ES2252746T3 - Procedimientos para el tratamiento de la enfermedad inflamatoria articular. - Google Patents

Abstract

SE MUESTRA EL USO DE COMPUESTOS QUE BLOQUEAN EL COMPLEMENTO DEL ELEMENTO C5 O SUS FRAGMENTOS ACTIVOS C5A Y/O C5B (ESTOS COMPUESTOS SE MENCIONAN NORMALMENTE "BLOQUEADORES C5") PARA TRATAR LA INFLAMACION ARTICULAR YA ESTABLECIDA (ARTRITIS). LA ADMINISTRACION DE ESTOS BLOQUEADORES C5 HA DEMOSTRADO: 1) LIMITAR Y/O REDUCIR LA INFLACION ARTICULAR YA ESTABLECIDA, Y 2) INBIBIR SU EXTENSION A ZONAS NO AFECTADAS.

Description

Procedimientos para el tratamiento de la enfermedad inflamatoria articular.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a procedimientos para el tratamiento de la enfermedad inflamatoria articular. En particular, la invención se refiere a la utilización de bloqueantes del componente C5 del complemento ("bloqueantes de C5") como agentes farmacéuticos en la preparación de un medicamento para tratar la inflamación articular establecida.

Antecedentes de la invención I. El sistema del complemento

El sistema del complemento actúa conjuntamente con otros sistemas inmunológicos del cuerpo en la defensa contra la intrusión de patógenos celulares y virales. Existen por lo menos 25 proteínas del complemento, presentes como una compleja colección de proteínas plasmáticas y cofactores membranales. Las proteínas plasmáticas (que también se encuentran en la mayoría de los demás líquidos corporales, tales como la linfa, médula ósea, líquido sinovial y líquido cerebroespinal) constituyen aproximadamente el 10% de las globlulinas presentes en el suero de los vertebrados. Los componentes del complemento adquieren sus funciones inmunológicas defensivas mediante la interacción en una serie de sucesos complejos pero precisos de corte enzimático y unión a membranas. La cascada del complemento resultante conduce a la producción de productos con funciones opsónicas, inmunorreguladoras y líticas.

La cascada del complemento progresa a través de la vía clásica o a través de la vía alternativa. Estas vías comparten muchos componentes y, aunque difieren en sus primeras etapas, ambas convergen y comparten los mismos componentes terminales del complemento responsables de la destrucción de las células y de los virus diana.

La ruta clásica del complemento se inicia típicamente con el reconocimiento y unión de los anticuerpos a un sitio antigénico sobre una célula diana. Este anticuerpo unido en la superficie reacciona seguidamente con el primer componente del complemento, C1. El componente C1, unido de esta manera, experimenta un conjunto de reacciones autocatalíticas que resultan en, inter alia, la inducción de actividad proteolítica de C1 que actúa sobre los componentes del complemento C2 y C4.

Este C1 activado divide C2 y C4 formando C2a, C2b, C4a y C4b. La función de C2b no se conoce bien. C2a y C4b se combinan para formar el complejo C4b,2a, que es una proteasa activa conocida como la convertasa C3 clásica. C4b,2a actúa dividiendo C3 para formar C3a y C3b. C3a y C4a son anafilatoxinas relativamente débiles que pueden inducir la degranulación de los mastocitos, resultando en la liberación de histamina y de otros mediadores de inflamación.

C3b presenta múltiples funciones. Como opsonina, se une a bacterias, virus y otras células y partículas y las etiqueta para eliminarlas de la circulación. C3b también puede formar un complejo con C4b,2a para producir C4b,2a,3b o la convertasa C5 clásica, que divide C5 para formar C5a (otra anafilatoxina) y C5b. La convertasa C5 alternativa es C3b,Bb,C3b y lleva a cabo la misma función. C5b se combina con C6, dando lugar a C5b,6, y este complejo se combina con C7 para formar el complejo ternario C5b,6,7. El complejo C5b,6,7 se une a C8 en la superficie de una membrana celular. Al unirse a C9, se forma el complejo de ataque membranal completo (MAC) (C5b-9), el cual media en la lisis de las células extrañas, microorganismos y virus.

