JPH09512167A - Hek5、hek7、hek8、hek11、新規なeph様受容体タンパク質チロシンキナーゼ - Google Patents

Hek5、hek7、hek8、hek11、新規なeph様受容体タンパク質チロシンキナーゼ

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JPH09512167A
JPH09512167A JP7527140A JP52714095A JPH09512167A JP H09512167 A JPH09512167 A JP H09512167A JP 7527140 A JP7527140 A JP 7527140A JP 52714095 A JP52714095 A JP 52714095A JP H09512167 A JPH09512167 A JP H09512167A
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Abstract

(57)【要約】 受容体タンパク質チロシンキナーゼのEPHサブファミリーの新規な4つのメンバーを開示する。受容体タンパク質をコードする核酸配列、組換えプラスミド及び発現用の宿主細胞、並びにそのような受容体の産生法及び使用法も開示する。

Description

【発明の詳細な説明】HEK5、HEK7、HEK8、HEK11、新規なEP H様受容体タンパク質チロシンキナーゼ 発明の分野 本発明は、受容体タンパク質チロシンキナーゼ(PTK)、特に新規なEPH 様受容体PTKとそのフラグメント及び類似体、並びに該PTKをコードする核 酸に係わる。本発明はまた、上記のような受容体を製造及び使用する方法にも係 わる。発明の背景 受容体PTK類は、構造に関連してファミリーを構成する、細胞外シグナルへ の細胞の応答を媒介するタンパク質である(Ullrich等, Cell 6 1, pp.203−212, 1990)。この受容体は三つの主要な機能性 ドメイン、即ち触媒活性をもたらす配列を含む細胞内領域と、単一疎水性膜透過 (spanning)ドメインと、その構造がリガンド結合特異性を決定するグ リコシル化細胞外領域とによって特徴付けられる。シグナル変換は、上記受容体 と類縁の(cognate)受容体の細胞外ドメインに成長または分化因子が結 合することによっ て開始される。リガンドの結合は受容体の自己リン酸化を誘導し得る受容体のダ イマー化を容易にする。可溶性タンパク質リガンドと膜関連タンパク質リガンド との両方が上記のように機能することが判明している。この過程は、様々な細胞 質基質のリン酸化を含み、細胞の生物学的応答を最終到達点とする一連の相互作 用の最初の段階である。最も良く解明された、チロシンキナーゼ受容体活性化に 対する応答は細胞の成長である。しかし、in vivoでの幾つかの成長因子 の役割についての分析は、分化または細胞の生存はチロシンキナーゼ受容体とリ ガンドとの相互作用によっても媒介され得ることを示唆している。 受容体PTKは、配列相同性と共有構造モチーフとの両方に基づいて十分に定 義されたファミリーに分類されている。触媒活性をもたらす細胞内ドメインの部 分のアミノ酸配列は総てのチロシンキナーゼ間で良く保存され、受容体サブファ ミリー内では更に密接に整合している。アミノ酸配列の上記部分の比較は、ファ ミリーのメンバー同士、またはファミリーのメンバーとチロシンキナーゼ全般と の関連性(relatedness)を示す系統樹の作成に用いられている(H anks及びQuinn, Metho ds Enzymol. 200, pp.38−62,1991)。上記配列 保存はまた、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いて新規なチロシンキナーゼ を単離するのにも用いられている(Wilks, Proc. Natl. A cad. Sci. USA 86, pp.1603−1607, 1989 )。PTKの高度に保存された触媒ドメインに基づくオリゴヌクレオチドは、鋳 型中に存在する関連配列の増幅にPCRプライマーとして用い得る。それらの断 片は従って、対応する完全長受容体クローンをcDNAライブラリーから単離す るためのプローブとして用い得る。ファージ発現ライブラリー中でのPTK c DNAクローンの同定には抗ホスホチロシン抗体も用いられている(Lindb erg及びPasquale,Methods Enzymol. 200, pp.557−564, 1991)。このような方策は何人かの研究者によっ て、増加し続けるタンパク質チロシンキナーゼ受容体の同定に用いられている。 現在、51の異なるPTK受容体遺伝子が公表されており、これらは14のサ ブファミリーに分類されている。それらのサブファミリーの一つにEPH様受容 体が有る。こ のサブファミリーの原型メンバーであるEPHはHirai等によって、ウイル スオンコジーンv−fpsに由来するプローブへの低ストリンジェンシーハイブ リダイゼーションを用いて単離された(Science 238,pp.171 7−1720, 1987)。EPH様受容体は、NIH 3T3細胞における 遺伝子の過発現が軟寒天及びヌードマウスの腫瘍においてフォーカス形成を惹起 することを示す研究に一部基づき、細胞の成長に関連付けられている(Maru 等, Oncogene 5, pp.199−204, 1990)。EPH サブファミリーの他のメンバーで同定済みのものには、 ECK(Lindberg等, Mol. Cell.Biol. 10, p p.6316−6324, 1990)、 ol. 11, pp.2496−2502, 1991)、 Cek4、5、6、7、8、9及び10(Pasquale, Cell Re gulation 2, pp.523−534, 1991; Sajjad i等, Th e New Biologist 3, pp.769−778, 1991; Sajjadi及びPasquale, Oncogene 8, pp.1 807−1813, 1993)、 HEK2(Bohme等, Oncogene 8, pp.2857−286 2, 1993)、 Eek、Erk(Chan及びWatt, Oncogene 6, pp.1 057−1061, 1991)、 Ehk1、Ehk2(Maisonpierre等, Oncogene 8, pp.3277−3288, 1993) が含まれる。これらの受容体のうちの幾つかに関して相同体が、他の種において 同定されている(Wicks等,Proc. Natl. Acad. Sci . USA 89, pp.1611−1615, 1992; Gilard i−Hebenstreit等, Oncogene 7, pp.2499− 2506, 1992)。幾つかのファミリーメンバーの発現パターン及び発生 特性は、当該受容体とそのリガンドが様々な組織の増殖、分化及び維持に重要で あることを示唆している(Nieto等, Development 116, pp.1137−1150, 1992) 。構造的にはEPHサブファミリーメンバーは、その細胞外ドメインに存在する Ig様ループ、システインに富む領域、及び二つのフィブロネクチン型反復部分 によって特徴付けられる。触媒ドメインのアミノ酸配列は細胞質PTKのSRC サブファミリーに対して、いずれの受容体PTKに対してよりも密接に関連する 。受容体PTKの触媒ドメインの中で、EPHサブファミリーものはアミノ酸配 列において上皮成長因子受容体サブファミリーのものに最も類似する。 本発明は、EPHサブファミリーに属する新規な受容体を同定することを目的 とする。先に示したPCR法を用いて、ヒト胎児脳cDNAライブラリーから5 種のヒトEPH様受容体を同定した。これらの受容体を、HEK4、HEK5、 HEK7、HEK8及びHEK11と呼称する。これらの受容体と、これまでに 同定されているEPH様受容体との関連性は次のとおりである。 