WO1998055619A1

WO1998055619A1 - Anti-gpiib/iiia rekombinante antikörper

Info

Publication number: WO1998055619A1
Application number: PCT/EP1998/003397
Authority: WO
Inventors: Peter Berchtold; Robert F. A. Escher
Original assignee: Asat Ag Applied Science & Technology
Priority date: 1997-06-06
Filing date: 1998-06-05
Publication date: 1998-12-10
Also published as: EP0990034A1; JP2001513652A; US20040202659A1; US6790938B1; CA2293693A1; CN1163599C; AU8436798A; CN1263556A; AU745965B2

Abstract

Die Erfindung betrifft neue Nukleinsäuresequenzen, die für humane Autoantikörper und antiidiotypische Antikörper gegen Blutplättchen-Membranproteine kodieren, neue Aminosäuresequenzen von humanen Antikörpern und deren Verwendung für die Diagnostik und Therapie von Krankheiten.

Description

ANTI-GPIIB/IIIA REKOMBINANTE ANTIKÖRPER

Beschreibung

Die Erfindung betrifft neue Nukleinsäuresequenzen, die für humane Autoantikörper gegen Blutplättchen-Membranproteine und für antiidioty- pische Antikörper kodieren, neue Aminosäuresequenzen von humanen Antikörpern und deren Verwendung für die Diagnostik und Therapie von Krankheiten.

Autoimmun-thrombozytopenische Purpura (AlTP) ist eine Immunkrankheit, die durch eine geringe Blutplättchenzahl bei normaler oder gesteigerter Megakaryozytopoiese definiert ist. Aufgrund des Vorhandenseins von Anti- Plättchen-Autoantikörpern findet eine verstärkte Zerstörung von Plättchen im reticuloendothelialen System (Milz, Leber, Knochenmark) statt. Diese Autoantikörper, die in etwa 75% der AlTP Patienten nachgewiesen werden können, sind überwiegend gegen die Plättchenmembran-Glykoproteine (GP) llb/llla und Ib/IX gerichtet. In einem einzigen Patienten können mehrere verschiedene Auto-Antikörper-Spezifitäten gefunden werden (vgl. z.B. Berchtold und Wenger, Blood 81 ( 1 993), 1 246-1 250; Kiefel et al., Br. J. Haematol. 79 ( 1 991 ), 256-262; McMillan et al., Blood 70 ( 1 987), 1040 und Fujisawa et al., Blood 79 (1 991 ); 1441 ). Die Charakterisierung von Bindeepitopen und die Ermittlung der pathogenetischen Signifikanz der Autoantikörper bleibt jedoch schwierig aufgrund der beschränkten Menge an Autoantikörpern, die aus AlTP Patienten erhältlich sind. Unter Verwendung der Hybridomatechnik konnten nur wenige humane monoklonale Antikörper aus Lymphozyten von AlTP Patienten erhalten werden, die mit GPIIb/llla reagieren (Kunicki et al., Hum. Antibodies Hybridomas 1 ( 1 990), 83-95) . Auch bei gesunden Personen wurde das Auftreten natürlicher Autoantikörper gegen verschiedene Selbstantigene berichtet, beispielsweise gegen intrazelluläre und zytoskelettale Komponenten humaner Plättchen (Guilbert et al., J. Immunol. 1 28 (1 982), 2779-2787; Hurez et al., Eur. J. Immunol. 23 ( 1 993), 783-789 und Pfueller et al., Clin. Exp. Immunol. 79 (1 990), 367-373). Einige dieser im Serum gesunder Personen beobachteten Autoantikörper können auch gegen Plättchenmembranproteine gerichtet sein (Souberbielle, Eur. J. Haematol. 56 ( 1 996), 1 78-1 80) . Die Rolle dieser natürlichen Autoantikörper sowie ihre Beziehung zu Krankheits-assoziierten Autoantikörpern ist jedoch noch unbekannt.

Zur Behandlung von AlTP können Corticosteroide eingesetzt werden. Etwa die Hälfte der Patienten reagiert auf eine Verabreichung von Prednison innerhalb von 4 Wochen, Langzeitremissionen werden jedoch nur selten gefunden. Bei Patienten, die starke Blutungen oder extrem geringe Plättchenzahlen aufweisen, wird als Notfallbehandlung die Verabreichung hoher Dosen von intravenösem Immunglubolin (IVIgG) empfohlen. Nach dieser Behandlung folgt ein schneller, aber üblicherweise nur vorübergehender Anstieg der Plättchenzahl bei den meisten Patienten. Die Wirkmechanismen von Corticosteroiden sowie von IVIgG bei der Behandlung der AlTP sind noch unbekannt. Durch Untersuchungen von Berchtold et al., (Blood 74 ( 1 989), 2414-241 7 und Berchtold und Wenger, Blood 81 (1 993), 1 246- 1 250) ist bekannt, daß die Bindung von Autoantikörpern an Plättchen- Glykoproteine durch antiidiotypische Antikörper in IVIgG gehemmt werden kann.

Das der vorliegenden Anmeldung zugrundeliegende Problem besteht darin, neue DNA Sequenzen zu identifizieren, welche für die Bindung von Autoantikörpern an GPIIb/llla verantwortlich sind. Auf diese Weise können neue pharmazeutische Präparate bereitgestellt werden, welche zur Verbesserung der Diagnose und Therapie von AlTP eingesetzt werden können. Die Identifizierung von Bindesequenzen aus Autoantikörpern gelang überraschenderweise nach Herstellung einer kombinatorischen Phagemid- Displaybibliothek von schweren und leichten Ketten humaner Antikörper unter Verwendung peripherer zirkulierender B-Zellen eines gesunden humanen Spenders. Nach Präsentation humaner schwerer und leichter Antikörper Fab-Fragmente an der Oberfläche des filamentösen Phagen M 1 3 konnten Phagen-Klone identifiziert werden, welche eine spezifische Bindung an GPIIb/llla zeigen.

Hierzu wurde die Phagemid-Bibliothek aufeinanderfolgend mit thrombasthe- nischen Plättchen ohne GPIIb/llla (negative Selektion) und normalen Plättchen (positive Selektion) in Kontakt gebracht. Nach mehreren Runden der Selektion und Amplifikation durch Infektion von E.coli wurden 23 Klone erhalten, die an den GPIIb/llla Komplex binden können. Inhibierungsstudien unter Verwendung Pools monoklonaler Antikörper gegen GPIIb/llla ergaben zwei Gruppen von Klonen: Beide Gruppen wurden durch monoklonale Antikörper, die spezifisch für den GPIIb/llla Komplex waren, inhibiert, und eine Gruppe auch durch einen GPIIb spezifischen monoklonalen Antikörper. Diese Befunde wurden durch DNA-Analyse der Klone bestätigt, die das Vorhandensein von 2 unterschiedlichen Anti-GPIIb/llla Phagen-Klonen ergab. Diese Ergebnisse zeigen, daß 2 GPIIb/llla spezifische Phagen-Klone, d.h. Autoantikörper, aus dem Genom einer gesunden Person kloniert werden können und daß diese Klone Konformationsepitope des GPIIb/llla Komplexes erkennen können. Durch Inhibierungsstudien wurde weiterhin festgestellt, daß beide Phagen-Klone die Bindung von Plättchen-assoziierten Autoantikörpern aus Patienten mit AlTP an gereinigtes GPIIb/llla hemmen und somit vermutlich AlTP-assoziierte Epitope von GPIIb/llla erkennen. Da die Phagen-Klone die Antigenbindesequenzen natürlicher Autoantikörper enthalten, die aus dem Genom einer gesunden Person stammen, kann dieser Befund zu neuen Erkenntnissen über den Ursprung Plättchen-assoziierter Autoantikörper in AlTP führen. Darüber hinaus ist es unter Verwendung der erfindungsgemäßen Phagen- Klone möglich, rekombinante antiidiotypische Antikörper gegen Anti- GPIIb/Illa Autoantikörper zu erzeugen, wobei die Anti-GPIIb/llla Phagen- Klone als Antigen verwendet werden. Die auf diese Weise erhältlichen rekombinanten antiidiotypischen Antikörper stellen eine interessante klinische Alternative zur Verwendung von IVIgG dar.

Die Nukleotid- und davon abgeleitete Aminosäuresequenzen der identifizierten Phagen-Klone sind in den Sequenzprotokollen SEQ ID No.1 bis 8 (Autoantikörper) bzw. SEQ ID No. 9 bis 1 8 (antiidiotypische Antikörper) dargestellt.

I . Autoantikörper

Ein erster Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft Nukleinsäuren, die für Autoantikörper kodieren. Ein Gegenstand der Erfindung ist somit eine Nukleinsäure, die für die schwere Kette eines humanen Antikörpers, ein funktionelles Derivat oder ein Fragment davon kodiert und eine CDR3- Region umfaßt, ausgewählt aus: (a) einer für die Aminosäuresequenz:

V L P F D P I S M D V (I) kodierenden Nukleotidsequenz,

(b) einer für die Aminosäuresequenz: A L G S W G G W D H Y M D V (II) kodierenden Nukleotidsequenz,

(c) einer Nukleotidsequenz, die für eine Aminosäuresequenz von mindestens 80% und vorzugsweise von mindestens 90% zu einer Aminosäuresequenz aus (a) oder (b) kodiert und

(d) einer Nukleotidsequenz, die für eine Aminosäuresequenz mit einer äquivalenten Bindefähigkeit an GPIIb/llla kodiert. Die erfindungsgemäße Nukleinsäure umfaßt weiterhin vorzugsweise eine CDR1 -Region ausgewählt aus

(a) einer für die Aminosäuresequenz:

G Y S W R (III) kodierenden Nukleotidsequenz,

(b) einer für die Aminosäuresequenz:

S Y A M H QV) kodierenden Nukleotidsequenz und

(c) einer Nukleotidsequenz, die für eine Aminosäuresequenz mit einer Homologie von mindestens 80% und vorzugsweise mindestens 90% zu einer Aminosäuresequenz aus (a) oder (b) kodiert.

Vorzugsweise umfaßt die erfindungsgemäße Nukleinsäure weiterhin eine CDR2-Region ausgewählt:

(a) einer für die Aminosäuresequenz: D I SY S G ST KY K P S L R S (V) kodierenden Nukleotidsequenz,

(b) einer für die Aminosäuresequenz: V I SY D G S N KYYA D SV K G (Vl) kodierenden Nukleotidsequenz und

(c) einer Nukleotidsequenz, die für eine Aminosäuresequenz mit einer Homologie von mindestens 80% und vorzugsweise von mindestens 90% zu einer Aminosäuresequenz aus (a) oder (b) kodiert.

Ein zweiter Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine Nukleinsäure, die für die leichte Kette eines humanen Antikörpers, ein funktionelles Derivat oder ein Fragment davon kodiert und eine CDR3-Region umfaßt, ausgewählt aus: (a) einer für die Aminosäuresequenz:

A TW D D G L N G PV (VII) kodierenden Nukleotidsequenz, (b) einer für die Aminosäuresequenz:

A AW D D S L N G WV (VIII) kodierenden Nukleotidsequenz, (c) einer Nukleotidsequenz, die für eine Aminosäuresequenz mit einer Homologie von mindestens 80% und vorzugsweise von mindestens 90% zu einer Aminosäuresequenz aus (a) oder (b) kodiert und (d) einer Nukleotidsequenz, die für eine Aminosäuresequenz mit einer äquivalenten Bindefähigkeit an GPIIb/llla kodiert.

Vorzugsweise umfaßt die erfindungsgemäße Nukleinsäure weiterhin eine CDR1 -Region ausgewählt aus:

(a) einer für die Aminosäuresequenz: S G S S S N I R S N PV S (IX) kodierenden Nukleotidsequenz,

(b) einer für die Aminosäuresequenz: S G S S S N I G S N TV N (X) kodierenden Nukleotidsequenz und (c) einer Nukleotidsequenz, die für eine Aminosäuresequenz mit einer Homologie von mindestens 80% und vorzugsweise von mindestens 90% zu einer Aminosäuresequenz aus (a) oder (b) kodiert.

Darüber hinaus umfaßt die erfindungsgemäße Nukleinsäure vorzugsweise weiterhin eine CDR2-Region ausgewählt aus: (a) einer für die Aminosäuresequenz:

G S H Q R P S (XI) kodierenden Nukleotidsequenz, (b) einer für die Aminosäuresequenz:

S N N Q R P S (XII) kodierenden Nukleotidsequenz und (c) einer Nukleotidsequenz, die für eine Aminosäuresequenz mit einer Homologie von mindestens 80% und vorzugsweise mindestens 90% zu einer Aminosäuresequenz aus (a) oder (b) kodiert.

Antiidiotypische Antikörper

Ein zweiter Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft Nukleinsäuren, die für antiidiotypische Antikörper kodieren. Ein Gegenstand der.Erfindungist somit eine Nukleinsäure, die für die schwere Kette eines humanen Antikörpers, ein funktionelles Derivat oder ein Fragment davon kodiert, und eine CDR3- Region umfaßt, ausgewählt aus:

(a) einer für die Aminosäuresequenz: V R D LG Y RV LST FT F D I (XIII) kodierenden Nukleotidsequenz,

(b) einer für die Aminosäuresequenz: D G R S G SYA R F D G M DV (XIV) kodierenden Nukleotidsequenz,

(c) einer für die Aminosäuresequenz: M G S S V V A T Y N A F D I (XV) kodierenden Nukleotidsequenz,

(d) einer für die Aminosäuresequenz: D A D G D G F S PYY F PY (XVI) kodierenden Nukleotidsequenz, (e) einer für die Aminosäuresequenz:

L R N D G W N D G F D I (XVII) kodierenden Nukleotidsequenz,

(f) einer für die Aminosäuresequenz: D S E T A I A A A G R F D I (XVIII) kodierenden Nukleotidsequenz,

(g) einer für die Aminosäuresequenz: E D G TTV P S Q P LE F (XIX) kodierenden Nukleotidsequenz, (h) einer für die Aminosäuresequenz:

GSGSYLGYYFDY (XX) kodierenden Nukleotidsequenz, (i) einer für die Aminosäuresequenz:

G L R S Y N Y G R N L DY (XXI) kodierenden Nukleotidsequenz, (j) einer Nukleotidsequenz, die für eine Aminosäuresequenz mit einer Homologie von mindestens 80% und vorzugsweise von mindestens 90% zu einer Aminosäuresequenz aus (a), (b), (c) oder (d) kodiert und (k) einer Nukleotidsequenz, die für eine Aminosäuresequenz mit einer äquivalenten Bindefähigkeit an Autoantikörper gegen

GPIIb/llla kodiert.

Die erfindungsgemäße Nukleinsäure umfaßt weiterhin vorzugsweise eine CDR1 -Region ausgewählt aus: einer für die in Tab. 7a gezeigten Aminosäuresequenzen N F A M S, S Y T M H, D Y A L H oder S H Y W S kodierenden Nukleotidsequenz, einer für die Aminosäuresequenz T Y Y W S kodierenden Nukleotidsequenz, einer für die in Tab. 7b gezeigten Aminosäuresequenzen D Y G M H, S H T I S, K Y A I H oder E L S M H kodierenden Nukleotidsequenz und einer Nukleotidsequenz, die für eine Aminosäuresequenz mit einer Homologie von mindestens 80% und vorzugsweise mindestens 90% zu einer der zuvor genannten Aminosäurese- quenzen kodiert.

