JPH02504468A - 繊維芽細胞成長因子のアナログ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 繊維芽細胞成長因子のアナログ 本発明は塩基性繊維芽細胞成長因子のアナログに関する。特に、本発明はＥ、ｃ ｏｌｉ（大腸菌）宿主菌株で組換えた塩基性繊維芽細胞成長因子（“ｒ−ｂＦＧ Ｆ”　）のアナログ及び前記因子をコードするポリヌクレオチドに関する。下記 の略語を使用する二繊維芽細胞成長因子＝ＦＧＦ　、酸性ＦＧＦ＝ａＦＧＦ　； 天然に存在する又は天然のＦＧＦ＝ｎ−ＦＧＦ；ヒトＦＧＦ＝ｈ−ＦＧＦ。

ウシＦＧＦ＝ｂ−ＦＧＦ、ヒト塩基性ＦＧＦ＝ｈ−ｂＦＧＦ、ウシ塩基性ＦＧＦ −ｂ−ｂＦＧＦ、組換え塩基性ＦＧＦ＝ｒ−ｂＦＧＦ；組換えヒト塩基性ＦＧＦ ＝＋ｈ−ｂＦＧＦ　Ｈ組換えウシ塩基性ＦＧＦ＝＋ｂ−ｂＦＧＦ。

従来の技術 繊維芽細胞成長因子（Ｆ　Ｇ　Ｆ）については、Ｇｏｓｐｏｄ＊ｒｏｖｉｃｘが Ｎ１ｊａ＋ｅ、　　２４９．１２３（１９７４）にウシの脳または下垂体組織に 由来する繊維芽細胞及び内皮細胞の分裂促進作用を有する物質として記載したの が最初である。後になって、脳から単離した主要なマイトジェンは下垂体から単 離したものと異なることが知見された。これら２つの因子は、同一ではないにせ よ類似した生物学的活性を有しているが異なる等電点を有しているため、夫々酸 性ＦＧＦ及び塩基性ＦＧＦと呼称された。その後、他の幾つかの内皮細胞マイト ジェンが塩基性ＦＧＦと非常に類似しているか同一の多数の細胞及び腫瘍から単 離された。前記因子ニハ、例エバ、ヘパドーム由来成長因子［ＫＩｓｇｓｂｒ＋ ｕら、ＰＮＡＳ。

８３、２４４８−２４５２（１９８６）及びＬｏｂｂら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃ ｈｅｗ、、　２３．６２９５−６２９９　（１０４）］　、軟骨肉腫由来成長因 子［Ｓｂ１ｍｇら、５ｃｉｒａｃｔ　。

２２３、１２９６−１２９９＋１９８４）　］　、β網膜由来成長因子［Ｂｓ１ ｒｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｌｒ７．２４．７８５５−７ＮＧ（ＩＪＢＳ）　］ 、軟骨由来成長因子［５ｗ１ｌｉｖ＊ｎ及びＫｌｔｇｓｂｒｕｎ　、　１．　　 Ｂｉｏｌ、　　Ｃｈｅｔ、　　２６０．　２３９９−２４０３（１９８５）　］ 　、星状膠細胞由来成長因子２　［ＰｔＮｍ５ｎら、ＦＥＩＩＳＬｅ目、　、　 　１８９．　１１１２−１０８］　、眼由来成長因子［Ｃ６１１目！ら、Ｂｉｏ −ｃｈｉｍｉ＜、　６７、２６５−２６９８　（１９８５）コ、カチオン性視床 下部由来成長因子［Ｋ　Ｉ　＊　Ｈｓ　ｂ　ｒ　ｕ　ｖ　及び５ｈｉＢ　、ＰＮ ＡＳ、　８２．８０５−８０９（１９８５）　］、クラス２及びβヘパリン結合 成長因子［Ｌｏｂｂ及びＦｓ目、Ｂｉｏ−ｅｈ！ｍ１ｕｒ７　、　２３．　６２ ６５−６２９９（１９８４）　　；　Ｌｏｂｂら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　　２４ ゜４９６９−４９７３（１９８５）　　；　Ｌｏｂｂら、ＢＢＲＣ，１３１，５ ８６−５９２（１９８５）　ＨＬｏｂｂら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈ！Ｉｎ、、 　　２６１．１９２４−１９２８（１９８６１］並びにマクロファージ由由来成 長子の成分［Ｂｘｉｒｄら、ＢＢＩＩＣ，１２６，３５８−３６４（１９８５） 　］が包含される。上記した因子はすべてヘパリンと強く結合するｂＦＧＦ特性 を有しており、すべて塩基性タンパク質である。ａＦＧＦに代表される類似のヘ パリン結合因子群も発見された。これらの物質は低塩化ナトリウム濃度でヘパリ ンから溶出し、酸性の等重点を有する。これらの因子のヘパリン結合特性により 精製が容易になり、場合によりアミノ酸配列分析のために十分なタンパク質が単 離され得た。ヘパリンの使用によりＦＧＦの精製が容易となつたが、精製を大規 模に行なうときにヘパリンを使用することは望ましくない。何故ならば、コスト 高となり、産物がヘパリンにより汚染される可能性があり、ヘパリンに不可逆的 に結合するために収率が下がるからである。酸性及び塩基性ＦＧＦの由来は恐ら く同一の先祖遺伝子であり、酸性及び塩基性ＦＧＦはアミノ酸配列の点で５５％ 相同であり且つ同一のイントロン／エキラン構造を有する。サザン法の実験によ り、酸性及び塩基性ＦＧＦの場合はたった１つの遺伝子であり、異なる組織から 単離された物買間の差異は多分翻訳後処理によるものと示唆される。２つのクラ スの生物学的活性の範囲は同一とみられるが、多くバイオアッセイ系ではｂＦＧ Ｆの活性はａＦＧＦに比べて約１０倍高い。

塩基性ＦＧＦは、約１６．５００の分子量を有する一本鎖の非グリコジル化タン パク質である。塩基性ＦＧＦは４つのシスティン残基を含むが、ジスルフィド結 合の数は不明である。ｂＦＧＦに対して１５５個のアミノ酸を有する主要な翻訳 産物が提案されているが、下垂体組織中に存在するメジャーな形態は　１４５個 のアミノ酸を有する。Ｎ−末端で長さの異なる幾つかの分子量形態のものが異な る組織から単離されたが、これらはすべて生物学的活性を有していると考えられ る。塩基性ＦＧＦは強塩基性のタンパク質であり、その等電点は９，６である。

塩基性ＦＧＦはヘパリンと強く結合し、ヘパリンセファロースカラムから約１． ６１１Ｎ＊ａ！テ溶出する。ｂＦＧＦ１７）生物学的活性は熱（７０℃）又は洗 剤により壊れる。ゲノムにおいては、この翻訳産物に対するコード配列が２つの イントロンにより中断されており、第一はコドン６０を分裂し、第二はコドン９ ４と９５を分離している。

全体のゲノムコード化領域の大きさは不明であるが、少なくとも３４ｋｂの長さ を有している。ｂＦＧＦに対する遺伝子は染色体４に位置している。

ｂＦＧＦの配列についてのデータは最初、ＢｏｈｌｅｎらがＰＮＡＳ。

ｉｌｌ、　５３６４−５３６８　＋１９８４）に発表した。彼らは、ウシの下垂 体組織から精製した物質のＮ末端の１５個のアミノ酸を調べた。次いで、Ｅｓｃ ｈらはＰＩＩＡＳ、　８２．６５０７−６５１１（１９１１５）にウシ下垂体由 来のｂＦＧＦの完全な配列を報告し、その中でａ　ＦＧＦのアミノ末端配列と比 較した。ＰＣＴ特許出願Ｎｏ　８６１０７５９５には、Ｅ、ｅｏｌｉでのｂ−ｂ 　Ｆ　Ｇ　Ｆの産生が開示されている。しかしながら、報告されて、いる産物の 収率は非常に低い。ｂ−ｂ　Ｆ　Ｇ　Ｆの遺伝子のクローニングについては入ｂ ＋ｔｔｕｍらが最初５ｃｉｚｂｃｅ、　　２３３．　５４５−５４８に報告し、 後になってｈ−ｂ　Ｆ　Ｇ　Ｆのヌクレオチド配列とゲノム体制を報告した［Ｅ Ｎ［ｌＯ１ｏｕｄｅｓｔ、　　５．２５０−２５０（１０Ｇ）　］。ウシとヒト ｂＦＧＦとは２つのアミノ酸の点で異なっていることは公知である。

最近になって高度に精製されたｂＦＧＦ製剤がテストに利用されるようになった が、多くのインビトロの研究では純度の異なる物質が利用されていた。これらの 研究で、ｂＦＧＦが中胚葉器官の各種細胞に対して強力なマイトジェンであるこ とが判明し、内皮細胞や繊維芽細胞に対して走化性であり得る。更に、天然に存 在するｒ−ｂ　Ｆ　Ｇ　Ｆ及び組織由来のｒ−ｂ　Ｆ　Ｇ　Ｆが家兎の角膜及び 鶏の漿尿膜アッセイにおいて血管新生を誘発させ、ｂＦＧＦは創傷の治癒を促進 するのに有用であると認められる。

Ｆ＊ｉｒｔ畠ｍ１ｒｒらは３．　　Ｉｎマ、　Ｄｅｒｍ、　、　８７．　７６− ８０　（１９８６）に、ウシ網膜由来の物質がモルモットの水痘モデルにおいて 血管新生及び再上皮化を刺激し、且つ創傷の治癒を促進し得ることを報告した。

ＤｓｖｉｄｉｏｎらはＪ、　　Ｃｅ１１．　　Ｂｉｏｌ、、　　１００．　１２ １９−１２２７（１９８５）　に、ラットの創傷モデルにおいてウシ軟骨由来の 因子により創傷の回復が促進されると同時に肉芽組織の増加とコラーゲンの蓄積 が認められると報告した。ＢＨｌｒｏｃｋらはＥ！ＩＩ、　　Ｐｉｊｂ、、　２ １．　４６−５３及びＥ！ｌｌ、　Ｐｉｊｂ、　、　２１．６２−６７　（１９ ｇ２１　に、ウシの脳組織抽出物を使用するとラットの創傷治癒が促進されると 同時に肉芽組織の増加と血管新生が認められると報告した。

発明の要旨 本発明は、天然に存在するｂＦＧＦより安定であり且つ＋−ｂＦＧＦの精製を容 易にす６ｂＦＧＦアナログに関する。システィン残基を含むアミノ酸配列を有す るｂＦＧＦのアナログが提供され、前記システィンの少なくとも１つ、好ましく は２つが異なるアミノ酸残基により置換されている。

本発明はｂＦＧＦアナログの好ましい産生方法に関する。前記方法は １）ＤＮＡプラスミドベクターを用いてトランスフオーメーシ、ンさせたＥ、ｃ ｏｌｉ宿主細胞を適当な栄養条件下で生育させる。

前記したＤＮＡプラスミドベクターは、ｂＦＧＦの主要な構造フンホメーシジン の一部若しくは全部とヒト塩基性繊維芽細胞成長因子の生物学的特性の１つ若し くはそれ以上とを有しており、少なくとも１つのシスティン残基が異なるアミノ 酸の残基で置換されているｂＦＧＦアナログ（以下、−ｂＦＧＦアナログと称す る）のＥ、ｅｏｌｉ宿主発現をコードするＤＮＡ配列、調節されたプロモータ配 列及び温度誘導性のコピー数コントロール遺伝子（ｔｔｍｐｅｒ＊ｌｕ＋ｅ−ｉ ｎ＋１ａｃｉｂｌｅ　ｅｏｐｙｎｌｂｅ＋　ｅｏｎｌ＋ｏｌ　ｇｅ＋＋ｅ）　ｓ を含む。２）前記ベクターでＤＮＡ配列を発現させた所望のｂＦＧＦアナログを 単離する。

３）所望のｂＦＧＦアナログを精製する。

本発明はまた、非ヘパリン含有クロマトグラフィーを用いるＥ、ｅｏｌｉ由来の ＋−ｂ　Ｆ　Ｇ　Ｆアナログの精製方法にも関する。

＋ｈ−ｂＦＧＦアナログの一部若しくは全部をコードするＤＮＡ配列も提供され る。前記した配列は好ましくは以下のものをフレアーゼ酵素による開裂部位を提 供する；及び／又は（３）すぐに発現するベクターの構築を容易にする先端、末 端又は中間のＤＮＡ配列を提供する。本発明の新規なりＮＡ配列はｂＦＧＦ本発 明のＤＮＡ配列は特に、（１）システィン残基をコードする少なくとも１つのコ ドンが異なるアミノ酸残基をコードするコドンにより置換されている第２図のＤ ＮＡ配列（以下“アナログ配列”と称する）；（ｂｌ　アナログ配列の１つ若し くはその断片にハイブリダイズするＤＮＡ配列；及び（ｅ３遺伝子コードの縮重 ではなく、アナログ配列の１つにハイブリダイズするＤＮＡ配列を含むと考えら れる。（ｅ）に特に包含されるものは、そのＤＮＡ配列が好ましい微生物宿主に おいてメツセンジャーＲＮＡの翻訳を容易にするコドンを含むｂＦＧＦアナログ をコードする製造されたＤＮＡ配列である。前記の製造された（ｍｓｎｗｌｓｃ ｊｗｒｓｄ）配列は、Ａ１１ｏｎら（ＰＣＴ出願公開ＷＯ８３１０４０５３参照 ）の方法に従って容易に構築され得る。

対立遺伝子変異体を含めた天然に存在するｂＦＧＦが持つ生物学的性質（例えば 免疫学的性質及びインビトロな生物学的活性）及び物理的性質（例えば分子量） の１つまたはそれ以上を有する精製・単離されたｂＦＧＦアナログを記載する。

これら宿主細胞から発現させた本発明のｂＦＧＦアナログは、（第２図に示す如 く１位に）先端メチオニンアミノ酸残基を含み得る。

また、当業者に公知の如く、天然に存在するｂＦＧＦの生物学的活性を実質的に 保持しているならば末端の１つ若しくはそれ以上がＤＮＡ配列から欠失し、てい てもよい。

Ｅ、ｃｏｌｉ由来のｂＦＧＦアナログを産生させるに必要な遺伝子情報を含む、 各種の複製可能なりローニングベヒクルと発現ベヒクルと形質転換されたＥ、ｅ ｏｌｉ培養物とも本発明に包含される。

部位特定的突然変異誘発を使用して、ｂ−ｂ　Ｆ　Ｇ　Ｆの遺伝子を＋ｈ−ｂＦ ＧＦをコードする遺伝子に変換させてもよい。或いは、ウシ遺伝子及びヒト遺伝 子を部位特定的突然変異誘発により修飾して、少な（とも１つのシスティン残基 を変換させてもよい。

本発明の特徴及び利点は、現在のところ好ましいとされる本発明の具体例を例示 する以下の記載から当業者には明らかであろう。

図面の簡単な説明 第１図はｂＦＧＦ遺伝子のアブセンブリ−とクローニングの概略説明図である。

第２図はｒ−１）　Ｆ　Ｇ　Ｆのヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。

実線のかこみは、ウシ遺伝子を＋ｈ−ｂＦＧＦをコードする遺伝子に変換させる べく部位特異的突然変異誘発により生起させたヌクレオチド及びその結果生じた アミノ酸の変化を示す。破線のかこみは、ｂＦＧＦ遺伝子を本発明のｂＦＧＦア ナログをコードする遺伝子に変換させるための変化を示す。

第３図はＭｌ）１３Ｔ３細胞に対するｒ−ｂ　Ｆ　Ｇ　Ｆのマイトジェニックな 活性を示すグラフである。８１１３７ｍ細胞に対するｒｈ　−ｂ　Ｆ　Ｇ　Ｆ（ ・）　、＋ｂ−ｂＦＧＦ　（０）及び組換えヒト（ｓｕ−７０，８８）　ｂ　Ｆ ＧＦ　（ｘ）のマイトジェニックな効果を示す。＋−ｂ　Ｆ　Ｇ　Ｆの用量に対 して、該用量における３Ｈチミジン摂取量から求められるＤＮＡ合成の最大刺激 率をプロットした。