HEK4はCek4(ニワトリ)及びMek4(マウス)のヒト相同体であり 、以前にヒトリンパ球腫瘍細胞系から単離されたHEK(Boyd等, J. Biol. Chem. 267, pp.3262−3267, 1992; Wicks 等, 1992)と同一である。 HEK5は、ニワトリ由来の完全長EPH様受容体クローンであるCek5の ヒト相同体である。HEK5配列の一部は、約60アミノ酸をコードするヒトク ローンERKとして以前に開示された(Chan及びWatt, 1991)。 HEK7は、ニワトリから単離されたCek7のヒト相同体である。 HEK8は、ニワトリ由来の完全長クローンCek8及びマウス由来の完全長 クローンSekのヒト相同体である(Nieto等, 1992; Sajja di等, 1991)。 HEK11は既知の非ヒト相同体を有しない。新しいメンバーHEK5、HE K7、HEK8及びHEK11が追加され、かつEPH様受容体をコードするP CR断片が報告されて(Lai及びLemke, Neuron 6,pp.6 91−704, 1991)、EPH様受容体を表わす配列は全部で12種公表 されたことになり、その結果このサブファミリーはPTKの既知のサブファミリ ーの うちで最大となった。 本発明は、可溶性のEPH様受容体、及びEPH様受容体に対する抗体を生成 させることも目的とする。前記可溶性受容体及び抗体は、EPH受容体活性化の 調節に有用である。発明の概要 本発明は、新規なEPH様受容体タンパク質チロシンキナーゼを提供する。本 発明は特に、EPH様受容体PTKのサブファミリーの、まとめてHEK(ヒト eph様キナーゼ)と呼称する4種の新メンバーをコードする核酸を単離して提 供する。本発明は、ストリンジェントな条件下にEPH様受容体核酸とハイブリ ダイズする核酸も包含する。本発明は、受容体ポリペプチド産生のための発現ベ クター及び宿主細胞、並びに受容体産生方法も提供する。 本発明はEPH様受容体のアミノ酸配列を有する単離ポリペプチドも、そのフ ラグメント及び類似体と共に提供する。本発明は、本発明のポリペプチドと特異 的に結合する抗体も包含する。本発明はまた、EPH様受容体の内在活性を調節 する方法、及び受容体リガンドを同定する方法も包含する。図面の簡単な説明 図1はHEK5受容体のヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列である。 図2はHEK7受容体のヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列である。 図3はHEK8受容体のヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列である。 図4はHEK11受容体のヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列である。 図5はヒトEPH受容体サブファミリーのアミノ酸配列の比較を示す説明図で ある。Genetics Computer Groupの配列分析ソフトウェ アパッケージに含まれたLineUpプログラム(Program Manua l for the GCG Package,Version 7, Apr il 1991; Genetics Computer Group, Ma dison, Wisconsin, USA 53711)を用いて、多配列 整列(alignment)を行なった。整列を最適化するべく導入したスペー スを点によって示す。各受容体の推定トランスメンブランドメイン及びシグナル 配列を下線及び斜体字によってそれぞれ示す。サブファミリー全体に保存された システイン残基は星印によって示す。チロシンキナーゼ触媒ドメインは矢印によ って示す。EPH、ECK及びHEK2のアミノ酸配列は適当な参考文献から得 た。 図6は受容体タンパク質チロシンキナーゼのEPHサブファミリーの分子の系 統発生を示す説明図である。触媒ドメイン配列を、Hanks及びQuinn, 1991に述べられているように分析した。図中スケールバーは任意の進化差 単位を表わす。短縮のため途中を省略して示したEPH枝は23.5単位の長さ を有する。 図7〜図11は、HEK受容体の組織分布のノザンブロット分析を示す説明図 である。32Pで標識した受容体cDNAプローブを2μgのヒト組織由来ポリA+ RNA(パネルA; Clontech)と、または10μgのラット組織 由来全RNA(パネルB)とハイブリダイズさせた。転写物の大きさをRNA分 子量マーカー(Bethesda Research Labs, Gaith ersburg, MD)との比較によって確定した。図7はHEK4の分析結 果、図8はHEK5の分析結果、図 9はHEK7の分析結果、図10はHEK8の分析結果、図11はHEK11の 分析結果である。発明の詳細な説明 本発明は、新規なEPH様受容体タンパク質チロシンキナーゼに係わる。本発 明は特に、EPH様受容体PTKのサブファミリーの4種の新メンバーをコード する単離核酸に係わる。前記4種のメンバーを以後HEK(ヒトephキナーゼ )と呼称する。受容体PTK及びEPH様受容体PTKの保存領域に対するオリ ゴヌクレオチドプローブを用いてヒト胎児脳cDNAライブラリー中で、HEK 受容体をコードする核酸を同定した。3種のHEK受容体の推定アミノ酸配列は これまでに同定されている、ニワトリから単離されたEPH様受容体Cek5、 Cek7及びCek8と触媒ドメインにおいて大幅な相同性を有し、従ってこれ らの受容体をHEK5、HEK7及びHEK8と呼称する。第四のHEK受容体 の推定アミノ酸配列は、これまでに同定されているいずれのEPH様受容体の相 同体でもないことが判明した。この受容体はHEK11と呼称する。「HEK」 という語は、HEK5、HEK7、HEK8及びHEK11、並びに本発明の範 囲内に有るこれらの受容 体の類似体、変異体及び突然変異体を包含すると理解される。 本発明は、 (a)配列番号10、配列番号12、配列番号14及び配列番号16のうちのい ずれかに示した核酸とその相補的鎖、 (b)配列番号10、配列番号12、配列番号14及び配列番号16のうちのい ずれかに示した核酸のコーディング領域にストリンジェントな条件下にハイブリ ダイズする核酸、及び (c)(b)の核酸であるが、遺伝暗号の縮重のために配列番号10、配列番号 12、配列番号14及び配列番号16のうちのいずれかに示した核酸のコーディ ング領域にハイブリダイズする核酸 の中から選択された単離核酸を包含する。本発明の核酸は好ましくは、既知のヒ トまたは非ヒトEPH様受容体の間で観察される核酸同等性に基づくヌクレオチ ド不整率(mismatch)が約5%以下となることを可能にする条件下にH EK5、HEK7、HEK8またはHEK11コーディング領域にハイブリダイ ズする。上記のような条件とは、例えば1M Na+中60℃でハイブリダイゼ ー ションを行ない、その後0.2×SSC中60℃で洗浄するといったものである 。同様の不整率レベルでの塩基対合を可能にする他のハイブリダイゼーション条 件も、当業者には確認可能である。 好ましい一例において、単離核酸はHEK5、HEK7、HEK8またはHE K11のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。核酸にはcDNA、 ゲノムDNA、合成DNAまたはRNAが含まれる。本発明の核酸は、細胞外リ ガンド結合ドメインと、トランスメンブランドメインと、細胞質ドメインとを有 する完全長受容体ポリペプチドをコードし得、または可溶分泌形態で産生される 細胞外ドメインなどのフラグメントをコードし得る。可溶性HEK受容体を産生 する核酸構築物を実施例3に説明する。本核酸によってコードされるポリペプチ ド及びフラグメントはEPH様受容体タンパク質チロシンキナーゼの、リガンド 結合能などの生物活性を少なくとも一つ有する。 