Vorzugsweise umfaßt die erfindungsgemäße Nukleinsäure weiterhin eine CDR2- Region ausgewählt aus einer für die in Tab.7a gezeigten Aminosäuresequenzen G I S G G G LLT H YA (D/N) SVK G, L I SY D G S N KY Y A D S V K G, G I SW D STS I G Y A D SV K G oder F I Y D G A R T RFN PSLRS kodierenden Nukleotidsequenz, einer für die Aminosäuresequenz YIYYSGNTNYNPSLKS kodierenden Nukleotidsequenz, einer für die in Tab.7b gezeigten Aminosäuresequenzen A I SY D G S N K YYA D S V K G, G I T P I F G TV N YA Q K F QG, A I S S N G G NTYYA D S V K G oder G FD PE D G E TIY AQ K F QG kodierenden Nukleotidsequenz und einer Nukleotidsequenz, die für eine Aminosäuresequenz mit einer Homologie von mindestens 80% und vorzugsweise von mindestens 90% zu einer der zuvor genannten Aminosäuresequenzen kodiert.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Nukleinsäure, die für die leichte Kette eines humanen Antikörpers, ein funktionelles Derivat oder ein Fragment davon kodiert und eine CDR3-Region umfaßt, ausgewählt aus:

(a) einer für die Aminosäuresequenz: C SYV H S ST N (XXII) kodierenden Nukleotidsequenz,

(b) einer für die Aminosäuresequenz: QVW D N T N D Q (XXIII) kodierenden Nukleotidsequenz,

(c) einer Nukleotidsequenz, die für eine Aminosäuresequenz mit einer Homologie von mindestens 80% und vorzugsweise mindestens 90% zu einer Aminosäuresequenz aus (a) kodiert und

(d) einer Nukleotidsequenz, die für eine Aminosäuresequenz mit einer äquivalenten Bindefähigkeit an Autoantikörper gegen GPIIb/llla kodiert.

Vorzugsweise umfaßt die erfindungsgemäße Nukleinsäure weiterhin eine CDR1 -Region ausgewählt aus einer für die in Tab.7a gezeigte Aminosäuresequenz TGTS SAI G NYN FVP kodierenden Nukleotidsequenz, einer für die in Tab. 7b gezeigte Aminosäuresequenz G G Y K I G S K S V H kodierenden Nukleotidsequenz und einer Nukleotidsequenz, die für eine Aminosäuresequenz mit einer Homologie von mindestens 80% und vorzugsweise von mindestens 90% zur der zuvor genannten Aminosäuresequenz kodiert.

Darüber hinaus umfaßt die erfindungsgemäße Nukleinsäure vorzugsweise weiterhin eine CDR2-Region ausgewählt aus einer für die in Tab. 7a gezeigte Aminosäuresequenz E G S K R P S kodierenden Nukleotidsequenz, einer für die in Tab. 7b gezeigte Aminosäuresequenz E D S Y R P S kodierenden Nukleotidsequenz und einer Nukleotidsequenz, die für eine Aminosäuresequenz mit einer Homologie von mindestens 80% und vorzugsweise mindestens 90% zu der zuvor genannten Aminosäuresequenz kodiert.

Unter dem Begriff "funktionelles Derivat einer Kette eines humanen Antikörpers" im Sinne der vorliegenden Erfindung ist ein Polypeptid zu verstehen, das mindestens eine CDR3-Region der schweren oder/und leichten Kette wie vorstehend definiert umfaßt und gegebenenfalls zusammen mit der jeweiligen komplementären Kette des humanen Antikörpers (oder einem Derivat einer solchen Kette) ein Antikörperderivat bilden kann, das eine äquivalente Erkennungsspezifität für ein Antigen wie der nicht derivatisierte Antikörper besitzt. Vorzugsweise weist ein derartiges Antikörperderivat eine Bindungskonstante von mindestens 1 0^"6 l/mol, vorzugsweise von mindestens 10^"8 l/mol für das jeweilige Antigen auf.

Die Herstellung funktioneller Derivate von Ketten eines humanen Antikörpers kann beispielsweise durch Deletion, Substitution oder/und Insertion von Abschnitten des für das jeweilige Polypeptid kodierenden Gens durch re- kombinante DNA-Techniken erfolgen.

Besonders bevorzugte funktioneile Derivate von Antikörperketten oder Antikörper sind Einzelkettenantikörper, die beispielsweise aus den variablen

Domänen der H- und L-Kette oder einer oder zwei H-Kettendomänen sowie gegebenenfalls einer konstanten Domäne zusammengesetzt sein können. Die Herstellung solcher Konstrukte ist bei Hoogenboom et al., Immunol. Rev. 1 30 ( 1 992), 41 -68; Barbas III, Methods: Companion Methods Enzymol. 2 ( 1 991 ), 1 1 9 und Plückthun, Immunochemistry (1 994), Marcel Dekker Inc., Kapitel 9, 210-235 beschrieben.

Unter dem Begriff "äquivalente Bindefähigkeit" im Sinne der vorliegenden Erfindung ist eine gleiche Bindeaffinität oder/und Spezifität, d.h. Epi- toperkennung wie in den konkret offenbarten Sequenzen zu verstehen.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Vektor, der mindestens eine Kopie einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure enthält. Dieser Vektor kann ein prokaryontischer Vektor oder ein eukaryontischer Vektor sein. Beispiele für prokaryontische Vektoren sind Plasmide, Cosmide und Bakteriophagen. Derartige Vektoren sind beispielsweise bei Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd Eddition ( 1 989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, in den Kapiteln 1 bis 4 ausführlich beschrieben. Vorzugsweise ist ein prokaryontischer Vektor ein Plasmid oder ein Phage.

Andererseits kann der Vektor auch ein eukaryontischer Vektor sein, z.B. ein Hefevektor, ein Insektenvektor (Baculovirus) oder ein Säugervektor (Plasmidvektor oder viraler Vektor). Beispiele für eukaryontische Vektoren sind bei Sambrook et al., supra, Kapitel 1 6 und Winnacker, Gene und Klone, Eine Einführung für die Gentechnologie ( 1 985), VCH Verlagsgesellschaft insbesondere Kapitel 5, 8 und 1 0, beschrieben.

Noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Zelle, die eine erfindungsgemäße Nukleinsäure exprimiert, oder eine Zelle, die mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure oder mit einem erfindungsgemäßen Vektor transformiert ist. Die Zelle kann eine prokaryontische Zelle (z.B. eine gram-negative Bakterienzelle, insbesondere E.coli) oder eine eukaryontische Zelle (z.B. eine Hefe-, Pflanzen- oder Säugerzelle) sein. Beispiele für geeignete Zellen und Verfahren zum Einführen der erfindungsgemäßen Nukleinsäure in derartige Zellen finden sich den obigen Literaturstellen.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Polypeptid, das von einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure kodiert ist, insbesondere ein rekombinantes Polypeptid. Besonders bevorzugt enthält das Polypeptid die variable Domäne der H- oder/und L-Kette eines humanen Antikörpers.

Besonders bevorzugt ist ein Polypeptid, das Antikörpereigenschaften aufweist und aus einer schweren Kette oder einem funktioneilen Derivat davon sowie aus einer leichten Kette oder einem funktionellen Derivat davon als Untereinheiten aufgebaut ist. Das Polypeptid kann aus zwei separaten Ketten zusammengesetzt sein oder als Einzelkettenpolypeptid vorliegen.

Noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Antikörper gegen ein erfindungsgemäßes Polypeptid, der gegen ein für die Erkennung des Antigens verantwortliche Region des Polypeptids gerichtet ist. Dieser Antikörper kann ein polyklonales Antiserum, ein monoklonaler Antikörper oder ein Fragment eines polyklonalen oder monoklonalen Antikörpers (z.B. ein Fab-, F(ab)₂-, Fab'- oder F(ab')₂ Fragment) sein. Vorzugsweise ist der Antikörper gegen die CDR3-Region der schweren oder/und leichten Antikörperkette des erfindungsgemäßen Polypeptids oder einen Bereich davon gerichtet. Derartige Antikörper können nach an sich bekannten Methoden durch Immunisierung eines Versuchstiers mit einem Peptid oder Polypeptid, welches eine erfindungsgemäße CDR3-Region enthält, und Gewinnung der resultierenden polyklonalen Antikörper aus dem Versuchstier erhalten werden. Weiterhin können monoklonale Antikörper durch Fusion einer Antikörper-produzierenden B-Zelle des Versuchstiers mit einer Leukämiezelle nach der Methode von Köhler und Milstein oder einer Weiterentwicklung davon erhalten werden. Darüber hinaus können rekombinante Antikörper, die gegen die CDR3-Region des erfindungsgemäßen Polypeptids gerichtet sind, auch durch Musterung einer geeigneten Phagemid-Bibliothek, z.B. einer Phageimid-Bibliothek aus einem gesunden humanen Spender, erhalten werden, wobei als Antigen ein erfindungsgemäßes Polypeptid verwendet wird.

Die Erfindung betrifft auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine Nukleinsäure, einen Vektor, ein Polypeptid, einen Antikörper oder eine Zelle wie zuvor genannt, als aktive Komponente, gegebenenfalls zusammen mit anderen aktiven Komponenten sowie pharmazeutisch üblichen Hilfs-, Zusatz- oder Trägerstoffe enthält.

Die pharmazeutische Zusammensetzung kann zur Herstellung eines diagnostischen odertherapeutischen Mittels eingesetzt werden. Beispielefür diagnostischen Anwendungen sind die Diagnose von AlTP oder einer Prädisposition für AlTP. Eine weitere bevorzugte diagnostische Anwendung ist die Überwachung des Krankheitsverlaufs bei AlTP.

Der Einsatz der pharmazeutischen Zusammensetzung als diagnostisches Mittel kann beispielsweise den Nachweis einer B-Zellsubpopulation umfassen, welche ein erfindungsgemäßen Polypeptid als Antikörper exprimiert. Der Nachweis dieses Antikörpers kann beispielsweise auf Nukleinsäureebene, z.B. durch einen Nukleinsäure-Hybridisierungs-Assay gegebenenfalls mit vorgeschalteter Amplifikation erfolgen. Andererseits kann der Nachweis auch auf Proteinebene durch einen Immunoassay unter Verwendung von spezifisch mit dem Polypeptid reagierenden Antigenen oder Antikörpern erfolgen.

Weiterhin kann die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung auch auf therapeutischem Gebiet angewandt werden, insbesondere zur Prävention oder Therapie von AlTP. Diese therapeutische Anwendung kann beispielsweise darauf beruhen, daß eine Stimulierung der Produktion von Anti-Autoantikörpern erfolgt. Hierzu kann beispielsweise das erfindungsgemäße Autoantikörper-Polypeptid einem Patienten verabreicht werden, wodurch die Bildung von antiidiotypischen Antikörpern hervorgerufen oder/und stimuliert wird. Diese Verabreichung kann dabei nach üblichen Immunisierungsprotokollen (Fox et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 279 ( 1 996), 1 000-1 008; Whittum-Hudson et al., Nat. Med. 2 ( 1 996), 1 1 1 6-1 1 21 ; Jardieu, Curr. Opin. Immunol. 7 ( 1 995), 779-782) erfolgen. Andererseits kann die Expression von Antikörpergenen spezifisch durch Verabreichung geeigneter Antisense-Nukleinsäuren gehemmt werden. Das erfindungsgemäße antiidiotypische Antikörper-Polypeptid kann einem Patienten verabreicht werden, um eine direkte Hemmung der Autoantikörper-Aktivität zu erreichen.

Untersuchungen der erfindungsgemäßen Autoantikörper-Polypeptide zeigten, daß diese überraschenderweise in der Lage sind, die Bindung von Fibrinogen an Blutplättchen zu hemmen. Die erfindungsgemäßen Auto- antikörper-Polypeptide und antidiotypischen Antikörper-Polypeptide können daher gegebenenfalls in Kombination als Mittel zur Modulation der Blutgerinnung eingesetzt werden, insbesondere zur Verhinderung einer Thrombose, beispielsweise nach Herzinfarkten, Schlaganfällen oder bei venösen Thrombosen mit Lungenembolien oder Ischämien etc.

Bisher wurden für therapeutische Zwecke als Fibrinogenantagonisten murine monoklonale Antikörper, z.B. der monoklonale Antikörper 7E3 (vgl. z.B. US- Patent 5,440,020) oder Fragmente davon (z.B. das kommerziell erhältliche Fab Fragment ReoPro^®) oder kurze synthetische Peptide eingesetzt. Murine monoklonale Antikörper und Antikörperfragmente haben jedoch den Nachteil, daß sie bei der Behandlung von humanen Patienten aufgrund ihrer Immunogenität zu unerwünschten Nebenreaktionen führen, während kurze Peptide im allgemeinen sehr schnell abgebaut werden. Gegenüber diesen bekannten Mitteln haben die erfindungsgemäßen Polypeptide den Vorteil, daß sie aus Aminosäuresequenzen humanen Ursprungs bestehen und daher geringere unerwünschte Nebenwirkungen als entsprechende murine Antikörper oder Antikörperfragmente aufweisen, und daß sie aufgrund ihrer Größe nicht einem so schnellen Abbau wie Peptide unterliegen.

Die Erfindung betrifft somit die Verwendung einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure, insbesondere einer für ein Autoantikörper-Polyeptid kodierenden Nukleinsäure, eines dieser Nukleinsäure enthaltenden Vektors, einer mit der Nukleinsäure oder dem Vektor transformierten Zelle, eines von der Nukleinsäure kodierten Polypeptids oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die eine oder mehrere der genannten Substanzen enthält, zur Herstellung eines Mittel für die Beeinflussung und insbesondere die Hemmung der Bindung von Fibrinogen an Blutplättchen. Vorzugsweise wird das Mittel zur Modulation der Blutgerinnung eingesetzt, insbesondere für die Auflösung von Thromben oder/und für die Prävention der Thrombenbildung . Die Verabreichung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammen- setzung kann nach bereits für murine Antikörper oder Antikörperfragmente etablierten Protokollen erfolgen.

Noch ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Gewinnung von Phagemid-Klonen, die Nukleinsäuren exprimieren, die für Autoantikörper gegen GPIIb/llla oder für gegen diese Autoantikörper gerichtete antiidiotypische Antikörper kodieren, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Phagemid-Bibliothek aus Lymphozyten eines humanen Spenders herstellt und die gewünschten Phagemid-Klone durch Affinitätsselektion, umfassend negative und positive Selektionsschritte gewinnt. Vorzugsweise beinhaltet das Verfahren außerdem, daß man Antikörperkodierende Nukleinsäuren aus den Klonen gewinnt oder/und daß man die Antikörper-kodierenden Nukleinsäuren zur Expression von rekombinanten Antikörperketten, Derivaten oder Fragmenten davon verwendet. Weiterhin wird die Erfindung durch nachfolgende Beispiele, Figuren und Sequenzprotokolle erläutert. Es zeigen:

SEQ ID No. 1 Die Nukleotidsequenz der H-Kette eines erfindungs- gemäßen Antikörpers (Phagemidklon PDG7), wobei

Framework-Region (FR) 1 von bp 1 -90, Komplementbestimmende Region (CDR) 1 von bp 91 -105, FR2 von bp 106-1 47, CDR2 von bp 148-1 95, FR3 von bp 1 96- 291 , CDR3 von bp 292-324 und FR4 von bp 325-357 reicht,

SEQ ID No. 2 die Aminosäuresequenz zu der in SEQ ID No. 1 dargestellten Nukleotidsequenz, wobei FR1 von A.S. 1 -30, CDR1 von A.S. 31 -35, FR2 von A.S. 36-49, CDR2 von A.S. 50-65, FR3 von A.S. 66-97, CDR3 von A.S. 98-

1 08 und FR4 von A.S. 109-1 1 9 reicht,

SEQ ID No. 3 die Nukleotidsequenz der L-Kette eines erfindungsgemäßen Polypeptids (Phagemidklon PDG7), wobei FR1 von bp 1 -60, CDR1 von bp 61 -99, FR2 von bp 1 00-

144, CDR2 von bp 1 45-1 65, FR3 von bp 1 66-261 , CDR3 von bp 262-294 und FR4 von bp 295-333 reicht,

SEQ ID No. 4 die Aminosäuresequenz zu der in SEQ ID No. 3 angege- benen Nukleotidsequenz, wobei FR1 von A.S. 1 -20,