Pueden encontrarse comentarios adicionales de la vía clásica del complemento, así como una descripción detallada de la vía alternativa de activación del complemento, en numerosas publicaciones, entre ellas, por ejemplo, Roitt et al., 1988, y Muller-Eberhard, 1988.

II. La inflamación articular

Una diversidad de trastornos médicos comunes presentan como elemento común la inflamación de las articulaciones del paciente. Sólo en los Estados Unidos, millones de pacientes sufren de inflamación articular. Los individuos afectados con frecuencia se ven discapacitados y el coste del cuidado médico para los pacientes que sufren dichos trastornos resulta significativo. Aunque se dispone de numerosos medios para el tratamiento de la inflamación articular y continúan apareciendo nuevos tratamientos disponibles, ninguno resulta tan seguro y efectivo como sería deseable y de esta manera desde hace mucho tiempo que se ha percibido una necesidad de nuevos enfoques y de mejores procedimientos para el control de la inflamación articular.

Clínicamente, la inflamación articular se encuentra asociada con rigidez articular, dolor, debilidad y en ocasiones fatiga articular. De manera uniforme la articulación se encuentra sensibilizada e inflamada y con frecuencia en estado eritematoso. El diagnóstico de la naturaleza inflamatoria de la enfermedad articular con frecuencia se basa en esta presentación clínica típica, así como en el examen radiográfico y en la aspiración y examen del líquido articular sinovial. El examen del líquido articular de una articulación inflamada generalmente revela que se eleva el nivel de diversos marcadores de inflamación, tales como leucocitos (incluyendo los neutrófilos), anticuerpos, citoquinas, moléculas de adhesión celular y productos de activación del complemento (De Clerck et al., 1989; Heinz et al., 1989; Moffat et al., 1989; Peake et al., 1989; Brodeur et al., 1991; Firestein et al., 1991; Matsubara et al., 1991; Olsen et al., 1991; Oleesky et al., 1991; Jose et al., 1990; Zvaifler 1968; Zvaifler, 1969a,; Zvaifler, 1969b; Zvaifler, 1974; Ward y Zvaifler, 1971; Ward, 1975; Moxley y Ruddy, 1985; Mollnes et al., 1986; Auda et al., 1990; Olmez et al., 1991; Kahle et al., 1992; Koch et al., 1994; Thorbecke et al., 1992; Saura et al., 1992; Feldman et al., 1990; Feldman et al., 1991; Fong et al., 1994; Harigi et al., 1993; Morgan et al., 1988; Shingu et al., 1994; Abbink et al., 1992; y Corvetta et al., 1992). El examen radiográfico de las articulaciones afectadas generalmente revela inflamación del tejido blando y/o cambios erosivos.

La inflamación articular se encuentra asociada con un grupo de enfermedades denominadas médicamente artriditias (tipos de artritis). El término "artritis" se utiliza médicamente para describir de manera general las enfermedades de las articulaciones. El término, sin embargo, también se utiliza para describir determinadas condiciones médicas, de las cuales la artritis reumatoide (AR) es el ejemplo principal, que consisten en una multiplicidad de diferentes manifestaciones patológicas, incluyendo, pero sin limitarse de ninguna manera a la misma, la enfermedad articular.

De esta manera, los comentarios acerca de la artritis pueden referirse a enfermedades tales como la AR, en la que los trastornos articulares únicamente son una faceta de las diversas patologías asociadas con la enfermedad. La presente invención se refiere específicamente a los aspectos de trastorno articular de estas enfermedades. Sin embargo, los procedimientos de la invención también pueden presentar efectos beneficiosos sobre las patologías no asociadas a una articulación. Por ejemplo, la utilización de los procedimientos de la invención para tratar la inflamación articular establecida asociada con la AR, psoriasis, lupus y otros trastornos también puede proporcionar beneficios terapéuticos con efectos sobre algunas de las otras manifestaciones patológicas de estos estados patológicos multifacéticos, tales como la inflamación vascular y la nefritis (ver, por ejemplo, Wurzner et al., Complement Inflamm. 8:328-340, 1991, solicitud US nº de serie 08/217.391 presentada el 23 de marzo de 1994, solicitud US nº de serie 08/236.208 presentada el 2 de mayo de 1994 y Sims et al., patente US nº 5.135.916).

