JPS61268181A - Ｓ−置換アルキル化還元リゾチ−ムおよびその製造方法 - Google Patents
Ｓ−置換アルキル化還元リゾチ−ムおよびその製造方法Info
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- JPS61268181A JPS61268181A JP27786584A JP27786584A JPS61268181A JP S61268181 A JPS61268181 A JP S61268181A JP 27786584 A JP27786584 A JP 27786584A JP 27786584 A JP27786584 A JP 27786584A JP S61268181 A JPS61268181 A JP S61268181A
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
この発明はＳ−置換アルキル化還元リゾチームおよびそ
の製造方法に関するものである。Ｓ−置換アルキル化還
元リゾチームは、殊にプロテアーゼ類の特異性を決定す
るのに極めて有用である。
の製造方法に関するものである。Ｓ−置換アルキル化還
元リゾチームは、殊にプロテアーゼ類の特異性を決定す
るのに極めて有用である。
プロテアーゼ類の特異性は短いポリへブタイドに対する
作用によって規定される。一般にプロテアーゼ類は多く
の結合部位を有し、また短いポリペブタイドに対する活
性も弱い。従って、得られる情報が余り正確でなかった
り、時には誤っていることさえある。これまでプロテア
ーゼ類の特異性を調べるためには酸化インシュリンのβ
−鎖が使用されてきた。しかし、この酸化インシュリン
β−鎖は、ある種のアミノ酸が欠如していて、満足する
情報を入手することができない場合があり、また酸化イ
ンシュリンβ−鎖は非常に高価であり。
作用によって規定される。一般にプロテアーゼ類は多く
の結合部位を有し、また短いポリペブタイドに対する活
性も弱い。従って、得られる情報が余り正確でなかった
り、時には誤っていることさえある。これまでプロテア
ーゼ類の特異性を調べるためには酸化インシュリンのβ
−鎖が使用されてきた。しかし、この酸化インシュリン
β−鎖は、ある種のアミノ酸が欠如していて、満足する
情報を入手することができない場合があり、また酸化イ
ンシュリンβ−鎖は非常に高価であり。
プロテアーゼ類の特異性決定に使用するのに難点が多い
。そこでプロテアーゼ類の特異性を十分に調査するため
には、全アミノ酸配列が決定されていて、かつその分子
量が比較的小さく、更に安価に入手できるタンパク質基
質が強く要望されてきた。
。そこでプロテアーゼ類の特異性を十分に調査するため
には、全アミノ酸配列が決定されていて、かつその分子
量が比較的小さく、更に安価に入手できるタンパク質基
質が強く要望されてきた。
従って、本発明者は、従来使用されてきた基質に代わる
タンパク質基質について鋭意研究を続けてきた結果、リ
ゾチームから、プロテアーゼ類の特異性を決定するのに
充分実用に供しうる基質が提供されることを見出して、
この発明を完成するに至った。
タンパク質基質について鋭意研究を続けてきた結果、リ
ゾチームから、プロテアーゼ類の特異性を決定するのに
充分実用に供しうる基質が提供されることを見出して、
この発明を完成するに至った。
リゾチームは、総てのアミノ酸を含有しているが、その
分子中に４個のジスルフィド（Ｓ−Ｓ）結合を有してい
るので、そのままではプロテアーゼ類の特異性を決定す
る基質として使用するには難点がある。そこで、本発明
者は、リゾチームを還元剤で還元し、そのジスルフィド
結合を開裂させ、遊離したスルフヒドリル（Ｓ−Ｈ）基
の１部もしくは全部にアルキル化剤で化学的修飾を行っ
て得られた生成物、即ちＳ−置換アルキル化還元リゾチ
ームが、変性タンパク質に溶解度を付与し、プロテアー
ゼ類の特異性を決定するのに有利なタンパク質基質とし
て使用できることを確認した。
分子中に４個のジスルフィド（Ｓ−Ｓ）結合を有してい
るので、そのままではプロテアーゼ類の特異性を決定す