CDR1 von A.S. 21 -33, FR2 von A.S. 34-48, CDR2 von A.S. 49-55, FR3 von A.S. 56-87, CDR3 von A.S. 88-98 und FR4 von A.S. 99-1 1 reicht,

SEQ ID No. 5 die Nukleotidsequenz der H-Kette eines erfindungsgemäßen Polypeptids (Phagemidklon PDG 1 3), wobei FR1 von bp 1 -90, CDR1 von bp 91 -109, FR2 von bp 1 06-1 47, CDR2 von bp 148-1 98, FR3 von bp 1 99-294, CDR3 von bp 295-336 und FR4 von bp 337-369 reicht,

SEQ ID No. 6 die Aminosäuresequenz der in SEQ ID No. 5 dargestell- ten Nukleotidsequenz, wobei FR1 von A.S. 1 -30, CDR1 von A.S. 31 -35, FR2 von A.S. 36-49, CDR2 von A.S. 50-66, FR3 von A.S. 67-98, CDR3 von A.S. 99-1 1 2 und FR4 von A.S. 1 1 3-1 23 reicht,

SEQ ID No. 7 die Nukleotidsequenz der L-Kette eines erfindungsgemäßen Polypeptids (Phagemidklon PGD1 3), wobei FR1 von bp 1 -60, CDR1 von bp 61 -99, FR2 von bp 1 00-144, CDR2 von bp 145-1 65, FR3 von bp 1 66-261 , CDR3 von bp 262-294 und FR4 von bp 295-333 reicht,

SEQ ID No. 8 die Aminosäuresequenz der in SEQ ID No. 7 dargestellten Nukleotidsequenz, wobei FR1 von A.S. 1 -20, CDR1 von A.S. 21 -33, FR2 von A.S. 34-48, CDR2 von A.S. 49-55, FR3 von A.S. 56-87, CDR3 von A.S. 88-98 und FR4 von A.S. 99-1 1 1 reicht,

SEQ ID No. 9 die Nukleotidsequenz der H-Kette eines erfindungsgemäßen Polypeptids (Phagemidklon AI-X1 6), wobei FR1 von bp 1 -90, CDR1 von bp 91 -105, FR2 von bp 1 06-1 47, CDR2 von bp 148-1 98, FR3 von bp 1 99-288,

CDR3 von bp 289-336 und FR4 von bp 337-369 reicht,

SEQ ID No. 10 die Aminosäuresequenz der in SEQ ID No. 9 dargestellten Nukleotidsequenz, wobei FR1 von A.S. 1 -30, CDR1 von A.S. 31 -35, FR2 von A.S. 36-49, CDR2 von A.S.

50-66, FR3 von A.S. 67-96, CDR3 von A.S. 97-1 1 2 und FR4 von A.S. 1 1 3-1 23 reicht, SEQ ID No. 1 1 die Nukleotidsequenz der L-Kette eines erfindungsgemäßen Polypeptids (Phagemidklon AI-X1 6), wobei FR1 von bp 1 bis 60, CDR1 von bp 61 -1 02, FR2 von bp 1 03-1 47, CDR2 von 1 48-1 68, FR3 von bp 1 69-264, CDR3 von 265-291 und FR4 von bp 292-375 reicht,

SEQ ID No. 1 2 die Aminosäuresequenz der in SEQ ID No. 1 1 dargestellten Nukleotidsequenz, wobei FR1 von A.S. 1 -20, CDR1 von A.S. 21 -34, FR2 von A.S. 35-49, CDR2 von A.S. 50-56, FR3 von A.S. 57-88, CDR3 von A.S. 89-97 und FR4 von A.S. 89-1 25 reicht,

SEQ ID No. 1 3 die Nukleotidsequenz der H-Kette eines erfindungsgemäßen Polypeptids (Phagemidklon AI-X20), wobei FR1 von bp 1 -90, CDR1 von bp 91 -105, FR2 von bp

106-147, CDR2 von bp 148-1 95, FR3 von bp 1 96-291 , CDR3 von von bp 292-333 und FR4 von bp 334-366 reicht,

SEQ ID No. 14 die Aminosäuresequenz der in SEQ ID No. 1 3 dargestellten Nukleotidsequenz, wobei FR1 von A.S. 1 -30, CDR1 von A.S. 31 -35, FR2 von A.S. 36-49, CDR2 von A.S. 50-65, FR3 von A.S. 66-97, CDR3 von A.S. 98-1 1 1 und FR4 von A.S. 1 1 2-1 22 reicht,

SEQ ID No. 1 5 die Nukleotidsequenz der H-Kette eines erfindungsgemäßen Polypeptids (Phagemidklon AI-X39), wobei FR1 von bp 1 -90, CDR1 von bp 91 -105, FR2 von bp 1 06-147, CDR2 von pb 1 48-1 98, FR3 von bp 1 99-294, CDR3 von bp 295-339 und FR4 von 340-372 reicht, SEQ ID No. 16 die Aminosäuresequenz der in SEQ ID No.15 dargestellten Nukleotidsequenz, wobei FR1 von A.S.1-30, CDR1 von A.S.31-35, FR2 von A.S.36-49, CDR2 von A.S. 50-66, FR3 von A.S. 67-98, CDR3 von A.S. 99-113 und FR4 von A.S. 114-124 reicht,

SEQ ID No. 17 die Nukleotidsequenz der H-Kette eines erfindungsgemäßen Polypeptids (Phagemidklon AI-X40), wobei FR1 von bp 1-90, CDR1 von bp 91-105, FR2 von bp 106-147, CDR2 von bp 148-198, FR3 von bp 199-297,

CDR3 von bp 298-339 und FR4 von bp 340-372 reicht,

SEQ ID No. 18 die Aminosäuresequenz der in SEQ ID No. ^dargestellten Nukleotidsequenz, wobei FR1 von A.S. 1 bis 30, CDR1 von A.S.31-35, FR2 von A.S.36-49, CDR2 von

A.S.50-66, FR3 von A.S.67-99, CDR3 von A.S.100- 113 und FR4 von A.S. 114-124 reicht,

SEQ ID No. 19 die Nukleotidsequenz der H-Kette eines erfindungs- gemäßen Polypeptids (Phagemidklon AI-X2), wobei FR1 von bp 1-90, CDR1 von bp 91-105, FR2 von bp 106- 147, CDR2 von bp 148-195, FR3 von bp 196-291, CDR3 von bp 292-327 und FR4 von bp 328-360 reicht,

SEQ ID No.20 die Aminosäuresequenz der in SEQ ID No.19 dargestellten Nukleotidsequenz, wobei FR1 von A.S. 1 bis 30, CDR1 von A.S.31-35, FR2 von A.S.36-49, CDR2 von A.S.50-65, FR3 von A.S.66-97, CDR3 von A.S.98- 109 und FR4 von A.S. 110-120 reicht,

SEQ ID No.21 die Nukleotidsequenz der H-Kette eines erfindungsgemäßen Polypeptids (Phagemidklon AI-B14), wobei FR1 von bp 1 -90, CDR1 von bp 91 -1 05, FR2 von bp 106-147, CDR2 von bp 1 48-1 98, FR3 von bp 1 99-294, CDR3 von bp 295-336 und FR4 von bp 337-369 reicht;

₅ Es wurden auch folgende Variationen der Sequenz gefunden: An Position 7 kann ein C, an Position 9 ein G, an Position 1 3 ein G, an Position 1 5 ein G, an Position 91 ein A, an Position 92 ein G, an Position 98 ein C, an Position 149 ein T, an Position 205 ein A, an 0 Position 228 ein A, an Position 251 ein A, an Position

253 ein T oder/und an Position 284 ein A vorliegen. Dies hat in der Aminosäuresequenz (vgl. SEQ ID No. 22) zur Folge, daß an Position 3 ein Q, an Position 5 ein V, an Position 31 ein S, an Position 33 ein A, an 5 Position 50 ein V, an Position 69 ein T, an Position 76 ein K, an Position 84 ein N, an Position 85 ein S oder/und an Position 95 ein Y vorliegen kann.

SEQ ID No. 22 die Aminosäuresequenz der in SEQ ID No. 21 dargestell- o ten Nukleotidsequenz, wobei FR1 von A.S. 1 bis 30,

CDR1 von A.S. 31 -35, FR2 von A.S. 36-49, CDR2 von A.S. 50-66, FR3 von A.S. 67-98, CDR3 von A.S. 99- 1 1 2 und FR4 von A.S. 1 1 3-1 23 reicht,

5 SEQ ID No. 23 die Nukleotidsequenz der H-Kette eines erfindungsgemäßen Polypeptids (Phagemidklon AI-B1 8), wobei FR1 von bp 1 -90, CDR1 von bp 91 -105, FR2 von bp 106-1 47, CDR2 von bp 1 48-1 98, FR3 von bp 1 99-294, CDR3 von bp 295-333 und FR4 von bp 334-366 reicht; 0

Es wurden auch folgende Variationen der Nukleotidsequenz gefunden: So kann an Position 7 ein C, an Position 1 3 ein G, an Position 1 6 ein C, an Position 56 ein A, an Position 94 ein T, an Position 97 ein G, an Position 1 55 ein T, an Position 1 73 ein C, an Position 223 ein T, an Position 252 ein T oder ein C, an Position 261 ein G, an Position 267 ein G, an Position 271 ein

A, an Position 275 ein C oder/und an Position 277 ein G vorliegen. Dies hat in der entsprechenden Aminosäuresequenz (vgl. SEQ ID No. 24) zur Folge, daß an Position 3 ein Q, an Position 5 ein V, an Position 6 ein Q, an Position 1 9 ein K, an Position 32 ein Y, an

Position 33 ein A, an Position 52 ein I, an Position 58 ein A, an Position 75 ein S, an Position 84 ein S, an Position 87 ein R, an Position 89 ein E, an Position 91 ein T, an Position 92 ein A oder/und an Position 93 ein V vorliegen kann.

SEQ ID No. 24 die Aminosäuresequenz der in SEQ ID No. 23 dargestellten Nukleotidsequenz, wobei FR1 von A.S. 1 bis 30, CDR1 von A.S. 31 -35, FR2 von A.S. 36-49, CDR2 von A.S. 50-66, FR3 von A.S. 67-98, CDR3 von A.S. 99-

1 1 1 und FR4 von A.S. 1 1 2-122 reicht,

SEQ ID No. 25 die Nukleotidsequenz der H-Kette eines erfindungsgemäßen Polypeptids (Phagemidklon AI-B24), wobei FR1 von bp 1 -90, CDR1 von bp 91 -105, FR2 von bp

106-147, CDR2 von bp 148-1 98, FR3 von bp 1 99-294, CDR3 von bp 295-330 und FR4 von bp 331 -363 reicht;

Es wurden auch folgende Variationen der Nukleotidse- quenz gefunden: An an Position 7 kann ein C, an

Position 9 ein G, an Position 1 3 ein G, an Position 1 5 ein G, an Position 31 ein G, an Position 46 ein A, an Position 67 ein G, an Position 89 ein G, an Position 92 ein G, an Position 93 ein C, an Position 98 ein G, an Position 1 02 ein G, an Position 140 ein G, an Position 1 41 ein G, an Position 145 ein G, an Position 1 49 ein T, an Position 1 57 ein T, an Position 1 58 ein A, an

Position 1 60 ein G, an Position 1 66 ein A, an Position 1 73 ein A, an Position 235 ein T, an Position 251 ein A, an Position 290 ein C oder/und an Position 293 ein A vorliegen. Dies hat in der entsprechenden Aminosäu- resequenz (vgl. SEQ ID No. 26) zur Folge, daß an

Position 3 ein Q, an Position 5 ein V, an Position 1 1 ein V, an Position 1 6 ein R, an Position 23 ein A, an Position 30 ein S, an Position 31 ein S, an Position 33 ein G, an Position 34 ein M, an Position 47 ein W, an Position 49 ein A, an Position 50 ein V, an Position 53 ein Y, an Position 54 ein D, an Position 56 ein S, an Position 58 ein K, an Position 79 ein L, an Position 84 ein N, an Position 97 ein A oder/und an Position 98 ein K vorliegen kann.

SEQ ID No. 26 die Aminosäuresequenz der in SEQ ID No. 25 dargestellten Nukleotidsequenz, wobei FR1 von A.S. 1 bis 30, CDR1 von A.S. 31 -35, FR2 von A.S. 36-49, CDR2 von A.S. 50-66, FR3 von A.S. 67-98, CDR3 von A.S. 99- 1 1 0 und FR4 von A.S. 1 1 1 -1 21 reicht,

SEQ ID No. 27 die Nukleotidsequenz der L-Kette eines erfindungsgemäßen Polypeptids (Phagemidklon AI-B24), wobei FR1 von bp 1 -60, CDR1 von bp 61 -96, FR2 von bp 97- 1 38, CDR2 von bp 1 39-1 59, FR3 von bp 1 60-255,

CDR3 von bp 256-282 und FR4 von bp 283-366 reicht; Es wurden auch folgende Variationen der Nukleotidsequenz gefunden: An Position 4 kann ein C oder ein T, an Position 37 ein G, an Position 40 ein A, an Position 50 ein G, an Position 67 ein A, an Position 72 ein T, an Position 1 33 ein A, an Position 1 36 ein T, an Position

1 38 ein T oder ein C, an Position 148 ein G, an Position 1 60 ein T, an Position 1 61 ein T, an Position 1 62 ein T oder ein C, an Position 200 ein C, an Position 21 7 ein T, an Position 21 8 ein G, an Position 220 ein A oder C, an Position 269 ein G, an Position 271 ein T, an Position 272 ein G, an Position 275 ein G oder/und an Position 282 ein T oder ein C vorliegen. Dies hat zu Folge, daß in der entsprechenden Aminosäuresequenz (vgl. SEQ ID No. 28) an Position 2 ein L, an Position 1 3 ein G, an Position 14 ein K, an Position 1 7 ein R, an

Position 23 ein N, an Position 24 ein N, an Position 45 ein I, an Position 47 ein Y, an Position 50 ein D, an Position 54 ein F, an Position 67 ein T, an Position 73 ein S, an Position 74 ein R, an Position 90 ein S, an Position 91 ein S, an Position 92 ein S oder/und an

Position 94 ein H vorliegen kann.

SEQ ID No. 28 die Aminosäuresequenz der in SEQ ID No. 27 dargestellten Nukleotidsequenz, wobei FR1 von A.S. 1 bis 20, CDR1 von A.S. 21 -32, FR2 von A.S. 33-46, CDR2 von

A.S. 47-53, FR3 von A.S. 54-85, CDR3 von A.S. 86-94 und FR4 von A.S. 95-1 22 reicht,

SEQ ID No. 29 die Nukleotidsequenz der H-Kette eines erfindungs- gemäßen Polypeptids (Phagemidklon AI-B38), wobei

FR1 von bp 1 -90, CDR1 von bp 91 -105, FR2 von bp 1 06-147, CDR2 von bp 148-1 98, FR3 von bp 1 99-294, CDR3 von bp 295-333 und FR4 von bp 334-366 reicht;

Es wurden auch folgende Variationen der Nukleotidse- quenz gefunden: Es kann an Position 7 ein C, an

Position 9 ein G, an Position 1 3 ein G, an Position 1 5 ein A oder/und an Position 1 6 ein C vorliegen. Dies hat zu Folge, daß in der entsprechenden Aminosäuresequenz an Position 3 ein Q, an Position 5 ein V oder/und an Position 6 ein Q vorliegen kann und

SEQ ID No. 30 die Aminosäuresequenz der in SEQ ID No. 29 dargestellten Nukleotidsequenz, wobei FR1 von A.S. 1 bis 30, CDR1 von A.S. 31 -35, FR2 von A.S. 36-49, CDR2 von A.S. 50-66, FR3 von A.S. 67-98, CDR3 von A.S. 99-

1 1 1 und FR4 von A.S. 1 1 2-1 22 reicht,

Figur 1 die Hemmung der Bindung von Autoantikörper-Phabs (PDG-X) an GPIIb/llla durch Zusatz des antiidiotypischen Antikörper- Phab AI-X1 7.