第４図は、精製＋−ｂ　Ｆ　Ｇ　Ｆをナトリウムドデシルサルフェートポリアク リルアミドゲル電気泳動（“５ＤＳ−ＰＡＧＥ”）にかけて得た銀染色ゲルの写 真である。

第５図はトリプシン消化させた活性＋ｂ−ｂＦＧＦ（上）及びＳ−カルボキシメ チル化＋ｂ−ｂＦＧＦ（下）の高圧液体クロマトグラフィー（ＩＩＰＬｃ）のプ ロフィールである。矢印は、Ｓ−カルボキシメチル化により保持時間に顕著な差 を示したペプチドを示す。

第６図は、遠ＵＶ領域（左）及び近ＵＶ領域（左）におけるｒｂ−’ｂＦＧの円 二色性スペクトルである。

第７図は、Ｎｌｌ１３７３細胞に対する５ｓｒ−２６，７０，８Ｂ、　９３ｂ　 Ｆ　Ｇ　Ｆアナログのマイトジェニックな活性を示すグラフである。＋−ｂＦＧ Ｆの用量に対して、該用量における　３Ｈチミジン摂取量か、ら求められるＤＮ Ａ合成の最大刺激率をプロットした。

第８図は、実施例１６の家兎耳を用いたインビボ実験における損傷化及び観察方 法を示す。

詳細な説明 本発明により提供される新規なりＦＧＦアナログは、天然のｂＦＧＦに存在する システィンの少なくとも１つ、好ましくは２つが別のアミノ酸残基により置換さ れていることを特徴とする。これらのアナログは天然のｂＦＧＦに比べて驚くほ ど高い安定性を示すことが判明している。本発明のより安定なりＦＧＦアナログ は創傷の治療及び手術の際のｂＦＧＦの効果を高めるものと予期される。

本発明では、ｂＦＧＦアナログを特定の微生物宿主（例えば培養した哺乳動物細 胞、細菌及び酵母）において直接合成し得る製造された若しくは合成された遺伝 子も提供される。

更に、本発明には、本発明のｂＦＧＦアナログの有効量と適当な希釈剤、アジュ バント及び／又はキャリアを含む薬剤組成物も包含され、前記薬剤組成物は表面 創傷の治療、骨の治療、血管発生（血管の形成、特に深い創傷の治療に重要であ る）、神経の再生並びに臓器の発生及び再生等を含めた皮膚科及び外科の領域に おいて有用である。

本明細書中、用語“組織由来の塩基性繊維芽細胞成長因子”は、腫瘍、培養され ている真核細胞、正常組織等に由来する塩基性繊維芽細胞成長因子を指す。

本明細書中、用語“製造された（ｍｓｎｕｌ婁ｃｌｕｒｅｄ）’はＤＮＡ配列又 は遺伝子に適用するときには、ヌクレオチド塩基のアッセンブリーより全体的に 化学合成した生成物、又はこうして化学合成した生成物を生物学的に複製したも のを指す。この用語から、元来生物学的起源の出発物質を用いるゲノムクローニ ング技法のｃＤＮＡ法により合成された生成物は除外される。

本明細書中、用語“合成された（ｓｙａｌｌｓ＋１ｚｓｄ）　”は既に製造され た遺伝子の部位特異的突然変異誘発及び他の変更を指す。

本明細書中、用語°遊離スルフヒドリルとして存在するシスティン°はジスルフ ィド結合に関与しないシスティン残基を指す。

Ｅ、ｃｏｌｉ由来の組換えｂＦＧＦを、以下の一般的手順に従って産生じた。

Ｅ＋ｅｂら、ＰＮＡＳ、　８２．６５０７−６５１１（１９８５）に記載されて いるｂ−ｂＦＧＦのアミノ酸配列を、Ｅ、ｃｏｌｉで発現させるためのｂＦＧＦ 遺伝子の製造原料として使用した。この製造された遺伝子のヌクレオチド配列は クローニングの目的で使用される有利な制限部位とＥ、ｅｏｌｉによりしばしば 使用されるコドンを含む。製造された遺伝子の例を表１に示す。表１はｂ−ｂ　 Ｆ　Ｇ　Ｆの製造された遺伝子を表し、表■はｈ−ｂ　Ｆ　Ｇ　Ｆの合成された 遺伝子を表す。

表　　　　１ ウシの塩基性繊維芽細胞成長因子／製造された遺伝子表　　　　■ ヒトの塩基性繊維芽細胞成長因子／合成遺伝子ｂ−ｂ　Ｆ　Ｇ　Ｆの製造された 遺伝子のヌクレオチド配列及びそれから誘導されたアミノ酸配列を第２図に示す 。実線のかこみは、製造されたウシ遺伝子をｈ−ｂ　Ｆ　Ｇ　Ｆをコードする合 成遺伝子に変換させるべく部位特異的突然変異誘発により生じたヌクレオチド変 化及びアミノ酸変化を示す。破線のかこみは、合成ｈ−ｂＦＧＦ遺伝子を１つ若 しくはそれ以上のシスティン残基がセリン残基により置換されているアナログ配 列に変換させるべく行なわれたその後の変化を示す。部位特異的突然変異誘発が 他のｂ−ｂ　Ｆ　Ｇ　Ｆアナログを生成するために使用され得ると認められる。

換言すると、他のアミノ酸を用いてシスティン残基を置換してもよい。一般にシ スティン残基を置換するために選択されるアミノ酸は、類似の構造を保持するが ダイマーを形成しないアナログを形成する能力に基づく。前記したアミノ酸とし ては、セリン、アラニン、アスパラギン酸及びアスパラギンが挙げられる。シス ティンと置換され得る他のアミノ酸は当業者に自明であろう。

ｂ−ｂ　Ｆ　Ｇ　Ｆ遺伝子の２本鎖に相当するオリゴヌクレオチドを重複した領 域で製造し、ハイブリダイゼーシタン後連結して２つの大領域に集合させた。次 いで、ヌクレオチド配列分析のために、２つの大領域を適当なファージベクター （即ちＭ１３ｉｐ１Ｂ　）にクローンさせた。前記のファージベクターを確認す ることは当業者にとうて容５である。正確な配列を確認したら両方の領域を制限 エンドヌクレアーゼ消化により切り出し、ゲル単離し、適当な発現ベクターに連 結させた。発現ベクターに対してコードさせたｂＦＧＦ遺伝子の発現は、調節さ れたプロモータ配列及び発現ベクター上に位置する温度誘導性のコピー数コント ロール遺伝子により調節される。本明細書中、用語“調節されたプロモータ（ｒ ＢＩｌｌｘｌｅｄ　ｐ＋ｏｍｏｌｅｒｔ）”はＰｔプロモータ（例えばλフアー ジ由来のプロモータ）及び短縮されたＰｔプロモータを指す。前記の調節された プロモータ及び温度誘導性のコピー数コントロール遺伝子を含む発現ベクターは 、ヨーロッパ特許出願ｋ　Ｈ６，４９０に記載されている。適当なＥ、ｅｏｌｉ 宿主菌株中でｂＦＧＦ含有発現ベクターを発育させるとｒｂ　−ｂ　Ｆ　Ｇ　Ｆ が生じた。ｒｂ　−ｂ　Ｆ　Ｇ　Ｆ含有細胞を溶菌させ、低速遠心分離にかける と、約３０〜７０％のｒｂ−ｂＦＧＦが上清画分中に可溶性の形態で認められた 。非ヘパリン含有クロマトグラフィー、即ちアフィニティークロマトグラフィー により精製すると、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により少なくとも９５％の 純度であると推定され且つ実質的にエンドトキシンもＤＮＡ汚染物も含まないポ リペプチド産物が得られた。

部位特異的突然変異誘発を使用して、ウシ遺伝子をヒトｂＦＧＦをコードする遺 伝子に変換させた。ｒｂ−ｂＦＧＦのときに使用したと同じ精製方法を用いて、 ｒｂ−ｂＦＧＦを精製した。

Ｅ、ｃｏｌｉ由来のｒｂ　−ｂ　Ｆ　Ｇ　Ｆ　、　ｔｈ　−ｂ　Ｆ　Ｇ　Ｆ及び 本発明のｂＦＧＦアナログのマイトジェニックな活性を、細胞細胞分裂中ＤＮＡ 合成の増加に伴って生ずるマウス３Ｔ３細胞による放射性標識チミジンの摂取量 増加に基くインビトロなマイトジェニックなアッセイ法を用いて測定した。

オリゴヌクレオチドの部位特異的突然変異誘発を用いて、システィン残基の一部 若しくは全部をコードする配列が別のアミノ酸残基をコードするように＋ｈ−ｂ ＦＧＦ遺伝子を修飾した。

本発明のｂＦＧＦアナログは驚くことに、ｂＦＧＦ活性を損うことなくｂＦＧＦ 分子に非常に高い安定性を付与することが判明した。

以下の実施例により、本発明の実施態様を例示する。本実施例中で使用した用語 “ＯＤ”は６Ｇｈｍにおける光学密度単位を指す。

実施例１ ｅｘｐ＋５ｓｓｉｏｃ　ｐｒｓｌｓｒｓｍｃｓ　ｃｏｄｏｎｓ）を含むｂ−ｂＦ ＧＦをコードする作製遺伝子（ｍｔｎｕｔｚｃｌｕｒｅ＋ｌ　Ｈｍｅ）の調製に 関する。ｂ−ｂＦＧＦ生成物をコードする作製遺伝子の調製に用いるプロトコル は、参考として本明細書に付加するＰＣＴ公報Ｎｏ、ＷＯ３３／　０４０５３に Ａ１１ｅｎらが一般的記述として開示している。この遺伝子は多重デュプレック ス（１１１目ｐｉｅ　ｄｗｐｌ＜ｘｅｓ）オリゴヌクレオチド成分の初期アッセ ンブリーとしてデザインされ、次いで二つの分離したセクシタンヘアッセンブル するこれらのセクションは速かに増殖（＊ｍｐｌｉ！ｉｃ［ｉｏゎ）するように デザインされまた、増殖系から除去されたとき、適切な発現ベクターにおいて逐 次的にあるいは多段フラグメント連結反応（Ｉｉｌ＊１ｉｏｎ）によ表■に示し たセクションＩのアッセンブリーに必要な１６個のオリゴマーの各々を２０Ｄｐ ｍづつエツベンドルフチューブに計り取り、急速真空ポンプにより乾燥した。

３２ｇのＩＯＸ連結反応バッファー溶液（５ＧＭ　　）（ＥＰＥＳ。

ｐＨ７，６）、　０．７ｊｄｌのｌｈ　Ｍアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、１ｗ ｌの３Ｘ１０７力ウント／分／成の放射性標識化（＋＊ｄｉｏｌｉｂｅｌｌｔｄ ）　Ａ　Ｔ　Ｐ及び２６６成の水を含む３２０ｗ１のキナーゼミックスを調製し た。試剤はｌＯ単位／ｐ１の濃度のキナーゼ酵素２０ｄを含むキナーゼ（ベーリ ンガーマンハイム、インゲルハイム、西独）のチューブ中で一緒にした。このキ ナーゼミックスを、それぞれオリゴヌクレオチド２〜１５を含む各々のチューブ ２〜１５に分配した。オリゴヌクレオチド１及び１６を含むチューブには連結反 応バッファーのみを入れた。２〜１５を含むチューブは３７℃で４５分間培養し た。この時間が終了したとき、各々のチューブからの１／４１Ｉｉのアリコート をＤＥ８１ペーパークロマト用ストリストリップトマン、メイドストーン、英国 ）上にスポットし、１３５Ｍギ酸アンモニウムで溶離し、液体シンチレーシラン カウンターで分析した。液体シンチレーシラン分析において、カウント数の１／ ２以上がオリジン（ｏｒｉｇｉｎ）にあることが判った。

表　　■ １）　　　　　　５’　　　　ＣＴＡＧＡＡＧＧＡＧＧＡＡＴＡＡＣＡ丁ＡＴＧ ＣＣＡＧＣＴＣＴ　　　　３’２）　　　　　５’　　　　ＧＣＣＡＧＡＡＧＡ ＴＧＧＴＧＧＡ丁ＣＣＧＧＴＧＣＴＴ丁ＣＣＣ３’３）　　５’　　ＧＣＣＡＧ ＧＴＣＡＴＴＴＣＡＡＡＧＡＴＣＣＧＡＡＡＣＧＴＣ丁Ｇ　３’４）　　５’　 　ＴＡＣＴＧＣＡＡＡＡＡＣＧＧＴＧＧＴＴＴＴＴＴＣＣＴＧＣＧＴＡ　３５） 　　　５’　　ＴＣＣＡＴＣＣＧＧＡＴＧＧＴＣＧＴＧＴＴＧＡＴＧＧＴＧＴＡ Ｃ３’６）　　　　　５’　　　　ＧＴＧＡＧＡＡＡＴＣＴＧＡ丁ＣＣＧＣＡＴ ＡＴＣＡＡＡＣＴＧＣＡ　　　３’７）　　　５’　　ＧＣＴＧＣＡＡＧＣＴＧ ＡＡＧＡＧＣＧＴＧＧＴＧＴＡＧＴＴＴ　　　３’８）　　　　　５’　　　　 ＣＴＡＴ丁ＡＡＡＧＧＴＧ丁ＡＴＧＴＧＣＴＡＡＣＣＧＧＴＡＣＣＴＧ　　３９ ）　　　　　５’　　　　ＣＴＧＧＣＡＧＡＧＣＴＧＧＣＡＴＡＴＧＴＴＡＴＴ ＣＣＴＣＣＴ丁　　３’１Ｇ）　　　５’　　ＴＧＧＣＧＧＧＡＡＡＧＣＡＣＣ ＧＧＡＴＣＣＡＣＣＡＴＣＴＴ　　　３’１１）　　　　　５’　　　　ＡＧ丁 ＡＣＡＧＡＣＧ丁ＴＴＣＧＧＡＴＣＴＴＴＧＡＡＡＴＧＡＣＣ３’１２）　　　 　　５’　　　　ＡＴＧＧＡＴＡＣＧＣＡＧＧＡＡＡＡＡＡＣＣＡＣＣＧＴ丁Ｔ ＴＴＧＣ３１３）　　　　　５’　　　　ＴＣＡＣＧＴＡＣＡＣＣＡＴＣＡＡＣ ＡＣＧＡＣＣＡＴＣＣＧＧ　　　　　３’１４）　　　　　５’　　　　ＣＡＧ ＣＴＧＣＡＧＴ丁ＴＧＡＴＩＴＧＣＧＧＡＴＣＡＧＡ丁Ｔ丁Ｃ３’Ｉｓ）　　　 　　　５’　　　　ＡＴＡＧＡＡＡＣＴＡＣＡＣＣＡＣＧＣＴＣＴＴＣＡＧＣＴ ＴＧ　　　　　３’１６）　　　　　　Ｓ’　　　　ＡＡＴＴＣＡＧＧＴＡＣＣ ＧＧＴＴＡＧＣＡＣＡＴＡＣＡＣＣＴＴ丁Ａ　　３’を含む各々のチューブに加 え、チューブは３７℃でさらに４５分間培養した。この期間の終りに、すべての チューブを１０分間員沸したのち、遠心処理し、組合せてデュプレックスとした 。このことは、チューブ９をチューブ１に（デュプレックス１番）、チューブ１ ０をチューブ２に（デュプレックス２番）、チューブ１１をチューブ３に（デュ プレックス３番）、チューブ１２をチューブ４に（デュプレックス４番）、チュ ーブ１３をチューブ５に（デュプレックス５番）、チューブ１４をチューブ６に （デュプレックス６番）、チューブ１５をチューブ７に（デュプレックス７番） 、チューブ１６をチューブ８に（デュプレックス８番）各々の内容物を加えるこ とにより行なった。これらの８つのオリゴヌクレオチド混合物はその後、煮沸し 、ゆっくり室温まで冷却してデュプレックスを形成させた。デュプレックス１番 と２番を結合（テトラマー１　＋　２　）　、デュプレックス３番と４番を結合 （テトラマー３＋４）、デュプレックス５番と６番を結合（テトラマー５＋６） ％そして最後にデュプレックス７番と８番を結合（テトラマー７＋８）というよ うに、デュプレックスをさらに結合した。これらのテトラマーを含む各々のチュ ーブに、１０５ＭのＡＴＰ２ｍとベーリンガーマンハイムからのＴ４ＤＮＡリガ ーゼ２誠を加えた。これらの連結反応混合物を３１℃で１０分間、次いで室温で １時間培養した。この時点で、テトラマー混合物を再びプールし、テトラマー１ ＋２とテトラマー３＋４が互いに結合し、テトラマー５＋６とテトラマー７＋８ が互いに結合するようにした。得られた２つの連結反応ミックス々に、１０＋ｅ ＭのＡＴＰとＴ４　ＤＮＡリガーゼ２成をさらに加えた。混合物を３７℃で１０ 分間、次いで室温で１時間培養した。最後に、すべての連結反応混合物を互いに プールした。すなわち、両方のチューブの内容物を一緒にし、８成のリガーゼを その混合物に加えたのち、混合物を３７”Ｃで１０分間、次いで４℃で一晩培養 した。−晩の連結反応のあと、７Ｍの尿素で作製した８％ポリアクリルアミドゲ ル上で、アリコート１０成を分析した。一つのバンドが２４２塩基対のＨｐｌ■ マーカーに隣接して識別でき、これにより連結反応が完了したことが示される。

