DE69918327T2

DE69918327T2 - Unterdrückung der abstossung bei xenotransplantation

Info

Publication number: DE69918327T2
Application number: DE69918327T
Authority: DE
Inventors: Satyavrat Punit RAMRAKHA; John Andrew Richmond GEORGE; Dorian Haskard; Ian Robert Lechler; Anthony Dorling
Original assignee: Imperial College Innovations Ltd
Current assignee: Ip2ipo Innovations Ltd
Priority date: 1998-11-20
Filing date: 1999-11-22
Publication date: 2006-05-11
Anticipated expiration: 2019-11-23
Also published as: US20070157328A1; EP1131411A2; AU1282900A; JP2002531072A; GB9825555D0; ES2224713T3; WO2000031126A2; DE69918327D1; WO2000031126A3; ATE269896T1; US20050255550A1; EP1131411B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Unterdrückung der Transplantatabstoßung, insbesondere die Unterdrückung der Xenotransplantatabstoßung.
Der Erfolg allogener Organtransplantationen ist in den letzten Jahrzehnten gut etabliert worden. Die eingeschränkte Verfügbarkeit von Spenderorganen bedeutet jedoch, dass viele Patienten eine geringe oder keine Chance haben, ein transplantiertes Organ zu erhalten, und daher versterben, bevor ein geeignetes Organ gefunden ist. Eine mögliche Lösung für dieses Problem ist die Transplantation von Xenotransplantaten bzw. die Verwendung von Organen aus einem nicht menschlichen („xenogenen") Spendertier.
Spenderorgane aus Schweinen sind besonders geeignete Kandidaten für eine Transplantation, da Schweine anatomisch und physiologisch dem Menschen ähnlich sind, in ausreichender Zahl zur Verfügung stehen und relativ frei von Pathogenen sind, die beim Menschen Infektionen verursachen können.
Darüber hinaus ermöglicht die transgene Technologie die genetische Modifizierung des Spendergewebes zur Aufhebung der Abstoßungsreaktion.
Ein Problem in Zusammenhang mit der Übertragung von Xenotransplantaten ist, dass diese xenogenen Organe bei einer Revaskularisierung durch einen humoral vermittelten Vorgang, der so genannten hyperakuten Abstoßung (HAA), schnell abgestoßen werden. Dies wird durch Vorhandensein natürlich vorkommender Antikörper im Transplantatempfänger verursacht, die Antigene auf den Endothelzellen (EZ) des Xenotransplantates erkennen und mit ihnen reagieren. Diese Erkennung löst die Komplementkaskade aus, was wiederum zu einer Abstoßung führt.
In den letzten Jahren sind einige neuartige, therapeutische Ansätze zur Unterdrückung einer HAA vorgeschlagen und erfolgreich getestet worden (Bach, 1998). Diese beruhen entweder auf einer Unterdrückung der Komplementaktivierung oder auf einer Prävention der Bindung von xenoreaktiven, natürlichen Antikörpern. Bei einer Transplantation vom Schwein zum Menschen gilt die HAA nicht mehr als unüberwindliches Problem. Es wird jedoch deutlich, dass die Prävention einer HAA alleine wahrscheinlich nicht ausreichend ist, um die Abstoßung xenogener Organe zu verhindern.
Selbst wenn HAA überwunden wird, kommt es typischerweise innerhalb von 2–3 Tagen zu einer starken Abstoßung des Transplantates, d.h. viel schneller als bei den meisten Formen einer allogenen Transplantation; dieser Vorgang wird verzögerte Xenotransplantatabstoßung (DXR) genannt. Die Histologie dieser Art der Abstoßung unterscheidet ich von HAA durch weniger Blutungen, allerdings mit einer signifikanten intravaskulären Thrombose. Darüber hinaus kommt es zu einer Ablagerung xenoreaktiver Antikörper auf dem Endothel sowie von Fibrin, Thrombozytenaggegraten und zu einer Infiltration des perivaskulären Gewebes mit inflammatorischen Zellen (Neutrophilen, Makrophagen und NK-Zellen) (Blakely et al., 1994).
Außer einer DXR besteht das Problem einer T-Lymphozyten-vermittelten Abstoßung. Es ist gezeigt worden (Dorling et al., 1994), dass die T-Zell-Antwort gegen Xenotransplantate aus Schweinen mindestens gleichwertig ist wie die Reaktion gegen ein Allotransplantat, aber wahrscheinlich aggressiver und mit Standarddosismengen systemischer Immunsuppressiva schwieriger zu kontrollieren ist.
Es wird angenommen, dass Endothelzellen (EZ) bei einer DXR die Rekrutierung inflammatorischer Zellen und die nachfolgende zelluläre Abstoßung auf unterschiedliche Art und Weise instrumentieren: (i) durch Produktion von Mediatorstoffen (wie beispielsweise Interleukin-8 (IL-8) und Plättchen-aktivierenden Faktor (PAF)), welche die Leukozytenfunktion, einschließlich die Adhäsion, aktivieren; (ii) durch ihre Wirkung als Antigen präsentierende Zellen, wobei sie die spezifische Immunantwort gegen das Fremdgewebe stimulieren; und (iii) durch Regulierung der räumlichen und zeitlichen Exprimierung von Zelladhäsionsmolekülen, um die Einwanderung von Leukozyten in das transplantierte Organ zu ermöglichen (Bevilacqua, 1993). Aus den rekrutierten Leukozyten freigesetzte Zytokine steigern die Exprimierung von Adhäsionsmolekülen auf der EZ-Oberfläche drastisch und verstärken so den Rekrutierungsprozess.
Die erste Struktur, mit der zirkulierende Leukozyten in Kontakt kommen, wenn Blut ein vaskularisiertes Transplantat perfundiert, ist das Endothel. Die Leukozyten müssen sich an diese Endothelbarriere anheften und diese durchqueren, um in das Transplantat einzuwandern. Kürzliche Fortschritte im Verständnis des Mechanismus der Wechselwirkungen zwischen Leukozyten und EZ haben eine Reihe von Adhäsions- und Aktivierungsereignissen (die Adhäsionskaskade) aufgedeckt, die während der Auswanderung von Leukozyten in die Gewebe hinein ablaufen (Springer, 1994). (Siehe 1).
Das zu Beginn stattfindende „Rollen" auf dem vaskulären Endothel wird durch vorübergehende Wechselwirkungen zwischen Selektinen (z.B. L-Selektin auf Leukozyten, E-Selektin auf aktivierten EZ und P-Selektin auf aktivierten EZ und aktivierten Thrombozyten) und Kohlenhydrat-tragenden Gegenstrukturen auf der gegenüber liegenden Zelle (EZ, Leukozyten oder Thrombozyten) (Tedder et al., 1995) vermittelt. Aufgrund der hohen Ein/Aus-Rate dieser Selektin-Kohlenhydrat-Wechselwirkungen kann diese Rezeptorklasse keine feste Adhäsion von Leukozyten unterstützen. Während des Rollens werden die Leukozyten aktivierenden Signalen ausgesetzt, was in einer Steigerung der Avidität der Integrine auf der Leukozytenoberfläche resultiert. Chemokine gelten als die wahrscheinlichsten Kandidaten für dieses auslösende Ereignis: Es wurde gezeigt, dass IL-8 auf der EZ-Oberfläche über Oberflächen-Proteoglykane verankert ist (Tanaka et al., 1993), was zu einer hohen lokalen Konzentration im Milieu des rollenden Leukozyten führt. Diese integrinvermittelte, sekundäre Adhäsion führt zu einem stabilen Stillstand des Leukozyten und ist gefolgt von dem Übertritt in die Gewebe (Springer, 1994).