Figur 2 die Hemmung der Bindung von Autoantikörper-Phabs (PDG-B) an Blutplättchen durch antiidiotypische Antikörper-Phabs Al-B,

Figur 3 die Bindung von Autoantikörper-Phabs an unbehandelte und

EDTA-behandelte Blutplättchen,

Figur 4 die Hemmung der Fibrinogenbindung an GPIIb/llla durch Autoantikörper-Phabs, Figur 5-7 die Hemmung der Bindung von Autoantikörper-Phabs an GPIIb/llla durch den Antikörper 7E3 und das Antikörperfragment ReoPro^®.

Beispiele

1 . Identifizierung von Autoantikörpersequenzen

1 .1 . Gewinnung von Autoantikörpern

Autoantikörper von 1 2 Patienten mit AlTP (8 mit primärer AlTP, 3 mit AlTP assoziiert mit SLE, 1 mit AlTP assoziiert mit Sjögren's Syndrom) wurden durch Inkubation von Patientenplasma über Nacht mit gereinigtem GPIIb/llla bei 4°C und anschließende Elution in 0,2 mol/l Glycin und 0, 1 5 mol/l NaCI pH 2, 5 für 1 5 min bei Raumtemperatur erhalten. Nach Zentrifugation für 30 min bei 100.000 g wurde der Überstand mit 1 mol/l Tris-HCI neutralisiert und über Nacht gegen Tris-gepufferte Salzlösung (TBS) dialysiert.

Zum Zeitpunkt der Plasmaentnahme waren alle Patienten thrombozytope- nisch (Plättchenzahl < 1 50 x 10⁹/l) und hatten normale oder vergrößerte Megakaryozyten im Knochenmark und waren frei von anderen nachweisbaren Formen der Immunthrombozytopenie.

1 .2. Gewinnung gereinigter Antigene

Als Antigene wurden gereinigtes GPIIb/llla, ein zytoplasmatisches Fragment von GPIIIa (Aminosäuren 721 -744) und ein extrazelluläres Fragment von GPIIIa (Aminosäuren 468-690) verwendet (Beardsley, Blut 59 (1 989), 47-51 und Phillips et al., Methods Enzymol. 21 5 ( 1 992), 244-263). 1 .3. Gewinnung von Plättchen zum Panning und Immunoblotting

Aus EDTA-antikoagulierten Blutproben gesunder humander Spender wurde Plättchen-angereichertes Plasma durch differenzielle Zentrifugation hergestellt. Die Plättchen wurden durch Zentrifugation bei 2000 g für 1 5 min isoliert, sechsmal in Zitronensäurepuffer (pH 6,2) mit 50 mmol/l Natriumeitrat, 1 00 mmol/l NaCI und 1 25 mmol/l Dextrose gewaschen und schließlich im gleichen Puffer resuspendiert.

Thrombasthenische Plättchen wurden aus einem 14 Jahre alten an Thrombasthenie Glanzmann Typ I erkrankten Jungen unter Verwendung des gleichen Anreicherungsprotokolls erhalten.

1.4. Monoklonale Antikörper

Es wurden murine monoklonale Antikörper verwendet, welche die kom- plexierte Form von GPIIb/llla erkennen, sowie Antikörper, die selektiv GPIIb oder GPIIIa erkennen. Diese Antikörper wurden mit üblichen Immunisierungsprotokollen unter Verwendung der entsprechenden Antigene gewonnen und sind nicht AlTP-assoziiert. Die Gewinnung solcher Antikörper ist bei Kouns et al. (J. Biol. Chem. 267 ( 1 992), 1 8844-1 8851 ), Steiner et al. (Biochim. Biophys. Acta 1 1 1 9 (1 992), 1 2-21 ) und Häring et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82 (1 985), 4837-4841 ) beschrieben.

1 .5. Phagemid-Bibliothek

Eine kombinatorische Fab-Bibliothek wurde nach der von Vogel et al. (Eur. J. Immunol. 24 ( 1 994), 1 200-1 207) beschriebenen Methode hergestellt, wobei periphere Blutlymphozyten aus einem gesunden präimmunisierten humanen Spender verwendet wurden. Alle Enzyme und Oligonukleotide wurden von Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Deutschland) mit Ausnahme der Taq Polymerase (Perkin Eimer, NJ, USA) bezogen. Die Primer für die PCR-Amplifikation der H-und L-Ketten der Fab-Moleküle, der VCSM 1 3 Helferphage und der Escherichia coli Stamm XL-Blue wurden von Stratacyte (La Jolla, CA, USA) bezogen. Das Phagemid pComb3 wurde vom Scripps Research Institute (La Jolla, CA, USA) bezogen. Die Klonierung, die Transformation in XL-Blue-Zellen und die Herstellung von Phabs erfolgte wie von Barbas III und Lerner, Methods: Companion Methods Enzymol. 2 ( 1 991 ), 1 1 9) beschrieben. Die Phabs wurden mit 4% (w/v) Polyethylen- glykol 8000 und 3% (w/v) NaCI präzipitiert und in PBS pH 7,4 resuspendiert. Die resultierende Expressionsbibliothek enthält 1 x 10⁷ Spezifitäten.

1 .6. Isolierung von GPIIb/llla-spezifischen Phabs

GPlIb/llla-spezifische Phabs wurden durch insgesamt 5 Runden einer Affinitätsselektion ("Panning") hergestellt. Nach Präabsorption (negative Selektion) mit 5 x 10⁷ thrombasthenischen Plättchen wurden die Phabs mit 1 0⁸ normalen Plättchen für 45 min inkubiert (positive Selektion) . Gebundene Phabs wurden dann mit 0,05 mol/l Natriumeitrat pH 2,5 eluiert und mit 1 mol/l Tris-Puffer neutralisiert. Nach jeder "Panning"-Runde wurde die Anreicherung von GPIIb/llla spezifischen Phabs durch Titration der Phagenkolonie-bildenden Einheiten verfolgt. Nach fünf Selektionsrunden wurde eine Anreicherung der eluierten Phabs um den Faktor von mehr als 100 gefunden.

Der nach der vierten Selektionsrunde erhaltene Pool von Phabs wurde näher auf seine GPIIb/llla Spezifität analysiert. Hierzu wurden 40 Phab-Klone zufällig ausgewählt und ihre Bindespezifität in einem Immunodot-Assay ermittelt. 1 μl normale und thrombasthenische Plättchen ( 10⁹ ml) sowie gereinigtes GPIIb/llla (500μg/ml) wurden auf Nitrozellulosestreifen (Millipore Corporation, Bedford, MA, USA) getropft. Die Streifen wurden in TBS mit 0, 1 5% Casein (TBS-Casein) blockiert und dann über Nacht mit den in TBS- Casein verdünnten Phabs inkubiert. Nach drei Waschungen mit TBS-0, 1 % Tween 20 (TBS-Tween) wurden die gebundenen Phabs mit 4-Chlor-1 -σ- naphthol (Merck, Darmstadt, Deutschland) nach Inkubation mit Mee- rettichperoxidase-konjugiertem polyklonalem Kaninchen-Anti-Phage- Antikörper (Vogel et al., supra) verdünnt 1 : 1000 in TBS-Casein nachgewiesen.

Die Bindung von Phabs an Plättchen und gereinigtes GPIIb/llla wurde auch nach Denaturierung der Proteine durch Erhitzen (70°C) oder durch Säurebehandlung (pH 2 mit 0,5 N HCI) vor dem Auftropfen getestet.

Von den 40 zufällig ausgewählten Klonen reagierten 23 (57,5%) mit GPIIb/llla, während 17 keine Bindung zeigten. Nach Denaturierung des Antigens durch Hitze oder pH 2 vor der Inkubation wurde keine Bindung von Anti-GPIIb/llla an Phabs beobachtet, wodurch gezeigt wird, daß intaktes GPIIb/llla für die Phab-Bindung notwendig ist. Fab-Bestimmung an negativen Phabs zeigte keine Fab-Moleküle bei 15 Klonen (88 %). Die zwei Fabpositiven Klone ohne Bindung an GPIIb/llla könnten eine geringe Bindeaffinität für GPIIb/llla aufweisen.

1.7. Fab Analyse

Zum Test der positiven Phabs auf kappa (K) , lambda (Λ) und Fd-Ketten wurden die Anti-GPIIb/llla Phabs auf Nitrozellulose getropft. Die Filter wurden 4 Stunden lang mit Peroxidase-markiertem Maus-anti-Human-Λ-, -K- (The Binding Site Limited, Birmingham, England) und -Fd-Antikörper (aus der Myelomazellinie HP6045, ATCC1757, Rockville, MD, USA) verdünnt 1 : 1000 in TBS-Casein inkubiert und mit Chemielumineszenz (ECL, Amersham, Schweiz, Zürich, Schweiz) entwickelt. Ein Test von 1 5 zufällig ausgewählten Anti-GPIIb/llla Fab-Klonen auf K, λ und Fd-Ketten ergab das Vorhandensein einer Fd-Kette in 12 Klonen (80%) und der Λ-Kette in allen Klonen. Eine quantitative Bestimmung der Fab-Bindung an GPIIb/llla auf Plättchen erfolgt durch Präinkubation gepoolter Phabs mit Plättchen in verschiedenen Konzentrationen. Der Überstand wurde dann durch ein Immunodotverfahren analysiert. Dabei wurde festgestellt, daß 1 bis 3 x 1 0⁴ Phabs pro Plättchen binden. Dies weist darauf hin, daß ungefähr 10 bis 50 % der GPIIb/llla Moleküle pro Plättchen durch Phabs besetzt werden können.

1 .8. Charakterisierung der Phab-Bindeepitope

Die Epitopspezifität von Phabs wurde durch einen Inhibitiontest unter Verwendung verschiedener monoklonaler Antikörper (siehe Punkt 4) bestimmt. 1 μl aufgetaute normale und thrombasthenische Plättchen ( 1 0⁹/ml), gereinigtes GPIIb/llla (500μg/ml), ein Peptidfragment von GPIIIa (Aminosäuren 468-690, 500μg/ml) und der cytoplasmatische Abschnitt von GPIIb/llla (500 μg/ml) wurden jeweils in Doppelansätzen auf Nitrozellulosestreifen aufgetropft. Nach der Blockierung wurden die Phab-Klone (0,4 μg/ml Fab) über Nacht mit oder ohne monoklonalen Antikörper ( 1 μg/ml) inkubiert. Die gebundenen Phabs wurden durch Peroxidase- markierten Anti-PHage-Antikörper und 4-Chlor- 1 -σ-naphthol nachgewiesen.

Bei diesen Untersuchungen wurden 2 Gruppen von Phabklonen identifiziert. Gruppe A (5 Klone) wurde mäßig durch einen Pool aller Antikörper, aber stark durch GPIIb/llla-Komplex-spezifische Antikörper inhibiert. Anti-GPIIb Antikörper hatten keinen Effekt. Gruppe B ( 10 Klone) wurde vollständig durch den Pool aller Antikörper, aber weniger durch den komplexspezifischen Antikörper und auch durch den Mb spezifischen Antikörper inhibiert. Keine Gruppe zeigte Reaktion mit GPIIIa spezifischen Antikörpern. Gleiche Ergebnisse wurden bei Verwendung von Plättchen oder gereinigtem GPIIb/llla als Antigen erhalten. Es wurde keine Phab-Bindung an das cytoplasmatische Peptid oder das extrazelluläre Fragment von GPIIIa gefunden. Eine Zusammenfassung dieser Ergebnisse ist in Tabelle 1 gezeigt.

Tabelle 1

1 .9. Inhibierungsuntersuchungen

Die Blockierung der Bindung von Autoantikörpern aus Patienten an GPIIb/llla durch die gefundenen anti-GPIIb/llla Phabs wurde durch Inhibierungsuntersuchungen ermittelt. Hierzu wurden zwei der wie zuvor beschrieben identifizierten Phabklone (PDG 1 6, PDG31 ) verwendet.

Serielle Verdünnungen von 1 :3 bis 1 : 1000 der eluierten Autoantikörper aus Patienten wurden auf die Bindung an gereinigtes GPIIb/llla analysiert. Hierzu wurde ein Immunodotassay durchgeführt. 1 00 ng gereinigtes GPIIb/llla wurde in jeweils dreifachen Ansätzen auf Nitrozellulosestreifen getropft und die Filter mit TBS-Casein blockiert. Zur Blockierung der AlTP Autoantikörper- Bindung an GPIIb/llla durch Phabs wurden die Streifen 1 h lang mit 1 0^{1 1} Phabs und anschließend 4 h lang mit AlTP Autoantikörpern in variablen Verdünnungen inkubiert. Gebundene Autoantikörper wurden durch Peroxidase-markierten Anti-human-lgG-Fc Antikörper und ECL nachgewiesen.

Die Bindung von Autoantikörpern aus 8 AlTP Patienten wurde durch Anti- GPIIb/llla Phabs inhibiert. Der Inhibierungsbereich war 10 bis 46 %, 32 bis 60 % und 20 bis 67 % für PTG1 6, PTG31 bzw. den Pool der beiden Phabs. Die Bindung von Autoantikörpern aus 4 AlTP Patienten wurde durch diese Phabs nicht verändert. In beiden Gruppen waren Autoantikörper von Patienten mit primärer und krankheitsassoziierter AlTP.

Eine Zusammenfassung der erhaltenen Ergebnisse ist in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2

1 .10. DNA Sequenzanalyse

Plasmid DNA wurde aus vier Phabklonen der Gruppe A und 4 Klonen der Gruppe mit dem Nukleobond^® AX Reinigungskit PC 20 (Macherey-Nagel AG, Oensingen, Schweiz) gereinigt. Die Nukleinsäuresequenzierung erfolgte auf einen ABI373A Sequenziersystem unter Verwendung eines PRISM Ready Reaction DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit. Die Primer wurden von Microsynth, Balgach, Schweiz bezogen. Zur Sequenzierung der H Kette wurden folgende Primer ver- wendet: Ch 1 (5'-CGC TGT GCC CCC AGA GGT-3') und PCH (5'-GGC CGC AAA TTC TAT TTC AAG G-3') . Zur Sequenzierung der L-Kette wurden folgende Primer verwendet: Cλ (5'-GAG ACA CAC CAG TGT GGC-3'), Ck (5'-CAC AAC AGA GGC AGT TCC-3') und PCL(5'-CTA AAC TAG CTA GTC TCC-3') . Die von der DNA Sequenz abgeleiteten Aminosäuresequenzen wurden mit der GenEMBL-Genbank verglichen und Stammlinien VH und VΛ Familien zugeordnet.

Die VH und VΛ Nukleotidsequenzen der 4 Phabklone jeder Gruppe (Gruppe A: PDG7, PDG8, PDG 1 0, PDG 1 6; Gruppe B: PDG 1 3, PDG 1 7, PDG31 , PTG37) wurden durch automatisierte Sequenzierung analysiert und mit bekannten Stammlinien-Gensequenzen verglichen (Tabellen 3 und 4). Innerhalb jeder Gruppe war 100 % Homologie in den abgeleiteten Aminosäuresequenzen der H- und L-Ketten. Im Gegensatz dazu war die Homologie zwischen Gruppe A und B nur 36,9 % für die H-Kette und 81 ,9% für die L- Ketten-Aminosäurensequenzen.

In der H-Kette zeigen Klone der Gruppe A den höchsten Grad an Sequenzidentität mit dem Stammliniengen VH4.1 1 der V_H4 Familie (Sanz, et al. EMBO J. 8 ( 1 989), 3741 -3748). Es gab 7 Aminosäureunterschiede in der Frameworkregion (FR) und 8 in der Komplement-bestimmenden Region (CDR) . Klone der Gruppe B unterschieden sich von der am meisten homologen Stammliniensequenz 1 .9111 der V_H3-Familie (Berman et al., EMBO J. 7 ( 1 988), 727-738) durch vier Aminosäuren in FR und eine in CDR.

