JPH08501442A

JPH08501442A - オリゴヌクレオチド配列と麻薬麻酔への感度低減性をもつｄｎａ感染された遺伝子導入動物

Info

Publication number: JPH08501442A
Application number: JP5518364A
Authority: JP
Inventors: ナンシー，エム．リー，; ホラス，エイチ．ロー，; デイビットリップマン，
Original assignee: ダズパートナーシップ
Priority date: 1992-04-10
Filing date: 1993-03-29
Publication date: 1996-02-20
Also published as: CA2117756A1; AU677200B2; WO1993021309A1; NO943808D0; NO943808L; EP0643768A1; AU4276993A; EP0643768A4

Abstract

(57)【要約】クローン（ＳＥＱＩＤＮＯ：１，ＳＥＱＩＤＮＯ：２，およびＳＥＱＩＤＮＯ：３）であって、分離されて配位決定されている。１つのアンチセンス構造はＳＥＱＩＤＮＯ：１であって、細胞中におけるオピオイドの結束を阻止し、そして遺伝子変換された動物であって、麻薬的な麻酔に対して減少させた感度を持つ。前記オリゴヌクレオチド配位は動物中にその胚形成段階において、最初の約５００基対の中から導かれるが、方向において反転させられている。本発明のオリゴヌクレオチド構造は治療上および診断上の薬剤として有用である。

Description

【発明の詳細な説明】発明の名称オリゴヌクレオチド配列と麻薬麻酔への感度低減性を持つＤＮＡ感染された遺伝子導入動物発明の分野本発明は一般的にはオピオイドリセプタ（モルヒネ用合成麻酔薬受容体）に関連し、さらに詳しく言えばオリゴヌクレオチド構造であって、遺伝子導入した人間以外の動物を製造することができ、そのような動物はネズミ目の動物であって、麻酔薬に対する鎮痛性への感度が減少させられており、麻酔常用者の診断のためのプローブまたは治療の処置のために用いることができる。この発明は、米国政府の支援を受けたものであって、認可番号ＤＡ００５６４，ＤＡ０２６４３，ＤＡ０１５８３であって、国の保健衛生省により与えられたものである。政府はこの発明についてある権利を所有している。発明の背景 μ−オピオイド特殊体リセプタ蛋白は、５８，０００ダルトンの単一分子重さの均一性を明らかに保つように純化され、それはチャオ等，プロシーディングオブナショナルアカデミーオブサイエンス米国８３（１９８６），４１３８頁から４１４２頁に示されている。しかしながらこのラットからの蛋白質はある種の脂質によって再構されたときにのみ高い結束活動を示した。前記脂質の役割は恐らく特殊な蛋白質の形成を安定化させるものであると推定される。ハセガワ等，ジャーナルオブニューロケミストリー，４９巻４号（１９８７），１００７頁から１０１２頁。多クローン性抗体は牛の脳からの生成されたオピオイドリセプタに対して抗体であることが報告されている。ロイ等，バイオケミストリーアンドバイオフィジックスリサーチコミュニケーション１５０巻１号（１９８８）の２３７頁から２４４頁。単一クローン抗体が純化されたオピオイドリセプタ蛋白に対するものであることが指摘され、そしてデータは前記蛋白質がμおよびδおよびある範囲においてκ リガンド（配位子）に近親性を持っていることが示唆されている。ロイ等，バイオケミストリーアンドバイオフィジックスリサーチコミュニケーシヨン１５４巻２号（１９８８），６８８頁から６９３頁；ロイ等，バイオケミカルファーマコロジイで−−ビー．ビー．ブロディに捧げる，エド．コスタ，イー．，ニューヨーク：ラーベンプレス社（１９８９），１７７頁から１８８頁。１９８９年に純化されたオピオイド結束体蛋白であって、牛の脳からのものがｃＤＮＡクローニングによることで特徴づけられた。蛋白質の第１次の配列はｃＤＮＡクローンから特にそれらの分子が細胞内の結束に関連する免疫グロブリン蛋白の上科の種々のメンバーに均一性を持つ連結であることが見出された。スコフィールド等，ザイーエムビーオージャーナル，８巻２号（１９８９）４８９頁から４９５頁。発明の要約本発明の１つの特徴は、新しく発見されたクローンに対応するＤＮＡのセグメントである。このＤＮＡセグメントはアンチセンス方向であるように準備されている。ＤＮＡ構成の製造物は内因性のｍＲＮＡでオピオイド結束蛋白のためのものに雑種形成し、そしてそれは細胞内（遺伝子導入動物）の中で培養されたものであって、麻酔の鎮痛作用に対する減少した完成を備えている。本発明のオリゴヌクレオチド構造はＲＮＡであり得る。オリゴヌクレオチド構成がＲＮＡまたはＤＮＡであるかは、それらが劣化に対して生体状態で抵抗があるように好ましく変形される。本発明によるオリゴヌクレオチドの使用としては診断目的または治療剤としてまたはプローブがあげられる。治療剤としてはそれらは好ましくは患者に対して治療的な投与の手段を持つことである。配位は１２基程度（１重螺旋）または１２基対（２重螺旋）が使用され、例えば麻薬常習者の治療的処置として用いられる。図面の簡単な説明図１はナロキソンの存在下の硫化モルヒネの侵害受容拒否能力を制御動物（遺伝子導入されていない）および本発明による動物（遺伝子導入されている）がモルヒネの前処置を受けた後で、本発明による遺伝子導入された動物がモルヒネに対する低下させられた感度を記録していることを示しており；そして図２は本発明による遺伝因子がコーディングのための領域とアンチセンスの発生のために用いられた領域れは哺乳類の表現でベクトルｐＳＶＬＳＶ４０に関係していることを示し、そして顕微鏡注射により導入されたものはマウスに導入された結合体は図１のデータに関連する遺伝子変形されたものに応えようとする。好適な実施例の詳細な説明本発明は感度（例えば細胞または動物）が、麻薬的種々のアルカロイド，例えばモルヒネ，モルヒネ塩（例えばモルヒネ水素臭化物，モルヒネ水素塩化物，モルヒネムスケイト，モルヒネオレイン酸，モルヒネＮ −酸化物，およびモルヒネ硫化物）およびモルヒネ類似体およびモルヒネ塩、例えばモルヒネ，ジアセチルジハイドロモルヒネ，ジアセチルモルヒネハイドロクロライド，コカイン，およびジセチルモルヒネ（ヘロイン）を意味する。その他広く用いられている麻酔性の鎮静剤はアルファプロダイン，メタドン，メレピリディン，ラバリファノール，プロポキシフェン，フェンタニール，オキシモルヒネ，アニルリダインおよびメトポンである。さらに麻酔性の鎮静剤としては、内因性のオピオイド（例えば、エンドロフィン）および合成オピオイドペプチド（例えば、Ｄ−Ａｌａ−２，Ｄ−Ｌｅｕ−５エンケファリン）。よく知られているように最近の少なくともこれらの麻酔性の鎮静剤の連続的な使用は、習慣性または中毒状態になる。しかしながらそれらの乱用の程度にも関わらず、これらの麻酔性の鎮静剤は治療的な用途，例えば患者が痛みを減少させるための慢性的な治療を必要とする場合である。そのような治療的な使用でさえも、患者は典型的にこれらの麻酔的な鎮静作用に対する耐性を増加させ、その結果痛みから開放することを助けるために投与量を増加させる。好ましくない副作用が大量の麻酔性鎮静剤の投与を招く。対向性の作用および麻薬麻酔の依存性製造物質は種々の人間を除く哺乳類について可能であり、またその研究が成されて、なぜならば、現実に政治的な配慮でしばしばそれらの研究はまずはじめに小さいげっ歯目の動物とかまたはサルによって人間にテストする前に薬物の麻酔性素質についての研究が成される。