Debe apreciarse que la presente invención no se refiere a todos los tipos de trastornos articulares, sino únicamente a aquellos que implican inflamación. De esta manera, por ejemplo, la invención es aplicable al tratamiento de la osteoartritis (OA) en estadio avanzado, la cual es una enfermedad inflamatoria articular, pero de manera general no a la OA de estadio temprano, que típicamente no presenta un componente inflamatorio significativo.

Pueden encontrarse comentarios detallados de las artriditias en numerosos textos médicos, entre ellos Arnett, 1992, Cecil Textbook of Medicine, Wyngaarden et al. (editores), W.B. Saunders Company, Philadelphia, capítulo 258, páginas 1508-1515; Lipsky, 1994, Harrison's Principles of Internal Medicine, 13ª edición, Isselbacher et al. (editores), McGraw-Hill, Inc., New York, capítulo 285, páginas 1648-1655; y McCarty y Koopman, 1993, Arthritis and Allied Conditions, 12ª edición, Lea y Febiger, Philadelphia. Tal como se comenta en detalle en estos y en otros textos, y tal como se revisa después, la inflamación articular se asocia con numerosos procesos patológicos locales y sistémicos.

Factores asociados con la inflamación articular

La inflamación articular es un proceso complejo que implica, entre otros, la activación de respuestas inmunológicas tanto celulares como humorales.

Entre las respuestas inmunológicas celulares se incluyen la infiltración de glóbulos blancos, sobre todo de neutrófilos (también denominados células polimorfonucleares o PMN). Los infiltrados de glóbulos blancos mononucleares también son comunes en muchas articulaciones inflamadas. Las células mononucleares infiltrantes, entre ellas los linfocitos T (así como las células que residen dentro de la articulación, tales como las células sinoviales, los fibroblastos y las células endoteliales) resultan activadas y contribuyen a la producción de múltiples citoquinas inflamatorias, entre ellas TNF-\alpha, IL-1, IFN-\gamma, IL-2, IL-6, IL-8, GM-CSF, PDGF y FGF, siendo capaces estas dos últimas de estimular la proliferación de las células sinoviales.

Se cree que la totalidad de dichas citoquinas desempeña un papel en la inducción de la producción de otros numerosos factores inflamatorios, así como de una diversidad de otros mediadores en la degradación de tejidos. Entre estos factores y mediadores de la degradación se incluyen productos del metabolismo del ácido araquidónico (que se encuentran activos en diversas rutas intracelulares de transducción de señales), intermediarios de oxígeno reactivo y enzimas degradativos, tales como la colagenasa, la estromelisina y otras proteasas neutras, todas las cuales pueden contribuir adicionalmente a la respuesta inflamatoria y a la destrucción de tejidos.

La infiltración celular en el sinovio se ve intensificada por la regulación positiva de las moléculas de adhesión celular, tales como las selectinas, LFA-3 y los elementos de la familia ICAM de moléculas de adhesión celular similares a Ig sobre las células dentro de la articulación. Estas moléculas de adhesión promueven la infiltración de glóbulos blancos activados hacia el interior de la articulación afectada mediante la estimulación de la adhesión, migración y activación de los leucocitos (entre ellos, de los linfocitos).

El sistema inmunológico humoral también contribuye a la inflamación articular. Los anticuerpos son producidos dentro de las articulaciones inflamadas en enfermedades tales como la AR, ARJ y OA (ver a continuación) y producen complejos inmunológicos localizados que pueden activar el sistema del complemento. Tal como se ha comentado anteriormente en más detalle, los componentes del complemento activado pueden presentar efectos citolíticos, de activación celular, anafilatóxicos y quimotácticos.