In der L-Kette zeigten die Klone der Gruppe A und B die höchste Homologie zu der Stammliniengensequenz der DPL2 der V_λ I Familie (Williams und Winter, Eur. J. Immunol. 323 (1 993), 1456). Es gab neun Aminosäureun- terschiede in FR und zehn in CDR für Klone der Gruppe A und einen in FR und zwei in CDR für Klone der Gruppe B. Die erhaltenen Ergebnisse sind in den Tabellen 3 und 4 zusammengefaßt.

Tabelle 3

A. Schwere Ketten KΪone ^■■ EB1 CDR1 FR2 CDR2 FR3 CDR3 FR4

VH4.11 QVQ QESGPG VKPSETLSLTCTVSGGSIS SYYWS WIRQPPGKG EWIG YIYYSGSTNYNPSLKS RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAΛDTAVYYCAR

PDG7 --K-L N G-S-R _s D-S K-K R- VLPFDPISMDV WGKGTTVTVSS

PDG8 VLPFDPISMDV WGKGTTVTVSS

PDG10 VLPFDPISHDV WGKGTTVTVSS

PDG16 VLPFDPISMDV WGKGTTVTVSS

1.9III OVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFS SYGMH HVRQAPGKGLEWVA VISYDGSNKYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCΛK

PDG13 --A R ALGSWGQWDIIYMDV WGKGTTVTVSS

PDG17 ALGSWGGWDHYMDV WGKGTTVTVSS

PDG31 ALGSWGGWDIIYMDV WGKGTTVTVSS

PDG37 ALGSWGGWDHYMDV WGKGTTVTVSS

M8525S ._Q-_V DRPIARWTYGGMDV WGQGTTVTVSS

B. Leichte Ketten Klone EE1 CDR1 FR2 CDR2 FR3 CDR3 FR4

DPL2 VLTQPPSΛSGTPGQRVTI SC SGSSSNIGSNTVN WYQQLPGTAPKLLIY SNNQRPS GVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEΛDYYC AAWDDSLNG

PDG7 -V W R--P-S —II-V F GSH -T G PV FGGGTKLTVLSQP

PDGB FGGGTKLTVLSQP

PDG10 FGGGTKLTVLSQP

PDG16 FGGGTKLTVLSQP

DPL2 VLTQPPSASGTPGQRVTISC SGSSSNIGSNTVN WYQQLPGTAPKLLIY SNNQRPS GVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYC AAWDDSLNG

PDG13 _V -WV FGGGTKLTVLGQP

PDG17 FGGGTKLTVLGQP

PDG31 FGGGTKLTVLGQP

PDG37 FGGGTKLTVLGQP

FR: framework-Region; CDR: Komplement-bestimmende Region. Die oberen Sequenzen (VH4.1 1 ; 1.9111; DPL2) sind zu Vergleichszwecken angegeben und stellen die abgeleitete Aminosäurensequenz für die am nächsten verwandte veröffentlichte Stammlinien-Gensequenz dar. Striche 0 bedeuten Identität. M85255 bezieht sich auf die EMPL/GenBank Kennzeichnungsnummer und bedeutet die abgeleitete Aminosäurensequenz des humanen Anti-GPIIb-Autoantikörpers 2E7 (Kunicki et al., J. Autoimmun. 4 (1991 ), 433-446). Für die schwere Kette sind die ersten drei Aminosäuren (QVK) durch die Vektorsequenz von pComb3 bestimmt.

Tabelle 4 zeigt die Zuordnung von Klonen der Gruppe A und B zu bekannten Stammlinien V-Gensequenzen nach der Aminosäurehomologie

2. Identifizierung von antiidiotypischen Antikörpersequenzen

2.1 Phab-Klone Al-X

Nach der in Beispiel 1 angegebenen Methode wurden durch die Phagemid- technik Sequenzen für antiidiotypische Antikörper identifiziert. Dabei wurde der in Beispiel 1 selektionierte Klon PDG 1 6 als Antigen verwendet. Eine negative Vorselektion fand nicht statt.

Es wurde ein Pool von kombinatorischen Phab-Bibliotheken, die Spezifitäten einer nichtimmunen und einer mit roten Blutzellen immobilisierten Bibliothek peripherer B-Lymphozyten und einer nichtimmunen Bibliothek von B- Lymphozyten aus Tonsillen verwendet. Der nach der vierten Panningrunde erhaltene Pool von Phabs wurde analysiert. Hierzu wurden 40 Phab-Klone zufällig ausgewählt und ihre Bindespezifität ermittelt. 25 der ausgewählten Klone reagierten mit Anti- GPIIb/llla-Phab. Diese antiidiotypischen Phab-Klone gehörten zu zwei Gruppen: Gruppe I (drei Klone) zeigte eine Reaktion ausschließlich mit Autoantikörper-Phab-Klonen der Gruppe A (PDG 7, 8, 1 0 und 1 6), während die Phab-Klone der Gruppe II (insgesamt 22 Klone) sowohl mit Phab-Klonen der Gruppen A und B, mit murinen monoklonalen Anti-GPIIb/IIIa-Antikörpem, mit gereinigtem Serumimmunglobulin (IVIgG) oder F(ab')₂ Fragmenten davon und mit Anti-lgE-Fab reagieren. 14 Phab-Klone (Gruppe III) reagierten mit keiner der genannten Substanzen. Ein Phab-Klon der Gruppe IV reagierte nur mit Anti-GPIIb/llla Antikörpern. Die Ergebnisse dieser Spezifitätsunter- suchungen sind in Tabelle 5a zusammengefaßt.

Eine DNA-Sequenzanalyse von Phab-Klonen der Gruppe I (AI-X1 6, 1 7 und 24) zeigte in den für die schwere Kette kodierenden Sequenzen eine bis auf eine Aminosäure in der CDR2 Region vollständige Identität und in den für die leichte Kette kodierenden Sequenzen eine vollständige Identität. Ein Vergleich mit bekannten Stammlinien-Gensequenzen zeigte ca. 85% Homologie zur H-Ketten-Sequenz VH3 und ca. 90% Homologie zur Sequenz der L-Kettenfamilie V-Λll. Von den Phab-Klonen der Gruppen II, III und IV wurde eine DNA-Sequenzanalyse des H-Kettengens jeweils an einem Vertreter durchgeführt. Die Ergebnisse dieser Sequenzanalyse und des Vergleichs mit bekannten Stammlinien-Gensequenzen ist in den Tabellen 6 und 7a zusammengefaßt.

Das Ergebnis einer Inhibitionsuntersuchung ist in Fig. 1 dargestellt. Die Hemmung der Bindung von AI-X1 7 an PDG-A durch gereinigtes GPIIb/llla wurde durch einen Immunodotassay bestimmt. 660 bzw. 220 ng PDG-A Phab wurden auf Nitrozellulose gegeben. Das Antigen wurde für 2 h mit GPIIb/llla in Konzentrationen im Bereich von 50 μg/ml bis 50 ng/ml sowie mit einer Pufferlösung als Kontrolle und dann für zwei weitere Stunden mit dem Phagenklon AI-X1 7 (Endkonzentration 10¹²/ml) inkubiert. Die gebundenen Phagen wurden mit Peroxidase-konjugiertem polyklonalen Kaninchen- Anti-Phage Antikörper und Elektrochemilumineszenz nachgewiesen.

Es wurde gefunden, daß der Phab AI-X1 7 (Gruppe I) die Bindung von Autoantikörper-Phabs der Gruppe A (PDG-X) an das Glykoprotein llb/llla hemmen kann. Dies bedeutet, daß AI-X1 7 die antigenbindende Stelle auf PDG-A erkennt.

Ein weiterer Klon AI-X2, der an PDG-A bindet, wurde sequenziert. Dieser Klon hat - wie auch die Klone AI-X20, 39 und 40 - nur eine schwere, aber keine leichte Kette. Die schwere Kette kann alleine, gegebenenfalls als Dimer, mit ausreichender Spezifität und Affinität an das Antigen, d.h. PDG- A, binden.

2.2 Phab-Klone Al-B

Nach der in Beispiel 2.1 angegebenen Methode wurden durch die Phagemid- Technik Sequenzen für weitere antiidiotypische Antikörper identifiziert. Dabei wurde ein in Beispiel 1 selektionierter Klon PDG-B als Antigen verwendet.

Es wurden insgesamt 40 Phab-Klone ausgewählt und ihre Bindespezifität ermittelt. 34 der ausgewählten Klone reagierten mit Anti-GPIIb/llla-PHAB. Diese antiidiotypischen Phabklone gehörten zu drei Gruppen:

Gruppe 1 ( 14 Klone) zeigte eine Reaktion ausschließlich mit Autoantikörper- Phab-Klonen der Gruppe B, während die Phab-Klone der Gruppe II (insgesamt 8 Klone) sowohl mit Phab-Klonen der Gruppen A und B reagierten. Die Phab-Klone der Gruppe III (insgesamt 1 2 Klone) reagierten darüber hinaus mit murinen monoklonalen Anti-GPIIb/llla-Antikörpern, mit gereinigtem Serumimmunglobulin (IVIgG) oder F(ab')₂-Fragmenten davon und mit Anti-lgE-Fab. Sechs Phab-Klone (Gruppe IV) reagierten mit keiner der genannten Substanzen. Die Ergebnisse dieser Spezifitätsuntersuchungen sind in Tabelle 5b zusammengefaßt.

Das Ergebnis einer DNA Sequenzanalyse von Phab-Klonen der Gruppe I (Al- 14, 1 8,24 und 38) ist in den Tabellen 6 und 7b zusammengefaßt. Die Klone AI-B1 4, 1 8 und 38 haben nur eine schwere Kette.

AI-B1 4 und 1 7 sind identisch. Ebenso sind AI-B34 und 40 mit AI-B1 8 identisch.

Die Hemmung der PDG-B-Bindung an Plättchen durch Al-B-Phabs wird in Fig. 2 dargestellt. Die Bestimmung erfolgte mittels durchflußzytometrischer Analyse. Hierzu wurde ein an Plättchen reiches Plasma (insgesamt 10⁷ Plättchen) mit biotinyliertem PDG-B in Gegenwart oder Abwesenheit von Al- B Phabs und unter Verwendung von Helferphagen als Kontrolle inkubiert. Die Plättchen wurden mit Paraformaldehyd fixiert und gebundenes PDG-B wurde mit R-Phycoerythrin (RPE)-markiertem Streptavidin nachgewiesen. 1 0.000 Vorgänge wurden in einem FACScan-Gerät gezählt und der mittlere Wert der Fluoreszenz ( ± SD) wurde aufgezeichnet. Die stärkste Inhibierung ( > 60%) wurde mit den Klonen AI-B1 8, 24 und 38 erzielt. Die Hemmung der Bindung zeigt eine Wechselwirkung von Al-B Klonen mit der Antigen- bindenden Stelle auf PDG-B.

Tabelle 5a

Bindung an

IX Phab-Klone PDG A PDGB antl-lgE-Fab anti-GPIIb/llla mAb SG F(ab')₂

Gruppe I 16,17,24

Gruppe II

1 ,2,3,4,5,6,7,9,

11 ,13,14,23,26, 22

27,28,29,33,35,

36,37,38,40

Gruppe III 8,10,12,15,18,

19,21,22,25,30, 14

31 ,32,34,39

Gruppe IV 20

Tabelle 5b

Al-B

Phab-Klone Bindung an

MgG n PDG-X PDG-B anti-lgE-Fab anti-GPIIb/llla mAb MgG _p

(Al-B5 1,74,8,14,17,18,23 24,30,31 ,33,34-38,40).

8 +

12 +

Tabelle 6 anti-ld H-Kette L-Kette phage clones antiidiotypische

Phab-Klone ie

V_H Familie Stammlinieni Homolog Homologie

V_λ Familie Stammlinien(Al-X und Al-B) gen (%) * gen (%) * ^{" "}

A1-X16, AI-X24 V_H3 DP47 88 _λ2 DPL10 88

AI-X17 V_H3 DP47 87 _Λ DPL10 88 ^

AI-X39 V_H3 DP49 94 - -

AI-X40 V_H3 DP31 95 - - -

AI-X20 _H DP71 78 - - -

AI-B14. AI-B17 V_H3 DP46 91 - - -

AI-B18 _H1 DP10 85 - - -

A1-B24 V_H3 DP49 81 V_Λ3 3h 82

AI-B38 _H1 DP5 98 - - -

20 Höchste Homologie (in %) der Aminosäuresequenzen der jeweiligen Phab-Klone zu Sequenzen von bekannten Stammlinien-V-Genen

Tabelle 7a

A. Schwere Ketten Klone FRI CDR1 FR2 CDR2 FR3 CDR3 FR4

DP47 EVQLLESGGG VQPGGSLRLSCAASGFTFS SYAMS WVRQAPGKGLEWVS AISGSGGSTYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK AIX16 Q-K H D NF G G-LL-H N—R--V VRDLGYRVLSTFTFDI WGQGTKVTVSS AIX24 AIX17 -N-

DP49 QVQ VESGGGWQPGRSLRLSCAASGΠTS SYG H WVRQAPGKGLEWVA VISYDGSNKYYADSVKG RFTISRDNSKNTI-YLQMNSLRAEDTAVYYCAK AIX39 _L —-A K DGRSGSYARFDGMDV WGQGTTVTVSS

DP31 EVQLVESGGGLVQPGRS RLSCAASGΓΓFD DYAMH WVRQAPGKGLEWVS GISWNSGSIGYADSVKG RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKD AIX40 D-T V~ MGSSWATYNAFDI WGQGTMVTVSS

DP71 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSIS SYYWS WIRQPPGKGLEWIG YIYYSGSTNYNPSLKS RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR AIX20 — K- DV— R -H— __L F—DGAR-RF R- --SL-M-P-K G S DADGDGFSPYYFPY WGQGIPVSVSS

B. Leichte Ketten Klone FRI CDR1 FR2 CDR2 FR3 CDR3 FR4

DPL10 QSALTQPASVSGSPGQSITISC TGTSSDVGSYNLVS WYQQHPGKAPKLMIY EVSKRPS GVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYC CSYAGSSTF

AIX16 W AI-N—F-P __{G E} ___VH—_N WVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSS

AIX24

AIX17

25

FR: Framework-Region; CDR: Komplement-bestimmende Region. Die oberen Sequenzen (DP47, DP49, DP31 , DP71 und DPL10) sind zu Vergleichszwecken angegeben und stellen die am nächsten verwandte bekannte Stammliniensequenz dar. Striche bedeuten Identität. Für die schwere Kette sind die ersten drei Aminosäuren (QVK) durch die Vektorsequenz von

30 pComb3 bestimmt.

Tabelle 7b

A. Schwere Ketten Klone FRI CDR1 FR2 CDR2 FR3 CDR3 FR4

DP-46 QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFS SYAMH WVRQAPGKGLEWVA VISYDGSNKYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR

AI -B14 --K-L D-G-- A __s N ST F DSETAIAAAGRFDI WGQGTMVTVSS

AI -B17

DP-10 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFS SYAIS WVRQAPGQGLEWMG GIIPIFGTANYAQKFQG RVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR

AI-B18 —K-LE M -HT— -_T _v P R—T-DDSGI EDGTTVPSQPLEF WGQGTRVTVSS

DP- 9 QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFS SYGMH WVRQAPGKGLEWVA VISYDGSNKYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK

AI-B24 —K-L L G S N K-AI- Y-S A—SN-G-T V S VR GSGSYLGYYFDY WGQGTLVTVSS

DP-5 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTLϊ ELSMH WVRQAPGKGLEWMG GFDPEDGETIYAQKFQG RVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCAT

AI-B3Θ Q-K-LE GLRSYNYGRMLDY WGQGTLVTVSS

B. Leichte Ketten Klone FRj CDR1 FR2 CDR2 FR3 CDR3 FR4

VL3h SYVLTQPPSVSVAPGKTARITC GGNNIGSKSVH WYQQKPGQAPVLVIY YDSDRPS FI PERFSGSNSGNTATLTI SRVEAGDEADYYC QVWDSΞSDH AI-B24 -V RQ--T— —YK V- E— Y HT -Q TI FGGGTKLTVLRQPKAAPSVTLFPPSS

25

FR: Framework-Region; CDR: Komplement-bestimmende Region. Die oberen Sequenzen (DP46, DP10, DP49, DP5 und VL3h) sind zu Vergleichszwecken angegeben und stellen die am nächsten verwandte bekannte Stammliniensequenz dar. Striche bedeuten Identität. Für die schwere Kette sind die ersten drei Aminosäuren (QVK) durch die Vektorsequenz von pComb3 bestimmt.