本発明は、キメラタンパク質をコードする核酸も包含し、その際キメラタンパ ク質はHEK受容体のアミノ酸配列の一部を、異種タンパク質由来のアミノ酸配 列に連結された状態で含む。このようなキメラタンパク質の一例に、異種 受容体細胞質ドメインと融合したHEK受容体細胞外ドメインが有る。実施例5 に、HEK8細胞外ドメインをtrkB細胞質ドメインと共に含むキメラ受容体 、及びHEK11細胞外ドメインをtrkB細胞質ドメインと共に含む第二のキ メラ受容体の構築及び発現を説明する。HEK受容体を、抗体識別部位として機 能するIgドメインなど、他の機能性タンパク質ドメインと融合させることも可 能である。 本発明の核酸は、受容体PTKを発現する異種核酸と連結し得る。前記のよう な異種核酸には、転写、翻訳、増幅、分泌等のための遺伝因子を提供する生物機 能性プラスミドまたはウイルスベクターが含まれる。本発明のEPH様受容体の 産生に適した発現ベクターの一例に、実施例3に述べたpDSRαが有る。哺乳 動物、酵母、昆虫または細菌細胞における本発明のEPH様受容体の発現には他 のベクターも適当であると理解される。加えて本発明は、本発明のEPH様受容 体PTKをコードする核酸をin vivoで発現させることも包含する。例え ば、選択した組織において機能するベクターを用いれば、トランスジェニック動 物におけるEPH様受容体の組織特異的発現を容易に実 現することができる。 本発明のEPH様受容体PTKを発現させるための宿主細胞はチャイニーズハ ムスター卵巣(CHO)細胞やNIH 3T3細胞といった、確立された哺乳動 物細胞とすることが好ましいが、哺乳動物遺伝子の発現に適した他の細胞系が容 易に入手可能であり、それらを用いてもよい。このような宿主細胞を、EPH様 受容体の発現に適した核酸構築物で形質転換またはトランスフェクトする。形質 転換またはトランスフェクトした宿主細胞を用いて、診断または治療用途に適し た量の受容体を産生させ、またEPH様受容体を脳、腎臓及び肝臓などの選択し た成体組織において、または胚組織もしくは急速に分裂する組織において特異的 に(targeted)発現させることができる。 本発明は、EPH様受容体の生物学的特性(例えばリガンド結合、シグナル伝 達)を少なくとも一つ有する、精製及び単離されたポリペプチドを提供する。単 離ポリペプチドは好ましくは、配列番号10、配列番号12、配列番号14及び 配列番号16のうちのいずれかに示したアミノ酸配列を有する。本発明のポリペ プチドは、細胞外ドメインと、トランスメンブランドメインと、細胞質ドメイン とを 有する完全長ポリペプチドか、またはそのフラグメント、例えば細胞外ドメイン もしくはその一部のみを有するフラグメントであり得る。受容体ポリペプチドが 、配列番号10、配列番号12、配列番号14または配列番号16に示したアミ ノ酸配列の類似体または天然変異体であってもよいことは理解されよう。上記類 似体は、当分野で利用可能な方法を用いるアミノ酸置換、欠失及び/または挿入 によって生成させる。 本発明のポリペプチドは好ましくは外来DNA配列の発現産物であり、即ちE PH様受容体は好ましくは組み換え手段によって産生される。本発明は、EPH 様受容体を発現するベクターで形質転換またはトランスフェクトした宿主細胞を 培養することを含むEPH様受容体産生方法も包含する。EPH様受容体、特に そのフラグメントは化学合成によって調製することも可能である。上記のように 調製したポリペプチドは、用いる宿主細胞に応じてグリコシル化されたりされな かったりし得、あるいはまたアミノ末端にメチオニン残基を有し得る。上記のよ うに調製したポリペプチドは、当分野で通常用いられる方法で同定し、かつ細胞 培養から回収する。 本発明のEPH様受容体は、該受容体に対する抗体の産生に用いられる。HE K受容体に対する抗体については実施例4に述べてある。本発明のポリペプチド を識別する抗体はポリクローナルまたはモノクローナルであり得、また結合フラ グメントまたはキメラ抗体であり得る。このような抗体は、診断アッセイにおけ るEPH様受容体の検出、前記受容体の精製、及びEPH様受容体活性の調節に 有用である。 本出願の米国特許同時係属出願第08/145,616号に述べたように、E PH様受容体に関するリガンドで唯一既知であるのが、ECK受容体に結合して 該受容体のリン酸化を誘導するタンパク質である。このECK受容体リガンドは 以前にB61として同定された(Holzman等, Mol. Cell. Biol. 10, pp.5830−5838, 1990)。ECK受容体 を利用できることはリガンドの同定に重要であったが、これはB61が以前は、 既知ではあったがECK受容体リガンドと看做されていなかったからである。従 って、リガンド結合ドメインを有するEPH様受容体はリガンドの同定及び精製 に有用である。本発明のポリペプチドは、HEK5、H EK7、HEK8及びHEK11受容体に関するリガンドの同定及び精製に用い 得る。潜在的リガンドを検出する結合アッセイは溶液中で、または本出願の米国 特許同時係属出願第08/145,616号に開示したような方法を用いる固体 支持体上への受容体の固定化によって行ない得る。このようなアッセイでは、単 離したHEK受容体のリガンド結合ドメインを用い得る。あるいは他の場合には 、Igドメインと融合させたHEKリガンド結合ドメインを、細胞表面上でHE Kリガンドの存在を検出するのに用い得る。 可溶性のEPH様受容体を用いて細胞関連受容体の活性化を、典型的には未結 合リガンドに関して細胞関連受容体と競合させることにより調節(即ち促進また は低減)することができる。EPH様受容体活性化を調節することによって、受 容体保有細胞の増殖及び/または分化を変更し得る。例えば、観察される本発明 の受容体の組織分布(表5参照)から、可溶性HEK7受容体は主に脳細胞の増 殖及び/分化に影響すると考えられ、一方可溶性HEK5受容体は主に脳及び膵 臓の細胞に影響し得るが、HEK5受容体が他の組織に及ぼす作用も無視するこ とはできない。 EPH様受容体に対する抗体は、当分野で通常のアッセ イ法であるイムノアッセイを用いて前記受容体を異なる種類の細胞中に検出する ための有用な試薬である。この抗体はまた、受容体活性化を調節する有用な治療 薬でもある。この抗体は受容体に結合してリガンドの結合を直接または間接にブ ロックし、それによって受容体活性化の拮抗物質として機能する。あるいは他の 場合には、この抗体は受容体に結合することでリガンドの結合を容易にすること により作用物質として機能し得、比較的低いリガンド濃度の下で受容体の活性化 を実現し得る。加えて、本発明の抗体は、受容体活性化を誘導することによって それ自体がリガンドとして機能し得る。EPH様受容体に対する抗体は、EPH 様受容体保有細胞に関して富化された細胞集団の選択に有用であるようにも企図 されている。前記のような細胞集団は、或る種の細胞を喪失した患者を治療しな ければならない場合の細胞治療法において有用であり得る。 本発明の単離核酸は、HEK5、HEK7、HEK8、HEK11及び関連受 容体をコードするDNA及び/またはRNAを検出及び定量するハイブリダイゼ ーションアッセイに用い得る。このようなアッセイは、様々な種類の細胞の上記 受容体を発現させる潜在能力の測定、及び実際の HEK受容体発現レベルの測定において重要である。加えて、上記核酸はHEK 受容体遺伝子中の、転座、転位(rearrangements)、重複等とい った異常の検出にも有用である。 EPH様受容体を用いる治療法では典型的には、可溶形態の受容体を医薬組成 物中に存在させて用いる。前記医薬組成物は、医薬に許容可能なキャリヤ、稀釈 剤、増量剤、塩、緩衝剤、安定剤、及び/または当分野で良く知られている他の 物質を含有し得る。