今日に至ってしかしながら、人間以外の哺乳類に対してモルヒネのように作用する薬物は人間においてもモルヒネ同様の作用をすることが見出されている。そして種々の麻酔上の検定（アッセイ）は人間中に発生するであろう物質を予言するための広範囲の受容性を持つ動物について行われてきた。本発明は一般的にはいくつかのクローンであって、オピオイドリセプタとしてられる新しいクローンでオピオイドリセプタ機能を持つ蛋白質のためのコードに関する。我々はＤＮＡ移転したマウスであって、ＤＵＺ１のアンチセンスの特異な領域のものであって、これらの遺伝子導入された動物はモルヒネの効果に対する反痛覚に対する感度を減少させることを示した。これらの遺伝子導入された動物およびオリゴヌクレオチド構造の下にあるものは、例えば麻薬の麻酔に対する常習者のための診断または処置のために有用である。例えば、本発明による応用は、常習者の治癒される可能性のあるものの処置に有効であり（なぜならば、本発明による耐性の発見については向けられていないからである）。これに加えて患者であって、痛みをやわらげるために麻酔の処置を常習的に要求する患者、例えば末期癌患者について本発明により、オピオイドリセプタ因子の発展を阻止するためにアンチセンスフラグメントの投与によることがでぎる。これは患者は麻薬的な麻酔の鎮痛効果を維持することができ、例えばモルヒネのようなものに対する耐性を維持することができるが、それに対する耐性の発展は阻止される。その結果として計量の麻薬性の麻酔の投与で種々の知られている副作用（呼吸の抑圧とか停止）であって、それらは永年的な麻薬麻酔の大量投与によるものを減少させることができる。本発明の特徴にしたがう診断のセットは、患者が麻薬常習者からまたはその程度を決定するために使用することができる。例えば、患者から取られた細胞のサンプルが本発明によるオリゴヌクレオチドを選び出すことによって可能である。患者の細胞中のオピオイドリセプタ因子の検出、例えば、血液細胞は麻薬性麻酔に対する耐性（すなわち常習者であるかどうかを）の検査、スクリーンすることができ、麻薬性の麻酔に対する耐性を持っていないものと区別することができる。本発明による治療が患者への投与の形で行われるときには、１重の螺旋の形態がより有効であるように思われる。しかしながら、２重螺旋の形態も生体においてより多くの抵抗性を持ち（すなわち、酵素性の分解またはそれらと同等）、しかしながら、その作用は１重螺旋の形式のものが使用された場合に比べて迅速ではない。本発明によるオリゴヌクレオチドは人間のゲノムの連鎖のプローブとして、そしてアヘン誘導体リセプタの他のサブユニットの発見のために用いられる。我々がＳＥＱＩＤＮＯ：１，ＳＥＱＩＤＮＯ：２，およびＳＥＱＩＤＮＯ：３として与える配位はｃＤＮＡである。本発明によるオリゴヌクレオチドをＲＮＡの形ではなく使用したいときには、よく知られているようにＲＮＡヌクレオチド（例えば、チミンをウラシルで置き換えたもの）を準備する手続きにより利用することができるであろう。本発明によるＤＮＡまたはＲＮＡの構造は少なくとも通常の生体での劣化を制限し、単発分解酵素または他の酵素への抵抗性を分配するためにホスホジエステルの高分子バックボーン構造を変形したものを持つ。これはオリゴヌクレオチドのアンチセンスが特定の遺伝因子の妨害因子として働くときを示すからであり、主要な問題は高速に細胞または自然に発生するホスホジエステルのバックボーン構造の急速な劣化に遭遇することであり（例えば、ホッケ等のニュークライアシッドリサーチ，１９（１９９１）の５７４３頁から５７４８頁を参照されたい）。ＤＮＡとＲＮＡの延ばされたバックボーンとリン酸塩，バックボーンの一部または全部を置き換える方法は、例えば、ニールセン等のサイセンス，２５４頁（１９９１），１４９７頁から１５００頁で報告されている。これらのキメラのオリゴヌクレオチドは安定したヘテロ２本鎖で相補的な１重のＤＮＡを形成することができる。本発明の構成は通常のホスホジエステルのバックボーンを多くの合成または反合成の同位体であって、核の元の置換器の距離と方向を真似ることができる合成または反合成の同位体で置き換えることができるということにおいて有用である。そのような変形はメチルホスホン酸基，ホスオラミデイト，ホスホロチオエイチルグリシン）またはリボースからチクロアルカンまたは部分的に不飽和のチクロアルカンに置換する手段によって行われる。クローンの部分は１９８９年の論文であって、我々の研究所によって行われたもの（スコフィールド等，前述）はアンチセンスｃＤＮＡを用意するために用いられた。１つの核外遺伝子がそれから製造され、それはラットのＯＢＣＡＭｃＤＮＡであって、真性の発現ベクターｐＳＶＬを用いるものの挿入を含んで構成された。例１に示されているように細胞が同一の数のδ−オピオイドリセプタが前記核外遺伝子でＤＮＡ感染させられて、それからオピオイドの結束がブロックされた。本発明によるクローンは先にスコフィールド等，前述によって発行されたものと共通するコーディング領域を持っているが、本発明によるクローンは特異な領域を持っている。これらの特異な領域はプローブを準備する段階において好ましいものであり、ＤＮＡまたはＲＮＡ構造，治療的，およびまたは診断的な薬剤であって、遺伝子導入動物であって、麻酔の鎮痛作用に対して変形された応答を示すものに好ましいものである。例２は我々の３つのクローンの分離について記述されている。最大のクローンであって、我々がときどき１によって与えられる）はそのＣ−ターミナル３１８アミノ酸ＯＢＣＡＭに対して比較し得る読み取りフレームを持っているが、そのＮ−ターミナルのアミノアていない領域とも異なる。んどは例３（アンチセンス方向）に記述されているように遺伝子導入されたマウスであって、モルヒネに対する（コントロール動物として痛みを殺すために３倍ものモルヒネを必要とする）モルヒネの応答を劇的に変化させたものである。ＳＥＱＩＤＮＯ：２）によって与えられるものお配位はＳＥＱＩＤＮＯ：３）によって与えられるものであって、それらはアンチセンス構造と投与に有効である。前記ＳＥＱＩＤＮＯ：３クローンは特本発明による遺伝子導入された動物は例えば、本発明による細胞培養、そこにおいては、動物からの体細胞が培養され、そしてそれから動物からの細胞培養を提供するために用いることができ、そしてそれからそれは、種々の診断または分析の技術に用いられる。遺伝子導入は動物に遺伝子導入された本発明による人間でない動物を製造するものであって、それはオリゴヌクレオチド配位が動物に導入されたものを含んでいるか、動物または動物の先祖に導入されたものを含んでおり、それは胚形成期に行われる。オリゴヌクレオチド配位は動物中に明確に現れており、そしてそれは動物の麻薬麻酔に対する応答を実験例３で示されるであろうように変更する。オリゴヌクレオチド配位は動物に導入されたものは転写ユニットを形成し、それは動物において伝達ＲＮＡ合成物であり、それはオピオイド結合蛋白のための内因性のｍＲＮＡを考察することができる。動物の麻薬麻酔に対する変更された応答は例えば、麻薬麻酔に対する感度を減少させることである（例えばモルヒネとしてモルヒネ類似体，内因性のオピオイドまたは合成オピオイドペプチド）。例えばオリゴヌクレオチド配位は動物に導入されたものは好ましくはＳＥＱＩＤＮＯ：１，ＳＥＱＩＤＮＯ：２，ＳＥＱＩＤＮＯ：３の中の全部または一部が選択されるが、しかしここにおいて、選択された配位（またはその部分）はアンチセンス方向の読み取りの中に読み取られる。かくして、実験例３はそのような５００基対のＳＥＱＩＤＮＯ：１（ＳＥＱＩＤＮＯ：１の新規な部分）に用いられたが、しかし遺伝子構成中のアンチセンス方法に用いられた。