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GEBIET DER
ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich allgemein auf humanes Thrombozytenglykoprotein
Ib alpha und genauer auf das Erhalten von variablen Leichtketten-
und Schwerkettenregionen von Antikörpern gegen humanes Thrombozytenglykoprotein
Ib alpha und Verwendungen davon.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Innerhalb
dieser Anmeldung wird auf verschiedene Publikationen Bezug genommen,
häufig
in Klammern. Vollständige
Zitate für
alle diese Publikationen werden am Ende der detaillierten Beschreibung
angegeben.
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Von
dem Thrombozytenglykoprotein Ib/IX(GPIb/IX)-Rezeptor für von Willebrand-Faktor
(vWf) wird angenommen, dass er aus einem 1:1 heterodimeren Komplex
(Du et al. 1987) zwischen GPIb (160 kDa) und GPIX (17 kDa) in nicht
konvalenter Assoziierung besteht. GPIb seinerseits besteht aus einer
Disulfid-gebundenen 150 kDa alpha-Kette (GPIb alpha) und einer 22
kDa beta-Kette (GPIb beta) (Fitzgerald und Phillips 1989).
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Der
GPIb/IX-Komplex bildet einen der Haupttransmembranrezeptorkomplexe
an Blutthrombozyten (Roth 1991; Lopez 1994; Clemetson und Clemetson
1995), der von Willebrand Faktor (vWF)-abhängige Thrombozytenadhäsion vermittelt.
In den 1980er Jahren entwickelten Miller et al. eine Reihe von monoklonalen
Antikörpern
(engl.: monoclonal antibody = mab), die gegen den GP Ib/IX-Komplexrezeptor
für vWf
gerichtet sind. Insbesondere wurde der monoklonale Antikörper C-34
im Detail charakterisiert, und es wurde bestimmt, dass mab C-34 ein Epitop innerhalb
des Thrombozytenglykoprotein Ib/IX-Komplexes erkennt (Miller et
al. 1990). In dieser und nachfolgenden Arbeiten zeigten Miller et
al., dass monoklonale Antikörper
C-34, AS-2 und AS-7 potente Inhibitoren der Ristocetin-induzierten
Aggregation von normalen Thrombozyten sind, die von von Willebrand-Faktor
abhängig
ist. Miller et al. zeigten auch, dass die Epitope für alle drei
monoklonalen Antikörper
innerhalb des GPIb/IX-Komplexes liegen.
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Versuche,
die Bindungsplätze
für verschiedene
monoklonale Antikörper
zu finden, haben zu der Entwicklung von Epitopbibliotheken geführt. Parmley
und Smith entwickelten einen Bakteriophagenexpressionsvektor, der
Fremdepitope an seiner Oberfläche
anzeigen kann (Parmley und Smith 1988). Dieser Vektor kann verwendet
werden, um große
Sammlungen von Bakteriophagen zu konstruieren, die geradezu alle
möglichen Sequenzen
eines kurzen Peptids (von z. B. 6 Aminosäuren) enthalten können. Sie
entwickelten auch das „Biopanning", das ein Verfahren
zum Affinitätsreinigen
von Phagen-anzeigenden Fremdepitopen unter Verwendung eines spezifischen
Antikörpers
ist (siehe Parmley und Smith 1988; Cwirla et al. 1990; Scott und
Smith 1990; Christian et al. 1992; Smith und Scott 1993).
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Nach
der Entwicklung von Epitopbibliotheken haben Smith et al. dann vorgeschlagen,
dass es möglich sein
sollte, den Bakteriophagenexpressionsvektor und die Biopanning-Technik
von Parmley und Smith zu verwenden, um Epitope aller möglichen
Sequenzen einer gegebenen Länge
zu identifizieren. Dies führte
zu der Idee, Peptidliganden für
Antikörper
durch Biopanning von Epitopbibliotheken zu identifizieren, die dann
bei dem Impfstoffdesign, der Epitopkartierung, der Identifikation
von Genen und vielen anderen Anwendungen verwendet werden könnten (Parmley
und Smith 1988; Scott 1992).
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Antikörperfragmente
sind auch auf der Oberfläche
von fadenförmigen
Phagen angezeigt worden, die die Antikörpergene codieren (Hoogenboom
und Winter 1992; McCafferty et al., 1990; Vaughan et al. 1996; Tomlinson
et al. 1992; Nissim et al. 1994; Griffiths et al. 1994). Variable
Schwerketten(VH)- und variable Leichtketten(VL)-Immunoglobulinbibliotheken sind damit
in Phagen entwickelt worden und Phagen können durch Panning mit Antikörpern selektiert
werden. Die codierten Antikörperfragmente
können
dann von infizierten Bakterien als lösliche Fragmente sekretiert
werden. Die Anzeige (das Display) der Antikörper auf Phagen und die Selektion
mit Antigenen bildet die Immunselektion nach und kann verwendet
werden, um Antikörper
ohne Immunisierung aus einer einzigen Phagenbibliothek herzustellen
(siehe Hoogenboom und Winter 1992).
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Eine
synthetische humane VH- und VL-ScFv-Bibliothek
wurde durch erneutes Klonen der variablen Schwerketten- und Leichtkettenregionen
von den Lox-Bibliotheksvektoren (Griffiths et al. 1994) in den Phagemidvektor
pHEN2 (s. 1) hergestellt. Diese "Griffin. 1"-Bibliothek ist eine
ScFv-Phagemidbibliothek, die aus synthetischen V-Gensegmenten hergestellt
wurde. Die World Wide Web-Adresse, um die V-Gen-Keimbahnsequenzen
herunter zu laden, die die Griffin. 1-Bibliothek ausbilden, lautet http://www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/vbase-questions.html.
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Ware
et al (1993) J. Biol. Chem. 268, 8376-8382 beziehen sich auf die
Expression von humanem Thrombozytenglykoprotein Ibα in transgenen
Mäusen.
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Die
WO 97/18236 bezieht sich auf Mimotope und anti-Mimotope von humanem
Thrombozytenglykoprotein Ib/IX.
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Die
US 5,817,748 bezieht sich
auf Mimotope von humanem Thrombozytenglykoprotein Ib/IX.
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Nissim
et al (1994) EMBO J. 13, 692-698 beziehen sich auf Antikörperfragmente
aus einer "Eintopf"-Phagenanzeigebibliothek
als immunchemische Reagenzien.
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Griffith
et al. (1994) EMBO J. 13, 3245-3260 bezieht sich auf die Isolation
von humanen Hochaffinitätsantikörpern direkt
aus großen
synthetischen Repertoires.
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Ein
Bedürfnis
besteht fort in Bezug auf die Beleuchtung der Sequenz von nützlichen
Epitopen von Antikörpern,
die an Glykoprotein Ib alpha anbinden.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Zu
diesem Zweck stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum
Selektieren eines Klons bereit, der an humanes Thrombozytenglykoprotein
Ib alpha anbindet, unter Verwendung einer humanen variablen Schwerketten-
und variablen Leichtkettenimmunglubolinbibliothek. Das Verfahren
weist auf: Inkubieren einer humanen variable Schwerketten- und variablen
Leichtkettenimmunglubolinbibliothek mit Zellen, die humanes Thrombozytenglykoprotein
Ib expressivieren, und Selektieren der Klone aus der Bibliothek,
die an die Zellen anbinden; und Inkubieren der selektierten Klone
der Bibliothek mit gewaschenen humanen Thrombozyten, und Selektieren
der resultierenden Klone, die an die gewaschenen humanen Thrombozyten
anbinden, wobei die resultierenden Klone an humanes Thrombozytenglykoprotein
Ib alpha anbinden.
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Die
vorliegende Erfindung kann verwendet werden, um Nukleinsäuremoleküle zu isolieren,
die eine variable Schwerketten- und eine variable Leichtkettenregion
eines Antikörpers
codieren, wobei der Antikörper an
humanes Thrombozytenglykoprotein Ib alpha anbindet und die Aggregation
von Thrombozyten hemmt.
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Die
isolierten selektierten Nukleinsäuremoleküle können in
geeignete Expressionsvektoren und/oder Wirtszellen eingesetzt werden.