る基質として使用するには難点がある。そこで、本発明
者は、リゾチームを還元剤で還元し、そのジスルフィド
結合を開裂させ、遊離したスルフヒドリル（Ｓ−Ｈ）基
の１部もしくは全部にアルキル化剤で化学的修飾を行っ
て得られた生成物、即ちＳ−置換アルキル化還元リゾチ
ームが、変性タンパク質に溶解度を付与し、プロテアー
ゼ類の特異性を決定するのに有利なタンパク質基質とし
て使用できることを確認した。
従って、この発明に係るＳ−置換アルキル化還元リゾチ
ームは、還元リゾチームのスルフヒドリル（ＳＨ）基を
部分的にもしくは全部に置換アルキル化したものである
。
ームは、還元リゾチームのスルフヒドリル（ＳＨ）基を
部分的にもしくは全部に置換アルキル化したものである
。
尚、この明細書において使用する「還元リゾチーム」と
いう語句は、リゾチームを還元剤によった開裂させて得
られるジスルフィド（Ｓ −Ｓ）結合の１部もしくは全
部がスルフヒドリル（ＳＨ）基に還元されたりゾチーム
を相称する。
いう語句は、リゾチームを還元剤によった開裂させて得
られるジスルフィド（Ｓ −Ｓ）結合の１部もしくは全
部がスルフヒドリル（ＳＨ）基に還元されたりゾチーム
を相称する。
この発明に使用するリゾチームは主に卵白より精製する
ことができるが、市販品を使用することもできる。リゾ
チームの還元は常法に従って行えばよく、例えばメルカ
プトエタノール等の還元剤を使用すればよい。還元剤の
使用量は、所望するりゾチームの還元程度、還元条件等
によって変えるミとができる６反応条件は、リゾチーム
が変性しないような緩和なものでなければならず１反応
を促進させるために加温させるのが好ましい。
ことができるが、市販品を使用することもできる。リゾ
チームの還元は常法に従って行えばよく、例えばメルカ
プトエタノール等の還元剤を使用すればよい。還元剤の
使用量は、所望するりゾチームの還元程度、還元条件等
によって変えるミとができる６反応条件は、リゾチーム
が変性しないような緩和なものでなければならず１反応
を促進させるために加温させるのが好ましい。
得られた還元リゾチームは次いで置換アルキル化剤によ
ってＳ−アルキル化がされて、そのスルフヒドリル（Ｓ
Ｈ）基の１部もしくは全部が置換アルキル基で保護され
たＳ−置換アルキル化還元リゾチームが得られる。使用
できる置換アルキル化剤としては１例えば、ヨード酢酸
、ヨードプロピオン酸等のヨード脂肪酸、ブロモ酢酸等
のブロモ脂肪酸等のハロゲン化脂肪酸、かかるハロゲン
化脂肪酸アミド、ブロムエチルアミン臭化水素酸塩等の
ブロモアルキルアミン臭化水素酸塩、ブロムエチルジメ
チルアンモニウムブロマイド、ブロムエチルトリメチル
アンモニウムブロマイド、ブロモプロピルトリメチルア
ンモニウムブロマイド等のブロモアルキル（モノ、ジも
しくはトリアルキル）アンモニウムブロマイド等が挙げ
られる。アルキル化剤の使用量は、アルキル化するスル
フヒドリル基の数によって変わるが、還元剤に対して通
常５モル程度、好ましくは約１〜４モル程度である。
ってＳ−アルキル化がされて、そのスルフヒドリル（Ｓ
Ｈ）基の１部もしくは全部が置換アルキル基で保護され
たＳ−置換アルキル化還元リゾチームが得られる。使用
できる置換アルキル化剤としては１例えば、ヨード酢酸
、ヨードプロピオン酸等のヨード脂肪酸、ブロモ酢酸等
のブロモ脂肪酸等のハロゲン化脂肪酸、かかるハロゲン
化脂肪酸アミド、ブロムエチルアミン臭化水素酸塩等の
ブロモアルキルアミン臭化水素酸塩、ブロムエチルジメ
チルアンモニウムブロマイド、ブロムエチルトリメチル
アンモニウムブロマイド、ブロモプロピルトリメチルア
ンモニウムブロマイド等のブロモアルキル（モノ、ジも
しくはトリアルキル）アンモニウムブロマイド等が挙げ
られる。アルキル化剤の使用量は、アルキル化するスル
フヒドリル基の数によって変わるが、還元剤に対して通
常５モル程度、好ましくは約１〜４モル程度である。
またアルキル化は、還元リゾチームが変性しない条件下
で行なわなければならないが、通常は多少加温した程度
の温度で、約５分間から１０時間までの反応時間で行な
