico de ocorrência natural em termos da identidade e/ou localização, por um ou mais restos de aminoácidos e em que um pelo menos dos restos de cisteína do referido factor de crescimento de fibroblastos básico de ocorrência natural 'está substituido por um resto de um aminoácido diferente, caracterizado pelo facto de se transformar ou transfectar uma célula hospedeira por meio de uma sequência de DNA exógeno que codifica para os análogos do factor de crescimento de fibroblastos básico.

2. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o referido aminoácido diferente ser escolhido no grupo constituído por serina, alanina, ácido aspártico e asparagina.

3. - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de o referido aminoácido diferente ser serina.

4. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de pelo menos um dos referidos restos de cisteína substituídos ser um resto de cisteína que existe sob a forma de sulfidrilo livre.

5. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de dois dos restos de cisteína referidos serem substituídos por um resto de um aminoácido diferente.

6. - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo facto de dois dos referidos restos de cisteína substituídos serem resíduos de cisteína que existem sob a forma de sulfidrilo livre.

7. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado' pelo facto de o análogo do factor de crescimento de fibroblastos básico possuir a sequência de aminoãcidos indicada a seguir:

1 . 10 20 vezPTcAliLeu?raGi-^AspG17G:ySerGlyAlaPí-.ePro?roGlyHisPheI.ysAsp

30<0

ProLy3ArgLeuTyrCysLysAsnGlyGlyPhePheI.euArgIleHi3ProAspGlyArg

5050

Vai AspGlyValArgGluLysSerAspProHisIleLysLeuGlnLeuGlnAlíGluGlu

7080

ArgGlyValValSerlleLysGlyValCysAlaAarArgTyrLeuAla.MetLysGluAsp

90100

GlyArgLeuLeuAlaS«rLysCysValThrAspGluCysPhe?h«?heGluArgl.euGlu

110120

SerAsr-AsnTyrAsnThrTyrArgSerArgLysTyrThrSerTrpTyrValAlaleuLys

130140

ArgThrGlyGlnTyrLysI.«uGlyS«rI.y3ThrGlyPr: GlyGlnLysAlalleLeuPhe

146

LauProMetSerAlaLysSer ou as suas variantes alélicas e de pelo menos um dos restos de cisteína nas posições 26, 70, 88 e 93 ser substituído por um resto de um aminoácido diferente.

8. - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo facto de pelo menos um dos restos de aminoácido terminal ser eliminado enquanto o analogo referido reter de um modo substancial a actividade biológica do factor de crescimento de fibroblastos básico de ocorrência natural.

9. - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo facto de se escolher o referido aminoácido diferente no grupo constituído por serina, alanina, ácido aspártico e asparagina.

10.- Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo facto de o referido aminoácido diferente ser a serina.

-1F zado pelo facto de o referido aminoácido diferente ser a serina.

11. - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterí. zado pelo facto de se escolher pelo menos um dos referidos restos de cisterna substituídos no grupo constituído por cisteínas nas posições 70 e 88 dos aminoácidos.

12, - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterí. zado pelo facto de se substituírem dois dos referidos restos de cisteína por um resíduo de aminoácido diferente.

13. - Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterí. zado pelo facto de os referidos aminoácidos substituídos serem cisteínas nas posições 70 e 88 dos aminoácidos.

14. - Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterí^ zado pelo facto de os referidos restos de cisteína substituídos serem cisteínas nas posições 26 e 93 dos aminoácidos.

15.Processo de acordo com a reivindicação 12 caracterí zado pelo facto de os referidos resíduos de cisteína substituídos consistirem em cisteínas nas posições 26, 70, 88 e 93 dos aminoácidos .

16.- Método para a produção de um análogo do factor de crescimento de fibroblastos básico purificado e isolado, caracte rizado pelo facto:

de se transfectar ou transformar células hospedeiras com uma sequência de DNA que codifica a expressão procariótica ou eu cariótica de um análogo de um factor de crescimento de fibroblas

-75/