Expression der Nukleinsäuremoleküle, die
eine variable Schwerketten- oder eine variable Leichtkettenregion
codieren, resultiert in einer Wirtszelle in die Produktion von variablen
Schwerketten- oder variablen Leichtkettenregionen eines Antikörpers (wobei
der Antikörper
an humanes Thrombozytenglykoprotein Ib alpha anbindet und die Aggregation
von Thrombozyten hemmt).
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KURZBESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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Diese
und andere Merkmale und Vorteile dieser Erfindung werden aus der
nachfolgenden detaillierten Beschreibung von bevorzugten Ausführungsbeispielen
deutlich werden, wenn sie in Verbindung mit den beigefügten Zeichnungen
gelesen wird, in denen:
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1 eine
Karte des pHEN2-Phagemidvektors ist;
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2 die
Struktur eines Antikörpers
illustriert;
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3 die
Struktur des Fab-Fragments eines Antikörpers illustriert;
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4 die
Struktur des Fv-Fragments eines Antikörpers illustriert;
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5 die
Aminosäuresequenz
unter Ausrichtung auf HIb-1 illustriert;
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6 die
Aminosäuresequenz
unter Ausrichtung auf HIb-2 illustriert;
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7 die
Aminosäuresequenz
unter Ausrichtung auf HIb-3 illustriert;
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8 die
Aminosäuresequenz
unter Ausrichtung auf HIb-5 illustriert;
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9 die
Aminosäuresequenz
unter Ausrichtung auf HIb-6 illustriert;
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10 ein
direkter Westernblot von humanem HIb-1-anti-GPIb alpha ist;
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11 Westernblots
von HIb-1, HIb-2 und SZ-2 unter nicht reduzierten und reduzierten
Bedingungen zeigt;
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12 die
Hemmung von Ristocetin-induzierter Thrombozytenaggregation durch
klonale Phagemide expressivierende humane VH- und VL-ScFv illustriert;
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13 die
in Hemmung von Botrocetin-induzierter Aggregation von Formalin-fixierten
humanen Thrombozyten illustriert; und
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14 die
Hemmung von Antikörpern
durch PRP-Aggregation illustriert, die durch Ristocetin induziert wird.
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Die 5 bis 14 beziehen
sich auf Klone, die durch das Verfahren der Erfindung selektiert
wurden, und ihre Verwendung.
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DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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So
wie sie hier verwendet werden, werden Antikörper, variable Schwerketten
(VH oder Vh) und variable Leichtketten (VL oder VI), Fv-Fragment, und CDR (hypervariable
Regionen) (CDR1, CDR2, CDR3) in dem Zusammenhang der 2 bis 4 verwendet. 1 zeigt
eine schematische Zeichnung der Organisation eines natürlichen
IgG und von abgeleiteten rekombinanten Fragmenten. Das Fv-Fragment
ist in 4 als "Einzelketten-Fv-Fragment" (Single Chain Fv
Fragment = ScFv) gezeigt. Bei diesem Typ von rekombinantem Protein
sind die zwei Antigen-bindenden Regionen der leichten und der schweren
Kette (Vh und VI) durch ein Peptid von 15–18 Aminosäuren verbunden. Diese Linkerregion
erlaubt die richtige Wechselwirkung zwischen den Vh- und VI-Regionen.
Eine weitere Beschreibung solch einer rekombinanten Antikörperstruktur
kann unter http://www.mgen.uni-heidelberg.de/SD/SDscFvSite.html
gefunden werden.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Selektieren eines
Klons bereit, der an humanes Thrombozytenglykoprotein Ib alpha anbindet,
unter Verwendung einer humanen variablen Schwerketten- und variablen
Leichtkettenimmunglobulinbibliothek. Das Verfahren weist auf: Inkubieren
einer humanen variablen Schwerketten- und variablen Leichtkettenimmunglobulinbibliothek
mit Zellen, die humanes Thrombozytenglykoprotein Ib expressivieren,
und Selektieren von Klonen aus der Bibliothek, die an die Zellen
anbinden; und Inkubieren der selektierten Klone aus der Bibliothek
mit gewaschenen humanen Thrombozyten, und Selektieren resultierender
Klone, die an die gewaschenen humanen Thrombozyten anbinden, wobei
die resultierenden Klone an humanes Thrombozytenglykoprotein Ib
alpha anbinden.
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Vorzugsweise
sind die Zellen, die das humane Thrombozytenglykoprotein Ib alpha
expressivieren, Zellen aus dem Eierstock des Chinesischen Hamsters
(CHO-Zellen).
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In
einer Ausführungsform
weist das Verfahren weiterhin das Inkubieren der selektierten resultierenden Klone
mit weiteren Thrombozyten und das Zugeben eines anti-Glykoprotein
Ib alpha-Moleküls,
das Klone verdrängen
kann, die bereits an die weiteren Thrombozyten gebunden sind, und
das Selektieren der dann resultierenden Klone auf, die nicht an
die weiteren Thrombozyten gebunden sind, wobei die dann resultierenden Klone
in der Lage sind, an humanes Thrombozytenglykoprotein Ib alpha anzubinden.
Vorzugsweise ist das anti-Glykoprotein
Ib alpha-Molekül
ein monoklonaler Mausantikörper
oder ein monoklonales Mauspeptid (wie beispielsweise der monoklonale
Mausantikörper
C-34 oder das Peptid mit der in SEQ ID NO: 1 gezeigten Aminosäuresequenz).
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Das
Verfahren der vorliegenden Erfindung kann verwendet werden, um ein
isoliertes Nukleinsäuremolekül bereitzustellen,
das eine variable Schwerketten- oder eine variable Leichtkettenregion
eines Antikörpers codiert,
wobei der Antikörper
an humanes Thrombozytenglykoprotein Ib alpha anbindet und eine Aggregation von
Thrombozyten hemmt. Das Nukleinsäuremolekül kann Deoxyribonukleinsäure (DNS)
oder Ribonukleinsäure
(RNS, einschl. Messenger-RNS oder mRNS), genomisch oder rekombinant,
biologisch isoliert oder synthetisch sein.
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Das
DNS-Molekül
kann ein cDNS-Molekül
sein, das eine DNS-Kopie einer Messenger-RNS (mRNS) ist, die die
variable schwere (VH)- oder variable leichte
(VL) Kette codiert.
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Ein
Beispiel solch einer variablen Schwerkettenregion eines Antikörpers ist
die variable schwere Kette, die eine Nukleotidsequenz aufweist,
welche aus der Gruppe ausgewählt
ist, die aus SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 4 besteht.
Ein Beispiel solch einer variablen Leichtkettenregion eines Antikörpers ist die
variable leichte Kette mit einer Nukleotidsequenz, die aus der Gruppe
ausgewählt
ist, welche aus den SEQ ID NO: 5–9 besteht.
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Die
Aminosäuresequenzen,
die von diesen Nukleotidsequenzen codiert werden, sind in den SEQ
ID NO: 10–15
(schwere Ketten) und SEQ ID NO: 16–21 (leichte Ketten) gezeigt.
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Die
Nukleinsäuremoleküle, die
unter Verwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung identifiziert
werden können,
können
in geeigneten rekombinanten Wirtszellen unter Verwendung konventioneller Techniken
expressiviert werden. Jegliches geeignete Wirts-/oder Vektorsystem
kann verwendet werden, um die variable Schwerketten- oder variable
Leichtkettenregion eines Antikörpers
zu expressivieren, wobei der Antikörper an humanes Thrombozytenglykoprotein
Ib alpha anbindet und eine Aggregation von Thrombozyten hemmt. Für eine in
vitro-Expression sind CHO-Zellen oder andere Säugetierzellen oder Escherichia
coli bevorzugt.
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Techniken
zum Einführen
der Nukleinsäuremoleküle in die
Wirtszellen können
die Verwendung von Expressionsvektoren einbeziehen, die die Nukleinsäuremoleküle aufweisen.
Diese Expressionsvektoren (wie beispielsweise Phagemide, Plasmide
und Viren; Viren einschl. Bakteriophagen) können dann verwendet werden,
um die Nukleinsäuremoleküle in geeignete
Wirtszellen einzuführen.