うのが有利である。
で行なわなければならないが、通常は多少加温した程度
の温度で、約５分間から１０時間までの反応時間で行な
うのが有利である。
得られたＳ−置換アルキル化還元リゾチームをアミノ酸
分析した結果、シスチン成分と置換アルキル化されたシ
スティン成分を除いて天然のりゾチームのアミノ酸分析
値と同じであることが確認された。またヒスチジン残基
及びメチオニン残基を含む他のいかなる残基においても
何ら副反応が起こっていないことが判明した。更に、得
られたＳ−置換アルキル化還元リゾチームは水、緩衝液
等に対して種々の溶解度を有しているが、その溶液を種
々のプロテアーゼで加水分解して各種のベプタイドを得
ることができる。このようにして得られたペプタイドを
分析した結果、この発明に係るＳ−置換アルキル化還元
リゾチームは各種のプロテアーゼの特異性を決定するの
に極めて有用であることが確認された。
分析した結果、シスチン成分と置換アルキル化されたシ
スティン成分を除いて天然のりゾチームのアミノ酸分析
値と同じであることが確認された。またヒスチジン残基
及びメチオニン残基を含む他のいかなる残基においても
何ら副反応が起こっていないことが判明した。更に、得
られたＳ−置換アルキル化還元リゾチームは水、緩衝液
等に対して種々の溶解度を有しているが、その溶液を種
々のプロテアーゼで加水分解して各種のベプタイドを得
ることができる。このようにして得られたペプタイドを
分析した結果、この発明に係るＳ−置換アルキル化還元
リゾチームは各種のプロテアーゼの特異性を決定するの
に極めて有用であることが確認された。
以下、この発明を実施例で詳細に説明する。
実施例１
リゾチームの゛ −び゛ −リゾチームのアルキルヒフ
０ｍｇのりゾチーム（生化学工業株式会社製のニワトリ
卵白リゾチームを５回再結晶したもの）を８Ｍ尿素およ
び５．２５Ｍエチレンジアミンテトラアセテートを含有
する０、５Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８，６）２ｍ Ｑに溶
解した。この溶液をアスピレータで脱ガスし、窒素で置
換した。得られた溶液に、０．４３ｍＭ２−メルカプト
エタノール３０μ℃を添加し、得られた反応液を４０℃
で２時間放置した。次いで０．４３ｍＭ３−ブロモプロ
ピルトリメチルアンモニウムブロマイド９３．４ｍｇを
添加し、得られた溶液を４０℃で２時間放置した。この
反応液を蒸留水で透析するか、または１０％酢酸で溶出
したセファデックスＧ−２５（登録商標）の１．５Ｘ９
２ｍＱカラムを通すとＳ−３−（トリメチルアミノ）プ
ロピル化リゾチームが得られた。
０ｍｇのりゾチーム（生化学工業株式会社製のニワトリ
卵白リゾチームを５回再結晶したもの）を８Ｍ尿素およ
び５．２５Ｍエチレンジアミンテトラアセテートを含有
する０、５Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８，６）２ｍ Ｑに溶
解した。この溶液をアスピレータで脱ガスし、窒素で置
換した。得られた溶液に、０．４３ｍＭ２−メルカプト
エタノール３０μ℃を添加し、得られた反応液を４０℃
で２時間放置した。次いで０．４３ｍＭ３−ブロモプロ
ピルトリメチルアンモニウムブロマイド９３．４ｍｇを
添加し、得られた溶液を４０℃で２時間放置した。この
反応液を蒸留水で透析するか、または１０％酢酸で溶出
したセファデックスＧ−２５（登録商標）の１．５Ｘ９
２ｍＱカラムを通すとＳ−３−（トリメチルアミノ）プ
ロピル化リゾチームが得られた。
この生成物を凍結乾燥した。
この生成物は水に可溶でかつｐ）１２〜９の間の緩衝液
に良く溶けるが、ある種の塩類もしくは製塩類溶液に対
する溶解度が低下することがある。この場合には、この
生成物の濃水溶液を塩類溶液で希釈するとかなり安定な
溶液が得られる。
に良く溶けるが、ある種の塩類もしくは製塩類溶液に対
する溶解度が低下することがある。この場合には、この
生成物の濃水溶液を塩類溶液で希釈するとかなり安定な
溶液が得られる。
得られた生成物をアミノ酸分析した結果、シスチン成分