このような成分の例は、Remington’s Phar maceutical Sciences 18th ed., A. R. Gennaro ed., 1990にも記載されている。可溶性EPH様受容 体組成物の投与は、治療する状態に応じた様々な経路で可能であるが、典型的に は静脈内または皮下投与を行なう。EPH様受容体に対する抗体を含有する医薬 組成物は好ましくはマウス−ヒトキメラ抗体、もしくはマウスにおいて生成させ た抗体に対する患者の免疫応答が誘起される恐れを最小限に留めるべくCDRグ ラフト抗体を含有する。抗EPH抗体組成物のその他の成分は、可溶性受容体に 関して述べたものに類似する。 医薬組成物中の可溶性EPH様受容体または抗EPH抗体の量は、治療する状 態の特性及び重篤度に依存する。所与の患者に関するこの量は当業者によって決 定され得る。本発明の医薬組成物は、可溶性受容体または抗EPH抗体を体重1 kg当たり約0.01μgから約100mgの量で含有するように企図されてい る。 本発明は、EPH様受容体PTKの活性化を調節する方法も提供する。この方 法の実施では、治療有効量の可溶性EPH様受容体または抗EPH抗体を投与す る。「治療有効量」という語はEPH様受容体の活性化を促進または低減する量 を意味し、体重1kg当たり約0.01μgから約100mgの可溶性受容体ま たは抗EPH抗体量のことである。この治療は通常、受容体保有細胞の増殖及び /または分化の状態に一部関連すると考えられる、可溶性受容体または抗EPH 抗体によって治療可能な状態を有する患者に適する。表4に示したHEK受容体 の組織分布に基づき、本発明の医薬組成物での治療は特に脳、心臓、筋肉、肺ま たは膵臓に関する障害向きであると指摘することができる。しかし、幾つかのH EK受容体はきわめて様々な組織に現われ、従って受容体活性化調節作用はここ に記した 組織に限定されるとはかぎらないと理解される。 本発明を以下の実施例によって更に詳述するが、これらの実施例を、本発明の 範囲を限定するものと解釈するべきではない。以下の実施例で用いた組み換えD NA法の全容は、Sambrook等, “Molecular Clonin g: A Laboratory Manual,” 2nd ed., Co ld Spring Harbor Press, 1989に記載されている 。実施例1 HEK受容体cDNAのクローニング及び配列決定 本発明者は、受容体PTKのEPHサブファミリーの5種のメンバーに関する クローンをヒト胎児脳cDNAライブラリーから単離した。キナーゼドメイン中 の保存アミノ酸配列に基づいてオリゴヌクレオチドを設計した。プライマーIは 、多くのファミリーのPTK間に良く保存されているアミノ酸配列Trp−Th r−Ala−Pro−Glu−Ala−Ile(配列番号1)に基づいて設計し た。プライマーIIは配列Val−Cys−Lys−Val−Ser−Asp−P he−Gly(配列番号2)に基づいて設計したが、この配列はEPHサブファ ミリーのメンバー 間では不変であるものの他のPTK中には、配列Asp−Phe−Gly以外は まれにしか見出されない。上記二つのタンパク質配列の逆翻訳に対応する、完全 縮重オリゴヌクレオチドを合成し、これらを、ヒト胎児脳cDNAライブラリー 由来の破壊ファージを鋳型として用いるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)におい てプライマーとして用いた。上記PCR反応の生成物をプラスミドベクターpU C19中へクローン化し、挿入部分のヌクレオチド配列を決定した。配列決定し た35のPCR挿入部分のうちの27が、PTK遺伝子の一部として識別可能で あった。それらの部分の、以前に公表された配列との対応を表1にまとめる。 六つのPCR挿入部分からSRCの一部と同一であるアミノ酸配列が推定され るが、これらの挿入部分は二つの異なるヌクレオチド配列を含む。一つの挿入部 分はヒト血小板由来成長因子(PDGF)のβ受容体をコードすると考えられる 。残りの18のPCR挿入部分は6種の異なるヌクレオチド配列から成り、これ らは総てEPHサブファミリーのメンバーのフラグメントであると考えられる。 1種 1)の対応領域と同一であるアミノ酸配列が推定され、このアミノ酸配列は前記 領域のヒト相同体であると考えられる。二つの挿入部分からはPCR断片tyr o−4(Lai及びLemke, 1991)の翻訳と整合するアミノ酸配列が 推定されるが、これらの挿入部分は明らかにヌクレオチドレベルにおいて相違し ており、一方他の二つの挿入部分はtyro−1及びtyro−5に対応する。 第6のPCR挿入部分は、これまでに報告されていないEPH関連配列を有する 。5個のクローンは、それらに関する完全長配列が未だ報告されていない潜在的 EPHサブファミリーメンバーの一部を有するので、それぞれ放射性標識してヒ ト胎児脳cDNAライブラリーのスクリーニングでプ ローブとして用いた。5個のプローブそれぞれに対応する幾つかのクローンを単 離した。5種の受容体それぞれに関して、推定コーディング領域の最大部分を有 するクローンのヌクレオチド配列を決定した。 完全なコーディング領域を有するただ1個のcDNAクローンをHEK4に関 してのみ単離した。HEK5、HEK7、HEK10及びHEK11の、これら の受容体のアミノ末端をコードする部分はいずれのクローン中にも見出されなか った。完全なコーディング配列を得るべく、cDNA末端急速増幅(RACE) 技術を用いた。場合によっては、コーディング領域の失われた部分の獲得に2ラ ウンド以上のRACEが必要であった。この操作を用いて、完全なコーディング 配列が、完全なリーダー配列を欠くHEK7以外の総てのクローンに関して得ら れた。HEK5、HEK7、HEK8及びHEK11のDNA配列を図1〜図4 にそれぞれ示し、かつ配列番号10(HEK5)、配列番号12(HEK7)、 配列番号14(HEK8)及び配列番号16(HEK11)に示す。アミノ酸配 列は、配列番号11(HEK5)、配列番号13(HEK7)、配列番号15( HEK8)及び配列番号17(HEK11) に示す。実施例2 HEK受容体配列の分析 HEK5、HEK7、HEK8及びHEK11は新規なヒトEPHサブファミ リーメンバーであるが、これらのうちのHEK11以外の総てに関しては他の種 から相同体が単離されている。本発明者はヒトEPH受容体サブファミリーメン バーを、Wicks等, 1992の命名法に従いHEK(uman PH −like inases)と呼称する。本発明者はこれらの受容体に関する 名称及び番号を、ニワトリ(Cek)及びマウス(Mek)のファミリーの以前 に発見されたメンバー(Sajjadi等, 1991; Sajjadi及び Pasquale,1993; Pasquale, 1991)に対応させて 選択した。起源種を第1文字によって示す慣例を拡張して、本発明者はHEK受 容体のラット相同体をRek(at PH−like inases)と 呼称する。 HEK4は、ニワトリ受容体Cek4(触媒ドメインのアミノ酸同等率91% )及びマウス受容体Mek4(触媒ドメインのアミノ酸同等率96%)のヒト相 同体である。 HEK5のアミノ酸配列はニワトリ受容体Cek5(Pasquale等, J . Neuroscience 12, pp.3956−3967, 199 2; Pasquale, 1991)に非常に密接に関連する(触媒ドメイン のアミノ酸同等率96%)。HEK7はおそらく、最近報告されたCek7(S ajjadi及びPasquale, 1993)のヒト相同体である。HEK 8も、Sek(Gilardi−hebenstreit等,1992)及びC ek8(Sajjadi及びPasquale, 1993)(触媒ドメインの アミノ酸同等率95%)に非常に密接に関連する。Cek6及びCek9のヒト 相同体は未だ報告されておらず、一方Cek10のヒト相同体はつい最近公表さ れた。