Z. B. kann DNS, die die variable Schwerketten- oder variable Leichtkettenregion
eines Antikörpers
codiert, in den Kern einer Wirtszelle injiziert oder in die Wirtszelle
unter Verwendung eines geeigneten Vektors transformiert werden,
oder mRNS, die die variable Schwerketten- oder variable Leichtkettenregion
codiert, kann direkt in die Wirtszelle injiziert werden, um in der
Wirtszelle Expression von variablen Schwerketten- oder variablen
Leichtkettenregionen eines Antikörpers
zu erhalten.
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Verschiedene
Verfahren sind im Stand der Technik zum Einführen von Nukleinsäuremolekülen in Wirtszellen
bekannt. Ein Verfahren ist Mikroinjektion, bei dem DNS durch feine
Glasnadeln direkt in den Kern von Zellen injiziert wird (oder RNS
direkt in das Zytoplasma der Zellen injiziert wird). Alternativ
kann DNS mit einem inerten Kohlenhydratpolymer (Dextrat) inkubiert
werden, an das eine positiv geladene chemische Gruppe (DEAE, für Diethylaminoethyl)
gekoppelt wurde. Die DNS haftet über
ihre negativ geladenen Phosphatgruppen an dem DEAE-Dextran. Diese
großen
DNS-enthaltenen Partikel haften ihrerseits an den Oberflächen von Zellen,
von denen angenommen wird, dass sie sie durch einen Prozess aufnehmen,
der als Endozytose bekannt ist. Ein Teil der RNS entzieht sich der
Zerstörung
in dem Zytoplasma der Zelle und entkommt zum Kern, wo er wie jedes
andere Gen in der Zelle in RNS transkribiert werden kann. Bei einem
anderen Verfahren nehmen Zellen effizient DNS in Form eines Präzipitats
mit Kalziumphosphat auf. Bei Elektroporation werden Zellen in einer
Lösung
angeordnet, die DNS enthält,
und einem kurzen elektrischen Puls ausgesetzt, der dazu führt, dass
sich vorübergehend
Löcher
in ihren Membranen öffnen.
Durch die Löcher
tritt DNS direkt in das Zytoplasma ein, wobei sie die endozytotischen
Vehikel umgeht, durch die sie bei den DEAE-Dextran- und Kalziumphosphatprozeduren
hindurch tritt. DNS kann auch in künstliche Lipidvehikel integriert
werden, das sind Liposome, die mit der Zellmembran fusionieren,
so dass sie ihre Inhalte direkt in das Zytoplasma austragen. Bei
einem noch direkteren Ansatz wird DNS an der Oberfläche von
Wolframmikroprojektilen absorbiert und mit einer Vorrichtung, die
an eine Schrotflinte erinnert, in Zellen geschossen.
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Einige
dieser Verfahren, Mikroinjektion, Elektroporaton und Liposomfusion,
sind angepasst worden, um Proteine in Zellen einzuführen. Für eine Übersicht
siehe Mannino und Gould-Fogerite
1988, Shigekawa und Dower 1988, Capecchi 1980, und Klein et al.
1987.
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Weitere
Verfahren zum Einführen
von Nukleinsäuremolekülen und
Zellen umfassen die Verwendung von Virusvektoren. Ein solcher Virus,
der umfangreich für
die Proteinproduktion verwendet wird, ist ein Insektenvirus, Baculovirus.
Für eine Übersicht über Baculovirusvektoren,
siehe Miller (1989). Verschiedene Virusvektoren sind auch verwendet
worden, um Säugetierzellen
zu transformieren, wie beispielsweise Bacteriophagen, Vacciniavirus,
Adenovirus und Retrovirus.
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Wie
angegeben ist, erfordern einige dieser Verfahren des Transformierens
einer Zelle die Verwendung eines Plasmidzwischenvektors. Das US-Patent
Nr. 4,237,224 für
Cohen und Boyer beschreibt die Produktion von Expressionssystemen
in der Form von rekombinanten Plasmiden unter Verwendung von Restriktionsenzymspaltung
und Ligation mit DNS-Ligase. Diese rekombinanten Plasmide werden
dann mittels Transformation in einzellige Kulturen, einschl. prokaryotischer
Organismen und eurkaryotischer Zellen, die in Gewebekultur gezogen
werden, eingeführt
und in diesen repliziert. Die DNS-Sequenzen werden unter Verwendung
von Standardklonprozeduren, die im Stand der Technik bekannt sind,
wie von Sambrook et al. (1989) beschrieben wird, in den Plasmidvektor
geklont.
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Es
sollte schnell deutlich werden, dass verschiedene dieser Verfahren
verwendet werden können,
um die Nukleinsäuremoleküle in die
Zellen eines oder in Zellimplantate innerhalb eines Subjekts in
vivo zu implantieren (Gentherapieanwendungen, einschl. humane Gentherapie).
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Z.
B. könnte
Nukleinsäure,
die eine variable schwere Kette und/oder eine variable leichte Kette
codiert oder die Fragmente davon codiert oder die einen Antikörper codiert,
der die variable schwere Kette und/oder die variable leichte Kette
oder Fragmente davon aufweist, unter Verwendung eines Säugetiervirusvektors,
wie beispielsweise Adenovirus, in vivo eingeführt werden. Solch ein Vektor
könnte
auch einen induzierbaren Promotor, der die Expression der Nukleinsäure steuert,
oder andere geeignete positive oder negative Antwortelemente umfassen
und einführen,
so dass das Subjekt einfach eine "Droge" nehmen könnte, die die Expression der
Nukleinsäure
der vorliegenden Erfindung einschalten oder abschalten würde. Die "Droge" könnte z.
B. den induzierbaren Promotor induzieren.
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Wirtszellen,
in die die Nukleinsäure,
die die variable Schwerketten- oder variable Leichtkettenregion codiert,
eingeführt
worden ist, können
verwendet werden, um die variable Schwerketten- oder variable Leichtkettenregion
zu produzieren (d. h. funktional zu expressivieren). Die Funktion
der codierten variablen Schwerketten- oder variablen Leichtkettenregion
kann gemäß der im
Stand der Technik bekannten Verfahren getestet werden, indem die
variable Schwerketten- oder variable Leichtkettenregion in einen
Antikörper
eingebaut wird und der Antikörper
auf seine Fähigkeit
getestet wird, an humanes Thrombozytenglykoprotein Ib alpha anzubinden
und die Aggregation von Thrombozyten zu hemmen.
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Die
Nukleinsäuremoleküle der vorliegenden
Erfindung können
entweder als Sonden oder für
die Konstruktion von Primern verwendet werden, um entweder durch
Klonen und Kolonisierung/Plaquehybridizierung oder durch Amplifizierung
unter Verwendung der Polymerasekettenreakton (PKR) DNS zu erhalten,
die andere variable Schwerketten- oder variable Leichtkettenregionen
eines Antikörpers
codiert, wobei der Antikörper
an humanes Thrombozytenglykoprotein Ib alpha anbindet und eine Aggregation
von Thrombozyten hemmt.
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Spezifische
Sonden, die von den Sequenzen hier erhalten werden, können unter
Anwendung bekannter Verfahren (siehe Sambrook et al. 1989) verwendet
werden, um Kolonien oder Plaques zu identifizieren, die geklonte
DNS enthalten, welche eine variable Schwerketten- oder variable
Leichtkettenregion eines Antikörpers
codiert. Ein Fachmann wird erkennen, dass durch Verwenden solcher
Sonden unter hochstringenten Bedingungen (z. B. Hybridisierung bei
42°C mit
5X SSPC und 50 % Formamid, Waschen bei 50 bis 65°C mit 0,5 X SSPC) Sequenzen
erhalten werden können,
die Regionen aufweisen, welche zu mehr als 90 % homolog oder identisch
mit der Sonde sind. Sequenzen mit niedriger prozentualer Homologie
oder Identität
mit der Sonde, die ebenfalls variable Schwerketten- oder variable
Leichkettenregionen eines Antikörpers
codieren, können
durch Reduzieren der Stringenz der Hybridisierung und des Waschens
erhalten werden (z. B. durch Reduzieren der Hybridisierungs- und
Waschtemperaturen oder Reduzieren der Menge an eingesetztem Formamid).