とＳ−３−（トリメチルアミノ）プロピル化システィン
成分を除いて天然のりゾチームのアミノ酸分析値と同じ
であり、ヒスチジンまたはメチオニン残基上で何ら副反
応が起こってないことが確認された。Ｓ−３−（トリメ
チルアミノ）プロピル化システィンは常法のアミノ酸分
析法に従ってリシンを使用した場合と同じ場所に溶出さ
れた。
とＳ−３−（トリメチルアミノ）プロピル化システィン
成分を除いて天然のりゾチームのアミノ酸分析値と同じ
であり、ヒスチジンまたはメチオニン残基上で何ら副反
応が起こってないことが確認された。Ｓ−３−（トリメ
チルアミノ）プロピル化システィンは常法のアミノ酸分
析法に従ってリシンを使用した場合と同じ場所に溶出さ
れた。
未反応のシスチンおよびシスティンの残基を調べるため
に、適当な時間反応させて得られたＳ−３−（トリメチ
ルアミノ）プロピル化リゾチームを再度同様に還元し、
′４ＩＪられた還元リゾチームをヨード酢酸でＳ−力
ルボキシメチル化した。得られた生成物をアミノ酸分析
した結果を第１図に示す。
に、適当な時間反応させて得られたＳ−３−（トリメチ
ルアミノ）プロピル化リゾチームを再度同様に還元し、
′４ＩＪられた還元リゾチームをヨード酢酸でＳ−力
ルボキシメチル化した。得られた生成物をアミノ酸分析
した結果を第１図に示す。
第１図に示すように、カルボキシメチル化システィンの
数の減少は、リシンとＳ−３−（トリメチルアミノ）プ
ロピル化システィンのピーク領域の増加と一致している
。リシンとＳ−３−（トリメチルアミノ）プロピル化シ
スティンとを合せたピーク領域は２ないし４時間で一定
になり、Ｓ−３−（トリメチルアミノ）プロピル化は４
０°Ｃで２時間以内に終了するようである。このことで
、使用した条件下し；おいては、リシン残基上では何ら
副反応が起こってないことが分かる。このことはまた、
この生成物のトリプシン分解によって得られたベプタイ
ドのベプタイド地図の結果からも確認された。
数の減少は、リシンとＳ−３−（トリメチルアミノ）プ
ロピル化システィンのピーク領域の増加と一致している
。リシンとＳ−３−（トリメチルアミノ）プロピル化シ
スティンとを合せたピーク領域は２ないし４時間で一定
になり、Ｓ−３−（トリメチルアミノ）プロピル化は４
０°Ｃで２時間以内に終了するようである。このことで
、使用した条件下し；おいては、リシン残基上では何ら
副反応が起こってないことが分かる。このことはまた、
この生成物のトリプシン分解によって得られたベプタイ
ドのベプタイド地図の結果からも確認された。
２〜４時間反応させて得られたピーク領域から、Ｓ−３
−（トリメチルアミノ）プロピル化システィンに対する
ニンヒドリン呈色因子はりシンに対するニンヒドリン呈
色因子の６１％であることが推定された。第１図では、
生成されたＳ−３−（１−リメチルアミノ）プロピル化
システィンの数は、この呈色因子を使用した時間に対し
てプロットした。
−（トリメチルアミノ）プロピル化システィンに対する
ニンヒドリン呈色因子はりシンに対するニンヒドリン呈
色因子の６１％であることが推定された。第１図では、
生成されたＳ−３−（１−リメチルアミノ）プロピル化
システィンの数は、この呈色因子を使用した時間に対し
てプロットした。
トリプシンによる加水分解
Ｓ−３−（トリメチルアミノ）プロピル化リゾチーム５
ｍｇをＯ，ＩＮ ＮＨａ ＨＣＯ３ＣｐＨ８，２）１＋
ＩＩＱに溶解し、得られた溶液を４０℃で２時間ＴＰＣ
Ｋ トリプシン（１％リゾチーム重量）を用いて蒸解し
た。この蒸解を沸騰水浴中で反応液を１０分間加熱させ
て止めた後。
ｍｇをＯ，ＩＮ ＮＨａ ＨＣＯ３ＣｐＨ８，２）１＋
ＩＩＱに溶解し、得られた溶液を４０℃で２時間ＴＰＣ
Ｋ トリプシン（１％リゾチーム重量）を用いて蒸解し
た。この蒸解を沸騰水浴中で反応液を１０分間加熱させ
て止めた後。
得られた混合物を半透膜フィルター（０，４５μｍ、西
ドイツ・ザルドーリウス社製）でろ過した。得られた液
を逆相高速液体クロマトグラフィーによって分析した結
果、トリプシン加水分解により得られたベブタイドの溶
出パターンは第２図の示す通りである。各ピークをアミ