Gegenrezeptoren für Leukozyten-Integrine sind Mitglieder der auf dem Endothel exprimierten Immunglobulin-Supergenfamilie (IgSF). Dazu gehören VCAM-1 (Vascular Cell Adhesion Molecule), ICAM-1 und ICAM-2 (Intercellular Adhesion Molecules) und MAd-CAM-1 (Mucosal Vascular Addressin). Die Gegenliganden für VCAM-1 sind heterodimere α4-Integrine mit einer nicht kovalenten Bindung an entweder eine β1- oder β7-Kette. Integrin α4β1 (Very late Antigen-4 [VLA-4]) ist auf den meisten mononucleären Leukozyten konstitutiv exprimiert, darunter auf Eosinophilen, Lymphozyten, Monozyten, Basophilen, fehlt aber auf Neutrophilen. Dagegen kommt Integrin α4β1 hauptsächlich auf einer Untergruppe von T-Zellen mit Tropismus für den Darmtrakt vor und sein primärer Ligand ist MAdCAM-1 (Mucosal Vascular Addressin), obwohl es auch an VCAM-1 bindet (18). Leukozytenrezeptoren für ICAM sind die β2-Integrine LFA-1 (Lymphocyte Function Associated Antigen 1) und αMβ2-Integrin (Mac-1).
Neutrophile und alle hämatopoietischen Zellen (außer Erythrozyten) exprimieren LFA-1, während die Exprimierung von Mac-1 eher auf Monozyten, Makrophagen und Granulozyten beschränkt ist.
Ruhendes, vaskuläres Endothel exprimiert eine Reihe von Molekülen, die nicht ausreichend sein dürften, um eine signifikante Bindung von Leukozyten und darauf folgende Transmigration zu fördern. Es ist jedoch anerkannt, dass eine Peritransplantat-Ischämie zu einer Endothelaktivierung mit erhöhter Exprimierung von Adhäsionsmolekülen führt.
Kürzlich ist gezeigt worden, dass die Interaktion von VCAM-1 auf EZ mit seinem Liganden, dem α4β1-Integrin VLA-4 auf dem Leukozyten, der hauptsächliche Mechanismus ist, der den Stillstand rollender Monozyten und Lymphozyten und die darauf folgenden Ausbreitung auslöst (Jones et al., 1994, Alon et al., 1995). Beteiligt an der Transmigration durch die Tight Junctions der Endothelzellen sind PECAM (Platelet-Endothelial-Cell- Adhesion-Molecule, CD31), IAP (Integrin Associated Protein, CD47) und Integrin α4β1 (Muller, 1995; Brown, 1996).
Es scheint, dass der Eingriff in die von diesen Adhäsionsmolekülen (insbesondere ICAM-1, LFA-1, VCAM-1 und CD2) vermittelten Erkennungsprozesse das Überleben eines allogenen Transplantats wesentlich verlängert. Des Weiteren induzierte die Blockade von Adhäsionsmolekülen mit monoklonalen Antikörpern in einigen Modellen nicht nur unbegrenztes Transplantatüberleben, sondern auch die spenderspezifische Toleranz (Isobe et al., 1992).
Schweine-EZ haben die Fähigkeit, sowohl die initiale Adhäsion als auch die Migration und Aktivierung infiltrierender, menschlicher Leukozyten zu vermitteln. Funktionelle Wechselwirkungen zwischen humanem LFA-1 und Schweine-ICAM und humanem VLA-4 und Schweine-VCAM sind dokumentiert worden. Des Weiteren führt auch die Interaktion menschlicher Monozyten mit Schweineendothel zu einer Aktivierung der EZ (Millan et al., 1997). Dies fördert wahrscheinlich den gezielten Eintritt (Trafficking) menschlicher Lymphozyten und Monozyten in ein Schweine-Xenotransplantat und löst eine Abstoßung aus.
Es ist gezeigt worden, dass Antikörper gegen Schweine-Adhäsionsmoleküle den Infiltrationsvorgang hemmen können (Dorling et al., 1996; Mueller et al., 1995). Um die Wechselwirkung von VCAM-1 und VLA-4 zu hemmen, sind monoklonale Antikörper gegen jeweils eines dieser beiden Moleküle verabreicht worden. Ebenfalls verwendet worden sind ein VCAM-Ig-Fusionsprotein, zyklische Proteinantagonisten, welche die α4-Bindungsschleife in Domäne 1 von VCAM-1 nachahmen, und bestimmte natürlich vorkommende Pilz-Zyklopeptolide (Übersicht in Foster, 1996).
Eine Zielsteuerung monoklonaler Antikörper zu Schweine-VCAM-1 könnte zwar möglich sein, es wird jedoch angenommen, dass die wiederholte Verabreichung dieser Antikörper zu einer Sensitivierung des Empfängers und einer Abnahme der Wirksamkeit der Blockade führt. Systemische Verabreichung von Substanzen wie beispielsweise des oben erwähnten VCAM-Ig-Fusionsproteins, zyklischer Peptidantagonisten, natürlich vorkommender Pilz-Zyklopeptolide, würde nicht nur zu einer Blockade der pVCAM-VLA-4-Interaktion in dem Transplantat sondern auch in anderen Geweben des Empfängers führen und könnte die Fähigkeit des Empfängers zur Infektionsbekämpfung beeinträchtigen.
Es besteht daher ein großer Bedarf für ein Verfahren der Bekämpfung der zellulären Phase des aus einer Xenotransplantation resultierenden Abstoßungsvorgangs ohne Beeinträchtigung des Immunsystems des Empfängers des transplantierten Gewebes.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein biologisches Gewebe bereit gestellt, umfassend Endothelzellen, die zur Erzeugung einer Verbindung induziert werden können, welche die Exprimierung eines Zelladhäsionsmoleküls durch die Zellen herunterreguliert.
Das biologische Gewebe kann jedes für eine Transplantation in ein Säugetier geeignetes Gewebe sein und umfasst Ansammlungen von Zellen und einzelne Gewebe und Organe. Entsprechend umfasst diese Definition Fibroblasten, neurales Gewebe, fetales Gewebe und Herz-, Leber-, Lungen-, Bauchspeicheldrüsen-, Insel-, Haut-, Dünndarm-, Hornhaut-, Knorpel-, Knochen-, Muskel- oder Nierengewebe bzw. Organe.
Das Gewebe kann aus jedem nicht menschlichen Tier stammen, das mit dem Menschen ausreichend eng verwandt ist, um eine Erhaltung der Funktion zu ermöglichen. Solche Tiere umfassen Schafe, Schweine, Laufvögel (Strauss, Emu), Wasserschweine und Primaten. Das Tier der Wahl ist das Schwein, da seine Organe eine ähnliche Physiologie und Größe haben wie menschliche Organe. Außerdem können Schweine in großer Zahl gezüchtet werden und sind relativ frei von Pathogenen, die beim Menschen Infektionen verursachen können.