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Spezifische
Primer, die von den Sequenzen hier erhalten werden, können unter
Anwendung bekannter Verfahren (siehe Innis et al. 1990) in PKR verwendet
werden, um eine DNS-Sequenz zu amplifizieren, die eine variable
Schwerketten- oder variable Leichtkettenregion eines Antikörpers codiert,
wobei der Antikörper
an humanes Thrombozytenglykoprotein Ib alpha anbindet und eine Aggregation
von Thrombozyten hemmt. Ein Fachmann wird erkennen, dass durch Verwenden
solcher Primer unter hochstringenten Bedingungen (z. B. Anlassen
bei 50–60°C, abhängig von
der Länge
und dem spezifischen Nukleotidgehalt des verwendeten Primers), Sequenzen
amplifiziert werden, die zu mehr als 75 % mit den Primern homologe
oder identische Regionen aufweisen.
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Die
Erfindung stellt weiterhin einen Antikörper bereit, der die hier offenbarte
variable Schwerketten- oder variable Leichtkettenregion aufweist.
Antikörper
der vorliegenden Erfindung umfassen monovalente, bivalente und polyvalente
Antikörper
sowie Fragmente der Antikörper
der vorliegenden Erfindung, sind aber nicht auf die Fab und die
F(ab')2-Fragmente
beschränkt.
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Die
Antikörper,
die unter Verwendung der vorliegenden Erfindung erhalten werden
können,
können
in einer detektierbar markierten Form bereitgestellt werden. Antikörper können durch
die Verwendung von Radioisotopen, Affinitätsmarkierungen (wie beispielsweise
Biotin, Avidin usw.), enzymatischen Markierungen (wie beispielsweise
Meerrettichperoxidase, alkalische Phosphathase usw.), fluoreszenzten
Markierungen (wie beispielsweise FITC oder Rhodamin usw.), paramagnetischen
Atome usw. detektierbar markiert werden. Epitopanhänge können ebenfalls
verwendet werden, wie beispielsweise das c-myc-Peptid (zu dem Antikörper verfügbar sind,
die das kleine interessierende Peptid oder Protein erkennen). Der
6x-Histiginanhang (für
den nicht nur Antikörper
verfügbar
sind, sondern auch gelierende Materialien, die eine hohe Affinität für die Histidine
aufweisen) wird auch gemeinhin verwendet, um sekretierte Proteine
aufzureinigen. Prozeduren, die solche ein Markieren bewirken, sind
im Stand der Technik wohl bekannt, für Beispiele s. Sternberger
et al. 1970, Bayer et al. 1979, Engval et al. 1972 und Goding 1976.
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Die
Antikörper,
die unter Verwendung des Verfahrens der Erfindung erhalten werden
können,
können in
einer Zusammensetzung verwendet werden, die den Antikörper und
einen Träger
aufweist. Die Zusammensetzung kann verwendet werden, um Aggregation
von Thrombozyten zu hemmen, indem die Thrombozyten der Zusammensetzung
ausgesetzt werden. Der Antikörper
kann auch verwendet werden, um an humanes Thrombozytenglykoprotein
Ib alpha anzubinden, wobei das Verfahren das Aussetzen von humanem
Thrombozytenglykoprotein Ib alpha gegenüber dem Antikörper aufweist.
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Bei
den Verfahren der Erfindung werden Gewebe oder Zellen oder Thrombozytenglykoprotein
Ib alpha (ein Zelloberflächenprotein)
mit der Zusammensetzung oder den Antikörpern der vorliegenden Erfindung
kontaktiert oder dieser/diesem ausgesetzt. In dem Zusammenhang dieser
Erfindung bedeutet, Gewebe oder Zellen oder Thrombozytenglykoprotein
Ib alpha mit einer Zusammensetzung oder einem Antikörper zu "kontaktieren" oder gegenüber dieser/diesem "Auszusetzen", die Zusammensetzung
oder den Antikörper, üblicherweise
in einem flüssigen
Träger,
zu einer Zellsuspension oder einer Gewebeprobe, entweder in vivo
oder ex vivo hinzu zu geben oder die Zusammensetzung oder den Antikörper an
Zellen oder Gewebe innerhalb eines Tiers (einschl. Menschen) zu
verabreichen.
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Nachdem
eine variable schwere Kette oder eine variable leichte Kette von
Interessen identifiziert ist, kann der unter Verwendung der variablen
schweren Kette oder der variablen leichten Kette konstruierte Antikörper verwendet
werden, um Peptide zu identifizieren, die in der Lage sind, die
hemmende Aktivität
des Antikörpers
nachzuahmen. Ein solches Verfahren verwendet die Entwicklung von
Epitopbiliotheken und das Biopanning von Bakteriophagenbibliotheken.
Kurz gesagt haben Versuche, die Bindungsplätze für verschiedene monoklonale
Antikörper
zu definieren, zu der Entwicklung von Epitopbibliotheken geführt. Parmley
und Smith entwickelten einen Bakteriophagenexpressionsvektor, der
Fremdepitope auf seiner Oberfläche
anzeigen kann (Parmley, S. F. & Smith,
G. P., Gene 73: 305-318 (1988)). Dieser Vektor könnte verwendet werden, um große Sammlungen
von Bakteriophagen zu konstruieren, die nahezu alle möglichen
Sequenzen eines kurzen (z. B. sechs Aminosäuren langen) Peptids enthalten
könnte.
Sie entwickelten auch das Biopanning, das ein Verfahren zum Affinitätsaufreinigen
von Phagen-anzeigenden Fremdepitopen unter Verwendung eines spezifischen Antikörpers ist
(s. Parmley, S. F. & Smith,
G. P., Gene 73: 305-318 (1988); Cwirla, S. E., et al., Proc Natl
Acad Sci USA 87: 6378-6382 (1990); Scott, J. K. & Smith, G. P., Science 249: 386-390
(1990); Christian, R. B., et al., J Mol Biol 227: 711-718 (1992);
Smith, G. P. & Scott,
J. K., Methods in Enzymology 217: 228-257 (1993)).
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Nach
der Entwicklung von Epitopbibliotheken haben Smith et al. vorgeschlagen,
dass es möglich
sein sollte, die Bakteriophagenexpressionsvektor- und Biopanningtechnik
von Parmley und Smith zu verwenden, um Epitope von allen möglichen
Sequenzen einer gegebenen Länge
zu identifizieren. Dies führte
zu der Idee, Peptidliganden für
Antikörper
durch Biopanning von Epitopbibliotheken zu identifizieren, die dann
bei dem Impfstoffdesign, der Epitopkartierung, der Identifikation
von Genen und vielen anderen Anwendungen verwendet werden könnten (Parmley,
S. F. & Smith,
G. P., Gene 73: 305-318 (1988); Scott, J. K., Trends in Biochem Sci
17: 241-245 (1992)).
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Unter
Verwendung von Epitopbibliotheken und Biopanning haben Forscher,
die nach Epitopsequenzen suchten, stattdessen Peptidsequenzen gefunden,
die das Epitop nachahmen, d. h. Sequenzen, die keine natürliche durchgängige lineare
Sequenz identifizieren und nicht notwendigerweise überhaupt
innerhalb einer natürlichen
Proteinsequenz auftreten. Diese nachahmenden Peptide werden Mimotope
bezeichnet. Auf diese Weise sind Mimotope von verschiedenen Bindungsplätzen/Proteinen
gefunden worden.
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Die
Sequenzen dieser Mimotope identifizieren definitionsgemäß keine
durchgängige
lineare Sequenz oder treten nicht notwendiger Weise in irgendeiner
Form in einem natürlich
auftretenden Molekül
auf, d. h. einem natürlich
auftretenden Protein. Die Sequenzen dieser Mimotope bilden nur ein
Peptid aus, das einen Bindungsplatz an einem natürlich auftretenden Protein
funktionell nachahmt.
