JP2001527385A - テロメラーゼ蛋白質をコードする遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 テロメラーゼ複合体のポリペプチドをコードする核酸分子が開示される。また、核酸分子およびポリペプチドを調製する方法、およびこれらの分子を使用する方法も開示される。

Description

【発明の詳細な説明】 テロメラーゼ蛋白質をコードする遺伝子 本出願は、１９９６年１１月１５日出願の米国出願第０８／７５１，１８９号 の一部継続出願である、１９９７年６月１１日出願の米国出願第０８／８７３， ０３９号の一部継続出願である。 発明の分野 本発明は、テロメラーゼ酵素複合体の成分を含むポリペプチドをコードする新 規遺伝子、ならびに該遺伝子およびポリペプチドを用いる方法および製造方法、 およびテロメラーゼ活性を検出する方法に関する。 背景 関連技術 ヒトが老化するに従い多くの生理学的変化が起こる。毛髪の色、皮膚の外観、 減少した痩せた身体質量等の変化のごとき目に見えるものに加えて、細胞および 生化学的レベルで多くの変化がある。観察されてきた１つのこのような変化は、 体細胞が加齢するに従って体細胞中のテロメアの長さの顕著な減少であ る（Ｈａｒ−ｌｅｙら、Ｎａｔｕｒｅ、３４５：４５８−４６０［１９９０］） 。テロメアは各染色体の末端に位置する反復ＤＮＡ配列であって、適当な染色体 維持、複製および細胞核内の染色体の局所化に必要である。「テロメリック反復 結合因子」または「ＴＲＦ」のごときある種の蛋白質は、テロメリックＤＮＡ配 列と相互作用することが示されてきた（Ｃｈｏｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７０ ：１６６３−１６６７［１９９５］）。 ほとんどの生物において、テロメアはテロメラーゼとして知られている酵素に よって合成され維持されている。テロメラーゼはＲＮＡおよび蛋白質成分よりな るリポヌクレオ蛋白質であり、成分の両タイプが活性に必要である（例えば、Ｇ ｒｅｉｄｅｒら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６５：３３７−３６５［ １９９６］Ｇｒｅｉｄｅｒら．，Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ａｇｉｎｇ ａｎｄ Ｃｅ ｌｌ Ｄｅａｔｈ、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ ，１２３−１３８頁［１９９６］）。 成人のほとんどの細胞はテロメラーゼ活性を有せず；例外は、例えば、生殖系 組織（精子細胞および卵母細胞）およびある種の血液細胞を含む（Ｇｒｅｉｄｅ ｒら、Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ａｇｉｎｇ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ、前掲）。減少したテロメア長は培 養中の細胞の減少した複製能力とよく相関する（細胞老化または細胞加齢という ）。短化したテロメアは分裂し続けることができない細胞能力と関連し得（Ｈａ ｒｌｅｙ、前掲；Ｌｅｖｙら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２５：９５１−９６ ０［１９９２］；およびＨａｒｌｅｙら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ ｒ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ５９：３０７−３１５［１９９４］）、それにより細胞の老化に寄与すると仮定 されてきた。 テロメア長が各連続的細胞分裂と共に減少する現象の分子的詳細は明確ではな いが、最近の報告は種々のモデルを提案している。例えば、Ｍａｒｃａｎｄら（ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７５：９８６−９９０［１９９７］；またＢａｒｉｎａｇａ 、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７５：９２８［１９９７］も参照）は酵母における「蛋白 質カウンティングメカニズム」を記載し、ここでテロメアに結合した蛋白質Ｒａ ｐＩの量は、報告されているところによれば、テロメア長に影響する。別の研究 において、ｖａｎ ＳｔｅｅｎｓｅｌらおよびＣｏｏｐｅｒら（各々、Ｎａｔｕ ｒｅ、 ３８５：７４０−７４３［１９９７］；Ｎａｔｕｒｅ、３８５：７４４−７４７ ［１９９７］；Ｓｈｏｒｅ、Ｎａｔｕｒｅ、３８５：６７６−６７７［１９９７ ］）は、テロメア反復結合因子、ＴＲＦは、報告されているところによれば、酵 母およびヒトにおいてテロメア伸長に影響することを示す。 最近、ＣＤ２８−／ＣＤ８＋Ｔ−細胞と呼ばれる白血球細胞の１つのクラスの テロメアは、同一または同様の年齢の健康な個人から得られた同一の細胞と比較 して、ＡＩＤＳ患者ではかなり短いことが示さた（Ｅｆｆｒｏｓら、ＡＩＤＳ、 １０：１７−２２［１９９６］）。 多くのヒト癌細胞において、これらの細胞の加齢にも拘わらず、テロメア長は 減少せず、テロメラーゼ活性が存在することが示されている（Ｋｉｍら、Ｓｃｉ ｅｎｃｅ、２６６：２０１１−２０１５［１９９４］；およびＣｏｕｎｔｅｒら 、ＥＭＢＯＪ．，１１：１９２１−１９２９［１９９２］）。癌細胞におけるテ ロメラーゼの阻害は、これらの細胞の増殖を低下させるように働くのではないか と提案されている（Ｈａｒｌｅｙら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ，前掲 ；およ びＧｒｅｉｄｅｒら、Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ａｇｉｎｇ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｄｅ ａｔｈ、前掲）。 いくつかの哺乳動物におけるテロメラーゼのＲＮＡ成分がクローン化され、配 列決定されており（ＰＣＴ特許出願ＷＯ９６／０１８３５、１９９５年１月２５ 日公開；Ｂｌａｓｃｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６９：１２６７−１２７０［１９ ９５］；Ｆｅｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６９：１２３６−１２４１［１９９５ ］参照）、このＲＮＡ成分はテロメラーゼ活性に必要であることが示されている （Ｂｌａｓｃｏら、前掲；Ｆｅｎｇら、前掲；Ｃｏlｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｔｅｌｏｍｅｒ ｅｓ ａｎｄ Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ，３−６ １９９６年１１月における口頭 でのプレゼンテーション）。マウス腫瘍モデルにおいて、テロメラーゼＲＮＡの 増加は増大した腫瘍進行と相関する（Ｂｌａｓｃｏら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅ ｔｉｃｓ，１２：２００−２０４［１９９６］）。しかしながら、Ａｖｉｌｉｏ ｎら（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５６：６４５−６５０［１９９６］）は、種々 のヒト腫瘍組織および細胞系におけるテロメラーゼＲＮＡの存在は、これらの組 織および細胞系にお けるテロメラーゼ活性の存在または量の良好な指標ではないことを示した。 最近、Ｂｌａｓｃｏら（Ｃｅｌｌ、９１：２５−３４［１９９７］；また、Ｚ ａｋｉａｎ，Ｃｅｌｌ，９１：１−３［１９９７］参照）はテロメラーゼＲＮＡ 遺伝子が欠損したマウスを作製した。これらのマウスの細胞は明らかにテロメラ ーゼ活性を欠くが、報告されているところによれば、培養において不死化され、 腫瘍を生産することができる。 Ｋｉｒｋら（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７５：１４７８−１４８１［１９９７］；Ｈ ａｗｌｅｙ、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７５：１４４１−１４４２［１９９７］も参照 ）による最近の報告は、テトラヒメナにおいて、細胞分裂の間に生殖系核が分離 する能力を改変するテロメラーゼＲＮＡ分子突然変異体の調製を記載する。 繊毛虫綱原生動物（単細胞真核生物）において、テロメラーゼの蛋白質部分は ｐ８０およびｐ９５という２つの区別されるポリペプチドよりなることが判明し ている（ＰＣＴ出願ＷＯ９６／１９５８０、１９９５年６月２７日公開；Ｈａｒ ｒｉｎｇｔｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７０：８８９３−８９０１ ［１９９５］；およびＣｏｌｌｉｎｓら、Ｃｅｌｌ、８１：６７７−６８６［１ ９９５］参照）。最近、分子量１２３ｋＤａおよび４３ｋＤａの２つのテロメラ ーゼポリペプチドが報告されているところによればＥｕｐｌｏｔｅｓ（単細胞真 核生物）で精製されている（Ｌｉｎｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３：１０７１２−１０７１７［１９９６］）。酵母同族体 （「ＥＳＴ２」）が同定された１２３ｋＤａ蛋白質は、報告されているところに よれば、逆転写酵素モチーフを有する（Ｌｅｎｄｖｅｙら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、 １４４：１３９９−１４１２［１９９６］；Ｌｉｎｇｎｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ 、２７６：５６１−５６７［１９９７］；また、Ｂａｒｉｇａｇａ、Ｓｃｉｅｎ ｃｅ、２７６：５２８−５２９［１９９７］参照）。Ｘｉｏｎｇらによって記載 されたもののごとき逆転写酵素モチーフ（ＥＭＢＯＪ．，９：３３５３−３３６ ２［１９９０］）は、機能的逆転写酵素の酵素活性に重要であることが知られて いる。この酵母相同体蛋白質のある種の突然変異体は、報告されているところに よれば、減少したテロメラーゼ活性を有する（Ｃｏｕｎｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎ ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ， ９４：９２０２−９２０７ ［１９９７］）。 ワシントン大学／ＮＣＴＩヒトＥＳＴプロジェクトデータベースにおける最近 登録された核酸配列（受託番号ＡＡ２８１２９６）は、Ｅｕｐｌｏｉｄｅｓ １ ２３ｋＤａ蛋白質およびその酵母相同体双方に対していくつかの配列類似性を有 する。最近の報告には、テロメラーゼの触媒サブユニットをコードするヒト遺伝 子のクローニングが記載されている（Ｎａｋａｍｕｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２ ７７：９５５−９５９［１９９７］；Ｍｅｙｅｒｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ９０：７ ８５−７９５［１９９７］）。 本発明に先立ち、哺乳動物テロメラーゼの蛋白質成分または成分類は同定され ていない。 最近、３４７塩基対核酸分子が受託番号Ｈ３３９３７として公のデータベース Ｇｅｎｂａｎｋに寄託された。この核酸分子はＮＧＦ（神経成長因子）で処理さ れたラットＰＣ−１２細胞から明らかに同定された。この核酸分子またはそれに よってコードされた蛋白質についての機能はＧｅｎｂａｎｋデータベース情報に 記載されていないが、この分子の一部は本発明のマウス・テロメラーゼＲＮＡ相 互作用蛋白質１（ＴＲＩＰ１）の領 域に対して高度に相同であることが見いだされた。ヒトＴＲＩＰ１のポリペプチ ド配列が最近同定された（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７５： ９７３−９７７［１９９７］；Ｎａｋａｙａｍａら、Ｃｅｌｌ、８８：８７５− ８８４［１９９７］）。 癌およびエイズの破壊的な効果を考慮すると、これらの病気の原因において重 要な役割を有し得るヒト身体中の分子を同定する、およびこれらおよび関連病気 に罹った患者においてこのような分子の発現を操作する必要性が当該分野にある 。 従って、本発明の目的は、テロメラーゼ酵素複合体の成分であって、ヒト身体 中の細胞の加齢および／または増殖に影響し得る核酸分子およびポリペプチドを 提供することである。 さらなる目的は、ヒト身体中のこのようなポリペプチドの発現レベルを改変す る方法を提供することにある。 他の関連目的はこの開示を読むと容易に明らかとなるであう。 発明の概要 １つの具体例において、本発明は、配列番号１の核酸分子；配列番号２の核酸 分子；配列番号３、配列番号４のポリペプチドをコードする核酸分子、またはそ の生物学的活性断片；配列 番号３または配列番号４のポリペプチドと少なくとも７０パーセント同一である ポリペプチドをコードする核酸分子；前記核酸のいずれかに対してストリンジェ ント条件下でハイブリダイズする核酸分子；および前記核酸のいずれかの相補体 である核酸分子よりなる群から選択されるポリペプチドをコードするＴＲＩＰ１ 核酸分子を提供する。 もう１つの具体例において、本発明は、配列番号３のポリペプチドのアミノ酸 １−８７１をコードする核酸分子を提供する。 １つの他の具体例において、本発明は、前記にあげた核酸を含むベクターを提 供し、ここで該ベクターは原核生物または真核生物細胞で使用するのに適した増 幅または発現ベクターであり得る。また、これらのベクターを含む宿主細胞を提 供し、ここで該宿主細胞は原核生物または真核生物細胞であり得る。 本発明は、さらに、適当な宿主中の請求項１記載の核酸によってコードされた ポリペプチドを発現させ、次いで該ポリペプチドを単離する工程を含み、ここで 該ＴＲＩＰ１ポリペプチドか配列番号３、配列番号４、または配列番号３のアミ ノ酸１−８７１であり得るＴＲＩＰ１ポリペプチドの製法を提供する。 さらにもう１つの具体例において、本発明は、配列番号３の ポリペプチド；配列番号３のアミノ酸１−８７１であるポリペプチド；これらの ポリペプチドの１つに対して少なくとも７０パーセント同一であるポリペプチド 、またはこれらのポリペプチドの１つの生物学的活性断片であるポリペプチドよ りなる群から選択されるＴＲＩＰ１ポリペプチドを含む。 もう１つの具体例において、本発明は、 （ａ）配列番号：１３、配列番号：１８または配列番号：１９の核酸分子、 （ｂ）配列番号：１３のヌクレオチド１９２０−２８２０である核酸分子、 （ｃ）配列番号：１４または配列番号：２０のポリペプチドをコードする核酸 分子、またはその生物学的活性断片、 （ｄ）配列番号：１４または配列番号：２０のポリペプチドに対して少なくと も９０パーセント同一であるポリペプチドをコードする核酸分子、 （ｅ）前記（ａ）−（ｄ）のいずれかに対してストリンジェント条件下でハイ ブリダイズする核酸分子、および （ｆ）前記（ａ）−（ｅ）のいずれかの相補体である核酸分子 よりなる群から選択されるポリペプチドをコードするＴＰ２核酸分子を提供する 。 さらに、本発明は、配列番号：１３のヌクレオチド１−１６８９、配列番号： １３のヌクレオチド１−１９２０、配列番号：１３のヌクレオチド１９２０−２ ８２０、配列番号：１３のヌクレオチド２０８９−２８２０、および配列番号： １３のヌクレオチド２０８９−２８５９よりなる群から選択される核酸分子を提 供する。 なおさらに、本発明は、配列番号：１４のポリペプチドまたは配列番号：２０ のポリペプチドのアミノ酸６４０−９４０をコードする核酸分子を提供する。 また、本発明は、 （ａ）適当な宿主中で配列番号：１３、配列番号：１９の核酸によってコード されるポリペプチドまたはその断片を発現させ、次いで （ｂ）該ポリペプチドを単離し、ここで該ポリペプチドはＮ−末端メチオニン を保有してもしなくてもよい 工程を含むＴＰ２ポリペプチドの製法を提供する。 なおさらに、本発明は、配列番号：１４のアミノ酸１−５６３； 配列番号：１４のアミノ酸１−６４０；配列番号：１４のアミノ酸６４０−９４ ０；配列番号：１４のアミノ酸６９６−９４０；および配列番号：１４のアミノ 酸６９６−９５３よりなる群から選択されるＴＰ２ポリペプチドを提供する。 なおさらに、本発明は、細胞中でＴＰ２をコードする核酸またはその生物学的 断片を発現させることを含む細胞の増殖を増大させる方法を提供する。 また、本発明は、細胞中でＴＰ２遺伝子またはその生物学的活性断片を発現す ることを含む細胞においてテロメラーゼ活性を増加させる方法を提供する。 加えて、本発明は、細胞中でＴＰ２突然変異体を発現させることを含み、ここ で該突然変異体がＴＰ２生物学的活性を有しない、細胞においてテロメラーゼを 減少させる方法を提供する。 なおさらに、本発明は、突然変異体ＴＰ２ポリペプチドをコードする核酸分子 を提供し、ここで、アミノ酸位置８６８または８６９におけるアスパラギン酸に ついてのコドンをアラニンについてのコドンに変化させ、またはアミノ酸位置８ ６８および８６９のアスパラギン酸についてのコドンをアラニンについてのコド ンに変化させてある。本発明は、さらに、これらの核 酸分子によってコードされたポリペプチドを提供する。 図面の簡単な記載 図１Ａ−１ＴはヒトＴＲＩＰ１の全長ｃＤＮＡ配列を示す（配列番号：１）。 図２Ａ−２１はマウスＴＲＩＰ１の全長ｃＤＮＡ配列を示す（配列番号：２） 。 図３Ａ−３ＣはｃＤＮＡ配列から翻訳されたヒトＴＲＩＰ１の推定全長アミノ 酸配列を示す（配列番号：３）。 図４Ａ−４ＣはｃＤＮＡ配列から翻訳されたマウスＴＲＩＰ１の推定全長アミ ノ酸配列を示す（配列番号：４）。 図５Ａ−５Ｄはヒト・テロメラーゼ蛋白質２の大部分をコードするｃＤＮＡの 配列を示す（「ＴＰ２」；「クローン３２」として実施例で言及する；配列番号 ：１３）。 図６Ａ−６Ｂは図５のｃＤＮＡから翻訳されたヒトＴＰ２の推定アミノ酸配列 を示す（配列番号：１４）。 図７（配列番号：１８）は図５に記載した配列にわたるヒトＴＰ２のさらなる ３’配列を示す。 図８Ａ−８Ｄ（配列番号：１９）はＴＰ２をコードする全長ヒトｃＤＮＡを示 す。この図は図５および７の配列を組み合わ せる。 図９Ａ−９Ｂ（配列番号：２０）は図８のｃＤＮＡから翻訳されたＴＰ２の推 定アミノ酸配列を示す。 図１０は、ＴＰ２突然変異体ｃＤＮＡ分子を作成するのに使用される戦略の模 式図である。９つのＰＣＲ反応を行って、最終ＴＰ２突然変異体構築体を得た。 これらの反応のうち６つ（１−６で示す）は全長ＴＰ２遺伝子を鋳型として用い る一次反応であった。最終の３つのＰＣＲ反応（７−９の番号）は反応１−６を 鋳型としてＰＣＲ産物を用いた。各ＰＣＲ反応につき使用したオリゴヌクレオチ ドプライマーはそれらの配列番号に従って番号付けした。 図１１Ａ−１１Ｃは、テロメラーゼアッセイ結果のゲル（図１１Ａおよび１１ Ｂ）およびウェスタンブロット（図１１Ｃ）を示す。これらの図における略語は 実施例７Ａに記載する。 図１２Ａ−１２Ｂは、各々、テロメラーゼアッセイ結果のゲル、およびウェス タンブロットを示す。これらの図で用いた略語は実施例７Ｂに記載する。 図１３Ａ−１３Ｂは、各々、ウェスタンブロットおよびテロメラーゼアッセイ 結果のゲルを示す。これらの図で用いる略語 は実施例７Ｃに記載する。 図１４はＴＰ２およびテロメラーゼＲＮＡのイン・ビトロでの再構成からのテ ロメラーゼアッセイの結果のゲルを示す。この図で用いた略語は実施例８で説明 する。 図１５はテロメラーゼＲＮＡ＋野生型または突然変異体ＴＰ２のイン・ビトロ 再構成からのテロメラーゼアッセイの結果のゲルである。この図で用いた略語は 実施例８で説明する。 図１６Ａ−１６Ｂは野生型ＴＰ２またはＴＰ２突然変異体いずれかでトランス フェクトした細胞についてのウェスタンブロット（１６Ａ）およびテロメラーゼ アッセイのゲル（１６Ｂ）を示す。この図で用いた詳細な略語は実施例９で説明 する。 図１７Ａ−１７Ｂはテロメラーゼアッセイのゲル（１７Ａ）およびウェスタン ブロット（１７Ｂ）を示す。使用した略語の詳細は実施例８に記載する。 図１８はテロメラーゼアッセイ結果のゲルを示す。使用した略語の詳細は実施 例８に記載する。 発明の詳細な記載 配列番号：３および配列番号：４のポリペプチドのごときＴＲＩＰ１（本明細 書では「ＴＲＩＰ１」という）ポリペプチド、 およびその関連する生物学的活性ポリペプチド断片および誘導体が本発明の範囲 内に含まれる。また、配列番号：１４のポリペプチドのごときテロメラーゼ２（ 本明細書では「ＴＰ２」ともいう）ポリペプチドおよびその関連する生物学的活 性ポリペプチド断片および誘導体が本発明の範囲内に含まれる。さらに、これら のポリペプチドをコードする核酸分子、および該ポリペプチドを調製する分子が 本発明の範囲内に含まれる。このような分子は、増大するＴＲＩＰ１活性または ＴＰ２活性が望まれる場合に治療剤として有用であり得る。 ＴＲＩＰ１活性および／またはＴＰ２活性が非癌細胞と比較して上昇している 癌細胞におけるごとく、ＴＲＩＰ１および／またはＴＰ２活性を減少させるべき 場合において、ＴＲＩＰ１および／またはＴＰ２を標的として働かせて、ＴＲＩ Ｐ１および／またはＴＰ２活性を阻害する分子、および／またはＴＲＩＰ１およ びＴＰ２の蛋白質−蛋白質相互作用、またはＴＲＩＰ１またはＴＰ２のテロメラ ーゼＲＮＡの結合を減少させるまたは阻害する分子を同定することができる。こ のようなＴＲＩＰ１および／またはＴＰ２阻害性分子を同定するので有用であり 得る技術を後記にて記載する。あるいは、エクス・ビボまたは イン・ビボ遺伝子治療を用いて、ＴＰ２アンチセンス分子のＴＲＩＰ１、または 細胞中でＴＲＩＰ１および／またはＴＰ２発現を破壊するまたは増強するように 働くことができるＤＮＡ構築体を投与することができる。 また、天然ＴＲＩＰ１および／またはＴＰ２をコードする遺伝子（または遺伝 子類）が、この遺伝子または遺伝子類の発現レベルが有意に減少したまたは完全 になくなるように破壊された（「ノックアウトされた」）マウス、ラット、ウサ ギ、ヤギまたはヒツジのごとき非ヒト哺乳動物が本発明の範囲内に含まれる。こ のような哺乳動物は米国特許第５，５５７，０３２号に記載されたもののごとき 技術および方法を用いて調製することができる。本発明は、さらに、ＴＲＩＰ１ および／またはＴＰ２をコードする遺伝子（または遺伝子類）（哺乳動物につい てのＴＲＩＰ１および／またはＴＰ２の天然形態または異種ＴＲＩＰ１および／ またはＴＰ２遺伝子（類））が当該哺乳動物によって過剰発現され、それにより 「トランスジェニック」哺乳動物が創製される、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ またはヒツジのごとき非ヒト哺乳動物を含む。このようなトランスジェニック哺 乳動物は米国特許第５，４８９，７４３号および１９９４ 年１２月８日に公開されたＷＯ９４／２８１２２に記載されたもののごときよく 知られた方法を用いて調製することができる。本発明は、さらに、ＴＲＩＰ１ま たはＴＰ２遺伝子がノックアウトされ、他の遺伝子（ＴＲＩＰ１またはＴＰ２い ずれか）が過剰発現される非ヒト哺乳動物を含む。 本明細書で用いる「ＴＲＩＰ１蛋白質」または「ＴＲＩＰ１ポリペプチド」と いう用語は、ＴＲＩＰ１につき本明細書で記載する特性を有するいずれの蛋白質 またはポリペプチドもいう。使用する場合、文字「ＴＲＩＰ１」の前の小文字は 特定の哺乳動物からのＴＲＩＰ１ポリペプチドをいい、すなわち、「ｈＴＲＩＰ １」はヒトＴＲＩＰ１をいい、「ｍＴＲＩＰ１」はマウスＴＲＩＰ１をいう。該 ＴＲＩＰ１ポリペプチドはそれが調製される方法に応じて、アミノ末端メチオニ ンを有しても有しなくてもよい。例として、ＴＲＩＰ１蛋白質またはＴＲＩＰ１ ポリペプチドは以下の（１）項目（ａ）−（ｆ）のいずれかで定義されるＴＲＩ Ｐ１核酸分子によってコードされたアミノ酸配列、およびそれから誘導された生 物学的活性ペプチドまたはポリペプチド、（２）配列番号：３または配列番号： ４のＴＲＩＰ１ポリペプチドと比較して１以上のアミノ酸置換、欠失、お よび／または挿入の結果となるＴＲＩＰ１遺伝子の天然に生じる対立遺伝子変異 体、および／または（３）本明細書で提供するその化学的修飾誘導体ならびに核 酸および／またはアミノ酸配列変異体をいう。 本明細書で用いる「ＴＲＩＰ１断片」という用語は、天然に生じるＴＲＩＰ１ 蛋白質の全長アミノ酸配列より小さいが、前記したＴＲＩＰ１ポリペプチドまた はＴＲＩＰ１蛋白質と同一の生物学的活性を有するペプチドまたはポリペプチド をいう。このような断片はアミノ末端、カルボキシ末端にて、および／または内 部にて切形することができ、また化学的に修飾することができる。このようなＴ ＲＩＰ１断片はアミノ末端メチオニンを含みまたは含まないように調製すること ができる。 本明細書で用いる「ＴＲＩＰ１誘導体」または「ＴＲＩＰ１変異体」という用 語は、１）例えば、１以上のポリエチレングリコール分子、糖、ホスフェート、 または野生型ＴＲＩＰ１ポリペプチドに天然では結合していない他のこのような 分子の付加によって化学的に修飾されたおよび／または図３または４に記載され たＴＲＩＰ１と比較して１以上の核酸またはアミノ酸配列の置換、欠失、および ／または挿入を含有するＴＲＩＰ１ ポリペプチド、蛋白質または断片をいう。 本明細書で用いる「生物学的ＴＲＩＰ１活性ポリペプチド」および「生物学的 活性ＴＲＩＰ１断片」という用語は、ＴＲＩＰ１につき確認されている以下の活 性：（１）テロメラーゼＲＮＡへの特異的結合；および（２）配列番号：３また は配列番号：４のポリペプチド上のエピトープに対する抗体への結合のうちの少 なくとも１つを有するＴＲＩＰ１についての前記記載に従ったＴＲＩＰ１ペプチ ドまたはポリペプチドをいう。 