JPH09511393A

JPH09511393A - キメラ補体インヒビタータンパク質

Info

Publication number: JPH09511393A
Application number: JP7523094A
Authority: JP
Inventors: フォードー、ウィリアム・エル; ローリンズ、スコット; スクウィント、ステファン・ピー
Original assignee: アレクション・ファーマシューティカル・インク
Priority date: 1994-03-03
Filing date: 1995-03-01
Publication date: 1997-11-18
Also published as: CA2184355A1; AU684007B2; US5624837A; DE69533256D1; US5627264A; EP0754227A1; WO1995023856A1; AU2099695A; EP0754227A4; EP0754227B1

Abstract

(57)【要約】Ｃ３阻害活性を有する第一の機能的ドメイン（第一のアミノ酸配列）およびＣ５ｂ〜９阻害活性を有する第二の機能的ドメイン（第二のアミノ酸配列）を含むキメラ補体インヒビタータンパクを提供する。第一の機能的ドメインは、第二の機能的ドメインのアミノ末端側にある。このようにして、本発明のキメラタンパクは、Ｃ３およびＣ５ｂ〜９阻害活性の両方を呈する。逆向き、すなわち、第二のアミノ酸配列が第一のアミノ酸配列のアミノ末端側にある方向は、Ｃ３阻害活性のみを生じる。このようなタンパクをコードする核酸分子も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】キメラ補体インヒビタータンパク質発明の分野本発明は、２つの補体インヒビタータンパク（ＣＩＰ）からの機能的ドメインを含み、その一方のＣＩＰからの機能的ドメインはＣ３補体阻害活性を有し、他方のＣＩＰからの機能的ドメインはＣ５ｂ〜９阻害活性を有する、キメラ補体インヒビタータンパク（ｃＣＩＰ）に関する。より具体的には、本発明は、Ｃ３阻害活性を有するドメインがＣ５ｂ〜９阻害活性を有するドメインのアミノ末端側にあるこのようなキメラタンパクに関する。発明の背景Ｉ．補体系補体系は、身体の他の免疫系とともに多段階・多タンパクのカスケード順序で作用して外来細胞およびウイルスの侵入に対して防御する、少なくとも２５の血漿タンパクおよび膜コファクターの複雑な相互作用である。補体タンパクは、ヒトおよび他の脊椎動物の正常血清中のグロブリンの約１０％を構成する。補体成分は、その免疫防御機能を、複雑な、しかし正確な一連の酵素的切断および膜結合事象として相互作用することにより達成する。結果として生じる補体カスケードは、オプソニン機能、免疫調節機能および溶解機能を有する生成物の産生をもたらす。補体の活性化には、古典的経路（主経路）および第二経路（副経路）という２つの主要なルートがある。これらの経路は、多くの成分を共有し、初期の段階では異なっているが、両者は合流して、標的細胞の活性化、侵襲および／または破壊の原因となる同じ「最終補体（terminal complement）」成分を共有する。古典的補体経路は、典型的には、抗体の、標的細胞の抗原性部位の認識およびそれに対する結合により開始される。第二経路は、通常、抗体には依存せず、病原因子表面上のある種の分子により開始され得る。両経路は、補体成分Ｃ３が（各経路で異なる）活性プロテアーゼにより切断されて、Ｃ３ａおよびＣ３ｂを生じる点で合流する。Ｃ３コンベルターゼ（転換酵素）と呼ばれるこの活性プロテアーゼは、古典的経路については補体成分Ｃ２ａＣ４ｂを、第二経路については補体成分Ｃ３ｂＢｂを包含する。Ｃ３ａは、マスト細胞の脱顆粒化を誘導し得るアナフィラトキシンであり、ヒスタミンおよび他の炎症媒介物質の放出をもたらす。Ｃ３ｂは複数の機能を有する。これは、オプソニンとして、細菌、ウイルスおよび他の細胞および粒子に結合し、循環からそれらを除去するための印をつける。また、Ｃ３ｂは、各経路に特有の他の成分と複合体を形成し、古典的または代替的Ｃ５コンベルターゼを形成することができる。これは、Ｃ５をＣ５ａ（別のアナフィラトキシンである）とＣ５ｂとに切断する。Ｃ５ａは、Ｃ３ａのように、顆粒球および血小板の活性化を引き起こし得る強力なアナフィラトキシンである。さらに、Ｃ５ａは、好中球の走化性物質（chem oattractant）であり、また、マスト細胞のヒスタミン放出および結果として生じる平滑筋の収縮を媒介する。一方、Ｃ５ｂは、標的細胞の表面でＣ６、Ｃ７およびＣ８と結合してＣ５ｂ〜８複合体を形成する。Ｃ９分子が結合すると、膜侵襲複合体(membrane attack complex、ＭＡＣ、Ｃ５ｂ〜９)が形成される。十分な数のＭＡＣが標的細胞膜中に挿入されると、それらが作り出す開口は、標的細胞の迅速な溶解を媒介する。より低い、非溶解性の濃度のＭＡＣは、他の効果を生じることができる。特に、内皮細胞および血小板への少数のＣ５ｂ〜９複合体の膜挿入は、潜在的に有害な細胞の活性化を引き起こし得る。いくつかの場合には、活性化は細胞溶解に先行する可能性がある。補体系の制御は、自己細胞の破壊を防止するために必要である。１９００年以来、補体媒介性細胞溶解は、補体および標的細胞が同じ種由来である場合には、効率的でないことがわかっている（Bordet，1900）。補体媒介性溶解に対する非ヒト細胞の感受性の研究から、このような細胞はヒト補体により容易に溶解されるが、同じ種に由来する補体による溶解に対しては一般に抵抗性であることが示された（Houle，et al.，1988）。この現象は、当技術分野で「補体媒介性溶解の同種制限」と呼ばれる。このような制限が起こるメカニズムは、同種補体媒介性損傷から細胞を保護するのに役立つ補体調節タンパクを同定した一連の実験によって、少なくとも部分的には解明されている（Rollins，et al.，1991）。II．Ｃ３インヒビタータンパク構造的特徴を共有する細胞表面タンパクのファミリーが記載されており、これらの作用の各々がＣ３ｂに影響を与える。崩壊促進因子（ＤＡＦまたはＣＤ５５）は、赤血球を含むすべての細胞に存在する。ＤＡＦは、一本鎖の７０kDaの糖タンパクであり、グリコホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）部分を通じて細胞膜に連結している。ＧＰＩ部分は、原形質膜二重層の外葉中に挿入している。ＤＡＦは、Ｃ３コンベルターゼ段階で、古典的経路および第二経路の両方のＣ３コンベルターゼの会合を防止することにより、補体活性化を調節する（Medof ，et al.，1984; Fujita，et al.，1987）。したがって、ＤＡＦは、宿主細胞膜上での補体カスケードの増幅を阻害することに加えて、アナフィラキシー性切断フラグメントであるＣ３ａおよびＣ５ａの形成を防止する。ＤＡＦは、細胞上での複雑な様式でのみ作用し、それが存在している細胞のみを保護するが、隣接する細胞にはなんら影響を与えないことが示された。ヒト赤血球からの抽出後、ＤＡＦは細胞膜中に再度取り込まれ、生物学的に活性である。ＤＡＦの膜形態および分泌形態が同定され、そのｃＤＮＡがクローニングされて特徴づけられている（Moran，et al.，1992）。ヒトＤＡＦのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、配列番号１として配列表に記載する。膜コファクタータンパク（ＭＣＰまたはＣＤ４６）は、赤血球以外のすべての細胞に存在する。ＭＣＰはＣ３ｂに結合するＩ型膜貫通糖タンパクである。ＭＣＰは、自己組織上に沈着したＣ３ｂおよびＣ４ｂのファクターＩ媒介性切断においてコファクターとして作用する。したがって、結合ＭＣＰの存在は、Ｃ３ｂを不活性フラグメントに切断する分子を活性化し、潜在的に細胞を溶解するＣ３ｂの蓄積を防止する。ＭＣＰのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、Lublin，et a l.，1988中に見い出すことができる。補体レセプター１（ＣＲ１またはＣＤ３５）は、赤血球、ならびにリンパ球、好中球および好酸球を含む選択された白血球のグループに見い出される。ＣＲ１は、１９０〜２８０kDaの膜貫通タンパクであり、それに接触する膜結合Ｃ３ｂ分子のタンパク分解的分解の引き金となる。これは、免疫複合体のクリアランスをも促進する。ＣＲ１のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、Wong，et al.，19 85中に見い出すことができる。ファクターＨおよびＣ４ｂ結合タンパクは、各々第二経路のＣ３コンベルターゼの活性を阻害する。ファクターＨのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、Ripo che，et al.，1988中に見い出すことができる。Ｃ４ｂ結合タンパクのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、Chung，et al.，1985中に見い出すことができる。これらのＣ３インヒビタータンパクのすべてをコードする遺伝子は、第１番染色体の長腕、バンド１ｑ３２にマッピングされており、ＲＣＡ（補体活性調節因子）遺伝子クラスターと呼ばれる遺伝子座を構成する。これらのＣ３インヒビタータンパクの分子構造において顕著なのは、ＳＣＲ（ショートコンセンサスリピート）と呼ばれる約６０アミノ酸の共通構造モチーフであり、これは、通常、必ずしも同一ではない複数のコピーで存在する。Perkins，et al.，1988; Coyne， et al.，1992を参照されたい。これらのＣ３インヒビタータンパクのＳＣＲモチーフは、４個の保存されたシステイン残基ならびに保存されたトリプトファン、グリシン、およびフェニルアラニン／チロシン残基を有する。ＳＣＲには、通常、長いセリン／スレオニン豊富領域が続いている。ＤＡＦおよびＭＣＰにおいては、ＳＣＲは十分な補体阻害活性に必要な機能的ドメインをコードすることが知られている（Adams，et al.，1991）。ＤＡＦは、ＳＣＲのカルボキシル末端側のセリン／スレオニン豊富領域に並べられた４個のＳＣＲからなっている。全部ではないにしてもほとんどの機能的ドメインは、ＳＣＲ２から４に存在すると報告されている（Coyne，et al.