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Viele
dieser Mimotope sind kurze Peptide. Die Verfügbarkeit von kurzen Peptiden,
die leicht in großen Mengen
synthetisiert werden können
und die natürlich
auftretende Sequenzen (d. h. Bindungsplätze) nachahmen können, bietet
große
potentielle Anwendung.
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Unter
Verwendung dieser Technik können
Mimotope für
einen Antikörper
identifiziert werden, der Thrombozytenglykoprotein Ibα erkennt.
Die Sequenz dieser Mimotope repräsentiert
kurze Peptide, die dann auf verschiedene Weisen genutzt werden können, z.
B. als Peptiddrogen, die an Thrombozytenglykoprotein Ibα anbinden
und die Aggregation von Thrombozyten hemmen.
-
Wenn
die Sequenz des Mimotops bestimmt ist, können die Peptiddrogen chemisch
synthetisiert werden.
-
Die
Antikörper,
die durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung erhalten werden
können,
(oder Fragmente davon) können
somit verwendet werden, um Peptide, Mimotope usw. zu selektieren,
die komplementär
zu den Antikörpern
sind und die dann als Gegenmittel zu den Antikörpern selbst verwendet werden können. Wenn
z. B. ein Subjekt, das mit dem Antikörper behandelt wird, um Thrombozytenaggregation
zu hemmen, in einen Autounfall verwickelt wird und das Risiko von
Blutungen das Risiko von Thrombosen weit überschreitet, wäre es wünschenswert,
den Antikörper
der vorliegenden Erfindung "auszuschalten". Dies könnte durch
Verwendung des Peptids bzw. Mimotops zu dem Antikörper selbst
getan werden. Das Peptid oder das Mimotop könnte somit an das Subjekt verabreicht
werden, um den Antikörper
von den Thrombozyten zu verdrängen,
wodurch die Antikörper-induzierte
Hemmung der Thrombozyten verhindert wird.
-
Die
identifizierten variablen Schwerketten- und variablen Leichtkettenregionen
eines Antikörpers,
wobei der Antikörper
eine Aggregation von Thrombozyten hemmt, können auch verwendet werden,
um zusätzliche
variable Leichtketten- und variable Schwerkettenregionen eines Antikörpers zu
selektieren, der eine Aggregation von Thrombozyten hemmt. Solch
ein Verfahren umfasst diese Selektion einer variablen Schwerketten-
oder variablen Leichtkettenregion, wie sie oben definiert ist (z.
B. SEQ ID NOs: 10–15
für schwere
Ketten, SEQ ID NO: 16–21
für leichte
Ketten), wobei jede der variablen Schwerketten- oder variablen Leichtkettenregionen
eine Aminosäuresequenz
aufweist; Ändern
der Aminosäuresequenz
der selektierten variablen Schwerketten- oder variablen Leichtkettenregion;
Konstruieren eines Antikörpers
mit der geänderten
Aminosäuresequenz
der variablen Schwerketten- oder variablen Leichtkettenregion; und
Bestimmen, ob der Antikörper
eine Aggregation von Thrombozyten hemmtt, wobei dadurch die geänderte variable
Schwerketten- oder variable Leichtkettenregion eines Antikörpers, der
eine Aggregation von Thrombozyten hemmt, selektiert wird.
-
BEISPIEL 1
-
Vollständige DNA-Sequenzen
wurden von der synthetischen humanen VH- und VL-ScFv-Bibliothek (der Griffin.1
Library, erhältlich
vom Medical Research Council in England) isoliert, und die Proteinsequenzen mehrerer
ScFv-Klone wurden bestimmt. Die ScFv-Klone wurden auf der Basis
ihrer Bindung an Thrombozyten-GPIb selektiert. Ob als Oberflächenproteine
an dem Phagemid angezeigt oder als freie ScFv durch E. coli expressiviert,
haben verschiedene dieser unterschiedlichen ScFv-Klone ihre Fähigkeit
bewiesen, von Willebrand Faktor (vWF)-abhängige Aggregation von Thrombozyten
zu hemmen, höchstwahrscheinlich
aufgrund ihrer Veränderung
des Bindungsplatzes für
vWF, von dem bekannt ist, dass er in GPIb enthalten ist. Da die
Griffin.1 Library aus Sequenzen von variablen schweren Ketten und
leichten Ketten humaner Antikörper
aufgebaut ist, bestehen ScFv, die aus dieser Bibliothek isoliert
werden, aus nativen humanen Proteinsequenzen und sind deshalb sehr
attraktive potentielle Reagenzien für therapeutische Zwecke. Die
ScFv stellen eine neue Klasse von anti-Thrombosemitteln bereit,
die für
die Verhinderung von Thrombozyten-abhängigen Thrombi in erkrankten
Arterien, Bypassimplantaten, Dialysezugängen usw. nützlich sind. Im Gegensatz zu
Antikörpern,
die von Mäusen
oder anderen Arten erhalten werden, haben die humanen ScFv eine
weit bessere Chance als Eigenproteine denn als Fremdproteine anerkannt
zu werden.
-
Zusätzlich zu
den potentiellen anti-Thromboseverwendungen der isolierten ScFv
sind diese ScFv auch als diagnostische Reagenzien in der Humanmedizin
nützlich.
Da GPIb ein in Bezug auf seine Expression über den Körper hinweg stark beschränktes Antigen
ist, hat es sich als einer der besten Marker zum Identifizieren von
Thrombozyten, ihren Vorformzellen (den Megakaryozyten) und leukämischen
Blasten von megakaryozytischem Ursprung herausgestellt. Zusätzlich gibt
es einige Hinweise in der Literatur, dass das Testen auf eine löslichen
Form von Thrombozyten-GPIb im Plasma (das mutmaßlich vom proteolytischen Abbau
von Thrombozytenoberflächen-GPIb
resultiert) als klinischer Marker nützlich sein mag. Die neuen
Anti-GPIb-ScFv werden anstelle von Säugetierzellen, die für monoklonale
Mausantikörper
erforderlich sind, leicht von E. coli-Kulturen geerntet, und sie
können
deshalb eine ökonomischere
Quelle für
anti-GPIb-Marker für
diagnostische Verwendungen sein, als sie zuvor verfügbar waren.
-
Da
die humanen ScFv gegen Thrombozytenglykoprotein Ib gerichtet sind,
sind sie HIb-1, HIb-2, HIb3 usw. benannt worden, um auf die (humane)
Quelle der ScFv und das Ziel (Ib) der ScFv hinzuweisen. Im Falle von
HIb-1, HIb-2 und HIb-3 hat DNS-Sequenzieren die Aminosäuresequenzen
sowohl der variablen Schwerketten- als auch der variablen Leichtkettenregionen
ergeben, die zu den ScFv beitragen, einschließlich der VH-Exon-, insbesondere
VH CDR3-, JH-, Linkersequenz-, VL-Exon-, insbesondere VL CDR3- und
JL-Segmente. Im
Falle von HIb-5 und HIb-6 hat DNS-Sequenzieren insoweit die Aminosäuresequenz
der variablen Leichtkettenregionen bereitgestellt, die zu den ScFv
beitragen.
-
Diese
Technologie stellt Vorteile gegenüber bestehender Technologie
bereit, einschließlich:
- 1. Für
therapeutische Zwecke kann ein anti-Thrombozytenantikörper von
humaner Sequenz die humane anti-Mausantikörperreaktion vermeiden, die
beobachtet wird, wenn Mausantikörper
verwendet werden. Thrombozyten-GPIb ist ein wichtiges Ziel für anti-Thrombosemittel,
das erst anfängt,
anerkannt zu werden.
- 2. Die ScFv werden durch Bakterienkulturen produziert, die potentiell ökonomischer
sein können
als Säugetierzellkulturen,
die für
Mausantikörper
benötigt
werden.
- 3. Da die ScFv vollständig
geklont werden, ist die Möglichkeit,
Modifikationen an den ScFv-Grundmolekülen vorzunehmen,
leicht verfügbar.