本明細書で用いる核酸分子またはその断片を記載するのに使用する場合の「Ｔ ＲＩＰ１」という用語は、（ａ）配列番号：１または配列番号：２に記載したヌ クレオチド配列を有する；（ｂ）配列番号：１または２いずれかによってコード されたポリペプチドと、少なくとも７０パーセント同一であるが、７０パーセン トよりも大であってもよい、すなわち８０パーセント、９０パーセント、または ９０パーセントよりも大でさえよいポリペプチドをコードする核酸配列を有する ；（ｃ）（ａ）または（ｂ）の天然に生じる対立遺伝子変異体である；（ｄ）本 明細書で提供するごとくに産生された（ａ）−（ｃ）の核酸変異体；（ｅ）（ａ ）−（ｄ）に対して相補的である配列を有する； および／または（ｆ）ストリンジェント条件下で（ａ）−（ｅ）のいずれかにハ イブリダイズする核酸分子またはその断片をいう。 本明細書で用いる「テロメラーゼ蛋白質２」、「ＴＰ２蛋白質」または「ＴＰ ２ポリペプチド」という用語は、ＴＰ２につき本明細書で記載した特性を有する いずれの蛋白質またはポリペプチドもいう。使用する場合、文字「ＴＰ２」の前 の小文字は特定の哺乳動物からのＴＰ２ポリペプチドをいう、すなわち、「ｈＴ Ｐ２」はヒトＴＰ２をいい、「ｍＴＰ２」はマウスＴＰ２をいう。ＴＰ２ポリペ プチドはそれが調製される方法に応じて、アミノ末端メチオニンを有しても有し なくてもよい。例を挙げると、ＴＰ２蛋白質またはＴ２ポリペプチドは（１）こ こで配列番号：１３、配列番号：１８、および配列番号：１９に定義したＴＰ２ 核酸分子によってコードされたアミノ酸配列、および例えば配列番号：１３のヌ クレオチド１９５０−２８８８によってコードされたペプチドのごときそれらか ら由来する生物学的活性ペプチドまたはポリペプチド、（２）配列番号：１４ま たは配列番号：２０のＴＰ２ポリペプチドと比較して１以上のアミノ酸の置換、 欠失、および／または挿入の結果とな るＴＰ２遺伝子の天然に生じる対立遺伝子変異体、および／または（３）本明細 書で提供するその化学的修飾誘導体ならびに核酸またはアミノ酸配列変異体をい う。 本明細書で用いる「ＴＰ２断片」という用語は、天然に生じるＴＰ２蛋白質の 全長アミノ酸配列未満であるが、前記したＴＰ２ポリペプチドまたはＴＰ２蛋白 質と実質的に同一の生物学的活性を有するペプチドまたはポリペプチドをいう。 このような断片はアミノ末端、カルボキシ末端で、および／または内部で切形さ れていてもよく、また化学的に修飾されていてもよい。このようなＴＰ２断片は アミノ末端メチオニンを含むようにまたは含まないように調製することができる 。 本明細書で用いる「ＴＰ２誘導体」という用語は、１）例えば、１以上のポリ エチレングリコール分子、糖、ホスフェート、または野生型ＴＰ２ポリペプチド に天然では結合していない他の分子の付加によって化学的に修飾されたおよび／ または２）図６および９に記載されたＴＰ２アミノ酸配列と比較して１以上の核 酸またはアミノ酸配列の置換、欠失、および／または挿入を含有するＴＰ２ポリ ペプチド、蛋白質または断片をいう。好ましいＴＰ２断片は配列番号：１４のア ミノ酸１−５６３； 配列番号：１４のアミノ酸１−６４０；配列番号：１４のアミノ酸６４０−９４ ０；および配列番号：１４のアミノ酸６９６−９５３を含む。 本明細書で用いる「生物学的活性ＴＰ２ポリペプチド」および「生物学的活性 ＴＰ２断片」という用語は、ＴＰ２についての前記の記載に従ってＴＰ２ペプチ ドまたはポリペプチドをいい、ここでＴＰ２はテロメラーゼアッセイにおいて触 媒活性も有する。加えて、生物学的に活性なＴＰ２は、ＴＰ２につき確認されて いる以下の特性：配列番号：１４または配列番号：２０のＴＰ２ポリペプチド上 のエピトープに対する抗体に結合し、また（ａ）他のテロメラーゼ蛋白質成分お よび／またはテロメラーゼ複合体のＲＮＡ成分と特異的に相互作用し、（ｂ）そ のアミノ酸配列に１以上の同定可能な逆転写酵素モチーフを含有し、または（ｃ ）（ａ）および（ｂ）双方で記載された特性を保有するもののいずれかのうち少 なくとも１つを有する。 本明細書で用いる核酸分子を記載する場合に使用する「ＴＰ２」という用語は 、（ａ）配列番号：１３または配列番号：１９に記載されたヌクレオチド配列、 または全長配列番号：１３または配列番号：１９より短いその断片の配列を有す る核酸分子 又はその断片、（ｂ）配列番号：１３によってコードされたポリペプチド、また は配列番号：１９によってコードされたポリペプチドに対して、少なくとも７０ パーセント同一であるが７０パーセントよりも大きくてよい、すなわち、８０パ ーセント、９０パーセント、または９０パーセント同一よりも大でさえよいポリ ペプチドをコードする核酸配列を有する核酸分子又はその断片、（ｃ）（ａ）ま たは（ｂ）の天然に生じる対立遺伝子変異体である核酸分子又はその断片、（ｄ ）本明細書で提供するごとくにここで産生された（ａ）−（ｃ）の核酸変異体で ある核酸分子又はその断片、（ｅ）（ａ）−（ｄ）に対して相補的である配列を 有する核酸分子又はその断片、および／または（ｆ）ストリンジェント条件下で （ａ）−（ｅ）のいずれかにハイブリダイズする核酸分子またはその断片をいう 。本発明の好ましいＴＰ２核酸は配列番号：１３に記載した全長ＴＰ２、配列番 号：１３の１−１６８９、配列番号：１３のヌクレオチド１−１９２０、配列番 号：１３のヌクレオチド１９２０−２８２０、配列番号：１３のヌクレオチド２ ０８９−２８２０、および配列番号：１３のヌクレオチド２０８９−２８５９を 含む。 パーセント配列同一性は、２つのポリペプチドのアミノ酸の 位置において類似性を比較するのに通常使用される標準的方法によって決定され る。例として、ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡのごときコンピュータープログラム を用い、パーセント配列同一性を決定すべき２つのポリペプチドをそれらの各ア ミノ酸の最適マッチングのために整列させる（１または両方の配列の全長、また は１または両方の配列の予備決定された部分を含み得る「マッチしたスパン」） 。各コンピュータープログラムは「不足」オープニングペナルティおよび「不足 」ギャップペナルティ、およびＰＡＭ２５０のごときスコアリングマトリックス を提供する。標準的スコアリングマトリックス（Ｄａｙｈｏｆｆら、：Ａｌｔａ ｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， 第５巻，追録３［１９７８］参照）をコンピュータープログラムと組み合わせて 使用することができる。次いで、パーセント同一性を、ＦＡＳＴＡのごときプロ グラムに含まれるアルゴリズムを用いてパーセント同一性を決定することによっ て計算することができる：少なくとも７０パーセント同一であるポリペプチドは、典型的には、野生型ＴＲ ＩＰ１と比較して１以上のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を有する 。通常、置換は、蛋白質の正味の総電荷、極性または疎水性に対してほとんどま たは全く影響を有しないように保存的であるが、所望によりＴＲＩＰ１の活性を 増大させてもよい。 以下の表Ｉに保存的置換を記載する。 「ストリンジェント条件」という用語は、高度に相同性の配列へのオリゴヌク レオチドまたはｃＤＮＡ分子プローブのごとき核酸分子の結合のみを可能とする 条件下でのハイブリダイゼーションおよび洗浄をいう。ストリンジェント洗浄溶 液の１例としては５５℃−６５℃の温度で使用する０．０１５Ｍ ＮａＣｌ、０ ．００５Ｍ クエン酸ナトリウム、および０．１パーセントＳＤＳである。他の ストリンジェント洗浄溶液の例としては５０℃−６５℃の温度で使用される０． ２×ＳＳＣおよび０．１パーセントＳＤＳである。オリゴヌクレオチドプローブ を用いてｃＤＮＡまたはゲノミックライブラリーをスクリーニングす る場合、以下のストリンジェント洗浄条件を用いる。１つのプロトコルはオリゴ ヌクレオチドプローブの長さに応じて、３５℃−６２℃の温度で０．０５パーセ ントのピロリン酸ナトリウムを含む６×ＳＳＣを使用する。例えば、３５−４０ ℃で１４塩基対プローブを用い、５２−５７℃で２０塩基対プローブを洗浄し、 ５７−６３℃で２３塩基対プローブを洗浄する。バックグラウンド非特異的結合 が高く現れる場合は温度を２−３℃上昇させることができる。第２のプロトコル はオリゴヌクレオチドプローブを洗浄するのに塩化テトラメチルアンモニウム（ ＴＭＡＣ）を利用する。１つのストリンジェント洗浄溶液は３Ｍ ＴＭＡＣ、５ ０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、および０．２パーセントＳＤＳである。こ の溶液を用いる洗浄温度はプローブの長さに応じて変動させる。例えば、１７塩 基対プローブは約４５−５０℃で洗浄する。 本明細書で用いる「有効量」および「治療上有効量」という用語は前記したＴ ＲＩＰ１および／またはＴＰ２の１以上の生物学的活性を支持するのに必要なＴ ＲＩＰ１および／またはＴＰ２の量をいう。 本発明の実施において用途を有するＴＲＩＰ１および／また はＴＰ２ポリペプチドは、天然に生じる全長ポリペプチド、または切形ポリペプ チドもしくはペプチド（すなわち、「断片」）であり得る。該ポリペプチドまた は断片は化学的に修飾されていてもよい、すなわち、グリコシレート化され、リ ン酸化され、および／またはポリマーに結合されていてもよい。加えて、ポリペ プチドまたは断片は天然に生じるＴＲＩＰ１および／またはＴＰ２の変異体であ ってもよい（すなわち、天然に生じるＴＲＩＰ１またはＴＰ２と比較して１以上 のアミノ酸の欠失、挿入および／または置換を含有していてもよい）。 全長ＴＲＩＰ１またはＴＰ２ポリペプチドまたはその断片は、Ｓａｍｂｒｏｏ ｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａ ｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐ ｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ［１９８９］）および ／またはＡｕｓｕｂｅｌら編（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍ ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｒｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｉｎ ｃ．およびＷｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，ＮＹ［１９９４］）に記載されてい るもののごときよく知られた組換えＤＮＡ技術を用いて調製 することができる。ＴＲＩＰ１またはＴＰ２蛋白質またはその断片をコードする 遺伝子またはｃＤＮＡは、例えば、ゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリ ーニングすることによって、あるいはＰＣＲ増幅によって得ることができる。別 法として、ＴＲＩＰ１またはＴＰ２蛋白質またはその断片をコードする遺伝子を Ｅｎｇｅｌｓら（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．，２８：７１６−７ ３４［１９８９］）によって記載されているもののごとき当業者によく知られた 方法を用いて化学合成によって調製することができる。これらの方法は、とりわ け、核酸合成のためのホスホトリエステル、ホスホルアミダイト、およびＨ−ホ スホネート方法を含む。このような化学合成用の好ましい方法は標準的なホスホ ルアミダイト化学を用いるポリマー支持合成である。典型的には、ＴＲＩＰ１ま たはＴＰ２ポリペプチドをコードするＤＮＡは長さが数１００ヌクレオチドであ ろう。約１００ヌクレオチドより大きい核酸はこれらの方法を用いていくつかの 断片として合成することができる。次いで、該断片を一緒に連結して全長ＴＲＩ Ｐ１またはＴＰ２ポリペプチドを形成することができる。通常、ポリペプチドの アミノ末端をコードするＤＮＡ断片は、メチオニン残基をコー ドするＡＴＧを有するであろう。このメチオニンは、宿主細胞で産生されるポリ ペプチドがその細胞から分泌されるか否かに応じて、ＴＲＩＰ１またはＴＰ２ポ リペプチドの成熟形態に存在しても存在しなくしてもよい。 いくつかの場合、天然に生じるＴＲＩＰ１またはＴＰ２の核酸および／または アミノ酸変異体を調製するのが望ましいであろう。(1以上のヌクレオチドが野生 型または天然に生じるＴＲＩＰ１またはＴＰ２とは異なるように設計された）核 酸変異体は、部位特異的突然変異誘発またはプライマー（類）が所望の点突然変 異を有するＰＣＲ増幅を用いて生成することができる（突然変異誘発技術の記載 については、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前掲およびＡｕｓｕｂｅｌら、前掲参照）。 Ｅｎｇｅｌｓら、（前掲）によって記載された方法を用いる化学合成を用いてこ のような変異体を調製することができる。当業者に知られた他の方法も同様に使 用することができる。好ましい核酸変異体はＴＲＩＰ１またはＴＰ２を生成させ るのに使用されるべき宿主細胞におけるコドン優先性を説明するヌクレオチド置 換を含有するものである。他の好ましい変異体は、野生型と比較して前記した保 存的アミノ酸変化をコードするもの（例えば、ここで、 天然に生じるアミノ酸側鎖の電荷または極性は、異なるアミノ酸ての置換によっ て実質的に改変されない）、および／またはＴＲＴＰ１またはＴＰ２上に新規グ リコシル化および／またはリン酸化部位（群）を生じるように設計したもの、ま たはＴＲＩＰ１またはＴＰ２上の存在するグリコシル化および／またはリン酸化 部位（群）を欠失するように設計したものである。 ＴＲＩＰ１またはＴＰ２遺伝子またはｃＤＮＡは宿主細胞中での発現用の適当 な発現ベクターに挿入することができる。該ベクターは、典型的には、使用する 特定の宿主細胞で機能的であるように選択される（すなわち、該ベクターは、Ｔ ＲＩＰ１またはＴＰ２遺伝子の増幅および／または該遺伝子の発現が起こり得る ように宿主細胞機器に適合するものである）。ＴＲＩＰ１またはＴＰ２ポリペプ チドまたはその断片は原核生物、酵母、昆虫（バクロウイルス系）および／また は真核生物宿主細胞で増幅／発現され得る。宿主細胞の選択は、ＴＲＩＰ１また はＴＰ２ポリペプチドまたはその断片がグリコシル化および／またはリン酸化さ れるべきか否かに少なくとも部分的には依存するであろう。もしそうであれば、 酵母、昆虫、または哺乳動物宿主細胞が好ましい：酵母細胞は、典型的には、該 ポリペプ チドをグリコシル化しリン酸化でき、昆虫および哺乳動物細胞は、それが天然で ＴＲＩＰ１またはＴＰ２ポリペプチドで起こるように（すなわち、「天然」グリ コシルおよび／またはリン酸化）該ポリペプチドをグリコシル化および／または リン酸化することができる。 典型的には、宿主細胞のいずれかで使用されるベクターは、５’フランキング 配列（「プロモーター」とも呼ばれる）および１つ以上のエンハンサー、複製起 点要素、転写終結要素、ドナーおよびアクセプタースプライス部位を含有する完 全なイントロン配列、シグナルペプチド配列、リポソーム結合部位要素、ポリア デニル化配列、発現されるべきポリペプチドをコードする核酸を挿入するための ポリリンカー領域、および選択可能マーカー要素のごとき他の調節要素を含有す るであろう。これらの要素の各々は後記する。任意に、該ベクターは「タグ」配 列、すなわち、（ヘキサＨｉｓのごとき）ポリＨｉｓをコードするＴＲＩＰ１ま たはＴＰ２コーディング配列の５’または３’末端に位置するオリゴヌクレオチ ド配列あるいはもう１つの小さな免疫原性配列を含有することができる。このタ グは当該蛋白質と共に発現されるであろうし、宿主細胞からのＴＲＩＰ１ま たはＴＰ２ポリペプチドの精製用のアフィニティータグとして働くことができる 。任意に、該タグは、引き続いて、例えば選択されたペプチダーゼを用いるごと き種々の手段によって精製ＴＲＩＰ１またはＴＰ２ポリペプチドから除去するこ ともできる。 該５’フランキング配列は同種（すなわち、宿主細胞と同一種および／または 株からのもの）、異種（すなわち、宿主細胞種または株以外の種からのもの）、 ハイブリッド（すなわち、複数の源からの５’フランキング配列の組合せ）、合 成のものであってよく、あるいはそれは天然ＴＲＩＰ１またはＴＰ２の５’フラ ンキング配列であってよい。それ自体、５’フランキング配列の源はいずれかの 単細胞原核生物または真核生物、いずれかの脊椎動物または無脊椎動物、または いずれかの植物であってよい。但し、５’フランキング配列は宿主細胞中で機能 的であるか、または宿主細胞によって活性化できるものとする。 本発明のベクターで有用な５’フランキング配列は、当該分野でよく知られた いくつかの方法のうちいずれかによって得ることができる。典型的には、ＴＲＩ Ｐ１またはＴＰ２の５’フランキング配列以外のここで有用な５’フランキング 配列は、 マッピングによっておよび／または制限エンドヌクレアーゼ消化によって従前に 同定されており、従って、適当な制限エンドヌクレアーゼを用いて適当な組織源 から単離することができる。いくつかの場合、５’フランキング配列の十分なヌ クレオチド配列は公知であり得る。ここで、５’フランキング配列は核酸合成ま たはクローニングにつき前記した方法を用いて合成することができる。 ５’フランキング配列の全部または一部が知られている場合、それは、ＰＣＲ を用いて、および／または適当なオリゴヌクレオチドおよび／または同一または もう１つの種からの５’フランキング配列断片にてゲノムライブラリーをスクリ ーニングすることによって得ることができる。 ５’フランキング配列か知られていない場合、５’フランキング配列を含有す るＤＮＡの断片は、例えば、コーディング配列またはその他の単数又は複数の遺 伝子を含むであろうより大きなＤＮＡから単離することができる。単離は、適当 なＤＮＡ断片を単離するように１以上の注意深く選択された酵素を用いる制限エ ンドヌクレアーゼ消化によって達成することができる。消化の後、所望の断片を アガロースゲル精製、Ｑｉａｇｅｎ （登録商標）カラムまたは当業者に知られた他の方法によって単離することがで きる。この目的を達成するための適当な酵素の選択は当業者には容易に明らかと なるであろう。 複製起点要素は、典型的には、商業的に購入された原核生物発現ベクターの一 部であり、宿主細胞におけるベクターの増幅を助けるものである。あるコピー数 までのベクターの増幅は、ある場合には、ＴＲＩＰ１またはＴＰ２ポリペプチド の最適発現で重要であり得る。もし選択されたベクターか複製起点部位を含有し なければ、公知の配列に基づいて化学的に合成し、ベクターに連結することがで きる。 転写終始要素は、典型的には、ＴＲＩＰ１またはＴＰ２ポリペプチドコーディ ング配列の３’末端に位置し、ＴＲＩＰ１またはＴＰ２ポリペプチドの転写を終 結するように働くことができる。通常、原核生物細胞における転写終始要素はＧ −Ｃリッチの断片、続いてのポリＴ配列である。該要素はライブラリーまたはベ クターの一部として商業的に購入したものからさえも容易にクローン化されるが 、前記したもののごとき核酸合成法を用いて容易に合成することもできる。 選択可能マーカー遺伝子要素は、選択培地中で増殖させた宿 主細胞の生存または増殖に必要な蛋白質をコードする。典型的な選択マーカー遺 伝子は、（ａ）原核生物宿主細胞では抗生物質または他のトキシン、例えばアン ピリシン、テトラサイクリン、またはカナマイシンに対する耐性を付与する、（ ｂ）当該細胞の栄養素要求性欠損を補う、または（ｃ）複合培地から利用できな い重要な栄養素を供給する蛋白質をコードする。好ましい選択可能マーカーはカ ナマイシン耐性遺伝子、アンピリシン耐性遺伝子、およびテトラサイクリン耐性 遺伝子である。 通常シャインダルガノ配列（原核生物）またはコザック配列（真核生物）と呼 ばれるリポソーム結合部位はｍＲＮＡの翻訳開始に必要である。該要素は、典型 的には、プロモーターの３’側であって、合成すべきＴＲＩＰ１またはＴＰ２ポ リペプチドの５’側に位置する。シャインダルガノ配列は変化するが、典型的に は、ポリプリンである（すなわち、高Ａ−Ｇ含有量を有する）。多くのシャイン ダルガノ配列が同定されており、その各々は前記した方法を用いて容易に合成で き、原核生物ベクターで使用することができる。 ＴＲＩＰ１またはＴＰ２が宿主細胞から分泌させるのが望ましい場合、シグナ ル配列を用いて、ＴＲＩＰ１またはＴＰ２ポ リペプチドをそれが合成される所から出すように仕向けることかでき、当該蛋白 質のカルボキシ末端部分を欠失させて、膜への係留を妨げることができる。典型 的には、シグナル配列はＴＲＴＰ１またはＴＰ２核酸配列のコーディング領域に 位置させるか、あるいはＴＲＩＰ１またはＴＰ２コーディング領域の５’末端に 直接的に位置させる。多くのシグナル配列が同定されており、選択された宿主細 胞で機能するそれらのうちいずれかを、ＴＲＩＰ１またはＴＰ２遺伝子と組み合 わせて使用することができる。従って、シグナル配列はＴＲＩＰ１またはＴＰ２ ポリペプチドに対して同種または異種であり得、ＴＲＩＰ１またはＴＰ２ポリペ プチドに対して同種または異種であり得る。さらに、シグナル配列は前記した方 法を用いて化学的に合成することができる。ほとんどの場合、シグナルペプチド の存在を介しての宿主細胞からのポリペプチドの分泌の結果、ポリペプチドから アミノ末端メチオニンが除去される。 多くの場合、ＴＲＩＰ１またはＴＰ２ポリペプチドの転写は、ベクター上の１ 以上のイントロンの存在によって増加し；これはＴＲＴＰ１またはＴＰ２が真核 生物宿主細胞、特に哺乳動物宿主細胞で産生される場合に特に当てはまる。特に 、使用する ＴＲＩＰ１またはＴＰ２核酸配列が全長ゲノム配列またはその断片である場合、 使用するイントロンはＴＲＩＰ１またはＴＰ２核酸配列内で天然に生じる。（ほ とんどのｃＤＮＡに関するように）該イントロンがＴＲＩＰ１またはＴＰ２ＤＮ Ａ配列内で天然に生じない場合、イントロン（群）は別の源から得ることかでき る。イントロンは機能するためには、転写されならなければならないので、５’ フランキング配列およびＴＲＩＰ１もしくはＴＰ２コーディング配列に関しては イントロンの位置は重要である。それ自体、ＴＲＩＰ１またはＴＰ２が核酸配列 かｃＤＮＡ配列であるような場合、該イントロンについての好ましい位置は転写 開始部位の３’側であって、ポリＡ転写終始配列の５’側である。好ましくは、 ＴＲＩＰ１またはＴＰ２ｃＤＮＡについては、イントロンは、それかこのコーデ ィング配列を中断しないようにＴＲＩＰ１またはＴＰ２コーディング配列の一方 側または他の側（すなわち、５’のたは３’側）に位置するであろう。いずれの ウイルス、原核および真核（植物または動物）生物をも含めたいずれの源からの いずれのイントロンを用いて本発明を実施することもできる。但し、それはそれ が挿入される宿主細胞（類）に適合するものとする。また、合 成イントロンもここに含まれる。任意に、１を超えるイントロンをベクターで用 いることもできる。 前記した１以上の要素が使用すべきベクターで既に存在する場合、それらは個 々に得て、ベクターに連結することができる。該要素の各々を得るために使用さ れる方法は当業者によく知られ、前記した方法（すなわち、ＤＮＡの合成、ライ ブラリースクリーニング等）に匹敵する。 本発明の実施に使用される最後のベクターは、典型的には、商業的に入手可能 なベクターのごとき出発ベクターから構築される。このようなベクターは、完成 されたベクターに含ませるべき該要素のうちのいくつかを含有させてもさせなく てもよい。もし所望の要素のいずれも出発ベクターに存在しなければ、連結させ るべき要素の末端およびベクターの末端が連結に適合するように、ベクターを適 当な制限エンドヌクレアーゼ（類）で切断することによって、各要素を個々にベ クターに連結させることができる。いくつかの場合、一緒に連結させるべき末端 を「平滑とする」ことが、満足すべき連結を得るのに必要である。平滑化は、全 ての４種のヌクレオチドの存在下でクレノウＤＮＡポリメラーゼまたはＴ４ＤＮ Ａポリメラーゼを用い、「粘着 末端」をまず満たすことによって達成される。この手法は当該分野でよく知られ ており、例えばＳａｍｂｏｏｋら、前掲に記載されている。 別法として、ベクターに挿入すべき２以上の要素を（それらが相互に隣接して 位置しておれば）まず一緒に連結し、次いでベクターに連結する。 ベクターを構築するもう１つの他の方法は、１つの反応混合物中で種々の要素 の全ての連結を同時に行うことである。ここで、多くのナンセンスまたは非機能 的ベクターが、該要素の不適当な連結または挿入に起因して生じるであろうが、 制限エンドヌクレアーゼ消化によって機能的ベクターを同定し、選択することが できる。 本発明を実施するための好ましいベクターは、細菌、昆虫および哺乳動物宿主 細胞に適合するものである。このようなベタターは、とりわけ、ｐＣＲＩＩおよ びｐＣＲ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃ Ａ）、ｐＢＳＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｏｍｐａｎｙ，ＬａＪｏｌｌａ， ＣＡ）およびｐＥＴＬ（ＢｌｕｅＢａｃＩＩ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む。 ベクターを構築し、ＴＲＩＰ１核酸がベクターの適当な部位に挿入された後、 完成されたベクターを増幅および／またはＴＲＴＰ１もしくはＴＰ２ポリペプチ ド発現のために適した宿主細胞に挿入することができる。 宿主細胞は(Ｅ．ｃｏｌｉのごとき)原核生物細胞または(酵母、昆虫細胞、ま たは脊椎動物細胞のごとき)真核生物宿主細胞であり得る。