Dichas respuestas inflamatorias multifactoriales conducen a la destrucción de cartílago y a la erosión de hueso, que en última instancia resultan en deformidades articulares observables en pacientes con inflamación articular crónica.

En vista de la compleja naturaleza de la inflamación articular, se ha propuesto una diversidad de teorías en la técnica, muchas de las cuales son contradictorias, para explicar la importancia relativa de los diversos factores implicados. A pesar del extenso trabajo que se ha realizado, sigue existiendo una controversia básica en la técnica acerca de las contribuciones relativas de los sistemas inmunológicos celular y humoral en la inflamación articular, incluyendo la cuestión de cuál es el papel que desempeña el complemento en la inflamación. Ver, por ejemplo, Andersson y Holmdahl, 1990; Brahn y Trentham, 1989; Chiocchia et al., 1990; Chiocchia et al., 1991; Durie et al., 1993; Goldschmidt et al., 1990; Goldschmidt y Holmdahl, 1991; Holmdahl et al., 1985; Holmdahl et al., 1989; Holmdahl et al., 1990; Horn et al., 1988; Horn et al., 1992; Horn et al., 1993; Mori et al., 1992; Myers et al., 1989A, Nakajima et al., 1993; Osman et al., 1993; Peterman et al., 1993; Seki et al., 1988; Seki et al., 1992; Terato et al., 1992; Watson et al., 1987; y, en particular, las publicaciones siguientes relativas al sistema del complemento y/o a los cometidos referentes a las células T y a los componentes del complemento en la inflamación articular: Andersson et al., 1991; Andersson et al., 1992; Banerjee et al., 1988B; Banerjee et al., 1989; David, 1992; Fava et al., 1993; Haqqi et al., 1989; Kakimoto et al., 1988; Maeurer et al., 1992; Morgan et al., 1981; Moxley y Ruddy, 1985; Reife et al., 1991; Spinella et al., 1991; Spinella y Stuart, 1992; van Lent et al., 1992; Watson et al., 1987; Watson y Townes, 1985; y Williams et al., 1992A. Hasta el momento, estos estudios amplios no han conducido a tratamientos efectivos para la inflamación articular establecida, basándose en la modulación del sistema del complemento y, en particular, basándose en la utilización de bloqueantes de C5.

Los estudios de los efectos profilácticos de los bloqueantes de C5 descritos posteriormente en el Ejemplo 2 se diseñaron para determinar si C5 era una diana apropiada y efectiva para la modulación farmacológica del sistema inmunológico humoral con el fin de prevenir la inflamación articular. La inesperada efectividad de los bloqueantes de C5 en la prevención de la aparición de la inflamación articular condujo al diseño y ejecución de los estudios que se describen en el Ejemplo 1, en los que los bloqueantes de C5 se utilizaron para tratar la inflamación establecida. Al inicio de estos experimentos, se previó que dicho tratamiento presentaría poco efecto medible sobre la inflamación articular establecida, al suponer que C5 era más importante en los estadios tempranos del proceso de la enfermedad, cuando la actividad quimiotáctica de C5a desencadenaría la infiltración de las células inflamatorias. Se suponía también que la implicación de las células T en la enfermedad establecida continuaría proporcionando estímulos inflamatorios significativos incluso en ausencia de actividad de C5. Tal como muestran los resultados del Ejemplo 1, esta previsión era incorrecta porque se descubrió que los bloqueantes de C5 eran inesperadamente efectivos en la detención y/o reducción de la inflamación de articulaciones que ya estaban inflamadas, inhibiendo simultáneamente la extensión de la inflamación a articulaciones no afectadas.