やはり７Ｍの尿素を含む８％ポリアクリルアミドゲルを作製した。連結反応ミッ クスをエタノールで沈澱させ、乾燥したのち８０％ホルムアミド８０４に加えた 。この連結反応ミックスの半分を次にＨｐ＊ＩＩ切断Ｐ　Ｂ　Ｒ３２２マーカー を含むレーンに隣接してプレパラティブゲル上にロードした。このゲルをキシレ ンシアツール染料マーカーがゲルの底部に達するまで運転したのち、ゲルを電気 泳動装置から取りはずしてコグツクＸ−線フイルムの隣のフィルムカセット中に 置いた。フィルムを現像してバンドが目に見えるようにし、隣接レーン上のＨｐ ｌｌｌ　２４２マーカーのすぐ上のゲル切片を切り取った。この２４４塩基対の バンドを含む切片は、フィブロブラスト成長因子の完全連結セクシ１ンＩとして 考えられる。このゲル切片をシリンジによりエツベンドルフチニーブへ押出し、 マクサムギルバートゲル溶離液で覆い、３７℃で一晩培養した。チューブの内容 物を次いでシリンジの胴部に設けたガラスフィルターを通して濾過し、上清をｎ −ブタノールで３回抽出したのち、エタノールで析出させた。乾燥ペレットを次 いで１０■Ｍのトリス−ＨＣＪ及び１ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ ）の溶液２００誠に加え、遠心操作でチューブの底に沈むポリアクリルアミドの 残渣を除去したのち、エタノールで再沈した。エタノール析出試料は、１分間に 約３７．　ＯＮカウントのものであり、これは、この連結反応に要したオリゴマ ーに対応する放射能に基づいて、約１．５ｐｍのデュプレックスに相当するもの であった。これら　１．５ｐ−のものは次に、　３Ｘ１Ｇ７力ウント／分の放射 性標識化ＡＴＰを含む２０ＩＩＲの連結反応バッファーに溶解した。アリコート を１７４ｇ取って、ＤＥ８１ストリップ上にスポットした。その後、１成のキナ ーゼを加え、チューブを３７℃で４５分間培養した。この時点で、１／４Ｉｉｌ をチューブから取り、ＤＥ８１ストリップ上にスポットした。両方のストリップ を次いで０．３５Ｍのギ酸アンモニウムで溶離したのち、各セクシ叢ンに切断し 、液体シンチレーシッンカウンター上でカウントした。前後のストリップからカ ウントはオリジンに結びつけられており、従ってキナーゼの反応は１１　（７） １０℃ｍＡ　Ｔ　Ｐを加え、３７℃で３０分間培養することにより完了に達する ことが明らかであった。その後、キナーゼ反応混合物を５分間員沸し、室温まで ゆっくり冷却した。

表　　■ ＦＧＦオリゴマー、セクション■ １７）　　　Ｓ’　　＾Ａ丁ＴＣＧＧＴＡＣＣＴＧＧＣＴＡＴＧＡＡＡＧＡＡＧ ＡＣＧＧＴＣＧ丁ＣＴＧＣＴＧＧ　　　　　３’１８）　　　５’　　ＣＴＴＣ ＴＡＡＧＴＧＴＧＴＴＡＣＴＧＡＣＧＡＡＴＧＴＴＴＣＴＴＴＴＴＣＧＡＡＣＧ 　　　　　　３’１９）　　　５’　　ＴＣ丁ＧＧ＾＾ＴＣＴＡＡＣＡＡＣＴＡ ＣＡＡＣＡＣＴＴＡＣＡＧＡＴＣＴＣＧ丁＾＾Ａ　　　　　　３’２０）　　　 ５’　　ＴＡＣＴＣＴ丁ＣＣＴＧＧ丁ＡＴＧＴＡＧＣＴＣＴＧＡＡＡＣＧＴＡＣ ＴＧＧ丁ＣＡＧ丁　　　　　３′２１１　　５’　　ＡＣＡ＾＾ＣＴＧＧＧＴＣ ＣＧ＾＾ＧＡＣＴＧＧＴＣＣＧＧＧＴＣＡＧ＾＾＾ＧＣＴＡＴＣＣ３’２２）　 　　５’　　丁ＧＴＴＴＣＴＧＣＣＧＡＴＧＴＣＴＧＣＴＡ＾＾ＴＣＴＴＡＡＴ ＡＧＣＴＣＧＡＧ＾　　　　　　３′２３）　　　５’　　ＧＡＡＧＣＣＡＧＣ ＡＧＡＣＧＡＣＣＧ丁ＣＴＴＣＴ丁ＴＣＡＴＡＧＣＣＡＧＧＴＡＣＣＧ　　　　 　３’２４）　　　５’　　ＣＡＧＡＣＧＴＴＣＧＡＡＡＡＡＧＡＡＡＣＡＴＴ ＣＧＴＣＡＧＴＡＡＣＡＣＡＣＴＴ＾　　　　３′２５）５’Ａ丁ＧＡＴＴＴＡ ＣＧＡＧＡ丁ＣＴＧＴＡＡＧＴＧＴＴＧＴＡＧＴＴＧＴＴＡＧＡＴＴＣ３’２６ ）　　　５’　　丁子ＧＴＡＣＴＧＡＣＣＡＧＴＡＣＧＴＴ丁ＣＡＧＡＧＣＴＡ ＣＡＴＡＣＣＡＧＧＡＡＧ　　　　　　３’２フ）　　　５’　　ＡＡＡＣＡＧ ＧＡＴＡＧＣ丁ＴＴＣＴＧＡＣＣＣＧＧＡＣＣＡＧＴＣ丁丁ＣＧＧＡＣＣＣＡＧ 丁　　３′２８）　　　５’　　ＡＧＣＴＴＣＴＣＧＡＧＣＴＡＴＴＡＡＧＡＴ ＴＴＡＧＣＡＧＡＣＡＴＣＧＧＣＡＧ　　　　　　　３’ブイプロブラスト成長 因子のセクション■のアッセンブリーフィブロブラスト成長因子セクション■は 同様の方法でアセンブリされた。表■に示した１２のオリゴヌクレオチドの各々 ２０Ｑｐｍをエッペンドルフチューブに測り取り、急速減圧して乾燥した。乾燥 を８０％エタノールｕＯｗｉを加えて繰り返した。２４屑の１０×連結反応バッ ファー、２μｓの放射性標識化ＡＴＰ（１，５×１０７カウント／分／１ＩＩｌ ）、０．５４の１０慾Ｍ　　ＡＴＰ、２０度のキナーゼ及び１９３ｊｉｅの水を 含み、全量２４０ρのキナーゼミックスを調製した。この混合物２０扉を、キナ ーゼ反応に供するオリゴヌクレオチド１８〜２７をそれぞれ含む各々のチューブ に加えた。

オリゴヌクレオチド１７及び２Ｂを含むチューブには連結反応バッファーのみを 加えた。これらのチューブを次いで３７℃で４５分間培養し、その後１／４成の アリコートを各々のチューブから取り、ＤＥ８１ストリップ上にスポットした。

ＤＥ８１ストリップを０．３５Ｍギ酸アンモニウムで溶離したのち、液体シンチ レーシ翳ンカウンターによりオリジンにおけるカウント数を計測した。

この分析から、キナーゼ反応が進行していることが明らかとなった。この時点で 、ＩＩＩＩｌの　１０ｍＭ　　Ａ　Ｔ　Ｐを各々のチューブに加え、チューブを ３７℃で４５分間さらに培養した。チューブを５分間煮沸したのち、遠心分離し デュプレックスを形成するように、−緒にした。つまりオリゴヌクレオチド２３ 番と１７番（デュプレックス１７番）、２４番と１８番（デュプレックス１８番 ）、２５番と１９番（デュプレックス１９番）、２６番と２０番（デュプレック ス２０番）、２７番と２１番（デュプレックス２１番）、及び２８番と２２番（ デュプレックス２２番）を各々−緒にした。これらのデュプレックス混合物を次 いで煮沸し、１時間かけて室温までゆっくり冷却した。その後デュプレックスを 組合せてテトラマーを形成させた。デュプレックス１７＋　１８を組合せてテト ラマー１７を、デュプレックス＋９＋２０を組合せてテトラマー１９を、またデ ュプレックス２１＋　２２を組合せてテトラマー２１を各々形成させた。これら を３７℃で１０分間アニールした。各々のテトラマー混合物に、２ＩＩＩｌの　 １０蔵Ｍ　　ＡＴＰと　２ＡＩＩｌのＴ４　ＤＮＡリガーゼを加えた。

３つの連結反応物を４℃で一晩培養した。この時点で、テトラマーを含む３つの チューブの各々から４１Ｊｉのアリコートを取り、７Ｍのウレアで作製した１０ ％ポリアクリルアミドゲル上で泳動させた。ゲルのオートラジオグラフィーから 、連結反応が進行していることが判ったテトラマー１７と１９をプールし、４屑 のＩＱｍＭ　　Ａ　Ｔ　Ｐと共に４成のりガーゼを加えた。８ピースの連結反応 物を次いで３７℃で１５分間培養したのち、連結反応混合物に最後のテトラマー を加える前に４℃で６時間培養した。この時点で、テトラマー２１をオクタマー 状の連結反応混合物に加え、連結反応物の全体を３７℃で１５分間培養した。５ ｐｆｌのりガーゼと５ＩｉＲの１ｈＭ　　Ａ　Ｔ　Ｐとを加え、得られた混合物 ３７℃で１５分間培養した。　５１１１のリガーゼと　５誠の　ＩｈＭ　　Ａ　 Ｔ　Ｐとを加え、得られた混合物を３７℃で１５分間培養した。５Ｊのりガーゼ と　５屑の１０５Ｍ　　Ａ　Ｔ　Ｐを再度連結反応混合物に加えたのち、連結反 応物全体を４℃で一晩培養した。７Ｍの尿素で作製した８％ポリアクリルアミド ゲル上で、全連結反応物を調べた所、予期したとおり　２４２塩基対のところに 明らかなバンドが認められた。

連結反応ミックスをフェノールで抽出し、プレパラティブゲル上にロードする前 にエタノールで析出させた。連結反応ミックスの１／２を８％７Ｍ尿素ゲル上に ロードし、２４２塩基対の生成物をオートラジオグラフィーにより可視化して、 切り取り、ｂＦ　Ｇ　ＦのセクションＩについて記述したと同様に精製した。

ｂ−ｂＦＧＦ遺伝子は実施例１で述べたように２つのセクションで合成した。各 々のセクションを、発現ベクターであるｐＣＦ　Ｍ　１１５６にアッセンブリす る前に、シーケンス確認のためにＭ　１３ｍｐｌＢにクローニングした。セクシ ョンｌのクローニング用の調製において、Ｍ　１３ｍｐｌＢは３倍過剰量の制限 酵素ＥｃｏＲＩとＸｂＩ工で２時間ダイジェストした。反応を当量のフェノール で抽出することにより停止させ、次いでクロロホルムで抽出後、２．５倍容のエ タノールで析出させた。ＤＮＡベレットをエタノールで洗浄し、減圧下で乾燥後 、１ｈＭのトリス、０，１鵬ＭのＥＤＴＡに　ｐＨ１，４で溶解した。上記のよ うに調製したＭ　ＨｍｐＨｌｍｐＨ−０，０６ｐｍａｌｔを合成ＦＧＦセクショ ンＩ（１，３ｐｓｏｌｚ　と共、に　５［１ｍＭのトリス（ｐＨ７，４）、　１ ０ＪｉＭのＭｇＣ１ｓ　　１０ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）　、１℃Ｍ のスペルミジン、ｌａＭのＡ　Ｔ　Ｐ　、　　１００４／　ｍｌのウシ血清アル ブミン（ＢＳＡ）及び１単位のＴ４リガーゼ中で１４℃にて４時間培養すること により連結反応を行なうた。互、■ｌｉＪＭ１０９ホスト細胞を、指数関数的に 成長する培養物から細胞を遠心分離し、氷冷した５０１ＭのＣａ　Ｃｊ　２に１ ．２０Ｄ／ｍｌの濃度で２０分間懸濁したのち、再遠心分離し、細胞を再度同じ 溶液に１２０Ｄ／ｍｌの濃度で懸濁することにより、旦、■ｌｉＪＭＩ０９ホス ト細胞を賦活化した（ｗｉｄｅ　ｃｏｍｐｒｌｔｔ＋）。連結反応混合物のアリ コート（０，１〜１０ｕｉ）を賦活化したホスト細胞のアリコート　２００ＡＩ Ｉｌに加え、氷上で４０分間放置した。

各々のチューブの内容物を次いで２００４の新鮮な旦、■ユＪＭ１０９．３ｍｌ の１００ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ） ｌｅｕｉを含む溶融０．７％ルリアアガ−（Ｌ　ｗｒｉ＊　Ｂｓｒ）及び５０／ Ｊｊの２９６５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラ ノシド（Ｘ−Ｇ＊ｌ）　に加えた。この混合物をルリアプレート上に置き、３７ ℃で一晩培養した。得られた４つの透明なプラークをプレートからつまみ上げ、 ホスト株としてＪＭ１０９を用いて１０ｍ１の培地中で生育した。

−木調ファージＤＮＡをこれらの培養物から調整し、Ｍ１３ユニバーサルブライ マーを用いてジデオキシ法によりシーケンスした。４つのＤＮＡのもののうち１ つは目的のシーケンスを有しており、ｒｂ−ｂＦＧＦ遺伝子のアッセンブリーの ために発現ベクターにセーブした。

作製ｂ　−ｂ　ＦＧＦ遺伝子のセクシ１ン■をセクションｌについてと同じ方法 を用いてシーケンシングのためにＭ　１３ｍｐｌＢにクローニングした。この場 合、ＭＨｍｐ１ｇベクターはセクションｎの粘着性末端を調節するために、Ｅｃ ｏＲＩとＨｉｎｄ　ｍ　（３倍過剰量）でダイジェストした。連結反応のために 、０．０２５ｐｍｏｌｅのＭ　１３ｍｐ１８ベクターを０．０７５ｐｍｏｌｅの リン酸化合成ＦＧＦセクシ３ン■と混合し、前と同様に１４℃で４時間培養した 。同じＣａ　Ｃ１２法を用いた形質転換によりセクシーンエと同様の透明なプラ ークが得られたが、コントロールプレート上に透明プラークの高いバックグラン ドが存在したため、ハイブリダイゼーシ■ンによってさらにセレクシッンを行な った。いくつかのプラークをＪＭ１０９ホストを用いて前記と同様に生育し、フ ァージＤＮＡを含む上清をニトロセルロースフィルター上にドツト状にのせた。