，1992）。配列番号１においては、ＤＡＦの４個のＳＣＲは、アミノ酸１からアミノ酸６１（ＳＣＲ１）、アミノ酸６２からアミノ酸１２５（ＳＣＲ２）、アミノ酸１２６からアミノ酸１８７（ＳＣＲ３）、アミノ酸１８８からアミノ酸２５０（ＳＣＲ４）を包含する（Lublin，et al.，1989）。「Ｃ３阻害活性」という言葉は、本明細書において、補体系に対する上記のタイプのＣ３インヒビタータンパクの効果を記載するために用い、したがって、Ｃ３コンベルターゼ複合体の破壊を導く活性および／またはＣ３ｂの分解に関与する活性を包含する。III．Ｃ５ｂ〜９インヒビタータンパク代表的なＣ５ｂ〜９インヒビタータンパクは、ＣＤ５９として知られるヒト糖タンパクである。ヒトＣＤ５９のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、配列番号２として配列表に記載する。ＣＤ５９は、ヒト赤血球、リンパ球および血管内皮細胞を含む細胞の膜に結合していることが見い出されている。これは、機能的ＭＡＣの会合を防止するのに役立ち、したがって補体媒介性細胞活性化および／または溶解から細胞を保護する。ＣＤ５９は、見かけの分子量が１８〜２１kDaであり、ＤＡＦのように、ＧＰＩアンカーで細胞膜の外側につながれている。例えば、Sims，et al.,米国特許第５１３５９１６号を参照されたい。ＣＤ５９は、Ｃ５ｂ〜８複合体中のＣ８に対する結合に関してＣ９と競合し、それによってＣ５ｂ〜９膜侵襲複合体（ＭＡＣ）の形成を減少させることにより、機能するようである（Rollins，et al.，1990）。したがって、ＣＤ５９は、最終補体ＭＡＣによる細胞の活性化および細胞の溶解の両方を減少させるよう作用する。ＣＤ５９のこの活性は、ほとんど種制限的であり、Ｃ８およびＣ９が同種の（すなわちヒト）血清に由来する条件下でＭＡＣの形成を最も効率よくブロックする（Venneker，et al.，1992）。非ヒト赤血球（これらは、それ自身の細胞表面補体インヒビタータンパクの作用によって同種の補体溶解から保護されていると考えられている）およびオリゴデンドロサイト（細胞表面タンパクによっては、あるとしても少ししか保護されていないが、脳血液関門により生体内（in vivo）で保護されている可能性があると信じられている脳細胞）の原形質膜中への精製ＣＤ５９の同化は、ＣＤ５９がこれらの細胞をヒト補体により媒介される細胞溶解から保護し得ることを示した（Rollins，et al.，1990; Rollins，et al.，1991; Stefanova，et al.，198 9; Meri，et al.，1990; Whitlow，et al.，1990; Okada，et al.，1989b; およびWing，et al.，1992）。ＣＤ５９をコードするｃＤＮＡがクローニングされ、ＣＤ５９遺伝子の構造が特徴づけされた（Davies，et al.，1989; Okada，et al.，1989; Philbrick，et al.，1990; Sawada，et al.，1990; およびTone，et al.，1992）。クローニングされたＣＤ５９ｃＤＮＡでトランスフェクトされ、それゆえその細胞表面にヒトＣＤ５９タンパクを発現する非ヒト哺乳動物細胞は、補体媒介性細胞溶解に対して抵抗性を獲得することが示された（Zhao，et al.，1991; およびWalsh,et al.，1991）。ＣＤ５９は、マウスのＬｙ−６抗原と構造的に関連していることが報告された（Philbrick，et al.，1990; およびPetranka，et al.，1992）。これらの抗原（Ｔ細胞活性化タンパクとしても知られる）をコードする遺伝子は、Ｌｙ−６多重遺伝子ファミリーのメンバーであり、Ｌｙ−６Ａ．２、Ｌｙ−６Ｂ．２、Ｌｙ −６Ｃ．１、Ｌｙ−６Ｃ．２およびＬｙ−６Ｅ．１を含む。マウス胸腺細胞Ｂ細胞抗原ＴｈＢをコードする遺伝子も、このファミリーのメンバーである(Shevach ,et al.，1989;および Gumley，et al.，1992)。Ｌｙ−６ファミリーのタンパクのアミノ酸配列の顕著な特徴は、そのシステイン残基の配置である。多くのタンパク質のシステイン残基は、当技術分野において「システイン骨格」と呼ばれる構造的要素を形成する。これらを有するタンパクにおいては、システイン骨格は、タンパク分子の三次元フォールディング、三次構造および究極的な機能の決定に本質的な役割を果たす。Ｌｙ−６多重遺伝子ファミリーのタンパク、ならびにいくつかの他のタンパク質は、本明細書中で「Ｌｙ−６モチーフ」と呼ぶ特定のシステイン骨格構造を共有する。例えば、ヒトウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子レセプター（ｕＰＡＲ；Roldan，et al.，1990）およびイカの機能の不明ないくつかの糖タンパクの１つ（Ｓｇｐ２；Williams，et al.，1988）は、Ｌｙ−６モチーフを含む。Ｌｙ−６モチーフを有するタンパク質のサブセットは、システイン残基のすぐ隣に保存されたアミノ酸が存在することによって同定することができる。タンパク質のサブセット中のこのような特定のアミノ酸の保存は、それらのタンパク質のフォールディング、三次構造および究極的機能の特定の側面に関連し得る。これらの保存されたパターンは、システイン残基を整合させるようにタンパク質の配列を整列させることによって、最も容易に認められる。 William L．Fodor，Scott Rollins，Russell Rother および Stephen P．Squi ntoによる、「非ヒト霊長類の補体インヒビタータンパク」なる発明の名称の、１９９３年８月１１日出願の、本願出願人の譲り受けた別出願である米国特許出願第０８／１０５７３５号（その関連部分は参照により本明細書中に包含されるものとする）およびRother，et al.，1994において十分に考察されているように、一連の非ヒト霊長類Ｃ５ｂ〜９阻害性タンパクが同定されており、これらは一般的Ｌｙ−６モチーフの特定のサブセットを定義するシステイン骨格構造を特徴とする。具体的には、これらの非ヒト霊長類ＣＩＰは、式： Cys-X₂-Cys-X_6-9-Cys-X₅-Cys-X₆-Cys-X₁₂- Cys-X₅-Cys-X₁₇-Cys-X₀-Cys-X₄-Cys (1) を特徴とするＬｙ−６モチーフを有するシステイン骨格を含むポリペプチドを包含する。さらに、非ヒト霊長類Ｃ５ｂ〜９阻害性タンパクは、以下の式： Cys-X₂-Cys-Pro-X_5-8-Cys-X₄-Asn- Cys-X₅-(Thr または Ser)-Cys-X₁₁-(Gln または Arg)- Cys-X₄-(Asn または Asp)-Cys-X₁₇-Cys-X₀-Cys-X₄-Cys (2) に従うアミノ酸配列を含む。両方の式において、Ｘ_nにおけるＸは、任意のアミノ酸の組み合わせを含むペプチドを示し、Ｘ_nにおけるｎは、ペプチドのアミノ酸残基の長さを表し、そして任意の位置の各Ｘは、他の任意の位置の同じ長さの他の任意のＸと、同一であっても、異なっていてもよい。 Bernhard Fleckensteinおよび Jens-Christian Albrechtによる、「ヘルペスウイルス・サイミリ（Herpesvirus Saimiri）の補体調節タンパク」なる発明の名称の、１９９３年１月１２日出願の、本願出願人の譲り受けた別出願であるＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９３／００６７２号（その関連部分は参照により本明細書中に包含されるものとする）およびAlbrecht，et al.，1992において十分に考察されているように、Ｃ５ｂ〜９阻害活性を有するHerpesvirus saimiriのタンパクが発見されている（本明細書中で「ＨＶＳ−１５」と呼ぶ）。このウイルスタンパクは、上記で考察した、すなわちその構造を上記式（１）および（２）で示した、非ヒト霊長類Ｃ５ｂ〜９阻害性タンパクに特徴的なＬｙ−６モチーフを有する。「Ｃ５ｂ〜９阻害活性」という言葉は、本明細書において、補体系に対する上記のタイプのＣ５ｂ〜９インヒビター分子の効果を記載するために用い、したがって、膜侵襲複合体（ＭＡＣ）の細胞活性化および／または溶解機能の阻害に導く活性を包含する。Ｖ．補体関連病理学ヒトの研究およびヒト機能不全の動物モデルを用いる研究は、病理学においてＣＩＰは多くの機能不全と関連していることを示している。これらには、以下のものが含まれる。移植：提供者（ドナー）器官の保存中の第二経路を通じての補体侵襲の複雑な活性化は、Ｃ５ｂ〜９ＭＡＣによる内皮細胞刺激および／または溶解の結果として生じる、器官移植に付随するある種の問題の原因となる（Brasile，et al. ，1985）。半ビボ（ex vivo）での補体侵襲は、保存された器官を移植する場合、血管の生存率の減少および血管の完全性の減少をもたらし、移植物の拒絶の可能性を高める。ＨＬＡ同一性を有する同種移植の腎臓の１０％は、in vivoの免疫学的メカニズムにより拒絶される（Brasile，et al.，1987）。これらの条件下で器官を拒絶する患者の７８％において、血管内皮細胞の表面上の分子に結合する細胞傷害性抗体が見られる（Brasile，et al.，1987）。このような抗体細胞傷害性は、補体侵襲により媒介され、腎臓および心臓を含む移植された固体器官の拒絶の原因となる（Brasile，et al.，1987; Brasile，et al.，1985）。抗体により開始される補体媒介性の拒絶は、通常、迅速かつ不可逆的な、超急性拒否反応と呼ばれる現象である。非ヒト器官をヒト患者に移植する場合のような、異種移植の状況においては、ドナー器官の脈管をおおう内皮細胞の表面上の分子に対する抗体による補体侵襲の活性化は、ほとんど常に観察される。このような異種反応性抗体の出現は、移植片の超急性拒否反応のほとんど普遍的な発生の原因である（Dalmasso，et al. ，1992）。ヒトを含む旧世界霊長類には、一致しない種からの異種細胞の表面に発現される炭水化物抗原決定基を主に認識する、あらかじめ存在する高レベルの循環「天然」抗体を有する。最近の証拠は、これらの抗体のほとんどが、ガラクトース（Ｇａｌ（α１−３）Ｇａｌ）を有するα１−３連鎖中のガラクトースと反応することを示している（Sandrin et al.，1993）。