宿主細胞は、適当な 条件下で培養する場合、ＴＲＩＰ１またはＴＰ２ペプチドを合成し、これは（も し宿主細胞がそれを培地に分泌するならば）引き続いて培地から収集することが でき、あるいは（それが分泌されなければ）それを産生する細胞から直接的に収 集することができる。収集の後、ＴＲＩＰ１またはＴＰ２蛋白質は、モレキュラ ーシーブクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等のごとき方 法を用いて精製することができる。 宿主細胞の選択は、部分的には、ＴＲＩＰ１またはＴＰ２蛋白質がグリコシル 化またはリン酸化されるか否か（この場合、真核生物が好ましい）、および生物 学的活性蛋白質が細胞によって調製させるように、宿主細胞が蛋白質を天然の三 次構造に「折り畳む」ことができる様式（例えば、ジスルフィド架橋の 適当な向き）に依存するであろう。しかしながら、宿主細胞が生物学的活性ＴＲ ＩＰ１またはＴＰ２を合成しない場合、該ＴＲＩＰ１またはＴＰ２は後記する適 当な化学的条件を用いて合成した後「折り畳む」ことができる。 適当な細胞または細胞系はチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）または ３Ｔ３細胞のごとき哺乳動物細胞であり得る。適当な哺乳動物宿主細胞および形 質転換、培養、増幅、スクリーニングおよび産物生産および精製の方法の選択は 当該分野で公知である。他の適当な哺乳動物細胞系はサルＣＯＳ−１およびＣＯ Ｓ−７細胞系、およびＣＶ−１細胞系である。さらなる例示的哺乳動物宿主細胞 は、形質転換細胞系を含めた霊長類細胞系および齧歯類細胞系を含む。通常の二 倍体細胞、一次組織のイン・ビトロ培養から誘導された細胞株、ならびに一次外 植体も適当である。候補細胞は遺伝子型的に選択遺伝子が欠損したものでよく、 あるいは優勢的に活動する選択遺伝子を含有してもよい。他の適当な哺乳動物細 胞系はマウス・メタロチオネインＮ２Ａ細胞、ＨｅＬａ、マウスＬ−９２９細胞 、Ｓｗｉｓｓ、Ｂａｌｂ−ｃまたはＮＩＨマウスに由来する３Ｔ３系、ＢＨＫま たはＨａＫハムスター細胞系を含むがこれらの限定されるも のではない。 本発明で適する宿主細胞として同様に有用なものは、細菌細胞である。例えば 、Ｅ．ｃｏｌｉの種々の株（例えば、ＨＢ１０１、ＤＨ５α、ＤＨ１０およびＭ Ｃ１０６１）はバイオテクノジーの分野で宿主細胞としてよく知られている。Ｂ ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｐｓｕｅｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．、他のＢａｃｉｌｌｕ ｓ ｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．等の種々の株もこの方法で 使用することができる。 当業者に知られた酵母細胞の多くの株も本発明のポリペプチドの発現用宿主細 胞として利用することもできる。加えて、望むならば、昆虫細胞を本発明の方法 で宿主細胞として使用することができる（Ｍｉｌｌｅｒら、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅ ｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ８：２７７−２９８［１９８６］）。 ベクターの選択された宿主細胞への挿入(「形質転換」または「トランスフェ クション」ともいう）は、塩化カルシウム、エレクトロポレーション、マイクロ インジェクション、リポフェクションまたはＤＥＡＥ−デキストラン方法を用い て達成することができる。これらの方法および他の適当な方法は当業者によく知 られており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前掲に記 載されている。 ベクターを含有する宿主細胞（すなわち、形質転換されたまたはトランスフェ クトされた）は、当業者によく知られた標準的培地を用いて培養することができ る。該培地は、通常、細胞の増殖および生存に必要な全ての栄養素を含有するで あろう。Ｅ．ｃｏｌｉを培養するための適当な培地は、例えば、Ｌｕｒｉａブロ ス（ＬＢ）および／またはＴｅｒｒｉｆｉｃ ブロス（ＴＢ）である。真核生物 細胞を培養するのに適した適当な培地はＲＰＭＩ １６４０、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ であり、その全ては培養すべき特定の細胞系によって要求される血清および／ま たは成長因子を補足することができる。昆虫培養に適した培地は、要すれば、酵 母分解物、ラクトアルブミン加水分解物および／または胎児ウシ血清を補足した グレース（Ｇｒａｃｅ）培地である。 典型的には、トランスフェクトされた細胞の選択的増殖で有用な抗生物質また は他の化合物のみが培地への補足物として添加される。使用すべき化合物は、宿 主細胞がそれにより形質転換されたプラスミドに存在する選択可能マーカー要素 に指示される。例えば、選択可能マーカー要素がカナマイシン耐性であ る場合、培地に添加された化合物はカナマイシンであろう。 宿主細胞で産生されたＴＲＩＰ１またはＴＰ２ポリペプチドの量は、当該分野 で知られた標準的な方法を用いて評価することができる。このような方法は、限 定されるものではないが、ウェスタンブロット分析、ＳＤＳ−ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動、非変性ゲル電気泳動、ＨＰＬＣ分離、免疫沈降、および／また はＤＮＡ結合ゲルシフトアッセイのごとき活性アッセイを含む。 もしＴＲＩＰ１またはＴＰ２ポリペプチドか宿主細胞から分泌されるように設 計されたならば、ポリペプチドの大部分は細胞培養培地中で見いだすことができ る。このようにして調製したポリペプチドは、典型的には、アミノ末端メチオニ ンを保有しない。というのは、それは細胞からの分泌の間に除去されるからであ る。しかしながら、もしＴＲＩＰ１またはＴＰ２ポリペプチドが宿主細胞から分 泌されないならば、それは細胞質（真核生物、グラム陽性菌、および昆虫宿主細 胞につき）またはペリプラズム（グラム陰性菌宿主細胞につき）に存在するであ ろうし、アミノ末端メチオニンを有し得る。 細胞内ＴＲＴＰ１またはＴＰ２蛋白質については、宿主細胞 は、典型的には、まず機械的にまたは浸透圧により破壊して、細胞質内容物を緩 衝溶液に放出させる。次いで、ＴＲＩＰ１またはＴＰ２ポリペプチドをこの溶液 から単離することができる。 溶液からのＴＲＩＰ１ポリペプチドの精製は種々の技術を用いて達成すること ができる。もしポリペプチドが、そのカルボキシもしくはアミノ末端のヘキサヒ スチジン（ＴＲＩＰ１／ヘキサＨｉｓまたはＴＰ２／ヘキサＨｉｓ）または他の 小さいペプチドのごときタグを含有するように合成されていたならば、カラムマ トリックスが直接的に該タグまたはポリペプチドに対して高アフィニティーを有 するアフィニティーカラム（すなわち、ＴＲＩＰ１またはＴＰ２を特異的に認識 するモノクローナル抗体）に溶液を通すことによって１工程プロセスで実質的に 精製することができる。例えば、ポリヒスチジンはニッゲルに対して大きな親和 性および特異性でもって結合し、このように、（Ｑｉａｇｅｎニッケルカラムの ごとき）ニッゲルのアフィニティーカラムをＴＲＩＰ１／ポリＨｉｓまたはＴＰ ２／ポリＨｉｓの精製で使用することができる。（例えば、Ａｕｓｂｅｌら編、 Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏ ｇｙ，セクション１０．１１．８、 Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ［１９９３］参照） 。 ＴＲＩＰ１またはＴＰ２ポリペプチドがタグを有さず、抗体が利用できない場 合、精製用の他のよく知られた手法を使用することができる。このような手法は 、限定されるものではないが、イオン交換クロマトグラフィー、モレキュラーシ ーブクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、ゲル溶出と組み合わせた天然ゲル電気泳動 、および分取用等電点電気泳動（「Ｉｓｏｐｒｉｍｅ」マシーン／技術、Ｈｏｅ ｆｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含む。いくつかの場合、これらの技術のうち ２以上を組み合わせて増大した純度を達成することができる。 ＴＲＩＰ１またはＴＰ２ポリペプチドが第一義的に細菌のペリプラズム空間ま たは真核生物細胞の細胞質に見いだされるであろうことが予測されるならば、封 入体を含めたペリプラズムまたは細胞質の内容物（例えば、グラム陰性菌）は、 加工したポリペプチドがこのような複合体を形成したならば、当業者に知られた いずれかの標準的な技術を用いて宿主細胞から抽出することができる。例えば、 宿主細胞を溶解して、フレンチプレス、ホモジナイゼーションおよび／または音 波処理によってペ リプラズムの内容物を放出させることができる。次いで、ホモジネートを遠心す ることができる。 もしＴＲＩＰ１またはＴＰ２ポリペプチドがペリプラズム中に形成された封入 体を有するならば、封入体はしばしば内方および／または他の細胞膜に結合する ことができ、このように、遠心後にはペレット物質中に第一義的に見いだされる であろう。次いで、該ペレット物質をグアニジンまたは尿素のごときカオトロピ ック剤で処理して、封入体を放出させ、破壊し、可溶化することができる。その 今や可溶性の形態のＴＲＴＰ１またはＴＰ２ポリペプチドを、次いで、ゲル電気 泳動、免疫沈降等を用いて分析することができる。もしＴＲＩＰ１またはＴＰ２ ポリペプチドを単離するのが望まれるならば、単離は後記するＭａｒｓｔｏｎら （Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．，１８２：２６４−２７５［１９９０］）に記載されたも ののごとき標準的な方法を用いて達成することができる。 もしＴＲＩＰ１またはＴＰ２ポリペプチド封入体が宿主細胞のペリプラズム中 でかなりの程度形成されないのならば、ＴＲＩＰ１またはＴＰ２ポリペプチドは 細胞ホモジネートの遠心後には一義的には上清中に見いだされるであろうし、Ｔ ＲＩＰ１ またはＴＰ２ポリペプチドは後記するもののごとき方法を用いて上清から単離す ることができる。 ＴＲＩＰ１またはＴＰ２ポリペプチドを部分的にまたは完全に単離するのが好 ましい状況では、精製は当業者によく知られた標準的な方法を用いて達成するこ とができる。このような方法は、限定されるものではないが、電気泳動、続いて の電気溶出による分離、種々のタイプのクロマトグラフィー（免疫アフィニティ ー、モレキュラーシーブ、および／またはイオン交換）、および／または高圧液 体クロマトグラフィーを含む。いくつかの場合において、完全な精製のためには これらの方法のうちの１を超えて使用するのが好ましい。 組換えＤＮＡ技術を用いるＴＲＩＰ１またはＴＰ２ポリペプチドを調製し精製 することに加えて、ＴＲＩＰ１またはＴＰ２ポリペプチド、その断片、および／ または誘導体は、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄら（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８ ５：２１４９[１９６４]、Ｈｏｕｇｈｔｅｎら、Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２：５１３２［１９８５］）、およびＳｔｅｗａｒｔおよ びＹｏｕｎｇ（Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｒｄ，ＩＬ［１９８４］）によって記載され ているもののごとき当該分野で知られている方法を用い、（固相ペプチド合成の ごとき）化学合成方法によって調製することができる。このようなポリペプチド はアミノ末端メチオニンを含みまたは含まずして合成することができる。化学的 に合成したＴＲＩＰ１またはＴＰ２ポリペプチドまたは断片をこれらの文献に記 載された方法を用いて酸化して、ジスルフィド架橋を形成することができる。Ｔ ＲＩＰ１またはＴＰ２ポリペプチドまたは断片を、治療的および免疫学的プロセ スにて、天然の精製されたＴＲＩＰ１またはＴＰ２ポリペプチド用の生物学的活 性または免疫学的代替物として使用することができる。 ＴＲＩＰ１またはＴＰ２ポリペプチドがポリマーに連結された（「ＴＲＩＰ１ またはＴＰ２−ポリマー」）化学的に修飾されたＴＲＩＰ１またはＴＰ２組成物 （すなわち、「誘導体」）は本発明の範囲内に含まれる。選択されたポリマーは 、典型的には、それに結合する蛋白質が生理学的環境のごとき水性環境で沈殿し ないように水溶性である。選択されたポリマーは、通常、重合度が本発明の方法 で提供されるごとくに制御できるよ うに、アシル化のための活性エステルまたはアルキル化のためのアルデヒドのよ うな単一の反応性基を有するように修飾される。好ましい反応性アルデヒドは水 溶性であるポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、またはそのモノＣ１ −Ｃ１０アルコキシまたはアリールオキシ誘導体である（米国特許第５，２５２ ，７１４号）。該ポリマーは分岐または非分岐状であり得る。ポリマーの混合物 はＴＲＩＰ１−ポリマーまたはＴＰ２−ポリマーの範囲内に含まれる。好ましく は、最終生成物調製の治療的使用では、該ポリマーは医薬上許容可能であろう。 水溶性ポリマーまたはその混合物は、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ ）、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン、セルロースまたは 他のカルボヒドレートベースのポリマー、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリ エチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキ シド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、 グリセロール）およびポリビニルアルコールよりなる群から選択される。アシル 化反応では、選択されたポリマー（類）は単一の反応性エステル基を有すべきで ある。還元性アルキル化では、選択されたポリマー（類）は単一 の反応性アルデヒド基を有すべきである。該ポリマーはいずれの分子量であって もよく、分岐状または非分岐状であってよい。 ＴＲＩＰ１またはＴＰ２のペギレーションは、例えば、以下の文献：Ｆｏｃｕ ｓ ｏｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ３：４−１０（１９９２）；ＥＰ ０ １５４ ３１６；およびＥＰ ０ ４０１ ３８４に記載されているごとき、 当該分野で知られているペギレーション反応のいずれかによって行うことができ る。好ましくは、ペギレーションは後記する反応性ポリエチレングリコール分子 （または類似の反応性水溶性ポリマー）でのアシル化反応またはアルキル化反応 を介して行うことができる。 アシル化によるペギレーションは、一般に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ ）の反応性エステル誘導体とＴＲＩＰ１またはＴＰ２蛋白質との反応を含む。い ずれの公知のまたは引き続いての発見された反応性ＰＥＧ分子を用いても、ＴＲ ＩＰ１またはＴＰ２のペギレーションを行うことができる。好ましい活性化ＰＥ ＧエステルはＮ−ヒドロキシスクシンイミド（「ＮＨＳ」）にエステル化された ＰＥＧである。本明細書で使用される「アシル化」は、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔ ｅ Ｃｈｅｍ．５： １３３−１４０（１９９４）に記載されているごとく、限定されることなく、以 下のタイプのＴＲＩＰ１またはＴＰ２とＰＥＧ：アミド、カルバメート、ウレタ ン等のごとき水溶性ポリマーとの間の結合を含む。反応条件は、ペキレーション 分野で知られているもの、または引き続いて開発されたもののいずれかから選択 することができる。但し、修飾すべきＴＲＩＰ１またはＴＰ２種を不活化するで あろう温度、溶剤、ｐＨのような条件は回避される。 アシル化によるペギレーションの結果、通常、ポリ−ペギレート化されたＴＲ ＩＰ１またはＴＰ２生成物がもたらされ、ここで、リシンε−アミノ基がアシル 結合性基を介してペギレート化される。好ましくは、連結結合はアミドであろう 。また、好ましくは、得られた生成物は少なくとも約９５パーセントモノ、ジ− またはトリ−ペキレート化されるであろう。しかしながら、より高い程度のペギ レート化（ＴＲＩＰ１またはＴＰ２のシリンε−アミノ酸基＋ＴＲＩＰ１または ＴＰ２のアミノ末端におけるα−アミノ基の最大数）を持ついくつかの種は、通 常、使用する具体的反応条件に応じた量で形成されるであろう。所望ならば、よ り精製されたペギレート化種は、とりわけ、透 析、塩析、限外濾過、イオン−交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラ フィーおよび電気泳動を含めた標準的な精製技術によって混合物、特に未反応種 から分離することができる。 アシル化によるペギレーションは、一般に、還元剤の存在下でのＰＥＧの末端 アルデヒド誘導体とＴＲＩＰ１またはＴＰ２との反応を含む。ペギレート化の程 度にも拘わらず、ＰＥＧ基は、好ましくは、−ＣＨ₂−ＮＨ−基を介して蛋白質 に結合する。−ＣＨ₂−基を特に参照すると、このタイプの結合を本明細書では 「アルキル」結合という。 モノペギレート化生成物を生じさせるための還元的アルキル化を介する誘導体 化により、ＴＲＩＰ１またはＴＰ２における誘導体化用に入手できる第一級アミ ノ基（リシン対Ｎ−末端）の異なるタイプの異なる反応性がもたらされる。典型 的には、該反応は、リシン残基のε−アミノ基の問のｐＫａ差異および当該蛋白 質のＮ−末端残基のα−アミノ基のそれを利用できるｐＨ（後記参照）で行われ る。このような選択的誘導体化によって、アルデヒドのごとき反応性基を含有す る水溶性ポリマーの蛋白質への結合が制御され：ポリマーとの結合が、リシン側 鎖アミノ基のごとき他の反応性基の有意な修飾なくして蛋白質 のＮ−末端で優勢的に起こる。本発明は、ＴＲＩＰ１−モノポリマーまたはＴＰ ２−モノポリマー蛋白質結合分子（ポリマー分子が実質的にＴＲＩＰ１またはＴ Ｐ２蛋白質上の単一位置のみ（すなわち、少なくとも約９５％）に付着されてい るＴＲＩＰ１またはＴＰ２蛋白質を意味する）の実質的に均一な調製物を提供す る。より詳細には、もしポリエチレングリコールを用いれば、本発明は可能性と して抗原性連結基を欠き、ＴＲＩＰ１またはＴＰ２蛋白質に直接的にカップリン グしたポリエチレングリコール分子を有するペギレート化ＴＲＩＰ１またはＴＰ ２蛋白質も提供する。 ここに使用される特に好ましい水溶性ポリマーはＰＥＧと略されるポリエチレ ングリコールである。本明細書で用いるポリエチレングリコールとは、モノ−（ Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ−またはアリールオキシ−ポリエチレングリコールの ごとき他の蛋白質を誘導体化するのに使用されてきたＰＥＧの形態のいずれも含 むことが意図される。 一般に、化学誘導体化は、生物学的活性物質を活性化ポリマー分子と反応させ るのに使用されるいずれかの適当な条件下で行うことができる。ペギレート化Ｔ ＲＩＰ１またはＴＰ２を調 製する方法は、一般に、（ａ）それによりＴＲＩＰ１またはＴＰ２が１以上のＰ ＥＧ基に結合するようになる条件下で、ＴＲＩＰ１またはＴＰ２ポリペプチドを （ＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体のごとき）ポリエチレングリ コールと反応させ、次いで（ｂ）反応生成物（類）を得る工程を含む。一般に、 アシル化反応用の最適反応条件は既知のパラメーターおよび所望の結果に基づい て決定されるであろう。例えば、ＰＥＧ：蛋白質の比がより大きくなれば、ポリ −ペギレート化生成物のパーセントはより大きくなる。 モノポリマー／ＴＲＩＰ１またはＴＰ２蛋白質結合分子の実質的に均一な集団 を生じる還元的アルキル化は、一般に、（ａ）ＴＲＩＰ１またはＴＰ２蛋白質を 、ＴＲＩＰ１またはＴＰ２蛋白質のアミノ末端のα−アミノ基の選択的修飾を可 能とするのに適したｐＨにて、還元的アルキル化条件下で、反応性ＰＥＧ分子と 反応させ、次いで、（ｂ）反応生成物（類）を得る工程を含む。 モノ−ポリマー／ＴＲＩＰ１またはＴＰ２蛋白質結合分子の実質的に均一な集 団については、還元的アルキル化反応条件は、ＴＲＩＰ１またはＴＰ２のＮ−末 端への水溶性ポリマー部位の 選択的結合を可能とするものである。このような反応条件は、一般に、リシンア ミノ基およびＮ−末端のα−アミノ基間のｐＫａ差異を提供する（該ｐＫａはア ミノ基の５０％がプロトン化されて、５０％がされていないｐＨである）。また 、該ｐＨは使用すべき蛋白質に対するポリマーの比率に影響する。一般に、ｐＨ が低ければ、蛋白質に対してより過剰のポリマーが所望されるであろう（すなわ ち、Ｎ−末端α−アミノ基が反応性が低くなれば、最適条件を達成するのに必要 なポリマーは多くなる）。ｐＨが高くなれば、ポリマー：蛋白質の比率は大きな 値である必要は無い（すなわち、より反応性の基が利用できれば、必要なポリマ ー分子は少なくなる）。本発明の目的では、ｐＨは、一般的には、３−９、好ま しくは３−６の範囲内となろう。 もう１つの重要な考慮はポリマーの分子量である。一般に、ポリマーの分子量 が高くなれば、蛋白質に結合できるポリマー分子の数は少なくなる。同様に、こ れらのパラメーターを最適化する場合、ポリマーの分岐を考慮すべきである。一 般に、分子量が高くなれば（または分岐が多くなれば）、ポリマー：蛋白質比率 は高くなる。一般に、ここに考えられるペギレーショ ン反応については、好ましい平均分子量は約２ｋＤａないし約１００ｋＤａであ る（「約」という用語は±１ｋＤａを示す）。好ましい平均分子量は約５ｋＤａ ないし約５０ｋＤａ、特に好ましくは約１２ｋＤａないし約２５ｋＤａである。 ＴＲＩＰ１蛋白質に対する水溶性ポリマーの比率は、一般に、１：１ないし１０ ０：１、好ましくは（ポリペギレーションについては）１：１ないし２０：１、 および（モノペギレーションについては）１：１ないし５：１の範囲となろう。 前記で示した条件下を用い、還元的アルキル化はアミノ末端にα−アミノ基を 有するいずれかのＴＲＩＰ１またはＴＰ２蛋白質の選択的結合を提供し、モノポ リマー／ＴＲＴＰ１またはＴＰ２蛋白質結合体の実質的に均一な調製物を提供す る。「モノポリマー／ＴＲＩＰ１またはモノポリマー／ＴＰ２蛋白質結合体」と いう用語は、ここでは、ＴＲＩＰ１またはＴＰ２蛋白質分子に結合した単一のポ リマー分子よりなる組成物を意味する。モノポリマー／ＴＲＩＰ１またはモノポ リマー／ＴＰ２蛋白質結合体は、好ましくは、Ｎ−末端に位置するポリマー分子 を有するが、リシンアミノ側鎖には有しないであろう。該調製物は、好ましくは 、９０％を超えるモノポリマー／ＴＲＩＰ１ またはモノポリマー／ＴＰ２結合体、より好ましくは９５％を超えるモノポリマ ーＴＲＩＰ１またはＴＰ２蛋白質結合体であり、観察された分子の残りは未反応 である（すなわち、ポリマ一部位を欠く蛋白質）。これらの例は、少なくとも約 ９０％モノポリマー／蛋白質結合体、および約１０％の未反応蛋白質である調製 物を提供する。モノポリマー／蛋白質結合体は生物学的活性を有する。 本還元的アルキル化については、還元剤は水性溶液中で安定であるべきあって 、好ましくは、還元的アルキル化の初期プロセスで形成されるシッフ塩基のみを 還元できる。好ましい還元剤はホウ水素化ナトリウム、シアノホウ水素化ナトリ ウム、ジメチルアミンボラン、トリメチルアミンボランおよびピリジンボランよ りなる群から選択される。特に好ましい還元剤はシアノホウ水素化ナトリウムで ある。 溶媒、反応時間、温度等のごとき他の反応パラメーター、および生成物の精製 の意味は、水溶性ポリマーでの蛋白質の誘導体化に関する公開された情報に基づ いて決定される。 ポリマーＴＲＩＰ１またはポリマー−ＴＰ２蛋白質結合分子の混合物は、前記 したごとくにアシル化および／またはアルキ ル化方法によって調製でき、混合物に含めるべきモノポリマー／蛋白質結合体の 割合を選択することができる。このように、所望ならば、種々の蛋白質と結合し た種々の数のポリマー分子の混合物（すなわち、ジ−、トリ−、テトラ−等）を 調製し、本発明の方法を用い、モノポリマー／ＴＲＩＰ１またはモノポリマー／ ＴＰ２蛋白質と組み合わせることができる。 一般に、本発明のポリマー／ＴＲＩＰ１またはポリマー／ＴＰ２の投与によっ て軽減され変調できる条件は、一般にＴＲＩＰ１およびＴＰ２分子につき本明細 書に記載したものを含む。しかしながら、ここに開示するポリマー／ＴＲＩＰ１ またはポリマー／ＴＰ２分子は、非誘導体化分子と比較して、他の活性、増強さ れたまたは低下した活性、または他の特徴を有し得る。 ＴＲＩＰ１またはＴＰ２核酸分子、断片、および／またはそれ自体は活性アッ セイで活性なポリペプチドをコードしない誘導体は、哺乳動物組織または体液試 料におけるＴＲＩＰ１またはＴＰ２ ＤＮＡまたは対応するＲＮＡの存在につい ての、定性的または定量的にテストする診断アッセイでハイブリダイゼーション プローブとして有用であり得る。 ＴＲＩＰ１またはＴＰ２ポリペプチド断片および／または活性アッセイでそれ 自体は活性ではない誘導体は、ＴＲＩＰ１またはＴＰ２ポリペプチドを認識する 抗体を調製するのに有用であり得る。 ＴＲＩＰ１またはＴＰ２ポリペプチドおよびその断片は、化学的に修飾された またはそうではないかを問わず、単独で、または他の医薬組成物と組み合わせて 使用することができる。 