3. Einfluß von Autoantikörper-Polypeptiden auf die Bindung von Fibrinogen an Blutplättchen

3.1 Methoden

Analyse der Fab-Bindung an EDTA-vorbehandelte Blutplättchen

Ein an Blutplättchen reiches Plasma wurde 30 min mit 10 mM EDTA inkubiert. Biotinylierte PDG-B und PDG-A Polypeptide wurden zugegeben und für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Die Bindung von PDG-A und PDG-B an Blutplättchen wurden mittels durchflußzytometrischer Analyse unter Verwendung von Phycoerythrin-markiertem Streptavidin gemessen.

Aqqreqationsexperimente

An Blutplättchen reiches Plasma (250 x 1 0⁹/l) wurde frisch hergestellt und unter 5% CO₂ gehalten. Das Plasma wurde durch unterschiedliche Verdünnungen an ADP (maximale Konzentration 410 //M) in Abwesenheit oder in Gegenwart von PDG-A oder PDG-B (maximale Menge 10 μg Fab) aktiviert. Die Aggregation wurde in einem Aggregometer Rodell 300BD-5 (Baxter AG, Düdingen, CH) gemessen. In weiteren Experimenten wurde nach Zugabe von PDG-A oder PDG-B polyklonales Anti-Fab-Antiserum zu den aktivierten Plättchen gegeben.

Fibrinoqen-Bindetest

Vertiefungen von ELISA-Platten wurden mit 0,5μg/ml GPIIb/llla beschichtet und mit 3,5% Rinderserumalbumin in Tris-gepufferter Salzlösung blockiert. Dann wurde Fibrinogen (Kabi Diagnostics, Stockholm, Schweden) in unter- schiedlichen Konzentrationen (maximal 0,08 μg/ml) in Abwesenheit oder in Gegenwart von PDG-A, PDG-B oder Anti-lgE Fab zur Kontrolle zugegeben (maximale Konzentrationen 23 yg/ml) . Das gebundene Fibrinogen wurde mit Ratten-Anti-Humanfibrogen- Antikörper, biotinyliertem Maus-Anti-Ratten- Antikörper und einem Konjugat aus Streptavidin und biotinylierter Meerret- tichperoxidase (Amersham Pharmacia Biotech Europe GmbH, Dübendorf, CH) unter Verwendung eines ELISA-Easy-Ablesegeräts (EAR340AT, SLT- Instruments, Österreich) bei 405 nm gemessen.

Kompetitionsassay unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers 7E3 und des Antikörperfraqments ReoPro^®

An Plättchen reiches Plasma (230 x 10⁹/l) wurde für 1 ,5 h mit PDG-B oder PDG-A (200 bzw. 400 //g/ml) mit oder ohne dem murinen monoklonalen Antikörper 7E3 oder dessen Fab-Fragment ReoPro^® (Gesamtmenge an Fab im Bereich von 10¹⁴ bis 10¹⁰) inkubiert. Nach Fixieren mit einem gleichen Volumen an 1 % Paraformaldehyd wurde die Bindung von PDG-B und PDG-A an Plättchen mittels durchflußzytometrischer Analyse unter Verwendung von Phycoerythrin-markiertem Streptavidin gemessen.

3.2 Ergebnisse

Die getesteten rekombinanten Anti-GPIIb/llla Fab Autoantikörperfragmente zeigen keine Bindung an Blutplättchen, die mit 1 0 mM EDTA vorbehandelt worden waren. Dies zeigt, daß die Autoantikörperfragmente nur ein in seiner Konformation intaktes Antigen erkennen (Fig. 3).

In Aggregationexperimenten, bei denen an Plättchen angereichertes Plasma verwendet wurde, zeigten PDG-A oder PDG-B keine Hemmung der Aggregation. In einem Fibrinogenbindetest, bei dem die Fibrinogenkonzen- tration 10⁴ bis 10⁶ mal geringer als in Serum ist, wurde die Fibrinogenbindung durch PDG-A und PDG-B vollständig gehemmt (Fig. 4) . Bei Ver- wendung von Anti-lgE Fab als Kontrolle, das durch ein ähnliches Anreicherungsprotokoll erhalten wurde, trat keine Hemmung auf. Diese Ergebnisse zeigen, daß sowohl PDG-A als auch PDG-B eine starke Wechselwirkung mit der Fibrinogenbindestelle auf GPIIb/llla zeigen.

In Untersuchungen mit dem murinen monoklonalen Anti-GPIIb/llla Antikörper 7E3 und dessen kommerziell erhältlichen Fab-Fragment ReoPro^®, die beide die Fibrinogenbindung an aktiviertes GPIIb/llla hemmen, wurde eine selektive und vollständige Hemmung der PDG-B Bindung an Blutplättchen gefunden (Figuren 5 bis 7) . In Gegensatz dazu wurde die Bindung von PDG- A an Blutplättchen weder durch 7E3 noch durch ReoPro^® signifikant gehemmt.

SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE ANGABEN:

( i ) ANMELDER :

(A) NAME: ASAT AG Applied Science & Technology

(B) STRASSE: Baarerstrasse 77

(C) ORT: Zug

(E) LAND: CH

(F) POSTLEITZAHL: 6302

(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Re ombinante Antikoerper (iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 30

(iv) COMPUTER-LESBARE FASSUNG:

(A) DATENTRÄGER: Floppy disk

(B) COMPUTER: IBM PC compatible

(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS

(D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version #1.30 (EPA)

(vi) DATEN DER URANMELDUNG:

(A) ANMELDENUMMER: DE 19723904.8

(B) ANMELDETAG: 06-JUN-1997

(vi) DATEN DER URANMELDUNG:

(A) ANMELDENUMMER: DE 19755227.7

(B) ANMELDETAG: 12-DEC-1997

(vi) DATEN DER URANMELDUNG:

(A) ANMELDENUMMER: DE 19820663.1

(B) ANMELDETAG: 08 -MAY- 1998

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 1:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 357 Basenpaare

(B) ART: Nucleotid

(C) STRANGFORM: beides

(D) TOPOLOGIE: linear

(ix) MERKMAL:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS

(B) LAGE :1..357

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:

CAG GTG AAA CTG CTC GAG TCG GGC CCA GGA CTG GTG AAG CCT TCG GAG 48 Gin Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15

ACC CTG TCC CTC AAC TGC ACT GTC TCT GGT CGC TCC ATC AGT GGT TAC 96 Thr Leu Ser Leu Asn Cys Thr Val Ser Gly Arg Ser Ile Ser Gly Tyr 20 25 30

TCT TGG AGA TGG ATC CGG CAG TCT CCA GGG AAG GGA CTA GAG TGG ATT 144 Ser Trp Arg Trp Ile Arg Gin Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45

GGG GAT ATC TCT TAT AGT GGG AGT ACC AAG TAC AAA CCC TCC CTC AGG 192 Gly Asp Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Lys Tyr Lys Pro Ser Leu Arg 50 55 60

AGT CGA GTC ACC CTG TCA GTA GAC ACG TCC AAG AAC CAG TTC TCC CTG 240 Ser Arg Val Thr Leu Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ser Leu 65 70 75 80

AAG CTG AAT TCG GTG ACC GCT GCG GAC ACG GCC GTC TAT TAC TGT GCG 288 Lys Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95

CGA GTC TTG CCC TTT GAC CCG ATC TCG ATG GAC GTC TGG GGC AAA GGG 336 Arg Val Leu Pro Phe Asp Pro Ile Ser Met Asp Val Trp Gly Lys Gly 100 105 110

ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA 357

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115

(2 ) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 2 :

( i ) SEQUENZKENNZEICHEN :

(A) LÄNGE: 119 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure (D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 2:

Gin Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Asn Cys Thr Val Ser Gly Arg Ser Ile Ser Gly Tyr 20 25 30

Ser Trp Arg Trp Ile Arg Gin Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Asp Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Lys Tyr Lys Pro Ser Leu Arg 50 55 60

Ser Arg Val Thr Leu Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ser Leu 65 70 75 80

Lys Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95

Arg Val Leu Pro Phe Asp Pro Ile Ser Met Asp Val Trp Gly Lys Gly 100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 333 Basenpaare

(B) ART: Nucleotid

(C) STRANGFORM: beides

(D) TOPOLOGIE: linear

(ix) MERKMAL:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS

(B) LAGE :1..333

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 3:

GTG GTG ACT CAG CCA CCC TCA GCG TCT GGG ACC CCC GGG CAG TGG GTC 48 Val Val Thr Gin Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gin Trp Val 120 125 130 135

ACC ATC TCT TGT TCT GGG AGC AGC TCC AAC ATC AGA AGT AAT CCT GTT 96 Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Arg Ser Asn Pro Val 140 145 150

AGC TGG TAT CAC CAG GTC CCA GGC ACG GCC CCC AAA CTC CTC ATC TTT 144 Ser Trp Tyr His Gin Val Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Phe 155 160 165

GGT AGT CAT CAG CGG CCC TCA GGG GTC CCT GAC CGA TTC TCT GGC TCC 192 Gly Ser His Gin Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 170 175 180

AAG TCG GGC ACC TCC GCC TCC CTG GCC ATC CGT GGG CTC CAA TCT GGG 240 Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Arg Gly Leu Gin Ser Gly 185 190 195

GAT GCT GGT GAC TAT TAC TGT GCA ACA TGG GAT GAC GGC CTC AAT GGT 288 Asp Ala Gly Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Asp Gly Leu Asn Gly 200 205 210 215

CCG GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAG CTG ACC GTC CTA AGT CAG CCC 333

Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Gin Pro 220 225 230

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 4:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 111 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure (D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 4:

Val Val Thr Gin Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gin Trp Val 1 5 10 15

Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Arg Ser Asn Pro Val 20 25 30

Ser Trp Tyr His Gin Val Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Phe 35 40 45

Gly Ser His Gin Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60

Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Arg Gly Leu Gin Ser Gly 65 70 75 80

Asp Ala Gly Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Asp Gly Leu Asn Gly 85 90 95

Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Gin Pro 100 105 110

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 5:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 369 Basenpaare

(B) ART: Nucleotid

(C) STRANGFORM: beides

(D) TOPOLOGIE: linear

(ix) MERKMAL: (A) NAME /SCHLÜSSEL : CDS

(B) LAGE : 1 . . 369

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 5:

CAG GTG AAA CTG CTC GAG TCT GGG GGA GGC GTG GTC CAG CCT GGG AGG 48 Gin Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 115 120 125

TCC CTG AGA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACC TTC AGT AGC TAT 96 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 130 135 140

GCT ATG CAC TGG GTC CGC CAG GCT CCA GGC AAG GGG CTG GAG TGG GTG 144 Ala Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 145 150 155

GCA GTT ATA TCA TAT GAT GGA AGC AAT AAA TAC TAC GCA GAC TCC GTG 192 Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 160 165 170 175

AAG GGC CGA TTC GCC ATC TCC AGA GAC AAT TCC AAG AAC ACG CTG TAT 240 Lys Gly Arg Phe Ala Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 180 185 190

CTG CAA ATG AAC AGC CTG AGA GCT GAG GAC ACG GCT GTG TAT TAC TGT 288 Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 195 200 205

GCG AGA GCG CTG GGG AGC TGG GGG GGT TGG GAC CAC TAC ATG GAC GTC 336 Ala Arg Ala Leu Gly Ser Trp Gly Gly Trp Asp His Tyr Met Asp Val 210 215 220

TGG GGC AAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA 369

Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 225 230

{2 ) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 6 :

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 123 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure (D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 6:

Gin Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ala Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Ala Leu Gly Ser Trp Gly Gly Trp Asp His Tyr Met Asp Val 100 105 110 Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 7:

(i) SEQUENZ-KENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 333 Basenpaare

(B) ART: Nucleotid

(C) STRANGFORM: beides

(D) TOPOLOGIE: linear

(ix) MERKMAL:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS

(B) LAGE :1..333

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7:

GTG GTG ACT CAG CCA CCC TCA GCG TCT GGG ACC CCC GGG CAG AGG GTC 48 Val Val Thr Gin Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gin Arg Val 125 130 135

ACC ATC TCT TGT TCT GGA AGC AGC TCC AAC ATC GGA AGT AAT ACT GTA 96 Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Thr Val 140 145 150 155

AAC TGG TAC CAG CAG CTC CCA GGA ACG GCC CCC AAA CTC CTC ATC TAT 144 Asn Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 160 165 170

AGT AAT AAT CAG CGG CCC TCA GGG GTC CCT GAC CGA TTC TCT GGC TCC 192 Ser Asn Asn Gin Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 175 180 185

AAG TCT GGC ACC TCA GCC TCC CTG GCC ATC AGT GGG CTC CAG TCT GAG 240 Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gin Ser Glu 190 195 200

GAT GAG GCT GAT TAT TAC TGT GCA GCA TGG GAT GAC AGC CTG AAT GGT 288 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly 205 210 215

TGG GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAG CTG ACC GTC CTA GGT CAG CCC 333

Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gin Pro 220 225 230

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 8:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 111 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure (D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 8:

Val Val Thr Gin Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gin Arg Val 1 5 10 15

Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Thr Val 20 25 30

Asn Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45

Ser Asn Asn Gin Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60

Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gin Ser Glu 65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly 85 90 95

Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gin Pro 100 105 110

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 9:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 369 Basenpaare

(B) ART: Nucleotid

(C) STRANGFORM: beides

(D) TOPOLOGIE: linear

(ix) MERKMAL:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS

(B) LAGE:1..369

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 9:

CAG GTG AAA CTG CTC GAG TCT GGG GGA GGC TTG GTT CAC CCC GGG GGG 48 Gin Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly 115 120 125

TCC CTG AGA CTC TCT TGT GCA GCC TCT GGA TTT ACG TTT GAC AAC TTT 96 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asn Phe 130 135 140

GCC ATG AGC _. TGG GTC CGC CAG GCT CCA GGG AAG GGG CTG GAG TGG GTC 144 Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 145 150 155

TCA GGC ATT AGT GGT GGT GGT CTT TTG ACA CAC TAC GCA GAC TCC GTG 192 Ser Gly Ile Ser Gly Gly Gly Leu Leu Thr His Tyr Ala Asp Ser Val 160 165 170 175

AAG GGC CGG TTC ACC ATC TCC AGA AAC AAT TCC AGG AAC ACT GTA TAC 240 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asn Asn Ser Arg Asn Thr Val Tyr 180 185 190

CTA CAA ATG AAC AGC CTG AGA GCC GAA GAC ACG GCC GTG TAT TAT TGT 288 Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 195 200 205

GTG AGA GAT CTG GGC TAT AGA GTA CTT TCG ACT TTT ACT TTT GAT ATC 336 Val Arg Asp Leu Gly Tyr Arg Val Leu Ser Thr Phe Thr Phe Asp Ile 210 215 220

TGG GGC CAG GGG ACA AAG GTC ACC GTC TCT TCA 369

Trp Gly Gin Gly Thr Lys Val Thr Val Ser Ser 225 230

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 10:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 123 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure (D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 10:

Gin Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asn Phe 20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Gly Ile Ser Gly Gly Gly Leu Leu Thr His Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asn Asn Ser Arg Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Val Arg Asp Leu Gly Tyr Arg Val Leu Ser Thr Phe Thr Phe Asp Ile 100 105 110