ノ酸分析したところ、その酸成分が同一であることが分
かった。
ドイツ・ザルドーリウス社製）でろ過した。得られた液
を逆相高速液体クロマトグラフィーによって分析した結
果、トリプシン加水分解により得られたベブタイドの溶
出パターンは第２図の示す通りである。各ピークをアミ
ノ酸分析したところ、その酸成分が同一であることが分
かった。
トリプシンはアルギニンとりシンのカルボキシル末端に
おいてだけＳ−３−（トリメチルアミノ）プロピル化還
元リゾチームを加水分解し、それによって得られたベプ
タイドはＳ−カルボキシメチル化還元リゾチームから得
られたベグタイド類と同じであった。尚、トリプシンは
、その強い塩基性にも拘わらず、Ｓ−３−（トリメチル
アミノ）プロピル化システィンのカルボキシル基末端に
おけるペプタイド結合を加水分解しなかった。
おいてだけＳ−３−（トリメチルアミノ）プロピル化還
元リゾチームを加水分解し、それによって得られたベプ
タイドはＳ−カルボキシメチル化還元リゾチームから得
られたベグタイド類と同じであった。尚、トリプシンは
、その強い塩基性にも拘わらず、Ｓ−３−（トリメチル
アミノ）プロピル化システィンのカルボキシル基末端に
おけるペプタイド結合を加水分解しなかった。
なお、第２図に示すアミノ酸ピークは次のことを示す。
また、アミノ醜名の後に、カッコで示した数字はアミノ
酸配列番号を示す。
酸配列番号を示す。
Ｔ １ ： Ｌｙｓ（１）
Ｔ ２ ： Ｖａ Ｑ （２） −Ｐｈｅ（３） −Ｇ
Ｑ ｙ（４） −Ａｒｇ（５）（１１） −Ｍｅｔ（
１２） −Ｌｙｓ（１３）Ｔ ａ ： Ａｒｇ（１４） Ｔｓ ：Ｈｉｓ（１５） ＧＱｙ（１６） −Ｌｅｕ
（１７） −Ａｓｐ（１８） Ａｓｎ（１９） −Ｔ
ｙｒ（２０） −Ａｒｇ（２１）Ｔ ｓ ： Ｇ Ｑ
ｙ（２２）−Ｔｙｒ（２３） −５ｅｔ（２４） −Ｌ
ｅｕ（２５） −Ｇ ｎ ｙ（２６） −Ａｓｎ（２７
） −Ｔｒｐ（２８） −Ｖａ Ｑ （２９）−Ｔ ７
： Ｐｈｅ（３４） −Ｇ Ｑ ｕ （３５） −５
ｅｔ（３６） −Ａｓｎ （３７） −Ｐｈｅ（３８）
−Ａｓｎ（３９） −Ｔｈｒ（４０） −Ｇ Ｑ ｎ
（４１）−Ａ Ｑ ａ（４２）−Ｔｈｒ（４３） Ａ
ｓｎ（４４） Ａｒｇ（４５）Ｔ ｏ ： Ａｓｎ（
４６） −Ｔｈｒ（４７） −Ａｓｐ（４８） −Ｇ
Ｑ ｙ（４９） −５ｅｔ（５０） −Ｔｈｒ（５１）
−Ａｓｐ（５２） −Ｔｙｒ（５３） −Ｇ Ｑ ｙ
（５４）−ＩＱｅ（５５）−Ｌｅｕ（５６）−Ｇｌｌｌ
ｎ（５７）−ＩＱ ｅ （５８）−Ａｓｎ （５９）
−Ｓｅｔ （６０） −Ａｇｒ （６１）−Ｇ Ｑ ｙ
（６７）−Ａｒｇ（６８）Ｔ１０：Ｔｈｒ（６９） −
Ｐｒｏ（７０）−（Ｊｙ（７１） −５ｅｔ（７２）
Ａｒｇ（７３）（８２） Ｌｅｕ（８３）−Ｌｅｕ
（８４） ５ｅｒ（８５） ５ｅｔ（８６） Ａ
ｓｐ（８７）−Ｉ Ｑ、 ｅ（８８） −Ｔｈｒ（８９
）−Ａ Ｑ ａ（９０） −５ｅｔ（９１） −Ｔ １
２ ： Ｌｙｓ（９７） Ｔ １３ ： Ｉ Ｑ ａ（９８） −Ｖａ Ｑ （９
９） −３ｅｔ（１００） −Ａｓｐ（１０１）−Ｇ
Ｑ ｙ（１０２）−Ａｓｎ（１０３） −Ｇ Ｑ ｙ（
１０４） −Ｎｅｔ（１０５）−Ａｓｎ（１０６） −
Ａ Ｑ ａ（１０７） −Ｔｒｐ（１０８） −Ｖａ
Ｑ （１０９）−Ａ Ｑ ａ（１１０） −Ｔｒｐ（１
１１） −Ａｒｇ（１１２）Ｔ １４ ： Ａｓｎ（１
１３）−Ａｒｇ（１１４）Ｔｚｓ：ＧＱｙ（１１７）
−Ｔｈｒ（１１８） Ａｓｐ（１１９）−ＶａＱ（１
２０）−Ｇ Ｑ ｎ（１２１）−＾１ａ（１２２） −
Ｔｒｐ（１２３）−Ｉ Ｑ ｅ （１２４）−Ａｒｇ
（１２５） Ｔ １ｓ ： Ｌｅｕ（１２９） 実施例２ ３−ブロモプロピルトリメチルアンモニウムブロマイド
の代わりにヨード酢酸を用い、還元リゾチームのアルキ
ル化をほぼ１５分間行う以外は、実施例１と同様に処理
すると、Ｓ−カルボキシメチル化還元リゾチームが得ら
れた。
Ｑ ｙ（４） −Ａｒｇ（５）（１１） −Ｍｅｔ（
１２） −Ｌｙｓ（１３）Ｔ ａ ： Ａｒｇ（１４） Ｔｓ ：Ｈｉｓ（１５） ＧＱｙ（１６） −Ｌｅｕ