本発明のヒト受容体のうちの一つは、他の種の受容体のうちに密接に関連 するものが無く、明らかにEPHサブファミリーの新規なメンバーである。本発 明者はこの受容体を、Cek9及びCek10のヒト相同体がHEK9及びHE K10とそれぞれ呼称されることを前提としてHEK11と命名した。既知のE PHサブファミリーメンバーを表2にまとめる。 四つの新規な受容体クローン、並びに従来公知のEPHサブファミリーメンバ ーであるECK(配列番号18)、EPH(配列番号19)、HEK2(配列番 号20)及びHEK4(配列番号21)の推定アミノ酸配列を、図5に 示したように整列させた。四つのクローンは互いに、また公知のEPHサブファ ミリーメンバーに密接に関連した。四つの新規な受容体のうちのいずれの細胞外 ドメイン配列も、EPHサブファミリーメンバーの特長を成すIgループ、フィ ブロネクチンIII型反復部分、及びシステインに富む領域を有する。20システ イン残基の位置は総てのサブファミリーメンバー間に保存されている。また、E PHサブファミリー特異的プライマー(Val−Cys−Lys−Val−Se r−Asp−Phe−Gly; 配列番号2; 図5のアミノ酸757〜764 )のベースとして用いた触媒領域部分も完全に保存されている。表3に、ヒトE PHサブファミリーメンバー対間の配列同等率(%)をまとめる。表中下方部分 に触媒ドメインのアミノ酸同等率(%)を示し、上半部には細胞外領域のアミノ 酸同等率(%)を示す。EPH様受容体のアミノ酸配列は、触媒領域ではきわめ て良く保存されている(アミノ酸同等率60〜89%)が、細胞外領域では同じ 受容体サブファミリーのメンバーに関して予測されるほど高率では保存されてい ない(アミノ酸同等率38〜65%)。 アミノ酸配列のペア毎の比較を用い、分子ファミリーの進化関係を示す系統樹 を構築し得る。図6は、EPHサブファミリーのメンバー間の関係を要約した系 統樹である。各グループの異種間相同体(cross−specieshomo logs)からの単一のファミリーメンバーのみが示されており、可能な限り、 ヒト標本を用いた(異種間相同体の要約については表2を参照されたい)。枝の 長さは、メンバー間のダイバージェンスの程度を表す。EPHサブファミリーは 、既に進化的に他の受容体PTKよりも細胞質PTKに近い枝上に存在している ことが示されている(Lindberg及びHunter,1993)。興味深 いことには、該系統樹を上ってゆくにつれ、受容体は より近縁となり、発現が脳に局在化するようになる。 実施例3 HEK受容体細胞外ドメインの構築及び発現 受容体のトランスメンブラン及び細胞質ドメインをコードするDNA配列を欠 失させ、細胞外ドメインの3′末端に翻訳停止コドンを導入して、可溶性細胞外 形態のHEK受容体タンパク質を構築した。図1に示されているように、HEK 5細胞外ドメイン構築物は、524位のリシンの後に導入された停止コドンを有 していた。図2に示されているように547位のグルタミンの後に停止コドンを 導入してHEK7細胞外ドメインを構築した。図3に示されているように547 位のトレオニンの後に停止コドンを導入してHEK8細胞外ドメインを構築した 。 細胞外ドメインコード領域に対するプライマー5′及び3′を用い、PCRに より、ヒト胎児脳cDNAライブラリーからHEK細胞外ドメインを増幅した。 HEK5の場合、プライマー: を用いて、細胞外ドメインを増幅し、プラスミドpDSRαにクローニングする ための制限部位を得た。さらに、以下のプライマー: を用いて、翻訳開始部位、発現用elk受容体シグナルペプチド、及びpDSR αにクローニングするための制限部位を得た。 得られた構築物は、elkシグナル配列Met−Ala−Leu−Asp−C ys−Leu−Leu−Leu−Phe−Leu−Leu−Ala−Ser(配 列番号:26)をコードするDNAとHEK5受容体の最初のコドンとの融合体 であった。 得られたHEK5細胞外ドメインをSalI及びXbaIで消化した後でpD SRαにクローン化し、発現させるためにCHO細胞にトランスフェクトした。 細胞外ドメインコード領域に対するプライマー5′及び3′を用い、PCRに より、ヒト胎児脳cDNAライブラ リーからHEK8細胞外ドメインを増幅した。HEK8の場合、プライマー: を用いて細胞外ドメインを増幅し、プラスミドpDSRαにクローニングするた めの制限部位を得た。 得られたHEK8細胞外ドメインをSalI及びXbaIで消化した後pDS Rαにクローン化し、発現させるためにCHO細胞に移した。 細胞外ドメインコード領域に対するプライマー5′及び3′を用い、PCRに より、ヒト胎児脳cDNAライブラリーからHEK7細胞外ドメインを増幅した 。HEK7の場合、プライマー: を用いて細胞外ドメインを増幅した。さらに、以下のプライマー: を用い、翻訳開始部位、HEK8受容体シグナルペプチド配列及びプラスミドp DSRαにクローニングするための制限部位を得た。 得られた構築物は、HEK8シグナル配列Met−Ala−Gly−Ile− Phe−Tyr−Phe−Ala−Leu−Phe−Ser−Cys−Leu− Phe−Gly−Ile−Cys−Aspをコードする(incoding)D NAとHEK7受容体の最初のコドンとの融合体であった。 得られたHEK7細胞外ドメインをSalI及びXbaIで消化した後でpD SRαにクローン化し、発現させるためにCHO細胞にトランスフェクトした。 実施例4 HEK受容体に対する抗体 抗原として細菌融合タンパク質を用い、細胞外ドメインを認識するHEK受容 体タンパク質に対する抗体を産生させた。抗原として合成ペプチドを用い、細胞 質ドメインを認識する抗体も産生させた。 用いた方法は既に記載されたものであった(Harlo w及びLane,Antibodjes:A Laboratory Manu al,1988)。細胞外ドメイン抗体を得るために、cDNAをpATHベク ターに挿入した(該構築物によりコードされる各受容体の領域については表4を 参照)。これらの構築物を細菌中で発現させ、得られたTrpE−融合タンパク 質をSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製した。細胞質ドメイン の抗ペプチド抗体を得るために、ペプチドを合成し(その配列については表4を 参照)、KLH(keyhole limpethemocyanin)に共有 結合させた。融合タンパク質及び結合したペプチドをウサギ中で抗原として用い 、抗血清を産生させ、記載のように(Harlow及びLane,1988)特 性決定した。SulfoLinkキット(Pierce,Rockford I L)を用いて抗ペプド抗体をアフィニティー精製した。 実施例5 HEK/TrkBキメラ受容体 1.ラットtrkB細胞質ドメインをコードするpSJA1の作製 全てのキメラ受容体は、ラットtrkBの細胞内部分とHEK受容体の1つの トランスメンブラン領域及び細胞外ドメインとから構成される。各個別の構築を 簡略化するために、RtrkB/AflII(又はpSJA1)と称される中間又 は親プラスミドを作製した。先ず、PCR支援突然変異誘発により、コードペプ チド配列を変えずに、AflII部位(CTTAAG)を、ラットtrkB cDN A〔Middlemasら,Mol.Cell.Biol.11,143−15 3(1991)〕の2021位(2021位のシトシン(C2021)〜202 6位のグアニン(G2026,CTCAAG)に導入した。簡潔に言えば、ラッ トtrkBcDNA配列に基づいてPCRプライマーを合成した。プライマーI は該cDNAのC2003〜G2034を含んでいた。該プライマーは2つの突 然変異、即 ち、2023位でのシトシンからチミン(T)への置換(C2023T)及びT 2013とG2014の間へのアデニン(A)の挿入を含んでいた。これらの突 然変異により、C2021位にAflII部位が、またAflII部位に隣接する追 加のXhoI部位が形成された。