Trp Gly Gin Gly Thr Lys Val Thr Val Ser Ser 115 120

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 11:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 375 Basenpaare

(B) ART: Nucleotid

(C) STRANGFORM: beides

(D) TOPOLOGIE: linear

(ix) MERKMAL:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS

(B) LAGE :1..375

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 11:

GTG GTG ACT CAG CCT GCC TCC GTG TCT GGG TCT CCT GGA CAG TCG ATC 48 Val Val Thr Gin Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gin Ser Ile 125 130 135

ACC ATC TCC TGC ACT GGA ACC AGC AGT GCT ATT GGG AAT TAT AAC TTT 96 Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Ala Ile Gly Asn Tyr Asn Phe 140 145 150 155

GTC CCC TGG TAC CAA CAG CAC CCA GGC AAA GCC CCC AAA CTC ATG ATT 144 Val Pro Trp Tyr Gin Gin His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile 160 165 170

TAT GAG GGC AGT AAG CGG CCC TCA GGG GTT TCT AAT CGC TTC TCT GGC 192 Tyr Glu Gly Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly 175 180 185

TCC AAG TCT GGC AAC ACG GCC TCC CTG ACA ATC TCT GGG CTC CAG GCT 240 Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gin Ala 190 195 200

GAG GAC GAG GCT GAG TAT TAC TGC TGC TCA TAT GTT CAT AGT AGC ACT 288 Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Cys Ser Tyr Val His Ser Ser Thr 205 210 215

AAT TGG GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAG CTG ACC GTC CTA GGT CAG CCC 336 Asn Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gin Pro 220 225 230 235

AAG GCT GCC CCC TCG GTC ACT CTG TTC CCA CCC TCC TCT 375

Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser 240 245

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 12:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 125 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure (D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 12:

Val Val Thr Gin Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gin Ser Ile 1 5 10 15

Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Ala Ile Gly Asn Tyr Asn Phe 20 25 30

Val Pro Trp Tyr Gin Gin His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile 35 40 45

Tyr Glu Gly Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gin Ala 65 70 75 80

Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Cys Ser Tyr Val His Ser Ser Thr 85 90 95

Asn Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gin Pro .100 105 110

Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser 115 120 125

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 13:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 366 Basenpaare

(B) ART: Nucleotid

(C) STRANGFORM: beides

(D) TOPOLOGIE: linear

(ix) MERKMAL:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS

(B) LAGE:1..366

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 13:

CAG GTG AAA CTG CTC GAG TCA GGA CCA GGA CTG GTG AAG CCC TCG GAG 48 Gin Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 130 135 140

ACC CTG TCT CTC ACC TGC ACT GTC TCT GAT GTC TCC ATC AGA AGT CAT 96 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Asp Val Ser Ile Arg Ser His 145 150 155

TAC TGG AGT TGG CTC CGG CAG CCC CCA GGG AAG GGA CTG GAG TGG ATT 144 Tyr Trp Ser Trp Leu Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 160 165 170 GGG TTT ATC TAT GAC GGT GCG AGA ACC AGG TTC AAC CCC TCC CTC AGG 192 Gly Phe Ile Tyr Asp Gly Ala Arg Thr Arg Phe Asn Pro Ser Leu Arg 175 180 185

AGT CGA GTC TCC CTT TCA ATG GAC CCA TCC AAG AAG CAG TTT TCC CTG 240 Ser Arg Val Ser Leu Ser Met Asp Pro Ser Lys Lys Gin Phe Ser Leu 190 195 200 205

AAA CTG GGG TCT GTG ACC GCT GCG GAC TCG GCC GTC TAC TAC TGT GCG 288 Lys Leu Gly Ser Val Thr Ala Ala Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 210 215 220

AGA GAC GCG GAT GGA GAT GGC TTC AGC CCA TAC TAC TTT CCC TAC TGG 336 Arg Asp Ala Asp Gly Asp Gly Phe Ser Pro Tyr Tyr Phe Pro Tyr Trp 225 230 235

GGC CAG GGA ATC CCG GTC TCC GTC TCC TCG 366

Gly Gin Gly Ile Pro Val Ser Val Ser Ser 240 245

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 14:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 122 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure (D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 14:

Gin Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Asp Val Ser Ile Arg Ser His 20 25 30

Tyr Trp Ser Trp Leu Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Phe Ile Tyr Asp Gly Ala Arg Thr Arg Phe Asn Pro Ser Leu Arg 50 55 60

Ser Arg Val Ser Leu Ser Met Asp Pro Ser Lys Lys Gin Phe Ser Leu 65 70 75 80

Lys Leu Gly Ser Val Thr Ala Ala Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95

Arg Asp Ala Asp Gly Asp Gly Phe Ser Pro Tyr Tyr Phe Pro Tyr Trp 100 105 110

Gly Gin Gly Ile Pro Val Ser Val Ser Ser 115 120

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 15:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 372 Basenpaare

(B) ART: Nucleotid

(C) STRANGFORM: beides

(D) TOPOLOGIE: linear

(ix) MERKMAL:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS

(B) LAGE :1..372 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 15:

CAG GTG AAA CTG CTC GAG TCT GGG GGA GGC GTG GTC CAC CCT GGG AGG 48 Gin Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Val Val His Pro Gly Arg 125 130 135

TCC CTG AGA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACC TTC AGT AGC TAT 96 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 140 145 150

ACT ATG CAC TGG GTC CGC CAG GCT CCA GGC AAG GGG CTG GAG TGG GTG 144 Thr Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 155 160 165 170

GCA CTT ATA TCA TAT GAT GGA AGC AAT AAA TAC TAC GCA GAC TCC GTG 192 Ala Leu Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 175 180 185

AAG GGC CGA TTC GCC ATC TCC AGA GAC AAT TCC AAG AAC ACG CTA TAT 240 Lys Gly Arg Phe Ala Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 190 195 200

CTG CAA ATG AAC AGC CTG AGA GCT GAG GAC ACG GCT GTG TAT TAC TGT 288 Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 205 210 215

GCG AAA GAT GGC CGG AGT GGG AGC TAC GCC AGG TTC GAC GGT ATG GAC 336 Ala Lys Asp Gly Arg Ser Gly Ser Tyr Ala Arg Phe Asp Gly Met Asp 220 225 230

GTC TGG GGC CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA 372

Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 235 240 245

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 16:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 124 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure (D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 16:

Gin Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Val Val His Pro Gly Arg 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Thr Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala Leu Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ala Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Lys Asp Gly Arg Ser Gly Ser Tyr Ala Arg Phe Asp Gly Met Asp 100 105 110

Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 *~ o o ^—

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 17:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 372 Basenpaare

(B) ART: Nucleotid

(C) STRANGFORM: beides

(D) TOPOLOGIE: linear

(ix) MERKMAL:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS

(B) LAGE:1..372

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 17:

CAG GTG AAA CTG CTC GAG TCT GGG GGA GGC TTG GTA CAG CCT GGC AGG 48 Gin Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Arg 125 130 135 140

TCC CTG AGA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACC TTT GAT GAT TAT 96 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 145 150 155

GCC CTG CAC TGG GTC CGT CAA GCT CCA GGG AAG GGC CTG GAG TGG GTC 144 Ala Leu His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 160 165 170

TCA GGT ATT AGT TGG GAT AGT GGT ACC ATA GGC TAT GCG GAC TCT GTG 192 Ser Gly Ile Ser Trp Asp Ser Gly Thr Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val 175 180 185

AAG GGC CGA TTC ACC ATC TCC AGA GAC AAC GCC AAG AAC TCC CTG TAT 240 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 190 195 200

CTG CAA ATG AAC AGT CTG AGA GCT GAG GAC ACG GCC TTG TAT TAC TGT 288 Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 205 210 215 220

GTA AAA GAT ATG GGG TCT TCG GTA GTG GCT ACG TAC AAT GCT TTT GAT 336 Val Lys Asp Met Gly Ser Ser Val Val Ala Thr Tyr Asn Ala Phe Asp 225 230 235

ATC TGG GGC CAA GGG ACA ATG GTC ACC GTC TCT TCA 372

Ile Trp Gly Gin Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 240 245

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 18:

( i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 124 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure (D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 18:

Gin Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Arg 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30

Ala Leu His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Ser Trp Asp Ser Gly Thr Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95

Val Lys Asp Met Gly Ser Ser Val Val Ala Thr Tyr Asn Ala Phe Asp 100 105 110

Ile Trp Gly Gin Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 19:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 360 Basenpaare

(B) ART: Nucleotid

(C) STRANGFORM: beides

(D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA zu mRNA

(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : AI-X2

(ix) MERKMAL:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS

(B) LAGE:1..360

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 19:

CAG GTG AAA CTG CTC GAG TCA GGC CCA GGA CTG GTG AAG CCT TCG GAG 48 Gin Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 125 130 135 140

ACC CTG TCC CTC ACC TGC ACT GTC TCT GGT GGC TCC TTC AGT ACT TAC 96 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Phe Ser Thr Tyr 145 150 155

TAT TGG AGC TGG ATC CGG CAG CCC CCA GGG AAG GGA CTG GAG TGG ATT 144 Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 160 165 170

GGG TAT ATC TAT TAC AGT GGG AAC ACC AAC TAC AAC CCC TCC CTC AAG 192 Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 175 180 185

AGT CGA GCC ACC ATA TCA GTA GAC ACG TCC AAG AAC CAG TTC TCC CTG 240 Ser Arg Ala Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ser Leu 190 195 200

AAG CTG AGC TCT GTT ACC GCC GCA GAC ACG GCC GTA TAT TAC TGT GCG 288 Lyε Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 205 210 215 220

AGA CTG CGT AAC GAT GGC TGG AAT GAT GGC TTT GAT ATC TGG GGC CAA 336 Arg Leu Arg Asn Asp Gly Trp Asn Asp Gly Phe Asp Ile Trp Gly Gin 225 230 235

GGG ACA ATG GTC ACC GTC TCT TCA 360

Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 240 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 20:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 120 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure (D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 20:

Gin Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Phe Ser Thr Tyr 20 25 30

Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60

Ser Arg Ala Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ser Leu 65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95

Arg Leu Arg Asn Asp Gly Trp Asn Asp Gly Phe Asp Ile Trp Gly Gin 100 105 110

Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 21:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 369 Basenpaare

(B) ART: Nucleotid

(C) STRANGFORM: beides

(D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA zu mRNA

(vi) URSPRÜNLICHE HERKUNFT:

(A) ORGANISMUS : Homo sapiens

(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:

(B) CLON(E) : AI-B14

(viii) POSITION IM GENOM:

(A) CHROMOSOM/SEGMENT: 14

(B) KARTENPOSITION: g32.3

(ix) MERKMAL:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS

(B) LAGE:1..369

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 21:

CAG GTG AAA CTG CTC GAG TCT GGG GGA GGC GTG GTC CAG CCT GGG AGG 48 Gin Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 125 130 135

TCC CTG AGA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACC TTC AGT GAC TAT 96 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 140 145 150 GGC ATG CAC TGG GTC CGC CAG GCT CCA GGC AAG GGG CTG GAG TGG GTG 144 Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 155 160 165

GCA GCT ATA TCA TAT GAT GGA AGT AAC AAA TAC TAT GCA GAC TCC GTG 192 Ala Ala Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 170 175 180

AAG GGC CGA TTC TCC ATC TCC AGA GAC AAT TCC AAC AAT ACG CTA TAT 240 Lys Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Asn Ser Asn Asn Thr Leu Tyr 185 190 195 200

CTG CAA ATG AGC ACC CTG AGA GCT GAG GAC ACG GCT GTC TAT TTC TGT 288 Leu Gin Met Ser Thr Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 205 210 215

GCG AGA GAT TCG GAA ACG GCA ATA GCG GCA GCT GGA CGG TTT GAT ATC 336 Ala Arg Asp Ser Glu Thr Ala Ile Ala Ala Ala Gly Arg Phe Asp Ile 220 225 230

TGG GGC CAA GGG ACA ATG GTC ACC GTC TCT TCA 369

Trp Gly Gin Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 235 240

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 22:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 123 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure (D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 22:

Gin Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 1 . 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala Ala Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Asn Ser Asn Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Ser Thr Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95

Ala Arg Asp Ser Glu Thr Ala Ile Ala Ala Ala Gly Arg Phe Asp Ile 100 105 110

Trp Gly Gin Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 23:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 366 Basenpaare

(B) ART: Nucleotid

(C) STRANGFORM: beides

(D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA zu mRNA _ _{ß 2} _

(vi) URSPRÜNLICHE HERKUNFT:

(A) ORGANISMUS : Homo sapiens

(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:

(B) CLON(E) : AI-B18

(viii) POSITION IM GENOM:

(A) CHROMOSOM/SEGMENT: 14

(B) KARTENPOSITION: q32.3

(ix) MERKMAL:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS

(B) LAGE:1..366

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 23:

CAG GTG AAA CTG CTC GAG TCT GGG GCT GAG GTG AAG AAG CCT GGG TCC 48 Gin Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 125 130 135

TCG GTG ATG GTC TCC TGC AAG GCT TCT GGA GGC ACC TTC AGC AGC CAT 96 Ser Val Met Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser His 140 145 150 155

ACT ATC AGC TGG GTG CGG CAG GCC CCT GGA CAA GGC CTT GAG TGG ATG 144 Thr Ile Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 160 165 170

GGA GGG ATC ACC CCT ATC TTT GGT ACA GTG AAC TAC GCA CAG AAG TTC 192 Gly Gly Ile Thr Pro Ile Phe Gly Thr Val Asn Tyr Ala Gin Lys Phe 175 180 185

CAG GGC AGA GTC ACC ATT ACC GCG GAC GAA CCC ACG AGC ACA GCC TAC 240 Gin Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Pro Thr Ser Thr Ala Tyr 190 195 200

ATG GAA CTG AGG AGC CTG ACA TCT GAC GAC TCG GGC ATC TAT TAC TGT 288 Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Gly Ile Tyr Tyr Cys 205 210 215

GCG AGA GAA GAT GGC ACT ACA GTA CCA AGT CAA CCC CTT GAG TTC TGG 336 Ala Arg Glu Asp Gly Thr Thr Val Pro Ser Gin Pro Leu Glu Phe Trp 220 225 230 235

GGC CAG GGA ACC CGG GTC ACC GTC TCC TCT 366

Gly Gin Gly Thr Arg Val Thr Val Ser Ser 240 245

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 24:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 122 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure (D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 24:

Gin Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15

Ser Val Met Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser His 20 25 30

Thr Ile Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Thr Pro Ile Phe Gly Thr Val Asn Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60

Gin Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Pro Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Gly Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Glu Asp Gly Thr Thr Val Pro Ser Gin Pro Leu Glu Phe Trp 100 105 110

Gly Gin Gly Thr Arg Val Thr Val Ser Ser 115 120

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 25:

(i) ΞEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 363 Basenpaare

(B) ART: Nucleotid

(C) STRANGFORM: beides

(D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA zu mRNA

(vi) URSPRÜNLICHE HERKUNFT:

(A) ORGANISMUS : Homo sapiens

(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:

(B) CLON(E) : AI-B24

(viii) POSITION IM GENOM:

(A) CHROMOSOM/SEGMENT: 14

(B) KARTENPOSITION: q32.3

(ix) MERKMAL:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS

(B) LAGE:1..363

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 25:

CAG GTG AAA CTG CTC GAG TCT GGG GGA GGC TTG GTC CAG CCT GGG GGG 48 Gin Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 125 130 135

TCC CTG AGA CTC TCC TGT TCA GCC TCT GGA TTC ACC TTC AAT AAA TAT 96 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr 140 145 150

GCA ATA CAC TGG GTC CGC CAG GCT CCA GGG AAG GGA CTG GAA TAT GTT 144 Ala Ile His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Val 155 160 165 170

TCA GCT ATT AGT AGT AAT GGG GGT AAC ACA TAC TAC GCA GAC TCC GTG 192 Ser Ala Ile Ser Ser Asn Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 175 180 185

AAG GGC AGA TTC ACC ATC TCC AGA GAC AAT TCC AAG AAC ACG GTG TAT 240 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr 190 195 200