（１７） −Ａｓｐ（１８） Ａｓｎ（１９） −Ｔ
ｙｒ（２０） −Ａｒｇ（２１）Ｔ ｓ ： Ｇ Ｑ
ｙ（２２）−Ｔｙｒ（２３） −５ｅｔ（２４） −Ｌ
ｅｕ（２５） −Ｇ ｎ ｙ（２６） −Ａｓｎ（２７
） −Ｔｒｐ（２８） −Ｖａ Ｑ （２９）−Ｔ ７
： Ｐｈｅ（３４） −Ｇ Ｑ ｕ （３５） −５
ｅｔ（３６） −Ａｓｎ （３７） −Ｐｈｅ（３８）
−Ａｓｎ（３９） −Ｔｈｒ（４０） −Ｇ Ｑ ｎ
（４１）−Ａ Ｑ ａ（４２）−Ｔｈｒ（４３） Ａ
ｓｎ（４４） Ａｒｇ（４５）Ｔ ｏ ： Ａｓｎ（
４６） −Ｔｈｒ（４７） −Ａｓｐ（４８） −Ｇ
Ｑ ｙ（４９） −５ｅｔ（５０） −Ｔｈｒ（５１）
−Ａｓｐ（５２） −Ｔｙｒ（５３） −Ｇ Ｑ ｙ
（５４）−ＩＱｅ（５５）−Ｌｅｕ（５６）−Ｇｌｌｌ
ｎ（５７）−ＩＱ ｅ （５８）−Ａｓｎ （５９）
−Ｓｅｔ （６０） −Ａｇｒ （６１）−Ｇ Ｑ ｙ
（６７）−Ａｒｇ（６８）Ｔ１０：Ｔｈｒ（６９） −
Ｐｒｏ（７０）−（Ｊｙ（７１） −５ｅｔ（７２）
Ａｒｇ（７３）（８２） Ｌｅｕ（８３）−Ｌｅｕ
（８４） ５ｅｒ（８５） ５ｅｔ（８６） Ａ
ｓｐ（８７）−Ｉ Ｑ、 ｅ（８８） −Ｔｈｒ（８９
）−Ａ Ｑ ａ（９０） −５ｅｔ（９１） −Ｔ １
２ ： Ｌｙｓ（９７） Ｔ １３ ： Ｉ Ｑ ａ（９８） −Ｖａ Ｑ （９
９） −３ｅｔ（１００） −Ａｓｐ（１０１）−Ｇ
Ｑ ｙ（１０２）−Ａｓｎ（１０３） −Ｇ Ｑ ｙ（
１０４） −Ｎｅｔ（１０５）−Ａｓｎ（１０６） −
Ａ Ｑ ａ（１０７） −Ｔｒｐ（１０８） −Ｖａ
Ｑ （１０９）−Ａ Ｑ ａ（１１０） −Ｔｒｐ（１
１１） −Ａｒｇ（１１２）Ｔ １４ ： Ａｓｎ（１
１３）−Ａｒｇ（１１４）Ｔｚｓ：ＧＱｙ（１１７）
−Ｔｈｒ（１１８） Ａｓｐ（１１９）−ＶａＱ（１
２０）−Ｇ Ｑ ｎ（１２１）−＾１ａ（１２２） −
Ｔｒｐ（１２３）−Ｉ Ｑ ｅ （１２４）−Ａｒｇ
（１２５） Ｔ １ｓ ： Ｌｅｕ（１２９） 実施例２ ３−ブロモプロピルトリメチルアンモニウムブロマイド
の代わりにヨード酢酸を用い、還元リゾチームのアルキ
ル化をほぼ１５分間行う以外は、実施例１と同様に処理
すると、Ｓ−カルボキシメチル化還元リゾチームが得ら
れた。
このＳ−力ルボキシメチル化還元リゾチームは水には殆
ど不溶であり、そのカルボキシ基がプロトン化されてい
る酸性溶液中にはある程度溶解する。このリゾチーム誘
導体は、中性ｐＨ領域においては、７アミノ基および１
１グアニジノ基がプラスに、８Ｓ−力ルボキシメチル基
および１０カルボキシ基がマイナスに負荷している。こ
のＳ−カルポキジメチル化還元リゾチームのアミノ酸成
分をトリプシンで分解して得られたベプタイドは、実施
例１で得られた還元リゾチーム誘導体のそれと同じであ
った。
ど不溶であり、そのカルボキシ基がプロトン化されてい
る酸性溶液中にはある程度溶解する。このリゾチーム誘
導体は、中性ｐＨ領域においては、７アミノ基および１
１グアニジノ基がプラスに、８Ｓ−力ルボキシメチル基
および１０カルボキシ基がマイナスに負荷している。こ
のＳ−カルポキジメチル化還元リゾチームのアミノ酸成
分をトリプシンで分解して得られたベプタイドは、実施
例１で得られた還元リゾチーム誘導体のそれと同じであ
った。
実施例３
３−ブロモプロピルトリメチルアンモニウムブロマイド
の代わりにヨードアセトアミドを用い。
の代わりにヨードアセトアミドを用い。
還元リゾチームのアルキル化をほぼ１５分間行うこと以
外は実施例１と同様に処理することにより、Ｓ−カルバ
ミドメチル化還元リゾチームを得た。得られたＳ−カル
バミドメチル化リゾチームは水に難溶である。
外は実施例１と同様に処理することにより、Ｓ−カルバ
ミドメチル化還元リゾチームを得た。得られたＳ−カル
バミドメチル化リゾチームは水に難溶である。
実施例４
３−ブロモプロピルトリメチルアンモニウムブロマイド
の代わりにブロムエチルアミン臭化水素酸塩２モルを用
いた以外は実施例１と同様に処理すると、Ｓ−アミノエ
チル化リゾチームが得られた。
の代わりにブロムエチルアミン臭化水素酸塩２モルを用