プライマーIIは、ApaI部位を有するcDN AのT2141〜A2165を逆方向で含んでいた。これらのプライマー及びラ ットtrkBcDNA鋳型により産生されたPCRフラグメントをXhoI及び ApaI酵素で消化し、発現ベクター、pcDNA3(InVitroGen) のXhoI及びApaI部位にサブクローン化して、pSJA1−bを作製した 。次いで、pSJA1−bをApaIで線状とし(linearize)、Ba nIIで消化したラットtrkBcDNAフラグメント(G2151〜G4697 )と連結して、ラットtrkBタンパク質(L442〜G790)の全細胞内ド メイン及びcDNAの1627ヌクレオチド3′末端の非コード領域の1571 残基(A3131〜G4697)をコードする配列を含む大きなフラグメント(C 2021〜G4697)を再構成した。 2.HEK8/ラットtrkB(pSJA5)キメラの作 製 上記と同様な方法でHEK8/ラットtrkBキメラを作製した。先ず、Sa lI/BsaI cDNAフラグメントをプラスミドTK10/FL13から分 離した。該フラグメントは、HEK8cDNAの始めからT1689までのヌク レオチド配列を含んでいた(図3)。次いで、HEK8 cDNA配列に基づい て一対のオリゴヌクレオチドを合成した。第1のオリゴヌクレオチドの配列は、 HEK8 cDNAのG1690〜C1740と同じであり、その3′末端に追 加のC残基が加えられていた。第2のオリゴヌクレオチドは、HEK8 cDN Aと逆方向であり、HEK8 cDNA配列のC1694〜C1740、及びそ の5′末端に追加の5個の残基モチーフ、TTAAGを含んでいた。これらの2 つのオリゴヌクレオチドをキナーゼ化し、等モル比でアニーリングして、HEK 8 cDNAのG1690〜C1740配列及びそれぞれその5′及び3′末端 にBsaI及びAflII付着端を有する二本鎖DNAフラグメントを形成した。 該フラグメントをSalI/BsaI cDNAフラグメントと共にXhoI/ AflII線状pSJA1に連結して、HEK8/RtrkB(pS JA5)キメラ構築物を作製した。 3.HEK11/ラットtrkB(pSJA6)キメラの作製 HEK11/ラットtrkBキメラを作製するために、先ず、プラスミドTK 19T3から、HEK11 cDNA(図4)のヌクレオチドCl〜T1674 の配列を含むSalI/AccIフラグメントを分離した。次いで、HEK11 cDNA配列に基づいて、一対のオリゴヌクレオチドを合成した。第1のオリ ゴヌクレオチドは、HEK11 cDNAのヌクレオチドA1666〜T169 1と同じ配列を有し、AccI部位を含んでいた。第2のオリゴヌクレオチドは 、HEK11 cDNAと逆方向であり、HEK11 cDNA配列のG189 5〜T1919を含んでいた。該オリゴヌクレオチドの5′末端に、追加の10 個の残基モチーフ、CCCGCTTAAGを加えて、AflII部位を導入した。 これは、HEK11受容体のトランスメンブラン領域及び外部ドメインと、同じ 読み取りフレーム中のpSJA1にクローン化されたラットtrkB cDNA の細胞内ドメインとの連結に用いられる。これらのオリゴヌクレオチドをプライ マーとして用い、また鋳型とし てHEK11 cDNAを用いてPCRを実施した。PCRフラグメントをAc cI及びAflII酵素で消化し、SalI/AccI cDNAフラグメント及 びXhoI/AflII線状pSJA1と連結して、HEK11/ラットtrkB (pSJA6)キメラ構築物を作製した。 実施例6 HEK受容体の組織分布 ノーザンブロットハイブリダイゼーションにより、ラット組織及びヒトにおけ るHEK4、HEK5、HEK7,HEK8及びHEK11受容体のmRNA発 現分布を調べた。 Chomczynski及びSacchi〔Anal.Biochem.16 2,156−159(1987)〕の方法を用い、ラットの全RNAを組織から 調製した。該RNAをホルムアルデヒド−アガロース電気泳動により分離し、2 0×SSC(Maniatisら,1982)を用いてHybond−N膜(A mersham,Arlington Heights,IL)に転移した。膜 を真空下に80℃で30分間脱水し、次いで、UV透照装置(transill uminator)(Fotodyne, New Berlin,WI)上で3分間架橋させた。膜を50%ホルムアミド 、5×SSPE、5×Denhardt’s、0.2%SDS及び100μg/ mlの変性ニシン精子DNA(Maniatisら,1982)中42℃で2時 間予備ハイブリダイズした。ヒト組織のノーザーンブロットは、Clontec h(Palo Alto,CA)から購入した。少なくとも1×109cpm/μ gの比活性までのヘキサヌクレオチドランダムプライミングキット(Boehr inger Mannheim,Indianapolis,IN)を用い、受 容体の細胞外ドメインをコードするcDNAのフラグメントを32P−dCTPで 標識してプローブを作製した。1×Denhardt’sを用いた以外は予備ハ イブリダイゼーション緩衝液と類似の緩衝液中、42℃で24〜36時間、1〜 5ng/mlの濃度でプローブを膜にハイブリダイズした。ハイブリダイゼーシ ョン後、それぞれ2×SSC、0.1%SDS中5分間室温で2回、次いで、0 .5×SSC、0.1%SDS中15分間55℃で2回膜を洗浄した。Dupo ntLightning Plus補力スクリーン(intensifying screen)を有するKodak XA Rフィルム(Kodak,Rochester,NY)を用い、ブロットを1〜 2週間露出した。結果を図7〜図11に示す。 HEK4の相同体(homologs)は既にマウス、ニワトリ及びラットか ら同定されている。成熟マウスでは、発現は主として脳と精巣で検出される(S ajjadiら,1991)。わずかに異なるパターンが成熟ニワトリ組織に検 出されたが、主たる発現源は、脳、肝臓及び腎臓であった。低レベルの発現が肺 及び心臓で検出可能であった〔Marcelle & Eichmann,On cogene7,2479−2487(1992)〕。Rek4遺伝子(tyr o−4)のフラグメントを分離し、成熟ラットにおける組織発現の検出に用いた (Sajjadiら,1991)。Rek4 mRNAを発現した唯一の組織は 脳であった。しかし、肺や精巣由来RNAは調べなかった。HEK4に関するこ れまでの実験では、細胞系でのmRNAの発現を調べたに過ぎないが、それは1 つの前B細胞系及び2つのT細胞系で検出された(Wicksら,1992)。 in vivoでの発現に関する上記の重要性はまだ解明されていない。該実験 において、本出願人は、ヒト組織中 でのHEK4の発現だけでなくラット組織中でのRek4の発現をも調べた。H EK4 mRNAは約7kbのサイズの単一転写体(transcript)に 相当する(図7A)。HEK4 mRNAは胎盤中で最も多量に発現されたが、 心臓、脳、肺及び肝臓にも低レベルの発現が存在する。長期露出すると、微量の mRNAが腎臓及び膵臓で検出された。ラットでの発現はマウス及びニワトリで 検出されたものと類似であった。Rek4は本明細書で特性決定したファミリー メンバーのいずれの最低レベルでも発現した。ラットの肺で約7kbの転写体が 検出され、脳ではより低い量が検出された(図7B)。さらに、4kbの転写体 がラットの精巣で発現した。該転写体は全RNAを用いても僅かしか検出されな かったので、他のラット組織は、検出レベル以下のREK4量しか含んでいない ものもあると思われる。 成熟組織におけるHEK5の発現はニワトリ及びラットで既に実験されている 。ニワトリにおける実験では、脳及び肝臓でCek5タンパク質が同定されたが 、より低量のタンパク質が腸でも検出された。ラットでは、tyro−5フラグ メントが成熟した脳でのみmRNAを発現させたことが検出されたが、腸は検査 しなかった(Lai及びL emke、1991)。