かくして本発明の特徴はＳＥＱＩＤＮＯ：１，ＳＥＱＩＤＮＯ：２およびＳＥＱＩＤＮＯ：３の全部または一部に対応する片節（セグメント）を含むＤＮＡまたはＲＮＡ構造を使用することであるが、方向については反対方向に示されているものであって（もしその構造がＲＮＡの場合にはＲＮＡ基を持っている）。片節（セグメント）は好ましくは内因性のｍＲＮＡとオピオイド結合蛋白質のために交雑するための充分な大きさをもっていることが好ましい。我々はその充分な大きさとは１２基（１重螺旋の場合）または１２基対（２重螺旋の場合）と信ずる。これよりも短い配位では特異性が失われる。本発明による構造は動作的に表現ベクター，例えば哺乳類の表現ベクターまたはレトロビールス的発現ベクターまたはそれらではないものに動作的に連携させられているであろう。すなわち、多くの治療的投与において１つの発現ベクターは必ずしも必要ではないと信じられており、そしてその構造は例えば直接に投与（１重螺旋または２重螺旋）で直接に患者に多くの処方に従って投与される。しかしながら、先にも述べたように本発明の構造は好ましくは分解への抵抗力を変更させられたものであり、例えば少なくとも通常のホスホジエステルのバックボーンが体内における分解を制限するために効果的である同位体によって変形させられている。我々のＤＮＡ構造の治療的な要素は麻薬麻酔の常習者であって、その常習性から治するのであるが、耐久力の展開を阻止するために投与することを含む。例えば、より少ない発明的なアンチセンス構造が因子の発現の抑圧のために用いることができる。我々は現実の１回分の投薬量として１０ｍモルまたはそれ以上の投薬量を予定しており、治療の期間はオリゴヌクレオチド治療の発展に関連して、担当の医者によって決定される。我々は下記の投与手段と方法が使用できると確信しており、それは皮膚経由投与または、鼻からの投与およびパッチ技術とさらには微量注射も含まれる。かくして本発明は診断または治療剤を含み、それはオリゴヌクレオチドであって、少なくとも１２基を１重螺旋のときに持ち、２重螺旋のときは１２基対を持ち、そしてバックボーンを持ち、そのバックボーンはオリゴヌクレオチドが実質的にＤＮＡ基（または２つのＲＮＡ同位体）で、ＳＥＱＩＤＮＯ：１，ＳＥＱＩＤＮＯ：２およびＳＥＱＩＤＮＯ：３の全部または一部に相当し、しかしそのアンチセンス方向であり、および患者へのオリゴヌクレオチドの治療的投与の手段を含む。そのような治療的投与手段はパッチテストおよび生理学的に受入れ可能な溶液とか媒体を含む。本発明の特徴は例１から３，および図１および２を参照して行われるが、それらは説明のためのものであって、本発明を制限するためのものではない。以下の略語が用いられる：ＯＢＣＡＭ，オプチド結束細胞接着分子；ｃＤＮＡＯＢＣＡＭ，ＯＢＣＡＭ符号化された因子のＤＮＡコピー；ｂＯＢＣＡＭ，オプチド結束細胞接着分子を符号化された牛の遺伝因子；ｒＯＢＣＡＭ，ラットのＯＢＣＡＭ；ｐＢＯＭ，牛のオピオイド結束分子のためのｃＤＮＡ；ｐＲＯＭ，ラットのオピオイド結束分子用のｃＤＮＡ；ｂｐ，基の対；ＰＣＲ，ポリミラーゼ鎖反応；ＲＴ，逆転写ＨＥＰＥＳ，４−（２−ヒドロオキシ）エチル−１−ピペラジンエタンスルホニック酸；ａａ，アミノ酸（ｓ）；ＤＵＺ２，ＵＺ文献からのクローン２；ｋｂ，キロベース（ｓ）または１０００ｂｐ；ｎｔ，ヌクレオチド（ｓ）；ＵＺ，ｃＤＮＡのライブラリーによって製造されたものであり、ラットの脳のポリ（Ａ）⁺ＲＮＡ（クローンテック）とストラタ遺伝因子のユニザップＸＲ。例１細胞線のＤＮＡ感染用の核外遺伝子構造核外遺伝子は標準的な組換体技術によって構成された。真核性の発現ベクター，ｐＳＶＬが用いられた。前記ラットＯＢＣＡＭｃＤＮＡがＳｍａＩによって消化され、そして６４９− ｂｐの片がアガローズゲル状に分離された。このＳｍａＩ片はラットのＯＢＣＡＭｃＤＮＡの電気ＡＵＧ（遺伝子暗号）であって、２７２ｂｐの上流の前記ＡＵＧと３７７ｂｐの下流を持つものをブラケットした。この破片はＳｍａＩ割られたｐＳＶＬの準備にリゲートされ、大腸菌の菌ＤＨ５α応答性のあるセルの変換によって従われた。アンピシリン抵抗性の２０個のコロニーからの核外遺伝子は分離され、２０個中９個のコロニーは６４９ｂｐの挿入を含んでいることが示された。内部ＸｈｏＩサイトの割れ目によって前記挿入の方向が検証された。２つのコロニーであってセンスまたはアンチセンス方ＶＬセンスとｐＳＶＬアンチセンスの方向が正しいかどうか確信するために核外遺伝子ＤＮＡはＫｐｎＩおよびＰｖｕＩＩによって消化された；生成物はｐＲＯＭ配位から期待されるものに対応していた。細胞培養およびＤＮＡ形質移入ＮＧ１０８−１５神経細胞種Ｘグリオーマ（膠種）細胞が組織培養中に成長させられた。組織媒体要素はＧＩＢＣＯから購入された。ウシの胎児の血清はハイクロン社を介して得られた。カルシウムリン酸媒介のＤＮＡ形質移入が次のようにして行われた。第１日、細胞はほぼ１．２×１０⁶細胞／１０ｃｍ皿の密度で植付けられた。第２日、形質移入の３時間前に全ての媒体は除去されて、１０ｍｌの新しい媒体と置き換えられた。２０から３０μｇの核外遺伝子ＤＮＡ（１：５０の比のｐＳＶＬセンスまたはｐＳＶＬアンチセンスプラス選択できる核外遺伝子ｐＳＶＮｅｏ）が形質移入されてプレートされた。プレートは一晩中３７℃で５％の炭酸ガス雰囲気中で培養された。第３日、媒体は除去され、そして食塩加リン酸緩衝液で２回細胞が洗われて２０ｍｌの新鮮な媒体が追加され、そして培養は１０％の炭酸ガス雰囲気，温度３７℃で一晩中培養された。第４日、前記細胞は適当な比率（１：３から１：５）に分割され、そして１０％の炭酸ガス雰囲気，温度３７℃の新鮮な媒体内で選択が始められる前２４時間培養された。第５日、媒体は除去され、そして媒体（Ｇ４１８サルフェイトで現実に４００μｇ／ｍｌの濃度）が次の４週間使用された。前記媒体は１週間に２回の割合で換えられ、抵抗性コロニーが可視化された。一般的に言って、各々の１０ｃｍの皿の１０から３０のコロニーが観察された。そして１つのコロニーが分離され、個々のセルラインへと拡張された。拡散の準備これらのコロニーからのポリ（Ａ）⁺ＲＮＡが１０ｃｍの皿中の培養から分離された。ポリ（Ａ）⁺ＲＮＡであって、ラットの脳からのものはクロンテック社から購入された。ゲノミックＤＮＡはラットの脳，ＮＧ１０８−１５，ＳＴ８− ４，およびＳＴ７−３から分離された。重合酵素鎖反応オリゴデオキシヌクレオチドプライマー（ノーザンバイオサイエンスインコーポレイテッド，ハーメル，ＭＮ）によって合成されたもの（括弧内に示されている数字はｐＲＯＭの配位中の位置を示す）：ＲＰＪ１，〔ヌクレオチド４８２−４９９〕；ＲＰＪ２，〔ヌクレオチド６２０−６０３〕；ＲＰＪ３，〔ヌクレオチド１５８−１７２〕；ＲＰＪ４，〔ヌクレオチド７６０−７４３〕；ｍＲＮＡＰＣＲ逆転写．１０ｎｇのポリー（Ａ）⁺ＲＮＡが、５０ｍＭのトリス−ＨＣＬ（ｐＨ８．３），３ｍＭのＭｇＣｌ₂，７５ｍＭＫＣＬ，２．５ｍＭのジチオスレイトール，１ｍＭの各ｄＮＴＰ，２０単位のＲＮａｓｅの阻害遺伝子（プロメガバイオテック），２００ユニットのモロネイマウス白血球バイラス逆転写酵素（ＧＩＢＣＯ／ベセスダリサーチラボラトリース）および５０ｐｍｏｌの任意のヘキサマーを含む反応液２０μｌ中に加えられ、そして４２℃で１時間培養された。反応は５分間９９ ℃に加熱することによって阻止された。増幅．２０μｌのｍＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッドに８０μｌのＰＣＲ溶液であって、１５ｐｍｏｌの各々のプライマーと２．５ユニットのタックＤＮＡポリミラーゼが加えられ、そして混合物は６０μｌのミネラルオイル（パーキンエルマーセタス）上に被せられた。