旧世界霊長類には、適切な機能的α１，３−ガラクトーストランスフェラーゼが欠けており、それゆえこの炭水化物エピトープは発現されない。したがって、血管新生した異種ドナー器官の移植に続いて、これらの高力価の抗体が、血管内皮のＧａｌ（α１−３）Ｇａｌエピトープに結合し、古典的経路を通じて受容者（レシピエント）の補体を活性化する。補体カスケードの活性化から起こる大規模な炎症応答は、数分から数時間以内にドナー器官の破壊をもたらす。異種反応性抗体は、すべての場合において排他的に一致しない器官の超急性拒否反応の原因となるわけではない。例えば、ある種からの赤血球は、第二経路を通じてヒト補体を活性化することができるし、あらかじめ形成される抗体を持たないように育てられた新生児ブタは、ほとんど直ちに異種移植片を拒絶する。したがって、いくつかの種の組み合わせにおいては、第二補体経路の活性化が移植片拒絶反応に寄与している可能性が高い。内在的に発現された、膜結合型補体インヒビタータンパクは、通常、自己補体から内皮細胞を保護する。しかし、これは、補体インヒビターの種に関する制限により、一致しない異種血清補体を調節することに関してはあまり効果的ではない。この抗体および補体媒介性超急性拒否反応を排除することを目的とする効果的な治療法の欠如は、一致しない動物の器官をヒト受容者に成功裡に移植することに対する主要な障壁となっている。最近、ヒヒからヒトへの肝臓移植に関する報告が刊行され、この中では、異種ドナー器官は超急性拒否反応の徴候を示さなかった（Starzl，et al.，1993）。ヒト血中に存在すると思われる低レベルの抗ヒヒ抗体は、超急性応答を起こりにくくする。しかし、最近発見されたヒヒＣＩＰが、ＣＤ５９に関連していること、およびヒト補体に対して効果的であることが示されており、これもこの異種移植された器官の完全性を維持するのにある役割を果たしていると信じられている（上記で引用した米国特許出願第０８／１０５７３５号を参照されたい）。上述のヒヒからヒトへの異種移植において見られた超急性拒否反応の欠如は、ヒト補体に対して効果的である補体インヒビタータンパクが、他の拒絶反応防止戦略と組み合わせることによって、このようなタンパクを発現するトランスジェニック動物の器官をヒト患者に安全かつ効果的に異種移植することを可能にし得ることを示唆する。発作性夜間ヘモグロビン尿症：補体活性化の第二経路が関与する補体媒介性疾患のひとつは、幹細胞機能不全の発作性夜間ヘモグロビン尿症（paroxysmal n octurnal hemoglobinuria）である。ＣＤ５９を含む補体インヒビタータンパクは、この疾患の患者に見い出されるほとんどの溶血感受性赤血球の膜から欠如している。これらのタンパクの欠如は、赤血球の補体媒介性溶解を増強すると考えられており、このことがこの疾患を特徴づける（Venneker，et al.，1992を参照されたい）。ＰＮＨ細胞の治療におけるキメラ最終補体インヒビタータンパクの使用は、Russel Rother，Scott Rollins，Seth A．Fidel およびStephen P．Squ intoの名前で同時に出願された「発作性夜間ヘモグロビン尿症の治療方法」なる発明の名称の、本願出願人の譲り受けた別出願である米国特許第０８／２０６１８９号に考察されている。VI．改変された膜アンカーを有するＣＩＰ細胞外表面へのＧＰＩアンカーを有するタンパクの付着手段を変更した機能的な帰結を調べるために、改変された膜アンカーを有するＣＩＰを作成する研究がなされてきた。これらの研究においては、ＣＩＰの本来の細胞表面アンカーは、他のアンカー部分との置換によりその天然のＧＰＩアンカーから変化させてある（Su，et al.，1991;および Lublin，et al.，1991）。例えば、ＤＡＦの誘導体は、ＭＣＰの膜貫通ドメイン（すなわち、ＭＣＰのアミノ酸２７０〜３５０）またはヒト主要組織適合性タンパクＨＬＡ−Ｂ４４の膜貫通ドメイン（すなわち、ＨＬＡ−Ｂ４４のアミノ酸２６２〜３３８）に融合したＤＡＦのアミノ酸１〜３０４を含み、本来のＤＡＦと同等の機能レベルを保持していることが報告された（Lublin，et al.，1991）。ＣＤ５９の誘導体は、ＭＣＰの膜貫通ドメイン（すなわち、ＭＣＰのアミノ酸２７０〜３５０）に融合したＣＤ５９のアミノ酸１〜７７を含み、本来のＣＤ５９と同等の機能レベルを保持していることが、Russell Rother，Scott および R ollins，Stephen P．Squinto の名前で同時に出願された、「最終補体インヒビター融合遺伝子およびタンパク質」なる発明の名称の、本願出願人の譲り受けた別出願である米国特許出願第０８／２０５７２０号において示された。発明の概要上記の点から見て、補体系を阻害することにおける用途のための新規なキメラタンパクを提供することは本発明の目的である。この目的および他の目的を達成するために、本発明は、２つのＣＩＰの機能的ドメインを含み、その一方の機能的ドメインはＣ３阻害活性を有し、他方の機能的ドメインはＣ５ｂ〜９阻害活性を有しており、Ｃ３阻害活性はＣ５ｂ〜９阻害活性のアミノ末端側にある、ｃＣＩＰを提供する。本発明の好ましい形態においては、Ｃ３およびＣ５ｂ〜９阻害活性は、ヒト補体系に対して向けられている。本発明は、１）そのようなｃＣＩＰをコードする核酸分子、２）そのような核酸分子を含有するトランスジェニック細胞、組織、器官および動物、３）その核酸分子を含有する発現ベクター、および４）その発現ベクターを含有する宿主細胞をも提供する。重要なことに、その構造、すなわち、キメラ分子内での阻害活性の順序の結果として、本発明のｃＣＩＰは、Ｃ３阻害活性およびＣ５ｂ〜９阻害活性の両方を発現する。これは、以前には当技術分野で達成されていなかった結果である。本発明に従って、これらのキメラタンパクおよびそれをコードするポリヌクレオチドは、補体媒介性病理状態の治療および／または予防のための治療剤の成分として用いることができる。本発明のｃＣＩＰによって与えられる補体侵襲からの保護は、例えば移植において、病理学的補体侵襲の治療的予防のために遺伝子移入（トランスファー）を通じて提供し得る。このような療法の好ましい形態においては、ｃＣＩＰの発現は、ヒト患者への移植に際し、補体侵襲から非ヒト動物器官を保護するために、このような器官の細胞表面に向けることができる。本発明は、トランスジェニック動物の作成において特に有利である。動物卵の前核中への組換えＤＮＡのマイクロインジェクションは、トランスジェニック動物の作成の日常的手順となっている。しかし、この技術はＤＮＡのランダムな組み込みに依存するために、個々のＣＩＰの使用を通してＣ３阻害活性およびＣ５ｂ〜９阻害活性を達成しようとするとしたら必要になるように、２つの個別の非相同タンパクをそのそれぞれのＤＮＡの同時マイクロインジェクションにより標的とする細胞で発現させることは、困難である。本発明は、Ｃ３およびＣ５ｂ〜９阻害活性の両方を単一のタンパクにコードする新規な単一の遺伝子を提供するので、この技術的ハードルを克服する。さらに、多くのＣＩＰ、特にＤＡＦおよびＣＤ５９は、糖リン脂質部分（ＧＰＩアンカー）を通じて原形質膜につながれているので、ＧＰＩアンカーの形成に必要な生化学的および酵素的機構（マシナリー）が限られていることにおいて、ＧＰＩアンカーを有する複数のＣＩＰを単一の細胞で高レベルで発現させることは、さらに困難である。これは、ＧＰＩアンカーを有するＣＩＰの機能性が望ましい場合には、本発明のさらなる利点である。要約すると、本発明のｃＣＩＰは、以下の利点を提供する：(1)それらは、Ｃ３およびＣ５ｂ〜９インヒビターの両方として同時に作用する、(2)それらは、トランスジェニック動物での発現に関して、単一のランダム組み込み事象しか必要とせず、したがってトランスジェニック動物のある一定の細胞タイプ（例えば、内皮細胞）での２つの補体インヒビターの高レベル発現の機会を有為に増大する、および、(3)ＧＰＩアンカーを有する単一の二機能性ｃＣＩＰの発現は、ｃＣＩＰがＧＰＩアンカーによって細胞膜に付着するような場合に、ＧＰＩアンカーを合成するのに必要な細胞マシナリーの重荷にならない。この最後の利点に関連して、単一の細胞でＧＰＩアンカーを有する２つの独立した組換えＣＩＰを発現させようとして得られるであろうものよりも、高いレベルの補体阻害活性が達成され得る。この特性は、異種細胞に与えられる補体保護の程度は細胞表面に発現される補体インヒビター分子の数に正比例することにおいて、特に重要な利点である。Zhao，et al.，1991を参照されたい。本発明のある好ましい態様においては、Ｃ３阻害活性を有する機能的ドメインは、ＤＡＦまたはＤＡＦ由来のものであり、Ｃ５ｂ〜９阻害活性を有する機能的ドメインは、ヒトＣＤ５９またはヒトＣＤ５９由来のものである。図面の簡単な説明図１Ａは、本発明に従って作成され、「ＤＣ」構築体と特定されるｃＣＩＰ分子（ＤＡＦ／ＳＣＲ２−４−ＣＤ５９）の模式図である（キメラＤＣ）。このｃＣＩＰは、Ｃ５ｂ〜９阻害活性のアミノ末端側にＣ３阻害活性を有する。図１Ｂは、逆の方向を有し、「ＣＤ」と名付けられたキメラ分子（ＣＤ５９−ＤＡＦＳＣＲ１−４）の分子構造の模式図である（キメラＣＤ）。ＤＣ分子は、Ｃ３およびＣＤ５９活性の両方を現す。ＣＤ分子はＣ３阻害活性のみを現す。図２は、ＤＣおよびＣＤ分子の細胞表面発現のフローサイトメトリー解析の結果を示す。図２Ａおよび２Ｂにおいては、ＭＥＭ４３抗ＣＤ５９モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を用い、一方、図２Ｃおよび２Ｄにおいては、ＢＲＩＣ２１６抗ＤＡＦｍＡｂを用いた。図３は、ＰＩ−ＰＬＣ処理の前後のＤＣｃＣＩＰの細胞表面発現のフローサイトメトリー解析の結果を示す。これらの図を作成するのに使用したクローンは、ＤＣ−Ａ５であった。図３Ａにおいては、ＭＥＭ４３抗ＣＤ５９ｍＡｂを用い、一方、図３Ｂにおいては、ＢＲＩＣ２１６抗ＤＡＦｍＡｂを用いた。図４は、増大する濃度（図４Ａでは５％；図４Ｂでは１０％；図４Ｃでは２０％；そして図４Ｄでは４０％）のヒト全血清とのインキュベーション後の、ＤＣｃＣＩＰを発現する哺乳動物細胞表面へのＣ３の沈着の程度のフローサイトメトリー解析の結果を示す。細胞表面Ｃ３沈着（通常、タンパク分解フラグメントの形態）は、Ｃ３コンベルターゼ活性の目安である。この図においては、ＤＣにより提供されるＣ３コンベルターゼ阻害の程度を、ＣＤ、ＤＡＦおよびＣＤ５９により提供されるものと比較している。