本出願人による実験の結果は、HEK5 mRNAがH EK4よりはるかに高レベルで発現し、数種のサイズの転写体として検出された ことを示している。最も多量のmRNAは約4.0及び4.4kbのものであり 、9.5kb以上の高分子量転写体は少量であった(図8A)。HEK5 mR NAは胎盤で最も多量に発現したが、脳、膵臓、腎臓、筋肉及び肺でも高レベル で発現した。ブロットをさらに長時間露出すると、心臓及び肝臓でも転写体の存 在が認められた。HEK5のラット相同体(Rek5)はいくらか類似した発現 パターンを示した。Rek5は腸で最も多量に発現し、次いで、脳、腎臓、肺、 胸腺、胃及び卵巣で発現した(図8B)。精巣、筋肉、心臓又は肝臓では発現が 検出されなかった。本出願人は、このファミリーの分析中に、ラットErkフラ グメント(Chan & Watt,1991)もRek5受容体の一部をコー ドするとの結論を下した。数種のラット組織中でErk発現を調べたが、肺にお いてのみ発現が検出された。該レポートと本出願人及び他の人々(Lai & Lemke,1991)が知見したものとの不一致がどうして起こるかは不明で ある。 HEK8の相同体がニワトリ、マウス及びラットから同定されている。成熟ニ ワトリでは、脳において単一のCek8転写体の高レベルの発現が検出され、腎 臓、肺、筋肉及び胸腺でも発現が検出された。HEK8のマウスの相同体、Se kの発現は、成熟脳中で単一転写体として多量に発現したことが検出され、低レ ベルの発現が心臓、肺及び腎臓に認められた。Rek8(tyro−1)のフラ グメントを用いてラット組織における発現を調べたが、脳においてのみ発現が検 出された(Lai & Lemke,1991)。本出願人は、Hek8 mR NAがHEK5と同レベルで発現することを見いだした。多重転写体も認められ たが、最も多量であったのは、7kbと5kbのものであった。最高レベルのm RNAの発現が脳に認められたが、心臓、肺、筋肉、腎臓、胎盤及び膵臓を含む 他の組織にも実質的レベルの発現が検出された。肝臓での発現は他の組織に比べ るとはるかに低レベルであった。ヒト及びマウスの発現パターンにおける唯一の 違いは、ニワトリにおいてCek8の場合にも見られる、ヒト筋肉における発現 であった。ラット組織中では、Rek8は脳で最も高レベルで発現し、次いで、 肺、心臓及び精巣であった(図10B)。 HEK8とは対照的に、Rek8の発現は、HEK8が容易に検出可能であった 二つの組織、即ち、筋肉及び腎臓では低いようであった。さらに、Rek8は、 長期露出してさえ認められなかったので、5.0kb転写体として発現しなかっ た。 本出願人は、このファミリーの分析中に、HEK7はCek7のヒトの相同体 であると推定した。成熟ニワトリで認められた唯一の発現は脳で検出された8. 5kb転写体であった(Sajjadi & Pasquale,193)。本 明細書に記載の5つのEPHサブファミリーメンバーの中で、HEK7がその発 現パターンが最も制限されていた。ヒトmRNAの分析により、脳にだけ有意な 発現が認められ、胎盤でははるかに低レベルの発現しか見られなかった(図9A )。長期露出しても、検査した他のいずれの組織にも発現が認められなかった。 2つの顕著な転写体が脳で検出され、最高レベルで発現したのは、6kbのサイ ズのものであり、他は9kbの長さのものであった。しかし胎盤では、9kbの 転写体のみが検出された。Rek7 mRNAはHEK7と類似のパターンで発 現し、最高レベルの発現は脳で検出され、卵巣でははるかに低レベルの発現し か認められなかった(図9B)。該転写体は、HEK7と類似サイズのものであ り、6kb転写体は脳でのみ検出された。 HEK11は数種の転写体として発現し、長さが7.5、6.0及び3.0k bの多量のmRNA、及び4.4及び2.4kbの少量の転写体が発現した(図 11A)。5つのmRNAは全て脳で最も高いレベルで発現し、次いで心臓であ った。胎盤、肺及び腎臓は5種の転写体中4種を有意な量で発現したが、筋肉で は低レベルの発現しか検出されなかった。膵臓では検出可能な量のHEK11 mRNAはほとんど検出されず、肝臓では検出可能なHEK11転写体は全く認 められなかった。Rek11は類似の発現パターンを有し、脳で4種の転写体( 10、7.5,3.5及び3.0kb)が検出された(図11B)。 検査した全ての組織における5つの受容体それぞれのmRNA発現の相対レベ ルを表5に要約する。 HEK4、5、8及び11の転写体は、ヒト組織中ではかなり広範囲に分布し ていたが、HEK7は脳特異的であった。ラットとヒト組織の発現パターンは、 ラットブロットが全RNAを用いたためにポリA+よりも感度が低かったことを 考えれば、ほぼ似通ったものであった。Sajjadi及びPasqualeに よりCek mRNAにつ いて検出されたように(Sajjadi & Pasquale,1993)、 しばしば単一受容体に対して数種の異なるサイズの転写体が検出された。転写体 のサイズ分布は、組織及び種特異的のようである。これまでの研究により、より 小型のMek4転写体は潜在的に分泌性の(secreted)受容体をコード することが示されている(Sajjadiら,1991)。 以下の章では、実施例1に記載の実験の実施に用いられた材料及び方法を説明 する。HEK受容体cDNAの分離、クローニング及び配列決定 鋳型としてヒト胎児脳cDNAライブラリーからの破壊(disrupted )ファージを用いるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いて、EPHサブファ ミリー受容体の触媒ドメインの一部を含むフラグメントを作製した。CDNAラ イブラリー(Stratagene,La Jolla,CA)の10μlアリ コートを70℃で5分間処理して、ファージ粒子を破壊し、次いで、湿潤氷上で 冷却した。破壊ファージを、総容量100μl中の10×Taqポリメラーゼ緩 衝液10μl、2mMの各dNTP8μl、各プライマー100ピコモル及びT aqポリメラー ゼ(Promega,Madison,WI)1.5μlに加えた。該反応を3 5サイクル実施したが、各サイクルは、96℃で1分間、50℃で1分間及び7 2℃で2分間から構成した。最後に72℃で5分間インキュベートして、完全な 延長が得られるようにした。用いたプライマーはEPHサブファミリーメンバー 間で強固に保持されているアミノ酸配列に基づくオリゴヌクレオチドの縮重(d egenerate)混合物であった。 PCR反応産物をEcoRI及びBamHIで消化し、配列分析するためにM 13mp19〔Messing,Methods Enzymol.(1983 )〕にクローン化した。EPH受容体サブファミリーメンバーのフラグメントで あると同定された5つのクローンをランダムプライミング(priming)に より32P−dCTPで標識し、各クローンを、ヒト胎児脳cDNAライブラリー 由来プラークを含むGenescreenニトロセルロースフィルター(NEN ,Boston,MA)のスクリーニングに用いた。単クローンを得るために、 陽性スクリーニングプ ラークから作製したファージストックを平板培養し、同一プローブで再スクリー ニングした。cDNAライブラリー(Stratagene,La Jolla ,CA)を補ったin vivo切り出し法(excision protoc ol)により、cDNA挿入断片をpBluescriptに転移した。Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencin gキット及びApplied Biosystems 373A自動DNA配列 決定装置(Applied Biosystems,Foster City, CA)を用いてヌクレオチド配列を決定した。