いた以外は実施例１と同様に処理すると、Ｓ−アミノエ
チル化リゾチームが得られた。
このＳ−アミノエチル化リゾチームは水に相当溶解する
。
。
実施例５
３−ブロモプロピルトリメチルアンモニウムブロマイド
の代わりに２−ブロムエチルジメチルアンモニウムブロ
マイド３．５モル使用し、還元リゾチームのアルキル化
反応を８時間行った以外は、実施例１と同様に処理する
と、Ｓ−ジメチルアミノエチル化リゾチームが得られた
。このＳ−ジメチルアミノエチル化リゾチームは水にか
なり良く溶解した。
の代わりに２−ブロムエチルジメチルアンモニウムブロ
マイド３．５モル使用し、還元リゾチームのアルキル化
反応を８時間行った以外は、実施例１と同様に処理する
と、Ｓ−ジメチルアミノエチル化リゾチームが得られた
。このＳ−ジメチルアミノエチル化リゾチームは水にか
なり良く溶解した。
実施例６
３−ブロモプロピルトリメチルアンモニウムブロマイド
の代わりに２−ブロムエチルトリメチルアンモニウムブ
ロマイド２．３モル使用し、また還元リゾチームのアル
キル化反応を８時間行った以外は、実施例１と同様に処
理すると、５−２−トリメチルアミノエチル化リゾチー
ムが得られた。この生成物は水に可溶であった。
の代わりに２−ブロムエチルトリメチルアンモニウムブ
ロマイド２．３モル使用し、また還元リゾチームのアル
キル化反応を８時間行った以外は、実施例１と同様に処
理すると、５−２−トリメチルアミノエチル化リゾチー
ムが得られた。この生成物は水に可溶であった。
第１図は、還元リゾチームのスルフヒドリル基と３−ブ
ロモプロピルトリメチルアンモニウムブロマイドの反応
の経時変化を示すグラフである。 図中、曲線３は、リシンとＳ−３−（トリメチルアミノ
）プロピル化システィンのピーク領域とアラニンのピー
ク領域との比を示し、曲線２は明細書に記載したように
ニンヒドリン呈色因子が得られたＳ−３−（トリメチル
アミノ）プロピル化システィンの数を示し、そして曲線
１は実施例１においてカルボキシメチル化して得られた
カルボキシメチル化システィンの数を示す。 第２図は、還元リゾチームにＳ−３−（トリメチルアミ
ノ）プロピル化反応を４時間行って得られたＳ−３−（
トリメチルアミノ）プロピル化リゾチームをトリプシン
で加水分解して得られたベプタイドを逆相高速液体クロ
マトグラフィーのグラフを示す。 出願人代理人 弁理士 池 浦 敏 明第１図 ス 反応時間（時間）
ロモプロピルトリメチルアンモニウムブロマイドの反応
の経時変化を示すグラフである。 図中、曲線３は、リシンとＳ−３−（トリメチルアミノ
）プロピル化システィンのピーク領域とアラニンのピー
ク領域との比を示し、曲線２は明細書に記載したように
ニンヒドリン呈色因子が得られたＳ−３−（トリメチル
アミノ）プロピル化システィンの数を示し、そして曲線
１は実施例１においてカルボキシメチル化して得られた
カルボキシメチル化システィンの数を示す。 第２図は、還元リゾチームにＳ−３−（トリメチルアミ
ノ）プロピル化反応を４時間行って得られたＳ−３−（
トリメチルアミノ）プロピル化リゾチームをトリプシン
で加水分解して得られたベプタイドを逆相高速液体クロ
マトグラフィーのグラフを示す。 出願人代理人 弁理士 池 浦 敏 明第１図 ス 反応時間（時間）
Claims (14)
- （１）還元リゾチームのスルフヒドリル基の１部もしく
は全部がＳ−置換アルキル化された５−置換アルキル化
還元リゾチーム。 - （２）還元リゾチームがカルボキシメチル基で置換され
ていることからなる特許請求の範囲（１）項に記載のＳ
−置換アルキル化還元リゾチーム。 - （３）還元リゾチームがカルバミドメチル基で置換され
ていることからなる特許請求の範囲（１）項に記載のＳ
−置換アルキル化還元リゾチーム。 - （４）還元リゾチームがアミノエチル基で置換されてい
ることからなる特許請求の範囲第（１）項記載のＳ−置
換アルキル化還元リゾチーム。 - （５）還元リゾチームがジメチルアミノエチル基で置換
されていることから特許請求の範囲第（１）項記載のＳ
−置換アルキル化還元リゾチーム。 - （６）還元リゾチームがトリメチルアミノエチル基で置