図５は、ＣＤ５９、ＤＡＦ、ＣＤおよびＤＣによる、細胞溶解からの哺乳動物細胞の保護を説明する。上述の図は、本明細書に取り込まれ、その一部を構成するものであり、本発明の好ましい態様のある側面を説明し、記載とともに、本発明のある原理を説明するのに役立つものである。もちろん、図面および記載の両方は、説明のためのみのものであり、本発明を制限するものではないことは理解されるべきである。好ましい態様の説明Ｉ．本発明のｃＣＩＰ上記で考察したように、本発明は、Ｃ３阻害活性を有するアミノ酸配列（以下、「Ｃ３／ＣＩＰ配列」と呼ぶ）およびＣ５ｂ〜９阻害活性を有するアミノ酸配列（以下、Ｃ５ｂ〜９／ＣＩＰ配列」と呼ぶ）を含み、Ｃ３／ＣＩＰ配列がＣ５ｂ〜９／ＣＩＰ配列のアミノ末端側にある、ｃＣＩＰに関する。Ｃ３／ＣＩＰ配列は、ｃＣＩＰにＣ３阻害活性を提供し、Ｃ５ｂ〜９／ＣＩＰ配列は、Ｃ５ｂ〜９阻害活性を提供する。Ｃ３阻害活性を有するアミノ酸配列は、天然のＣＩＰのアミノ酸配列全体または部分、例えば、ＣＩＰの１つまたはそれ以上のＳＣＲを含むことができる。例えば、Ｃ３／ＣＩＰ配列は、成熟ＤＡＦ分子（すなわち、配列番号１のアミノ酸１〜３４７）または成熟ＭＣＰ分子（すなわち、配列番号３のアミノ酸１〜３５０）であることができる。あるいは、Ｃ３／ＣＩＰ配列は、天然のＣ３インヒビタータンパクの一部分であることができる。ＤＡＦおよびＭＣＰの機能的ドメインを同定するために使用された手順に従って（Adams，et al.，1991）、他のＣ３インヒビターの機能的ドメインを同定し、本発明において使用することができる。一般に、用いる部分は、親分子の活性の少なくとも約２５％、好ましくは少なくとも約５０％を有するべきである。本発明における使用のために特に有用な成熟Ｃ３インヒビタータンパクの部分は、成熟分子のＳＣＲの１つまたはそれ以上を含む。上記で考察したように、これらのＳＣＲは、通常、約６０アミノ酸の長さであり、ジスルフィド結合を形成する４個の保存されたシステイン残基、ならびに保存されたトリプトファン、グリシン、およびフェニルアラニン／チロシン残基を有する。一般に、本発明の実施においては２つ以上のＳＣＲを用いる。後記の実施例に記載するように、特に好ましいＣ３／ＣＩＰ配列は、ＤＡＦのＳＣＲ２〜４を含む。Ｃ５ｂ〜９／ＣＩＰ配列は、天然のＣ５ｂ〜９インヒビタータンパクのアミノ酸配列全体または部分を含むことができる。例えば、Ｃ５ｂ〜９／ＣＩＰ配列は、成熟ＣＤ５９分子（すなわち、配列番号２のアミノ酸１〜１０３）、または非ヒト霊長類Ｃ５ｂ〜９インヒビタータンパク（例えば、配列番号４のアミノ酸１〜１０３、配列番号５のアミノ酸１〜１０１、配列番号６のアミノ酸１〜１０６、配列番号７のアミノ酸１〜１０３、または配列番号８のアミノ酸１〜１０３）、または成熟ＨＶＳ−１５インヒビタータンパク（すなわち、配列番号９のアミノ酸１〜１０２）であることができる。あるいは、Ｃ５ｂ〜９／ＣＩＰ配列は、天然のＣ５ｂ〜９インヒビタータンパクの一部分であることができる。本発明における使用に好適な活性部分は、当技術分野で公知の様々なＣ５ｂ〜９阻害活性に関する検定を用いて同定することができる。Rollins，et al.，1990; Rollins，et al.，1991; Zhao，et al.，1991 ; および Rother，et al.，1994を参照されたい。例えば、上記で引用した「最終補体インヒビター融合遺伝子およびタンパク質」なる発明の名称の別出願である出願番号第０８／２０５７２０号中で明らかにされているように（その関連部分は参照により本明細書中に包含されるものとする）、ＣＤ５９のアミノ酸１〜７７は、Ｃ５ｂ〜９阻害活性を有するＣＤ５９分子の一部分を含む。一般に、用いる部分は、親分子の活性の少なくとも約２５％、好ましくは少なくとも約５０％を有するべきである。上述したように、天然のＣ５ｂ〜９インヒビタータンパクは、一般に上記式（１）および（２）で表すことができる共通モチーフを共有する。本発明における使用のために好ましい成熟Ｃ５ｂ〜９インヒビタータンパクの部分は、これらの式で定義されるアミノ酸配列を有するものである。Petranka，et al.，1993およびNorris，et al.，1993は、ＣＤ５９（配列番号２）において、Ｃｙｓ６とＣｙｓ１３との間のジスルフィド結合、ならびにＣｙｓ６４とＣｙｓ６９との間のジスルフィド結合は、これらのシステインをセリンで置き換えることによって、ＣＤ５９の機能性を実質的に損なうことなく破壊することができることを報告した。これらのシステインは、上記式中の、２番目、３番目、９番目、１０番目のシステインに相当する。したがって、上記式を有するが、上記のシステインのいくつかまたは全部がセリンまたは他のアミノ酸で置き換えられている、成熟Ｃ５ｂ〜９インヒビタータンパクの部分は、本発明の実施において用いることができる。上述したように、本発明の重要な側面は、Ｃ３阻害活性を有するアミノ酸配列とＣ５ｂ〜９阻害活性を有するアミノ酸配列とがキメラ分子中で存在する順序である。後記の実施例で明らかにするように、Ｃ３阻害活性を有するアミノ酸配列は、Ｃ５ｂ〜９阻害活性を有するアミノ酸配列のアミノ末端側でなければならない。逆の順序では、Ｃ３阻害活性のみしか生成されない。Ｃ３阻害活性を有するアミノ酸配列およびＣ５ｂ〜９阻害活性を有するアミノ酸配列は、互いに直接接続していなければならないことはない。むしろ、リンカー配列でこれらの２つの配列を分けることができる。リンカーは、好ましくは１個〜約１０個のアミノ酸を含むが、望ましい場合にはより多くのアミノ酸を用いることができる。後記の実施例では、リンカーの形成にグリシンを用いた。このアミノ酸は、リンカー領域を含む他のキメラタンパクにおいて成功裡に働くことが見い出されている。Curtis，et al.の「ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−３を含む融合タンパク」、米国特許第５０７３６２７号を参照されたい。望ましい場合には、他のアミノ酸ならびにアミノ酸の組み合わせをリンカー領域に用いることもできる。後記の実施例においては、Ｃ５ｂ〜９阻害活性を有するアミノ酸配列は、ＧＰＩアンカーを含み、これがキメラＣＩＰを細胞膜に付着させる。Ｃ５ｂ〜９阻害活性を有し、ＧＰＩアンカーではなく膜貫通ドメインによって細胞膜に付着するＣＩＰは、上記で引用した「最終補体インヒビター融合遺伝子およびタンパク質」なる発明の名称の別出願である出願第０８／２０５７２０号（その関連部分は参照により本明細書中に包含されるものとする）に記載されている。細胞膜付着のためのこのような膜貫通ドメインは、本発明の実施に用いることができる。上述したように、本発明のｃＣＩＰは、Ｃ３／ＣＩＰ配列およびＣ５ｂ〜９／ＣＩＰ配列の順序を通じて、Ｃ３阻害活性およびＣ５ｂ〜９阻害活性の両方を現す。このキメラ分子は、そのキメラを作成した元の親インヒビタータンパクの阻害活性の少なくとも約２５％、好ましくは少なくとも約５０％を現す。このようにして、上述のような、１つの分子において両方のタイプの補体阻害を提供する利点が達成される。II．ｃＣＩＰ遺伝子およびこのような遺伝子を含むベクター本発明のｃＣＩＰをコードするヌクレオチド配列を包含する分子は、当技術分野で現在公知の、または後に開発される種々の技術を用いて調製することができる。例えば、ｃＣＩＰは、ＰＣＲ生成、および／またはクローニングした遺伝子の制限消化を用いて、Ｃ３およびＣ５ｂ〜９阻害活性を有するアミノ酸配列をコードするフラグメントを生成することにより、調製することができる。これらのフラグメントは、制限消化生成物の酵素的連結またはＰＣＲ融合を用いて組み立てることができる（Sambrook，et al.，1989; Ausubel，et al.，1992）。あるいは、本発明のｃＣＩＰをコードする核酸分子またはｃＣＩＰのキメラ遺伝子を組み立てるのに用いるいずれかもしくはすべての核酸フラグメントは、化学的手段により合成することもできる（Talib，et al.，1991）。本発明のｃＣＩＰをコードする核酸分子は、分子にＣ３およびＣ５ｂ〜９阻害活性を与えるアミノ酸配列をコードするものに加えて、さらなる配列を含むことができる。例えば、上述したように、キメラタンパクはリンカー配列を含むことができ、この場合、核酸分子はリンカーをコードする対応する配列を含む。さらに、宿主細胞によるプロセッシングを可能にするために、核酸配列は、好ましくは、その５’末端に、細胞の外へのキメラタンパクの輸送を指示するシグナルペプチドをコードする。好適なリーダー配列は、ＣＩＰに天然に付随するもの、例えば、ＣＤ５９のリーダー配列、すなわち配列番号２のアミノ酸−２５〜−１である。キメラ分子に所望の阻害活性を有する全長ＣＩＰの一部分のみを含む場合には、クローニング手順は、全ＣＩＰ分子に関する核酸配列から始めることができる。核酸分子の所望の部分は、ＰＣＲまたは制限消化技術を用いて全分子から得ることができる。上述のものに加えて、本発明は、本発明のｃＣＩＰをコードする核酸フラグメントを含む組換え発現ベクターを提供する。このようなキメラタンパクをコードする核酸分子は、適切な発現ベクター、すなわち、挿入されたタンパクコード配列の転写および翻訳に必要な要素を含むベクターに、挿入することができる。必要な転写および翻訳シグナルは、本発明の融合遺伝子を構築するのに用いた遺伝子および／またはその隣接（フランキング）領域から供給することもできる。脊椎動物細胞において発現を指示するのに用いるべき発現ベクター系のための転写および翻訳調節配列は、ウイルス供給源から提供してもよい。例えば、一般に使用されるプロモーターおよびエンハンサーは、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、サルウイルス４０（ＳＶ４０）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、そのロングターミナルリピート（ＭＭＬＶ−ＬＴＲ）、ならびにヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、そのサイトメガロウイルス初期（immediate- early）遺伝子１プロモーターおよびエンハンサーから由来する。レトロウイルス発現ベクターは、本発明のｃＣＩＰの発現に関して好ましい系である。レトロウイルスベクターを構築するためのレトロウイルス核酸およびパッケージング細胞の操作は、当業界で公知の技術を用いて達成する。