セクシ豐ンｎの合成において使用したオリゴヌクレオチド１８と２４をポリヌク レオチドキナーゼを用いて３２Ｐ−ＡＴＰで放射性標識化し、これらのフィルタ ーを精査するのに用いた。２つのポジティブスクリーニングクローンを選択し、 前と同様にシーケンスした。これらのクローンの１つが所期のシーケンスを有し ており、ｐｃＦＭ１１５６への遺伝子のアセンブリーに使用した。

実施例３ 発現ベクターｐｃ　Ｆ　Ｍ　１１５６中でのｒｂ−ｂＦＧＦのアッセンブリー セクシ１ン１とｎＭＨクローンに対する二重鎖複製型ＤＮＡを調製した。７Ｍ１ ０９ホスト中の各々のファージの５００　ａ＋１培養物を生育し、細胞を遠心分 離により採取した。細胞を次いで１５％スクロース、Ｏ，０５Ｍ　）リス、０． ０５ＭＥＤＴＡ及び１■／ｍｌのりゾチーム中に再懸濁し、氷上で２５分間培養 した。リボヌクレアーゼを０．１■／ｍｌに加え、さらに１０分間氷上で培養を 続けた。

等量の　０．１％トリトンＸ　−１００，５０５Ｍ　）リス及び５０ｍＭＥＤＴ Ａを加えて、氷上での培養をさらに１０分間続けた。これらの培養物を次いで３ ９０００Ｇで６０分間遠心処理し、透明な上清をセーブした。臭化エチジウムを １■／ｍｌに加え、塩化セシウムを加えて密度を１．５５　ｇ　／　ｍｌとした 。この溶液を平衡に到達させるために、ＶＴｉ−５Ｑｃｙ−ター中、４５０００ ｒｐ−で１８時間遠心処理した。各々のチューブからのスーパーコイルＤＮＡバ ンドをＵＶ光で可視化して、シリンジで採集した。ブタノールで抽出して臭化エ チジウムをすばやく除去し、ｌｈＭ）リスとＱ、　ｌｉＭＥ　Ｄ　Ｔ　Ａ　！、 ：対して徹底透析（ｅｘｅｎＩｉｗｔ　ｄｉｌｌＨｉｓ）を行ってＣｓＣ１を除 去した。このようにして調製したＤＮＡストックを以後のクローニングにおいて 使用した。

このＤＮＡを発現するには多くのベクターを使用し得るが、規制されたプロモー ターと温度で誘導しうるコピー数のコントロール遺伝子を有する発現ベクターが 、最高の生成物収率を与える点で好ましい。この実施例で用いた発現プラスミド ｐＣＦＭ　１１５６はプラスミドｐＣＦＭ８３６から容易に構築しうる。この構 築に関しては欧州特許出願第１３６．４９０号に記載されている。

端化した。次に、表Ｖに示すように置換ポリリンカーに連結する前に、ベクター をＣＩ暑ＩとＳ　ＩｃＩＩでダイジェストして存在するポリリンカーを除去した 。この置換ポリリンカーは上記のＡ　ｆｌｅｆｉらの方法に従って構築し得る。

発現ｐＣＦ　Ｍ　１１５６ブラスミド中での発現のコントロールは縮小ランブダ （１＊ｍｂｄｓ）　Ｐ　Ｌプロモーターによる。このプロモーター自体はｃ１８ ５７リブレツサー遺伝子のコントロール下にある（旦、■旦ストレインＫＩ２△ Ｈｌｒｐにおいてもたらされるのと同様）。

発現ベクターｐＣＦ　Ｍ　１１５６は、ＥＧＦセクションＩ及び■との連結反応 のための調製において、（２倍過剰量の）Ｘｂ畠１及びＨｉｅｌｌ［［でダイジ ェストされる。上記のように調製されたセフシロンｌ及び■のＤＮＡストックは （２倍過剰量の）Ｘｂ＊１とＫｐｎＩ　（セフシランり又はＫｐゎｌとＨｉｎｄ ■（セフシラン■）のいずれかによりダイジェストされる。すべての３つのダイ ジェストを５０ｍＭのトリス−アセテート中で作製した１、２％低溶融アガロー スゲル上にロードし、６ｏボルトで３時間電気泳動した。ゲルを１〜／ｍｌの臭 化エチジウム溶液で染色し、Ｕｖ先光下可視化した。直線化したベクターバンド 並びにＦＧＦセクションエ及び■のバンドをメスでゲルから切り取り、別々のチ ューブに入れ、７０℃で１５分間溶融した。直線化したベクターを含む溶融ゲル ５μを、セフシランＩおよび■を含む溶融ゲルの各々１０屑に加え、混合物を３ ７℃で平衡化した。溶融ゲルを２ｍ　ＭのＡＴＰを含む等量の氷冷２Ｘリガーゼ バツフア及び０５単位のＴ４リガーゼとすばやく混合し、１４℃で一晩培養した 。この連結反応ミックスのアリコートを、ＨｚＩｂ＊ｅ　（Ｊ　。

Ｍ　ｏｆ、　　Ｂ　ｉｏｌ、　１６６、５５７−５８０　（１９８３））記載の 形質転換プロトコルを用いて凍結賦活化（ｃｏｍｐ＠１ｔｎｌ）Ｅ、　ｃｏｌｉ Ｆ　Ｍ６ホスト株に形質転換し、２．５時間生育してカナマイシン耐性を発現さ せ、２０ＪＪ９／ｍｌのカナマイシンを含むルリアプレート上に置いた。１０ニ ーをニトロセルロースフィルター上でレプリカプレート化し、マスタープレート をセーブした。フィルター上のコロニーを２８℃で生育して直径約１＋ｍとし、 ３７℃に一装置いてプラスミドコピー数を増加させた。フィルターを６Ｘ標準食 塩水クエン酸塩バッＶｙ　　（ＳＳＣ，０，１５Ｍ　　ＮａＣＪ、　　Ｏ，ｌｌ ｌ５Ｍクエン酸ナトリウム）中６５℃で（遺伝子合成からの）放射性標識化オリ ゴヌクレオチド１８によりハイブリダイズすることによりスフリーリングした。

得られた２５のポジティブなりローンのうち、４つが選択され、５１１０ｍｌの 培地中で生育した。複製型ＤＮＡは、透明化培養液（ＩＨ＊ｌｅ）を用いてセク シタンエ及び■について述べたと同じように操作したのち、Ｃ５Ｃｊ平衡密度勾 配遠心分離法により調製した。これら４つのクローンを、発現ベクターの二重鎖 型をジデオキシシーケンシング反応に対するテンプレートとして用りて直接的に シーケンスし、すべての４つのクローンは正しいシーケンスを有することを明ら かにした。これらのクローンのうち１つをｒｂ−ｂＦＧＦの発現に使用するため に選んだ。これを以後ｐｃ　Ｆ　Ｍ　１１５Ｇ／　ｂＦ　Ｇ　Ｆと呼ぶ。

ｐＣＦ　Ｍ　１１５６／　ｂＦ　Ｇ　Ｆベクター中にこのように構築されたｒｂ −ｂＦＧＦ遺伝子についてのＤＮＡシーケンスを表１に示す。

表Ｖ Ｉ　　　　ＡＴＣＧＡＴＴＴＧＡｎＣＴＡＧＡＡＧＧＡＧＧＡＡＴＡＡＣＡＴＡ ＴＧＧＴＴＡＡＣＧＣＧＴ丁ＧＧＡＡＴ丁ＣＧＧＴＡＣＣＡs ＴＡＧＣＴＡＡＡＣＴＡＡＧＡＴＣＴＴＣＣＴＣＣＴＴＡＴＴＧＴＡＴＡＣＣＡ ＡＴＴＧＣＧＣＡＡＣＣＴＴＡＡＧＣＣＡＴＧＧＴＡ１皿、１２部２９−史１． ３５ｈ屯展３９肪４７且ｏＲＩＩ。

５３」■Ｃ１上１，５７８■１皿。

６１　ＧＧＡＡＧＣＴＴＡＣＴＣＧ、ＡＧＧＡＴＣＣＧＣＧＧＡＴＡＡＡＴＡＡ ＧＴＡＡＣＧＡＴＣＣＣＣＴＴＣＧＡＡＴＧＡＧＣＴＣＣＴＡＧＧＣＧＣＣＴＡ ＴＴＴＡＴτＣＡＴＴＧＣＴＡＧＧ＋ｂ−ｂＦＧＦの発現と精製 発　　現 製造株の一晩培養物を２０［／ｍｌのカナマイシンを含むルリアブロス（ルリア ブロス：バクトトリブトンｌｅｇ／ｎ、酵母エキスＳｇ／ｌ　、　Ｎａ　ＣＪ　 　５ｇ／Ｉ　）中で２８℃にて生育し、８１の発酵バッチへの接種に使用した。

この８！の発酵パッチ培地は４０ｇの酵母、４０ｇのグルコース、１０．の塩化 ナトリウム及び適当なバッファ塩、ビタミン溶液、少量の金属を含有していた。

デュアルフィードプロトコルを用いた。最初の供給液（１１）は４５０ｇのグル コース及び適当なビタミン類と塩類を含むものであった。

２００Ｄまで生育したのち、第二の供給を２００ｍ１／時間の速度で開始した。

この際温度は４２℃にシフトした。この供給液は２００ｇ／ｊのバクトートリブ トン、１００ｇ／ｊの酵母エキス及び１００ｇ／／のグルコースを含むものであ った。収穫時に細胞濃度が５００Ｄに達するように４２℃にて６時間生育を続け た。

精　　製 ガラリンホモジナイザーを用いて、互、■旦細胞を水中で破壊し、Ｊ６Ｂ遠心分 離機により　４．２にで４０分間遠心分離を行なった。５ＤＳ−ＰＡＧＥにより 分析するとｒｂ−ｂＦＧＦはペレッ゛トと上清の両方に認められ、上清中のタン パク買は６０〜７０％であった。そこで、ペレットを捨て、上清をイオン交換ク ロマトグラフィーにより精製した。トリス−塩基でｐＨ７，４に滴定Ｌり、＜７ ）チ、上清ヲＩｉＭ（７）　Ｄ　Ｔ　Ｔ　トＬ、４０ｇＭ）！Ｊスス−Ｃｌ　／ １ＬＭ　　ＤＴＴ／　ｐＨ７，４により平衡化したカルボキシメチルセルロース −セファロース（登録商標’）（ＣＭ−セファロース（登録商標）、ファーマシ ア、ウプサラ、スエーデン）と混合した。次いで樹脂を同じバッファーでバッチ 式に洗浄したのち、ＮａＣＪ濃度０から０．７Ｍまでの直線的グラジェント法に よりカラム式に溶出した。５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析に基づいて、０．５Ｍ付近での 単一ピークをプールした。このプールをトリス−塩基でｐＨ８，２に滴定し、冷 水で３倍に希釈し、４０１Ｍトリス−ＨＣ７／１■Ｍ　　ＤＴＴ／　ｐＨ８，２ 中のＣＭ−セファロース上にロードした。カラムを０．１５Ｍ　　ＮａＣｆで洗 浄したのち、ＮａＣｊ濃度０．ＩＳＭから　０．５Ｍまでの直線的グラジェント 法により溶出した。２つの小さなピークの間の主ピークをプールした。この主ピ ークは、非還元５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（わｏｎ　−ｒｅｄｓｃｉＢ　　Ｓ　Ｄ　Ｓ 　−Ｐ　Ａ　Ｇ　Ｅ　）による分析から、少量のダイマーを含み約９５％の純度 であることが判った。

プールを１Ｍ酢酸ナトリウム／ｐＨ４でただちに約ｐＨ５まで滴定してｒｂ−ｂ ＦＧＦ生成物の酸化を防ぎ、次いで２０−Ｍクエン酸ナトリウム／　Ｏ，ＩＭ　 　Ｎ　ａ　Ｃｊ　／　ｐＨ５中のセファデックスＧ−７５カラムに直接ロードし た。その結果、肩ピーク（ダイマーに相当するもの）と小さな化合物のピーク（ ＤＴＴのようなもの）との間で単一のピークとして溶出した。このピークのフラ クションをプールし、４℃又は−２０”Ｃにて、あるいは凍結乾燥して保存した 。ゲルが過における収率はほぼ１ｆｉＯ％であった。５６０　ｇの細胞ペースト から約１６０１冨の＋ｂ−ｂＦＧＦが得られた。

表■ ヒト基本フィブロブラスト成長因子／ペプチドシーケンス１　　　　　　　　　 　　　　１Ｌ　　　　　　　　　　　　　　２ＧＭｅ　ＩＰｒｏＡＩ　５Ｌｅｓ ＰｒｏＧ　ＩａＡｓ　ｐＧ　Ｉ　ＦＧＩｙＳｓ　ｒＧ　！７Ａ　ｌ　＊ＰｂｔＰ 　ｒｏＰｒｏＧ　１７１１ｉ@ＩＰｈｅＬ７５Ａｓｐ ＰｒｏＬ７ｓ＾ｒ　ＩＬｎＴ７　ｒＣ７ｓＬ７ｓＡｓｎＧ　ｌ　２Ｇ　ｌ　ｙＰ ｈｅＰｈｔＬｅｇＡ＋　ｇ　ｌ　ｌ　ｅＨｉ　５ＰｒｏＡｓ垂f　ＩｙＡｒ１ ０６Ｇ Ｖ＊　ＩＡｓｐＧ　ｌ　７Ｖ＊　ｌＡｒ　ｇＧ　ｌ＋＋Ｌｙ　ｓｓｅ　ｒＡｓ　 ｐＰ　＋ｏＨｉ　ｓ　Ｉ　Ｉ　ｓＬｙ　５ＬｅｕＧ　１ｎＬ獅f　ｌｎＡ　ｌ５ ＧＩｎＧ　Ｉｎ ＡｒｌＧ　ｌ　７Ｖ＊　ＩＶｔ　Ｉ　Ｓｓ　ｒ　Ｉ　ＩｅＬ７　ｓＧ　１７ＶＩ ＩＣ７＋Ａｌ　ｔＡｕ＋Ａｒ　ＨＴ７　＋ＬｅｕＡ　ｌ＊Ｍ■@１Ｌ７ｓＧＩ　 ｕ＾５ｐ Ｇ１７Ａ　ｒ　ＩＬｅ＋＋ＬｕＡ　ｌ　ｔｓｅ　＋Ｌｙ　５ｃ７ｓＶ＊　ｌＴｂ 　ｒＡｓ　ｐＧ　ｌ　ｏｃ７５ＰＩｕＰｈｓＰｈｔＧ　ｌ　高`　＋ｇＬｅｕＧ 　Ｉｓ ＋１０　　　　　　　　　　　　　　１２０Ｓｅ　ｒＡｓｎＡｓ　ａＴｙ　ｒＡ ｓ　ｎＴｈ　＋Ｔ７　＋Ａ　＋ｇＳｅ　ｒＡ　ｒｇＬ７　ｓＴ７　ｒＴｂ　＋５ ｅｒＴｒｐＴ７ｒＶ＊　hＡ　Ｉ　募ＬｅｕＬ７　ｓ ＋３０　　　　　　　　　　　　　　１４０＾ｒｌＴｈ＋Ｇ１２ＧＩｎ丁２ｒＬ ｙｓＬｅ＋＋Ｇ１７ｓｅ＋Ｌ７ｓＴｂ＋Ｇ１７ＰｒｏＧ１７ＧｌｎＬ７ｓＡｌｚ Ｉ　１ｔＬｅｕＰｈｅＬｅａＰ＋ｏＭ！１Ｓｔｒ＾ｌ＊Ｌｙｓｓｅｒ実施例５ ｒｂ−ｂＦＧＦのキャラクタリゼーシランｒｂ−ｂＦＧＦの活性を３Ｔ３細胞で の３Ｈ−チミジン取り込みにより試験した。４℃、−２０℃及び凍結乾燥で保存 したすべての調製物は、アッセイに用いた３Ｔ３細胞の特定の株に依存しつつ、 半分の最大活性について２０−　Ｎｏ　１１！／　ｍｌからのタンパク質濃度で 、投与量に依存した活性を示した。