Der Begriff „Exprimierung", wie hierin verwendet, bezieht sich je nach Kontext auf die Exprimierung eines Peptids oder Polypeptids von einem Gen und/oder die Exprimierung eines Peptids oder Proteins auf der Oberfläche einer Zelle.
Mit „herunterregulieren" ist gemeint, dass die Verbindung den Grad der Exprimierung des Zelladhäsionsproteins herabsetzt. Das Herunterregulieren kann auf der Ebene der Transkription stattfinden, kann durch Beeinflussung der Translation oder über einen anderen Mechanismus erfolgen, beispielsweise durch das Bewirken von Änderungen der mRNA-Stabilität.
Das herunterzuregulierende Adhäsionsmolekül kann jedes Protein sein, dass auf der Oberfläche einer Endothelzelle exprimiert wird und zu einer Wechselwirkung mit einem Leukozyten oder einem Thrombozyten in der Lage ist, wie beispielsweise VCAM-1, ICAM-1, LFA-1, CD2, PECAM, CD31, IAP, CD47, Integrin ανβ3, MAd-CAM, PECAM, Selektive (P-, L- and E-Selektin), LFA-3, CD80/CD86 oder Thrombospondin.
VCAM-1 ist das Zelladhäsionsmolekül der Wahl, da Interaktionen von VCAM-1 auf EZ mit seinem Liganden, dem α4β1-Integrin VLA-4 auf Leukozyten, sich als hauptsächlicher Mechanismus erwiesen haben, durch welchen der Stillstand rollender Monozyten und Lymphozyten und deren nachfolgende Ausbreitung ausgelöst werden.
Es ist ein Merkmal der vorliegenden Erfindung, dass die Verbindung, welche die Exprimierung des Zelladhäsionsmoleküls verhindert, induzierbar erzeugt wird. Es wurde herausgefunden, dass die gezielte Unterbrechung des Adhäsionsmoleküls VCAM-1 bei Mäusen für den sich entwickelnden Embryo in fast allen Fällen tödlich ist aufgrund eines Ausbleibens einer effektiven Plazentaeinnistung; dadurch kommt es zu einer fehlenden oder verzögerten, chorioallantoischen Verschmelzung, was zum Tod des Embryo zwischen dem 8. und 12. Tag in utero führt (Gurtner et al., 1995).
Die ideale Strategie für die Induktion ist die eines konditionellen Knockouts des Zelladhäsionsmoleküls, was eine normale Exprimierung während der Entwicklung und im jungen, adulten Tier erlaubt, aber die Möglichkeit bietet, die Exprimierung des Zelladhäsionsmoleküls im Spenderorgan unmittelbar vor und/oder nach der Transplantation zu hemmen. Geeignete Verfahren der Induktion sind einem Fachmann bekannt, wie beispielsweise Klonieren der Inhibitorverbindung unterhalb (downstream) eines geeigneten Response-Elements, Enhancer-Elements oder Promotor-Elements. Beispielsweise ermöglichen einige bekannte Systeme die Transkription eines Gens, das in Säugetierzellen mithilfe kleiner Moleküle kontrolliert werden soll, darunter das Tet-On^TM-System (Clontech, GB), das Metallothionin-Promotor-System (Palmiter et al., 1983), das Ekdyson-induzierbare Säugetierexpressionssystem (Invitrogen, BV), steroidinduzierbare Promotoren (Clackson et al., 1997) und zytokininduzierbare Promotoren (Aranciba et al., 1998; Bachiller et al., 1990). Welches System ausgewählt wird, richtet sich nach dem erforderlichen Grad der Suppression.
Die Verbindung, welche die Exprimierung des Zelladhäsionsmoleküls herunterreguliert, kann ein Polynucleotid sein.
Gemäß einem zweiten Aspekt der Erfindung ist ein biologisches Gewebe bereit gestellt, in dem die Endothelzellen des Gewebes induziert werden, um ein Polynucleotid zu erzeugen, welches die Exprimierung eines Zelladhäsionsmoleküls durch die Zellen herunterreguliert.
Die Sequenz des Polynucleotids kann zu einem Teil des Gens oder der mRNA, die das Zelladhäsionsmolekül kodieren, komplementär sein, so dass sie an das Gen oder die mRNA hybridisiert und so deren Transkription oder Translation verhindert. Idealerweise sollte ein solches Polynucleotid eine Länge von mindestens 15 Nucleotiden haben, vorzugsweise von mindestens 50 Nucleotiden, mehr bevorzugt von mehr als 100 Nucleotiden. Um sicherzustellen, dass nur das Zelladhäsionsgen angegriffen wird, sollte das Polynucleotid komplementär zu einem Abschnitt des Gens sein, der sich von anderen Nucleinsäuresequenzen so weit wie möglich unterscheidet. Das Polynucleotid sollte vorzugsweise mit dem Gen oder der mRNA, die das Zelladhäsionsmolekül exprimieren, unter hoch stringenten Bedingungen hybridisieren, z.B. bei 0,1 × SSC, 65°C (wobei SSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumcitrat, pH 7,2).
Gemäß diesem Aspekt der Erfindung wirken die Polynucleotidsequenzen so, dass sie die Transkription eines ein Zelladhäsionsmolekül kodierenden Gens oder die Translation einer Zelladhäsions-mRNA aufheben, indem sie mit dem Molekül hybridisieren und dadurch die Wechselwirkung der Nucleinsäure mit den relevanten Proteinfaktoren verhindern, die erforderlich sind, damit Transkription oder Translation stattfinden können.
Alternativ können die Polynucleotidsequenzen eine Ribozymsequenz umfassen, die spezifisch gegen ein Gen oder eine mRNA, die für ein Zelladhäsionsmolekül kodieren, gerichtet ist.
Gemäß einem dritten Aspekt der Erfindung ist ein biologisches Gewebe bereit gestellt, in dem die Endothelzellen des Gewebes induziert werden können, um ein Peptid oder ein Polypeptid zu erzeugen, das die Exprimierung eines Zelladhäsionsmoleküls von der Zelle herunterreguliert.
Das Peptid oder Polypeptid kann eine hohe Affinität für das Zelladhäsionsmolekül besitzen. Vorzugsweise ist die Affinität der Verbindung für das Zelladhäsionsmolekül höher als 10^–8 M, mehr bevorzugt höher als 10^–9 M, noch mehr bevorzugt höher als 10^–10 M. Die Verbindung sollte außerdem spezifische Bindungsaktivität für das Zelladhäsionsmolekül aufweisen, um sicherzustellen, dass die Bindungsaktivität der Verbindung nicht für eine unpassende Zerstörung anderer Moleküle in der Zelle verantwortlich ist.