Ausubel，et al. ，1992、１巻、セクションIII(ユニット９．１０．１〜９．１４．３)；Sambroo k,et al.，1989; Miller，et al.，1989; Eglitis，et al.，1988; 米国特許第4 650764号、第4861719号、第4980289号、第5122767号、および第5124263号；ならびにＰＣＴ特許公報ＷＯ85/05629号、ＷＯ89/07150号、ＷＯ90/02797号、ＷＯ90 /02806号、ＷＯ90/13641号、ＷＯ92/05266号、ＷＯ92/07943号、ＷＯ92/14829号、およびＷＯ93/14188号を参照されたい。特に、本発明のレトロウイルスベクターは、以下のように調製し、使用することができる。最初に、ｃＣＩＰレトロウイルスベクターを構築し、両栄養性（am photropic）パッケージング系、好ましくは遺伝子治療での適用に使用するのに好適なものを使用して、非感染性の形質導入ウイルス粒子（ビリオン）にパッケージングする。このようなパッケージング系の例は、例えば、Miller，et al.，1986; Markow itz，et al.，1988; Cosset，et al.，1990;米国特許第4650764号、第4861719号、第4980289号、第5122767号、および第5124263号；ならびにＰＣＴ特許公報ＷＯ85/05629号、ＷＯ89/07150号、ＷＯ90/02797号、ＷＯ90/02806号、ＷＯ90/13641号、ＷＯ92/05266号、ＷＯ92/07943号、ＷＯ92/1 4829号、およびＷＯ93/14188号に見い出される。好ましいパッケージング細胞は、ＰＡ３１７パッケージング細胞株（ＡＴＣＣＣＲＬ９０７８）である。「プロデューサー細胞」の生成は、レトロウイルスベクターをパッケージング細胞に導入することにより達成する。このようなレトロウイルスベクターの例は、例えば、Korman，et al.，1987; Morgenstern，et al.，1990;米国特許第４４０５７１２号、第４９８０２８９号、および第５１１２７６７号；ならびにＰＣＴ特許公報ＷＯ８５／０５６２９号、ＷＯ９０／０２７９７号、およびＷＯ９２／０７９４３号に見い出される。好ましいレトロウイルスベクターは、ＭＭＬＶ由来発現ベクターであるｐＬＸＳＮ（Miller，et al.，1989）である。本発明の実施に使用するレトロウイルスベクターは、ｃＣＩＰをコードするキメラ遺伝子を含むように改変する。上述の手順で生成されたプロデューサー細胞は、レトロウイルスベクター粒子（ビリオン）を生成するのに使用する。これは、細胞を好適な生育培地中で培養することによって達成する。好ましくは、ビリオンは、培養物から収穫し、形質導入すべき標的細胞、例えば、ｃＣＩＰにより補体を阻害されうる患者への移植に使用すべき異種細胞、このような患者への移植に使用すべき異種器官の細胞、患者自身の細胞、および補体侵襲から保護すべき他の細胞、ならびに胚性幹細胞のような幹細胞に投与する。これらは、移植のためのトランスジェニック細胞、組織または器官を生成するのに使用することができる。あるいは、実施可能な場合には、標的細胞をプロデューサー細胞と同時培養することもできる。ビリオンの安定な保存およびその後の使用のために好適な緩衝液および条件は、例えば、 Ausubel，et al.，1992に見い出すことができる。本発明のレトロウイルスベクター粒子を含有する医薬組成物は、様々な単位用量形態で投与することができる。用量は、例えば、特定のベクター、投与の仕方、治療する特定の疾患およびその重症度、患者の総合的健康状態および年齢、処置する細胞の状態、および医師の判断によって変化する。哺乳動物細胞の形質導入のための投薬レベルは、一般に、１処置あたり約１０⁶〜１０¹⁴コロニー形成単位のレトロウイルスベクター粒子の間である。本発明のレトロウイルスベクター粒子の投与には、様々な医薬製剤を用いることができる。好適な製剤は、例えば、「レミントンの医薬科学（Remington's Ph armaceutical Sciences）」、第１７版、Mack Publishing Company，Philadelph ia，PA(1985)に見い出され、生理食塩水、緩衝（例えば、リン酸緩衝）生理食塩水、ハンクス液、リンガー溶液、デキストロース／生理食塩水、ブドウ糖溶液などのような医薬的に有効な担体を含有する。製剤は、必要に応じて医薬的に許容可能な補助物質、例えば、浸透圧調整剤（tonicity adjusting agents）、湿潤剤、殺菌剤、保存剤、安定剤などを含有していてもよい。III．トランスジェニック動物本発明のある側面に従って、本発明の核酸分子は、当技術分野で公知の技術を用いて細胞（例えば、内皮細胞）の表面に本発明のｃＣＩＰを発現する工学処理されたトランスジェニック動物（例えば、齧歯類、例えばマウス、ラット、キャピバラなど、ウサギ目、例えばウサギ、ノウサギなど、有蹄類、例えばブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジなど）を生成するのに用いられる。これらの技術としては、（例えば前核の）マイクロインジェクション、卵または接合子の電気穿孔法（エレクトロポレーション）、核移植、および／または選択した動物由来の胚性幹細胞の安定なトランスフェクションまたは形質導入が挙げられるが、それらに制限されない。これらの技術の共通の要素は、移入遺伝子（transgene）転写単位の調製に関する。このような単位は、一般に、１）プロモーター、２）目的の核酸配列、すなわち本発明のｃＣＩＰをコードする配列、および３）ポリアデニル化シグナル配列、を含むＤＮＡ分子を包含する。他の配列、例えば、エンハンサーおよびイントロン配列は、所望であれば含ませることができる。この単位は、ｃＣＩＰタンパクを（例えば哺乳動物細胞で）発現するプラスミドベクターの制限フラグメントを単離することにより好都合に調製することができる。好ましくは、制限フラグメントは、細菌宿主細胞で複製を指示する配列を含まない。これは、そのような配列が胚の生存率に対して悪影響を有することが知られているためである。トランスジェニック動物の作成のための最もよく知られた方法は、ドナー雌の排卵過度化、卵の外科的除去、胚の前核への移入遺伝子転写単位の注入、および通常は同じ種である偽妊娠宿主母の生殖管へのトランスジェニック胚の導入によって、トランスジェニックマウスを作成するのに用いられた方法である。Wagner の米国特許第４８７３１９１号；Brinster，et al.，1985; Hogan et al.，1986 ; Robertson，1987; Pedersen，et al.，1990を参照されたい。トランスジェニック家畜を作成するためのこの方法の使用も、当業者により広く行われている。一例としては、トランスジェニックブタは、ブタ胚への移入遺伝子転写単位のマイクロインジェクションにより日常的に作成されている。例えば、ＰＣＴ公報ＷＯ９２／１１７５７号を参照されたい。手短に述べると、この手順は、以下のように実施し得る。最初に、移入遺伝子転写単位をゲルで単離し、例えばＥＬＵＴＩＰカラム（Sc hleicher & Schuell，Keene，NH）を通して徹底的に精製して、発熱物質（パイロジェン）無含有注入緩衝液（パイロジェン無含有水中、１０mMトリス、pH７. ４および０.１mMＥＤＴＡ）に対して透析し、胚注入に用いる。胚を、ホルモンにより同調させた、排卵誘発した雌の卵管から、好ましくは前核段階で回収する。これらを、約０.５mlの胚移入培地（１０％ウシ胎児血清を含むリン酸緩衝生理食塩水）を含有する１．５ml微量遠心管に入れる。これを、微量遠心機で１６０００×ｇで１２分間遠心分離する。先を細くして磨いたパスツールピペットで微量遠心管から胚を回収し、検査のために３５mmペトリ皿に入れる。前核が明確に見えないように細胞質が脂質でまだ不透明だったら、さらに１５分間、胚を再び遠心分離する。マイクロインジェクションに用いるべき胚を、１００mmペトリ皿の蓋の中央の１滴の培地（約１００μl）中に置く。シリコーン油を用いて、この１滴をおおい、培地が蒸発するのを防ぐために蓋を満たす。胚を含むペトリ皿の蓋を、加熱したステージ（３７．５〜３８℃）およびホフマンモジュレーションコントラスト部材（Hoffmann moduration contrast optic s）を装着した倒立顕微鏡（最終拡大率２００倍）の上に設置する。細く延ばして磨いたマイクロピペットを用いて胚を安定化しながら、別の細く延ばして磨いたマイクロピペットで、約２００〜５００コピーの精製された移入遺伝子転写単位を含有する約１〜２pl（ピコリットル）の注入緩衝液を、核、好ましくは雄性前核中に送り込む。形態学的観察により判断して、マイクロインジェクションの過程を生き残った胚を、レシピエントの偽妊娠ブタへの移入のためにポリプロピレン管（内径２mm）に入れる。子孫を、各仔ブタの尾から採った組織からゲノムＤＮＡを単離し、このゲノムＤＮＡ約５μgを、移入遺伝子特異的プローブを用いる核酸ハイブリダイゼーション解析に付すことによって、移入遺伝子の存在について試験する。トランスジェニック動物の作成のために一般に用いられる別の技術は、ＰＣＴ特許公報ＷＯ９３／０２１８８号およびRobertson，1987に記載されているように、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）の遺伝子操作に関する。この技術に従えば、ＥＳ細胞は、例えば、Robertson，1987 およびWilliams et al.に対する米国特許第５１６６０６５号に記載されているように生育させる。遺伝物質は、例えばMacMah on，et al.，1990に従って、電気穿孔法などにより、または例えばRobertson，e t al.，1986の方法に従って、レトロウイルスベクターでの形質導入により、またはLovell-Badge，1987に記載されている種々の技術のいずれかにより、胚性幹細胞中に導入する。キメラ動物は、例えば、Bradley，1987に記載のように生成する。手短に述べれば、遺伝的に改変したＥＳ細胞を胚盤胞に導入し、次に改変した胚盤胞を偽妊娠雌動物に移植する。キメラは、例えば、ＥＳ細胞の調製に用いた系統と胚盤胞の調製に用いた系統との差異によって生じるモザイク状の外皮の色を観察することにより、子孫から選択して、非キメラトランスジェニック動物を生成するために交配する。