Enfermedades asociadas comúnmente con la inflamación articular

La artritis reumatoide (AR) y la artritis reumatoide juvenil (ARJ) son enfermedades multisistema crónicas de causa desconocida. La AR afecta aproximadamente al 1% de la población, afectando tres veces más a las mujeres que a los hombres. La aparición es más frecuente durante la cuarta y quinta décadas de la vida. La AR y ARJ son enfermedades sistémicas con numerosas manifestaciones patológicas además de los aspectos de inflamación articular. En la AR, entre estas manifestaciones se encuentran la AR vasculitis (inflamación de los vasos sanguíneos), que puede afectar a casi cualquier sistema orgánico y puede provocar numerosas secuelas patológicas, entre ellas la polineuropatía, la ulceración cutánea y el infarto visceral. Entre las manifestaciones pleuropulmonares se incluyen la pleuritis, la fibrosis intersticial, los nódulos pleuropulmonares, la neumonitis y la arteritis. Otras manifestaciones son el desarrollo de nódulos inflamatorios reumatoides en una diversidad de estructuras periarticulares, tales como las superficies de los extensores, así como sobre la pleura y las meninges. Son comunes la debilidad y la atrofia del músculo esquelético.

Los aspectos de inflamación articular de la AR se presentan como sinovitis inflamatoria persistente, habitualmente implicando articulaciones periféricas en una distribución simétrica. En general, las complejas respuestas inflamatorias intraarticulares observadas en la AR son del tipo descrito anteriormente en el comentario general de la inflamación articular.

Muchos pacientes con lupus eritematoso sistémico (LES) también desarrollan inflamación articular denominada artritis del lupus. El LES es una enfermedad autoinmunológica de causa desconocida en la que numeras células, tejidos y órganos diferentes resultan dañados por autoanticuerpos y complejos inmunológicos patogénicos. Las manifestaciones clínicas del LES son numerosas e incluyen una diversidad de erupciones maculopapulares, nefritis, cerebritis, vasculitis, anormalidades hematológicas, incluyendo citopenias y coagulopatías, pericarditis, miocarditis, pleuresía, síntomas gastrointestinales y la inflamación articular anteriormente indicada.

La osteoartritis (OA) representa la enfermedad articular más común en el hombre y la OA de la rodilla es la causa principal de discapacidad crónica en los países desarrollados. Se manifiesta con dolor, rigidez e inflamación de las articulaciones implicadas. El cartílago articular, responsable de las funciones mecánicas más críticas de la articulación, es el tejido diana principal de la OA. La degradación del cartílago articular en la OA se encuentra mediado por diversos enzimas, tales como las metaloproteinasas, plasmina y catepsina, que a su vez resultan estimuladas por diversos factores que también pueden actuar como mediadores inflamatorios. Entre estos factores se incluyen las citoquinas, tales como la interleuquina-1, que es sabido que activa el cartílago patogénico y las proteasas sinoviales.

La identificación de niveles superiores a los normales de inmunoglobulinas en el cartílago en la OA generalizada y la demostración de la existencia de anticuerpos específicos de colágeno de tipo II en algunos pacientes con OA proporciona una evidencia de que la activación inmunológica posee un papel en este estado patológico (ver, por ejemplo, Jasin 1989). La observación de que la OA raramente continúa siendo monoarticular también sugiere que esta enfermedad es un trastorno sistémico del cartílago articular. La inflamación sinovial se convierte en más frecuente a medida que progresa la enfermedad. De hecho, en la OA de estadio avanzado, la evidencia histológica de la inflamación sinovial puede ser tan marcada como la del sinovio de pacientes con inflamación articular asociada a
AR.

La artritis psoriática es un trastorno articular inflamatorio crónico que afecta a entre el 5% y el 8% de las personas con psoriasis. Un porcentaje significativo de estos individuos (un cuarto) desarrollan una enfermedad destructiva progresiva. El veinticinco por ciento de los pacientes con psoriasis y que presentan inflamación articular desarrollan inflamación articular simétrica similar a las manifestaciones de inflamación articular de la AR y más de la mitad de éstas llegan a desarrollar diversos grados de destrucción articular.

Otras enfermedades asociadas con la inflamación articular

Una diversidad de otras enfermedades sistémicas presentan la inflamación articular como característica prominente de la presentación clínica.