- 4. Da diese ScFv ohne Immunisierung von Tieren selektiert wurden,
ist es möglich,
dass eines oder mehrere dieser ScFv gegen ein Epitop innerhalb von
GPIb gerichtet ist/sind, in Bezug auf welches Tiere aufgrund eines
hohen Maßes
an Strukturkonservierung über
die Arten hinweg nicht in der Lage sind, eine Immunantwort aufzubauen.
Die Griffin.1-Bibliothek wurde in solcher Weise aufgebaut, dass
ScFv, die gegen normale humane Antigene gerichtet sind, ebenfalls
in dem Repertoire enthalten sind.
-
Die
ScFv Klone wurden durch Screenen der Griffin.1-Bibliothek erhalten.
Die Schlüsselpunkte
bei diesem Screeningprozess waren, dass die ersten Schritte der
Screeningprozedur CHO-Zellen
nutzten, die rekombinantes GPIb alpha expressivierten, und dass
der Anmelder dann die Teilmenge der Bibliothek, der drei Selektionsrunden
gegenüber
diesen Zellen überlebte,
nahm, und dass der Anmelder dann in eine vierte Runde gegen normale
gewaschene humane Thrombozyten ging. Der Anmelder führte dann
zwei Endrunden aus, in denen der Anmelder versuchte, die ScFv durch
Fluten mit einer Menge an monoklonalem Mausantikörper (C-34 oder SZ-2) oder
Mimotoppeptid (AWNWRYREYV) von gewaschenen Thrombozyten zu verdrängen.
-
Die
humane synthetische VH- und VL-ScFv-Bibliothek
wurde durch erneut Klonen der variablen Schwer- und Leichtkettenregionen
aus den Lox-Bibliothekvektoren (Griffiths et al. 1994) in den Phagemidvektor
pHEN2 (siehe 1) hergestellt. Diese "Griffin.1"-Bibliothek ist eine
ScFv- Phagemidbibliothek,
die aus synthetischen V-Gensegmenten besteht. Die Internetadresse,
um die V-Gen-Keimbahnsequenzen herunter zu laden, die die Griffin.1-Bibliothek
ausmachen, lautet http://www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/vbase-questions.html.
Die variablen kappa- und lambda-Leichtkettenregionen wurden aus
den fdDOG-21oxVk- und -VL-Konstrukten PKR-amplifiziert. Die PKR-Fragmente wurden
aufgereinigt und mit ApaL1 und Not 1 aufgeschlossen. Die gelgereinigten
Fragmente wurden dann in den Vektor pHEN2 eingebunden. Variable
Schwerkettenregionen wurden von dem Vektor pUC19-21oxVH PKR-amplifiziert.
Die PKR-Fragmente
wurden aufgereinigt und mit Sfi1 und XhoI aufgeschlossen. Die gelgereinigten
Fragmente wurden dann in den Vektor Vk-pHEN2 oder VL-pHEN2 eingebunden.
-
Die
Isolation der HIb-Serie von ScFv wurde wie folgt durchgeführt:
Anfangs
drei Runden Phagemidselektion gegen transfizierte Eierstockzellen
des Chinesischen Hamsters (CHO)-Zellen, die nur die GPIb alpha-Komponente
des GPIb/IX/V-Komplexes auf ihrer Oberfläche expressivieren
- – 1012–1013 Phagemide für 1,5 h bei Raumtemperatur
mit an Kulturflasche anhaftenden transfizierten CHO-Zellen inkubiert
- – ungebundene
Phagemide durch umfangreiches Waschen entfernt
- – gebundene
Phagemide mit Triethylamin eluiert, mit Tris neutralisiert, in den
E. coli Suppressorstamm TG1 infiziert, und (unter Verwendung von
Hilfsphagen) zur Verwendung in der nächsten Runde amplifiziert
- – der
monoklonale Phagemidklon HIb-3 ist ein repräsentativer Klon aus dieser
Selektionsstufe
-
Runde
4 der Selektion: Gegen gewaschene humane Thrombozyten:
- – 1012 Phagemide mit einer Suspension von gewaschenen
Thrombozyten für
1,5 h bei Raumtemperatur inkubiert
- – ungebundenes
Phagemid durch eingehendes Waschen der Thrombozyten entfernt
- – gebundenes
Phagemid mit Triethylamin eluiert, mit Tris neutralisiert, in E.
coli, infiziert und zur Verwendung in der nächsten Runde amplifiziert
- – der
monoklonale Phagemidklon HIb-3 ist ein repräsentativer Klon aus dieser
Selektionsstufe
-
Runden
5 und 6 der Selektion: Verdrängen
von an Thrombozyten gebundenen Phagen (optional)
- – Runde
5: 1012 Phagen aus Runde 4 mit 3 × 109 gewaschenen Thrombozyten inkubiert, ungebundene
Phagen durch eingehendes Waschen entfernt, und Thrombozyten dann
in drei Aliquots aufgeteilt
- – Inkubation
von Thrombozyten für
90 min bei Raumtemperatur mit 25 μg/ml
anti-GPIb alpha-Maus-mab C-34
oder SZ-22 oder 200 μg/ml
C-34-Mimotoppeptid AWNWRYREYV
- – Phagemide
aus dem Puffer geborgen, dann in E. coli infiziert, und zur Verwendung
in der nächsten
Runde amplifiziert
- – Runde
6: amplifizierte Phagen aus der 5. Runde an gewaschene Thrombozyten
gebunden und dann mit demselben potentiellen Verdränger beansprucht,
wie er in Runde 5 verwendet wurde
-
Produktion
von ScFv von Phagemiden der Runde 6
- – aus Runde
6 geborgene Phagemide in den E. coli-Nichtsuppressorstamm HB2151
infiziert
- – monoklonale
24-Lochkulturüberstände in Westernblots
gegen Thrombozytenlysate und auf ihre Fähigkeit getestet, Ristocetin-induzierte
Aggregation von gewaschenen humanen Thrombozyten zu hemmen
- – interessierende
Klone zum DNS-Sequenzieren und für
weitere funktionale Studien an gereinigten ScFv aufskaliert
-
Diese
Arbeit verwendet ScFv-Technologie bei der Entwicklung einer neuen
Familie von Antikörpermolekülen, die
gegen humane Thrombozyten-GPIbα-Moleküle gerichtet
sind, welche ihrerseits von humanen variablen Immunglubolinsequenzen
abgeleitet sind. Als eine Alternative zu natürlichen IgG-Antikörpern, können monovalente
synthetische Antikörper
mit ansteigenden hohen Affinitäten
aus den variablen Schwerketten- und variablen Leichtkettenregionen
hergestellt werden, die durch eine Linkerregion getrennt sind. Solche
synthetischen variablen Antikörper
werden ScFv bezeichnet. Die synthetische Griffin.1-ScFv-Bibliothek,
die aus humanen VH- und VL-Keimbahnsequenzen besteht, welche für diese
Studien verwendet wurden, wurde durch das Labor von Dr. Greg Winter
vom MRC in Cambridge, UK hergestellt. Wie auf die Website (http://www.mrc-cpe.cam.ac.uk/-phage/)
dieser Laborgruppe gestellt ist, enthält diese Bibliothek exakt dieselben
synthetischen humanen V-Gene wie die synthetische humane Fab (4–12) 2Iox
Library (Griffiths, A. D. et al., (1994). EMBO J. 13, 3245-3260),
liegt aber in einem Einzelketten-Fv (scFv)-Format anstelle eines
Fab-Formats vor. Der Vektor ist auch ein Phagemid statt einer Phage;
so ist er der synthetischen humanen ScFv- Bibliothek oder "Nissim Library" (Nissim, A. et al.,
(1994). EMBO J. 13, 692-698) ähnlich,
aber ohne die Diversifizierung bei den leichten Ketten sowie den
schweren Ketten. Zusätzlich
zu der in vitro-Rekombination
von schweren und leichten Ketten, hat diese Bibliothek durch in
vitro-Zufallsverteilung
bei den hypervariablen CDR3-Regionen eine abgeschätzte Diversität von 1,2 × 109 erreicht. Die resultierenden VH- und VL-codierenden
Sequenzen wurden dann in das pHEN2-Phagemid geklont. Abhängig davon,
ob das Phagemid in einen Stamm von E. coli infiziert wird, dem es
an einem Supressor für
den Bernstein-Kodon fehlt oder der einen solchen besitzt, kann man
dann entweder Nachkommenphagemid erhalten, das die ScFv in Fusion
mit einem Hauptphagenmantelprotein oder eine sekretierte Form der
ScFv expressiviert. Die sekretierten ScFv enthalten auch einen 6x-His-Anang,
der bei Proteinaufreinigung verwendet werden kann, und einen c-myc-Anhang
für die
Detektion mit anti-c-myc-Antikörper,
wie beispielsweise 9E10.