最終的なＭｇＣｌ₂の濃度は３．８ｍＭであった。反応混合物が９４℃で５分間加熱されることによって変性された後に、ｃＤＮＡはパーキンエルマーＤＮＡ熱サイクラーで３５サイクルだけ増幅され、変性ステップは９４℃で３０分，アニーディング工程は５５℃で３０秒，拡張工程は７２℃で３０秒，行われた。ＤＮＡＰＣＲＤＮＡＰＣＲは５０ｍｇのゲノミックＤＮＡ，１５ｐｍｏｌの各プライマー，２０ｎｍｏｌの各ｄＮＴＰが５０ｍＭＫＣＬ中に存在するもの，１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３），１．５ｍＭのＭｇＣｌ₂ および０．００１％（Ｗ／Ｖ）のゼラチンを含む１００μｌ中に含む溶液中でＤＮＡＰＣＲが行われた。熱サイクルの条件は上述したとおりである。これらのＰＣＲ生成物はアガローズゲル状で電気泳動処理され、そしてマグナグラフナイロン膜に移された。前記膜は、³²Ｐ−ラベルされたＳｍａＩ片を用いて、ハイブリゼーションするために用いられた。ノーザンブロッティング法７μｇのポリ（Ａ）⁺ＲＮＡは熱変性されたホルムアルデヒド／アガローズ（１％）ゲル状で分割され、そしてマグナグラフナイロン膜（ミクロンセパレイションインコーポレイテッド）へ移された。ｐＲＯＭの前記ＳｍａＩ片とＰＣＲ製品の１３８ｂｐであって、ＲＰＪ１とＲＰＪ２の間にあるものは、〔α−³²Ｐ〕ｄＣＴＰとランダムヘキサマー（ファインベルグおよびボーゲルスタイン，１９８３）を用いることによって、ラベルされた。交雑は前述されたように（トーマス，１９８０）で³²Ｐ−ラベルドプローブを用いることによって行われた。前記ナイロン膜は４０分間６８℃で１×ＳＳＣおよび０．５％（Ｗ／Ｖ）のナトリウムドデシルキ硫化物（アン等，１９８７）において４０分間培養されて洗われた。前記ＳＳＣ組成は０．５Ｍの食塩と４５ｍＭのナトリウムシトレートをもっていた。ＰＣＲプロダクトの塩基配列の決定ＲＰＪ１とＲＰＪ２間のＰＣＲ製品は反応液から抽出された。鈍い端部にするために抽出されたＤＮＡは０．１ｍｇ／ｍｌの牛の血清アルブミンの存在下に２ユニットのＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（プロメガ）とともに培養され、そして１００μＭの各々のｄＮＴＰで３７℃で５分間行われた。この反応は７５℃で１０分間の加熱によって停止させられた。鈍い端部を持つ前記ｃＤＮＡはスピンコラム（ベーリンゲルマンハイム社）によって集められた。そしてｐＵＣ１９ベクター（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）のＳｍａＩサイトの中にクローンされた。多重コイル核外遺伝子ＤＮＡはシーケナーゼ（ユナイテッドステイトバイオケミカル）を用いて、塩基配列の順序決定が成された。膜の準備食塩カロリン酸緩衝液／ＥＤＴＡ（リン酸塩バッファ＋１ｍＭのＥＤＴＡ）中における細胞は収穫され、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４），０．３２Ｍスクロース中で同質化され、そして１，０００×ｇで遠心分離された。結果として得られた上澄みは１００，０００×ｇで遠心分離され、そしてペレットは２５ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４中）で再懸垂された。リセプタ結合検定細胞膜（約３００μｇ）は９０分間室温において、ラベルされた配位子に（特に記載されない限り２ｎＭで）１μＭのラベルされていない配位子の存在または不存在下で２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）の中で培養された。結束検定のために使用された前記配位子はトリチューム化されたディプレノルフィン（オピオイド），スコポラミン（ムスカリン状），ロウヲルシン（α₂−アドレナリン性）および¹²⁵Ｉ−インシュリンであった。前記ラベルされていない配位子であってオピオイド，ムスカリン状のもの，α₂−アドレナリン状のもの，およびインシュリン結束検定に用いられるものはＤ−Ａｌａ²−Ｄ−Ｌｅｕ⁵−エンケファリン（ＤＡＤＬＥ）または種々の他のオピオイド配位子，アトロフィン，フェントラミン，およびインシュリンのそれぞれであった。前記反応はＧＦ／Ｂフィルターズ（ファットマン）で濾過することによって終了させられ、前記フィルタは３回ＨＥＰＥＳバッファ緩衝液で洗われ、そしてシンチバース−ＢＤ（フィッシャー）に一晩中シンチレーションカウンタの中でスタンドすることが許容された。結果ＮＧ１０８−１５細胞中のＯＢＣＡＭのｃＤＮＡの検出のためのＲＴ−ＰＣＲの使用．ｐＲＯＭから導き出されたセンスまたはアンチセンスｃＤＮＡを持ってＮＧ１０８−１５細胞をＤＮＡ感染させる前に前記ｐＲＯＭ配位または高度に類似性を持つもののｐＲＯＭの配位がこれらの細胞中に存在することを示すことは必要であった。ｐＲＯＭをプローブとして用いるノーザンブロッティング分析ではＯＢＣＡＭのための転写はほとんどわずかにマイクログラムのポリ（Ａ）⁺ ＲＮＡであって、ＮＧ１０８−１５細胞（データは示されていない）をほとんど検出できなかった。この観察はＮＧ１０８−１５の細胞がラットまたはマウス細胞線から導かれたものであるという事実に照らして期待できなかったものであり、ｐＲＯＭそれ自身またはラットからまたは高度に同化された分子であって、恐らくマウス中に存在するものを含むことが期待された。ノーザンブロットは比較的に検定システムに対して感度がない。もっと高い感度を持つアプローチとして我々はＲＴ−ＰＣＲを使用した。２つの対のプライマーはこの実験において、計画され合成された。ＲＰＪ１および２はｐＲＯＭのヌクレオチド６８２−４９９および６０３−６２０からそれぞれ構成されており、そしてＲＰＳ５と６はｐＲＯＭヌクレオチド１５８−１７２および７６０−７４３をそれぞれを含んでいた。後者の２つはセンスとアンチセンスｃＤＮＡのために領域が使用されたものをかけ渡すために選ばれ、しかしながらこの領域はコード化されていないシーケンスを含み、それは異なった種間の低いホモロジーとして検出を期待された。かくして我々はＲＰＪ１および２を使用し、それは短い領域で完全に読み取りフレーム内に属するものをかけ渡した。予想される大きさであるほぼ６００ｂｐのＲＰＳ５および６を用いた生成物はセンスまたはアンチセンスＤＮＡ感染されたセルで感染されていないものではなくて検出された。ＲＰＪ１および２を用いることにより、しかしながら、予期された１４０ｂｐの生成はコントロールおよびＤＮＡ感染されたセル中に発見された。２つのクローン，ＮＧＪ２およびＮＧＪ６であって、ＲＰＪ１とＲＰＪ２間のＰＣＲ生成物の塩基配列が決定された。ｐＲＯＭまたはｐＢＯＭからわずかなヌクレオチドだけ異なっていた。そしてヌクレオチド配列におけるこれらの差異は誘導されたアミノ酸の配列に影響を与えるものではなく、その配列は牛とラットのＯＢＣＡＭと同一であった。２つのＰＣＲ誘導クローン間の僅かな差異は一方において、ＮＧ１０８−１５細胞の不均一性かまたは前記タックポリメラーゼによって導かれた誤差によるものかもしれなかった。これらの誘導されたアミノ酸配列における保存性はこれらのＲＴ−ＰＣＲ製品がＮＧ１０８−１５細胞のｃＤＮＡに対応するものであることを示唆した。センスまたはアンチセンスＤＮＡで成功裏に遺伝子感染させられたクローンの特定．ＯＢＣＡＭの機能をさらに研究するために我々はＮＧ１０８−１５細胞中のセンスまたはアンチセンスｐＳＶＬｐＲＯＭの安定的に細胞感染させられるものを発生させることを試みた。