Vorzugsweise ist die Verbindung ein Antikörper oder ein Antikörperfragment, das einfach hergestellt werden kann und eine hohe Spezifität und Affinität für ein gewünschtes Ziel aufweist. Antikörperfragmente wie beispielsweise Fab-Fragmente oder Einzelkettenfragmente (sFvs) sind besonders geeignet, da es sich dabei um kleine Moleküle mit hoher Löslichkeit und größerer Durchdringungsfähigkeit in einer intrazellulären Umgebung handelt. Intrazelluläre sFv-Antikörper sind in vitro erfolgreich zur Neutralisierung von Viren (HIV (Rondon et al., 1997) und Flaviviren (Jiang et al., 1995)) und zur Verminderung der Exprimierung intrazellulärer Onkoproteine (z.B. erbB-2 (Beerli et al., 1994; Graus Porta et al., 1995) und ras (Bioca et al., 1993)) und Zelloberflächenrezeptoren (z.B. IL-2R (Richardson et al., 1997)) eingesetzt worden. Diese sFv-Arten wurden aus Hybridomas monoklonaler und spezifisch gegen das Zielprotein gerichteter Antikörper hergestellt.
Das Polypeptid kann ein Fusionsprotein sein, umfassend eine Bindungsdomäne mit Affinität für ein Zelladhäsionsmolekül und eine Effektordomäne, die spezifisch gegen ein Zelladhäsionsmolekül oder gegen ein Gen oder eine mRNA gerichtet ist, die für das Zelladhäsionsmolekül kodieren. Beispielsweise kann die Effektordomäne in die Umgebung des Zelladhäsionsmoleküls eingebracht werden (mittels der Bindungsdomäne), so dass das Adhäsionsmolekül gezielt zerstört wird.
Ist die Effektordomäne ein Protein, so kann sie eine Protease, eine Kinase, eine Phosphatase oder ein anderes Enzym umfassen, das in der Lage ist, ein Zelladhäsionsmolekül zu inaktivieren. Alternativ kann die Effektordomäne ein Oligonucleotid oder ein Ribozymmolekül umfassen, das auf das Gen und die mRNA einwirkt, die für das Zelladhäsionsmolekül kodieren.
Gemäß einem vierten Aspekt der Erfindung ist ein biologisches Gewebe bereit gestellt, in dem die Endothelzellen des Gewebes induziert werden können, um ein bispezifisches Fusionsprotein herzustellen, das die Exprimierung eines oder mehrerer Zelladhäsionsmoleküle durch die Zelle herunterreguliert. Ein solches Fusionsprotein kann Domänen oder Peptide mit Affinitäten für unterschiedliche Zelladhäsionsproteinepitope umfassen. Beispielsweise könnte ein Fusionsprotein mit Bindungsaffinität und Spezifität gegen zwei oder mehr unterschiedliche Epitope auf einem Zelladhäsionsmolekül wie VCAM konzipiert werden. Dies würde die Effizienz des Knockouts des Zelladhäsionsmole küls verbessern. Darüber hinaus könnte eine Reihe von Epitopen auf unterschiedlichen Zelladhäsionsmolekülen gezielt angezielt werden, um ihre Exprimierung gleichzeitig aufzuheben.
Damit das Zelladhäsionsmolekül nicht zur Exprimierung an die Zelloberfläche transportiert wird, muss die Aminosäuresequenz des Peptids oder Polypeptids eine Zielsequenz für eine direkte Degradation des Zelladhäsionsmoleküls enthalten.
Die Zielsequenz kann jedes geeignete, intrazelluläre Signal für den gezielten Proteineintritt (Protein Trafficking) umfassen, sofern das Signal an der Weiterleitung des gebundenen Komplexes zu einem subzellulären Kompartiment zur Degradation beteilt ist. Beispiele geeigneter, intrazellulärer Protein-Trafficking-Signale sind erörtert in Pudsley, 1989 und von Magee und Wileman, 1992.
Vorzugsweise umfasst das Signal ein Lokalisierungssignal, das ein entstehendes Peptid zum endoplasmatischen Reticulum (ER) leitet. Ein besonders geeignetes Signal ist der Einschluss der Aminosäuresequenz Lys-Asp-Glu-Leu (KDEL) am C-Terminus des Peptids oder Polypeptids. Es ist bekannt, dass Proteine, die sich im Lumen des endoplasmatischen Reticulums (ER) befinden, d.h. dem ersten Kompartiment für neu hergestellte, membrangebundene Proteine oder sezernierte Proteine, diese kurze Sequenz besitzen (Munro und Pelham, 1987). Wird diese Sequenz entfernt oder durch Addition weiterer Aminosäuren verlängert, wird das Protein aus der Zelle sezerniert, anstatt in der Zelle zu bleiben.
Alternative Signalregionen sind Fachleuten bekannt und umfassen lysosomale Zielsequenzen. Es könnten auch Fusionsproteine konstruiert werden, umfassend ein Peptid oder Polypeptid in Fusion mit einem viralen Protein wie beispielsweise das nef Protein von HIV-1 oder mit zytoplasmatischen Signalen für einen schnellen Umsatz, wie beispielsweise auf CTLA-4 gefunden wurde (siehe Magee und Wileman (1992) Protein targeting: a practical approach; Oxford University Press).
Gemäß einem fünften Aspekt der Erfindung ist ein Polypeptid bereit gestellt, umfassend eine Bindungsregion, die in der Lage ist, an ein Zelladhäsionsmolekül zu binden, und eine Signalregion für eine Zielsteuerung an das Polypeptid auf subzellulärer Ebene. Vorzugsweise umfasst das Polypeptid einen Antikörper oder ein Antikörperfragment, am meisten bevorzugt ein einzelkettiges Antikörperfragment (sFv). Die Signalregion der Wahl ist ein Lokalisierungssignal für das endoplasmatische Reticulum. Am meisten bevorzugt umfasst die Signalregion die Aminosäuresequenz KDEL am C-Terminus des Polypeptids.
Gemäß einem sechsten Aspekt der Erfindung ist ein Polynucleotid bereit gestellt, das für ein Peptid oder Polypeptid gemäß dem fünften Aspekt der Erfindung kodiert. Vorzugsweise umfasst das Polynucleotid Sequenzen, die sich für die Regulierung der Exprimierung des Peptids oder Polypeptids eignen. Diese Exprimierung kann vorzugsweise kontrolliert werden, beispielsweise durch zellspezifische Kontrolle, induzierbare Kontrolle oder zeitliche Kontrolle. Vorzugsweise sollte die Exprimierung spezifisch sein für vaskuläre Glattmuskelzellen, Fibroblasten, Herzmyozyten, EZ oder eine andere Kombination dieser Zellarten. Am meisten bevorzugt sollte die Exprimierung spezifisch für EZ sein; eine EZ-spezifische Exprimierung kann durch Verwendung gewebespezifischer Promotoren, wie beispielsweise E-Selektin, ICAM und MAdCAM, erreicht werden.
Gemäß einem siebten Aspekt der Erfindung ist ein Vektor bereit gestellt, umfassend ein Polynucleotid gemäß dem sechsten Aspekt der Erfindung.
Der Begriff „Vektor" bezeichnet eine Einheit, die in der Lage ist, ein Polynucleotid auf eine Wirtszelle zu übertragen. Vorzugsweise ist der Vektor ein DNA-Vektor und mehr bevorzugt in der Lage, RNA zu exprimieren, die ein erfindungsgemäßes Protein kodiert. Im Stand der Technik sind zahlreiche geeignete Vektoren dokumentiert; Beispiele sind beispielsweise enthalten in Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2. Auflage, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbour Laboratory Press oder DNA cloning: a practical approach, Volume II: Exprimierung systems, herausgegeben von D. M. Glover (IRL Press, 1995).