トランスジェニック動物の作成のための他の方法は、Wagner et al.に対する米国特許第５０３２４０７号およびＰＣＴ公報ＷＯ９０／０８８３２号に開示されている。他の応用の中で、本発明に従って調製したトランスジェニック動物は、その工学処理された組織または器官の異種移植の試験のためのモデル系として、そして、異種移植のための工学処理された組織または器官の供給源として有用である。トランスジェニック動物の組織および器官の内皮細胞および／または他のタイプの細胞（例えば、膵臓の小島中のもののようなホルモン産生細胞）の表面での機能的ｃＣＩＰの発現は、これらの細胞、組織および器官に対して、レシピエント動物、例えばｃＣＩＰによりその補体を阻害し得るヒトのような動物における異種移植後の超急性補体媒介性拒絶反応からの、強化された保護を提供する。移植用の器官の生成における用途に加えて、本発明のｃＣＩＰ核酸構築体は、移植における後の使用のために種々の種の培養細胞（例えば、内皮細胞）を工学処理するためにも使用することができる。IV．代表的な改変態様本発明の特定の態様を本明細書において記載し、説明するが、本発明の精神および範囲から逸脱することなしに、変更を加えることができることは理解されるべきである。例えば、本発明のｃＣＩＰの一次アミノ酸構造は、アミノ酸置換または核酸突然変異を作ることにより改変してもよい。そのような改変の後、少なくともいくらかの補体調節活性は保持されるはずである。同様に、アミノ酸配列を変えない核酸突然変異、例えば、縮重コドンの３番目のヌクレオチドの変化は、本発明の範囲内に包含される。ｃＣＩＰを作成するのに用いるＣ３／ＣＩＰおよびＣ５ｂ〜９／ＣＩＰの遺伝子の天然の対立遺伝子変異体として見い出される変化を含む配列もまた、包含される。本発明を、いかなる形においても制限することを意図せずに、以下の実施例において、より十分に説明する。実施例１ＤＣをコードするポリヌクレオチドの構築ＤＣと名付けたｃＣＩＰは、未成熟ＣＤ５９ポリペプチドのアミノ末端リーダーペプチド配列、２番目、３番目および４番目のＳＣＲを含むＤＡＦポリペプチドのフラグメント、５個のＧｌｙ残基を含むリンカー領域、および成熟ＣＤ５９ポリペプチドの残基１〜１０３を含むペプチドのキメラの組み合わせである（図１Ａ）。リーダーペプチドは、通常、生成期のＣＤ５９ポリペプチドの細胞の外への輸送を指示した後、それから除去される。また、ＣＤ５９ポリペプチドの少なくともいくつかのカルボキシル末端アミノ酸も、ｃＣＩＰを細胞膜につなぎ止めるＧＰＩアンカーの付着の間に除去される。ＤＣは、順に、配列番号２のアミノ酸−２５〜＋２、配列番号１のアミノ酸６２〜２５１、４個の付加的なグリシン残基、および配列番号２のアミノ酸１〜１０３を含む。ＤＣをコードするキメラＤＮＡ構築体は、最初にＰｓｔＩ部位に接し、ＰｓｔＩで消化したＰＣＲ生成ＤＮＡフラグメントを作成することにより調製した。このＰｓｔＩで消化したＰＣＲ生成フラグメント（以下、ＰｓｔＩ隣接フラグメントと呼ぶ）は、グリシン架橋ならびに配列番号１のアミノ酸６２からアミノ酸２５１にわたるＤＡＦのフラグメントをコードする配列を含む。ＰｓｔＩ隣接フラグメントは、プラスミドｐＣ８−ｈＣＤ５９−１０３（ＡＴＣＣ命名：６９２３１）と同じＣＤ５９をコードするインサートを含有する、プラスミドｐＧＥＭ７Ｚｆ（Promega Corporation，Madison，WI）中の全長ＣＤ５９クローンのリーダーペプチドおよび成熟タンパクコード領域の間の接合部の単一のＰｓｔＩ部位に連結した。ＰｓｔＩ隣接フラグメントを生成するのに用いたＰＣＲ反応のための鋳型は、配列番号１のアミノ酸−３４から３３７をコードするＤＡＦの配列を含む、全長ＤＡＦポリペプチドのカルボキシル末端より１０アミノ酸短い、ＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ隣接短縮（truncated）ＤＡＦｃＤＮＡクローンであった。このＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ隣接クローンは、ＨｅＬａ細胞（ヒト）第一鎖ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲにより調製した。細胞質ＲＮＡは、約５×１０⁶個の細胞から調製し、以下の反応条件を用いて、４μgのＲＮＡから第一鎖ｃＤＮＡを最終容量１００μlで合成した：１０mMトリス−ＨＣｌ、pH８.３；５０mMＫＣｌ；１.５mMＭｇＣｌ₂；８００ngオリゴ（ｄＴ）₁₅（Promega Corporation，Madison，Wiscons in）；１０mMＤＴＴ；０．２５mMｄＮＴＰｓ（ｄＧ、ｄＣ、ｄＡ、ｄＴ）；４０ U ＲＮａｓｉｎ（Promega Corporation，Madison，Wisconsin）；および２０Uトリ骨髄芽球症ウイルス（avian myeloblastosis virus）逆転写酵素（Seikagaku of America，Inc.，Rockville，Maryland）中で、４２℃、１時間。ＰＣＲは、ｃＤＮＡ合成に続いて、８μlの第一鎖ｃＤＮＡ反応混合物を鋳型として用いて、以下のプライマー：５′プライマー（オリゴＡ、配列番号１０）、５′−ＣＧＣＴＧＧＧＣＧＴＡＧＣＧＴＣＧＡＣＴＣＧＧＣＧＧＡＧＴＣＣＣＧ−３′；および３′プライマー（オリゴＢ、配列番号１１）、５′−ＧＣＣＣＡＴＧＧＡＴＣＣＴＡＧＣＧＴＣＴＡＡＡＧＣＡＡＡＣＣＴＧＴＣＡＡＣＧ−３′を用いて行った。ＰＣＲ反応混合物（最終容量１００μl）は、以下の反応成分を含んでいた：１０mMトリス−ＨＣｌ、pH８．３；５０mMＫＣｌ；３．５mMＭｇＣｌ₂；１．６mMｄＮＴＰｓ；１００ngオリゴＡ；１００ngオリゴＢ；および５U ＡｍｐｌｉＴａｑ（Perkin-Elmer Corporation，Norwalk，Connect icut）。ＰＣＲ条件は、９５℃ １分間、５９℃ １分間、７２℃ ３分間の合計３５サイクル、およびその後に７２℃で１０分間の伸張反応であった。このＰＣＲ反応は、約１２００ヌクレオチドの単一のＤＮＡフラグメントを生成し、これを、製造業者（Invitrogen，San Diego，CA）の指示に従ってプラスミドｐＣＲＩＩ中にインサートとしてＴＡサブクローニングして、プラスミドｐＤＡＦ−＃１０を作成した。ＰＣＲ生成配列を含むｐＤＡＦ−＃１０のＢａｍＨＩフラグメントを、プラスミドｐｃＤＮＡＩ／ＡＭＰ（Invitrogen，San Diego ，CA）中にサブクローニングし、クローンを配列決定により解析して、発現のために正しい方向でインサートを有するクローン、ｐＤＡＦ−ｃ＃１８を同定した。インサートのヌクレオチド配列は、配列解析により、配列番号１のヌクレオチド７８から１１６６にわたる配列を含むことを確認した。ＰｓｔＩ隣接フラグメントを生成するためのＰＣＲは、上記と基本的に同じ条件を用いて実施したが、鋳型がＢａｍＨＩで直線化したプラスミドｐＤＡＦ−ｃ＃１８約５０ngであったこと、およびプライマーがオリゴ５４（５′プライマー、５′−ＧＡＡＧＡＧＴＴＣＴＧＣＡＧＡＡＴＣＧＴＡＧＣＴＧＣＧＡＧＧＴＧＣＣ−３′、配列番号１２）およびオリゴ５５（３′プライマー、５′− ＣＣＡＣＧＴＧＣＴＧＣＡＧＴＣＣＴＣＣＡＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＴＧＣＡＴＴＣＡＧＧＴＧＧＴＧＧＧ−３′、配列番号１３）であったこと、およびＰＣＲ条件が、最初の変性工程９５℃ ３分間、続いて９５℃ １分間、５５℃ １分間、７２℃ １分間の２０サイクル、続いて７２℃ １０分間の伸張反応、であったことが異なっていた。この反応のＰＣＲ生成物は、長さ約５００〜６００ヌクレオチドのバンドとして電気泳動した。このＰＣＲ生成フラグメントを、プラスミドｐＣＲＩＩ（Invitrogen，San Diego，CA）中にインサートとしてＴＡサブクローニングし、配列決定して、このインサートが配列番号１のヌクレオチド３３９から９０８にわたる配列を含むことを確認した。このｐＣＲＩＩクローンをＰｓｔＩで切断し、ＰｓｔＩ隣接フラグメントを生成して、これをプラスミドｐＧＥＭ７Ｚｆ（上記で引用したもの）中の全長ＣＤ５９クローンのインサート中の単一のＰｓｔＩ部位（配列番号２のヌクレオチド１３８から１４３にわたる）に連結した。ｐＧＥＭ７Ｚｆベクター配列は、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩにより、生じたキメラインサートから分離し、生じたキメラＢａｍＨＩ− ＥｃｏＲＩフラグメントを、ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩで切断したｐｃＤＮＡＩ／ＡＭＰ（Invitrogen，San Diego，CA）にサブクローニングして、以下、ＤＣ構築体と呼ぶ、プラスミドｐＤＣ＃１−ｐｃＤＮＡＩ−ＡＭＰ（ＡＴＣＣ命名：６９５６３）を作成した。実施例２全長ＤＡＦおよびＣＤをコードするポリヌクレオチドの構築全長ＤＡＦおよびＤＡＦ配列のアミノ末端側に位置するＣＤ５９配列の分子、すなわち、ＣＤ分子の発現を指示するベクターを構築した。実施例１で記載したｐＤＡＦ−ｃ＃１８ベクターを、ＤＡＦのカルボキシル末端領域全体および完全ＤＡＦアミノ末端リーダーペプチドをコードするように、いくつかの工程で再工作した。ＣＤ分子の合成を指示するベクターは、ＤＡＦのカルボキシル末端短縮形態を包含させて調製し、続いてＤＡＦの全カルボキシル末端領域をコードするようｐＤＡＦ−ｃ＃１８と同じようにして再工作した。ｐＤＡＦ−ｃ＃１８ベクターは、配列解析によりＰＣＲ反応が突然変異リーダー配列を生成していたことが明らかになった後、完全ＤＡＦアミノ末端リーダーペプチドをコードするよう再工作した。正しいリーダー配列は、ＤＡＦリーダーの正しい配列を含む一対の相補的オリゴヌクレオチド、オリゴ１７３（５′−ＴＧＣＡＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＣＣＧＴＣＧＣＧＣＧＧＣＣＧＡＧＣＧＴＧＣＣＣＧＣ−３′、配列番号１８）およびオリゴ１７４（５′−ＧＧＧＣＡＣＧＣＴＣＧＧＣＣＧＣＧＣＧＡＣＧＧＴＣＡＴＧＧＡＴＣＣＧ−３′、配列番号１９）により提供された。