ｐＳＶＬセンスからの１２個の個々のクローンおよびｐＳＶＬアンチセンス細胞感染からの９つのクローンがＧ４１８抵抗の基準で選び出され、そして１０ｃｍの培養皿に展開した。適当なＲＮＡを含んでいるクローンはノーザンボルティング解析で前記ＳｍａＩ破片をプローブとして用いることによって特定化することができた。しかしながら、７μｇのポリ（Ａ）⁺ＲＮＡであって、ＮＧ１０８−１５細胞からのものであり、ラットのＯＢＣＡＭＤＮＡによって細胞感染されなかったものは³²ＰでラベルされたＳｍａＩｐＲＯＭのＳｍａＩ破片でもって交雑させることはできなかった。２つの細胞感染された細胞の線中におけるｐＲＯＭの挿入されたものの転写数の決定．ゲノミックＤＮＡがＮＧ１０８−１５，ＳＴ８−４およびＳＴ７−３の細胞線から分離され、そして前記ｐＲＯＭ挿入体はＰＣＲの１つの分析された２％アガローズゲルによって増幅された。ＳＴ７−３のアンチセンスの数の推定およびＳＴ８−４のセンス挿入の推定はアンチセンスＤＮＡクローンｐＳＶＬの既知量中のアンチセンス配列の数をアンチセンスまたはセンス配列でＳＴ７−３またはＳＴ８−４のゲノミックＤＮＡいずれかの中の５０ｎｇ中の存在するアンチセンスまたはセンス配列と比較する比重操作を用いることによって得られた。転写された数の推定はＳＴ７−３およびＳＴ８−４細胞からのＰＣＲ増幅生成物の相対密度を知られているｐＳＶＬアンチセンスＤＮＡの知られている転写数のＰＣＲ性の同等の大きさ中の強度と比較することによって達成された。この分析はＳＴ７−３のゲノム中にほぼｐＳＶＬアンチセンスのほぼ１２の複写およびＳＴ８−４のゲノム中にｐＳＶＬの４つの複写が存在していることを示した。形質移入された細胞線へオピオイドおよび他の配位子のリセプタ結合．前記ＯＢＣＡＭ−形質移入された細胞線ＳＴ８−４（センス）およびＳＴ７−３（アンチセンス）はオピオイドのためのリセプタの存在と同様に配位子のいくつかのクラスのために試験された。オピオイド〔³Ｈ〕ディプレノルフィンのアンチセンス形質移入セル中の結束は形質移入されない細胞と比較して８０％だけ減少した。〔³Ｈ〕ディプレノルフィンのセンス形質移入された細胞への結束は１０％だけ減少させられており、それは統計的にはあまり意味のないものであった。これと対象的にα₂−アドレナリン配位子〔³Ｈ〕のロウヲルシン，ムスカリン状の配位子〔³Ｈ〕のスコポラミン，および¹²⁵Ｉ−インシュリンはアンチセンス（またはセンス）の形質移入によっては影響されなかった。センスまたはアンチセンス形質移入細胞線中におけるオピオイドリセプタの性質はさらに試験された。スカチャード分析はアンチセンス形質移入細胞中における〔³Ｈ〕のディプレノルフィン結束の減少は実質的に全ての８０％であり、それはＢ_MAX，中の減少に起因するものであるが、Ｋ_dには影響を受けなかった。種々のオピオイド配位子の親和性の段階：ＤＡＤＬＥ＞β−エンドルフィン＞モルフィン＞Ｕ−５０，４８８Ｈに示されているように両方の細胞線中のオピオイドリセプタは形質移入させられていないＮＧ１０８−１５のδ特性を保持していた。これに加えて形質移入されたいずれかの細胞中に存在するオピオイドリセプタはその立体選択性を保持していた。最後に、形質移入された細胞線における常習的なオピオイド作用処置の効果について調べた。１００ｎＭＤＡＤＬＥで２４時間形質移入された細胞の培養はオピオイドリセプタの８０％の減少を起こし、これは形質移入されない細胞において観察されるものとほぼ実質的に同じであった。しかしながら、同じ処置はオピオイドリセプタのアンチセンス形質移入された細胞へのバインディングをさらに減少させることはなかった。これらの実験はアンチセンスｃＤＮＡからＯＢＣＡＭをもってしての形質移入された細胞はオピオイド結束を阻止できることを示している。例２この例は我々が行ったＯＢＣＡＭ状の蛋白質のためのｃＤＮＡ記号化であって、１またはそれ以上の付加的な領域（例えば、細胞内外およびまたは細胞内の領域における記号化）である。我々は長さが３．０ｋｂで高いｂＯＢＣＡＭに対してそれの開放読み取りフレームのはじめにおいて、非常に高い類似性を持つものであった。一般的なアプローチ．２つのｃＤＮＡのライブラリーがスクリーンされた。１つはストラタゲネー（ＳＧ；一時に増幅された）から購入したものであり、もう１つは我々の研究所においてラットの脳ポリ（Ａ）⁺ＲＮＡ（クロンテック）とストラタゲネーのユニザップＸＺ（ＵＺ）を用いて作り出したものであった。前記ライブラリーはプローブで２つの異なったＯＢＣＡＭの領域を代表するものをスクリーンし、１つは牛のクローン（ｂＯＢＣＡＭ）で、もう１つは前記部分的なラットクローン（ｒＯＢＣＡＭ）である。これらの２つのクローンの比較の結果、記号化された領域は高度に保存され、両方のプローブはこの領域から発生させられることが明らかになった。ＵＺライブラリーのスクリーニング．ＵＺライブラリー（１／５はパックされ，プレートされた）は２つのクローンＤＵＺ１（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）およびＤＵＺ２において製造され、それらは長さにおナルからマップの制限に加え、それらは実質的に同じであるということが結論づけられた。したがって、ＤＵＺ１（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）のみが完全な配位決定に用いられた。配位決定の結果はｂＯＢＣＡＭに対する高い同一近似性が後者の開放読み取りフレームい領域のある部分についてはほとんど類似性がなかった。ＤＵＺ１（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）は僅かに短い推定読み取りフレームの３３８ａａを含んでおり；前記Ｃ−ターミナル３１８ａａは下層的にＯＢＣＡＭのそれと同一であり、同じストップ遺伝暗号（コドン）を含んでいるが、前記Ｎ−ターミナル２０ａａは固有のものであった。ＳＧライブラリーのスクリーニング．高いストリンジェンシー条件を用いて、ＳＧライブラリーから０．６ｋｂから３．５ｋｂの大きさに広がる１８クローンが得られた。１．０ｋｂより大きいこれらのクローンのみがさらに特徴づけられ、そしてターミナル配列が急速にそのクローンが最も全体の符号配列を持っていそうなものが決められた。これらのクローンの多くは非常にＤＵＺ１（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）への質移入された領域にみられた。これらのクローンは停止遺伝符号（コドン）をｂＯＢＣＡＭ中に見出されるものと同じ位置に含んでいた。しかしながら、これらの２つのクローンＳＧ８（ＳＥＱＩＤＮＯ：３）およびＳＧ１３（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）は特別の興味のためにプローブされた。ＳＧ１３（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）は、２つのクローンが重なっている領域において、ｒＯＢＣＡＭと同一であった；しかしながら、ｒＯＢＣＡＭ，ＳＧ１３（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）とは異なり、完全なリーて、ｒＯＢＣＡＭのそれよりも上流まで広がるものをもっていた。我々は、ＳＧ１３（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）がｒＯＢＣＡＭに対応して配列が延びており、そじる。