換されていることからなる特許請求の範囲第（１）項に
記載のＳ−置換アルキル化還元リゾチーム。 - （７）還元リゾチームがトリメチルアミノプロピル基で
置換されていることからなる特許請求の範囲第（１）項
に記載のＳ−置換アルキル化還元リゾチーム。 - （８）還元リゾチームにＳ−置換アルキル化剤を反応さ
せてそのスルフヒドリル基の１部もしくは全部が置換ア
ルキル化されたＳ−置換アルキル化還元リゾチームを得
ることを特徴とするＳ−置換アルキル化還元リゾチーム
およびその製造方法。 - （９）前記アルキル化剤がヨード酢酸であることからな
る特許請求の範囲第（８）項に記載の製造方法。 - （１０）前記アルキル化剤がヨードアセトアミドである
ことからなる特許請求の範囲第（８）項に記載の製造方
法。 - （１１）前記アルキル化剤がブロムエチルアミン臭化水
素酸塩であることからなる特許請求の範囲第（８）項に
記載の製造方法。 - （１２）前記アルキル化剤がブロムエチルジメチルアン
モニウムブロマイドであることからなる特許請求の範囲
第（８）項に記載の製造方法。 - （１３）前記アルキル化剤がブロムエチルトリメチルア
ンモニウムブロマイドであることからなる特許請求の範
囲第（８）項に記載の製造方法。 - （１４）前記アルキル化剤がブロモプロピルトリメチル
アンモニウムブロマイドであることからなる特許請求の
範囲第（８）項に記載の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27786584A JPS61268181A (ja) | 1984-12-28 | 1984-12-28 | Ｓ−置換アルキル化還元リゾチ−ムおよびその製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27786584A JPS61268181A (ja) | 1984-12-28 | 1984-12-28 | Ｓ−置換アルキル化還元リゾチ−ムおよびその製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61268181A true JPS61268181A (ja) | 1986-11-27 |
| JPH0529430B2 JPH0529430B2 (ja) | 1993-04-30 |
Family
ID=17589360
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP27786584A Granted JPS61268181A (ja) | 1984-12-28 | 1984-12-28 | Ｓ−置換アルキル化還元リゾチ−ムおよびその製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61268181A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5126588A (en) * | 1987-03-16 | 1992-06-30 | Sgs-Thomson Microelectronics Gmbh | Digital push-pull driver circuit |
-
1984
- 1984-12-28 JP JP27786584A patent/JPS61268181A/ja active Granted
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5126588A (en) * | 1987-03-16 | 1992-06-30 | Sgs-Thomson Microelectronics Gmbh | Digital push-pull driver circuit |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0529430B2 (ja) | 1993-04-30 |
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