これらのオリゴは、互いにアニーリングした際に、オリゴＡによって導入された工作したＳａｌＩ部位に相補的な制限部位の突出（オーバーハング）、および配列番号１のヌクレオチド７８〜８４にわたるＳａｃII部位を有するように設計した。オリゴ１７３および１７４は、キナーゼ処理し、アニーリングさせ、欠陥のあるリーダーペプチド領域を除去するためにＳａｌＩおよびＳａｃIIで消化した後のｐＤＡＦ−ｃ＃１８に連結した。得られた構築体、プラスミドｐＤＡＦ−Ｌのリーダーをコードする領域の完全性は、配列解析により確認した。カルボキシル末端短縮ＤＡＦドメインを含むＣＤ分子の発現を指示する発現ベクターは、ｐＤＡＦ−ｃ＃１８プラスミドから得られるＢａｍＨＩ−ＥａｇＩフラグメント、およびＰＣＲおよび制限酵素消化によって生成したＣＤ５９ｃＤＮＡのＢａｍＨＩ−ＥａｇIIフラグメントを用いて構築した。ＰＣＲ反応は、オリゴ５（５′プライマー、５′−ＧＧＡＡＧＡＧＧＡＴＣＣＴＧＧＧＣＧＣＣＧＣＡＧＧ−３′、配列番号１４）およびオリゴ５３（３′プライマー、５′− ＧＧＴＣＴＴＣＧＧＣＣＧＣＴＣＣＡＣＣＴＣＣＣＣＣＡＣＣＡＴＴＴＴＣＡＡＧＣＴＧＴＴＣＧ−３′、配列番号１５）を用い、鋳型として全長ＣＤ５９ｃＤＮＡのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを用いて行った。この反応のための条件は、基本的に実施例１のＰＣＲ反応について記載のとおりであった。ただし、プログラムは、最初の変性工程が９５℃ ３分間、続いて９５℃ １分間、５２℃ １分間、７２℃ １分間の１０サイクル、続いて９５ ℃ １分間、５８℃ １分間、７２℃ １分間の１０サイクル、続いて７２℃で１０分間の伸張反応であった。オリゴ５３は、グリシンリンカーのグリシン残基およびクローニングのためのＥａｇＩ制限部位をコードする配列を含む。オリゴ５は、ＣＤ５９のアミノ酸−２５の約３０bp上流（５′側）のＢａｍＨＩ部位を含む（配列番号２）。約３３０bpのＰＣＲ生成物を、プラスミドｐＣＲＩＩ（Invitrogen，San Dieg o，CA）中にインサートとしてＴＡサブクローニングし、配列決定して、インサートが配列番号２のヌクレオチド２７〜３７４にわたる配列を含むことを確認した。このｐＣＲＩＩサブクローンをＢａｍＨＩおよびＥａｇＩで消化した。２つのフラグメント、すなわち、ＤＡＦのＢａｍＨＩ−ＥａｇＩフラグメントおよびＣＤ５９のＢａｍＨＩ−ＥａｇＩフラグメントを、三方連結（three-way li gation）により、ＢａｍＨＩで切断したベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Invitr ogen，San Diego，CA）に連結し、制限酵素マッピングを行って、発現のための正しい順序のフラグメントを有するクローン、プラスミドｐＣＤ−ｐｃＤＮＡＩ −ＡＭＰを同定した。プラスミドｐＣＤ−ｐｃＤＮＡＩ−ＡＭＰを試験し、これは、哺乳動物細胞に対してＤＡＦ免疫反応性物質の検出可能な発現を指示しないことが見い出された。この発現の欠如は、このベクター中のＤＡＦコード領域中に存在するカルボキシル末端短縮に起因するものであった。したがって、このベクターおよびｐＤＡＦ−Ｌベクターは、以下のようにして、合成ポリヌクレオチドカルボキシル末端のＰＣＲ付加によりＤＡＦの全長カルボキシル末端領域をコードするように再工作した。オリゴ１７５（５′プライマー、５′−ＣＣＣＣＡＡＡＴＡＡＡＧＧＡＡＧＴＧＧＡＡＣＣＡＣＴＴＣＡＧＧＴＡＣＴＡＣＣＣ−３′、配列番号１６）およびオリゴ１７６（３′プライマー、５′−ＧＧＣＴＡＡＧＴＣＡＧＣＡＡＧＣＣＣＡＴＧＧＴＴＡＣＴＡＧＣＧＴＣＣＣＡＡＧＣＡＡＡＣＣ−３′ 、配列番号１７）を用いて、ＤＡＦの最後の１０個のカルボキシル末端アミノ酸をｐＤＡＦ−ＬおよびｐＣＤ−ｐｃＤＮＡＩ−ＡＭＰに付加した。オリゴ１７５はＤＡＦ配列中に存在するＸｍｎＩ部位にわたり、オリゴ１７６はＥｃｏＲＩ部位を含む。この反応のための条件は、基本的に実施例１のＰＣＲ反応について記載のとおりであった。ただし、鋳型はｐＤＡＦ−ｃ＃１８、約１３ngであり、プログラムは、反応混合物中にオリゴ１７６のみが存在する状態で９５℃ １分間、５０℃ １分間、７２℃ １分間の５サイクル、続いてオリゴ１７５を添加し、９５℃ １分間、５８℃ １分間、７２℃ １分間の２０サイクル、続いて７２℃で１０分間の伸張反応であった。約１２０bpのＰＣＲ生成物を、プラスミドｐＣＲＩＩ（Invitrogen，San Dieg o，CA）中にインサートフラグメントとしてＴＡサブクローニングし、配列決定して、インサートが配列番号１のヌクレオチド１１８４〜１１９６にわたる配列を含むことを確認した。このｐＣＲＩＩサブクローンから単離したＥｃｏＲＩ−ＸｍｎＩフラグメントを用いて、プラスミドｐＤＡＦ−ＬおよびｐＣＤ− ｐｃＤＮＡＩ−ＡＭＰの部分的に相同のＢａｍＨＩ−ＸｍｎＩフラグメントを置き換えた。得られたプラスミドは、ｐＦＬＤＡＦ（以下、ＤＡＦ構築体と呼ぶ）およびｐＣＤＧＰＩ＃１−ｐｃＤＮＡＩ−ＡＭＰ（ＡＴＣＣ命名：６９５６４、以下、ＣＤ構築体と呼ぶ）であった。ＣＤ構築体は、配列番号２の残基−２５〜＋７９（ＣＤ５９、マイナスの番号を付した残基は上述のリーダーペプチド配列の部分である）、５個のグリシン残基を含むグリシンリンカー領域（このうち２個は配列番号２のアミノ酸７８および７９であり、このうち３個はＣＤ５９をコードするＤＮＡフラグメントを生成するのに用いたＰＣＲプライマーに工作したものである）、およびＳＣＲ１−４をＤＡＦの疎水性テールとともに含むＤＡＦポリペプチドのフラグメント、をコードする配列を包含する（図１Ｂ）。このＤＡＦコード領域は、ＳＣＲ１の５アミノ酸Ｎ末端側のＥａｇＩ部位で始まり、すなわち、配列番号１のアミノ酸−５で始まって、配列番号１のアミノ酸３４７で終わり、ＤＡＦの完全Ｃ末端をコードする。この領域のカルボキシル末端部分は、ＤＡＦの推定ＧＰＩアンカーシグナル配列をコードするヌクレオチドを包含する。実施例３哺乳動物細胞におけるＤＣおよびＣＤの細胞表面発現リン酸カルシウムトランスフェクションによって、マウス繊維芽細胞株Ｂａｌｂ／３Ｔ３中へのＤＡＦ、ＤＣおよびＣＤ構築体の安定なトランスフェクションを実施した（Ausubel，et al.，1992）。プラスミドＳＶ２Ｎｅｏの同時トランスフェクションにより、Ｇ４１８（Gibco）含有培地での選択を可能にした。次に、Ｇ４１８耐性コロニーを拾い、増殖させ、抗ＤＡＦモノクローナル抗体ＢＲＩＣ２１６（Serotec，Indianapolis，IN）および抗ＣＤ５９モノクローナル抗体ＭＥＭ４３（Biodesign International，Kennebunkport，ME）、およびＦＩＴＣ結合（コンジュゲート化）抗マウス二次（２°）抗体を用いて、間接蛍光抗体法により、細胞表面に発現されたＤＣおよびＣＤの存在について試験した。増加した蛍光は、増加した細胞表面発現と関連する。図２は、２つの独立したＤＣの陽性クローン（ＤＣ−Ａ５およびＤＣ−Ｄ６、図２ＡおよびＣ）ならびに２つの独立したＣＤクローン（ＣＤ−４．１５およびＣＤ−４．２１、図２ＢおよびＤ）の細胞表面発現プロフィールを、陰性対照としてＳＶ２Ｎｅｏ単独でトランスフェクトした細胞と比較して示す。図２に示すフローサイトメトリープロフィールは、ＤＣおよびＣＤは各々安定に形質転換したＢａｌｂ／３Ｔ３細胞の表面に発現され、抗ＤＡＦおよび抗ＣＤ５９モノクローナル抗体の両方に認識されることを示す。これらの結果は、これらの分子は本来の（ネイティブな）親インヒビターＤＡＦおよびＣＤ５９に固有のコンフォメーション性エピトープの少なくともいくつかを保持していることを示す。実施例４哺乳動物細胞で発現されたＤＣのＰＩ−ＰＬＣ解析ＣＤ５９のひとつの構造的特徴は、この分子がグリコホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）連鎖を通じて細胞膜表面へ付着（アンカーリング）していることである。上記のように、ＤＣは、ＤＡＦポリペプチドの大きい部分に融合したＣＤ５９アミノ酸配列全体を含む。このキメラ分子がやはりＧＰＩアンカーによって細胞表面に保持されているかどうかを試験するために、ＤＣを発現するＢａｌｂ／３Ｔ３細胞に、ＦＡＣＳ解析に先立って、１U／mlで１時間、ＰＩ−ＰＬＣ（Boehringer-Mannheim，Corporation，Biomedical Products Division，Indian apolis，Indiana）消化を行った。この実験の結果を図３に示す。ＰＩ−ＰＬＣ処理は、ＣＤ５９（ＭＥＭ４３、図３Ａ）またはＤＡＦ（ＢＲＩＣ２１６、図３Ｂ）のいずれかに対するモノクローナル抗体を用いて間接蛍光抗体法により測定したところ、安定に形質転換したＢａｌｂ／３Ｔ３細胞表面からＤＣタンパクを除去した。疑似（モック）処理した細胞（−ＰＩ−ＰＬＣ）は細胞表面上にｃＣＩＰＤＣを保持しており、一方、ＰＩ−ＰＬＣ処理（＋ＰＩ− ＰＬＣ）は、減少した蛍光強度により示されるように、細胞表面タンパクの喪失をもたらした。実施例５ＤＣおよびＣＤはＤＡＦのＣ３阻害活性と同等の活性を有する形質転換したＢａｌｂ／３Ｔ３細胞で発現されたＤＣおよびＣＤの機能的活性を、ネイティブなＤＡＦのＣ３阻害活性を疑似するその能力を測定することによって評価した。この解析は、形質転換した細胞を、増加する濃度のヒト血清とともにインキュベートすることにより実施し（５、１０、２０、および４０％；図それぞれ図４Ａ〜Ｄ）、抗Ｃ３モノクローナル抗体（抗Ｃ３ｄ、Quidel，San Di ego，CA）を用いて、補体成分Ｃ３の細胞表面沈着をフローサイトメトリーにより検定した。ＣＤ５９を発現する形質転換したＢａｌｂ／３Ｔ３細胞は、上記で引用した「最終補体インヒビター融合遺伝子およびタンパク質」なる発明の名称の別出願である出願第０８／２０５７２０号（この関連部分は参照により本明細書中に包含されるものとする）に記載のとおりに調製した。ＤＡＦ、ＣＤ、ＤＣおよびＣＤ５９の各々のトランスフェクタントの細胞は、収穫して、１×ＨＢＳＳおよび１％ＢＳＡ中に再懸濁した。１アリコートあたり約１×１０⁵個の細胞を、最初に抗Ｂａｌｂ／３Ｔ３補体結合ポリクローナル抗体とともに、４℃で３０分間インキュベートした。細胞をペレットにして、１×ＨＢＳＳおよび１％ＢＳＡで２回洗浄してから、ヒト血清を添加した。細胞を、増加する濃度のヒト血清とともに３７℃で３０分間インキュベートし、次いで１×ＨＢＳＳおよび１％ＢＳＡで１回洗浄してから、抗Ｃ３モノクローナル抗体とともにインキュベートした。