CTT CAA ATG AGC AGT CTG AGA GCT GAG GAC ACG GCT GTG TAT TAC TGT 288 Leu Gin Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 205 210 215

GTT AGA GGA AGT GGG AGC TAC TTA GGA TAC TAC TTT GAC TAC TGG GGC 336 Val Arg Gly Ser Gly Ser Tyr Leu Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 220 225 230 ,. „

- 6 4 -

CAG GGA ACC CTG GTC ACC GTC TCC TCA 363

Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 235 240

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 26:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 121 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure (D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 26:

Gin Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr 20 25 30

Ala Ile His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Val 35 40 45

Ser Ala Ile Ser Ser Asn Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Val Arg Gly Ser Gly Ser Tyr Leu Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110

Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115^' 120

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 27:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 366 Basenpaare

(B) ART: Nucleotid

(C) STRANGFORM: beides

(D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA ZU mRNA

(vi) URSPRÜNLICHE HERKUNFT:

(A) ORGANISMUS: Homo sapiens

(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:

(B) CLON(E) : AI-B24

(viii) POSITION IM GENOM:

(A) CHROMOSOM/SEGMENT : 22

(B) KARTENPOSITION: qll

(ix) MERKMAL:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS

(B) LAGE :1..366

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 27:

GTG GTG ACT CAG CCA CCC TCG GTG TCA GTG GCT CCA AGA CAG ACG GCC 48 Val Val Thr Gin Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Arg Gin Thr Ala 125 130 135 ACG ATT ACC TGT GGG GGA TAC AAG ATT GGA AGT AAA AGT GTC CAC TGG 96 Thr Ile Thr Cys Gly Gly Tyr Lys Ile Gly Ser Lys Ser Val His Trp 140 145 150

TAC CAA CAG AAG CCA GGC CAG GCC CCT GTA TTG GTC GTC TAT GAG GAT 144 Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Val Leu Val Val Tyr Glu Asp 155 160 165

TCC TAC CGG CCC TCA GAG ATC CCT GAG CGA TTC TCT GGC TCC AAC TCT 192 Ser Tyr Arg Pro Ser Glu Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser 170 175 180 185

GGG AAC ATG GCC ACC CTG ACC ATC ACC GGG GTC GAA GCC GGG GAT GAG 240 Gly Asn Met Ala Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Glu Ala Gly Asp Glu 190 195 200

GCC GAC TAC TAC TGT CAG GTG TGG GAT AAT ACT AAT GAT CAG ACG ATA 288 Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Val Trp Asp Asn Thr Asn Asp Gin Thr Ile 205 210 215

TTC GGC GGA GGG ACC AAG CTG ACC GTC CTA CGT CAG CCC AAG GCT GCC 336 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Arg Gin Pro Lys Ala Ala 220 225 230

CCC TCG GTC ACT CTG TTC CCG CCC TCC TCT 366

Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser 235 240

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 28:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 122 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure (D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 28:

Val Val Thr Gin Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Arg Gin Thr Ala 1 5 10 15

Thr Ile Thr Cys Gly Gly Tyr Lys Ile Gly Ser Lys Ser Val His Trp 20 25 30

Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Val Leu Val Val Tyr Glu Asp 35 40 45

Ser Tyr Arg Pro Ser Glu Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser 50 55 60

Gly Asn Met Ala Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Glu Ala Gly Asp Glu 65 70 75 80

Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Val Trp Asp Asn Thr Asn Asp Gin Thr Ile 85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Arg Gin Pro Lys Ala Ala 100 105 110

Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser 115 120

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 29:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 366 Basenpaare

(B) ART: Nucleotid

(C) STRANGFORM: beides (D) TOPOLOGIE: linear (ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA zu mRNA

(vi) URSPRÜNLICHE HERKUNFT:

(A) ORGANISMUS : Homo sapiens

(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:

(B) CLON(E) : AI-B38

(viii) POSITION IM GENOM:

(A) CHROMOSOM/SEGMENT: 14

(B) KARTENPOSITION: q32.3

(ix) MERKMAL:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS

(B) LAGE:1..366

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 29:

CAG GTG AAA CTG CTC GAG TCT GGG GCT GAG GTG AAG AAG CCT GGG GCC 48 Gin Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 125 130 135

TCA GTG AAG GTC TCC TGC AAG GTT TCC GGA TAC ACC CTC ACT GAA TTA 96 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Leu 140 145 150

TCC ATG CAC TGG GTG CGA CAG GCT CCT GGA AAA GGG CTT GAG TGG ATG 144 Ser Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 155 160 165 170

GGA GGT TTT GAT CCT GAA GAT GGT GAA ACA ATC TAC GCA CAG AAA TTC 192 Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Gin Lys Phe 175 180 185

CAG GGC AGA GTC ACC ATG ACC GAG GAC ACA TCT ACA GAC ACG GCC TAC 240 Gin Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 190 195 200

ATG GAG CTG AGC AGC CTG AGA TCT GAG GAC ACG GCC GTG TAT TAC TGT 288 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 205 210 215

GAG ACA GGT CTG AGG TCG TAC AAC TAT GGT CGT AAC CTT GAC TAT TGG 336 Glu Thr Gly Leu Arg Ser Tyr Asn Tyr Gly Arg Asn Leu Asp Tyr Trp 220 225 230

GGC CAG GGA ACC CTG GTC ACC GTC TCC TCA 366

Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 235 240

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 30:

( i ) SEQUENZKENNZEICHEN :

(A) LÄNGE: 122 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure (D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 30:

Gin Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Leu 20 25 30 Ser Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60

Gin Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Glu Thr Gly Leu Arg Ser Tyr Asn Tyr Gly Arg Asn Leu Asp Tyr Trp 100 105 110

Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120

Claims

Ansprüche

1. Nukleinsäure, die für die schwere Kette eines humanen Antikörpers, ein funktionelles Derivat oder ein Fragment davon kodiert und eine

CDR3-Region umfaßt, ausgewählt aus:

(a) einer für die Aminosäuresequenz: V L P F D P I S M D V (I) kodierenden Nukleotidsequenz,

(b) einer für die Aminosäuresequenz: A LG SW G G W D H Y M D V (II) kodierenden Nukleotidsequenz,

(c) einer Nukleotidsequenz, die für eine Aminosäuresequenz mit einer Homologie von mindestens 80% zu einer Aminosäuresequenz aus (a) oder (b) kodiert und

(d) einer Nukleotidsequenz, die für eine Aminosäuresequenz mit einer äquivalenten Bindefähigkeit an GPIIb/llla kodiert.

2. Nukleinsäure nach Anspruch 1, weiterhin umfassend eine CDR1- Region ausgewählt aus:

(a) einer für die Aminosäuresequenz: G Y S W R kodierenden Nukleotidsequenz,

(b) einer für die Aminosäuresequenz:

S Y A M H (IV) kodierenden Nukleotidsequenz, und (c) einer Nukleotidsequenz, die für eine Aminosäuresequenz mit einer Homologie von mindestens 80% zu einer Aminosäuresequenz aus (a), oder (b) kodiert.

3. Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 oder 2, weiterhin umfassend eine CDR2-Region, ausgewählt aus

(a) einer für die Aminosäuresequenz: D I SY SG ST KY K PSL R S (V) kodierenden Nukleotidsequenz,

(b) einer für die Aminosäuresequenz: V I SY D G S N KYYA D SV K G (VI) kodierenden Nukleotidsequenz und

(c) einer Nukleotidsequenz, die für eine Aminosäuresequenz mit einer Homologie von mindestens 80% zu einer Aminosäuresequenz aus (a) oder (b) kodiert.

4. Nukleinsäure, die für die leichte Kette eines humanen Antikörpers, ein funktionelles Derivat oder ein Fragment davon kodiert und eine CDR 3-Region umfaßt, ausgewählt aus:

(a) einer für die Aminosäuresequenz: A T W D D G L N G P V (VII) kodierenden Nukleotidsequenz,

(b) einer für die Aminosäuresequenz: A A W D D S L N G W V (VIII) kodierenden Nukleotidsequenz, (c) einer Nukleotidsequenz, die für eine Aminosäuresequenz mit einer Homologie von mindestens 80% zu einer Aminosäuresequenz aus (a) oder (b) kodiert, und

5. Nukleinsäure nach Anspruch 4, weiterhin umfassend eine CDR1- Region ausgewählt aus:

(a) einer für die Aminosäuresequenz:

S G S S S N I R S N PV S (IX) kodierenden Nukleotidsequenz,

(b) einer für die Aminosäuresequenz:

S G S S S N I G S N TV N (X) kodierenden Nukleotidsequenz, und

6. Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 4 oder 5, weiterhin umfassend eine CDR2-Region ausgewählt aus:

(a) einer für die Aminosäuresequenz:

G S H Q R P S (XI) kodierenden Nukleotidsequenz,

(b) einer für die Aminosäuresequenz:

S N N Q R P S (XII) kodierenden Nukleotidsequenz, und (c) einer Nukleotidsequenz, die für eine Aminosäuresequenz mit einer Homologie von mindestens 80% zu einer Aminosäuresequenz aus (a) oder (b) kodiert.

Nukleinsäure, die für die schwere Kette eines humanen Antikörpers, ein funktionelles Derivat oder ein Fragment davon kodiert und eine CDR3-Region umfaßt, ausgewählt aus:

(a) einer für die Aminosäuresequenz:

V R D L G Y R V L ST FT F D I (XIII) kodierenden Nukleotidsequenz,

(b) einer für die Aminosäuresequenz: D G R S G SY A R F D G M D V (XIV) kodierenden Nukleotidsequenz,

(c) einer für die Aminosäuresequenz: M G S SVV ATY N A F D I (XV) kodierenden Nukleotidsequenz,

(d) einer für die Aminosäuresequenz: D A D G D G F S PYY F PY (XVI) kodierenden Nukleotidsequenz,

(e) einer für die Aminosäuresequenz: L R N D G W N D G F D I (XVII) kodierenden Nukleotidsequenz,

(f) einer für die Aminosäuresequenz: D S ETA I AA A G R F D I (XVIII) kodierenden Nukleotidsequenz,

GSGSYLGYYFDY (XX) kodierenden Nukleotidsequenz, (i) einer für die Aminosäuresequenz: G L R SY N Y G R N L DY (XXI) kodierenden Nukleotidsequenz, (j) einer Nukleotidsequenz, die für eine Aminosäuresequenz mit einer Homologie von mindestens 80% und vorzugsweise von mindestens 90% zu einer Aminosäuresequenz aus (a), (b), (c) oder (d) kodiert und

(k) einer Nukleotidsequenz, die für eine Aminosäuresequenz mit einer äquivalenten Bindefähigkeit an Autoantikörper gegen

GPIIb/llla kodiert.

8. Nukleinsäure nach Anspruch 7, weiterhin umfassend eine CDR1- oder/und CDR2-Region ausgewählt aus einer für die in Tab.7a oder b gezeigten Aminosäuresequenzen oder dazu mindestens 80% homologen Aminosäuresequenz kodierenden Nukleotidsequenz.

9. Nukleinsäure, die für die leichte Kette eines humanen Antikörpers, ein funktionelles Derivat oder ein Fragment davon kodiert und eine CDR 3-Region umfaßt, ausgewählt aus:

(a) einer für die Aminosäuresequenz: C S Y V H S S T N (XXII) kodierenden Nukleotidsequenz,

(b) einer für die Aminosäuresequenz: QVW D N T N D Q (XXIII) kodierenden Nukleotidsequenz, (c) einer Nukleotidsequenz, die für eine Aminosäuresequenz mit einer Homologie von mindestens 80% und vorzugsweise mindestens 90% zu einer Aminosäuresequenz aus (a) kodiert und (d) einer Nukleotidsequenz, die für eine Aminosäuresequenz mit einer äquivalenten Bindefähigkeit an Autoantikörper gegen GPIIb/llla kodiert.

10. Nukleinsäure aus Anspruch 9, weiterhin umfassend eine CDR1 - oder/und CDR2-Region ausgewählt aus einer für die in Tab. 7a oder b gezeigten Aminosäuresequenzen oder dazu mindestens 80% homologen Aminosäuresequenz kodierenden Nukleotidsequenz.

1 1 . Vektor, dadurch gekennzeichnet, daß er (a) mindestens eine Kopie einer Nukleinsäure nach einem der

Ansprüche 1 bis 3 oder/und mindestens eine Kopie einer

Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 4 bis 6 enthält oder

(b) mindestens eine Kopie einer Nukleinsäure nach Anspruch 7 oder 8 oder/und mindestens eine Kopie einer Nukleinsäure nach Anspruch 9 oder 1 0 enthält.

1 2. Zelle, dadurch gekennzeichnet, daß sie (a) eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder/und eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 4 bis 6 oder (b) eine Nukleinsäure nach Anspruch 7 oder 8 oder/und eine Nukleinsäure nach Anspruch 9 oder 10 exprimiert.

1 3. Polypeptid, dadurch gekennzeichnet, daß es

(a) von einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder/und einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 4 bis

6 oder

(b) von einer Nukleinsäure nach Anspruch 7 oder 8 oder/und einer Nukleinsäure nach Anspruch 9 oder 10 kodiert ist.

14. Polypeptid nach Anspruch 1 3, dadurch gekennzeichnet, daß es die variable Domäne der H-Kette oder/und die variable Domäne der L-Kette eines humanen Antikörpers umfaßt.

1 5. Polypeptid nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß es sowohl die variable Domäne der H-Kette als auch die variable Domäne der L-Kette umfaßt.

1 6. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 3 bis 1 5, dadurch gekennzeichnet, daß es mit einer Markierungsgruppe oder einem Toxin gekoppelt ist.

1 7. Antikörper gegen ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 3 bis 1 6.

1 8. Antikörper nach Anspruch 1 7, dadurch gekennzeichnet, daß er gegen die CDR3-Region der schweren oder/und leichten Antikörperkette des Polypeptids gerichtet ist.

1 9. Pharmazeutische Zusammensetzung, die als aktive Komponente eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 1 0, einen Vektor nach Anspruch 1 1 , eine Zelle nach Anspruch 1 2, ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 3 bis 1 6 oder einen Antikörper nach einem der Ansprüche 1 7 oder 1 8, gegebenenfalls zusammen mit anderen aktiven Komponenten sowie pharmazeutisch üblichen Hilfs-, Zusatzoder Trägerstoffen enthält.

20. Verwendung einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 1 0 eines Vektors nach Anspruch 1 1 , einer Zelle nach Anspruch 1 2, eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 3 bis 1 6, eines Antikörpers nach Anspruch 1 7 oder 1 8 oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 1 9 zur Herstellung eines Mittels für die Diagnose oder für die Behandlung oder Prävention von AlTP.

21 . Verwendung einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 10, eines Vektors nach Anspruch 1 1 , einer Zelle nach Anspruch 1 2, eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 3 bis 1 6 oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 1 9 zur Herstellung eines Mittels zur Beeinflussung der Bindung von Fibrinogen an Blutplättchen.

22. Verwendung nach Anspruch 21 zur Herstellung eines Mittels für die Modulation der Blutgerinnung, insbesondere für die Auflösung von Thromben oder/und für die Prävention der Thrombenbildung.

23. Verfahren zur Gewinnung von Phagemid-Klonen, die Nukleinsäuren exprimieren, die für Autoantikörper gegen GPIIb/llla oder für gegen diese Autoantikörper gerichtete antiidiotypische Antikörper kodieren, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Phagemid-Bibliothek aus Lymphozyten eines humanen Spenders herstellt und die gewünschten Phagemid-Klone durch Affinitätsselektion, umfassend negative und positive Selektionsschritte, gewinnt.

24. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß man Antikörper-kodierende Nukleinsäuren aus den Klonen gewinnt.

25. Verfahren nach Anspruch 23 oder 24, dadurch gekennzeichnet, daß die Antikörper-kodierenden Nukleinsäuren zur Expression von rekombinanten Antikörperketten, Derivaten oder Fragmenten davon verwendet.