ＳＧ８（ＳＥＱＩＤＮＯ：３）は同様に完全な読み取りフレームであって、ＳＧ１３（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）のそれと同一のものをもっており、そしい領域と２００またはその程度のヌクレオチドで推定されるスタート，遺伝暗号子の直上上流のものと同じ化されていない領域はさらに上流で意味のある配列の同位性をＳＧ１３（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）と持っておらず、それは転写を規制する領域を含むことを示唆している。クローンの生理学的な意味．ＤＵＺ１（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）およびＳＧ１３（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）はマウスのクロモゾーム９上に存在していることが見出された。仮のインサイチュハイブリゼーシヨン研究であって、これらの２つのクローンの特異な領域を使用する研究はそれらのｃＤＮＡは異なった脳の領域に存在し、それらが異なった転写規則であることを示している。これらの新しいクローン中における１または２以上のそれらの特異な領域は否定的に制御された遺伝子表現中で含まれるであろう。例３ＤＵＺ１（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）（二重螺旋構造において準備されたもの）からのアンチセンス方向の領域を含む形質移入させたマウスはモルヒネの侵害受容器に反する効果に対する減少された感度を示した。これらの研究に用いられた遺伝子導入は当初５００基対であって、クローンＤＵＺ１（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）の破片であるが、しかしながら、アンチセンス方向に構成されたものであった。形質移入されたマウス（始祖）は特定され、そして形質移入されない同腹子が侵害受容器に反するテストのためのコントロールとして用いられた。ＤＵＺ１（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）の始祖３３匹と１８（５４％）匹が遺伝子移入されたものであった。遺伝子導入されたオス（＃１３５５）は近交系（Ｃ５７ＢＬ／１０）と交配されて、Ｎ１世代のマウスを製造した。２９匹の子孫のうち８（２８％）匹が形質移入を含んでいた。６匹の形質移入されたもの（２匹のオスと４匹のメス）および６匹の形質移入されない同腹のもの（２匹のオスと４匹のメス）で同じ年令のものが反侵害受容性のテストのためにグループ化された。形質移入されていないコントロールマウスは１つのＡＤ₅₀を表１に示されているようにモルヒネを与えた。これらの値は形質移入されない同腹で，形質移入された動物または年令および性が合わされた純粋なＣ５７ＢＬ／１０のマウスでこれはコントロールグループとして表１のデータに示されているように用いられた。妊娠させられた雑種の接合種は（Ｃ５７ＢＬ／６のメス×ＳＪＬオス）Ｆ２雑種のマウス性交後ほぼ１２時間で得られた。接合子の分離，注射および再移植を輸卵管，偽妊娠のスイス−ウエブスター宿主のメスに再移植した。形質移入された子孫は、ポリメラーゼ鎖反応をマウスの尻尾のＤＮＡサンプルによって行うことによって、特定化された。ほぼ１ｃｍの尻尾が除かれ、そして一晩中５５℃で２００μｌの５０ｍＭのトリス，ｐＨ８，１００ｍＭＥＤＴＡ，１００ｍＭＮａＣｌ，１％ソジュームドデシルサルファイト，および２．５ｍｇ／ｍｌのプロティナーゼＫ．において行われた。ダイジェステッドされた溶液はイソプロパノールによって沈降され、スプールされ、５０μ１の水中に移され、１５分間煮沸された。モルヒネ硫化物の反侵害受容の活動は、テイルフリック法によって決定された。モルヒネ硫化物はｓ．ｃ．で注入された。少ない数の利用できない（各グループにおいて６）であるから、ＡＤ₅₀を決定するためにアップアンドダウン方法が用いられた。（ディクソン，アメリカン．スタティシカルジャーナル．，（１９６５），９６７頁から９７８頁）。接合子の操作は配合形成されない成（アダルト）鼠についてはモルヒネ感度の影響はなかった。これと対象的に始祖のマウスと最初のゼネレーションであって、アンチセンス構造を含むものはモルヒネＡＤ₅₀の１１．２２±１．３２を持った。一方、Ｎ１ゼネレーションのマウス，第二世代はモルヒネＡＤ₅₀の２２．４ ±１．２２を持った。かくして、マウスにおける形質移入の存在は、モルヒネに対する感性を減少させ、そしてこの減少は次の世代において、増加させられた。Ｎ１世代のマウスで始祖のオス１３５５から導かれたものは、アンチセンス形質移入を他の近交系（ＤＢＡ／２Ｊ）の中にモルヒネに対するより少ない感性を明白に示すものが見られる。この観察は始祖におけるモルヒネの感度とＣ５７ＢＬ／１０のＮ１子孫における感度の差は形質移入の発現がマウス系列がそれをハーバリングすることの遺伝子的な影響を受けていることを示している。これに加えて形質移入されたＮ１世代と形質移入されていない動物が迅速な耐久力のためにテストされた。動物において最初に試されたのは、テイルフリックラテンシーで薬物なしにして行ない、ベースラインのデータを得た。３０分後にマウスはモルヒネをｓ．ｃ．で固定的に０．１ｍｌのフィオロジカルサリーン（下記参照）を投与し、そしてテイルフリックラテンシーがそれらがベースラインに戻るまで、行われた。モルヒネの潜伏期間は１２５μｇ／ｋｇｓ．ｃ．ナロキソンで同じ側のモルヒネ硫化物を同時に行うことにより成された。最初の反受容性試験において、モルヒネＡＤ₅₀はアップアンドダウン法によって決められた。４組の緊急耐久テストが行われ、モルヒネを０，１０，３０および１００ｍｇ／ｋｇ前処理投与したものについて行われた。なぜならば、少ない数の遺伝子導入されたマウスが利用可能であるから、同じ動物がこれらの最初の反受容性テストと同様に用いられた。最初のテストのときの残存薬物の存在することを確かめ、最初の緊急耐久テストは最初の反受容器テストの後、２週間後に行われた。そして各々引き続く研究（より高いモルヒネの投与の前処理）は先行するものの２週間後に行われた。最後に２つの２週間後において、最後の緊急耐性研究が成され、モルヒネＡＤ₅₀の動物が再び、これらのパラメータが実験の渦中に変わらなかったことを確認した（ナルキソンなしで）。図１に示されているようにモルヒネのＡＤ₅₀が緊急対応耐性研究において増加させられ、より高いモルヒネの前処置にしたがって、ＡＤ₅₀はより高くなった。最大の前処理の投与は１００ｍｇ／ｋｇ，前記ＡＤ₅₀の形質移入されない動物は最高６７．４５ｍｇ／ｋｇに達し、モルヒネで前処理されないマウスのほとんど１０倍に達した。これと対象的に前記モルヒネのＡＤ₅₀の形質移入された動物（Ｎ１世代）においては、相対的にモルヒネ前処理量に対して増加し、最高は３５．５３ｍｇ／ｋｇが形質移入された動物で、１００ｍｇ／ｋｇのモルヒネの前処理であった。なぜならば、これらの動物におけるコントロールＡＤ₅₀は２２．４４ｍｇ／ｋｇまでに上昇され、これはわずか５０％の上昇を示した。このテストにより、マウスで形質移入されたものはモルヒネに対する間隔が減少させられていることを示した。このケースにおいてこの減少させられた感度は前記ＡＤ₅₀を上昇させるモルヒネの前処置の効果において少ないことを明白にした。これらのデータは成功裏に形質移入されたマウスでアンチセンスｃＤＮＡ符号化のためのオピオイド結束蛋白質の部分を示す。このｃＤＮＡの結果の存在は、モルヒネにおける感度の低下は異なったテストによって成された。