Viele bekannte Techniken und Protokolle für die Manipulation von Nucleinsäuren, beispielsweise bei der Herstellung von Nucleinsäurekonstrukten, Mutagenese, Sequenzierung, Einführung von DNA in Zellen und Genexprimierung und Analyse von Proteinen sind ausführlich beschrieben in Short Protocols in Molecular Biology, Zweite Auflage, Ausubel et al. Hrsg., (John Wiley & Sons, 1992) oder Protein Engineering: A practical approach (herausgegeben von A. R. Rees et al., IRL Press 1993). Beispielsweise können die Vektoren der Wahl in eukaryontischen Zellen virusbasiert sein.
Für bestimmte Ausführungsformen der Erfindung kann ein bicistronischer Exprimierungsvektor verwendet werden, um eine stöchiometrische Co-Exprimierung zweier Gene aus einer mRNA zu ermöglichen. In einem bestimmten System (Jackson et al., 1990) wird die Exprimierung von einem einzigen Promotor angetrieben und der Einbau der internen Ribosomeneintrittstelle (IRES) des Enzephalomyokarditisvirus (ECMV) erlaubt eine CAP-unabhängige, ribosomale Bindung und Translation des zweiten offenen Leserahmens. Dies erlaubt die Transfektion eines Konstruktes, das Sequenzen enthält, welche gegen zwei verschiedene Epitope auf einem Zelladhäsionsmolekül gerichtet sind, um die Effizienz des Knockouts zu verbessern oder die Zielsteuerung von einem oder zwei verschiedenen Zelladhäsionsmolekülen unter Verwendung von nur einem Konstrukt zu erlauben.
Nach der Einführung der Nucleinsäure kann die Exprimierung der Nucleinsäure ausgelöst oder ermöglicht werden, beispielsweise durch Kultivieren von Wirtszellen unter Bedingungen, welche die Exprimierung des Gens ermöglichen.
In einer Ausführungsform ist die Nucleinsäure der Erfindung in das Genom (z.B. Chromosom) der Wirtszelle integriert.
Die Integration kann durch Einschluss von Sequenzen nach Standardtechniken gefördert werden, welche die Rekombination mit dem Genom fördern.
Vorzugsweise ist der Vektor geeignet für die Produktion eines transgenen Tiers. Für die Herstellung transgener Schweine geeignete Vektoren sind beispielsweise beschrieben in Heckl-Östreicher (1995), McCurry (1996), White (1995), Yannoutsos (1995) und Langford (1996). Für die Herstellung transgener Mäuse geeignete Minivektoren sind beschrieben in Diamond (1995).
Gemäß einem achten Aspekt der Erfindung ist ein Transportsystem bereit gestellt, umfassend ein Molekül des fünften, sechsten oder siebten Aspekts und Mittel zum Transport des Moleküls zu und in eine Zielzelle.
Das Transportsystem kann viral oder nicht-viral sein.
Nicht-virale Systeme wie beispielsweise Liposomen, vermeiden einige der mit virusbasierten Systemen verbundenen Schwierigkeiten, wie beispielsweise der Aufwand bei einer gestaffelten Produktion, schlechte Dauerhaftigkeit der Exprimierung und Sicherheitsbedenken. Vorzugsweise ist das Transportsystem für die Verwendung in der Gentherapie geeignet. Zahlreiche entsprechende Transportsysteme sind im Stand der Technik bekannt, wie beispielsweise polykationische, kondensierte DNA, verknüpft oder nicht verknüpft mit abgetötetem Adenovirus (siehe Curiel, 1992), und ligandenverknüpfte DNA (siehe Wu, 1989). Nackte DNA kann ebenfalls verwendet werden, wahlweise unter Verwendung von biologisch abbaubaren Latexkügelchen zur Erhöhung der Aufnahme. Liposomen können ebenfalls als Gentransportvehikel wirken, indem sie eine Nucleinsäure umfassend ein unter der Kontrolle unterschiedlicher gewebespezifischer oder ubiquitär aktiver Promotoren stehendes Gen verkapseln. Auch mechanische Transportsysteme, wie beispielsweise der in Woffendin et al. (1994) beschriebene Ansatz, können verwendet werden.
Durch Injektion, entweder subkutan, intraperitoneal, intravenös oder intramuskulär oder abgegeben in den Interstitialraum eines Gewebes, wird im Allgemeinen ein direkter Transport von Gentherapiezusammensetzungen erreicht, entweder als Einzeldosis- oder Mehrfachdosisregime. Andere Verabreichungsarten umfassen orale und pulmonale Applikation, die Verwendung von Zäpfchen und transdermale Applikationen, Kanülen und Genpistolen oder Hyposprays.
Vorzugsweise wird das Transportsystem so zielgesteuert, dass Moleküle gemäß der vorliegenden Erfindung von den für eine Transplantation geeigneten Zellen oder von Zellen, die bereits transplantiert worden sind, aufgenommen werden.
Mehr bevorzugt ist das Transportsystem spezifisch für diese Zellen. Beispielsweise kann das Transportsystem zu einem bestimmten Organ zielgesteuert werden, wie beispielsweise zum Herzen oder der Niere, oder zu einem bestimmten Zelltyp, wie beispielsweise zu Endothelzellen.
Um dies zu erreichen, kann das Transportsystem beispielsweise ein rezeptorvermitteltes Transportsystem sein, das zu auf Zielzellen vorhandenen Rezeptoren zielgesteuert wird.
Beispielsweise kann das Transportsystem zu Rezeptoren auf Herzzellen, vorzugsweise zu Rezeptoren, die nur auf Herzzellen vorkommen, zielgesteuert werden oder es kann zu Rezeptoren auf Endothelzellen, vorzugsweise zu Rezeptoren, die nur auf Endothelzellen vorkommen, wie beispielsweise E-Selektin oder P-Selektin, zielgesteuert werden.
Das Transportsystem ist vorzugsweise geeignet für die Herstellung transgener Tiere. Beispielsweise kann das Transportsystem zu einem Gameten, einer Zygote oder einer embryonalen Stammzelle zielgesteuert werden.
Gemäß einem neunten Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zur Transfektion einer Zelle mit einem erfindungsgemäßen Vektor bereit gestellt. Die Zelle für die Transfektion sollte ein Vorläufer der Art sein, die der Organspender sein wird, vorzugsweise eine Endothelzelle. Die stabile Transfektion porziner Endothelzellen ist beschrieben in Heckl-Östreicher (1995).
Vorzugsweise ist die Zelle geeignet für die Herstellung eines transgenen Tiers. Mehr bevorzugt ist die Zelle ein Gamet, eine Zygote oder eine embryonale Stammzelle. Die Transfektion muriner Eizellen durch Mikroinjektion zur Herstellung transgener Mäuse ist beispielsweise beschrieben in Diamond (1995), und die Mikroinjektion porziner Zygoten, beispielsweise zur Herstellung transgener Schweine, ist beschrieben in Yannoutsos (1995), Langford (1996) und White (1995).