ＴＲＩＰ１またはＴＰ２ポリペプチドおよび／またはその断片を用いて、標準 的な方法によって生じた抗体を調製することができる。従って、ＴＲＩＰ１また はＴＰ２ポリペプチドと反応する抗体、ならびにこのような抗体の反応性断片は も本発明の範囲内にあると考えられる。該抗体はポリクローナル、モノクローナ ル、組換え、キメラ、一本鎖および／または双方特異的であり得る。典型的には 、抗体またはその断片はヒト起源であり、あるいは「ヒト化されており」、すな わち患者に投与された場合に抗体に対する免疫化反応を防止しまたはそれを最小 化するように調製されるであろう。抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’等のごとき本 発明のＴＲＩＰ１またはＴＰ２と反応性であるいずれの断片であってもよい。ま た、本発明によって、選択 された哺乳動物に対して抗原としてＴＲＩＰ１もしくはＴＰ２またはその断片を 提示し、続いて公知の技術によって哺乳動物の細胞（例えば、脾臓細胞）とある 種の癌細胞とを融合させて不死化細胞系を創製することによって創製されるハイ ブリドーマが提供される。このような細胞系を創製するのに使用される方法およ び本発明のヒトＴＲＩＰ１またはＴＰ２ポリペプチドの全てまたは一部に対する 抗体も本発明に含まれる。 該抗体は、ＴＲＩＰ１またはＴＰ２のテロメアへの、テロメラーゼＲＮＡへの 、またはテロメラーゼ複合体またはテロメラーゼ複合体に結合する蛋白質の他の 成分への結合を阻害する、または他の方法でＴＲＩＰ１またはＴＰ２活性を阻害 するのに使用することができる。該抗体は、さらに、体液または細胞試料中のＴ ＲＩＰ１またはＴＰ２の存在を検出するための標識形態におけるごとく、イン・ ビボまたはイン・ビトロ診断目的で使用することができる。 治療組成物および投与 ＴＲＩＰ１またはＴＰ２の治療組成物は本発明の範囲内にある。このような組 成物は、医薬上許容される担体と混合した治療上有効量のＴＲＩＰ１またはＴＰ ２ポリペプチドまたはその 断片（化学的に修飾できるもののいずれか）を含み得る。担体物質は、好ましく は、哺乳動物への投与用の溶液に共通した他の物質を補足した注射用水であり得 る。典型的には、ＴＲＩＰ１治療化合物を、１以上の生理学的に許容される担体 、賦形剤または希釈剤と組み合わせた、（化学的に修飾し得る）精製したＴＲＩ Ｐ１ポリペプチドまたは断片を含む組成物の形態で投与されるであろう。中性緩 衝化生理食塩水または血清アルブミンと混合した生理食塩水は適当な担体である 。好ましくは、該生成物は適当な賦形剤（例えば、スクロース）を用いて凍結乾 燥体として処方される。他の標準的な担体、希釈剤および賦形剤は要すれば含め ることができる。他の組成物の例は約ｐＨ７．０−８．５のトリス緩衝液、また は約ｐＨ４．０−５．５の酢酸緩衝液を含み、これはさらにソルビトールまたは それに代えての適当な代替物を含み得る。 ＴＲＩＰ１またはＴＰ２組成物は非経口にて全身投与することができる。別法 として、該組成物は静脈内または皮下投与することができる。全身投与する場合 、本発明で用いる治療組成物はパイロジェン不含の非経口的に許容される水性溶 液の形態とし得る。必要なｐＨ、等張性、安定性等にての、このような 医薬上許容される蛋白質溶液の調製は当業者の技量内のものである。 本発明を実施するのに有用なＴＲＩＰ１またはＴＰ２の治療処方は、凍結乾燥 ケーキまたは水性溶液の形態にて、所望の程度の純度を有する選択された組成物 を任意の生理学的に許容される担体、賦形剤、または安定化剤（Ｒｅｍｉｎｇｔ ｏｎｓ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，第１８版、Ａ． Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ［１ ９９０］）と混合することによって貯蔵用に調製することができる。許容される 担体、賦形剤または安定化剤は受容者に対して非毒性であって、好ましくは、使 用する用量および濃度で不活性であって、ホスフェート、シトレート、または他 の有機酸のごとき緩衝液；アスコルビン酸のごとき抗酸化剤；低分子量ポリペプ チド；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンのごとき蛋白質；ポリビ ニルピロリドンのごとき疎水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン 、アルギニンまたはリシンのごときアミノ酸；単糖、二糖およびグルコース、マ ンノース、またはデキストリンを含めた他の炭水化物；ＥＤＴＡのごときキレー ト剤；マンニトールまたはソ ルビトールのごとき糖アルコール；ナトリウムのごとき塩形成性対イオン；およ び／またはＴｗｅｅｎ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓまたはポリエチレングリコール（Ｐ ＥＧ）のごとき非イオン性界面活性剤を含む。 イン・ビボ投与で使用すべきＴＲＩＰ１またはＴＰ２組成物は無菌でなければ ならない。これは滅菌濾過膜を通す濾過によって容易に達成される。ＴＲＩＰ１ またはＴＰ２組成物が凍結乾燥される場合、これらの方法を用いる滅菌を、凍結 乾燥および復元に先立って、またはその後に行うことができる。非経口投与用組 成物は、通常、凍結乾燥形態または溶液中に保存することができる。 治療組成物は、一般に、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射 針で刺すことができるストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルに入 れられる。 組成物の投与経路は公知の方法に従う。例えば、経口、注射または静脈内によ る点滴、腹腔内、脳内（実質内）、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内または病巣内 経路、または所望によりカテーテルの使用を含み得る徐放系または移植デバイス 。所望ならば、該組成物は注入、ボーラス注射によって、または移植デ バイスによって連続的に投与することができる。別法としてあるいは加えて、Ｔ ＲＴＰ１またはＴＰ２は、膜、スポンジ、またはＴＲＴＰ１またはＴＰ２ポリペ プチドが吸着された他の適当な物質の患部への移植を介して局所投与することが できる。 ＴＲＩＰ１またはＴＰ２ポリペプチドは、徐放処方もしくは製剤にて投与する ことができる。徐放製剤の適当な例は、成型製品、例えばフィルムまたはマイク ロカプセルの形態の半透性ポリマーマトリックスを含む。徐放性マトリックスは ポリエステル、ヒドロゲル、ポリアクチド（米国特許第３，７７３，９１９号、 ＥＰ ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸およびガンマエチル−Ｌ−グルタメー トのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ、２２：５４７−５ ５６［１９８３］）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）（Ｌａｎ ｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．、１５：１６７−２７７［ １９８１］およびＬａｎｇｅｒ、Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．、１２：９８−１０５［ １９８２］）、エチレンビニルアセテート（Ｌａｎｇｅｒら、前掲）またはポリ −Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ １３３，９８８）を含む。また、徐放 組成物は当該分野で公知のいくつかの方法のうちいずれかに よって調製することができるリポソームを含有することもできる（例えば、ＤＥ ３，２１８，１２１；Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ ｃｉ．ＵＳＡ、８２：３６８８−３６９２［１９８５］；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏ ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７：４０３０−４０３４［１９８ ０］；ＥＰ ５２，３２２；ＥＰ ３６，６７６；ＥＰ ８８，０４６；ＥＰ １４３，９４９）。 他の場合において、ＴＲＩＰ１またはＴＰ２は、ＴＲＩＰ１ポリペプチドを発 現し分泌するように遺伝的に操作された患者のある種の細胞への移植を通じて送 達することもできる。このような細胞は動物またはヒト細胞であり得、患者自身 の組織、またはもう１つの源（ヒトまたは非ヒト）に由来し得る。任意に、該細 胞は不死化させることができる。該細胞は患者の適当な身体組織または器官に移 植することができる。 有効量の治療で使用すべきＴＲＩＰ１またはＴＰ２組成物（類）は、例えば、 ＴＲＩＰ１またはＴＰ２が使用されるべき症状、投与経路、および患者の状態の ごとき治療目的に依存するであろう。従って、医師は、最適治療効果を得るのに 必要な用量を力価滴定し、投与経路を修飾することが必要であろう。 典型的な日用量は、前記した因子に応じて、約０．１μｇ／ｋｇないし１００ｍ ｇ／ｋｇ以上の範囲とし得る。典型的には、臨床医は、所望の効果が達成される 用量に到達するまでＴＲＩＰ１またはＴＰ２組成物を投与するであろう。ＴＲＩ Ｐ１またはＴＰ２組成物は、従って、単一用量として、または経時的に（ＴＲＩ Ｐ１またはＴＰ２の同一用量を含有してもまたはしなくてもよい）２以上の用量 として、あるいは移植デバイスまたはカテーテルを介した連続的注入として投与 することができる。 さらなる研究が行われるにつれ、種々の患者における種々の疾患の治療用の適 当な用量レベルに関する情報が得られるであろうし、治療の意味、治療下の障害 のタイプ、受容者の年齢および一般的健康を考慮し、当業者は適当な用量を確認 できるであろう。 ある状況では、例えば、末成熟老化および他の老化障害のごとき、ＴＲＩＰ１ またはＴＰ２が有効な治療剤であるＨＩＶ感染、エイズまたは他の病気に罹った 患者へのＴＲＩＰ１またはＴＰ２の投与用の遺伝子治療方法を使用するのが望ま しいであろう。これらの状況において、ＴＲＩＰ１またはＴＰ２をコードするゲ ノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、および／または合成ＤＮＡ、 またはその断片または変異体を、当該組成物が注射される組織で活性な構成的ま たは誘導的プロモーター（ここで、該プロモーターは同種または異種であり得る ）に作動可能に連結させることができる。次いで、この構築体をアデノウイルス ベタターまたはレトロウイルスベタターのごとき適当なベクターに挿入して「遺 伝子治療ベクター」を得ることができる。（例えば、エイズ患者におけるＴ−細 胞のごとき）治療すべき患者の細胞を患者から取り出し、真核生物細胞用の標準 的トランスフェクション手法を用いて遺伝子治療ベクターに感染させ、ＴＲＩＰ １またはＴＰ２蛋白質生産用にテストすることができる。次いで、ＴＲＩＰ１ま たはＴＰ２を発現する細胞を患者に再導入することができる。 遺伝子治療を用いてＴＲＩＰ１またはＴＰ２発現を変調できる第２の方法は、 プロモーターのヌクレオチド組成物を修飾することである。このような修飾は、 典型的には、同種組換え方法を介して達成される。ＴＲＩＰ１またはＴＰ２プロ モーター配列の一部を含有するＤＮＡ構築体は、転写を調節するプロモーター片 を除去するように作成することができる。例えば、ＴＲＩＰ１および／またはＴ Ｐ２プロモーター（類）の転写アク チベーター蛋白質のＴＡＴＡボックスおよび／または結合部位を欠失することが できる；このような欠失はプロモーター活性を阻害し、それにより、対応するＴ ＲＩＰ１および／またはＴＰ２遺伝子（類）の転写を抑制することができる。プ ロモーター中のＴＡＴＡボックスまたはアクチベーター結合配列の欠失は、１以 上のＴＡＴＡボックスおよび／またはアクチベーター結合部位ヌクレオチドが１ 以上のヌクレオチドの置換、欠失および／または挿入を介して突然変異された突 然変異プロモーター配列を含むノックアウト構築体を生成することによって達成 することができる。この構築体は直接的にまたは標準的な真核生物トランスフェ クション技術を用いてベクター中にて適当な細胞に挿入することができる（エク ス・ビボまたはイン・ビボ）。 ＴＲＩＰ１および／またはＴＰ２発現を活性化するのが望ましい状況において 、遺伝子治療および同種組換えを用いて、エンハンサー要素類をＴＲＩＰ１およ び／またはＴＰ２プロモーターに挿入することができる。使用されるエンハンサ ー要素（類）は、ＴＲＩＰ１またはＴＰ２を活性化するのが望ましい組織に基づ いて選択されるであろう；所与の組織中にてプロモーター活性化を付与すること が知られているエンハンサー要素 類が選択されるであろう。例えば、もしＴＲＩＰ１および／またはＴＰ２がＴ− 細胞中で「スイッチを入れる」べき場合、ｌｃｋプロモーターエンハンサー要素 を使用することができる。ここで、活性化すべきプロモーター（ＴＲＩＰ１およ び／またはＴＰ２）の一部を含有する同種組換え構築体を、標準的なクローニン グ技術を用いてプロモーターに挿入することができる。次いで、同種組換え構築 体をエクス・ビボまたはイン・ビボにて所望の細胞に挿入することができる。 また、ＴＲＩＰ１またはＴＰ２活性を阻害するのが望ましい場合、遺伝子治療 方法を使用することもできる。ここで、（１）全長テロメラーゼＲＮＡ、（２） ＴＲＴＰ１またはＴＰ２と相互作用するテロメラーゼＲＮＡの少なくとも一部、 （３）ＴＲＩＰ１またはＴＰ２ ｍＲＮＡの一部、または（４）全長ＴＲＩＰ１ またはＴＰ２ ｍＲＮＡに対して相補的な配列を持つアンチセンスＤＮＡまたは ＲＮＡを調製し、適当なベクターに入れ、（予めエクス・ビボにて患者から取り 出された）選択された細胞にトランスフェクトすることができる。別法として、 アンチセンス構築体を含有するベクターを、患者において、マイクロインジェク ション、リポフェクション等、または所望の細 胞タイプを介するイン・ビボ投与で用いることができる。該ベクターは、典型的 には、宿主細胞の機器と組み合わせて高レベルのアンチセンスＲＮＡを生じるそ の能力に基づいて選択される。 別法として、遺伝子治療を用いて、ＴＲＩＰ１またはＴＰ２の優性−陰性阻害 剤を生じさせることができる。この状況において、ＴＲＩＰ１またはＴＰ２の突 然変異体全長または切形をコードするＤＮＡをレトロウイルスまたはアデノウイ ルス、あるいは匹敵するベクターに挿入し、該ベクターは今度はエクス・ビボま たはイン・ビボにて患者の細胞にトランスフェクトする。このＴＲＩＰ１または ＴＰ２突然変異体は、テロメラーゼ複合体が機能的に不活性となるように、（１ ）テロメラーゼ複合体を形成するにおいて内因性ＴＲＩＰ１またはＴＰ２と競合 し、（２）野生型ＴＲＩＰ１またはＴＰ２と比較して、１以上の挿入、欠失およ び／または突然変異を含有するように設計される。例えば、ＲＮＡに結合する分 子の一部（ヒトＴＲＩＰ１のほぼアミノ酸１−９００）が変更されていないが、 そのテロメア結合ドメインまたはその蛋白質−蛋白質相互作用ドメインが欠失ま たは非機能的とされたＴＲＩＰ１またはＴＰ２切形 突然変異体を、標準的クローニング技術を用いて生成させることができ；次いで 、この突然変異体は（それが導入される細胞タイプで活性な）適当なプロモータ ーに作動可能に連結し、患者の細胞にトランスフェクトすることができる。この 突然変異体ＴＲＩＰ１蛋白質は、それが導入された細胞で過剰生産されると、テ ロメラーゼＲＮＡの結合用の内因性ＴＲＩＰ１蛋白質および／または内因性ＴＰ ２と競合でき、その結果、不活性なテロメラーゼ複合体が形成される。 優性−陰性発現技術は、逆転写酵素ドメインの１つに位置する、アミノ酸位置 （群）８６８および／または８６９において１以上の点突然変異を含有するＴＰ ２ＤＮＡ構築体を生成させることによって、ＴＰ２の逆転写酵素活性が低下した またはなくなった突然変異体ＴＰ２構築体でトランスフェクトされた細胞で効果 的であることがここに示された。特定の点突然変異が構築された実施例参照。他 のこのような点突然変異および／または逆転写酵素活性を不活化する置換または 欠失、および／またはＴＲＩＰ１結合ドメイン、および／またはＴＰ２のテロメ ラーゼＲＮＡ結合ドメインもここで考えられる。このような突然変異体ＴＰ２構 築体は、内因性テロメラーゼ活性を有する細 胞で発現させることができ、天然（野生型）ＴＰ２と競合することによって、こ のようなテロメラーゼ活性を阻害するように働くことができる。 ＴＲＩＰ１またはＴＰ２の阻害剤につきスクリーニングするアッセイ 前記したごとく、癌細胞（不死化細胞）のごときある種の細胞においてＴＲＴ Ｐ１またはＴＰ２活性のレベルを阻害しまたは有意に減少させるのが望ましいで あろう。ＴＲＩＰ１またはＴＰ２活性を阻害する化合物は、局所または静脈内注 射によって、あるいは経口送達、移植デバイス等によつてエクス・ビボまたはイ ン・ビボにて投与することができよう。後記するアッセイは、ＴＲＩＰ１活性を 阻害し得る化合物を同定するのに有用な方法の例を提供する。 読みやすさのため、以下の定義をアッセイを記載するのに使用する。 「テスト分子（類）」は、（１）ＴＲＩＰ１またはＴＰ２とテロメラーゼＲＮ Ａとの相互作用、（２）ＴＲＩＰ１またはＴＰ２とテロメア結合蛋白質との、テ ロメア自体との、またはテロメラーゼ複合体を含む他のポリペプチドとの相互作 用、また は（３）ＴＲＩＰ１またはＴＰ２の活性部位をブロックするその潜在的能力によ って、ＴＲＩＰ１またはＴＰ２の阻害剤としての評価下にある分子（類）をいう 。 Ａ．精製された蛋白質を用いるイン・ビトロアッセイ 精製された蛋白質を用いるイン・ビトロアッセイのいくつかのタイプを行って 、テロメラーゼ活性を消滅させる化合物を同定することができる。このような活 性の消滅は、ＴＲＩＰ１またはＴＰ２とテロメアとの相互作用を阻害する化合物 、テロメラーゼＲＮＡまたはテロメラーゼ酵素複合体の他の蛋白質成分とのＴＲ ＩＰ１またはＴＰ２会合を阻害する化合物によって、または逆転写酵素モチーフ またはＴＰ２のモチーフをブロックする化合物によって、達成することができる 。 １つのアッセイにおいて、（例えば、前記した方法を用い調製された）精製Ｔ ＲＩＰ１またはＴＰ２蛋白質またはその断片は、マイクロタイタープレートのウ ェルの底への付着によって固定化することができる。放射標識テロメラーゼＲＮ Ａ、ならびにテスト分子（類）を、次いで、該ウエルに一度に１つまたは同時に 添加することができる。インキュベーションの後、該ウェルを洗浄し、放射能用 のシンチレーションカウンターを用 いて計数して、テスト分子の存在下でＴＲＩＰ１／テロメラーゼＲＮＡ結合また はＴＰ２／テロメラーゼ結合ＲＮＡの程度を決定することができる。典型的には 、該分子は一定濃度範囲にわたってテストし、テストアッセイの１以上の要素を 欠く一連の対照「ウェル」を、結果の評価での正確性のために使用することがで きる。このアッセイの変形は、ウェルへのテロメラーゼＲＮＡの結合、およびテ スト分子と共にＴＲＩＰ１またはＴＰ２のウェルへの結合を含む。インキュベー ションおよび洗浄の後、該ウェルを放射能につき計数することができる。 放射標識以外のいくつかの手段がＴＲＴＰ１、ＴＰ２またはテロメラーゼＲＮ Ａを「マーク」するのに利用できる。例えば、ＴＲＩＰ１をコードするＤＮＡが ｃ−ｍｙｃエピトープのごときペプチドのコーディング配列に融合したＴＲＩＰ １またはＴＰ２の融合蛋白質である。ＴＲＸＰ１−ｍｙｃ融合蛋白質またはＴＰ ２−ｍｙｃ融合蛋白質は、ｍｙｃに向けられた商業的に入手可能な抗体で容易に 検出することができる。 テロメラーゼＲＮＡは、それを３２−Ｐ ＡＴＰのごとき放射標識ヌクレオチ ドで合成することによって標識することができ、次いで、放射能のレベルをシン チレーションカウンティン グによって測定することができる。別法として、該ＲＮＡはビオチン、ジゴキシ ケニン、または匹敵する化合物を用いて標識することができる。 結合アッセイのマイクロタイタープレート型の別法は、アガロースビーズ、ア クリルビーズまたは不活性基質のごとき他のタイプ上のＴＲＩＰ１、ＴＰ２、ま たはテロメラーゼＲＮＡを固定化することを含む。該ＲＮＡまたはＴＲＩＰ１も しくはＴＰ２を含有する不活性基質を、放射標識または蛍光標識されている相補 的成分（ＲＮＡまたはＴＲＩＰ１もしくはＴＰ２）と共にテスト分子を含有する 溶液に入れることができ；インキュベーションの後、不活性基質を遠心によって 沈殿させることができ、ＴＲＩＰ１およびＲＮＡの間の結合の量またはＴＰ２お よびＲＮＡの間の結合の量を、前記した方法を用いて評価することができる。別 法として、不活性基質複合体をカラム中に固定化することができ、テスト分子お よび相補的成分をカラムに通すことができる。ＴＲＩＰ１／ＲＮＡ複合体または ＴＰ２／ＲＮＡ複合体の形成は、次いで、前記した技術セット、すなわち放射標 識、抗体結合等のいずれかを用いて評価することができる。 ＴＲＩＰ１活性を阻害する分子を同定するのに有用なイン・ビトロアッセイの もう１つのタイプは、表面プラズモン共鳴ディテクター系を用い、製造業者のプ ロトコルに従うＢｉｏｃｏｒｅアッセイ系（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔ ａｗａｙ，ＮＪ）である。このアッセイは、ディテクター中に位置すデキストラ ン−被覆センサーチップへのＴＲＩＰ１またはテロメラーゼＲＮＡの共有結合を 含む。次いで、テスト分子および相補的成分を、センサーチップを含有するチャ ンバーに同時にまたは順次に注射することができ、ＴＲＩＰ１／ＲＮＡまたはＴ Ｐ２／ＲＮＡの結合の量を、センサーチップのデキストラン−被覆側と物理的に 会合した分子の質量の変化に基づいて評価することができ；分子質量の変化はデ ィテクター系によって測定することができる。 ＴＲＩＰ１／ＲＮＡまたはＴＰ２／ＲＮＡ複合体の分子破壊を評価するのに有 用な１つの他のアッセイ破壊ゲルシフトアッセイである。ここで、ＴＲＩＰ１ま たはＴＰ２、テロメラーゼＲＮＡ、およびテスト分子を一緒にインキュベートす ることができる。典型的には、該ＲＮＡは（３２−Ｐ ＡＴＰのごとき）核酸用 の標準的な放射性同位体を用いて放射標識される。イン キュベーションの後、試料を、アクリルアミド濃度が約４−６パーセントである 非変性アクリルアミドゲル上を泳動させることができる。次いで、該ゲル上のテ ロメラーゼＲＮＡの移動パターンを評価することができる。ＴＲＩＰ１／ＲＮＡ 複合体またはＴＰ２／ＲＮＡ複合体が（テスト分子での処理後でさえ）電気泳動 の間に無傷である場合、複合体の増大した分子量により移動が示されるであろう 。しかしながら、もしテスト分子がＴＲＩＰ１／ＲＮＡ複合体またはＴＰ２／Ｒ ＮＡ複合体を十分に破壊しておれば、テロメラーゼＲＮＡは対照（未処理）テロ メラーゼＲＮＡと匹敵するように移動するであろう。移動はオートラジオグラフ ィーによって検出することができる。 いくつかの場合、ＴＲＩＰ１またはＴＰ２活性を減少させるかまたは阻害する のに使用される２以上のテスト分子を評価するのが望ましいであろう。これらの 場合において、前記したアッセイは、このようなさらなるテスト分子（類）を同 時にまたは引き続いて第１のテスト分子に添加することによって容易に修飾する ことができる。アッセイにおける工程の残りは前記したものであり得る。 Ｂ．培養された細胞を用いるイン・ビトロアッセイ 不死化細胞（自然に無限に複製する能力を獲得した通常の哺乳動物細胞、オン コジーンで形質転換した通常の哺乳動物細胞、または腫瘍に由来する哺乳動物細 胞いずれか）の培養を用いて、ＴＲＩＰ１またはＴＰ２阻害につきテスト分子を 評価することができる。不死化細胞はいずれかの哺乳動物から得ることができる が、好ましくは、ヒトまたは他の霊長類、イヌまたは齧歯類源からのものであろ う。 １つのタイプの細胞培養アッセイにおいて、不死化細胞をＤＭＥＭ、アルファ −ＭＥＭ、またはＲＰＭＩのごとき標準的な培地中で培養することができる。典 型的には、該培地は約１０パーセントまでの（ｖ：ｖ）の胎児ウシ血清を含有す るであろう。インキュベーションは、典型的には、１−５日間行う。このインキ ュベーションの後、テスト分子または分子類を添加でき、細胞を１−７日間イン キュベートし、３−８細胞周期を行わせる。細胞を洗浄していずれの残存するテ スト分子も除去した後、細胞を収穫し、ＴＲＡＰアッセイ（Ｋｉｍら、前掲）ま たはＴＲＦアッセイ（Ｈａｒｌｅｙら、１９９０、前掲）のごときイン・ビトロ アッセイでテロメラーゼ活性を分析すること ができる。阻害はテロメア長、テロメラーゼ活性または双方の減少によって維持 することができる。例えば、２つの公知の逆転写酵素阻害剤、ジデオキシＧＴＰ およびＡＺＴは、不死化細胞においてテロメア長の減少およびイン・ビトロのテ ロメラーゼ活性の減少を引き起こすことが示されている（Ｓｔｒａｈｌら、Ｍｏ ｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１６：５３−６５［１９９６］）。 もう１つの細胞アッセイにおいて、ヒト不死化細胞を、全長ＴＲＩＰ１もしく はＴＰ２、またはＴＲＩＰ１もしくはＴＰ２の切形バージョンいずれかをコード するＤＮＡ構築体でトランスフェクトすることができる。トランスフェクション の後、細胞を一定時間インキュベートでき、その後にテロメラーゼ活性をＴＲＡ Ｐアッセイを用いて評価でき、ＴＲＦまたは他の適当なアッセイによってテロメ ア長をアッセイすることができる。 以下の実施例は例示的目的のみを意図し、断じて本発明の範囲を限定するもの と解釈されるべきではない。 実施例 １．