形質移入された動物のラインの出願はオピオイド機能の投与の広い範囲において有効であった。好適な特定の具体例について述べられたのであるが、記述と例は説明のためであって、本発明の範囲を制限するものでなくて、本発明の範囲は添付の請求の範囲によって規定されるものである。配位リスト（１）一般的な情報：（ｉ）出願人：リー，ナンシーエム．ロー，ホラスエイチ．リップマン，デイビット（ii）発明の名称：オリゴヌクレオチド配列と麻薬麻酔への感度低減性を持つＤＮＡ感染された遺伝子導入動物（iii）配列の数：３（iv）対応するアドレス： (A)名宛人：ジェイ．スーザンシーべルト (B)街：フォーエンバルカデロセンタースート１４５０ (C)市：サンフランシスコ (D)州：カリフォルニア (E)国．米国 (F) ZIP （郵便番号）：94111 （ｖ）電算機読み取り形式： (A)媒体の形式：フロッピーディスク (B)電算機：IBM PC コンパーチブル (C)オペレーティングシステム： PC-DOS/MS-DOS (D)ソフトウェア：パテントインレリース＃1.0,バージョン＃1.25 （vi）現在の出願データ： (A)出願番号： (B)出願日： 10-４月-1992 (C)分類：（viii）弁護士／代理人情報： (A)氏名：シーベルト，ジェイ．スーザン (B)登録番号：28，758 (C)参照／書類番号：2983．1 （ix）電話通信情報： (A)電話： (415)362-5556 (B)テレファックス： (415)362-5418 (C)テレックス：278638 MGPS （２） SEQ ID NO：１の情報：（ｉ）配列の特徴： (A)長さ：3069基対 (B)型：核酸 (C)ストランドネス：２重 (D)トポロジー：直線（ii）分子のタイプ：cDNA （iii）ハイポセティカル：ノー（iv）アンチセンス：イエス（vi）オリジナルソース： (A)生物：くまねずみ（ラタスラタス） (D)成長段階成鼠 (F)組織の形式：脳（vii）直近の資源： (A)ライブラリー：リー，ロー，リップマンのライブラリー（遺伝子バンクアクセッション＃M88709） (B)クローン：クローンDUZ1 （viii）ゲノム中の位置： (B)マップ位置：マウスのクロムゾウメ９ (C)単位：ｂｐ（xi）配列の記述：SEQ ID NO：1: （２）SEQ ID NO:２の情報：（ｉ）配列の特徴： (A)長さ：2337基対 (B)型：核酸 (C)ストランドネス：２重 (D)トポロジー：直線（ii）分子のタイプ：cDNA （iii）ハイポセティカル：ノー（iv）アンチセンス：イエス（vi）オリジナルソース： (A)生物：くまねずみ（ラタスラタス） (D)成長段階：成鼠 (F)組織の形式：脳（vii）直近の資源： (A)ライブラリー：ストラタジーニ（遺伝子バンクアクセッション＃M88 711） (B)クローン：SG13 （viii）ゲノム中の位置： (B)マップ位置：マウスのクロムゾウメ９ (C)単位：ｂｐ（xi）配列の記述：SEQ ID NO:2: （２）SEQ ID NO:３の特徴：（ｉ）配列の特徴： (A)長さ：2179基対 (B)型：核酸 (C)ストランドネス：２重 (D)トポロジー：直線（ii）分子のタイプ：cDNA （iii）ハイポセティカル：ノー（iv）アンチセンス：イエス（vi）オリジナルソース： (A)生物：くまねずみ（ラタスラタス） (D)成長段階：成鼠 (F)組織の形式：脳（vii）直近の資源： (A)ライブラリー：ストラタジーニ（遺伝子バンクアクセッション＃M88 710） (B)クローン：SG8 （viii）ゲノノ、中の位置： (C)単位：ｂｐ（xi）配列の記述：ＳＥＱＩＤＮＯ：３：

【手続補正書】特許法第１８４条の７第１項【提出日】１９９３年８月２５日【補正内容】特許請求の範囲：１．形質移入された人類以外の動物であって、それらの原基細胞と体細胞はオリゴヌクレオチド配列であって、前記動物にあるいは胚形成段階において前記動物の先祖に導入されたものを含み、ここにおいて、前記オリゴヌクレオチド配列が前記動物中において発現可能であり、そして前記動物の麻薬麻酔に対する応答の変更に影響するオリゴヌクレオチド配列と麻薬麻酔の感度低減性をもつＤＮＡ感染された遺伝子導入動物。２．請求項１記載の前記動物は、前記変更された麻薬麻酔に対する変更された応答は麻薬麻酔に対して減少させられた感度であるオリゴヌクレオチド配列と麻薬麻酔の感度低減性をもつＤＮＡ感染された遺伝子導入動物。３．請求項１または２記載の動物において、前記麻薬麻酔はモルヒネ類似体内因性のオピオイドまたはオピオイドペプチドの合成体であるオリゴヌクレオチド配列と麻薬麻酔の感度低減性をもつＤＮＡ感染された遺伝子導入動物。４．請求項１または２記載の動物であって、オリゴヌクレオチド配列は動物の体内で転写ユニットを形成し、オピオイド結束蛋白用の内因性のｍＲＮＡにハイブリダイゼイション可能なメッセンジャーＲＮＡ合成物として動物の体内にあるオリゴヌクレオチド配列と麻薬麻酔の感度低減性をもつＤＮＡ感染された遺伝子導入動物。５．請求項４記載の動物であって、オリゴヌクレオチド配列は１重または２重螺旋でＳＥＱＩＤＮＯ：１，ＳＥＱＩＤＮＯ：２，ＳＥＱＩＤＮＯ：３のグループの全部または一部から構成されるものであるが、ここにおいて選択された配列または配列部分はそれに対して反転可能であるオリゴヌクレオチド配列と麻薬麻酔の感度低減性をもつＤＮＡ感染された遺伝子導入動物。６．請求項４記載の動物であって、選ばれたオリゴヌクレオチドの配列は、少なくとも１２の基を持っているオリゴヌクレオチド配列と麻薬麻酔の感度低減性をもつＤＮＡ感染された遺伝子導入動物。７．請求項４記載の動物であって、前記オリゴヌクレオチド配列はＳＥＱＩＤＮＯ：１のはじめの５００基の一部または全部から選択された配列であるオリゴヌクレオチド配列と麻薬麻酔の感度低減性をもつＤＮＡ感染された遺伝子導入動物。８．細胞培養を提供するための方法であって：遺伝子導入された人間以外の動物でそれの体細胞であって、１つのオリゴヌクレオチド配列で前記動物中に誘導されたものまたは前記動物の祖先で、胚形成段階に前記オリゴヌクレオチド配列が前記動物の中に発現可能であって、前記動物の麻薬麻酔に対する応答を変更するもの；および前記動物の１またはそれ以上の体細胞を培養するオリゴヌクレオチド配列と麻薬麻酔の感度低減性をもつＤＮＡ感染された遺伝子導入動物の細胞培養を提供するための方法。９．オリゴヌクレオチド構造であって、ＳＥＱＩＤＮＯ：１の約１２から５００基に対応し、前記セグメントはオピオイド結束蛋白用の内因性のｍＲＮΛで、ハイブリッド可能な十分な大きさであり、しかし反転しており、オリゴヌクレオチド配列と麻薬麻酔の感度低減性をもつＤＮＡ感染された遺伝子導入動物のオリゴヌクレオチド構造。１０．請求項９記載の構造において前記破断片は、オピオイドリセプタの要素遺伝子の発現を抑圧するのに効果があるオリゴヌクレオチド配列と麻薬麻酔の感度低減性をもつＤＮＡ感染された遺伝子導入動物。１１．請求項９記載の構造において前記破断片は発現ベクターと動作的に結合されているオリゴヌクレオチド配列と麻薬麻酔の感度低減性をもつＤＮＡ感染された遺伝子導入動物のオリゴヌクレオチド構造。１２．請求項１１記載の構造において、前記発現ベクターは哺乳類またはレトロバイラル発現ベクターであるオリゴヌクレオチド配列と麻薬麻酔の感度低減性をもつＤＮＡ感染された遺伝子導入動物のオリゴヌクレオチド構造。１３．請求項９記載の構造において、通常のホスホジエステールバックボーンは生体中における分解の限界に対して類似な効果を持つように変形されたものであるオリゴヌクレオチド配列と麻薬麻酔の感度低減性をもつＤＮＡ感染された遺伝子導入動物のオリゴヌクレオチド構造。