-
Für die vorliegenden
Studien wurde die Anfangsrunde der Phagemidselektion gegen transfizierte
Eierstockzellen des Chinesischen Hamsters (CHO-Zellen) durchgeführt, die
nur die GPIbα-Komponente
des GPIb/IX/V-Komplexes an ihrer Oberfläche expressivierten. 1012–1013 Phagemide wurden für 1,5 h bei Raumtemperatur
mit transfizierten CHO-Zellen inkubiert, die an Kulturflaschen anhafteten.
Ungebundene Phagemide wurden dann durch eingehendes Waschen entfernt,
und gebundene Phagemide wurden mit Triethylamin eluiert, mit Tris
neutralisiert, in den E. coli-Supressorstamm TG1 infiziert und dann
(unter Verwendung von Helferphagen) zur Verwendung in der nächsten Runde
amplifiziert. Dieser Prozess wurde für zwei zusätzliche Runden wiederholt.
-
Für die vierte
Runde der Selektion führten
wir einen „Überkreuz
(engl.: crossover)"-Schritt
unter Verwendung humaner Thrombozyten durch. Wir zielten durch diesen
Ansatz darauf ab, Phagemid signifikant anzureichern, die Epitope
erkennen, welche nur sowohl auf den CHO-Zellen als auch den Thrombozyten vorliegen,
um dadurch die Chancen zu erhöhen,
ScFv mit Spezifizitäten
für GPIbα zu finden.
Der monoklonale Phagemidklon HIb-3 ist ein repräsentativer Klon aus dieser
Selektionsstufe. Während
die polyklonale Sammlung aller Phagemide der vierten Runde GPIbα in Westernblots
identifizierte, taten es die meisten getesteten einzelnen Klone
nicht. Darüberhinaus
ergab die zufällige
Umwandlung von Phagemidklonen der Runde 4 in lösliche ScFv keine ScFv, die
eine hemmende Aktivität
in Funktionstests ergaben.
-
Wir
schritten entsprechend zu weiteren Runden fort, die dazu ausgelegt
waren, die Selektion auf Epitope zu richten, die für die vWF-bindende
Funktion, GPIbα am
meisten relevant sind. In Hinblick auf dieses Ziel wurden Phagen
aus Runde 4 mit gewaschenen Thrombozyten inkubiert, und ungebundene
Phagen wurden durch umfangreiches Waschen entfernt. Thrombozyten
wurden dann weiter mit gesättigten
Konzentrationen der anti-GPIbα-Maus-mab
C-34 oder SZ-2 oder mit C-34 Mimotoppeptid inkubiert, von denen
wir zuvor gezeigt haben, dass sie mit Thrombozyten um die Bindung
an C-34 in Wettbewerb treten. Phagen, die in diesem Puffer nach
diesen Inkubationen geborgen wurden, wurden amplifiziert und dann
in einer sechsten und letzten Runde verwendet, in der die Verdrängung von
Phagen erneut mit demselben mab oder Peptid versucht wurde, der/das
in der vorherigen Runde verwendet wurde.
-
Phagemide,
die aus der sechsten Runde geborgen wurden, wurden direkt in den
E. coli-Nichtsuppressorstamm HB2151 infiziert. Sekretierte ScFv
von Übernachtüberständen wurden
in Westernblots gegen Thrombozytenlysate getestet und auf ihre Fähigkeit überprüft, Ristocetininduzierte
Aggregation von gewaschenen humanen Thrombozyten zu hemmen. Interessierende
Klone wurden dann für
weitere Studien ausgewählt.
Ein besonders vorstechender Klon (HIb-1) wurde beobachtet, egal
ob SZ-2, C-34 oder C-34 Mimotoppeptid als Verdränger verwendet wurde. Ein Klon
HIb-2 wurde nur dann gesehen, wenn SZ-2 als Verdränger verwendet
wurde. Ein Klon HIb-3, wie er oben erwähnt wurde, wurde aus einer
früheren
Selektionsrunde erhalten. Klone HIb-5 und HIb-6 wurden in dem Puffer
geborgen, wenn C-34-Momotoppeptid als Verdränger verwendet wurde.
-
Die
gereinigten HIb-ScFv hatten, egal ob sie von Kulturüberständen oder
aus periplasmischen Räumen
aufgereinigt wurden, das vorhergesagte Molekulargewicht von 39 kDa.
Dies ist in 10 illustriert, wo sowohl rohe Überstände als
auch aufgereinigte periplasmische Fraktionen von einer E. coli-Kultur
auf SDS-Polyakrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) laufen gelassen,
elektrogeblottet und dann mit dem monoklonalen Mausantikörper 9E10
inkubiert wurden, der den c-myc-Epitopanhang erkennt, der innerhalb
der sekretierten ScFv enthalten ist. Peroxidasekonjugierter sekundärer anti-Mausantikörper wurde
dann verwendet, um die Anwesenheit von gebundnem 9E10 zu detektieren.
-
Die
Bindungsspezifizität
von selektierten Klonen bezüglich
der Epitopzellen, die von humanen Thrombozyten erhalten wurden,
wurde ebenfalls durch Immunblotten bestätigt. Detergentlysate von Thrombozyten, die
aus humanem Blut erhalten wurden, wurden präpariert und wurden entweder
unter nicht reduzierenden Bedingungen oder nach Reduktion mit b-Mercaptoethanol
durch SDS-PAGE elektrophoresiert. GPIbα hat eine scheinbare molekulare
Masse von 135-140 kDa, wenn es in diesem System unter reduzierenden
Bedingungen elektrophoresiert wird, wandert aber unter nicht reduzierenden
Bedingungen charakteristisch mit einer scheinbaren Molekularmasse
im 160 bis 170 kDa-Bereich, was die zusätzliche Masse von GPIbB widerspiegelt,
das in dem nicht reduzierten, nativen Zustand kovalent gebunden
ist. Nach dem Elektroblotten auf eine Membran wurden die elektrophoresierten
Thrombozytenlysate dann entweder mit dem gut etablierten monoklonalen
anti-GPIbα-Mausantikörper SZ-2
oder mit einem Produkt eines der selektierten Klone getestet. Detektion
von Bindung des SZ-2 verwendete einen Peroxidase-markierten sekundären anti-Mausantikörper, wie
oben beschrieben ist. In den früheren
Selektionsrunden wurden Phagemide von selektierten Klonen direkt
mit den Blots inkubiert, und nach Waschungen wurde die Restbindung
von Phagemiden durch die Verwendung eines Anti-M13-Bakteriophagenantikörpers detektiert,
da das M13-Oberflächenepitop
für diesen
Antikörper
bei den pHEN2-Phagemiden erhalten ist. Dieser Ansatz erlaubte eine
schnelle Unterscheidung zwischen Klonen von Phagemiden, die das
Bindungsmuster nachahmen, das mit SZ-2 gesehen wird, und denjenigen,
die dies nicht tun. Nach den späteren
Selektionsrunden jedoch, als sekretierte klonale ScFv verfügbar wurden,
wurden die ScFv anstelle von tatsächlichen Phagemiden beim Immunblotten
verwendet. So zeigten alle ScFv, die von den Klonen HIb-1, HIb-2,
HIb-5 und HIb-6 sekretiert wurden, wenn sie als primäre Antikörper in
einem Westerblot gegen humane Thrombozytenlysate verwendet wurden,
ein Muster, das dicht dasjenige von monoklonalem Mausantikörper SZ-2
nachahmt. Ein Beispiel hierfür
ist in 11 für HIb-1- und HIb-2-ScFv gezeigt.