マウスＴＲＩＰ１ ｃＤＮＡの分子クローニング ライブラリー調製、ＤＮＡクローニング、および蛋白質発現 のための標準的方法はＳａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ ｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ ｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｒｉｔｅ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ ｒｂｏｒ，ＮＹ［１９８９］）に記載されている。 成体マウス・クローニング陰窩細胞から精製したＲＮＡを用い、ｃＤＮＡラリ ブラリーを構築した。ｍＲＮＡはＲＮＡの膜結合ポリソーム画分から単離した（ Ｍｅｃｈｌｅｒら、Ｍｅｔｈ，Ｅｎｚ．，１５２：２４１−２４８［１９８７］ ）。ポリ（Ａ＋）ｍＲＮＡ画分は、製造業者の推奨に従い、ＦａｓｔＴｒａｃ ｍＲＮＡ単離キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用 い、全ＲＮＡから単離した。第１鎖ｃＤＮＡはランダムヘキサヌクレオチドを用 い、該ＲＮＡを逆転写することによって得た（ＲｅｄｉＰｒｉｍｅキット、Ａｍ ｅｒｓｈａｍ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）。 ランダム起点ｃＤＮＡラリブラリーは、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔプラスミド系 を用い、第１鎖ｃＤＮＡから調製した（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓ ｂｕｒｇ，ＭＤ）。内部 ＮｏｔＩ制限部位を含有するランダムｃＤＮＡプライマーを用いて、第１鎖合成 を開始し、該プライマーは以下の二本鎖配列を有していた。 第１鎖ｃＤＮＡ合成反応は、１μｇのｍＲＮＡおよび１５０ｎｇのＮｏｔＩラ リブラリープライマーを用いて組み立てた。第２鎖合成後、反応生成物をフェノ ール：クロロホルム：イソアミルアルコール混合液で抽出し、エタノール沈殿さ せた。二本鎖（ｄｓ）ｃＤＮＡ産物を以下のオリゴヌクレオチドアダプター（Ｇ ｉｂｃｏ ＢＲＬ）に連結した。 連結後、該ｃＤＮＡをＮｏｔＩで完全消化し、フェノール／クロロホルム／イ ソアミルアルコール（２５：２４：１比）で抽出し、エタノール沈殿させた。次 いで、再懸濁したｃＤＮＡを、製造業者に推奨されるように、既製カラムＳｕｐ ｅｒｓｃｒｉｐｔプラスミド系（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を用いるゲル濾過によっ てサイズ分画した。最大のｃＤＮＡ産物を含有する画分を エタノール沈殿させ、次いで、ＮｏｔＩおよびＳａｌＩ消化のｐＭＯＢベクター ＤＮＡに向きを定めて連結した（Ｓｔｒａｔｈｍａｎｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２ ５２：８０２−８０８［１９９１］）。エレクトロポレーションによって、該連 結したｃＤＮＡをエレクトロコンピテントＸＬ１−Ｂｌｕｅ Ｅ．ｃｏｌｉに導 入した（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ、ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ）。該ラリブラリーをｃｍ １と名づけた。 該ラリブラリーからのほぼ２０，０００コロニーを拾い、約２００μｌのＬ− ブロス、７．５％グリセロール、５０μｇ／ｍｌのアンピリシンおよび１２．５ μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有する９６ウェルのマイクロタイタープレー トに分注した。該培養を３７℃で増殖させ、無菌９６ピン複製ツールを用いて二 セットのマイクロタイタープレートを作製し、両セットをさらなる分析のために −８０℃で保存した。 このラリブラリーからのランダムｃＤＮＡクローンを配列決定するために、ベ クタープライマーを用い、クローン化ｃＤＮＡインサートのＰＣＲ増幅によって 配列決定鋳型を調製した。ｃＤＮＡクローンのグリセロールストックを解凍し、 小アリコートを蒸留水中に１：２５希釈した。ほぼ３．ｌμｌの希釈細 菌培養を、以下のオリゴヌクレオチド： を含有するＰＣＲ反応混合物（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）に添 加した。 以下のサイクル条件：２分間の９４℃；５秒間の９４℃、５秒間の５０℃およ び３分間の７２℃の３０サイクルおよび４分間の７２℃における最終伸長にて、 反応をサーモサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ９６００）中でインキュベ ートした。サーモサイクラー中でのインキュベーション後、反応を２．０ｍｌの 水で希釈した。増幅したＤＮＡ断片を、製造業者の推奨手法を用い、Ｃｅｎｔｒ ｉｃｏｎカラム（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）を用いてさら に精製した。いくつかの場合には、低プライマーおよびデオキシヌクレオチド三 リン酸濃縮物を増幅反応で用い、これらの場合に、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ精製は必 要ではなかった。ＰＣＲ反応生成物はＴ３プライマー： を用い、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３７３Ａ自 動ＤＮＡシーケンサーで配列決定した。 製造業者の推奨の手法に従い、Ｔａｑ染料−ターミネーター反応（Ａｐｐｌｉ ｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を行った。 これらのクローンからの６方法の翻訳されたＤＮＡ配列のサーチを行って、以 下の基準に適合するクローンを単離した： １．潜在的シグナルペプチド：翻訳された配列は以下のものを含有する：メチ オニン、続いて１ないし３個正に荷電した残基、続いて６−１５個の疎水性残基 、続いて１−２個の荷電残基、続いて少なくとも残基のオープンリーディングフ レーム。 ２．予測されるアルファらせん構造。オープンリーディングフレームは、ソフ トウェアプログラムＭａｃｖｅｃｔｏｒ４．５のＲｏｂｓｏｎ／Ｇａｒｎｉｅｒ アルゴリズムによって検定して少なくとも３０％のアルファらせんを含有するこ とが予測される配列を含有する。 ３．ロイシン含有量。該オープンリーディングフレームは少なくとも１０％の ロイシン残基を含有する。 ４．システイン含有量。該オープンリーディングフレームは少なくとも１個で あるが７個以下のシステイン残基を含有する。 ５．膜貫通ドメインの欠如。該オープンリーディングフレー ムは１５−２５個の連続的疎水性または非荷電残基の配列を含有しない。 これらの基準の全てを満足する１つのクローンｃｍ１−８５−ｇ３をさらなる 特徴付けのために選択した。このクローンのさらなる配列を同定するために、ｃ ｍ１−８５−ｇ３をプローブとして用い、（実質的に前記したごとくに調製した ）マウス結腸組織ｃＤＮＡライブラリーから得られたクローンをサーチした結果 、ｃｍ１−８５−ｇ３との重複（相同）配列、更に３’終始コドンを含む３’配 列を含有する、クローンｃｍ３−１−ｅ４が同定された。クローンｃｍ１−８５ −ｇ３は長さが約１３２２塩基対（ｂｐ）であり、クローンｃｍ３−１−ｅ４は 約６．９ｋｂであった。コーディング領域の５’部分を得るために、該ｃｍｌ− ８５−ｇ３の５’末端に対応するアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびｐＭ０ Ｂベクターポリリンカー配列の一部に対応するオリゴヌクレオチドを用いてＰＣ Ｒ増幅を行った。このＰＣＲ反応用の鋳型は９６ＤＮＡ試料であった。各試料は 、まず、９６の１５ｃｍプレート上の１０，０００クローンの密度にて全ｃｍ１ ライブラリーを平板培養することによって調製した。培養後、各プレートを掻き 取り、該クローン を含有する得られたプールした細菌をグリセロールストックとして調製した。Ｄ ＮＡは各プールの一部から調製し、各ＤＮＡ試料の１−３μｇを個々のウェルに 添加した。 ＰＣＲ条件は：３０サイクルの、２０秒間の９４℃；１０秒間の５０℃、およ び３０秒間の７２℃であった。試料はアガロースゲル電気泳動によって分析した 。 約１．５ｋｂのＰＣＲ断片をＰＣＲ反応液の１つから単離し、配列決定した。 このＰＣＲ断片での種々のデータベースのサーチの結果、ｂｍｓｔ２−１５−ｇ ６と命名した相同配列が同定された。このクローンを全配列決定し、いくつかの 停止コドンが先行するメチオニンを含有することが判明し、これは当該遺伝子に ついての翻訳開始部位を示す。 ３つのクローンｃｍ１−８５−ｇ３、ｃｍ３−１−ｅ４およびｂｍｓｔ２−１ ５−ｇ６は重複する長さきち約８１５９ｂｐの隣接配列を形成した。この配列内 には約２６２９個のアミノ酸を含む約７８８７ｂｐのオープンリーディングフレ ームがあった。 Ｇｅｎｂａｎｋ ＤＮＡ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙにおける全ての翻訳されたＤ ＮＡ配列に対するこのオープンリーディング フレームのＦＡＳＴＡサーチにより、テトラヒメナのテロメラーゼＰ８０サブユ ニットに対する相同性が明らかになった。アミノ酸相同性のいくつかの重要なス トレッチはこのテトラヒメナのアミノ酸配列を横切ることが判明した。これらの 領域のうちの１つはテトラヒメナのテロメラーゼＰ８０サブユニットの９０アミ ノ酸にわたって約４６パーセントの同一性を示した。テトラヒメナの・テロメラ ーゼとの相同性のため、この遺伝子をマウス・テロメラーゼＲＮＡ相互反応性蛋 白質１（「ＴＲＩＰＩ」）と命名した。 ２．ヒトＴＲＩＰ１遺伝子のクローニング マウスＴＲＩＰ１遺伝子に対するヒト相同性は、ヒト結腸腫瘍細胞系ＬＩＭ１ ８６３からのＲＮＡを用いて構築したｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングす ることによって同定した（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、４ ７：２７０４−２７１３［１９８７］）。全ＲＮＡを単離し、製造業者の推奨す る手法に従い、ＦａｓｔＴｒａｃ ｍＲＮＡ単離キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ 、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いてポリ（Ａ＋）ｍＲＮＡ画分を得た。 内部ＮｏｔＩ制限部位を含有するランダムｃＤＮＡプライマ ーを用いて、第１鎖ｃＤＮＡ合成を開始した。このプライマーは配列番号：５お よび配列番号：６につき前記した二本鎖配列を有していた。第１鎖ｃＤＮＡ合成 反応は、約１μｇのｍＲＮＡおよび１５０ｎｇのＮｏｔＩランダムプライマー（ すなわち、配列番号：５および６）を用いて構築した。次いで、Ｓｕｐｅｒｓｃ ｒｉｐｔプラスミド系（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ ）を用い、この第１鎖ｃＤＮＡ物質からランダム起点ｃＤＮＡライブラリーを調 製した。 第２鎖合成後、反応生成物をフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコー ル混合液で抽出し、エタノール沈殿させた。二本鎖（ｄｓ）ｃＤＮＡ産物を、配 列番号：７および配列番号：８につき前記した配列と共に二本鎖オリゴヌクレオ チドアダプターに連結した。 第２鎖合成後、反応生成物をフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコー ル混合液で抽出し、エタノール沈殿させた。二本鎖（ｄｓ）ｃＤＮＡ産物を、配 列番号：７および配列番号：８につき前記した配列と共に二本鎖オリゴヌクレオ チドアダプターに連結した。 連結後、ｃＤＮＡをＮｏｔＩで完全消化し、フェノール：ク ロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１比）で抽出し、エタノール 沈殿させた。次いで、再懸濁させたｃＤＮＡを、製造業者によって推奨されてい るごとく、既製カラムＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔプラスミド系（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲ Ｌ）を用いるゲル濾過によってサイズ分画した。最大のｃＤＮＡ産物を含有する 画分をエタノール沈殿させ、次いで、ＮｏｔＩおよびＳａｌＩ消化したｐＳＰ０ ＲＴベクター（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）に向き を定めて連結した。連結したｃＤＮＡをエレクトロポレーションによってエレク トロコンピテントＸＬ１−Ｂｌｕｅ Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌ ａＪｏｌｌａ、ＣＡ）に導入した。 ９６の１５ｃｍペトリ皿上のプレート当たり約１０，０００クローンの密度に て、全ライブラリーを平板培養することによって、ｃＤＮＡライブラリーを分注 した。インキュベーション後、各プレートを掻き取り、得られたプールした細菌 をグリセロールストックとして調製した。各プールのアリコートからＤＮＡを調 製し、ＮｏｔＩで消化し、１％アガロースゲル上の電気泳動に付し、サザンブロ ッティング用の荷電ナイロン膜に移した。該ゲル上の９６レーンの各々は、この ように、約 １０，０００のｃＤＮＡクローンを含有した。標準的方法を用い、クローンｃｍ １−８５−ｇ３のほぼ５００ｂｐのＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片をランダム プライマー標識し、サザンブロットにハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼー ションは、Ｒａｐｉｄ Ｈｙｂ緩衝液（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ）を用い、製造業者のプロトコルに従い、５０℃で少な くとも２時間行った。約１０パーセントの試料がプローブにハイブリダイズした 。ＤＮＡプール５４、５８および８７に対応するレーンは最大のインサートを含 有し、これらをさらなる分析用に選択した。 上記プールクローンを含有する細菌のグリセロールストックを、寒天プレート を被覆するニトロセルロースフィルター上に直接的に平板培養し、３０℃で数時 間増殖させ、溶解させ、ｃｍ１−８５−ｇ３の５００ｂｐランダムプライマープ ローブにハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション条件はＲａｐｉｄ Ｈ ｙｂ緩衝液を用いて前記したごとくに行った。陽性クローンを拾い、再スクリー ニングして各ストックから単一クローンを単離した。５４、５８および８７と命 名した３つの選択したクローンは相互にかなり重複した配列を含有した。ヒトＴ ＲＩＰ １遺伝子用のさらなる５’配列を同定するために、３つのクローンのうちの最大 のクローン５４を用いて、ＰＣＲプライマーのためのその５’末端近くに位置す る１つのアンチセンスオリゴヌクレオチドを得た。第２のＰＣＲプライマーはｐ ＳＰ０ＲＴベクターに対応した。ＰＣＲ用の鋳型は前記と同一の９６ウェルプー ルであった。ＰＣＲ条件は：３０サイクルの２０秒間の９４℃；１０秒間の５０ ℃、および３０秒間の７２℃であった。ｐＳＰ０ＲＴポリリンカーに見いだされ るオリゴヌクレオチド配列と一緒にアンチセンスオリゴヌクレオチドを用い、ア ガロースゲル電気泳動によって試料を分析した。 ほぼ１．５ｋｂｐのバンドがプール９６中に同定された。次いで、このプール を平板培養し、少なくとも２時間、前記したＲａｐｉｄ Ｈｙｂ緩衝液を用い、 フィルターを６０℃でハイブリダイズさせた以外は前記したごとくにスクリーニ ングした。該プローブはクローン５４の５’末端に対してアンチセンスオリゴヌ クレオチドであり、以下のように標準的方法を用いて５’末端で放射標識した。 約１７０ｎｇのプローブを、製造業者によって供された緩衝液を用い、約２００ μｇの３２−Ｐ標識ＡＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ）および約２０Ｕのポリヌクレオチドキナーゼ（Ｂｏｅｈ ｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｈｅｉｍ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を含有する 溶液中で約37゜Ｃにて約１時間インキュベートした。製造業者のプロトコルに従 い、Ｇ２５ Ｑｕｉｃｋｓｐｉｎカラム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｈｅｉ ｍ）を通す遠心によって、放射標識オリゴヌクレオチドを組み込まれなかったヌ クレオチドから分離した。 ヒトＴＲＩＰ１遺伝子の３’領域を同定するために、クローン５４の３’末端 に対応するセンスオリゴヌクレオチドおよびｐＳＰ０ＲＴポリリンカーに対応す るオリゴヌクレオチド配列をＰＣＲ反応で用いた。同一の９６ウエルプールをＰ ＣＲ反応の鋳型として用いた。 ＰＣＲ条件は：３０サイクルの２０秒間の９４℃；１０秒間の５５℃、および ３０秒間の７２℃であった。試料はアガロースゲル電気泳動によって分析した。 ３ｋｂのＰＣＲ産物をＤＮＡプール６３から同定した。次いで、このプールを 平板培養し、前記したごとくにスクリーニングした。この反応用のプローブは標 準的な方法を用いて５’末端にて放射標識したクローン５４の３’に対するセン スオリゴ ヌクレオチドであった。該プローブに強力にハイブリダイズするＤＮＡクローン を含有する２つのコロニーを、次いで、その全部を配列決定した。これらのクロ ーンを９６および６３と呼んだ。 コーディング配列の残りの３’部分を同定するために、もう１ラウンドのＰＣ Ｒを行った。ここで、使用したプライマーは（１）クローン６３の３’末端に対 するセンスオリゴヌクレオチドおよび（２）ｐＳＰＯＲＴベクターのＳＰ６に対 応するオリゴヌクレオチドであった。ＰＣＲ条件は、３０サイクルの２０秒間の ９４℃；１０秒間の５５℃、および３０秒問の７２℃であった。ＰＣＲ用の鋳型 は同一の９６ウェルのプールであった。試料はアガロースゲル電気泳動であった 。ほぼ２００ｂｐの断片がプール１５で同定された。次いで、このプールを平板 培養し、フィルターを放射標識プローブとハイブリダイズさせることによって前 記したごとくにスクリーニングした。この反応用のプローブは標準的方法を用い て５’にて放射標識したクローン６３の３’末端に対するセンスオリゴヌクレオ チドであった。このクローン、クローン１５を全配列決定し、終始コドンを保有 することが判明した。 ３．マウスＴＲＩＰ１蛋白質調製 アミノ酸１−８７１をコードするマウスＴＲＩＰ１蛋白質の切形バージョンを 前記したごとくに調製した。この領域をコードするＤＮＡは以下の２つのオリゴ ヌクレオチド：（１）ＳａｌＩ制限部位をコードするオリゴヌクレオチド、続い てのマウスＴＲＩＰ１の最初の６アミノ酸、および（２）アミノ酸８６６−８７ １に対応するオリゴヌクレオチド、続いてのＴＡＧ停止コドンおよびＳａｌＩ制 限部位を用いるＰＣＲによって得た。この反応用の鋳型はクローンｃｍ１−８５ −ｇ３、ｃｍ３−１−ｅ４およびｂｍｓｔ２−１５−ｇ６であった。ＰＣＲ反応 は１５サイクルの２０秒間の９４℃、１０秒間の５５℃、および３０秒間の７２ ℃であった。 この反応の結果、アガロースゲル上のほぼ２．６ｋｂのバンドをもたらした。 このバンドを該ゲルから精製し、ＳａｌＩで消化し、ベクターｐＣＲ３ＭｙｃＴ ａｑのＸｈｏＩ部位にクローン化した。ｐＣＲ３ＭｙｃＴａｑは以下のように調 製した。ベクターｐＣＲ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ ）をＫｐｎＩおよびＸｈｏＩで消化した。ｃ−ｍｙｃエピトープの２つのコピー および開始メチオニンをコードする 核酸分子をｐＣＲ３に挿入した。このインサートの配列を配列番号：１２に記載 する。ＴＲＩＰ１インサートを含有する得られたプラスミド（アミノ酸１−８７ １をコードするｃＤＮＡ）はｐＣＲ３ＭｙｃＴａｑ２と命名した。 全長マウスＴＲＩＰ１をコードするｃＤＮＡを含有する第２のプラスミドｐＣ Ｒ３ＭｙｃＴａｑ３を以下のごとくに調製した。プラスミドｐＣＲ３ＭｙｃＴａ ｑ２を（当該ベクターからのアミノ酸８１６−８７１をコードするｃＤＮＡを欠 失させるのに働く）ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで消化し、ＸｂａＩ／ＳａｌＩリ ンカーを消化したプラスミドに連結した。（マウスＴＲＩＰ１のアミノ酸８１６ ないし２６２７に対応する）クローンｃｍ３−１−ｅ４のＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ 断片を該ベクターに連結した。得られたプラスミドｐＣＲ３ＭｙｃＴａｑ３は以 下の成分（５’ないし３’）：開始コドン、２つのｃ−ｍｙｃエピトープ、およ び全長マウスＴＲＩＰ１ ｃＤＮＡを有する。 全長および切形（アミノ酸１−８７１）マウスＴＲＩＰ１蛋白質は以下のごと くに調製した。ｐＣＲ３ＭｙｃＴａｑ３およびｐＣＲ３ＭｙｃＴａｑ３からのプ ラスミドＤＮＡを、完全液体トランスフェクションキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅ ｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いるリポフェクションによって、マウス神 経芽細胞腫Ｎ２Ａ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌ ｌｅｃｔｉｏｎ、カタログ番号ＣＣＬ１３１）にトランスフェクトした。これら の細胞は外来性蛋白質の一過性および安定な発現のために一般に使用される。ト ランスフェクションに２４時間先立って、細胞を、ＤＭＥＭ＋１０パーセントの 胎児ウシ血清およびＰＳＧ（ペニシリン、ストレプトマイシンおよびグルタミン ）中の１００ｍｍ皿当たり約７００，０００で接種した。リポフェクションでは 、細胞をＯｐｔｉｍｅｍＩ減少血清アルブミン（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、Ｇｒａｎ ｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）の約６ｍｌに入れ、約１７４μｇのＰｆｘ−６（Ｉｎ ｖｉｔｒｏｇｅｎ）および２９μｇのＤＮＡを添加した。細胞を約４時間インキ ュベートし、その後、培地を前記した新鮮なＤＭＥＭ、胎児ウシ血清、およびＰ ＳＧ培地と交換した。細胞を約２４時間後に収穫し、製造業者のプ ロトコルに従って、Ｑｉａｇｅｎシュレッダー（Ｑｉａｇｅｎ、Ｃｈａｔｓｗｏ ｒｔｈ、ＣＡ）を用いて溶解させた。蛋白質溶解物を６パーセントＳＤＳ−ＰＡ ＧＥによって電気泳動に付し、標準的な方法を用いてナイロン膜に移し、マウス ・モノクローナル抗−ｍｙｃ抗体（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒ ｏｄｕｃｔｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）と共にインキュベートした。抗−ｍ ｙｃ抗体の結合はＨＲＰ−結合二次抗体で検出し、製造業者のプロトコルに従い 、ＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ）を 用いて複合体を可視化した。ＴＲＩＰ１切形ｃＤＮＡを含有するベクターでトラ ンスフェクトした細胞は、（約８７１アミノ酸のポリペプチドに対応する）約９ ７ｋＤの顕著なバンドを示し、他方、全長ＴＲＩＰ１を含有するベクターでトラ ンスフェクトした細胞は（約２６２５アミノ酸のポリペプチドに対応する）約２ ８０ｋＤの顕著なバンドを示した。これらの結果は、ＴＲＩＰ１の切形または全 長蛋白質が細胞で発現されたことを示した。 ４．マウスＴＲＩＰ１ ＲＮＡ−結合アッセイ ｍＴＲＩＰ１がマウス・テロメラーゼＲＮＡであることが知 られているＲＮＡ分子との特異的相互反応を有するか否かを判断するために、Ｓ ｅｎＧｕｐｔａら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３：８ ４９６−８５０１［１９９６］）によって記載された３つのハイブリッドアッセ イを用いた。ＳｅｎＧｕｐｔａらによって記載された出発プラスミドｐＭＳ２− ２は、標準的な連結方法を用い、全長マウス・テロメラーゼＲＮＡ転写体（ｍＴ Ｒ；Ｂｌａｓｃｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６９：１２６７−１２７０［１９９５ ］）をコードするＤＮＡを、ポリリンカー領域の３’末端の２つのＭＳ２ＤＮＡ 配列と同一の向きにｐＭＳ２−２のＳｍａＩポリリンカー部位に挿入することに よって改変した。(全て後記の表Ｉに記載した、ＲＮＡ分子α−ｍＴＲ、ＴＬＣ １、ＩＲＥおよび突然変異体ｍＴＲ分子は同様にして構築した；Ｕ２、Ｕ４およ びＵ６は同様にＭＳ２ヘアーピンでタグ付けしたが、異なるＵＲＡ３選択酵母プ ラスミドｐＲＳ３１６に挿入した［Ｓｉｋｏｒｓｋｉら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１ ２２：１９−２７、１９８９］)。 