次に、細胞をフローサイトメトリーで解析した。ここでは、増加した蛍光は、Ｃ３沈着からの保護の欠如を示し、したがって、Ｃ３コンベルターゼ阻害の欠如を示す。図４に見られるように、ＤＣ、ＣＤおよびＤＡＦは、２０％までのヒト血清で抗原投与した場合に、同等に効果的にＣ３沈着を阻害することができる。比較のために、ＣＤ５９のみを発現する細胞（これも図４に示す）は、ＣＤ５９にはＣ３阻害活性がないことから、Ｃ３沈着をブロックできない。実施例６キメラ補体インヒビターＤＣおよびＣＤ５９は、ＤＡＦまたはＣＤよりも効果的な膜侵襲複合体の溶解活性のインヒビターであるキメラ補体インヒビタータンパクの機能的活性のさらなる試験として、ＤＡＦ、ＣＤ５９、ＣＤまたはＤＣを発現する安定に形質転換したＢａｌｂ／３Ｔ３細胞株（実施例５に記載したもの）を、膜侵襲複合体（Ｃ５ｂ〜９）の溶解活性をブロックするその能力について検定した。ＭＡＣの溶解活性は、抗Ｂａｌｂ抗体およびヒト血清で抗原投与した安定に形質転換したＢａｌｂ／３Ｔ３細胞からの捕捉された細胞質指示色素、カルセインＡＭ（Molecular Probes，Inc.，Eugene，Oregon）の流出を定量することにより評価した（図５）。ＤＣ、ＣＤ、ＤＡＦまたはＣＤ５９を発現する形質転換細胞、ならびにベクター単独対照を、９６ウェルプレートで集密状態（コンフルエント）になるまで生育させた。細胞を、１％(W/V)ＢＳＡを含むＨＢＳＳ（ＨＢＳＳ／ＢＳＡ）中で２００μlで２回洗浄した。カルセインＡＭ（最終濃度１０μM）を添加し、プレートを３７℃で３０分間インキュベートして、色素が、細胞によって内在化され、細胞のエステラーゼによって損傷を受けていない細胞の内側に保持される極性蛍光性誘導体に変換されるのを可能にした。次に、ウェルをＨＢＳＳ／ＢＳＡで２回洗浄して、細胞の外側に残っている色素を除去した。次いで、細胞を、古典的補体経路の活性剤として役立つ抗Ｂａｌｂ／３Ｔ３ＩｇＧ（ＨＢＳＳ／ＢＳＡ中、２mg／ml）とインキュベートした。２３℃で３０分間のインキュベーションの後、結合していないＩｇＧを洗い落とした。次に、細胞をＨＢＳＳ／ＢＳＡ中の２５％ヒトＣ８欠損血清の存在下で３７℃ で３０分間インキュベートし、細胞表面でＣ５ｂ〜７が会合するのを可能にした。次いで、細胞を、横座標上に示す濃度のＨＢＳＳ／ＢＳＡ中の精製Ｃ８およびＣ９と、３７℃で３０分間インキュベートして、ＭＡＣの会合を可能にし、したがって、補体媒介性損傷が起こるのを可能にした（ヒトＣ８破壊血清、ならびに精製Ｃ８およびＣ９は、Quidel Corporation，San Diego，CAから入手した）。次いで、蛍光の測定のために細胞を浸す培地を清浄な９６ウェルプレートに移した。この検定の条件下では、カルセインＡＭの蛍光性極性誘導体は、細胞膜の完全性が損なわれている場合、試験細胞を浸す培地中に放出されるのみである。したがって、試験細胞を浸す培地中へ放出されたカルセインＡＭの蛍光に対する細胞に保持されたそれは、細胞が受けた補体媒介性損傷のレベルの、間接的ではあるが正確な測定値を提供する。残っている細胞付随色素は、９６ウェル培養プレート中に保持された細胞の１％ＳＤＳ溶解物（ライセート）から決定した。これは、以下の式を用いて色素放出（％）を算出することを可能にした：総量＝放出量＋保持量、および放出（％）＝（放出量／総量）×１００。蛍光は、ミリポア（ Millipore）ＣＹＴＯＦＬＵＯＲ２３５０蛍光プレートリーダー（４９０nm励起、５３０nm放射）を用いて測定した。図５に示すように、これらの検定の結果は、ＤＣ（黒の三角）およびＣＤ５９（白丸）は、ネオマイシン耐性のみを発現する対照細胞（白四角）と比較して、ＭＡＣの溶解活性をほぼ完全にブロックすることにおいて同等に効果的であることを明らかにした。補体インヒビターＣＤ（黒丸）およびＤＡＦ（黒の菱形）もまた、ＣＤ５９またはＤＣよりもＭＡＣ活性をブロックする効率は低いものの、同等に効果的であった。これらの結果と、実施例５記載の実験の結果（Ｃ３沈着からの同等の保護が、ＣＤおよびＤＣによって提供されるが、ＣＤ５９によっては提供されないことを示した）との比較は、ＣＤではなくＤＣが、Ｃ３コンベルターゼおよびＭＡＣ阻害活性の両方を提供することを明らかにする。本発明の、好ましい、またはその他の態様を本明細書において記載したが、さらに別の態様を、本発明の範囲から逸脱することなく、当業者は看取し、実施することができる。後記のクレーム（請求の範囲）は、本明細書に記載の具体的な態様ならびにこのような改変体、変異体および等価物をカバーすることを意図するものである。この出願を通じて、種々の刊行物、特許および特許出願が引用されている。これらの刊行物、特許および特許出願の教示および開示全体は、本発明が属する技術水準をより十分に説明するために、参照により本出願に包含される。寄託物上述のプラスミドｐＣ８−ｈＣＤ５９−１０３、ｐＤＣ＃１−ｐｃＤＮＡＩ− ＡＭＰ、およびｐＣＤＧＰＩ＃１−ｐｃＤＮＡＩ−ＡＭＰは、E．coli中で米国A merican Type Culture Collection，12301 Parklawn Drive，Rockville，Maryla nd，20852に寄託され、各々６９２３１、６９５６３、および６９５６４と命名されている。これらの寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約（1977）に基づいて行った。ＡＴＣＣ受託番号６９２３１を有する上記の寄託は、１９９３年１月２９日に行い、ＡＴＣＣ受託番号６９５６３および６９５６４を有する上記の寄託は、１９９４年２月９日に行った。寄託物第６９２３１号は、Escherichia coli株ＤＨ５α中に作成されたものであり、これは以下の遺伝子型を有する： F^- φ80dlacZΔM15 Δ(lacZYA-argf)U169 recA1 endA1 hsdR17(r_k-,m_k＋)supE44 λ^- thi-1 gyrA96 relA1 寄託物第６９５６３号および第６９５６４号は、Escherichia coli株ＴＯＰ１０Ｆ′中に作成されたものであり、これは以下の遺伝子型を有する： F'｛lacI^qTNlO(Tet^R)｝mcrAΔ(mrr-hsdRMS-mcrBC)φ80lacZΔM15 ΔlacX74 deoR recA1 araD139 Δ(ara-leu)7697 galU galK rpsL(Str^R)endA1 nupG

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｎ 5/10 8615−4ＣＣ０７Ｈ 21/04 Ｂ // Ａ６１Ｋ 38/00 9637−4ＢＣ１２Ｐ 21/02 ＣＣ０７Ｈ 21/04 9282−4ＢＣ１２Ｎ 5/00 ＢＣ１２Ｐ 21/02 9051−4ＣＡ６１Ｋ 37/02 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:92） (72)発明者スクウィント、ステファン・ピーアメリカ合衆国、コネチカット州 06524、ベサニー、コーチマンズ・レーン 16

Claims

【特許請求の範囲】１．以下のもの： (a)（i）Ｃ３阻害活性を有する第一の機能的ドメイン；および（ii）Ｃ５ｂ〜９阻害活性を有する第二の機能的ドメインを含み、上記第一の機能的ドメインが上記第二の機能的ドメインのアミノ末端側にあるキメラ補体インヒビタータンパクをコードする配列；または (b) (a)に相補的な配列；または (c) (a)および(b)の両方を含み、(a)、(b)または(c)を含まない核酸分子を実質的に包含しないことを特徴とする核酸分子。２．上記第一の機能的ドメインが、天然Ｃ３インヒビタータンパクの少なくとも一部を含み、上記キメラ補体インヒビタータンパクが、上記天然Ｃ３インヒビタータンパクの補体阻害活性の少なくとも約２５％を有する、請求項１記載の核酸分子。３．上記第二の機能的ドメインが、天然Ｃ５ｂ〜９インヒビタータンパクの少なくとも一部を含み、上記キメラ補体インヒビタータンパクが、上記天然Ｃ５ｂ〜９インヒビタータンパクの補体阻害活性の少なくとも約２５％を有する、請求項１記載の核酸分子。４．上記キメラ補体インヒビタータンパクが、第一および第二の機能的ドメインの間にリンカー領域を含む、請求項１記載の核酸分子。５．上記キメラ補体インヒビタータンパクが、細胞膜付着のための膜貫通ドメインを含む、請求項１記載の核酸分子。６．上記キメラ補体インヒビタータンパクが、ヒト補体に対する補体阻害活性を有する、請求項１記載の核酸分子。７．そのベクターを含む宿主が上記キメラ補体インヒビタータンパクを発現するよう、第二の核酸分子に作動可能に連結された請求項１記載の核酸分子を含む核酸ベクター。８．請求項７記載のベクターを含む組換え宿主。９．ヒト補体侵襲から非ヒト器官を保護する方法であって、請求項６記載の核酸分子を、非ヒトトランスジェニック動物を生成することができる多能性細胞に導入する工程、および上記細胞から非ヒトトランスジェニック動物を生成する工程を含み、それによりヒト補体侵襲に対する上記非ヒトトランスジェニック動物の器官の抵抗性を強化することを特徴とする方法。 10．請求項９記載のトランスジェニック動物から単離された細胞。 11．以下のもの：（i）Ｃ３阻害活性を有する第一の機能的ドメイン；および（ii）Ｃ５ｂ〜９阻害活性を有する第二の機能的ドメインを含み、上記第一の機能的ドメインが上記第二の機能的ドメインのアミノ末端側にあることを特徴とするキメラ補体インヒビタータンパク。 12．上記第一の機能的ドメインが、天然Ｃ３インヒビタータンパクの少なくとも一部を含み、上記キメラ補体インヒビタータンパクが、上記天然Ｃ３インヒビタータンパクの補体阻害活性の少なくとも約２５％を有する、請求項１１記載のキメラ補体インヒビタータンパク。 13．上記第二の機能的ドメインが、天然Ｃ５ｂ〜９インヒビタータンパクの少なくとも一部を含み、上記キメラ補体インヒビタータンパクが、上記天然Ｃ５ｂ〜９インヒビタータンパクの補体阻害活性の少なくとも約２５％を有する、請求項１１記載のキメラ補体インヒビタータンパク。 14．第一および第二の機能的ドメインの間にリンカー領域を含む、請求項１１記載のキメラ補体インヒビタータンパク。 15．細胞膜付着のための膜貫通ドメインを含む、請求項１１記載のキメラ補体インヒビタータンパク。 16．ヒト補体に対する補体阻害活性を含む、請求項１１記載のキメラ補体インヒビタータンパク。