最終生成物の一般的性質 ２８０／　２６０比　　　〜２．０ ＬＡＬ　　エンドトキシン活性 ＜　　　０．６　　　ＥＵ／ｍ１［０，６２３ＦＧＦＩ１ｇ）Ｄ　Ｎ　Ａ　　　 　　　　　＜　２０ｐｇ／　ｍｌ　（０，６２３Ｆ　Ｇ　Ｆ　＊）消衰係数（２ ７ｇａｍ）　　タンパク質０．１％に対して１．３純　　　度　　　　　　　　 　　〉９５％安定性 ｔｂ−ｂＦＧＦ調製物を４℃で異なったｐＨ値において培養した場合、ｒｂ　　 ｂ　Ｆ　Ｇ　Ｆは、鎖相互の間でのジスルフィド結合により　ｐＨ＞６．０で１ 以上のｂＦＧＦ分子から成るポリマーを生成し、ＡＨ−Ｐｒｏ結合が酸に不安定 であるために、ｐｎ　＜　４．０では分解が生じる。この情報に基づいて、ｐＨ ５のバッファーを選択した。この安定性のデータは、最終生成物中に存在する遊 離のスルフヒドリル基は鎖内部でのジスルフィド結合よりむしろ鎖相互の間での ジスルフィド結合を形成する傾向があることを示唆している。セファデックスＧ −７５ゲル濾過により測定すると、ｒｂ−ｂＦＧＦ調製物は明らかにモノメリッ クである。

実施例４に記載した方法で調製した精製＋ｂ−ｂＦＧＦタンパク質のコンホーメ ーシッン分析を、スルフヒドリル滴定、円二色性（ＣＤ）およびゲル濾過を使っ て調べた。

分子中のシスティン残基もペプチドマツプおよび配列分析から超精製尿素をＳ　 ｃｈｖ＊ｒｒ／　Ｍ　ＭＩ（ＣＩｅｗｔｌ＊ｎｄ、　ＯｂｉＯ）から入手した。

５．５′−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）　　（ＤＴＮＢ）はＳ　ｉ！ｉ ｇ　　Ｃｈｔｍｉｃ＊Ｉ　Ｃｏ■ｐｉＢ　（Ｓ　Ｌ　Ｌ　ｏｕｉｓ。

Ｍ　１ｓｓｏ＋＋ｒｉ）から入手した。組換えｂ−ｂＦＧＦを実施例４に記２０ ｍＭのクエン酸ナトリウムと　０．１ＭのＮａＣｊ中（ｐＨ５，０）ｒｂ−ｂＦ ＧＦを０．６２６■／　ｍｌ含む溶液１２ｍ１に、ＩＭのＴｒｉｓ　−ＨＣｊ　 　（ｐＨ８，２）中０．５Ｍのヨードアセト酢酸１．５ｍ１（最終的に５５ｍＭ ）を加え、次いで飽和トリス塩基を用いてｐＨ８，２に滴定した。混合物を室温 で１２時間放置した後、冷２ｈＭクエン酸ナトリウムと　０．１Ｍ　　ＮａＣ１ （ｐＨ５，０）で透析した。

充分に透析した後、タンパク質溶液を濃縮し、遠心分離にかけて僅少量の沈澱物 を除去した。スルフヒドリル基の滴定は、基本的に）ｌ＊ｂｂｅｂ　、　Ａ、　 　Ｆ、　　Ｓ、　Ａ、　　２ＳＭｅｊｈｏｄｓ、　　Ｅｎａｍｅｌ。

４５７−４６５　（１９７２）に従いＤＴＮＢを用いて行なった。

ゲル濾過は、２０ｍＭクエン酸ナトリウムと　０．１Ｍ　　ＮａＣ１■ （ｐＨ５，０）中のＳ　ｔｐｈ＞ｄ！ｘ　　　Ｇ　−７５カラム（２，５ｘ　１ １０　ａｍ。

ファーマシア、ウプサラ、スウェーデン）上、１ｍｌ／ｗｉ１１の流速で行なっ た。カラムは、ミオグロビン（１７ＯＮ）および牛血清アルブミン（６８００） で度盛しておいた。

タンパク室濃度は分光光度法で決定した。

ＵＶ吸収スペクトルは、Ｈｅｖｌ！■−Ｐ　＊ｃｋ＊ｒｄ　　Ｍ　ｏｄｅ１８４ ＳＩＡ　　ｄｉｏｄｅ分光光度計で測定した。円二色性スペクトルは、室温でＪ 　ｓｔｅＯＭｏｄｔｌ　　Ｊ　−５１１（ｌ　Ｃ分光施光計（ＯＫｉ　ＩｆＢｏ ｏ　ｍｏｄｅＮＯコンピューターを装着）を用いて測定した。各測定は、近ＵＶ および遠ＵＶ範囲それぞれにｌａｗおよびＯ，Ｄ２Ｃ１１のキュヴエットを用い て室温で行なった。データは、ｂＦＧＦの平均残余重量１１２を用いて計算し、 平均残余楕円率［ｅｌで表わした。

トリプシン消化は、トシルフェニルアラニルクロロメチルケトン処理トリプシン （Ｃｏｏｐｅｒ　Ｂ　ｉｏｍｅｄｉｃｔｌ、　Ｍ　ｒｌｗｔｒｎ。

Ｐ　！ｅｎｓｙ１ｗ＊ｎ１１）を用い、０．１Ｍ重炭酸アンモニウム（ｐＨ８， ０）中３７℃で４時間かけて行なった。ｒｂ−ｂＦＧＦ濃度は、酵素対基質比が ｌ：５０で０．５■／ｍｌであった。

ペプチド？−７プ作成は、Ｖ　ｔｄ＊ｃ　　Ｃ４ｔｙ　ラム（２１４Ｔ　Ｐ　５ ４）（Ｖｙｄｔｃ、　　Ｈｔ＋ｐｅｒｉｓ、Ｃｔｌｉｆｏ＋ｎ１ｘ）を利用する 逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィー（流速Ｇ、　ｌ１ｍ１　／　１ｉａ）で行なっ た。Ｏ％バッファーＡ（０，１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／水）から５０％ バッファーＢ（０，１％ＴＦＡ／９０％アセトニトリル／水）へ９０分かけて線 型グラジェントした。試料をＷｉｓｐ■（Ｗ　山ｒ　＋Ｃｏｒｐｏｒｗ口ｏ３　 Ｍ　１ｌｌｏ＋ｄ、　Ｍ　＊ｓｓ＊ｅｂｗｓｅＮｓ）のオートサンプラーコント ロールで注入した。自動ピーク検出モニターで２２ｈａのワラクシ９ンを集めた 。

配列分析は、Ａｐｐｌｉｅｄ　　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１１ ７、ＣＡ）の装置で行なった。Ｍｏｄｅｌ　４７０ＡおよびＭｏｄｅ１４７フＡ を使用した。Ｍｏｄｅｌ　４７０Ａ装置の場合、変性Ｒ２試薬を用いた（Ｌ＊ｉ 。

ＩＧ３Ａ　ｅ＊Ｉ、　Ｃｈｉｍ、　Ａ　ｃｌｉ、　２４３−２４８．１９８４） 。

結　　果 スルフヒドリル滴定は精製ｒｂ−ｂＦＧＦ調製物を用いて行なった。１．５ｖＭ のＥＤＴＡを含有する　０．１Ｍ　　ＴｒｉＩ−ＨＣＩ（ｐＨ８，０）でｒｂ− ｂＦＧＦを透析して得られた試料をＤＴＮＢで滴定すると、混合物は光散乱性と なり、吸収測定を不可能にした。そこで、透析ｒｂ−ｂＦＧＦ試料を、０．１Ｍ 　　Ｔｒｉｓ　−ＨＣＺと１．、ＳｍＭ　　ＥＤＴＡ中（ｐＨ１１，０）　６Ｍ グアニジウム−ＨＣｌ溶液の４倍容量で希釈し、直ちにＤＴＮＢ滴定した。この 試料の滴定から、１分子あたり約２．５モルの遊離スルフヒドリルが検出された 。

ＤＴＮＢ滴定実験は還元型＋ｂ−ｂＦＧＦについても行なった。

すなわち、０．１Ｍ　　Ｔｈ１ｓ−ＨＣＩと１．５ｓＭ　　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ中（ ＰＨ８，０）のｒｂ−ｂＦＧＦを最初に５［１ｓＭ　　ＤＴＴで還元した。２時 間のインキニベーシタン後、還元型ｒｂ−ｂＦＧＦを５％トリクロロ酢酸（ＴＣ Ａ）で沈澱させ、残余のペレットを５％ＴＣＡで３回洗浄した。最終ペレットを 少量のＲ２０で洗浄し、０．１Ｍ　　Ｔｈ１ｓ−ＨＣＩと１．５ｍＭ　　Ｅ　Ｄ 　Ｔ　Ａ中（ｐＨ８，０）６ＭＧＩゎＨＣｌでタンパク質を可溶化した後直ちに ＤＴＮＢ滴定した。これによると、還元型ｒｂ−ｂＦＧＦ１分子あたり約４モル の遊離スルフヒドリルを検出した。この結果を上記非還元型試料の約２の検出遊 離スルフヒドリルと合わせて考えると、ｒｂ−ｂＦＧＦ調製物は２つの遊離スル フヒドリル基をもっており、残りのシスティンが変性剤を使用しなくとも容易に 開裂できるジスルフィド結合を形成していることが示唆されている。

スルフヒドリル滴定は、Ｓ−カルボキシメチル化した（Ｓ−ＣＭ）ｒｂ−ｂＦＧ Ｆについても行なった。Ｓ−ＣＭｒｂ−ｂＦＧＦ試料を４０１Ｍ　　Ｔｒｉｓ　 −ＨＣｌ　　（ｐ）（７，５）で透析し、ＩＨｍＭ　　ＤＴＴで一晩処理した。

透析Ｓ−ＣＭ　　ｒｂ　−ｂＦＧＦを５％ＴＣＡで処理し、上記のようにして遊 離スルフヒドリル基を分析した。そうすると、Ｓ−ＣＭ　　＋ｂ−ｂＦＧＦ１モ ルあたり２モルの遊離スルフヒドリルが検出され、Ｓ−ＣＭｒｂ−ｂＦＧＦは還 元により２つの遊離スルフヒドリル基をもつことが判った。このことは、ｒｂ− ｂＦＧＦがカルボキシメチル化された２つの遊離スルフヒドリル基を有している ことを示唆している。

ペプチドマツプを、２つのシスティンがジスルフィド結合に関与しているか又は 遊離の還元状態にあるかどうかを調べるために利用した。トリプシン消化を利用 して、システィンを３つのペプチドすなわちｃ７ｓ−２６を含むｉ！４−２７； ｃ７ｓ−７０を含む６ｇ−７３およびｃｙｓ−８８とＣＦＩ−９３を含む１１Ｂ −９８に単離した。

トリプシン消化は、非還元の天然ｒｂ−ｂＦＧＦと非還元Ｓ−ＣＭｒｂ−ｂＦＧ Ｆに行なった。消化した後、得られたペプチドを逆相ＨＰＬＣで分離し、得られ たペプチドマツプを比較した（第５図）。システィン含有ペプチドにアセテート 基を導入すると、該ペプチドがより親水性となり、逆相ＨＰＬＣグラジェントで のより早い溶出が予期された。

第５図において、天然ｒｂ−ｂＦＧＦに対するＳ−ＣＭｒｂ−ｂＦＧＦでは２つ のペプチドピークがより早い溶出時間にシフトしていることが判る。１つのピー クシフトは２５分から１６分であり、他の１つは５７分から５３分である。これ らのピークを集め、配列分析で同定した。２５分で溶出するペプチドの配列を決 定すると、トリプシンペプチド６８−７３に相当していた。このペプチドはＣＦ Ｉ−７０を含んでいた。このペプチドは単一のピークを生スるので、システィン のうちの１つはジスルフィド結合に関与していないことが予想される。

５３分で溶出するペプチドの配列は２つあった。この領域の単一ピークがカルボ キシメチル化によりシフトし、こノ領域内に含まれるペプチドが２つの配列を生 ずることから、ジスルフィド結合をもつペプチドであると考えられる。５３分ピ ークからの２つの配列と全ＦＧＦ配列を較べると、これら２つの構成配列が２４ −２７ペブチドおよび８Ｂ−９８ペプチドに対応していることが判った。これら ２つのペプチドには３つのシスティンが存在する。

第１の配列サイクルにおけるカルボキシメチルシスティンフェニルチオヒダント インの同定から、他の遊離システィンとしてｃ７ａ−８８が判り、シスチン２６ と９３との間にジスルフィド結合の存在が示唆される。

Ｓ−ＣＭ　　ｒｂ　−ｂＦＧＦを実施例８のようにして３Ｔ３セル中で分析した 。これによると、Ｓ−ＣＭ　　ｒｂ　−ｂＦＧＦは天然分子に匹敵する程の活性 を有しており、分子中の遊離スルフヒドリル基が３７３セルのマイトジェン活性 必要でないことが示された。

円二色性スペクトルは、２Ｇ＋ｃＭクエン酸ナトリウムと　０．ＩＭＮａＣｊ！ 中（ｐＩ（５，０）のｒｂ−ｂＦＧＦを用いて得た。この結果を第６図に示す。

近ＵＶ　　ＣＤは、多くの極値をもつ強い負の楕円率を示している。２６２ｎｓ および２６ｈ＋＋の極値はフェニルアラニン残基によるものであり、２７Ｆ＋Ｆ ｌの極値はおそらくチロシン吸収から生じたものである（　Ｓ　ｊ＋１ｃｋｌｓ ｃｄ　、　２ｄ　　ＣＲＣＣｒｉｂ　Ｒｅｖ、　Ｂ　１ｏｃｂｅＩ１．　ｌＮ− １７５（１９７４））　ｏ　３０Ｌａｍから２９０１にかけてブロードな負の楕 円率がみられるが、これは芳香ＣＤと重なる。このＣＤバンドはジスルフィドに よるものであろうが、通常２４０１および２５０１にピークをもっている。した がって、ｒｂ−ｂＦＧＦの測定したＵＶ　　ＣＤは、ブロードな負のジスルフィ ドＣＤといくつかの芳香ＣＤシグナルで特徴づけられるものである。これらの結 果は、芳香残基が固い非対称環境下にあり、且つ、＋ｂ−ｂＦＧＦが顕著なター シャリ−構造をとっていることを示す。（Ｔｉｉ＊５ｂｅｌ＋、　　Ｖｏｌ、　 　１１　１ｎ　ｌｂｅ　　ＥｍＢｍｅｓ。

Ｂ　ｅａｒ　（ｅｄ、　３３７１−４４３　　（１９７０））。

Ｓ−ＣＭ　　ｒｂ　−ｂＦＧＦもＣＤで調べた。結果は、近ＬＴＶスペクトルも 遠ＵＶスペクトルも共にその天然タンパク質と同一であることを示した。このこ とは、２つの遊離スルフヒドリル基をＳ−カルボキシルメチル化しても、該タン パク質のセカンダリ−およびターシャリ−構造が明らかな影響を受けないことを 示すものである。このことは、Ｓ−カルボキシメチル化が該タンパク室の活性に 影響を及ぼさないという観察と一致している。