この連結後、得られたプラスミドをＥｃｏＲＩで消化し、５’から３’にｍＴ Ｒおよび２つのＭＳ２ ＤＮＡ配列を含有するほぼ７００塩基対（ｂｐ）断片を 標準的なアガロースゲル精製 方法によって単離した。次いで、この７００ｂｐ断片を、ＥｃｏＲＩで予め消化 してあったプラスミドｐＩＩＩＥｘ４２６（ＳｅｎＧｕｐｔａら、前掲）に挿入 した。該プラスミドをｐＩＩＩ−ｍＴＲと命名した。 また、第２のプラスミドを以下のごとくに調製した。出発プラスミドはｐＡＣ ＴＩＩであった(Ｌｅｇｒａｉｎら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２２：３ ２４１−３２４２［１９９４］)。ｐＡＣＴＩＩをまず酵素ＢａｍＨＩで消化し 、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼを用いて末端を平滑とした。プラスミドｐＣＲ３Ｍ ｙｃＴａｑ３（前記参照）のＳｓｐＩ／ＸｂａＩは標準的なゲル精製方法を用い て単離し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑末端化した。約２７３９ｂｐ であったこの断片は５’末端のベクター配列の１２６ｂｐ（４２アミノ酸）およ びｍＴＲＩＰ１の最初の８７１アミノ酸を含有した。該断片をＢａｍＨＩ消化の ｐＡＣＴＩＩに挿入し、得られたプラスミドをｐＡＣＴＩＩ／ＭＴＲＩＰ１−Ｓ ／Ｘと呼んだ。 プラスミドｐＡＣＴＩＩ／ＭＴＲＰ１１−Ｓ／ＸおよびｐＩＩＩ−ｍＴＲを、 標準的酵母培地中で培養してあった酵母細胞（株Ｌ４０−コート；ＳｅｎＧｕｐ ｔａら、前掲）に導入した （ＹＥＰＤ；Ｓｈｅｒｍａｎら、Ｍｅｔｈ．Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔ．、Ｃｏｌ ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌ ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ［１９８３］）。プラスミドの（形質転 換ともいう）導入は、Ｃｈｅｎら（Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．、２１：８３−８４ ［１９９２］）によって記載されているもののごとき標準的方法を用いて達成し た。共形質転換体（すなわち、両プラスミドが導入された酵母細胞）は、約３０ ℃で２日間、ロイシンおよびウラシルを欠く（ＳＤ−ｕｒａ−ｌｅｕ；Ｓｈｅｒ ｍａｎら、前掲）酵母寒天プレート上de細胞を培養することによって選択した。 これらのプレート上で増殖した細胞の８つの別のランダムに選択されたコロニー を新鮮なＳＤ−ｕｒａ−ｌｅｕプレート上に再パッチし、前記したごとくにイン キュベートした。各コロニーの小さな部分をウラシル、ロイシン、ヒスチジンを 欠き、５−２０ｍＭの３−アミノトリアゾール（Ｓｉｇｍａ、ＳＴ．Ｌｏｕｉｓ 、ＭＯ）を含有する酵母寒天プレート上で平板培養し、該プレートを約３０℃で ３日間インキュベートし、しかる時点の後、増殖したコロニーの（８つの合計数 のうちの）数を評価した。 結果を以下の表ＩＩに示す。 表ＩＩでは、「ＲＮＡ」と表示した欄はテストしたＭＳ２タグ付きＲＮＡ分子 をいう。ｍＴＲは野生型マウス・テロメラーゼＲＮＡである；ｍＴＲ−１はｍＴ Ｒの置換突然変異体であり、（転写開始部位に対して：Ｂｌａｓｃｏら、前掲参 照）１４２位のＣの代わりにＴ、２０２位のＧの代わりにＣ、および２２７位の Ｇの代わりにＡを含有し；ｍＴＲ−３は２７２位のＧの代わりにＡを含有し、や はりｍＴＲの挿入突然変異体であり、こ こで、２つのヌクレオチドＡおよびＧがｍＴＲ転写体のヌクレオチド２６８位の 後に挿入されており（Ｂｌａｓｃｏら、前掲）；ｍＴＲ−２７は３３位のＧの代 わりにＡを含有するｍＴＲの置換突然変異体であり；Ｕ２、Ｕ４およびＵ６はｓ ｎＲＮＡであり（Ａｒｅｓ、Ｃｅｌｌ、４７：４４−５９［１９８６］；Ｔｏｌ ｌｅｖｅｙら、Ｃｅｌｌ、３５：７５３−７６２[１９８３]；Ｂｒｏｗら、Ｎａ ｔｕｒｅ、３３４：２１３−２１８［１９８８］)；ＴＬＣ１は酵母テロメラー ゼＲＮＡ遺伝子であり（Ｓｉｎｇｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６６：４０４−４ ０９［１９９４］）；α−ｍＴＲはＭＳ２ヘアピンに対してアンチセンス方向に クローン化されたｍＴＲ配列であり；ＩＲＥはラット鉄調節要素ＲＮＡであり（ Ｆｉｅｌｄｓら、前掲）；およびＭＳ２はさらなる結合したＲＮＡなしのＭＳヘ アピンをいう。 「蛋白質」と表示された欄は、３つのハイブリッドアッセイにおけるＲＮＡ− 蛋白質相互作用を評価するためにテストＲＮＡ分子と共導入された蛋白質をいう 。「ｍＴＲＩＰ１」はｍＴＲＩＰ１遺伝子のアミノ末端断片であって、蛋白質の アミノ末端８７１アミノ酸よりなり；ＩＲＰは鉄調節要素結合蛋白質（ＳｅｎＧ ｕｐｔａら、前掲）。 「相互作用」と表示された欄は、酵母寒天プレート上の３−アミノトリアゾー ルの濃度（５、１０または２０ｍＭ）をいう。 ３日後に検出可能な増殖を示した合計８つのうちのコロニーの数が各ＲＮＡ／ 蛋白質対につき示される。マウス・テロメラーゼＲＮＡは、野生型または突然変 異体を問わず、ｍＴＲＩＰ１と特異的に相互作用する。ＩＲＥを例外として、他 のＲＮＡ分子Ｕ２、Ｕ４、Ｕ６、ＴＬＣ１およびα−ｍＴＲはｍＴＲＩＰ１と相 互作用しなかった。３−アミノトリアゾールの低濃度にて、ＭＳ２は単独でｍＴ ＲＩＰ１と幾分相互作用した。ＩＲＥと相互作用し（従って、陽性対照として使 用される）ことが知られているＩＲＰはｍＴＲ−１と相互作用しないことを証明 することによって、ｍＴＲの結合の特異性をさらに確認した。 ５．ヒトＴＰ２遺伝子のクローニング ヒトＴＰ２遺伝子をクローニングするための戦術はヒトＴＲＩＰ１遺伝子をク ローニングするためのそれと同様であった。ヒトＴＰ２ ｃＤＮＡは、ヒト結胞 腫瘍細胞系ＬＩＭ１８６３からのＲＮＡを用いて構築したｃＤＮＡライブラリー をスクリーニングすることによって同定した（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄら、 Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、４７：２７０４−２７１３［１９８７］）。全ＲＮＡ を単離し、ポリ（Ａ＋）ｍＲＮＡ画分は製造業者の推奨する手法に従ってＦａｓ ｔＴｒａｃ ｍＲＮＡ単離キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ 、ＣＡ）を用いて得た。 内部ＮｏｔＩ制限部位を含有するランダムｃＤＮＡプライマーを用いて、第１ 鎖合成を開始した。このプライマーは配列番号：５および配列番号：６につき前 記した二本鎖配列を有していた。第１鎖ｃＤＮＡ合成反応は、約１μｇのｍＲＮ Ａおよび１５０ｎｇのＮｏｔＩランダムプライマー（すなわち、配列番号：５お よび６）を用いて組み立てた。次いで、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔプラスミド系（ Ｇｉｂｃｏ ＢＲＩ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を用いて、ランダム起 点ｃＤＮＡライブラリーを第１鎖ｃＤＮＡ物質から調製した。 第２鎖合成の後、反応生成物をフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコ ール混合液で抽出し、エタノール沈殿させた。二本鎖（ｄｓ）ｃＤＮＡ産物を配 列番号：７および配列番号：８につき前記した配列を持つ二本鎖オリゴヌクレオ チドアダプターに連結した。 連結後、該ｃＤＮＡをＮｏｔＩで完全消化し、フェノール：クロロホルム：イ ソアミルアルコール（２５：２４：１）で抽出し、エタノール沈殿した。次いで 、再懸濁させたｃＤＮＡを、製造業者によって推奨されたごとく、既製カラムＳ ｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔプラスミド系（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を用いるゲル濾過に よってサイズ分画した。最大のｃＤＮＡ産物を含有する画分をエタノール沈殿さ せ、次いで、ＮｏｔＩおよびＳａｌＩ消化のｐＳＰＯＲＴベクター（Ｇｉｂｃｏ ／ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）に向きを定めて連結した。連結し たｃＤＮＡをエレクトロポレーションによって、エレクトロコンピテントＸＬ１ −Ｂｌｕｅ Ｅ．Ｃｏｌｉ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ）。 ９６の１５ｃｍのペトリ皿上のプレート当たり約１０，０００クローンの密度 にて、全ラリブラリーを平板培養することによって該ｃＤＮＡラリブラリーを分 注した。インキュベーションの後、各プレートを掻き取り、得られたプールした 細菌をグリセロールストックとして調製した。標準的なアルカリ溶解手法を用い て、プラスミドＤＮＡを各ストックから調製し、次いで、各ストックＤＮＡをＰ ＣＲ用の鋳型として用いて、ＴＰ２ ｃ ＤＮＡ配列を含有するそれらのストックを同定した。ＰＣＲ反応物はほぼ２５ピ コモルのプライマー、５０−２２０ｎｇの鋳型（両者はＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ ＰＣＲ反応緩衝液中）を含有するものであり、次いで、それに約２５μｌの容量 にて約１．２５ＵのＴＡＱポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を添加した。 ＰＣＲ条件は３０サイクルの２０秒間の９４℃；１０秒間の５０℃、および３０ 秒間の７２℃であった。ＰＣＲで使用するプライマーは以下のものであった。 試料はアガロースゲル電気泳動によって分析した。３つのストックは約３８０ ヌクレオチドの予想されたサイズに対応するゲル上のＰＣＲバンドを有していた 。これらのストックは以下のさらなる分析用に選択した。 ３つの陽性プールのグリセロール細菌ストックを、寒天プレートを被覆するＭ ａｇｎａｌｉｆｔブランドのナイロン膜（Ｍｉｃｒｏｎ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｓ，Ｗｅｓｔｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＡ）上に直接に平板培養し、３０℃で数時間増 殖させ、０．５Ｍ ＮａＯＨおよび１．５Ｍ ＮａＣｌ中で７分間で溶 解させた。次いで、該膜を１Ｍ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０中で中和し、次い で真空オーブン中で、約８０℃で少なくとも２時間加熱した。次いで、該膜を、 ０．１Ｍ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｅ ＤＴＡ、０．２パーセントＳＤＳ、および約５０Ａｔｇ／ｍｌのプロテイナーゼ Ｋ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）の溶液中でインキュベートすることによって、プロ テインキナーゼＫ溶解に付した。 膜のハイブリダイゼーションは、製造業者のプロトコルに従い、Ｒａｐｉｄ Ｈｙｂ緩衝液（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ ）を用いて約６０℃にて約２時間行った。このハイブリダイゼーション用のプロ ーブは、前記ＰＣＲで用いるプライマーよりなるものであった（すなわち、配列 番号：１５および１６）。合計約１７０ｎｇのプローブ混合物をハイブリダイゼ ーションに先立って以下のごとく放射標識した：約１７０ｎｇのプローブを、製 造業者によって推奨されている緩衝液を用い、約２００μＣｉの３２−Ｐ標識Ａ ＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ）および 約２０Ｕのポリヌクレオチドキナーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｈｅｉｍ 、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌ ｉｓ、ＩＮ）を含有する溶液中で、約３７℃で約１時間インキュベートした。放 射標識したオリゴヌクレオチドを、製造業者のプロトコルに従い、Ｇ２５ Ｑｕ ｉｃｋｓｐｉｎカラム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｈｅｉｍ）を通す遠心に よって非組込ヌクレオチドから分離した。このスクリーニングの結果、スクリー ニングした３つのプールのうち１つの陽性クローンを生じた。＃３２と呼ばれる このクローンを標準的な方法を用いて配列決定し、サイズが約２８５９塩基対で あることが判明し、これは５’および３’末端双方を欠くと考えられた。Ｌｉｎ ｇｎｅｒらによって報告されているテロメラーゼ・ポリヌクレオチドに対するい くつかの核酸相同性に基づき（Ｓｃｉｅｎｃｅ、［１９９７］、前掲）、クロー ン＃３２は第２のヒト・テロメラーゼ・サブユニットであるらしいと判断された 。「テロメラーゼ蛋白質２」または「ＴＰ２」の部分配列と言われるクローン３ ２の核酸配列は図５に示し（配列番号：１３）、翻訳されたアミノ酸配列は図６ に示す（配列番号：１４）。７つの逆転写酵素モチーフ（Ｘｉｏｎｇら、前掲に よって記載された逆転写酵素についての情報に基づく）がＴＰ２に存在し、これ はこの蛋白質が逆転写酵素活性を含有することを示唆する。これら のモチーフはヌクレオチド１９２０−２８２０の領域に存在する。 ＴＰ２に見いだされた逆転写酵素モチーフに加えて、この蛋白質の他の重要な 領域はアミノ酸配列ＦＦＹＶＴＥ（配列番号：１７）、ＲＦＩＰＫ（配列番号： ４２）、ＧＩＰＱＧＳ（配列番号：４３）およびＬＬＬＲＬＶＤＤＦＬＬ（配列 番号：４４）を含む。 ＴＰ２遺伝子の３’末端を同定するには、クローン３２の３’末端近くの領域 に対応するオリゴヌクレオチドを調製した。このオリゴヌクレオチドの配列は以 下のものであった。 このオリゴヌクレオチドは、ｐＳＰＯＲＴベクターのＳＰ６ウイルスＲＮＡ転写 開始部位にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドと組み合わせてＰＣＲに用い た。以下の条件：約１５秒間の９４℃；約１５秒間の６２℃；および約３０秒間 の７２℃の下で、ＰＣＲの３３サイクルをライブラリーの全てのプールで行った 。ＰＣＲ産物はアガロースゲル電気泳動によって評価し、約７つの陽性体を得た 。これらのクローンのさらなる分析は、それらがＴＰ２ ｃＤＮＡではなかった ことを示した。従 って、第２のスクリーニングアプローチを使用した。 クローン＃３２を制限エンドヌクレアーゼＭｌｕＩで消化して２つの断片（小 さい５’断片、および大きい３’断片）を得た。このより大きな断片をＸｈｏＩ で消化して５’および３’断片を得た。約８３０塩基対であった該３’断片をプ ローブとして用いて、ｃＤＮＡライブラリーの全てのプールをスクリーニングし た。標準的なランダムプライマー標識技術を用いて、該プローブを標識した。該 ライブラリーは前記したごとくにスクリーニングするために調製し、Ｒａｐｉｄ Ｈｙｂ緩衝液（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ、Ｉ Ｌ）中、約６０℃にて約２時間、フィルターをプローブとハイブリダイズさせ、 その後、フィルターをストリンジェント条件下で洗浄した。７つの陽性体が同定 され、これらを、プライマー配列番号：１７およびＳＰ６プライマーを用い、Ｐ ＣＲ分析に付した。ＰＣＲ条件はこれらのプライマーにつき前記した。ＰＣＲ産 物をアガロースゲル電気泳動によって評価すると、３つの陽性体が同定されたが 、配列決定の際に、陽性体のいずれもクローン３２と比較してさらなるＴＰ２配 列を含有しなかった。 前記したのと同一条件下で、同一プローブ（８３０塩基対ＸｈｏＩ断片）を用 いてｃＤＮＡライブラリーを再スクリーニングした。約８つの陽性体が得られ、 これらの陽性体を再度平板培養して８つのプールの各々から単一のクローンを単 離した。平板培養後、細胞を増殖させ、プラスミドＤＮＡを標準的なミニプレッ プ手法を用いて単離した。該プラスミドＤＮＡクローンのうち４つを配列決定し た。１つのクローン、ＴＰ２−１５はサイズが約１．１ｋｂであり、その１３３ 塩基はクローン＃３２の３’末端と重複した。残存する９４９塩基は３’末端で 新しいＴＰ２配列を含み、また停止コドンも含有していた。これらのさらなる９ ４９塩基のＤＮＡ配列を図７に記載する。クローン３２＋ＴＰ２−１５の９４９ 塩基を含む全長ＴＰ２遺伝子を図８に記載し、全長ＴＰ２の推定アミノ酸配列は 図９に示す。 ８６８位（ＤからＡ；「５−１」突然変異という）；８６９位（ＤからＡ、「 ５−２」突然変異という）；および８６８および８６９（両方、ＤからＡ「５− １，２」突然変異という）における全長ＴＰ２の逆転写酵素ドメインで単一また は二重点突然変異を行った。これらの点突然変異は以下のごとくに調製 した。 まず、５’から３’に、ＨｉｎｄＩＩＩについての制限酵素配列、ＡＴＧ開始 コドン、ＦＬＡＧペプチド配列をコードするＤＮＡ配列、およびＥｃｏＲＩにつ いての制限酵素配列を（センス配列につき）含有するセンスおよびアンチセンス 両オリゴヌクレオチドを合成することによって、マーカー配列ＦＬＡＧ（ＤＹＫ ＤＤＤＤＫ；配列番号：２２）を含有するＴＰ２構築体を調製した。該センスオ リゴヌクレオチドは配列： を有する。 該アンチセンスオリゴヌクレオチドは配列： を有する。 ２つのオリゴヌクレオチドを一緒に９５℃で加熱し、次いで室温までゆっくり と冷却することによってアニーリングした。得られた二本鎖オリゴヌクレオチド をｐＣＲ３ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃ Ａ）のＨ ｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ部位に挿入した。 制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩを用いて、ＴＰ２クローン３２をｐＳＰＯ ＲＴベクターから切り出し、得られた断片をｐＣＲ３ ＦＬＡＧベクターの同一 部位に挿入した。ＴＰ２の３’末端を含有するクローン１５（前記実施例５参照 ）を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで消化し、ｐＣＲ ＦＬＡＧ／クローン ３２ベクターの同一部位に挿入し、ＦＬＡＧペプチドがＴＰ２蛋白質のアミノ末 端に位置する全長ヒトＴＰ２蛋白質を発現するベクターを得た。 図１０に概説したＰＣＲ突然変異誘発戦略を用い、野生型および突然変異体Ｔ Ｐ２蛋白質を次に生成させた。６つの個々のＰＣＲ反応を行って、「一次ＰＣＲ 産物」という一連の小さな断片が得られ、これを引き続いて増幅させて最終構築 体を得た。まず、２つのＰＣＲプライマーの６つのセットを用いて、６つのＰＣ Ｒ反応を行って、ＴＰ２の特定の領域を増幅し、所望の点突然変異を組み込んだ 。６つのプライマー対の各々によって増幅されたＴＰ２の領域を図１０に示し、 反応１−６と表示する。 ＰＣＲ反応は以下のプライマーセットを用いて行った。反応 ２、４および６については、５’プライマーは： であり、３’プライマーは、各々、 であった。 反応１、３および５については、３’プライマーは： このプライマーはＦＬＡＧペプチドをコードする配列と共にＴＰ２の３’配列 、続いてＸｂａＩ制限部位を含むものであった。 反応１、３および５についての５’プライマーは、各々： であった。 反応１−６で使用した鋳型はｐＣＲ３ ＦＬＡＧ ＴＰ２で あった。各反応は、製造業者の指示に従って、ＰＦＵポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔ ａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を用いて行った。３０サイクルを各反応 につき行い、各サイクルは１５秒間の９６℃、１５秒間の６２℃および、次いで 、２分間の７２℃よりなるものであった。ＰＣＲ産物はアガロースゲルから抽出 した。 全長突然変異体ＴＰ２ ｃＤＮＡ分子を生成させるために使用する最終突然変 異構築体を調製するには、（５．１突然変異を含有する）ＰＣＲ産物１および２ をＰＣＲ反応７で鋳型として使用し、ここで、該反応用の５’プライマーは配列 番号：２５であって、該反応用の３’プライマーは配列番号：２９であった。Ｐ ＣＲについての条件は、７２℃工程を４分間行った以外は上記したのと同一であ った。同一戦略を使用して反応８において突然変異構築体を生成させ、ここで、 (５．２突然変異を含有する)ＰＣＲ産物３および４を鋳型として用い、配列番号 ：２５が該反応用の５’プライマーであって、配列番号：２９が該反応用の３’ プライマーであった。同様に、（５．１および５．２二重突然変異を含有する） ＰＣＲ産物５および６をＰＣＲ反応番号９で鋳型として用い、ここで、配列番号 ：２５を５’ プライマーとして用い、配列番号：２９を３’プライマーとして用いた。 得られた最終の４つのＰＣＲ産物（図１０中、反応７、８および９、野生型Ｐ ＣＲ断片と一緒）を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで消化し、断片を、酵素 ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで予め切断したｐＣＲ３ ＦＬＡＧ３２ベクターの部 位にクローン化した。この結果、３’末端にＦＬＡＧタグを含有する４つのＴＰ ２発現ベクターが生成した。これらのベクターは、Ｄ８６８および／またはＤ８ ６９の位置における特定の突然変異した残基を除いて同一のインサートを有した 。製造業者の指示に従い、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓシーケンサー を用い、各ベクターのコーディング領域を配列決定した。 ６．ＴＰ２抗体調製 抗−ＴＰ２ウサギポリクローナル抗血清は以下のＴＰ２ペプチド： をウサギに注射することによって調製した。このペプチドは本明細書では「ＴＰ ２ペプチド」ともいう。注射に先立って、該 ペプチドを不活化蛋白質ＫＬＨにカップリングさせ、精製し、ウサギに注射した 。約１カ月後、注射を反復した。２週間後、ウサギから採血し、予めＴＰ２ Ｄ ＮＡでトランスフェクトした細胞からの細胞溶解物のウェスタンブロット分析に よって抗−ＴＰ２抗体につき分析した。抗体産生の確認に際して、標準的な手法 を用い、ウサギによって産生された抗血清を収集し、Ａｆｆｉｇｅｌ^TMビーズ（ Ｂｉｏｒａｄ Ｃｏｒｐ．、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）に共有結合したＴＰ２ペ プチドよりなるアフィニティーカラムにそれを通すことによってアフィニティー 精製した。低ｐＨ緩衝液を用いて抗体をカラムから溶出させた。 免疫沈降実験のための調製において、各免疫沈降反応については、約５μｇの アフィニティー精製抗血清が１０μＬのプロテインＧ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビー ズ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓｅ、ＭＯ）に結 合した。 ７．ＴＰ２の生物学的活性 ＴＰ２とテロメラーゼ活性との会合を評価するために、３種の哺乳動物細胞系 、ＨｅＬａ細胞、トランスフェクトしたマウス神経芽細胞腫Ｎ２Ａ細胞、および トランスフェクトしたヒト胚腎臓２９３細胞を評価した。 Ａ．ＨｅＬａ細胞におけるＴＰ２の検出 ＨｅＬａ細胞（Ｚｈｏｕら、Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．、６：１９６ ４−１９７４［１９９２］）を標準ダルベッコの修飾イーグル培地中で培養し、 サブコンフルエントになるまで増殖させ、その後にＰｒｏｗｓｅら（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ、９０：１４９３−１４９７［１９９３ ］）に記載されているごとくに細胞溶解物を調製した。略言すれば、細胞をペレ ット化し、洗浄し、Ｄｏｕｎｃｅホモゲナイザーを用いて低張緩衝液中で溶解さ せた。細胞抽出物を約１００，０００×ｇで約１時間遠心し、「Ｓ１００」とい う上清を取り出し、マイナス８０℃でアリコートにて凍結した。 ２つのアッセイを用いて、テロメラーゼ活性におけるＴＰ２の役割を評価した ：これらは（１）テロメラーゼ・バイオアッセイ（Ｋｉｍら、前掲［１９９４］ ）、および（２）免疫沈降アッセイを含むものであった。 ＴＰ２がテロメラーゼ活性で必須であるか否かを評価するために、ＨｅＬａ細 胞溶解物をアリコートに分割し、いくつかのアリコートをテロメラーゼ活性アッ セイを行うのに先立って 種々の抗体と共にインキュベートした。ポリクローナルＴＰ２または対照抗体（ その全てを、約１０μｌのプロテインＧに対する約５μｇの抗体の割合でプロテ インＧ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズに予め結合させた）を約４℃にて約１時間、 約１ｍｇのＨｅＬａ細胞溶解物と共にインキュベートした。 いくつかの場合において、以下に示すように、抗体をまずペプチド（ＴＰ２特 異的または非特異的）と共にインキュベートした。Ｐ１およびＰ３という非特異 的ペプチドはＴＲＩＰ１アミノ酸配列に由来した。 該Ｐ１列は： であり、該Ｐ３配列は： であった。 特異的（ＴＰ２）ペプチドはＴＰ２抗血清の調製につき前記したものである。 