La inflamación articular periférica se produce hasta en un quinto de los pacientes con enfermedad inflamatoria intestinal. La inflamación articular es aguda, asociada con recidivas de la enfermedad intestinal, manifestada como articulaciones dolorosas, calientes, eritematosas e inflamadas. Los líquidos sinoviales de los enfermos presentan un exudado inflamatorio agudo constituido en su mayor parte por neutrófilos y las radiografías demuestran inflamación y efusiones de los tejidos blandos.

La sinovitis que acompaña a la hepatitis B es similar a la enfermedad del suero, con una aparición súbita de fiebre y de inflamación articular. Generalmente se produce una inflamación simétrica de las articulaciones, incluyendo la rodilla, hombro, muñeca, tobillos, codo y las articulaciones de las manos. Los complejos inmunológicos que contienen antígenos de hepatitis B se encuentran presentes en el suero y en el sinovio, apoyando el concepto de que la sinovitis se encuentra mediada inmunológicamente. Entre otras enfermedades virales asociadas con la inflamación articular se incluyen la rubéola, la infección por virus de la inmunodeficiencia humana y las infecciones por coxsackievirus y adenovirus.

La cirugía de derivación intestinal también se asocia a inflamación articular mediada por un complejo inmunológico y la inflamación articular es una manifestación prominente de la enfermedad de Whipple o lipodistrofia intestinal, en la que también se observan fiebre, edema, serositis, linfadenopatía, uveitis e inflamación cerebral. Además, la inflamación articular potencialmente relacionada con el sistema inmunológico es una secuela asociada de la endocarditis infecciosa y de determinadas infecciones espiroquetales, más notablemente la infección por Borrelia burgdorferi, el organismo causativo de la enfermedad de Lyme.

El síndrome de Sjögrens primario es una enfermedad autoinmunológica crónica de progresión lenta caracterizada por la infiltración linfocítica de las glándulas exocrinas que resulta en xerostomía y ojos secos. Un tercio de los pacientes se presenta con manifestaciones sistémicas, entre ellas vasculitis, nefritis, mononeuritis múltiple y, más comúnmente, inflamación articular.

La espondilitis anquilosante (EA) es un trastorno inflamatorio de causa desconocida que afecta principalmente al esqueleto axial, aunque también resultan afectadas las articulaciones periféricas. Su incidencia se correlaciona con la presencia de haplotipo de histocompatibilidad HLA-B27 y además están implicados mecanismos que están mediados inmunológicamente a través de los niveles séricos elevados de IgA y una histología inflamatoria de las articulaciones con características similares a las observadas en los aspectos de inflamación articular de la AR. De esta manera, el líquido sinovial de las articulaciones periféricas inflamadas en la AS no es claramente diferente al de otras enfermedades articulares inflamatorias.

La artritis reactiva (ARe) se refiere a una inflamación articular aguda no purulenta que complica una infección en otra parte del cuerpo. La artritis reactiva se cree que está mediada inmunológicamente. Dentro de esta categoría se encuentra la constelación de observaciones clínicas denominadas frecuentemente síndrome de Reiter o enfermedad de Reiter. Además de la inflamación articular, este síndrome afecta a la piel, ojos, membranas mucosas y menos comúnmente al corazón, pulmones y sistema nervioso. El síndrome de Reiter puede seguir a infecciones entéricas por cualquiera de las especies de los géneros Shigella, Salmonella, Yersinia y Campylobacter y a las infecciones genitales por Chlamydia trachomatous. La histología de las articulaciones afectadas por este síndrome es similar a la observada en otros tipos de inflamación articular. La inflamación articular habitualmente es bastante dolorosa y no son infrecuentes las efusiones de articulaciones tensas, especialmente en la rodilla. La inflamación articular habitualmente es asimétrica y aditiva, con implicación de nuevas articulaciones a lo largo de un periodo de unos cuantos días a varias semanas.