Gemäß einem zehnten Aspekt der Erfindung ist eine Zelle bereit gestellt, die gemäß dem neunten Aspekt transfiziert worden ist.
Gemäß einem elften Aspekt der Erfindung ist biologisches Gewebe bereit gestellt, umfassend eine Zelle gemäß dem zehnten Aspekt der Erfindung. Der Begriff „biologisches Gewebe" wie hierin verwendet, umfasst Ansammlungen von Zellen, Geweben und Organen. Entsprechend umfasst die Definition beispielsweise Fibroblasten-, Nervengewebe-, Herz-, Leber- oder Nierengewebe bzw. -organe.
Gemäß einem zwölften Aspekt der Erfindung ist ein Tier bereit gestellt, umfassend eine erfindungsgemäße Zelle und/oder ein erfindungsgemäßes biologisches Gewebe. Vorzugsweise ist das Tier geeignet für die Produktion von Organen zur Transplantation in Menschen. Vorzugsweise ist das Tier ein Säugetier, und mehr bevorzugt ist es ein transgenes Schwein oder ein transgenes Schaf.
Das Tier kann behandelt werden, während es am Leben ist, so dass es transgenes, biologisches Gewebe umfasst (d.h. es kann durch Gentherapie behandelt werden). Vorzugsweise wird ein lebendes Tier mit einem Vektor transfiziert, der spezifisch zu Endothelzellen transportiert wird, um für eine Xenotransplantation geeignete, transgene Organe zu produzieren.
Alternativ kann das Tier als transgenes Tier geboren sein.
Verschiedene geeignete Ansätze für die Herstellung solcher transgener Tiere sind aus dem Stand der Technik bekannt (z.B. Bradley & Liu, 1996; Clarke, 1996, Wheeler, 1994).
Beispielsweise ist die direkte Manipulation der Zygote oder des jungen Embryo durch Mikroinjektion von DNA gut bekannt, sowie die in vitro-Manipulation pluripotenter Zellen, wie beispielsweise embryonaler Stammzellen. Retrovirale Infektion junger Embryos erwies sich bei einer Reihe von Arten als erfolgreich, und die adenovirale Infektion von Zona-freien Eiern ist berichtet worden. Transgenese und Klonierung von Schafen durch Kerntransfer wurde ebenfalls beschrieben (z.B. WO97/07668).
Gemäß einem dreizehnten Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren bereit gestellt, mit dem biologisches Gewebe für eine Transplantation geeignet gemacht wird, umfassend das Exprimieren einer oder mehrerer Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung in dem biologischen Gewebe, vorzugsweise exklusiv in seinen Endothelzellen. Das biologische Gewebe kann so entweder in vivo oder ex vivo behandelt werden. Beispielsweise kann ein Tierorgan in vivo mit einem erfindungsgemäßen Vektor transfiziert werden, oder ein Organ könnte vor der Transplantation ex vivo oder nach der Transplantation in vivo transfiziert werden.
Gemäß einem vierzehnten Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zur Transplantation bereit gestellt, umfassend das Transplantieren erfindungsgemäßen, biologischen Gewebes von einem Spendertier in ein Empfängertier. Vorzugsweise dient das Verfahren der Xenotransplantation und das biologische Spendergewebe ist in Bezug auf das Empfängertier xenogen.
Die Erfindung wird nun ausführlich und unter spezifischer Bezugnahme auf gegen das VCAM-1-Molekül gerichtete, einzelkettige Antikörperfragmente beschrieben. Es können Verände rungen von Details vorgenommen werden, ohne vom Schutzumfang der Erfindung abzuweichen.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1: Leukozyten-Endothelzellen-Adhäsionskaskade
2: Durchflusszytometrie mit Phagenantikörpern mit Spezifität für VCAM
3: Restriktionsenzym-Fingerabdruck der sFv-Klone
4: Exprimierungsvektor für sFv
5: Cotransfektion von sFv/ER mit pEF/GFP/ER
6a: VCAM-Expression auf stabilen EZ-Transfektanden mit sFv-Klon F5
6b: VCAM-Expression auf stabilen EZ-Transfektanden mit sFv-Klon E 6.2
7a: VCAM-Expression auf stabilen EZ-Transfektanden mit sFv-Klon F5
7b: VCAM-Expression auf stabilen EZ-Transfektanden mit sFv-Klon E 6.2
8: Färbung für VCAM in nicht transfizierten und transfizierten Endothelzellen
9: Bindung von Jurkat-Zellen an Endothelzellen unterschiedlicher Dichte
BEISPIELE
Beispiel 1:
Es wurde eine Phagen-Display-Antikörperbibliothek verwendet, um ein für VCAM-1 spezifisches sFv herzustellen. Die verwendete Bibliothek enthält > 10⁸ Klone, die mithilfe einer Bank von 50 klonierten, menschlichen VH-Gensegmenten mit einer zufälligen (random) Nucleotidsequenz, welche für CDR3-Längen von 4–12 Resten kodiert (Richardson et al., 1993), hergestellt worden sind. Diese Bibliothek ist bereits verwendet worden, um spezifische Einzellkettenantikörper gegen unterschiedliche Antigene zu isolieren, darunter Haptene, Fremd- und Eigenantigene. Die Selektion hing jedoch von der Verfügbarkeit von gereinigtem oder rekombinantem Antigen ab. Wir haben eine neuartige Screening-Strategie entwickelt, um den Mangel an rekombinantem, porzinem VCAM zu überwinden.
Es wurde cDNA für porzines VCAM verwendet, um stabile Zelllinien herzustellen, die entsprechend der durchflusszytometrischen Untersuchung eine starke Exprimierung von porzinem VCAM auf der Oberfläche aufweisen. VCAM-positive Zellen wurden mit 3 μM CellTracker^TM Green CMFDA (5-Chlormethylfluoresceindiacetat, (Molecular Probes, Oregon)) eine Stunde lang bei 37°C inkubiert. Bei Eintritt dieser membrandurchlässigen Sonde in die Zelle wird nicht fluoreszierendes CMFDA durch Esterasehydrolyse in fluoreszierendes 5-Chlormethylfluorescein umgewandelt, welches mit Thiolen auf Proteinen reagiert, um aldehydfixierbare Konjugate zu bilden. Damit markierte Zellen sind lebensfähig und fluoreszieren mehrere Zellteilungen lang.
Eine Suspension von VCAM-negativen Zellen wurde in 4% Marvel/PBS bei 4°C unter vorsichtigen Hin- und Herbewegen mit der Phagenbibliothek inkubiert. Nach 30 Minuten wurden die markierten VCAM-positiven Zellen im Verhältnis 1:10 (VCAM-positiv: negativ) zugegeben und für weitere 90 Minuten inkubiert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation pelletiert und dreimal mit PBS gewaschen. Die fluoreszierenden VCAM-positiven Zellen (und an die Zelloberfläche gebundener Phage) wurden dann durch FACS getrennt. Die Phagen wurden nach Standardverfahren (Griffiths et al., 1994) wiedergewonnen, amplifiziert, und die Bibliothek wurde drei weiteren Screening-Runden unter zogen. Durch „polyklonalen" Phagen-ELISA wurde bestätigt, dass die Bibliothek hinsichtlich VCAM-spezifischen Phagen angereichert worden war. Dann wurden einzelne Klone durchflusszytometrisch auf Bindung an die VCAM-positive Zelllinie getestet, und die Ergebnisse von repräsentativen Klonen sind in 2 gezeigt.