ペプチド−抗体インキュベーションは室温にて約３０分間のものであり、その後 、ＨｅＬａ細胞溶解物インキュベーションは直前に記載したごとくに行った。種 々の細胞溶解物アリコートに添加した抗体は以下のものであった： １）抗体添加無し ２）対照抗体(抗−Ｍｙｃ；Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃ Ａ） ３）対照抗体（抗−ＧＳＴ；Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｉｎｃ．、Ｌａｋｅ Ｐｌａｃｉｄ、ＮＹ） ４）抗ＴＰ２ペプチド抗血清 ５）予め約３０μｇの非特異的ペプチドと共にインキュベートした抗ＴＰ２ペ プチド抗血清 ６）予め約６０μｇ非特異的ペプチドと共にインキュベートした抗−ＴＰ２ペ プチド抗血清 ７）予め約３０μｇのＴＰ２−特異的ペプチドと共にインキュベートした抗− ＴＰ２ペプチド抗血清 ８）予め約６０μｇのＴＰ２−特異的ペプチドと共にインキュベートした抗− ＴＰ２ペプチド抗血清 インキュベーション後、細胞溶解物を遠心してＳｅｐｈａｒｏｓｅビーズをペ レット化した（抗体および免疫沈降物を含有）。免疫沈降物を、０．１Ｍ Ｎａ Ｃｌを含有する低張緩衝液で洗浄し（Ｐｒｏｗｓｅら、前掲）、次いで、両上清 （ほぼ５μｇの合計蛋白質）および免疫沈降物（約２μＬのプロテイ ンＧビーズ）を、Ｋｉｍら、前掲によって記載されている方法を用い、テロメラ ーゼ活性につきテストした。略言すれば、この方法は、３２Ｐ標識および未標識 デオキシヌクレオチドおよび適当な緩衝液条件の存在下で、ＴＳオリゴヌクレオ チドという基質オリゴヌクレオチドと共にテロメラーゼ抽出物または免疫沈降物 のアリコートをインキュベートすることを含む。テロメラーゼによるＴＳオリゴ ヌクレオチドの伸長に続き（テロメラーゼは該抽出物または免疫沈降物中で活性 であると仮定）、Ｔａｑポリメラーゼおよびテロメリック反復の増幅用のオリゴ ヌクレオチド（「ＣＸ」という）を添加し、ＰＣＲ増幅を行う。次いで、生成物 は非変性アクリルアミドゲル上の生成物の電気泳動によって分解した。電気泳動 の後、該ゲルを乾燥し、フォトイメージャーを用いて可視化する。 テロメラーゼアッセイに先立って、免疫沈降物または細胞抽出物のいくつかを 全体を通じて「ＲＮａｓｅ」というリボヌクレアーゼＡの存在下でインキュベー トした。ＲＮａｓｅを使用する場合、約１μｇのＲＮａｓｅ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈ ｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓｅ、ＭＯ）を約５μｇのＨｅＬａ細胞 溶解物または約２−３μｌのプロテインＧ免疫沈降 物のいずれかと共にインキュベートした。インキュベーションは室温で約５分間 行った。 免疫沈降物がＴＰ２を含有するか否かを判断するために、ウェスタンブロット 分析を以下のごとくに各免疫沈降物のアリコートで行った。活性アッセイ後の各 アリコートに残存する免疫沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、次いで、ＰＶＤＦ 膜に移した。ウェスタンブロットでのＴＰ２の検出では、該ブロットをまず室温 にて約１時間、ＴＢＳＴ緩衝液（０．５パーセントＴｗｅｅｎ−２０および５パ ーセント乾燥乳中のトリス−緩衝化生理食塩水）中でインキュベートし、次いで 、０．２μｇ／ｍｌの抗−ＴＰ２抗体と共に、続いてホースラディッシュペルオ キシダーゼ結合二次抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈ ｔｓ、ＩＬ）と共にインキュベートした。該ブロットをＥＣＬキットを用いて可 視化した（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＴＬ）。 テロメラーゼ活性アッセイおよびウェスタンブロット分析の結果を図１１Ａ− Ｃに示す。図１１Ａは細胞溶解物（レーン１−２）および免疫沈降後における上 清（レーン３−９）についてのテロメラーゼ活性アッセイの結果を示す１２パー セントの アクリルアミドゲルである。レーン１は抗体の添加が無いおよび免疫沈降無しの 対照ＨｅＬａ細胞溶解物を表す。レーン２は、ＲＮａｓｅをテロメラーゼアッセ イに先立って添加した以外はレーン１同一である。レーン３および４は、テロメ ラーゼ活性アッセイおよび免疫沈降に先立って抗−Ｍｙｃ抗体（レーン３）また は抗−ＧＳＴ抗体（レーン４）と共に予備インキュベートした細胞溶解物の上清 を表す。レーン５は、抗−ＴＰ２抗体と共に予備インキュベートし、次いで免疫 沈降させた細胞溶解物の上清を表す。レーン６および７は３０μｇ（レーン６） または６０μｇ（レーン７）の非特異的ペプチド３の存在下で抗−ＴＰ２抗体と 共に予備インキュベートした細胞溶解物の上清を表す。レーン８および９は、抗 −ＴＰ２抗体を認識するＴＰ２ペプチドの３０μｇ（レーン８）または６０μｇ （レーン９）の存在下で抗−Ｔｐ２抗体と共に予備インキュベートした細胞溶解 物の上清を表す。この図で分かるように、テロメラーゼ活性はレーン２を除いて 全てのレーンで存在した。 図１１ＢはＨｅＬａ細胞溶解物の免疫沈降物からのテロメラーゼ活性の１２パ ーセント非変性ゲルである。テロメラーゼ活性につき免疫沈降物をテストするの に先立って、各免疫沈降物 を２つのアリコートに分割し、ＲＮａｓｅをＲＮａｓｅインキュベーションにつ き前記した条件下で１つのアリコートに添加した。各レーンの頂部の記号「＋」 および「−」はテロメラーゼアッセイに先立ってのＲＮａｓｅ処理の存在（プラ ス）または不存在（マイナス）を指す。レーン１および２は、対照（非特異的） 抗−Ｍｙｃ抗体での免疫沈降物におけるテロメラーゼ活性を示し；レーン３およ び４は第２の対照抗体（抗−ＧＳＴ）を示し；レーン５および６はＴＰ２特異的 抗体を示し；レーン７−１０は抗−ＴＰ２抗体での免疫沈降物におけるテロメラ ーゼ活性を示し、ここで、抗体は３０μｇの非特異的ペプチド３（レーン７およ び８）または６０μｇの非特異的ペプチド３（レーン９および１０）と共に予備 インキュベートした；レーン１１−１４は抗−ＴＰ２抗体での免疫沈降物におけ るテロメラーゼ活性を示し、ここで、抗体は３０μｇのＴＰ２ペプチド（レーン １１および１２）または６０μｇのＴＰ２ペプチド（レーン１３および１４）と 共に予備インキュベートした。ＲＮａｓｅが存在したアッセイはＲＮａｓｅ無く して行った対応するアッセイと比較して、低量のテロメラーゼ活性を有し、これ はテロメラーゼＲＮＡがテロメラーゼ活性につき必要な成分である ことを示唆する。さらに、ＴＰ２がＴＰ２抗体で沈殿したのではないアッセイ（ すなわち、レーン１−４および１１−１４）は低下した量のテロメラーゼ活性を 示し、これはＴＰ２がテロメラーゼ活性に関連することを示唆する。 図１１Ｃは、免疫沈降物のウェスタンブロットである。各レーンでの標識は図 １１Ａおよび１１Ｂについての標識と合致する。ウォスタンブロットを抗−ＴＰ ２抗血清でプローブして、免疫沈降物におけるＴＰ２の存在を検出した。レーン １および２は、非特異的抗体り抗−Ｍｙｃおよび抗−ＧＳＴがＴＰ２蛋白質を認 識せず（従って、免疫沈降しない）ことを示す；レーン３は抗−ＴＰ２抗血清が ＴＰ２蛋白質を認識しそれを免疫沈降させることを示す；レーン４および５は、 非特異的ペプチド（レーン３における３０μｇおよびレーン４における６０μｇ ）と共に予備インキュベートしたＴＰ２抗血清が依然としてＴＰ２蛋白質を認識 しそれを免疫沈降させることを示す；レーン６および７は、ＴＰ２特異的ペプチ ドと共に予備インキュベートしたＴＰ２抗血清が細胞溶解物中のＴＰ２蛋白質を 免疫沈降させることができないことを示す。 Ｂ．ＴＰ２の触媒活性 ヒト胚性腎臓２９３細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃ ｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）を、それらが５０−８０パーセント密集するまで１６０ｍ ｍプレート中で培養した。細胞をプラスミド無し（全体を通じて「ＭＯＣＫ」と いう）、野生型プラスミド（天然、全長ＴＰ２ ｃＤＮＡ（全体を通じて「ＷＴ 」という））、または野生型ＴＰ２ ｃＤＮＡの単一または二重点突然変異を含 有するプラスミドいずれかでトランスフェクトした。単一または二重点突然変異 を担うプラスミドを以下のようにいう：５−１（８６８Ｄないし８６８Ａ）；５ −２（８６９Ｄないし８６９Ａ）；５−１，２および（８６８Ｄないし８６８Ａ および８６９Ｄないし８６９Ａ）。 ＤＮＡ構築体を用いて、これらの細胞を前記したごとくに調製したＴＰ２でト ランスフェクトした。 トランスフェクションに約２４時間先立ち、約７×１０（５）細胞を、約１０ パーセント（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含有する約１５ｍｌのダルベッコの修飾イ ーグル培地中の各１００ｍｍ培養皿に接種した。 プラスミドトランスフェクションについては、細胞を、約６ｍｌのＯｐｔｉｍ ｅｍＩ低下血清培地（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、 Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）、約６０μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）および約２９μｇのＴＰ ２プラスミドＤＮＡ中でインキュベートした。約４時間後、培地を、約１０パー セント（ｖ／ｖ）の胎児ウシ血清を含有する新鮮なダルベッコの修飾イーグル培 地で置き換え、細胞を２４時間後に収穫した。細胞溶解物を実質的にはＫｉｍら 、前掲の方法に従って調製した。略言すれば、細胞をペレット化することによっ て収集し、細胞のペレットをＰＢＳ緩衝液中で洗浄し、ＣＨＡＰＳ洗剤緩衝液中 に再懸濁させた。氷上で約３０分後、混合物を約１４，０００×ｇで３０分間回 転させ、上清を収集し、−８０℃で保存した。 テロメラーゼ活性アッセイは１−５μｇの細胞溶解物蛋白質を用い、ＨｅＬａ 細胞につき前記したごとくに行った。次いで、約１００μｇの各２９３細胞溶解 物を抗−ＦＬＡＧ Ｍ２アフィニティーゲル（アガロースに共有結合したマウス ＩｇＧ１；Ｋｏｄａｋ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）と共にインキュベートした 。インキュベーションの後、試料を遠心して抗体複合体をペレット化し、低張緩 衝液（Ｐｒｏｗｅｓら、前掲）中で洗浄した。まず、免疫沈降物をＲＮａｓｅの 存在下でまたは不存 在下でインキュベートし、次いで、テロメラーゼ活性アッセイを前記したごとく に免疫沈降物につき行った。 テロメラーゼアッセイの結果と共に１２パーセントアクリルアミドゲルを図１ ２Ａに示す。この図のレーン６−１９における記号「＋」および「−」は、各々 、テロメラーゼアッセイに先立ってのＲＮａｓｅの存在または不存在を示す。こ の図では、「Ｍｏｃｋ」は、プラスミド無くしてトランスフェクトした細胞をい い：「ＷＴ」は野生型ＴＰ２をいい；突然変異体をそれらの調製についての前記 記載に従って標識する。レーン１−５は、示したＴＰ２遺伝子または対照プラス ミドでトランスフェクトした細胞からの溶解物を示し、これらのレーンはテロメ ラーゼ活性が全ての細胞溶解物に存在することを示す。 レーン６−１９は細胞溶解物のＴＰ２抗体免疫沈降物のテロメラーゼアッセイ である。ここで、ＲＮａｓｅ無しの野生型および抗−ＴＰ２抗体を非特異的ペプ チドと共に予備インキュベートしたＲＮａｓｅ無くしての野生型（各々、レーン ８および１２）のみが、合理的レベルのテロメラーゼ活性を有していた。突然変 異体ＴＰ２免疫沈降物につきテロメラーゼ活性はほとんど明らかでなかった（レ ーン１５１４−１９）。 免疫沈降物および溶解物を共にウェスタンブロット分析に付した。免疫沈降物 がＴＰ２を含有するか否かを判断するために、活性アッセイの後に各アリコート に残存する免疫沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、次いで、ＰＶＤＦ膜に移した 。ウェスタンブロットでのＴＰ２の検出については、ブロットをまず室温で１時 間、ＴＢＳＴ緩衝液（０．５パーセントのＴｗｅｅｎ−２０および５パーセント の乾燥乳中のトリス−緩衝化生理食塩水）中でインキュベートし、次いで、０． ２μｇ／ｍｌの抗−ＴＰ２抗体、続いてホースラディッシュペルオキシダーゼ結 合二次抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ） と共にインキュベートした。ＥＣＬキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ａｒｌｉｎｇｔ ｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）を用いて該ブロットを可視化した。 ウェスタンブロット分析の結果を図１２Ｂに示す。ＦＬＡＧ−ＴＰ２蛋白質の おおよその分子量は還元条件下で１３０ｋＤａである。ＦＬＡＧ−ＴＰ２蛋白質 は、ＭＯＣＫトランスフェクト細胞溶解物（レーン１）を除いて全ての溶解物（ レーン２−５）中で検出可能であり、これは２９３細胞が粗製細胞溶解物中で検 出可能なレベルの内因性ＴＰ２を有しないこと、およ び野生型および突然変異体ＴＰ２蛋白質が共に２９３細胞の細胞溶解物中で匹敵 するレベルで発現されることを示す。 レーン７および９におけるものを除いて免疫沈降物（図中に「抗−ＦＬＡＧペ レット」）の全ては、ウェスタンブロットのレーン６、８および１０−１３上の ほぼ１３０ｋＤａバンドによって示されるＦＬＡＧ−ＴＰ２蛋白質を含有した。 これは、ＴＰ２抗体が野生型および突然変異体ＴＰ２蛋白質を認識することを示 す。 抗−ＦＬＡＧ抗体を約１０μｇのＦＬＡＧペプチドと共に予備インキュベート したＭｏｃｋ（レーン７）および野生型ＴＰ２（レーン９）は検出可能なＴＰ２ 蛋白質を示さなかった。レーン９については、ＦＬＡＧペプチドの調製は標準的 ペプチド合成方法によるものであった；該ペプチドは配列番号：２２に記載した 配列を有する；このペプチドと一緒での抗血清のインキュベーションは免疫沈降 に先立っての室温における約３０分間であった。 Ｃ．ＴＲＩＰ１およびＴＰ２会合 ＴＲＩＰ１およびＴＰ２が活性なテロメラーゼ複合体において会合するか否か を判断するために、Ｍｙｃ−ＴＲＩＰ１、Ｆ ＬＡＧ−ＴＰ２、または双方をマウス神経芽細胞腫Ｎ２Ａ細胞（Ａｍｅｒｉｃａ ｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１２３０１ Ｐａｒｋ ｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）にトランスフェク トした。細胞を１００ｍｍプレート中のＤＭＥＭ＋１０パーセント胎児ウシ血清 中で密集近くまで増殖させ、次いで、製造業者の指示に従って、Ｓｕｐｅｒｆｅ ｃｔ試薬（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）を用い、約１０μｇの ＴＰ２ ＣＤＮＡ（ＭｙｃＴＲＩＰ１またはＦＬＡＧＴＰ２ ｃＤＮＡいずれか ）でトランスフェクトした。対照細胞は全くトランスフェクトしなかったか（図 １３Ａ中「Ｎ２Ａ溶解物」）、あるいはＴＲＩＰ１またはＴＰ２ ｃＤＮＡを含 有しないプラスミドでトランスフェクトした（図１３Ａ中、「Ｎ２Ａ Ｍｏｃｋ 」）。 トランスフェクションの約３６時間後、約３００μｇの全蛋白質と等量の細胞 溶解物の量を用い、ＨｅＬａ細胞について記載したごとくに細胞溶解物を調製し 、ＨｅＬａ細胞につき前記したごとくにテロメラーゼ活性アッセイを行った。抗 −ＦＬＡＧ免疫沈降物につき前記した条件下で、ＴＰ２のＦＬＡＧエピトープを 認識する抗−ＦＬＡＧ抗体を用い、全ての細胞溶解物 を免疫沈降させた。いくつかの場合、該抗体を(前記したごとくに)抗−ＦＬＡＧ ペプチドと共にまたはＭｙｃペプチド(「非特異的」ペプチドという)と共に予備 インキュベートした。次いで、ウェル当たり免疫沈降物の約１／３を用い、免疫 沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥに付した。電気泳動の後、該蛋白質をＩｍｍｏｂｉｌ ｏｎ Ｐ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）に移して、ウェスタ ンブロットを生成させ、該膜を、ＰＢＳ＋０．１パーセントＴｗｅｅｎ−２０（ 「ＰＢＳＴ」を作成するためのもの）、およびブロッキング剤として５パーセン ト無脂乾燥乳粉末（ｗ：ｖ）中でインキュベートした。次いで、該膜をＰＢＳＴ ＋５パーセントの乳粉末および１μｇ／ｍｌの抗−Ｍｙｃまたは抗−ＦＬＡＧ抗 体の溶液中でインキュベートした。インキュベーションは室温にて約２時間のも のであった。この工程に続き、次いで、該膜をＰＢＳＴ中で各時点で約１０分間 にて３回洗浄した。この工程に続き、該膜をＰＢＳＴ＋５パーセント乳粉末およ びホースラディッシュペルオキシダーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ａｒｌｉｎｇｔｏ ｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）に結合した抗−マウス抗体中でインキュベートした 。抗−マウス抗体を１：１０００希釈率で添加した。次いで、該膜 をＰＢＳＴ中で再度各１０分間にて３回洗浄し、抗−Ｍｙｃまたは抗−ＦＬＡＧ 抗体の存在を製造業者の指示に従ってＥＣＬ抗体検出キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ)を用いて検出した。 ウェスタンブロット分析の結果を図１３Ａに示す。この図において、各レーン の頂部の標識は、細胞−「Ｎ２Ａ Ｍｏｃｋ」（レーン１）のトランスフェクシ ョンはＴＲＩＰ１またはＴＰ２インサート無くしてのプラスミドをいい；「ＭＹ ＣＴＲＩＰ１」（レーン２）はＭＹＣ標識したＴＲＩＰ１遺伝子を含有するプラ スミドをいい；「ＦＬＡＧＴＰ２」（レーン３−５）はＦＬＡＧ標識を含有する 全長ＴＰ２をいい、ここでペプチド(レーン３)、特異的ペプチド（レーン４）ま たは非特異的ペプチド（レーン５）は免疫沈降に先立っては添加されておらず；「 ＭｙｃＴＲＩＰ１／ＦＬＡＧＴＰ２」（レーン６−８）は標識ＴＲＩＰ１および ＴＰ２遺伝子双方の共トランスフェクションをいい、ここでペプチド（レーン６ ）、特異的ペプチド（レーン７）または非特異的ペプチド（レーン８）は免疫沈 降に先立って抗血清に添加されていないことを示す。左側の表示「抗−ＦＬＡＧ 」および「抗−ＭＹＣ」はいずれの抗体を用いて各ウェ スタンブロットをプローブしたかを示し；右側の表示は分子量マーカーの位置を 示し、「ＴＰ２」はＴＰ２がそこへゲル／ブロット上を移動する位置を表し、「 ＴＲＩＰ１」はそこへＴＲＩＰ１がゲル／ブロットが移動する位置を表す。結果 はＴＲＩＰ１およびＴＰ２が相互作用することを示す。というのは、レーン６（ マイナスペプチド）およびレーン８（プラス非特異的ペプチド）が、抗−ＦＬＡ Ｇプローブドウェスタンブロット上のＴＰ２に対応するバンド、および抗−Ｍｙ ｃプローブドウェスタンブロット上のＴＲＩＰ１に対応するバンドを示す。従っ て、ＴＰ２に対する抗血清（抗−ＦＬＡＧ抗血清）がＴＰ２およびＴＲＩＰ１両 者を免疫沈降させ、テロメラーゼのこれらの２つの成分がＮ２Ａ細胞中で会合す るようであることを示す。 ウェスタンブロットに加えて、前記したアッセイを用いて各免疫沈降をテロメ ラーゼ活性についてのテスト、ここで免疫沈降をまず前記した条件下で「＋」で または「−」ＲＮａｓｅなくして処理した。 このアッセイの結果を図１３Ｂに示す。該レーンを前記したごとくに標識する 。分かるように、テロメラーゼ活性はＲＮａｓｅに暴露した試料では低下する。 加えて、レーン１−２は、 未トランスフェクトＮ２Ａ細胞溶解物が内因性テロメラーゼ活性を有することを 示す。 レーン３−１８は（組換えＴＰ２蛋白質のＦＬＡＧタグを認識する）抗−ＦＬ ＡＧ抗体を用いる免疫沈降である。レーン３−４は、ベクターでトランスフェク トした細胞の免疫沈降のみが比較的低いレベルのテロメラーゼ活性を有すること を示す。 レーン５−６は、ＭＹＣタグ付きＴＲＩＰ１でトランスフェクトした細胞の免 疫沈降がやはり比較的低レベルのテロメラーゼ活性を有することを示す。レーン ７−１２はＦＬＡＧタグ付きＴＰ２でトランスフェクトした細胞の免疫沈降であ る。 レーン７はレーン３および５と比較した増大したレベルのテロメラーゼ活性を 示し、これは組換えにより発現されたＴＰ２がテロメラーゼ活性に関連すること を示唆する。 レーン９−１０は、組換えにより発現されたＴＰ２に関連したテロメラーゼ活 性が、抗−ＦＬＡＧ抗体が特異的ＦＬＡＧペプチドと共に予備インキュベートし た場合に低下することを示し、これは抗−ＦＬＡＧ抗体がＦＬＡＧＴＰ２会合テ ロメラーゼ活性を特異的に免疫沈降させることをことを証明する。レーン１１− １２（ここで、抗−ＦＬＡＧ抗体は非特異的ペプチド で予備インキュベートした）はレーン９−１０についての対照レーンである。 レーン１３−１８はＴＲＩＰ１およびＴＰ２標識ＤＮＡでトランスフェクトし た細胞のＦＬＡＧＴＰ２抗体免疫沈降である。レーン１３はレーン３および５と 比較したテロメラーゼ活性の増大したレベルを示し、これは組換えにより発現し たＴＰ２がテロメラーゼ活性と関連し、この免疫沈降におけるＭｙｃＴＲＩＰ１ 蛋白質の存在がテロメラーゼ活性に影響しないことを示す。 レーン１５−１６は、組換えにより発現したＴＰ２に関連するテロメラーゼ活 性が、抗−ＦＬＡＧ抗体を特異的ＦＬＡＧペプチドで予備インキュベートした場 合に低下することを示す。レーン１７−１８（ここで、抗ＦＬＡＧ抗体は非特異 的ペプチドで予備インキュベートした）はレーン１５および１６についての対照 レーンである。 ８．テロメラーゼ活性のイン・ビトロ再構成 テロメラーゼＲＮＡと組み合わせた場合に、ＴＰ２が生物学的に活性であるか 否かを評価する手段として、これらの成分のイン・ビトロ再構成、続いてテロメ ラーゼ活性アッセイを行っ た。 イン・ビトロアッセイについては、ヒト・テロメラーゼＲＮＡが以下のごとく に得られた。全ヒトゲノムＤＮＡは標準的方法を用いてＨｅＬａ細胞から調製し た。ほぼ５２０塩基対のゲノムＤＮＡテロメラーゼＤＮＡ断片が以下のプライマ ーを用いるＰＣＲによってこのゲノムＤＮＡから得られた： 次いで、以下の条件：９４℃の３０秒間；５５℃の３０秒間、および７２℃の １．０分間下で、２ＵのＴａｑポリメラーゼおよび緩衝液（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅ ｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用い、ＰＣＲの３５ラウンドをほぼ５０μｌの反応容 量で行った。次いで、ＰＣＲ産物をアガロースゲルから精製し、このＤＮＡ断片 をＰＣＲ鋳型として使用して、各々がＴ７プロモーターを含有する２つのＤＮＡ 構築体を調製した。１つの構築体は転写反応においてセンス鎖ヒト・テロメラー ゼＲＮＡを生成するであろうＤＮＡを含有した。他の構築体は転写反応において アンチセンス鎖ヒト・テロメラーゼＲＮＡを生成するであろうＤＮＡを含有した 。両ＤＮＡ構築体を設計してほぼ４５０塩基対の 断片を得た。各ＰＣＲで使用したプライマーは以下のものであった： センスＲＮＡでは、 アンチセンスＲＮＡでは、 次いで、これらの構築体を用いて、ＤＮＡ構築体を鋳型として用いて、転写に よってテロメラーゼＲＮＡを調製した。約５−１５μｇの鋳型ＤＮＡ、４０ｍＭ のトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、６ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１０ｍＭ ＤＴＴ、１ｍ Ｍの各リボヌクレオチド、２ｍＭ精子、３５０ＵのＲＮＡ Ｇｕａｒｄ（Ｂｏｅ ｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、および５００ＵのＴ７ ＲＮＡポリメラ ーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を３７℃にて約２００μＬの 最終容量にて約１．５時間一緒にインキュベートした。インキュベーションの後 、試 料を１容量のフェノール：クロロホルム（１：１）で抽出し、クロロホルム、エ タノール沈殿させ、滅菌水中に再懸濁した。 転写反応の後、生成物を変性アクリルアミドゲル上で分離し、全長テロメラー ゼＲＮＡ（ほぼ４５０塩基対）をＵＶシャドウイングによって同定し、切り出し 、Ａｃｒｏｄｉｓｃ（Ｇｅｌｍａｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，Ｍ Ｉ）を用いて破砕したアクリルアミドスライスからのＲＮＡの溶出によって精製 した。 別途、標準的クローニングおよび連結方法を用い、全長ヒトＴＰ２ ｃＤＮＡ をベクターｐＣＲ３(Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ)に挿入し た（前記実施例５参照；使用した構築体は５’および３’末端にてＦＬＡＧタグ を有していた）。 ほぼ０．５μＬのＴＰ２ｐＣＲ３構築体を約５０μｇのイン・ビトロのウサギ 網状赤血球翻訳緩衝液（「ＴＮＴ」イン・ビトロ再構成キット；Ｐｒｏｍｅｇａ 、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）に入れた。次いで、この混合物を１０μＭアリコート に分け、ヒト・テロメラーゼＲＮＡを生成するのに使用する種々の量の各ＤＮＡ 構築体を添加した。（製造業者の指示に従って）１μ ＬのＴ７ポリメラーゼを添加することによって反応を開始させ、約３０℃で約１ ．