III. Las terapias actuales

Las terapias actuales para los diversos tipos de inflamación articular comentados anteriormente incluyen la administración de fármacos antiinflamatorios, tales como los fármacos no esteroideos, entre ellos la aspirina y los fármacos inmunosupresores no específicos, tales como los compuestos de oro, corticoesteroides, penicilamina, hidroxicloroquina, metotrexato, azatioprina, agentes alquilantes, tales como ciclofosfamida y sulfasalacina. La administración de cada uno de estos agentes en ocasiones se encuentra asociada con efectos secundarios y toxicidades severas. Los pacientes que reciben algunos de estos tratamientos también están expuestos a los peligros de la infección oportunista y a un riesgo incrementado de neoplasia asociada con la inmunosupresión generalizada. Además de los textos médicos citados anteriormente, pueden encontrarse comentarios de los fármacos utilizados para tratar la inflamación articular establecida en The Pharmacological Basis of Therapeutics, de Goodman y Gilman, 18ª edición, Gilman et al. (editores), 1990, Pergamon Press, Inc., New York, capítulo 26, páginas 638-681; Physician's Desk Reference 47th Ed., 1993, Medical Economics Co., Inc., Montvale, NJ; The United States Pharmacopeia 22nd Ed., 1989, Mack Printing Co., Easton, PA; Drug Evaluations Annual 1991, 1990, American Medical Association, Milwaukee, WI; y Cash y Klippel, 1994, N. Eng. J. Med. 330:1368-1375.

Además de los tratamientos farmacológicos, en ocasiones se consigue aliviar los síntomas de la inflamación articular con baños calientes o fríos. La intervención quirúrgica utilizando procedimientos de liberación de tendón y/o procedimientos de sustitución de la articulación con frecuencia son el último recurso en el tratamiento de la inflamación articular crónica. Esta cirugía ortopédica se asocia con un riesgo incrementado de infección y las prótesis presentan vidas útiles limitadas.

Los nuevos enfoques terapéuticos que se están desarrollando en la actualidad incluyen intentos de tratar los diversos elementos de la respuesta inmunológica celular que contribuyen a la cascada inflamatoria presente en las articulaciones inflamadas. Entre estos enfoques se incluyen la administración de preparaciones terapéuticas, entre ellas agentes anticélulas T y/o agentes anticitoquina (ver, por ejemplo, Banerjee et al., 1988A; Cannon et al., 1990; Chiocchia et al., 1991; Elliot et al., 1993; Fava et al., 1993; Fujimori et al., 1993; Griswold et al., 1988; Horn et al., 1988; Horn et al., 1991; Horn et al., 1993; Inoue et al., 1993; Kakimoto et al., 1992; Kleinau et al., 1989; Myers et al., 1989b; Myers et al., 1993; Nagler-Anderson et al., 1986; Nishikaku y Koga, 1993; Peterman et al., 1993; Piguet et al., 1992; Smith et al., 1990; Spannaus-Martin et al., 1990; Thompson et al., 1988; Trentham et al., 1993; Williams et al., 1992b; Williams et al., 1994; y Wolos et al., 1993).

Annals of the rheumatic diseases, vol. 51, publicado en 1992, páginas 1123-1128 se refiere a la contribución relativa del contacto y activación del complemento en las reacciones inflamatorias en las articulaciones artríticas. Comple, inflammation 8:328-340, 1991, da a conocer la identificación y caracterización de dos mAb contra C5 y una contra C6. En la Carta al Editor, en Immunogenetics 35:71-72, 1992; se comenta una relación que se ha propuesto entre el componente C5 del complemento y la artritis inducida por colágeno. La carta describe brevemente los resultados conflictivos de dichos estudios. La patente US nº 5.173.499 da a conocer compuestos que inhiben el complemento. Específicamente, la patente US nº 5.173.499 da a conocer una pequeña molécula que inhibe el procesamiento proteolítico de C5. La patente US nº 5.135.916 se refiere a los inhibidores del complejo C5b-9, en particular a una proteína inhibitoria de 18 kD que se expresa sobre los eritrocitos. El documento PCT/US95/05688 da a conocer la utilización de anticuerpos monoclonales C5, específicamente mAb 5G1.1 en el tratamiento de las condiciones inflamatorias que implican la sobreactivación del sistema del complemento. El documento WO nº 9525540 da a conocer la utilización de anticuerpos anti-C5 para reducir la disfunción de los sistemas inmunológico y hemostático asociados con procedimientos de circulación extracorpórea, tales como los procedimientos de derivación cardiopulmonar. El documento WO nº 95/23856 da a conocer proteínas inhibidoras quiméricas del complemento que comprenden un primer dominio funcional que presenta actividad inhibitoria de C3 y un segundo dominio funcional que presenta actividad inhibitoria de C5b-9. La patente US nº 94/05285 da a conocer la utilización de componentes del complemento en el tratamiento de las condiciones que implican la sobreactivación del complemento. El documento PCT/US93/07406 se refiere a sCR1 y a la utilización del mismo en el tratamiento de la inflamación. Los ejemplos en la misma se refiere a la inhibición de la hemólisis utilizando isoformas de CR1.