Die Sequenz der VCAM-spezifischen sFv-Klone wurde aus Minipräparationen des Phagemidvektors durch PCR amplifiziert und 18 Stunden lang entweder mit BstN1 oder BsaJ1 entsprechend dem Protokoll des Herstellers verdaut. Kartierung (Mapping) der Restriktionsfragmentlängenpolymorphismen (RFLP) der ersten 15 VCAM-spezifischen Klone zeigte, dass es mindestens 5 verschiedene Verdauungsmuster gab, was auf mindestens 5 verschiedene Antikörpersequenzen hindeutet (3). Zwei davon wurden für eine weitere Analyse verwendet.
Beispiel 2: Subklonierung von sFv für zielgesteuerte, intrazelluläre Exprimierung
Unsere Strategie war, das VCAM-spezifische sFv so zu konstruieren, dass es im ER zurückbehalten wird, so dass bei ausreichender Affinität der sFv-VCAM-Wechselwirkung beide Moleküle im ER zurückbehalten und abgebaut werden und somit die VCAM-Menge auf der Zelloberfläche reduziert wird. Zu Beginn wurde sFv mit einem konstitutiv aktiven Promotor, dem Promotor der Untereinheit des menschlichen Elongationsfaktors 1α(EF-1α), exprimiert.
sFv wurde aus dem Phagemidvektor durch PCR amplifiziert (30 Zyklen, Anlagerungstemperatur 55°C, 1,5 μM Mg²⁺) unter Verwendung folgender Primer:
(5') CAGTCTATGCGGCCCCATTCA (3'); und
(5') TCCACAGGCGCGACTCCCAGCCGGGCATGGCCCAGGT (3').
Das resultierende Fragment wurde in BssHII/NotI-Schnittstellen in pEF/myc/ER (Invitrogen, BV) kloniert. sFv wurde durch Ein bau der Sequenz eines Signalpeptids einer Maus-VH-Kette am 5'-Ende des sFv-Gens in das ER dirigiert; dieses Peptid wird nach der Translokation in das ER abgespalten. sFv bleibt aufgrund der KDEL-Peptidsequenz am C-Terminus zurück. Das Konstrukt ist schematisch in 4 gezeigt.
Beispiel 3: Effekt von sFv-Konstrukten auf die VCAM-Expression
Cotransfektion von sFv/ER mit pEF/GFP/ER
Durch Transfektion in eine immortalisierte, porzine Endothelzelllinie A9 wurde eine funktionelle Analyse der Konstrukte durchgeführt. Die Zelllinie wurde durch Mikroinjektion von pZipSVU19-DNA in primäre Aorta-Endothelzellen hergestellt (Dorling et al., 1996). Die immortalisierten Zellen behalten die Eigenschaften von Endothelzellen bei, weisen aber im Gegensatz zu primären EZ eine konstitutive Exprimierung von VCAM auf. Zytokinbehandlung der Zellen erhöhte die VCAM-Expression marginal (RMFI Erhöhung von 38,2 auf 66,3 nach 72 Stunden).
Die Transfektion von DNA wurde mit der Liposomenformulierung LipofectAMINE (Life Technologies) mit einer Modifikation des Protokolls des Herstellers durchgeführt. LipofectAMINE-Reagenz ist eine 3:1 (Gew./Gew.)-Formulierung des polykationischen Lipids 2,3-Diolyloxy-N-[2(spermincarboxamido)ethyl]-N,N-dimethyl-1-propanaminiumtrifluoracetat (DOSPA) und dem neutralen Lipid Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE) in Wasser.
In jeder Vertiefung einer Platte mit 6 Vertiefungen wurden 1 × 10⁵ Zellen in Komplettmedium (DMEM) ausgesät und konnten sich über Nacht bei 37°C in einem Inkubator mit 5% CO₂ anheften. Am nächsten Tag wurde die Zellen zweimal in vorgewärmtem, serumfreiem Opti-MEM^® I (Gibco BRL) gewaschen. In jede Vertiefung wurden 2 ml serumfreies Opti-MEM^® gegeben und die Zellen für 2–3 Stunden bei 37°C zurück in den CO₂-Inkubator gestellt.
Die zu transfizierende DNA (1–2 μg pro Transfektion) wurde in serumfreiem Medium, Opti-MEM^® I, auf ein Endvolumen von 100 μl pro Transfektion verdünnt. Für jede Transfektion wurden in ein gesondertes Röhrchen 5 μl LipofectAMINE und 15 μg bovines Transferrin (Sigma; Stammlösung hergestellt als 1 μg/ml in serumfreiem Opti-MEM^® I) zu einem Endvolumen von 100 μl in serumfreiem Opti-MEM^® I gegeben. Die DNA und die Mischung aus LipofectAMINE und Transferrin wurden vereint und 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen, damit sich DNA-Liposom-Komplexe bilden konnten.
Für jede Transfektion wurden in das Röhrchen mit den Komplexen 0,8 ml vorgewärmtes, serumfreies Opti-MEM^® I gegeben. Das Medium wurde von der Gefäßwand abgesaugt und 2 ml der verdünnten Komplexlösung zu den Zellen gegeben. Die Zellen wurden bei 37°C und 5% CO₂ 5–6 Stunden lang inkubiert. Dann wurde die Transfektionsmischung entfernt und in jede Vertiefung 2 ml Komplettmedium (DMEM) mit 10% FKS gegeben.
In transienten Transfektionsassays wurden die Zellen 24–72 Stunden nach Beginn der Transfektion getestet. Die transfizierten Zellen wurden geerntet und mit dem spezifisch gegen porzines VCAM gerichteten, monoklonalen Antikörper 10.2C7 (Celltech, UK) und einem mit Texas-Rot markierten „Zweite-Schicht (Second-Layer)"-Reagenz gefärbt. Um Zellen zu identifizieren, welche die Plasmid-DNA aufgenommen hatten, wurden die sFv-Konstrukte mit dem Vektor pEF/GFP/ER cotransfiziert, der ein 716 bp-Fragment von pαGFP (Crameri et al., 1996) in Fusion mit dem KDEL-ER-Retentionssignal im selben Vektorrahmen wie die sFv-Konstrukte enthält.
5 zeigt ein typisches Histogramm, wenn die Population auf Exprimierung von VCAM (rote Fluoreszenz) und Exprimierung von GFP (grüne Fluoreszenz) untersucht wurde. GFP-exprimierende Zellen zeigten eine 77%ige Verringerung der VCAM-Expression (RMFI-Kontrolle 10,9, GFP-positive Zellen 2,4). Diese Verringerung wurde in Zellen, die nur mit dem pEF/GFP/ER-Plasmid transfiziert wurden, nicht beobachtet, woraus zu schließen ist, dass die Reduktion auf die Exprimierung des VCAM-spezifischen sFv zurückzuführen ist.