５時間進行させた。各試料を氷上に置くことによって反応を停止させた。次い で、前記したテロメラーゼアッセイを用い、ほぼ１μＬの各試料をテロメラーゼ 活性につきアッセイした。ヒト・センスＲＮＡ以外の種々のＲＮＡをイン・ビト ロ翻訳用の対照として使用した。これらは、（前記したごとくに調製した；結果 は図１４のレーン１０−１３に示す）アンチセンス・ヒト・テロメラーゼＲＮＡ 、（Ｔ７プロモーター（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃ ２７５：９７ ３−９７７［１９９７］）が先行する全長マウス・テロメラーゼＲＮＡを含有す るベクターからの転写によって調製した；結果は図１４のレーン１８−２１に示 す）センス・マウス・テロメラーゼＲＮＡ、および転移ＲＮＡ（Ｓｉｇｍａ Ｃ ｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ；結果は図１４のレー ン１４−１７に示す）。 （前記実施例７に記載したごとくに調製した）Ｈｅｌａ細胞溶解物を、テロメ ラーゼアッセイ用の陽性対照として使用し、テロメラーゼアッセイ当たりに使用 した溶解物の量はほぼ５μｇの蛋白質であった。該ＨｅＬａ細胞溶解物をＲＮａ ｓｅの不 存在下（図１４；レーン１）または存在下（図１４；レーン２）でアッセイした 。陰性対照はＴＰ２ ＤＮＡ構築体を添加しない１μＬのＴＮＴ溶解物（図１４ ；レーン３）；１μＬのＴＰ２ ＤＮＡを含むがＲＮＡを添加しないＴＮＴ溶解 物（図１４；レーン４）；０．００１、０．００５、０．０１または０．１μｇ のヒト・テロメラーゼＲＮＡを含む１μＬのＴＮＴ溶解物(図１４のレーン２２− ２５)を含んだ。 実験的イン・ビトロ再構成試料は、その１μＬをテロメラーゼアッセイで使用 した、０．０１、０．０５、０．１または１μｇのセンス・ヒト・テロメラーゼ ＲＮＡ（図１４のレーン５−８）の存在下で約１０μＬのＴＮＴ反応混合物中に ＴＰ２ ＤＮＡ鋳型を含有した。図１４のレーン９は、テロメラーゼアッセイに 先立って約１μｇのＲＮａｓｅを添加した以外は、レーン８と同一の反応を示す 。 図１４で分かるように、ＲＮａｓｅを存在させなかった（レーン５−８）テロ メラーゼ・センスＲＮＡおよびＴＰ２蛋白質を共に含有する試料のみがテロメラ ーゼ活性を有した。 網状赤血球翻訳系においてテロメラーゼ活性をなくするＴＰ２突然変異体の能 力を、各イン・ビトロ翻訳反応で全長野生型 ＴＰ２、またはＴＰ２突然変異体５−１、５−２、または５−１，２（実施例５ に記載したごとくに調製）のうちの１つをコードするＤＮＡ構築体を用いる以外 は、直前に記載ものに対応する実験で評価した。陽性および陰性対照を前記した ごとくに使用した。結果を図１５に示す。レーン１−９は図１５についてと同一 であった。レーン１０−１３はＴＰ２突然変異体５−１を示す；レーン１４−１ ７はＴＰ２突然変異体５−２を示す；レーン１８−２１はＴＰ２突然変異体５− １．２を示す。レーン１０−２１には、該アッセイで存在したテロメラーゼＲＮ Ａまたは対照ＲＮＡの量を示す。 この一連のアッセイの結果は、野生型ＴＰ２およびセンス・テロメラーゼＲＮ Ａがテロメラーゼ活性で必要であることを示す（レーン５−８）。 ＴＰ２クローン３２（実施例５参照；このＴＰ２クローンは全長未満である） がイン・ビトロで触媒的テロメラーゼ活性を有するか否かを評価するために、実 質的には前記したごとくにＴＮＴキット（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗ Ｉ）を用いイン・ビトロ再構成アッセイを行った。再構成アッセイについては、 約５０μＬのＴＮＴ網状赤血球抽出物を約１μｇ のセンス鎖ヒト・テロメラーゼＲＮＡ、ｐＣＲ３ベクター中の１μｇの全長ＴＰ ２ ｃＤＮＡ、または１μｇのクローン３２ ＴＰ２ ｃＤＮＡいずれか（「短 ＴＰ２」；「ＴＰｓ」ともいう）および約１μＬのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼと 混合した。反応は約３０℃にて約１．５時間行い、試料を氷上に置くことによっ て停止させた。次いで、実施例７に記載したテロメラーゼアッセイを用い、約１ μＬの各試料をテロメラーゼ活性につきアッセイした。 テロメラーゼアッセイの結果を図１７Ａに示す。レーン１および２は１μｇの ＲＮａｓｅなくして（レーン１）またはそれと共に（レーン２）インキュベート したＨｅＬａ細胞溶解物(約５μｇの蛋白質)を示す。レーン３および４は全長Ｔ Ｐ２ヒト・テロメラーゼＲＮＡ（レーン３）および短いＴＰ２＋ヒト・テロメラ ーゼＲＮＡ（レーン４）の結果を示す。レーン５−８は、テロメラーゼＲＮＡの 不存在下（レーン５および６）、ＴＰ２の不存在下（レーン７）、またはＲＮＡ およびＴＰ２の不存在下（レーン８）で行った再構成およびテロメラーゼアッセ イの結果を示す。分かるように、全長ＴＰ２およびクローン３２ ＴＰ２（Ｔｐ ｓ）はテロメラーゼＲＮＡの存在下でテロメラーゼ アッセイで活性であった。 図１７Ｂに示したウェスタンブロットは、全長ＴＰ２ ｃＤＮＡまたはクロー ン３２ ＴＰ２ ｃＤＮＡ（ＴＰｓ）が存在する場合に、ＴＰ２蛋白質が網状混 合物で生成したことを示す。 テロメラーゼ活性に対するＴＲＩＰ１の効果は以下のごとくに評価した。ＴＮ Ｔ溶解物系を用いるイン・ビトロ再構成アッセイは、前記したごとくに全長ＴＰ ２ ｃＤＮＡ＋ヒト・テロメラーゼＲＮＡを用いて行った。別途、ＴＮＴ溶解物 系および全長ＴＲＩＰ１ ｃＤＮＡを用いるイン・ビトロ再構成アッセイは前記 したごとくに行った。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼの存在下で各アッセイのインキ ュベーションの後、約６μＬのＴＰ２含有抽出物を同一容量のＴＲＴＰ１抽出物 に添加し、混合物を氷上で約３０分間インキュベートした。対照として、約６μ ＬのＴＰ２抽出物を、テロメラーゼＲＮＡまたはＴＲＩＰ１もしくはＴＰ２ ｃ ＤＮＡを有しない抽出物に添加した。１または２μＬの各混合物、ならびにＴＰ ２のみ抽出物を、前記した方法を用いてテロメラーゼ活性につきアッセイした。 結果を図１８に示す。「ＤＮＡ無し」とは、テロメラーゼＲＮＡをコードする ＤＮＡ、またはＴＰ２もしくはＴＲＩＰ１を コードするＤＮＡをそれに添加しなかった網状抽出物をいう；「−ＴＰ１」とは 、テロメラーゼＲＮＡおよびＴＰ２蛋白質のみを含有する抽出物をいい；「＋Ｔ Ｐ１」とは、テロメラーゼＲＮＡ、ＴＲＩＰ１蛋白質、およびＴＰ２蛋白質を含 有する抽出物の混合物をいう。ＴＰ２、ＴＲＩＰ１、およびテロメラーゼＲＮＡ を含有する抽出物（レーン５および６）はＴＰ２およびテロメラーゼＲＮＡのみ を含む抽出物と比較して増強したテロメラーゼ活性を有した（レーン３および４ ）。 ９．ＴＰ２の優性−陰性アッセイ ４つのＴＰ２発現カセットの各々をベクターｐＣＲ３から切り出し、ｐＣＲ３ ／ＴＰ２ベクターをともにＫｐｎＩおよびＸｂａＩで消化し、当該ベクターの固 有のＮｏｔＩおよびＥｃｏＲＩ部位の間にＮｈｅＩ部位（ＫｐｎＩに適合）およ びＸｂａＩ部位を導入するように予め修飾したｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰベクターに 得られたＴＰ２ ｃＤＮＡを挿入することによって、ｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ発現 ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）に挿入した。テスト 遺伝子（この場合は、全長野生型または突然変異体ＴＰ２）の発現が当該ベクタ ーの発現カセットによって産生されたＧｒｅｅｎ Ｆｌｕ ｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ（「ＧＦＰ」）の量に直接的に関連するよう に、ｐＩＲＥＳ−ＥＧＥＰベクターを設計した。 ヒト肝性腎臓２９３細胞（実施例８Ｂ参照）を、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ 中の１００ｍｍプレート中で密集近くまで増殖させ、次いで、プレート当たり１ １μｇのＴＰ２／ｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰベクターでトランスフェクトし、ここに 該ベクター中のＴＰ２は野生型であるか、あるいは３つの突然変異体のうち１つ である。加えて、対照細胞を、ＴＰ２インサートを含有しないｐＩＲＥＳ−ＥＧ ＥＰベクターでトランスフェクトした。トランスフェクションは製造業者の指示 に従って、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ試薬（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，Ｃ Ａ）を用いて達成した。４８時間後、トランスフェクトした細胞を、トリプシン で５分間処理することによってプレートから取り出した。該細胞を、２パーセン トの胎児ウシ血清を補足したＰＢＳに再懸濁した。次ぎに、トランスフェクトし た細胞集団の各々を標準的蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）を用いて別 途に集めた。 ＦＡＣＳソーティングは各細胞で発現されたＧＦＰのレベル に従って、トランスフェクトした細胞の５集団の各々の分離を可能とした。低レ ベルのＧＦＰを発現した構築体を含有する各トランスフェクトした細胞を「低」 という集団にプールした。高レベルのＧＦＰの細胞を「高」という集団にプール した。加えて、トランスフェクトしたＤＮＡを含有しなかった集団を同定し、「 非」という。 次いで、１５，０００×Ｇでの遠心によって、５つのトランスフェクトしたベ クターからの細胞の１５集団の各々をペレット化し、１００μＬのテロメラーゼ 溶解緩衝液に溶解させた。 図１６Ａは１５の細胞集団の各々からの溶解物のウェスタンブロットを示す。 ウェスタンブロットは実施例７に記載したごとくに調製し、抗−ＦＬＡＧ抗体で プローブした（Ｋｏｄａｋ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）。レーン１−３は、各 々、５．１ＴＰ２突然変異体の「非」、「低」および「高」ＧＦＰ発現細胞集団 を示す。分かるように、ＧＦＰ（ＦＡＣＳ分析に基づいた、前記参照）の発現レ ベルおよびＴＰ２蛋白質の発現レベルの間に直接的関係がある。「非」（レーン １）は検出可能なＦＬＡＧ ５．１ ＴＰ２突然変異体蛋白質を有さず、他方、 「低」（レーン２）は低レベルのＦＬＡＧ ５．１ ＴＰ２突然変異 体蛋白質を示し、および「高」（レーン３）は高レベルのＦＬＡＧ ５．１ Ｔ Ｐ２突然変異体蛋白質を示す。レーン４−６は、ＦＬＡＧ ５．２ ＴＰ２突然 変異体蛋白質との同様の関係を示し、これらのレーンは、各々、「非」、「低」 および「高」溶解物を含有する。レーン７−９は、ＦＬＡＧ ５．１／５．２ ＴＰ２突然変異体蛋白質との同様の関係を示し、他方、レーン１０−１２は、Ｆ ＬＡＧ野生型ＴＰ２蛋白質との同様の関係を示す。レーン１３−１５はＴＰ２イ ンサートを含まないｐＩＲＥＳ−ＥＧＥＰでトランスフェクトした細胞は検出可 能なレベルのＴＰ２蛋白質を発現しない。 図１６Ｂは図１６Ａに記載した１５の細胞集団溶解物の各々についての関連テ ロメラーゼ活性を示す。レーン１−３は、ＴＰ２突然変異体蛋白質（図１６Ａ） およびテロメラーゼ活性の間の逆関係を示す。同一の逆関係が突然変異体の全て で観察される（突然変異体５．２につきレーン４−６、および二重突然変異体５ −１，２につきレーン７−９）。対照的に、野生型ＴＰ２エクスプレッサーから の溶解物中のテロメラーゼ活性レベルは、溶解物中に存在する野生型ＴＰ２の量 に拘わらず、実質的に同一である。同様に、テロメラーゼかつ性はＩＲＥＳ− ＥＧＦＰベクター単独でトランスフェクトした細胞中で実質的に一定である（レ ーン１３−１５）。この結果は、テロメラーゼ活性を通常有する細胞で発現させ た場合、生物学的に不活性なＴＰ２突然変異体を用いてこのようなテロメラーゼ 活性を低下または抑制できることを示唆する。 ＴＲＩＰ１ ｃＤＮＡの寄託 インサートＴＲＩＰ１ＭｙｃＴａｑ３（マウス全長ＴＲＩＰ１ポリペプチドを コードする）を持つプラスミドｐＣＲ３を含有するＥ．ｃｏｌｉ細胞はＡＴＣＣ （Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１２ ３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ） に受託番号９８２５０として１９９６年１１月８日に寄託された。加えて、ヒト ＴＲＩＰ１ ｃｏｌｉコーディング配列の一部が導入されたプラスミドｐＳＰＯ ＲＴを含有するＥ．ｃｏｌｉ細胞の４つの別のクローンも、同日にＡＴＣＣに寄 託された。クローン１５はアミノ酸１０４６−２６２７をコードするｃＤＮＡを 含有し、ＡＴＣＣ受託番号９８２５４を有し；クローン５４はアミノ酸４２３− １４６７をコードするｃＤＮＡを含有し；クローン６３はアミノ酸１３４６−２ ４ ８８をコードするｃＤＮＡを含有し、ＡＴＣＣ受託番号９８２５２を有し；クロ ーン９６はアミノ酸１−５６７をコードするｃＤＮＡを含有し、ＡＴＣＣ受託番 号９８２５１を有する。

【手続補正書】 【提出日】平成１１年６月１日（１９９９．６．１） 【補正内容】 請求の範囲 １． （ａ）配列番号：１３の核酸分子、 （ｂ）配列番号：１３のヌクレオチド１９２０−２８２０である核酸分子、 （ｃ）配列番号：１９の核酸分子、 （ｄ）配列番号：１４のポリペプチドをコードする核酸分子、またはその生物 学的活性断片、 （ｅ）配列番号：２０のポリペプチドをコードする核酸分子、またはその生物 学的活性断片、 （ｆ）配列番号：１４のポリペプチドと少なくとも９０パーセント同一である ポリペプチドをコードする核酸分子、 （ｇ）配列番号：２０のポリペプチドと少なくとも９０パーセント同一である ポリペプチドをコードする核酸分子、 （ｈ）前記（ａ）−（ｇ）のいずれかに対してストリンジェント条件下でハイ ブリダイズする核酸分子；および （ｉ）前記（ａ）−（ｇ）のいずれかの相補体である核酸分子 よりなる群から選択されるポリペプチドをコードするＴＰ２核酸分子。 ２． 配列番号：１３または配列番号：１９である核酸分子。 ３． 配列番号：１３のヌクレオチド１９２０−２８２０である核酸分子。 ４． 配列番号：２０の配列番号：１４のポリペプチドをコードする核酸分子。 ５． 配列番号：１３のヌクレオチド１−１６８９、配列番号：１３のヌクレオ チド１−１９２０、配列番号：１３のヌクレオチド１９２０−２８２０、配列番 号：１３のヌクレオチド２０８９−２８２０、および配列番号：１３のヌクレオ チド２０８９−２８５９から選択される核酸分子。 ６． 配列番号：１４のポリペプチドのアミノ酸６４０−９４０をコードする核 酸分子。 ７． 請求項１記載の核酸分子を含むベクター。 ８． 請求項２記載の核酸分子を含むベクター。 ９． 請求項３記載の核酸分子を含むベクター。 １０． 請求項４記載の核酸分子を含むベタター。 １１． 請求項５記載の核酸分子を含むベクター。 １２． 請求項６記載の核酸分子を含むベクター。 １３． 請求項７記載のベクターを含む宿主細胞。 １４． 請求項８記載のベクターを含む宿主細胞。 １５． 請求項９記載のベクターを含む宿主細胞。 １６． 請求項１０記載のベクターを含む宿主細胞。 １７． 請求項１１記載のベクターを含む宿主細胞。 １８． 請求項１２記載のベクターを含む宿主細胞。 １９． （ａ）適当な宿主中の請求項１記載の核酸によってコードされたポリペ プチドを発現させ、 （ｂ）ポリペプチドを単離する 工程を含むＴＰ２ポリペプチドの生産方法。 ２０． 該ポリペプチドが配列番号：１４または配列番号：２０である請求項１ ９記載の方法。 ２１． 該ポリペプチドが配列番号：１４のアミノ酸６４９−９４０である請求 項１９記載の方法。 ２２． （ａ）配列番号：１４のポリペプチド、 （ｂ）配列番号：１４のアミノ酸６４０−９４０であるポリペプチド、 （ｃ）配列番号：２０のポリペプチド、および （ｄ）（ａ）−（ｃ）のポリペプチドのいずれかと少なくとも９０パーセント 同一であるポリペプチド よりなる群から選択されるＴＰ２ポリペプチド。 ２３． 配列番号：１４、配列番号：２０のポリペプチド、またはその生物学的 活性断片であるＴＰ２ポリペプチド。 ２４． 配列番号：１４のアミノ酸１−５６３、配列番号：１４のアミノ酸１− ６４０、配列番号：１４のアミノ酸６４０−９４０、配列番号：１４のアミノ酸 ６９６−９４０、および配列番号：１４のアミノ酸６９６−９５３よりなる群か ら選択されるＴＰ２ポリペプチド。 ２５． アミノ末端メチオニンを保有しない請求項２２記載のＴＰ２ポリペプチ ド。 ２６． 細胞中でＴＰ２をコードする核酸、またはその生物学的活性断片を発現 することを含む、細胞の増殖を増大させる方法。 ２７． 細胞中でＴＰ２遺伝子、またはその生物学的活性断片を発現させること を含む、細胞中でテロメラーゼ活性を増加させる方法。 ２８． 細胞中で、ＴＰ２の生物学的活性を有しないＴＰ２突然変異体を発現さ せることを含む、細胞においてテロメラーゼを減少させる方法。 ２９． アミノ酸８６８位または８６９位のアスパラギン酸のコドンをアラニン のコドンに変化させたことを特徴とする、突然変異体ＴＰ２ポリペプチドをコー ドする核酸分子。 ３０． アミノ酸８６８位および８６９位のアスパラギン酸のコドンがアラニン のコドンに変化されたことを特徴とする、突然変異体ＴＰ２ポリペプチドをコー ドする核酸分子。 ３１． 請求項２９記載の核酸分子によってコードされたポリペプチド。 ３２． 請求項３０記載の核酸分子によってコードされたポリペプチド。 ３３． （ａ）配列番号：１の核酸分子、 （ｂ）配列番号：２の核酸分子、 （ｃ）配列番号：３、配列番号：４のポリペプチド、またはその生物学的活性断 片をコードする核酸分子、 （ｄ）配列番号：３または配列番号：４のポリペプチドと少なくとも７０パーセ ント同一であるポリペプチドをコードする核酸分子、 （ｅ）上記（ａ）−（ｄ）のいずれかと緊縮条件下でハイブリダイズする核酸分 子、および （ｆ）上記（ａ）−（ｅ）のいずれかの相補体である核酸分子 から成る群から選択されるポリペプチドをコードするＴＲＩＰ１核酸分子。 ３４． 配列番号：１の核酸分子。 ３５． 配列番号：２の核酸分子。 ３６． 配列番号：３のポリペプチドをコードする核酸分子。 ３７． 配列番号：４のポリペプチドをコードする核酸分子。 ３８． 配列番号：３のポリペプチドのアミノ酸１−８７１をコードする核酸分 子。 ３９． 請求項３３の核酸分子を含むベクター。 ４０． 請求項３４の核酸分子を含むベクター。 ４１． 請求項３５の核酸分子を含むベクター。 ４２． 請求項３６の核酸分子を含むベクター。 ４３． 請求項３７の核酸分子を含むベクター。 ４４． 請求項３８の核酸分子を含むベクター。 ４５． 請求項３９のベクターを含む宿主細胞。 ４６． 請求項４０のベクターを含む宿主細胞。 ４７． 請求項４１のベクターを含む宿主細胞。 ４８． 請求項４２のベクターを含む宿主細胞。 ４９． 請求項４３のベクターを含む宿主細胞。 ５０． 請求項４４のベクターを含む宿主細胞。 ５１． （ａ）適当な宿主中において、請求項１の核酸にコードされたポリペプ チドを発現させる工程および（ｂ）ポリペプチドを単離する工程から成る、ＴＲ ＩＰ１ポリペプチドを産生する方法。 ５２． 前記ポリペプチドが配列番号：３である請求項５１の方法。 ５３． 前記ポリペプチドが配列番号：３のアミノ酸１−８７１である請求項５ １の方法。 ５４． （ａ）配列番号：３のポリペプチド、 （ｂ）配列番号：３のアミノ酸１−８７１であるポリペプチド、および （ｃ）（ａ）あるいは（ｂ）のポリペプチドに少なくとも７０パーセント同一で あるポリペプチド、から成る群から選択されるＴＲＩＰ１ポリペプチド。 ５５． 配列番号：３のポリペプチドあるいはその生物学的活性断片であるＴＲ ＩＰ１ポリペプチド。 ５６． アミノ末端メチオニンを有さない請求項５２のＴＲＩＰ１ポリペプチド 。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 43/00 １０７ Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ０７Ｋ 16/40 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/19 9/12 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9/12 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 (31)優先権主張番号 ０８／９５１，７３３ (32)優先日 平成９年10月16日(1997．10．16) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ， ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ハーリントン，レア・エイ カナダ国、オンタリオ・エム・５・アー ル・１・エス・９、トロント、ピアーズ・ アベニユー・55 (72)発明者 ロビンソン，マーレイ・オー アメリカ合衆国、カリフオルニア・90272、 パシフイツク・パリセーズ、ラス・ロマ ス・アベニユー・974

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． （ａ）配列番号：１３の核酸分子、 （ｂ）配列番号：１３のヌクレオチド１９２０−２８２０である核酸分子、 （ｃ）配列番号：１９の核酸分子、 （ｄ）配列番号：１４のポリペプチドをコードする核酸分子、またはその生物 学的活性断片、 （ｅ）配列番号：２０のポリペプチドをコードする核酸分子、またはその生物 学的活性断片、 （ｆ）配列番号：１４のポリペプチドと少なくとも９０パーセント同一である ポリペプチドをコードする核酸分子、 （ｇ）配列番号：２０のポリペプチドと少なくとも９０パーセント同一である ポリペプチドをコードする核酸分子、 （ｈ）前記（ａ）−（ｇ）のいずれかに対してストリンジェント条件下でハイ ブリダイズする核酸分子；および （ｉ）前記（ａ）−（ｇ）のいずれかの相補体である核酸分子 よりなる群から選択されるポリペプチドをコードするＴＰ２核 酸分子。 ２． 配列番号：１３または配列番号：１９である核酸分子。 ３． 配列番号：１３のヌクレオチド１９２０−２８２０である核酸分子。 ４． 配列番号：２０の配列番号：１４のポリペプチドをコードする核酸分子。 ５． 配列番号：１３のヌクレオチド１−１６８９、配列番号：１３のヌクレオ チド１−１９２０、配列番号：１３のヌクレオチド１９２０−２８２０、配列番 号：１３のヌクレオチド２０８９−２８２０、および配列番号：１３のヌクレオ チド２０８９−２８５９から選択される核酸分子。 ６． 配列番号：１４のポリペプチドのアミノ酸６４０−９４０をコードする核 酸分子。 ７． 請求項１記載の核酸分子を含むベクター。 ８． 請求項２記載の核酸分子を含むベクター。 ９． 請求項３記載の核酸分子を含むベクター。 １０． 請求項４記載の核酸分子を含むベクター。 １１． 請求項５記載の核酸分子を含むべクター。 １２． 請求項６記載の核酸分子を含むベクター。 １３． 請求項７記載のベクターを含む宿主細胞。 １４． 請求項８記載のベクターを含む宿主細胞。 １５． 請求項９記載のベクターを含む宿主細胞。 １６． 請求項１０記載のベクターを含む宿主細胞。 １７． 請求項１１記載のベクターを含む宿主細胞。 １８． 請求項１２記載のベクターを含む宿主細胞。 １９． （ａ）適当な宿主中の請求項１記載の核酸によってコードされたポリペ プチドを発現させ、 （ｂ）ポリペプチドを単離する 工程を含むＴＰ２ポリペプチドの生産方法。 ２０． 該ポリペプチドが配列番号：１４または配列番号：２０である請求項１ ９記載の方法。 ２１． 該ポリペプチドが配列番号：１４のアミノ酸６４９−９４０である請求 項１９記載の方法。 ２２． （ａ）配列番号：１４のポリペプチド、 （ｂ）配列番号：１４のアミノ酸６４０−９４０であるポリペプチド、 （ｃ）配列番号：２０のポリペプチド、および （ｄ）（ａ）−（ｃ）のポリペプチドのいずれかと少なくと も９０パーセント同一であるポリペプチド よりなる群から選択されるＴＰ２ポリペプチド。 ２３． 配列番号：１４、配列番号：２０のポリペプチド、またはその生物学的 活性断片であるＴＰ２ポリペプチド。 ２４． 配列番号：１４のアミノ酸１−５６３、配列番号：１４のアミノ酸１− ６４０、配列番号：１４のアミノ酸６４０−９４０、配列番号：１４のアミノ酸 ６９６−９４０、および配列番号：１４のアミノ酸６９６−９５３よりなる群か ら選択されるＴＰ２ポリペプチド。 ２５． アミノ末端メチオニンを保有しない請求項２２記載のＴＰ２ポリペプチ ド。 ２６． 細胞中でＴＰ２をコードする核酸、またはその生物学的活性断片を発現 することを含む、細胞の増殖を増大させる方法。 ２７． 細胞中でＴＰ２遺伝子、またはその生物学的活性断片を発現させること を含む、細胞中でテロメラーゼ活性を増加させる方法。 ２８． 細胞中で、ＴＰ２の生物学的活性を有しないＴＰ２突然変異体を発現さ せることを含む、細胞においてテロメラーゼ を減少させる方法。 ２９． アミノ酸８６８位または８６９位のアスパラギン酸のコドンをアラニン のコドンに変化させたことを特徴とする、突然変異体ＴＰ２ポリペプチドをコー ドする核酸分子。 ３０． アミノ酸８６８位および８６９位のアスパラギン酸のコドンがアラニン のコドンに変化されたことを特徴とする、突然変異体ＴＰ２ポリペプチドをコー ドする核酸分子。 ３１． 請求項２９記載の核酸分子によってコードされたポリペプチド。 ３２． 請求項３０記載の核酸分子によってコードされたポリペプチド。