Nach der anfänglichen
Inkubation mit und auf nachfolgende Waschungen der Membranen mit
den angegebenen ScFv folgend wurden sekundärer Antikörper 9E10 und anschließend Peroxidase-konjugierter
Anti-Mausantikörper mit
der Membran inkubiert und Färbung
mit Peroxidasesubstrat entwickelt. Wie in diesem Beispiel gesehen werden
kann, waren die Produkte der selektierten Klone in der Lage, Bänder zu
erkennen, die die Migrationseigenschaften von GPIbα sowohl unter
nichtreduzierenden als auch unter reduzierenden Bedingungen haben.
-
Die
Fähigkeit
von Produkten von den selektieren Klonen, Thrombozytenfunktion zu
hemmen, wurde durch Thrombozytenaggregation getestet. Da eine Hauptfunktion
von GPIbα seine
Rolle als Rezeptor für
den adhäsiven
Liganden von Willebrand Faktor (vWF) ist, war die vWF-abhängige Thrombozytenaggregation
von besonderem Interesse. In vitro wird die Aggregation, die die
Bindung von vWF an Thrombozyten-GPIb einbezieht, konventionell unter
Verwendung von entweder Ristocetin oder Botrocetin als Mittlersubstanzen
getestet. Von ScFv, die von den Klonen HIbB-1, HIbB-2, HIbB-5 und
HIbB-6 erhalten wurden, wurde herausgefunden, dass sie vWF-abhängige Thrombozytenaggregation
hemmen, die durch mindestens eine dieser Mittlersubstanzen induziert
wird. Im Falle von HIB-3 zeigte das Phagemid selbst in einem Aggregationstest
hemmende Aktivität.
-
Ein
repräsentatives
Beispiel der Hemmung auf dem Phagemidniveau ist in 12 gezeigt.
Humane Thrombozyten, die Formalin-fixiert waren, wurden in einer
Thrombozytenendkonzentration von 150.000/μl in Puffer suspendiert, der
5 μg/ml
gereinigten vWF enthielt, zu einer Cuvette mit einem Rührstab gegeben
und bei 1200 U/min, 37°C
in einem Chronolog Aggregometer gerührt. Ristocetin wurde dann
in variierenden Endkonzentrationen zugegeben, und die resultierende Änderung
der Lichttransmission wurde als Indikator der Thrombozytenaggregation
verwendet. Wie in der Figur gesehen werden kann, ergab in diesem
System selbst Vorinkubation der Thrombozyten (bei 150.000/μl) für 1,5 h
mit 1 × 1012 HibB-3-Phagemid eine totale Hemmung der
Thrombozytenaggregation bei Ristocetin-Konzentrationen von oder weniger als
0,35 mg/ml, und selbst bei einer Ristocetinkonzentration so hoch
wie 1,0 mg/ml entwickelte sie eine fortgesetzte starke Hemmung.
Im Gegensatz dazu wurde in der Anwesenheit einer gleichen Konzentration
an Phagemid, das keine Aktivität
gegen Thrombozyten-GPIbα zeigte
(Kontrollphagemid), eine volle Aggregationsantwort bei 0,5 mg/,l
Ristocetin erreicht, wobei moderate Aggregationsantworten in dem
Bereich von 0,3 bis 0,35 mg/ml Ristocetin beobachtet wurden. (Beachte
dass die Formalin fixierten Thrombozyten charakteristischer Weise
in der Gegenwart geringerer Konzentrationen an Ristocetin aggregiert
werden, als sie üblicherweise
bei nicht fixierten Thrombozyten erforderlich sind.)
-
Ein
repräsentatives
Beispiel für
Inhibierung auf dem ScFv-Niveau ist in 13 gezeigt.
Fixierte humane Thrombozyten wurden erneut unter ähnlichen
Bedingungen wie die zuvor beschriebenen verwendet. Bei diesem Experiment
wurden Formalin-fixierte humane Thrombozyten bei einer Konzentration
von 150.000/μl
für 1,5
h mit HIB-ScFv bei der angegebenen Endkonzentration inkubiert. Gereinigter
vWF wurde dann auf eine Endkonzentration von 5 μg/ml zugegeben, die Probe wurde
in der oben beschriebenen Weise in das Aggregometer gegeben, und
Botrocetin wurde in einer Endkonzentration von 0,6 μg/ml zugegeben,
um die Aggregation zu initiieren. Bei diesem Beispiel wird die Rate
der Lichttransmissionsänderung
in dem Aggregometer als Index der Aggregation verwendet. Recht starke
(> 75 %) Hemmung der
Aggregationsantwort wird beobachtet, wenn die Thrombozyten mit 12 μg/ml HIB-1
vorinkubiert wurden. Eine halbe maximale Hemmung wird charakteristischer
Weise in dem Bereich von 5 bis 10 μg/ml HIb-1 beobachtet. Ähnliche
Resultate werden erhalten, wenn Ristocetin als Agonist verwendet
wird. HIB-2-ScFv inhibieren in ähnlicher
Weise die Aggregation von humanen Thromozyten, die entweder durch
Ristocetin oder Botrocetin moduliert ist. NIB-2-ScFv zeigen auch
eine halbe maximale Hemmung solcher vWF-abhängiger Thromozytenaggregation
in dem Bereich von 5–10 μg/ml ScFv,
wobei das maximale Maß solcher
Hemmung mit dem vergleichbar ist, was bei HIB-1 beobachtet wird,
oder sogar noch darüber
hinaus geht. Während
HIB-5 und HIB-6 auch Hemmung in Bezug auf vWF-abhängige Thrombozytenaggregation
entwickeln, wurde das maximale Maß dieser Hemmung als schwächer beobachtet
als dasjenige, das mit HIB-1 oder HIB-2 erhalten wurde, und erreichte
nur einen Bereich von 20 bis 30 % Hemmung der ungehemmten Aggregationsantwort.
-
Ein
weiteres respräsentatives
Beispiel, das in diesem Fall die Fähigkeit, hemmende Aktivität in Bezug auf
nicht fixierte humane Thrombozyten zu entwickeln, von ScFv, die
von den HIB-Klonen
aufgereinigt wurden, demonstriert, ist in 14 gezeigt.
Hier sind die hemmenden Effekte einer einstündigen Inkubation von Thrombozyten
(150.000 Thrombozyten/μl)
mit entweder HIB-2-ScFv oder mit dem intakten (d. h. vollständigen IgG) monoklonalen
Mausantikörper
SZ-2 direkt verglichen. In diesem Beispiel wurde das thrombozytenreiche
Plasma (platelet-rich plasma = P. P.) durch Zentrifugieren von frisch
abgenommenem zitriertem humanem Blut präpariert, und das P. P. wurde
dann in dem Thrombozytenaggregometer unter ähnlichen Bedingungen wie oben beschrieben
untersucht. Es kann gesehen werden, dass HIB-2 bei einer Konzentration von 10 μg/ml in der Lage
war, ein Maß an
Aggregation zu produzieren, das gut vergleichbar mit dem war, das
bei SZ-2 bei derselben Endkonzentration gesehen wird.
-
Diese
Arbeit demonstriert damit die Entdeckung einer auf der Basis der
oben beschriebenen Selektionsstrategie selektierten Gruppe von ScFv,
von denen herausgefunden wurde, dass sie vWF-abhängige Thrombozytenaggregation
hemmen, welche durch Botrocetin oder Ristocetin induziert wird,
und die tatsächlich
Epitope innerhalb des humanen Thrombozyten-GPIbα spezifisch erkennen, welche
SDS-Denaturierung sowie Reduktion mit Mercaptoethanol überleben.
-
Obwohl
bevorzugte Ausführungsformen
hier im Detail dargestellt und beschrieben worden sind, wird es
dem Fachmann klar sein, dass verschiedene Modifikationen, Ergänzungen,
Substitutionen und dgl. gemacht werden können, ohne von dem Geist der
Erfindung abzuweichen, und diese werden deshalb als in dem Bereich
der vorliegenden Erfindung liegend betrachtet, wie er in den folgenden
Patentansprüchen
definiert ist.
-
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