Beispiel 4: Analyse stabiler Transfektanden
Um stabile Transfektanden zu erhalten, wurden IPEZ mit einem für Hygromycinresistenz kodierenden Plasmid cotransfiziert (Kioussis et al., 1987). Nach 48–72 Stunden wurden die Zellen passagiert und 1:10 in Komplettmedium mit 150 μg/ml Hygromycin verdünnt. Die VCAM-Expression wurde nach 10–14 Tagen durch Durchflusszytometrie der gegen Hygromycin resistenten Zellen untersucht.
6A und B zeigen typische Histogramme von Zelllinien, die durch Transfektion von Konstrukten zweier verschiedener sFv-Klone, E6.2 und F5, hergestellt wurden. Beide sFv-Konstrukte verringern die VCAM-Expression auf der Oberfläche der Endothelzellen. Die Werte für die mittlere Fluoreszenz in Bezug zum Grad der VCAM-Expression, der in diesen Figuren gezeigt ist, sind: RMFI-nicht transfizierte Population = 38,2, Klon sFv/ER E6.2 = 4,82 und F5 = 10.1.
7A und B präsentieren die Ergebnisse eines zweiten Experiments in permanent transfizierten Zellen zur Beurteilung der Verringerung der VCAM-Expression auf der Oberfläche dieser Zellen.
Diese Daten zeigen, dass es möglich ist, die VCAM-Expression auf Endothelzellen zu verringern, indem in den Zellen ein VCAM-spezifisches scFv, das zur Retention im ER zielgesteuert ist, exprimiert wird.
Beispiel 5: Transfektion von scFv-Konstrukten hält VCAM in der Zelle fest.
Die Techniken der Immunfluoreszenzfärbung und Konfokalmikroskopie wurden daraufhin verwendet, um die Colokalisierung von VCAM und scFV in den scFv-Transfektanden E6.2 und F5 zu zeigen.
Nicht transfizierte A9-Endothelzellen zeigen für VCAM eine diffuse Membranfärbung (siehe 8A). Beide transfizierten scFv-Klone zeigten bei Färbung auf VCAM-Expression ein peri nucleäres, punktförmiges Färbemuster, was der Retention von VCAM im endoplasmatischen Reticulum entspricht (ein Beispiel einer transfizierten Zelle ist in 8B gezeigt). Färben der transfizierten Zellen mit einem Anti-Myc-Antikörper zum Nachweis des c-myc-Epitops auf den scFv-Konstrukten produzierte ein starkes, perinucleäres Färbemuster, entsprechend der ER-Retention des scFv (8C).
Zweifache Exposition mit geeigneten Filtern bestätigte, dass VCAM und scFv im ER colokalisiert waren (Tafel D).
Beispiel 6: Reduktion der VCAM-Expression durch intrazelluläres scFv ist assoziiert mit einer Reduktion der Adhärenz humaner Leukozyten.
Um zu zeigen, dass die Reduktion der VCAM-Expression, die durch intrazelluläres scFv erreicht wurde, funktionell signifikant war, wurde die Bindung der T-Zell-Leukämielinie Jurkat an die Transfektanden und an die ursprüngliche A9-Endothelzelllinie untersucht.
Aufgrund der hohen Exprimierung von Oberflächen-VLA-4 und da die Bindung an Endothelzellen erwiesenermaßen von diesem Integrin abhängt (van Kooyk, Y. et al., 1993), wurde die Jurkat-Linie J6 ausgewählt.
Die in 9A und B dargestellten Grafiken zeigen die Bindung von Jurkat-Zellen an Endothelzellen unterschiedlicher Dichte, die in einzelnen Vertiefungen einer Platte mit 96 Vertiefungen ausplattiert wurden. Bei beiden scFv-Transfektanden verlagerte sich die Bindungskurve nach rechts, was eine verringerte Affinität der Jurkat-Zellen für die Transfektanden zeigt, sowie eine signifikante Verringerung der maximalen Bindung der Leukozyten an den Monolayer aus Endothelzellen.
Bezugsquellen

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Claims

Ein endotheliale Zellen enthaltendes biologisches Gewebe, welches induziert werden kann, eine Zusammensetzung zu erzeugen, die die Exprimierung und/oder Freisetzung eines Zelladhäsionsmoleküles durch die Zellen herunterreguliert, wobei die Zusammensetzung entweder (a) ein Polynucleotid ist, das mit der Sequenz zu dem Teil von dem Gen oder der mRNA, welches das Zelladhäsionsmolekül kodiert, komplementär ist, oder (b) ein Polynucleotid ist, dass eine Ribozym-Sequenz enthält, die spezifisch auf ein Gen oder eine mRNA zielt, welche ein Zelladhäsionsmolekül kodieren, oder (c) ein Peptid oder Polypeptid mit spezifischer Bindungsaffinität für das Zelladhäsionsmolekül ist.
Ein Gewebe nach Anspruch 1, wobei das genannte Polypeptid (c) ein bispezifisches Fusionsprotein ist.
Ein Polypeptid, das eine Bindungsregion enthält, die in der Lage ist, an ein Zelladhäsionsmolekül zu binden, und das eine Signalregion für eine subzelluläre Zielsteuerung des Polypeptids enthält, so dass es nicht an die Zelloberfläche transportiert wird.
Ein Polypeptid nach Anspruch 3, dass einen Antikörper oder ein Antikörperfragment enthält.
Ein Polypeptid nach Anspruch 4, das ein einzelkettiges Fv-Fragment enthält.
Ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 3 bis 5, wobei die Signalregion für die subzelluläre Zielsteuerung des Polypeptids ein Lokalisationssignal für das endoplasmatische Reticulum enthält.
Ein Polypeptid nach Anspruch 6, wobei die Signalregion am C-Terminus des Polypeptids die Aminosäuresequenz KDEL enthält.
Ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 3 bis 7, wobei die genannte Bindungsregion eine Affinität für eines der Adhäsionsmoleküle VCAM-1, ICAM-1, LFA-1, CD2, PECAM, CD31, IAP, CD47 oder Integrin ανβ3 aufweist.
Ein Polynucleotid, das ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 3 bis 7 kodiert.
Ein Vektor, der ein Polynucleotid nach Anspruch 9 enthält.
Eine Zelle, die ein Polynucleotid nach Anspruch 9 oder einen Vektor nach Anspruch 10 enthält.
Ein biologisches Gewebe, das eine Zelle nach Anspruch 11 enthält.
Ein nichtmenschliches Tier, das ein biologisches Gewebe nach Anspruch 12 und/oder eine Zelle nach Anspruch 11 enthält.
Ein Tier nach Anspruch 13, wobei das genannte Tier ein transgenes Schwein oder Schaf ist.
Ein Verfahren um ein Gewebe oder Organ für eine Transplantation geeignet zu machen, dadurch gekennzeichnet, dass ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 3 bis 8 in endothelialen Zellen im genanntem Gewebe oder Organ exprimiert und/oder freigesetzt wird, und hierdurch die Exprimierung und/oder Freisetzung eines Zelladhäsionsmoleküles herunterreguliert wird.
Verwendung eines biologischen Gewebes nach Anspruch 12 für Transplantationen.
Verwendung eines biologischen Gewebes nach Anspruch 12 bei der Herstellung eines Arzneimittels für das Verpflanzen in ein Empfänger-Tier.
Verwendung von Anspruch 17, wobei das genannte Empfänger-Tier ein Mensch ist.