第６図に示す遠ＵＶ　　ＣＤは、不規則側構造に典型的なスペクトルを示してい るＣ　Ｇ　＋ｅｔｎｌｉｅｌｄ　＊ｎｄ　Ｆ　ｘｔｗａｎ。

Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉｉ！ｒｙ　８．４＋０８−４１１６　（１９６９））。

このスペクトルは２０２ｎＩｍに負のピークと２２５ＩＩＩＩ付近にブロードな 正のピークを示す。２０２ｃｍピークと、　２０５〜２２Ｏｎ！１に負の楕円率 がほとんどないことは、不規則セカンダリ−構造の典型的な特徴である。２２５ Ｉの正のピークはβ−ターンによるものであろう（ＣｈｚＢ　ｔｌ　ａｔ、、　 ９１Ａ　ｎｍ１．　Ｂ　１ｏｅｂｔｓ、　　Ｈ−３１［９？ｌ１））。したがっ て、＋ｂ−ｂＦＧＦのポリペプチドは不規則になっているものと思われるが、β −ターンをもつ顕著なターシャリ−構造に折り立たまれている。

２ｈＭクエン酸ナトリウムと　０．ＩＭ　　Ｎａｃｌ中（ｐＨ５，０）のｒｂ− ｂＦＧＦのゲル濾過によると、このタンパク質はミオグロビン（１７０００）と 同じ溶出位置で溶出した。ｂＦ　Ｇ　Ｆの分子量（１６０００）はミオグロビン のそれよりも小さいので、ゲル濾過の結果は、同タンパク質が若干非対称のコン ホーメーシロンをとっていることを示すものである。

この実験で使用したヒト訣静脈内皮細胞（ＨＵＶＥ）は、Ｇ１５ｂｒｏ＋ｅ　　 ｓｔ　　ｓｌ、１（＊ｍ■　　Ｖｓｓｃｗｌｔｒ　　Ｅ＋＋ｄｏｔｂｔｌｉｓｌ 　　　Ｃｔｌｌｓｉｎ　Ｃｗｌｌｗｒｅ、　　Ｊ、　Ｃ！ｌｌ　Ｂｉｏｌ。、６ ＆、１ｉ７３−６８４　　（Ｂ７４）の方法でＪ　ｗｄｉＮ＋　Ａ、　　Ｂ　ｔ ｒｌｉ＋ｅｒによって単離されたものである。細胞は、リン酸緩衝すリーン中０ ．１％ゼラチンを被覆した培養フラスコおよびそれぞれ３０分間ウシ胎児血清を 除いた培地中１０４／ｍｌのフィブロネクチン（Ｂ　ｏｅｈｒｉＢ＠ｒ　Ｍ■Ｉ ｌｈｔｉｍ、　Ｉ　ｎＭ＠ｌｈｅｉｍ。

Ｗ＜ｓｌ　Ｇ＊ｒｉ＊ｎ２）で被覆した培養フラスコ中に連続的に維持して継代 培養した。細胞を０．０１２５％トリプシン−０，００５％ＥＤＴＡでリリース し、１週間に１度１：２又は１：３でパスした。

使用した維持培地はＭ　ＣＤ　Ｂ　１０５　　（Ｉ　ｒｖｉｎＥＳ　ｃｉ＊１Ｎ ｉｃ。

Ｉ　ｒｗｉｍｅ、　Ｃｓｌ目ｏｒ＋＋ｉｓ）にベニシリアＧ（ｌＱ、：Ｌニー７ ト／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１Ｇ＃／ｍｌ）、ウシ胎児血清（２０％、ハ イクローン）、Ｌ−グルタミン（２ｘＭ）、ピルビン酸ナトリウム（ＩＩＭ）、 ヘパリン（４１１Ｎ　／　＋ｍｌ、　１７０ユニツト／■）および内皮細胞成長 助剤（Ｅ　ＣＧ　８．４ＤＩ４／ｍｌ、Ｃｏｌｌｒｂｏｒｓ目ｗｅＲｔｓｅ＊ｒ ｃｂ）を添加したものであった。細胞を２％Ｃ０２インキユベーター中で成長さ せた。

以下の実験は、Ｈ１ＪＶ内皮細胞に対するＦＧＦの３つの異なる形態、すなわち １）　　Ｅ、　ｃｏｌｉ誘導組み換えウシ塩基性ＦＧＦ　（＋ｂ−ｂＦＧＦ）； ２）　ウシ酸性ＦＧＦ　（ｂ−ｚＦＧＦ、特にウシ脳から精製したもの）； ３）天然ウシ塩基性ＦＧＦ　（ウシ下垂体から精製したｂＦＧＦ。

Ｓ　１ｌｓｓ　　Ｃｂｅｍｉｃｓｌ　Ｃｏｍｐ■ｙ、　　Ｓ　１．　Ｌ　ｏｍｉ ｓ、　Ｍ　ｉｓｓｏｗｒｉ）の成長助長活性およびマイトジェン活性を比較した ものである。

１つのウェルにつき　１００個の細胞を、４つの２４−ウェルプレートの中央８ ウエルに接種した。上記３つの繊維芽細胞成長因子のうちの１つを各ウェルに加 えた。ただし、コントロール用のウェルには該成長因子を添加しなかった。

最初に接種した日から５日および６日目に細胞に成長因子を供給した。接種後ｌ Ｏ０日目クリスタルバイオレット染色で培養物を分析した。

表■の結果から、ｔＦＧＦ又は天然ｂＦ　Ｇ　Ｆを含むウェルのコロニーよりも ｒｂ−ｂＦＧＦを含む８つのウェル中のコロニーがそれぞれ２０％および３２％ 多いことが判る。また、ｒｂ−ｂＦＧＦを含む全コロニーの７５％がＯ，ｉｓま たはそれよりも大であるのに対し、ＩＦＧＦおよびｖ−ｂＦＧＦを含ませて成長 させたコロニーそれぞれの５日％および５１％だけがこのような大きさでありた という事実も興味深いものがある。

ｒｂ−ｔＦ　Ｇ　Ｆ　　　　　　０１　　　　　　　　　２６５＊Ｆ　Ｇ　Ｆ　 　　　　　　２９３　　　　　　　　　１６１１天然ｂＦ　Ｇ　Ｆ　　　　　２ ６５　　　　　　　　１３４コントロール　　　　８０ 実施例８ Ｎｉｌ（３Ｔ３細胞に対するｒｂ−ｂＦＧＦバイオアッセイこのアッセイに使用 した細胞は、ＡＴＣＣから入手したＮＩＢ　　３Ｔ３細胞であった。この細胞を 、ＤＭＥ培地にペニシリンＧ（１０〜／ｍｌ）、ストレプトマイシン（ＩＪ＃／ ｍｌ）および仔ウシ血清（１０％）を加えて成長させた。細胞を１週間１；２度 １：４０でパスした。本アッセイの第１日目；；、全面継代培養物（ｓｗｔ＋… 目＊ｅ＋＋ｔ　ｃｗｌｔｗｒｅｓ）にトリプシンを分散させ、２４−ウェルプレ ートに、１■ｌあたり　２ｘ　１０’細胞濃度で、前言己成長培地を含むウェル １つあたり　１■ｌの割合で入れた。

５日目に培地を、ペニシリン、ストレプトマイシンおよび５％ヒヒト血小板血奨 （清澄へ、（リン化血清）を含むＤＭＥで置き換え、各ウェル１ｍｌとした。６ 日目に、ＦＧＦの実験試料およびコントロール試料を１００μｓよりも少なｔ１ 容量で培地番こ加えた。

１８時間後、５％仔ウシ血清および２μＣｉの”Ｈ−Ｍｅチミジンを含むＤＥＭ Ｌｍ＋を用いて、３７℃で１時間１；わたり細胞をパルスした。細胞を次いで１ ■ｌのリン酸緩衝すリーンＣＰ　Ｂ　Ｓ）および５％のトリクロロ酢酸それぞれ で１回ずつ洗った（両方とも４℃）。プレートを３０分間空気乾燥した後、１■ ｌの０．２５Ｍ　　Ｎａ０Ｉ（を各ウェルに添加した。室温で１時間経過後、各 ウェルの内容物を、１０ａ＋ｌのＡ…ｓｏｌ■ｎ　（Ｎ＠瞥　Ｅ　Ｂ１５ｎｄＮ 　ｓｃｌ！ｓｒ、　　Ｂ　ｅｓｊｏ＋＋、　Ｍ　ｉｓｓ＊ｃｂ＋５ｅｌＤ）を含 む別の計測ノくイアルに移した。Ｂ　！ｃｋｍ＊ｍ　　Ｌ　Ｓ　　？、　５００ シンチレーシ一ンカウンター（Ｂ　ｓＣｋｍ＊ｍｍ　　Ｉ　ｎｓｔｒｗｍｔ＋ｌ ＊、　　Ｉ　ｅｃ、、　Ｆ　ｗｌｌｔｒｌｏｎ、　　Ｃ５ｌｉｌｏｒｃｉ＊）の １１−３９７窓を介して試料を１分間にわたりカウントした。

組み換えｂ−ｂＦＧＦ標準物を、ｐＨ５のクエン酸ナトリウム緩衝液中６０　ｆ ｌｕ　／　ｍｌの濃度のストックから形成した。標準物の範囲は１ｍｌあたり　 ５〜１．’ＯＯＯｐｇであった。最大の３Ｈ−チミジン吸収を示す最大濃度標準 物は５００ｐ１であった。１４Ｇ−２１０Ｈの平均は、標識チミジンの最大導入 の半分であった。

実施例１で調製したウシｂＦ　Ｇ　Ｆ遺伝子のｂ−ｂＦＧＦをコードする遺伝子 への変換は、オリゴ部位特異的突然変異誘発によって行なった。

改質すべきセグメントをまず最初にファージベクターＭｔ３ｍｐ１８にクローン し、Ｅ、　ｃｏｌｉ　　Ｊ　ＭＩＯＩに形質転換して一重鎖ファージＤＮＡの成 長と調製を図った（Ｍ　ｅｓ＋ｉｎｇ、　　Ｊ　、　Ｖ　ｏｆ、　９゜Ｎａｃｌ 　、　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、、３０９−３２１　（１９８１））　ｏ約（１，５Ｉ ４の鋳型ＤＮＡを、５ｐｏｏｌの普遍Ｍ１３シークエンシングブライマーと５ｐ ｍｏｌの各突然変異誘発ブライマーと混合し、３分６５℃に加熱してその後ゆっ くりと冷却した。アニールした鋳型ブライマーを次いで、ＡＴＰ、デオキシヌク レオチドトリホスフェート（ｄＮＴＰ）ミックス、ＤＮＡポリメラーゼＩ　（Ｄ ＮＡ　　Ｐｏ１Ｉ）の大きいフラグメント（フレノウフラグメント）およびリガ ーゼに混合し、続いて１５℃で４時間インキニペートした。この反応混合物のア リコツトをコンピテントＥ、ｅｏｌｉ　　ＪＭＩＯＩ細胞に形質転換し、０．７ ％ルリアアガーに入れた。３２Ｐ標識突然変異誘発ブライマーを用いるレプリカ ニトロセルロー、スフイルターの交雑により、突然変異ファージを含むプラーク を選択した。−木調ＤＮＡをポジティブスクリーニングプラークから調製し、ジ デオキシチェインターミネータ−法を用いてその配列を確めた。

形成されたアミノ酸変化および使用した対応突然変異誘発ブライマーは、 ｐｒｏ−１２９から　ｓｓ＋−１２９）　　５’　ＧＡＣ□ＣＡＧ丁ＣＴＴＣＧ ＡＡＣＣＣＡＧＴＴＴＧＴＡ　　３’５ｅｒ−ＩＮから　ｌｂ、−１１３）　　 ５’　ＣＡＴＡＣＣＡＧＧ＾＾ＧＴＧＴＡＴＴＴＡＣＧＡＧＡ　　３’であった 。

ブライマーは、ｂＦＧＦ遺伝子の非転写鎖に相当する。

例４のように成長させた。細胞を破壊して低速遠心分離にかけると、ｒｂ−ｂＦ ＧＦ（票■）は上清フラクシヨンおよびペレットフラクシタンにも存在していた 。ペレットからの精製には変性剤による可溶化を必要とするが、続いて再生され て活性物質を得る。しかし、このようなステップは、下記するように、上清フラ クッションからの精製には必要でない。このフラクシツンを４０５Ｍ　　Ｔｒｉ ｓ　−ＨＣｌ　　（ｐＨ７，４）中のＣＭ−セファロースカラムに供給して、線 型ＮａＣｊグラジェントで溶出した。次いでｒｈ−ｂＦＧＦ含有フラクションを 同じ樹脂（ただしｐＨ８，２の４０■Ｍ　　Ｔｒｉｔ−ＨＣｌ中）に結合させ、 再び線型ＮａＣｊグラジェントで溶出した。これら２つのクロマトグラフィーに おいて、１ｉＭＤＴＴを含有させ、酸化を防止した。

さもないと、分子間ジスルフィド結合が形成されるからである。

得られたタンパク質を更に、’ｌ　Ｏｍ　Ｍクエン酸ナトリウムと　０．１■ Ｍ　　ＮａＣ１中（ｐＨ５，０）のＳ　ｔｐｈｘｄｔｔ　　　Ｇ　−７５カラム （ファーマシア、ウプサラ、スウェーデン）でゲル濾過することにより精製した 。Ｅ、　ｃｏｌｉ細胞からｒｂ−ｂＦＧＦを精製する最初の試みによると、１ｍ ＭのＤＴＴを精製段階を通じて含有させなかった場合ダイマーが容易に形成され た。ヒト　ｂＦＧＦの精製は、実施例４に記載したウシ材料と本質的に同じ方法 で行なった。精製の各段階において＋ｂ−ｂＦＧＦとｒｂ−ｂＦＧＦとの間には 何の相違も認められなかった。還元条件下に５ＤＳ−ＰＡＧＤ上で調べると、＋ −ｂＦＧＦは、モノマーの分子量に相当する１６．５００ダルトンに主バンドを 有しており、おそらくダイマ一体およびテトラマ一体を表わすであろうと思われ るより大きい分子量のところに副バンドを有していた。（第４図参照）。非還元 条件下に操作すると、より大きい分子量バンドが多数表われていた。精製ｒｈ− ｂＦＧＦのアミノ酸配列分析から、メチオニンが殆んどの材料から開裂されてし まっており、Ｎ末端で７０％プロリン、１３％アラニンおよび１７％だけのメチ オニンが得られることが判った、天然ｂＦ　Ｇ　Ｆと同じように、ｒｈ−ｂＦＧ Ｆはヘパリンに強い親和性を示し、約１．５〜２．０ＭＮａＣｊでヘパリンセフ ァロースカラムから溶出する（データは示さない）。

ｒｂ−ｂＦＧＦの活性を、実施例８に記載したようにしてに示すように、このア ッセイにおいて、ｒｋ−ｂＦＧＦはｔｂ−ｋＦ　Ｇ　Ｆと本質的に同一の活性を 示し、その約１５０〜２０１１　ｐｔ／ｍｌの用量はＤＮＡ合成の最大刺激の半 量である。

本ＨＵＶＥ細胞アッセイは実施例７の記載と同様にしたが、アッセイの接種およ び時間にわずかの変更を加えた。

ｒｈ−１＋ＦＧＦを添加した場合には、成長因子を含まないコントロールに較べ て顕著な細胞増殖が認められた。組み換え体のウシｂＦＧＦとヒト　ｂＦＧＦの 間に大きな差はなかった。

表　　■ 成長因子　　　全コロニー　　　大きいコロニーｔｈ−ｂＦ　Ｇ　Ｆ　　　　　 　　１６　　　　　　　　２２ｒｂ　−ｂＦＧＦ　　　　　　６８　　　　　　 　　１９コントロール　　　　　２３　　　　　　　　０すべての繊維芽細胞を 、ｌｈｇ／＋ａｌの濃度で、接種時および接種後３日と６日目に加えた。細胞を 染色し、９日目に計測した。

径が０．５■−よりも大きいコロニーを「大きいコロニー」とした。

実施例１３ ｒｂ−ｂＦＧＦアナログの調製 ｔｂ−ｂＦＧＦの安定性を向上させ且つ精製を高めるために、オリゴヌクレオチ ド部位特異的突然変異誘発を使用してヒトｂＦＧＦ遺伝子を変性し、システィン 残基のいくつか又はスヘてをコードする配列がセリンをコードするようにした。