１４．請求項１３記載の構造において、前記変形はメチルホスホン塩基，ホソラミデイト，ホスホルティミノエチルグリシン）またはリボースのシクロアルケンまたは部分的に不飽和されたシクロアルケンに変形されたものの手段によるオリゴヌクレオチド配列と麻薬麻酔の感度低減性をもつＤＮＡ感染された遺伝子導入動物のオリゴヌクレオチド構造。１５．請求項９記載の構造において、前記セグメントは相補的なそれに関連するストランドを持っているオリゴヌクレオチド配列と麻薬麻酔の感度低減性をもつＤＮＡ感染された遺伝子導入動物のオリゴヌクレオチド構造。１６．請求項９または１５記載の構造において、前記セグメントの基はＲＮＡに対応するオリゴヌクレオチド配列と麻薬麻酔の感度低減性をもつＤＮＡ感染された遺伝子導入動物のオリゴヌクレオチド構造。１７．診断または治療のための薬剤であって、オリゴヌクレオチドであって、１重螺旋のときには１２基，そして２重螺旋のときは１２基対であって、バックボーンを持ち、オリゴヌクレオチドＤＮＡ基またはＲＮＡ基であって、ＳＥＱＩＤＮＯ：１，ＳＥＱＩＤＮＯ：２，およびＳＥＱＩＤＮＯ：３の全部または一部からなるが、アンチセンスダイレクションである診断または治療のための薬剤。１８．請求項１７記載の薬剤であって、少なくともバックボーンの一部が制限された酵素的分解の制限に有効である診断または治療のための薬剤。１９．請求項１７記載の薬剤であって、前記破断片はオピオイド結束蛋白質のためにｍＲＮＡへ交雑可能である診断または治療のための薬剤。２０．請求項１７記載の薬剤であって、オリゴヌクレオチドを患者に治療的に投与する手段を含む診断または治療のための薬剤。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者リップマン，デイビットアメリカ合衆国 95204 カリフォルニア州スタックトン、ウェストソノマアベニュー 1739

Claims

【特許請求の範囲】１．形質移入された人類以外の動物であって、それらの原基細胞と体細胞はオリゴヌクレオチド配列であって、前記動物に導入されたものを含むか、または前記動物の先祖を含み、胚形成段階において前記オリゴヌクレオチド配列が前記動物中において発現可能であり、そして前記動物の麻薬麻酔に対する応答の変更に効果があるオリゴヌクレオチド配列と麻薬麻酔の感度低減性をもつＤＮＡ感染された遺伝子導入動物。２．請求項１記載の前記動物は、前記変更された麻薬麻酔に対する変更された応答は麻酔麻酔に対して減少させられた感度であるオリゴヌクレオチド配列と麻薬麻酔の感度低減性をもつＤＮＡ感染された遺伝子導入動物。３．請求項１または２記載の動物において、前記麻薬麻酔はモルヒネ類似体内因性のオピオイドまたはオピオイドペプチドの合成体であるオリゴヌクレオチド配列と麻薬麻酔の感度低減性をもつＤＮＡ感染された遺伝子導入動物。４．請求項１または２記載の動物であって、オリゴヌクレオチド配列は動物の体内で転写ユニットを形成し、オピオイド結束蛋白用の内因性のｍＲＮＡにハイブリダイゼイション可能なメッセンジャーＲＮＡ合成物として動物の体内で発現するものであるオリゴヌクレオチド配列と麻薬麻酔の感度低減性をもつＤＮＡ感染された遺伝子導入動物。５．請求項４記載の動物であって、オリゴヌクレオチド配列は１重または２重螺旋でＳＥＱＩＤＮＯ：１，ＳＥＱＩＤＮＯ：２，ＳＥＱＩＤＮＯ：３のグループの全部または一部から構成されるものであるが、ここにおいて選択された配列または配列部分はそれに対して反転可能であるオリゴヌクレオチド配列と麻薬麻酔の感度低減性をもつＤＮＡ感染された遺伝子導入動物。６．請求項４記載の動物であって、選ばれたオリゴヌクレオチドの配列は、少なくとも１２の基を持っているオリゴヌクレオチド配列と麻薬麻酔の感度低減性をもつＤＮＡ感染された遺伝子導入動物。７．請求項４記載の動物であって、前記オリゴヌクレオチド配列はＳＥＱＩＤＮＯ：１のはじめの５００基の一部または全部から選択された配列であるオリゴヌクレオチド配列と麻薬麻酔の感度低減性をもつＤＮＡ感染された遺伝子導入動物。８．細胞培養を提供するための方法であって：遺伝子導入された人間以外の動物でそれの体細胞であって、１つのオリゴヌクレオチド配列で前記動物中に誘導されたものまたは前記動物の祖先で、胚形成段階に前記オリゴヌクレオチド配列が前記動物の中に発現可能であって、前記動物の麻薬麻酔に対する応答を変更するもの；および前記動物の１またはそれ以上の体細胞を培養するオリゴヌクレオチド配列と麻薬麻酔の感度低減性をもつＤＮＡ感染された遺伝子導入動物の細胞培養を提供するための方法。９．オリゴヌクレオチド構造であって、ＳＥＱＩＤＮＯ：１のはじめの５００基の一部または全部に対応するセグメントを含むが、それに対しては反対であって、前記セグメントは充分に内因性のｍＲＮＡをオピオイド結束蛋白でハイブリッド化が可能であるオリゴヌクレオチド配列と麻薬麻酔の感度低減性をもつＤＮＡ感染された遺伝子導入動物のオリゴヌクレオチド構造。１０．請求項９記載の構造において、前記破断片は少なくとも１２の基を持っているオリゴヌクレオチド配列と麻薬麻酔の感度低減性をもつＤＮＡ感染された遺伝子導入動物のオリゴヌクレオチド構造。１１．請求項９記載の構造において前記破断片は、発現ベクターと動作的に結合されているオリゴヌクレオチド配列と麻薬麻酔の感度低減性をもつＤＮＡ感染された遺伝子導入動物のオリゴヌクレオチド構造。１２．請求項１１記載の構造において、前記表現ベクターは哺乳類またはレトロバイラル発現ベクターであるオリゴヌクレオチド配列と麻薬麻酔の感度低減性をもつＤＮＡ感染された遺伝子導入動物のオリゴヌクレオチド構造。１３．請求項９記載の構造において、通常のホスホジエステールバックボーンは生体中における分解の限界に対して類似な効果を持つように変形されたものであるオリゴヌクレオチド配列と麻薬麻酔の感度低減性をもつＤＮＡ感染された遺伝子導入動物のオリゴヌクレオチド構造。１４．請求項１３記載の構造において、前記変形はメチルホスホン塩基，ホソラミデイト，ホスホルティミノエチルグリシン）またはリボースのシクロアルケンまたは部分的に不飽和されたシクロアルケンに変形されたものの手段によるオリゴヌクレオチド配列と麻薬麻酔の感度低減性をもつＤＮＡ感染された遺伝子導入動物のオリゴヌクレオチド構造。１５．請求項９記載の構造において、前記セグメントは相補的なそれに関連するストランドを持っているオリゴヌクレオチド配列と麻薬麻酔の感度低減性をもつＤＮＡ感染された遺伝子導入動物のオリゴヌクレオチド構造。１６．請求項９または１５記載の構造において、前記セグメントの基はＲＮＡに対応するオリゴヌクレオチド配列と麻薬麻酔の感度低減性をもつＤＮＡ感染された遺伝子導入動物のオリゴヌクレオチド構造。１７．診断または治療のための薬剤であって、オリゴヌクレオチドであって、１重螺旋のときには１２基，そして２重螺旋のときは１２基対であって、バックボーンを持ち、オリゴヌクレオチドＤＮＡ基またはＲＮＡ基であって、ＳＥＱＩＤＮＯ：１，ＳＥＱＩＤＮＯ：２，およびＳＥＱＩＤＮＯ：３の全部または一部からなるが、アンチセンスダイレクションである診断または治療のための薬剤。１８．請求項１７記載の薬剤であって、少なくともバックボーンの一部が制限された酵素的分解の制限に有効である診断または治療のための薬剤。１９．請求項１７記載の薬剤であって、前記破断片はオピオイド結束蛋白質のためにｍＲＮＡへ交雑可能である診断または治療のための薬剤。２０．請求項１７記載の薬剤であって、オリゴヌクレオチドを患者に治療的に投与する手段を含む診断または治療のための薬剤。