5′レース(Race) 製造業者の指示に従い、5′RACEキット(GIBCO/BRL,Gait hersburg,MD)を用いてcDNAの5′末端を分離した。ウルトラフ リー−MC(ultrafree−MC)セルロースフィルター(30,000 分子量カットオフ,Millipore,Bedford,MA)を用い、過剰 なプライマーを第1鎖cDNA合成後に除去した。増幅PCR産物を適切な制限 酵素で消化し、アガロースゲル電気泳動により分離し、Gene cleanキット(Bio101,La Jolla,CA)を用いて精製した 。精製PCR産物を、適切な制限酵素で消化しておいたプラスミドベクターpU C19〔Yanisch−Perronら,Gene 33,103−119( 1985)〕に連結し、連結混合物をエレクトロポレーションにより宿主細菌に 導入した。得られたコロニーからプラスミドDNAを作製した。DNA配列を決 定するために最大挿入断片を含むクローンを選択した。 本発明を好ましい実施態様に関して説明したが、当業者にはその変更及び改変 が考えられるものと理解する。従って、添付請求の範囲にはそのような均等な変 更が全て含まれ、該変更も請求されている本発明の範囲内に包含されるものとす る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI C07H 21/04 0276−2J G01N 33/53 D C07K 14/705 0276−2J 33/573 A 16/28 8502−2B A01K 67/027 C12N 5/10 9284−4C A61K 39/395 D 9/12 9284−4C P G01N 33/53 9358−4B C12P 21/08 33/573 9282−4B C12N 5/00 B // A01K 67/027 9051−4C A61K 37/52 AED A61K 39/395 9051−4C ACJ 9051−4C AAB C12P 21/08 9051−4C ADS (C12N 9/12 C12R 1:91) (81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE, DK,ES,FR,GB,GR,IE,IT,LU,M C,NL,PT,SE),OA(BF,BJ,CF,CG ,CI,CM,GA,GN,ML,MR,NE,SN, TD,TG),AP(KE,MW,SD,SZ,UG), AM,AT,AU,BB,BG,BR,BY,CA,C H,CN,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,GB ,GE,HU,JP,KE,KG,KP,KR,KZ, LK,LR,LT,LU,LV,MD,MG,MN,M W,MX,NO,NZ,PL,PT,RO,RU,SD ,SE,SG,SI,SK,TJ,TM,TT,UA, UG,UZ,VN (72)発明者 ジング,シユキアン アメリカ合衆国、カリフオルニア・91362、 サウザンド・オークス、ボーデロ・レイ ン・3254

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1.EPH様受容体タンパク質チロシンキナーゼの少なくとも1種の生物学的活 性を有するポリペプチドをコードする分離された核酸であって、 (a)配列番号10、配列番号12、配列番号14又は配列番号16のいずれか に記載の核酸並びにそれらの相補的鎖; (b)配列番号10、配列番号12、配列番号14又は配列番号16のいずれか の核酸のコード領域とハイブリダイズする核酸; (c)遺伝コードの縮重がなければ、配列番号10、配列番号12、配列番号1 4又は配列番号16のいずれかの核酸のコード領域とハイブリダイズする前記( b)の核酸;からなる群から選択される前記核酸。 2.真核又は原核宿主細胞において請求項1に記載の核酸により発現したポリペ プチド産物。 3.ヒト由来のものである請求項1に記載の核酸。 4.配列番号10、配列番号12、配列番号14又は配列番号16のいずれかに 示されているアミノ酸配列の一部又 は全てを有するポリペプチドをコードする、請求項1に記載の核酸。 5.EPH様受容体の細胞外ドメインを含むフラグメントをコードする、請求項 1に記載の核酸。 6.cDNA、ゲノムDNA、合成DNA又はRNAである、請求項1に記載の 核酸。 7.E.coli宿主細胞中での発現に好ましい1つ以上のコドンを含む、請求 項1に記載の核酸。 8.哺乳動物細胞中での発現に好ましい1つ以上のコドンを含む、請求項1に記 載の核酸。 9.配列番号10に記載のアミノ酸6〜524、及び、場合によって、アミノ末 端メチオニル残基をコードする核酸。 10.配列番号12に記載のアミノ酸1〜547、及び、場合によって、アミノ 酸末端メチオニル残基をコードする核酸。 11.配列番号14に記載のアミノ酸21〜547、及び、場合によって、アミ ノ末端メチオニル残基をコードする核酸。 12.配列番号16に記載のアミノ酸23〜553、及び、場合によって、アミ ノ末端メチオニル残基をコードする核 酸。 13.異種受容体細胞質ドメインに融合したEPH様受容体細胞外ドメインを含 むキメラタンパク質をコードする核酸。 14.細胞外ドメインが、HEK5、HEK7,HEK8及びHEK11細胞外 ドメインからなる群から選択される、請求項13に記載の核酸。 15.請求項1の核酸を含む生物学的に機能的なプラスミド又はウイルスDNA ベクター。 16.請求項15のプラスミドで安定に形質転換又はトランスフェクトされた原 核又は真核宿主細胞。 17.請求項16の宿主細胞を培養して該宿主細胞にEPH様受容体タンパク質 チロシンキナーゼを発現させることを含む、EPH様受容体タンパク質チロシン キナーゼを産生する方法。 18.配列番号10、配列番号12、配列番号14若しくは配列番号16のいず れかに示されているアミノ酸配列、又はそのフラグメント若しくは類似体を有し 、EPH様受容体タンパク質チロシンキナーゼの少なくとも1種の生物学的活性 を有する分離されたポリペプチド。 19.精製・分離されたHEK5受容体。 20.精製・分離されたHEK7受容体。 21.精製・分離されたHEK8受容体。 22.精製・分離されたHEK11受容体。 23.生物学的活性がリガンドの結合である、請求項18に記載のポリペプチド 。 24.ヒト由来のものである、請求項18に記載のポリペプチド。 25.外因性DNA配列の原核又は真核細胞発現の産物であることを特徴とする 、請求項18に記載のポリペプチド。 26.外因性DNAがcDNAである、請求項25に記載のポリペプチド。 27.外因性DNAがゲノムDNAである、請求項25に記載のポリペプチド。 28.請求項18のポリペプチドを特異的に結合する抗体又はそのフラグメント 。 29.モノクローナル抗体である、請求項28に記載の抗体。 30.医薬上許容し得るアジュバント、担体、可溶化剤又は希釈剤と混合した、 治療上有効量の請求項18のポリペ プチドを含む医薬組成物。 31.医薬上許容し得るアジュバント、担体、可溶化剤又は希釈剤と混合した、 治療上有効量の請求項28の抗体を含む医薬組成物。 32.有効量の請求項18のポリペプチドを投与することを含む、EPH様受容 体タンパク質チロシンキナーゼの内因性活性化を調節する方法。 33.アンチセンスオリゴヌクレオチドを請求項1の核酸とハイブリダイズする ことを含む、EPH様受容体タンパク質チロシンキナーゼの合成を調節する方法 。 34.請求項18の受容体ポリペプチドに結合するリガンドを同定する方法であ って、 (a)少なくとも1つの分子を、受容体/リガンド複合体を形成させるに十分な 時間受容体ポリペプチドに露出する段階; (b)複合体を形成していない分子を除去する段階;及び (c)受容体ポリペプチドに結合した分子の存在を検出する段階; からなる前記方法。
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