ウシｂＦ　Ｇ　Ｆ遺伝子も同様の方法で変性でき、システィン残基の１つ又はす べてをコードする配列が他のアミノ酸たとえばアラニン、アスパラギン酸、アス パラギンをコードし得ることが判り、た。４つのオリゴヌクレオチドを合成し、 それぞれを下記表に示す。

表■ オリゴヌクレオチド　　　　　配　　　列　　　　　　　　コード変化１０２− ２１　　　　　５’＾ＣＣＧＴＴ丁ＴＴＧＧＡＧＴＡＣＡＧＡＣＧ　　３’　　 ２６番目のＣＹＳをＳＥＲに１０２−２２　　　　　５’　ＣＣＧＧＴＴＡＧＣ ＡＧＡＴＡＣＡＣＣＴＴＴ　　３’　　７０番目のｃｙｓを５ＥＩＩに１０２− ２３　　　　　５’　ＧＴＣＡＧＴＡＡＣＡＧＡＣＴＴＡＧＡＡＧＣ３’　　８ ８番目のＣＹＳをＳＥＲに１Ｇ２−２４　　　　　５’　ＧＡＡＡＡＡＧＡＡＡ ＧＡｎＣＧＴＣＡＧＴ　　３’　　９３番目のＣＹＳを５ＥＩＩに最初の突然変 異誘発はオリゴヌクレオチド１０２−２２と１０２−２３を使用し、　７０番目 と８８番目のシスティンをセリンに変えた。次いで、システィンの６つの可能性 あるペアーのすべてをセリンで置き換えた遺伝子を構築し、４つのシスティンの すべてをセリンで置き換えた１つの遺伝子を構築した。これらの突然変異遺伝子 の構築に使用したオリゴヌクレオチドを次表に示す。

表　　Ｘ 、ア　＋　。　グ　　　　突然変異誘発に使用したオリゴヌクレオチド セリン　フＯ，ａｌｌ　　　　　　１０２−２２．１０２−２３セリン２６．　 Ｈ１０２−２１，１０４−２４セリン２６．７０　　　　１０２−２１．１０２ −２２セリン２６．８８　　　　１０２−２１．１０２−２３セリン７１１．９ ３　　　　１０２−２２．１０２−２４セリン８８．９３　　　　１０２−２３ ．１１１２−２４セリンＨ，７０，８１１，９３１０２−Ｈ，１０２−２２，１ ０２−２３，１０２−２４突然変異誘発反応および交雑による形成プラークのス クリーニングに使用するオリゴヌクレオチドを変えただけで、すべての突然変異 誘発反応を本質的に同様の方法で行なった。ｌｅｄの７０ａＭ　トリス、１０　 ｓ　Ｍ　　Ｍ　ｇ　ＣＪ　２および５■Ｍ　　ＤＴＴ中の１ｍＭ　　ＡＴＰとポ リヌクレオチドキナーゼｌＯ単位を用いて３７℃で３０分間インキニベーシーン することにより、Ｍ１３普遍ブライマーおよび上記ブライマーの各々のｉｌｌ　 ｐｅｅｌｓをリン酸化した。

各キナーゼ処理したオリゴヌクレオチド５ｐｍｏｌｅを約０．５〜の一木調Ｍ　 １！ｉｐ１ｇ／　ｔｂ　−ｂＦ　Ｇ　Ｆと混合し、６０℃に加熱し、次いで室温 まで冷却することによって再生した。この鋳型／プライマー混合物に、ｄＡＴＰ 、　　ｄｃＴＰ、　　ｄＧＴＰ、ＴＴＰ各々を２５−Ｍ含むＩＩＩＩｌの溶液、 ２単位のＴ４リガーゼ、および８単位のＤ　Ｎ　Ａ　　Ｐ　ｏｆ　Ｉ大フラグメ ントを加えた。この混合物を１４℃で４時間インキエベートした。連結反応混合 物のアリコツトをＥ、　ｃｏｌｉ　　Ｊ　ＭＩＯＩに形質転換した。このＥ、　 ｃｏｌｉ　　ＪＭＩＯＩは、５０■Ｍ　　Ｃｎ　Ｃｊ　２でコンピテントにされ ているものであり、予じめ注いだ１．５％シルリアアガープレート上１１．７％ ルリアアガーに接種していたものである。得られた清澄なプラークについて、ニ トロセルロースフィルター上ヘリフトし、該フィルターを交雑により適当なラジ オ標識オリゴヌクレオチドにスクリーンした。各プローブを使っていくつかのポ ジティブが得られた。ポシティブブラークを取り出し、突然変異誘発の第２ラウ ンドにおいて鋳型として使用するため一本鎖ＤＮＡを調製した。所望の構築がな されたなら、複製型ＤＮＡを細胞リシスによって精製し、ＣｓＣ１密度グラジェ ントでバンドに分けた。変性遺伝子を次いで、Ｅ、　ｃｏｌｉ発現用のプラスミ ドベクターｐｃ　Ｆ　Ｍ　１１５６に転移させた。変性遺伝子は、ＸｂａｌとＨ ｉｍｄｌｌを用いる開裂によりそのＭ１３ベクターから切断し、アガロースゲル 電気泳動法で精製した。この精製フラグメントを次にＸｂａｌ／Ｈ４ｎｄｌｌ［ 切断ｐＣＦ　Ｍ　１１５６に結合させた。この新しい構築物を発現用のＥ、ｔｏ ｌｉ株はＦＭＳに組み入れた。セリン−ＴＧ、８Ｂとセリン−２６，、，９３ア ナログを発現ベクターに転移させた。

生産株の成長とそれに続くセーリンーＴｏ、８８アナログの精製を、実施例４に 記載したｒｂ−ｂＦＧＦと、ｒｈ−ｂＦＧＦと同様に行なった。ただし、ＤＴＴ はすべての精製段階から削除した。ＤＴＴを用いなくともよい。というのは、精 製段階においてｂＦＧＦの二量体化の原因となるシスティン残渣が除かれている からである。このようにして、セリン−７０，８８アナログは、天然配列型の　 ！−ｂＦＧＦよりもはるかに優れたものとなる。なぜならば、それは検出し得る 二量体不純物を含んでおらず、且つ、経時的に二量体を形成しないからである。

これは、遊離のスルフヒドリル基が欠落していることによる。更に、還元剤を加 える必要がないので、調剤上の問題もなくなる。

セリン−２６，９３アナログは、組み換え体であるウシおよびヒト　ｂＦＧＦ並 びにセリン−７０，，１１８分子と同じような挙動をとらなかった。おそらく、 それが天然ｂＦＧＦのジスルフィド構造をもっていないからであろう。精製中、 大部分のセリン−２６，９３アナログは分解した。このような分解は、７Ｍ尿素 の存在下でｒｂ−ｂＦＧＦを精製する場合にも生じた。７Ｍ尿素は分子のターシ ャリ−構造を変性するものである。実施例４および実施例ｉに記載したように上 清から精製するとき、セリン−１２６、９３アナログはセリン−７０，８８アナ ログと同じ生物学的活性をもっていないようであるが、その不活性アナログはア ンタボニストス又は遮断分子として利用できる。

封入体からセリン−２６，７０，８８，９３アナログを精製した場合、驚くべき ことに、上清からよりも、明らかな非遊離スルフヒドリルの変、化にもかかわら ず、活性アナログが得られた。

オリゴ特定部位の突然変異誘発を使用して、ｈ−ｂＦＧＦに対する合成遺伝子を 実施例９に記載のように一般的に変更して４つのシスティンコドン全てをセリン 残基をコードするヌクレオチドで置き換えた。対応するタンパク質をＥ、Ｃｏ１ １で発現させ、尿素中可溶化の後、一連のカラムクロマトグラフィーおよび折り 返しステップにより封入体から精製した。システィン残基をもたない得られたタ ンパク質は、分子内あるいは分子間ジスルフィド結合のいずれも形成不可能であ る。それにもかかわらず、このアナログタンパク質はＮ！Ｔ　３Ｔ３細胞で天然 配列により発現したものと区別できないマイトジェン活性を示すことが知見され た。

オリゴ特定部位の突然変異誘発 前に構築したｂＦＧＦアナログ遺伝子（該遺伝子中システィン７０および８０に 対するコドンはセリンコドンに変換した）を突然変異誘発用の開始鋳型として使 用した。約０．５／Ｉｇの鋳型ＤＮＡをｓｐｍｏｌのユニバーサルＭＵシークエ ンスプライマーおよび５ｐｉｏ、ｌの各突然変異誘発ブライマーと混合し、６５ ℃に３分間加熱しゆっくり冷却するよう放置した。アニールした鋳型−ブライマ ーをＡＴｆ　、　ｄＮＴＰミックス、ＤＮＡ　Ｐｏｌ　　Ｉ大フラグメントおよ びリガーゼと混合し、１５℃で一晩インキユベートした。この反応混合物のアリ コートを適当なＪＭＩＯＩ細胞に形質転換し、０．７％Ｌｕｒｉｔ寒天に塗布し た。各々３２Ｆでラベルした突然変異誘発ブライマーを有するレプリカニトロセ ルロースフィルターのハイブリダイゼーシヨンにより、突然変異体ファージを含 むプラークを選択した。両方のハイブリダイゼーシランスクリーニングにおいて 陽性であったプラークから一本鎖ＤＮＡを調製した。所望の配列の選択は、ジデ オキシ読み終わりＤＮＡ配列決定法を使用して確認した。作られたアミノ酸変化 および対応する突然変異誘発ブライマーは以下のようであった。

Ｂｓ−２６〜５ｔｒ−２６５’　ＡＣＣＧＴＴＴＴＴＧＧＡＧＴＡＣＡＧＡＣＧ 　３’ｃ７ｓ−９３〜５ｅｒ−９３５’　　ＧＡＡＡＡＡＧＡＡＡＧＡＴ丁ＣＧ ＴＣＡＧＴ　　３’両ブライマーはｂＦＧＦ遺伝子のアンチセンスストランドに 対応突然変異誘発ｂＦＧＦ遺伝子含有プラスミドを含むＥ、Ｃｏ１１細胞を２Ｘ 　Ｌ＋＋＋ｉｓブｏス中３０℃で約３０℃Ａ６０Ｇまで増殖し、４２℃に移すよ りもｂＦＧＦの発現を誘導した。−晩増殖後、細胞を遠心分離によって回収し、 １０，０００ｐｓｉのフレンチプレスを３回働かせることにより破壊した。封入 体中にトラップされたｂＦＧＦを含む不溶性物質を低速遠心分離で回収した。封 入体は尿素に可溶化し、陽イオン交換およびシリカカラムクロマトグラフィーに 付した。

部分精製化アナログを希釈を重ね、陽イオン交換クロマトグラフィーによりほと んど均賀に精製した。破壊したＥ、Ｃｏ１１細胞の可溶性フラクシーンから一連 のクロマトグラフィーステップを利用して組み換え体天然配列ヒトｂＦＧＦを精 製した。

Ｎ１１１３７３細胞におけるマイトジェネシスアッセイアナログｂＦＧＦの生物 学的活性を、実施例７に記載のようにして、Ｎｌｌ＋　３τ３細胞の全面培養に おける　３Ｈ−チミジン取り込みを刺激するその能力によって試験した。第７図 はセリン−２６，１０゜８８、９３アナログおよび天然配列ｈ−ｂＦＧＦに対す るマイトジェン活性の濃度依存関係を示す。実験誤差内において２つのプロフィ ールは区別できないが約１５０ｐｇ／ｉｆの投与量で見られた５０％最大マイト ジェン効果を有する。これらの結果は、少なくともアナログを上清からよりも封 入体から精製する場合、レセプター介在マイトジェン活性に求められる配列が４ つのシスティン残基の置換によって変化しないことを示す。

ｒｂ−ｂＦＧＦアナログの生物活性は実施例７および８のウシ形態について記載 したように特徴づけられる。ＮＩＢ　３丁３細胞におけるマイトジェンアッセイ での＋ｂ−ｂＦＧＦセリンーＴ０．８！ｌアナログの５０％最大活性（実施例８ ）は、第３図に示したように　ｒｂ−ｂＦＧＦおよび＋ｈ−ｂＦＧＦのものと同 じである。予期通りこのアッセイでセリン−２６，９３アナログは活性を示さな かった。

更にセリン−７０，８８アナログを、実施例７に記載のように１１０ＶＥ細胞の 成長を維持させる能力を試験した。ｒｂ−ｂＦＧＦセリン−Ｔｏ、　８１１アナ ログは培養におけるＩＩＵＶＥ細胞の成長促進においてｒｂ−ｂＦＧＦおよびｒ ｈ−ｂＦＧＦと同様の効果を有した。

表　　ＸＩ 成長因子全コロニー　　　　大コロニー５ｔｒ−７０，８８８４２４ ｒｂ−ｂＦＧＦ　　　　　　　　　　　　　フロ　　　　　　　　　　　　　　 　　２２ｒ　ｂ　−ｂ　Ｆ　Ｇ　Ｆ　　　　　　６Ｂ　　　　　　　　＋９コン トロール　　　　　　２３　　　　　　　　０各々約３１と秤量した二ニーシー ラントシロウサギに５■ｇ／ｋＨＲｏｍｐｍｎ■（Ｆｓ山山１山ｃｍ、　ＢｓＨ ｒ、西ドイツ）を鎮静薬として使用して筋肉内投与で麻酔をかけ、更に（１１１ 分後）約５０〜６０ｉＨ’／ｋ（ケタミンを筋肉内投与した。各ウサギの重さを 量り記録した。小さい綿またはガーゼの栓をウサギの両耳に詰め、動物用クリッ パー（＃４０ブレード）を使用して両耳の内側表面および外側の縁を剃った。市 販されているＮ！ｅｔ■脱毛剤クリームを両耳の内側表面に塗布し、１０分経過 後乾いたガーゼで取り除いた。耳の内側表面を生理食塩水含浸ガーゼで拭き、７ ０％アルコール溶液を塗布した。ウサギの片耳の内側表面の皮膚を３０ゲージニ ードルを使用して１：１ＯＯＯエピネフリン（これは　１．５〜３　ｃｃの全容 量を要する）を含む２％キシロカイン溶液で耳を浸透させて漂白した。浸透領域 をＢｅｌ＊ｄｉｎｓの次に７０％アルコール溶液で擦るサイクルを３回行つた。

このとき必要により耳栓を乾いた栓と取り替える。

ウサギを滅菌した手術室に移動した。漂白した耳を、２つのパークランプ（一方 は動物の耳の先端、もう一方は付は根）を利用して血液供給を傷つけることなく ウサギの耳を固定させるプレキシガラスのｒｅｓｒ　ｂｏｓｒｄ　Ｊ　（Ｗ■ｂ ｉＢ＋ｏｎ　ＵｎｉｙｓｒｓｉｌｒＩＪＣｄｉｅＩＩ　Ｃｃｅｔｅｔ、　Ｄｉｖ ｉｓｉｏｎ　ｏｒ　Ｔ！ｃｈｆｆｉｉｃｒｌ　５ｅｒｖｉＣ＠ｓ）上に固定した 。動物を覆い、Ｂｅを畠ｄｉａｅをスプレーした手術領域（即ち漂白した耳の内 側表面）を乾燥のため３〜５分放置した。

創傷処理（ＷｏｍＩｄｉａｇ） 創傷処理中滅菌操作を施した。耳の内側を６　ｍ＋＋生検パンチで切り口をつけ 、生検部位は顕微外科ピンセット、朧切除鋏、刃先が丸い２ｍｓ　Ｌｔｍｐｔｒ ｔ骨膜起子およ骨膜菌子綿棒を使用して軟骨をむき出しにした状態まで全組織お よび繊維（骨膜を含む）を取り除いた。軟骨をパンチで完全に切り抜いた生検は 実験目的には使用しなかった。ただし軟骨の部分的厚切り口は許容可能とみなし た。軟骨中のいかなる傷もしくは自然の孔の位置を注意して記録した（回収日に おける参考のため）。滅菌した綿棒で生検部位から血液を取り除き、気をつけて 創傷中が血液過剰になるのを避けた。完成した各生検を生理食塩水で含浸したガ ーゼの小片で覆った。４つの生存可能な生検を傷つけた真上、（耳をボード上に 固定したとき折って決定した）中線の両側に２つずつ配置した。いかなる場合も 各耳に全部で５個より多いの生検は配置しなかつた。生検は最低１ｃ■離して配 置した。

一つの耳を終えると、耳を生理食塩水で湿らしたガーゼで覆い、ＦＧＦの塗布ま で湿らせたままにするようガーゼの周囲をテープで閉じた。第２の耳を第１の耳 と同じ方法で漂白し、擦り、固定し、傷つけた。第２の耳の生検部位から血液を 取り除き、完成した各生検を生理食塩水で含浸したガーゼの小片で覆った。

第２の耳が済んだら、これもＦＧＦの塗布まで生理食塩水で湿らしたガーゼで覆 った。操作中この時点まではいつでもウサギが麻酔から回復する徴候を見せたら 、２５Ｂ／ｋｇケタミン筋肉内投与により再麻酔した。

ＦＧＦ調製物の塗布 第１の耳からのみ湿らしたガーゼを除き、耳の傷ついていない表面をガーゼで穏 やかに拭いて乾かし、ＦＧＦをまず第１の傷つけた耳に塗布した。全ての生検を 滅菌した綿棒で血液もしくは過剰の流体を穏やかに取り除いた。注意して生検を 避けながら耳の傷ついていない表面に複合ベンゾインチンキを塗り、３〜５分空 気乾燥させた。

１１ｄｅｒｍ”　（ＣｏｌｌＢｅｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）中淘のｒｂ−ｂ ＦＧＦまたは＋ｅ＋−７０．　８８　＋ｂ−ｂＦＧＦを、低いデッドスペースの Ｏ，Ｓｃｃまたはｌｃｃシリンジ［Ｂｅｃｌｏｎ−Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）に永久 固定した２６ゲージのニードルまたはマイクロピペッタ−を使用して各生検に塗 布した。

生検はは最大１０２５　ｅｅの粘性ｂＦＧＦ−２７ｄｅｒｉ■調製物を収容可能 であった。　１つの生検にＦＧＦを塗布した後、生検部位にいかなる気泡もしく はしわも生じぬように注意しながら密封包帯Ｔｅｇ１ｄｅｒｉ■（３Ｍ　Ｃｏｒ ｐｏ＋ｇｌｉｏｍ、　ｌ１ｉｎｃｅ＊ｐｏｌｉｓ、旧＋ｎｔｓ山）で直ちに覆つ た。Ｔｅｇ山ｒｍ■は約２ｃｉのサイズに予め切った。この操作を真上の各生検 に繰り返した。いずれの失敗した生検も感染の危険を最小にするため１甲ｄｅｒ ＩＩＯで覆った。第１の耳が済んだら、残る耳から湿ったガーゼをはずして操作 を繰り返し、滅菌済綿棒で全ての生検の血液または過剰の流体を穏やかに取り除 くことを確実にした。′ 外科手術をする調査員の観察下でウトギを麻酔から回復させた。回復中、傷口ま たは包帯を引き裂くことからウサギを守るため、約１５〜２５ｃｍ外側に伸びた プラスチックのカラーをウサギの首の周りにはめた。ウサギを離れたケージに戻 し、回収までそるままにした。カラーをはずしたウサギの傷口、および回収日前 に何らかの方法で丁ｃｇｓｄｅ＋ｍ■を引き裂いたものの傷口は、問題が認めら れたらすぐに再評価し、傷口が痛んでいるようであったら分析からはずした。

回　　収 創傷処理後７日目に予備操作準備に記載したのと同じ方法でウサギに麻酔をした 。各ウサギを秤量し記録し、特にＴＢ＊ｄｓｒ＋ｃ■の有無および包帯の下の過 剰の流体の有無に注意して創傷の状態の質的記述を記録した。ウサギを心臓内注 射処理により５０ｃｃ／に１空気塞栓症でと殺し、ナイフハンドル上に固定した ＃１５外科用ブレードを使用して体から両耳を切断した。

任意の側の約５Ｈの周囲の組織とまだ無傷のＴ甲ｄｅｒ−を有する各生検を耳か ら切開し、軟骨中の自然の孔もしくは傷を通って三等分することを避けるために 創傷処理日にとった記録を参照してながら、生検部位を中線で正確に三等分する ために測定した。生検を傷口の状態を壊さないように単一の下向き動きを使って 一枚刃の剃刀で注意して三等分した。三等分した生検はウサギの識別番号をラベ ルしたカセットに直ちに置き、組織学的処理および定量分析用の適当な固定液中 に置いた。

定量組織学的分析 三等分した創傷を通るよう注意して向きを合わせた横断面を埋め込み、切断し、 ヘマトキシリンおよびエオシンの混合物またはＴｒｉｃｈｒｏｍのいずれかを使 用して染色した。真正の創傷中心を通る横断面を得るために切断の荒さを最小限 にした。第８図に示すように、実施した測定は創傷を横切る再上皮化ギャップ（ ＥＧ）、傷口の縁（両側の平均）における創傷の肉芽組織の最大高さＣＭｌり　 、傷口を横切る肉芽組織ギャップ（ＧＴＧ）を含む。目盛り付レンズマイクロメ ーターを使用しミリメーターに換算（ｗｍ）する２人の別々の観察者によって予 備コード化したスライド上で測定を手探りで行った。

コードを解き、データを統計学的に分析した後、両観察者の測定の平均を算出し た。観察者間の差が１０％より大きい場合にはスライドを再分析した。得られた データは表ｘ■に示す。

ｒｂ−ｂＦＧＦ コントロール　　　　　ｒｂ−ｂＦＧＦ創傷の数　　　　　　　４１２２ 全回上皮化の頻度　　　２４％　　　　　　　　５０％Ｇ　　Ｔ　　Ｇ　　　　 　　　　４．６８±０．１２　　　　　４．ｔ６±０．１３新しい肉芽組織 のＭｌ（（ｍｓ）　　　　　　０．７６±０．０３　　　　　０．７９±０．０ ２５ｔｒ−７０，Ｈｒｂ−ｂＦＧＦ　７ナログコントロール　　　５ｅｒ（７０ ，８８）　ｒｂ−ｂＦＧＦ創傷の数　　　　　　１２６　　　　　　　　　１３ 全再上皮化の頻度　　　２２％　　　　　　　　６９％Ｇ　　Ｔ　　Ｇ　　　　 　　　　４．４１±０．０９　　　　　３．８５±０．１４新しい肉芽組織 のＭＨ（ａｍ）　　　　　　０．６０±０．０１　　　　　０．７４±０．０４ データは平均値上標準誤差として表される。

！７ｄｅｔ−調製物中のｒｂ−ｂＦＧＦと５ｅｒ−７０，８８ｒｈ−ｂＦＧＦの 両方は再上皮化で顕蕃なプラスの効果を有したが、５ｅｒ−Ｔｏ、　８８　ｒｂ −ｂＦＧＦの効果がいくらか大きかった。ただし新しい肉芽組織の組成はｓ！ｒ −７０，Ｈｒｂ−ｂＦＧＦｌ：よッテ著しく影響サレタカ、　ｒｂ−ｂＦＧＦは 何の作用もないようであった。この相違は、天然配列物質と比較して５ｓｒ−７ ０，８８ｔｈ−ｂＦＧＦの亢進安定性によって説明し得る。ＦＧＦをいったんこ の調査、即ち創傷処理時に塗布しただけで、ｚ山ｒｍ■コラーゲン中の安定性が 肉芽組織形成におけるプラスの効果を生成するのに重要となり得た。本発明のｂ ＦＧＦアナログを使用する他の創傷治療および外科手術は当業者に明らかである 。

前記の詳細な実施例を考慮すれば本発明の実施における多数の改良および変形も 当業者に明らかである。従って、本発明は添附した請求の範囲を参照する範囲に のみ制限されるべきである。

３．０− ＦＩＧ、４ 今　　ＦＩＧ、５ｂ ［ｅｌ　（ｄｅｇ　−Ｃｍ２　／ｄｅｃｉｍｏｌｅ　）（ａｌｏｕ、＋ｐｅり／ ２ｕＪ：）−５ａｐ　）、−ＯＬ　Ｘ　［ｅｌ−トミジン融ソｅニーｉ−（％） ＦＩＧ、８ 手続補正書動式） ％式％ ２、発明の名称　　　繊維芽細胞成長因子のアナログ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 名　称　　　　アムジエン・インコーホレーテッド４、代　理　人　　　東京都 新宿区新宿１丁目１番１４号　山田ビル５、補正命令の日付　平成２年９月４日 ６、補正の対象　明細書及び請求の範囲の翻訳文７、補正の内容 （１）浄書した明細書及び請求の範囲の翻訳文を別紙の通り補充する。

（内容に変更なし） 国際調査報告 ｌ″ｌ′ｌｔｏ″ｌ　Ａｍａｌｓｅ　ｈａ、、、、、、ｑ、、、ｏ、、　８ｑＰ Ｃ丁／ＵＳ８１］１０４１Ｅ１９ Ａ＋：ｔａｃｈｍｅｎセｔｏ　ＰＣＩゾＩＳＡ／２１０Ｘ、　　Ｃ１ａ＠５ｉｆ ｉｃａｔｉｏｎ　　ｏｆ　　５ｕｂｊｅｃｔ　　Ｍａｔｔａｒ＋ＮＰＣ（４）＋ 　　Ｃｌ２Ｐ　２１１００；　Ｃｌ２Ｎ　１５１０Ｏ＋　Ｃｌ２Ｎ　５７ｏｏ＋ 　Ｃｌ２Ｎ　ｌ／２Ｌ）Ｕ、Ｓ、ＣＬ、１　２４０．１，２５３ＸＸ、ＦｉａＬ ＋１ｓ　Ｓｅａｒｃｈｅｄｋｅｙｗｏｒｄｓ＋　ｍｕｔａｎｔ、　　ｍｕｔａｔ ｉｏｎ、　　ｒｅｐｌａｃｅ、　　５ｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ。

５ｕｌｆｈｙｄｒｙＬ、　ｃｙｓｔｅｉｎｅ、　ｄｉｓｕｌｆｉｄ＠、　ｏｒｉ ｄｇ？、　ａｎセａｇｏｎｉｓ？

Claims (31)

【特許請求の範囲】
1. １．１つ若しくはそれ以上のアミノ酸残基の同一性及び／又は位置の点で天然に 存在する塩基性繊維芽細胞成長因子と異なる塩基性繊維芽細胞成長因子のアナロ グであって、天然に存在する塩基性繊維芽細胞成長因子のシステイン残基の少な くとも１つが異なるアミノ酸の残基で置換されていることを特徴とする前記アナ ログ。
2. ２．異なるアミノ酸がセリン、アラニン、アスパラギン酸及びアスパラギンから なる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載のアナログ。
3. ３．異なるアミノ酸がセリンであることを特徴とする請求項２に記載のアナログ 。
4. ４．置換されるシステイン残基の少なくとも１つが遊離スルフヒドリルとして存 在するシステイン残基であることを特徴とする請求項１に記載のアナログ。
5. ５．システイン残基の２つが異なるアミノ酸の残基で置換されていることを特徴 とする請求項１に記載のアナログ。
6. ６．置換されるシステイン残基の２つが遊離スルフヒドリルとして存在するシス テイン残基であることを特徴とする請求項５に記載のアナログ。
7. ７．位置２６、７０、８８及び９３のシステイン残基の少なくとも１つが異なる アミノ酸の残基で置換されていることを特徴とする、表ＶＩに記載のアミノ酸配 列を有する塩基性繊維芽細胞成長因子のアナログ及びその対立遺伝子変異体。
8. ８．少なくとも１つの末端アミノ酸残基が欠失しているが、天然に存在する塩基 性繊維芽細胞成長因子の生物学的活性を実質的に保持していることを特徴とする 請求項７に記載のアナログ。
9. ９．異なるアミノ酸がセリン、アラニン、アスパラギン酸及びアスパラギンから なる群から選択されることを特徴とする請求項７に記載のアナログ。
10. １０．異なるアミノ酸がセリンであることを特徴とする請求項８に記載のアナロ グ。
11. １１．置換されるシステイン残基の少なくとも１つがアミノ酸位置７０及び８８ のシステインからなる群から選択されることを特徴とする請求項７に記載のアナ ログ。
12. １２．システイン残基の２つが異なるアミノ酸の残基で置換されていることを特 徴とする請求項７に記載のアナログ。
13. １３．置換されるアミノ酸がアミノ酸位置７０及び８８のシステインを含むこと を特徴とする請求項１１に記載のアナログ。
14. １４．置換されるシステイン残基がアミノ酸位置２６及び９３のシステインを含 むことを特徴とする請求項１１に記載のアナログ。
15. １５．置換されるシステイン残基がアミノ酸位置２６、７０、８８及び９３のシ ステインを含むことを特徴とする請求項１２に記載のアナログ。
16. １６．請求項７に記載の塩基性繊維芽細胞成長因子アナログの原核又は真核発現 をコードするＤＮＡ配列。
17. １７．ＤＮＡ配列がヒトの繊維芽細胞成長因子遺伝子から修飾されていることを 特徴とする請求項１６に記載のＤＮＡ配列。
18. １８．ヒトの塩基性繊維芽細胞成長因子遺伝子がオリゴヌクレオチドの部位特定 的突然変異誘発により修飾されていることを特徴とする請求項１７に記載のＤＮ Ａ配列。
19. １９．ヒト塩基性繊維芽細胞成長因子遺伝子がウシの塩基性繊維芽細胞成長因子 遺伝子から修飾されていることを特徴とする請求項１８に記載のＤＮＡ配列。
20. ２０．ウシの繊維芽細胞成長因子遺伝子がオリゴヌクレオチドの部位特定的突然 変異誘発により修飾されていることを特徴とする請求項１９に記載のＤＮＡ配列 。
21. ２１．治療上有効な量の請求項１に記載の塩基性繊維芽細胞成長因子アナログと 薬学的に許容し得るアジュバントを含むことを特徴とする薬剤組成物。
22. ２２．治療上有効な量の請求項１に記載の塩基性繊維芽細胞成長因子アナログを 創傷に投与することを特徴とする創傷の治療方法。
23. ２３．創傷が表面創傷であることを特徴とする請求項２２に記載の方法。
24. ２４．創傷が手術創傷であることを特徴とする請求項２２に記載の方法。
25. ２５．創傷が骨折又は骨の欠陥を含むことを特徴とする請求項２２に記載の方法 。
26. ２６．創傷が損傷した神経を含むことを特徴とする請求項２２に記載の方法。
27. ２７．治療上有効な量の請求項１に記載の塩基性繊維芽細胞成長因子アナログを 投与することを特徴とする組繊及び／又は臓器を発生させる方法。
28. ２８．宿主細胞が請求項７に記載の塩基性繊維芽細胞成長因子アナログを発現し 得るように請求項１６に記載のＤＮＡをトランスフォーメーション若しくはトラ ンスフェクションさせた原核若しくは真核宿主細胞。
29. ２９．請求項１６に記載のＤＮＡを宿主細胞にトランスフォーメーション若しく はトランスフェクションさせ、宿主細胞が塩基性繊維芽細胞成長因子アナログを 発現し得るようにトランスフォーメーション若しくはトランスフェクションさせ た宿主細胞を培養し、塩基性繊維芽細胞成長因子のアナログを単離することを特 徴とする精製・単離した塩基性繊維芽細胞成長因子アナログの産生方法。
30. ３０．塩基性繊維芽細胞成長因子アナログを含む上清を非ヘパリンクロマトグラ フィーにかけることを特徴とする請求項７に記載の組換え塩基性繊維芽細胞成長 因子アナログの精製方法。
31. ３１．塩基性繊維芽細胞成長因子を含む宿主培養物から封入体を溶解させ、溶解 した封入体を非ヘパリンクロマトグラフィーにかけることを特徴とする請求項７ に記載の組換え塩基性繊維芽細胞成長因子アナログの精製方法。