Sumario de la invención

En vista de lo expuesto anteriormente, es un objetivo de la presente invención proporcionar un nuevo enfoque para la preparación de un medicamento para el tratamiento de la inflamación articular establecida.

La invención proporciona procedimientos que implican la utilización de bloqueantes del componente C5 del complemento, tales como anticuerpos monoclonales anti-C5, como agentes farmacéuticos para conseguir el tratamiento terapéutico de la inflamación articular establecida. Los bloqueantes de C5 se administran a animales, por ejemplo a seres humanos, que presentan por lo menos una articulación inflamada. Los bloqueantes pueden administrarse sistémicamente o localmente. Consiguen una reducción o una estabilización de la inflamación de las articulaciones que ya se encuentran inflamadas e inhiben la extensión de la inflamación a articulaciones no afecta-
das.

Tal como se utiliza en el presente documento, un "bloqueante de C5" es un compuesto que interacciona directamente con C5, C5a y/o C5b, es decir, un compuesto que se une directamente o modifica directamente (es decir, mediante una reacción química directa) uno de estos componentes del complemento, de manera que se inhibe la formación y/o función fisiológica de C5a y/o de C5b. Preferentemente, la formación y/o funciones fisiológicas tanto de C5a como de C5b resultan inhibidas por el bloqueante de C5.

Las interacciones directas con C5, C5a y/o C5b presentan la importante ventaja de que otros componentes de la cascada del complemento pueden dejarse intactos. En particular, las funciones de opsonización asociadas con la activación del componente C3 del complemento por una convertasa C3 para producir C3a y C3b pueden dejarse intactas, permitiendo que continúe la eliminación de las partículas y sustancias extrañas al cuerpo por la acción de C3b. Los bloqueantes de C5 más preferentes son aquellos que son de este tipo, es decir, los que no interfieren con la función de C3b.

Tal como demuestran los ejemplos presentados después, de acuerdo con la invención, inesperadamente se ha descubierto que el tratamiento con los bloqueantes de C5 que son anticuerpos monoclonales anti-C5, detiene y, en muchos casos, por lo menos revierte parcialmente el proceso de la enfermedad en una articulación inflamada, evitando simultáneamente la progresión de la inflamación articular a articulaciones no afectadas. Dada la comprensión anterior de la técnica del papel del sistema inmunológico celular en la inflamación articular (ver anteriormente), no sería previsible que un bloqueante de C5 que es un anticuerpo monoclonal anti-C5 presentase dicho gran efecto beneficioso sobre la inflamación articular establecida.

Las figuras adjuntas, que se incorporan en la especificación y constituyen parte de la misma, ilustran determinados aspectos de la invención y conjuntamente con la descripción, sirven para explicar los principios de la invención. Debe entenderse, evidentemente, que tanto las figuras como la descripción son únicamente explicativas y que no son limitativas de la invención.

Breve descripción de los dibujos

Las figuras 1a-c son fotomicrografías de articulaciones teñidas con hematoxilina y eosina que ilustran la utilización de un bloqueante de C5 para detener la progresión de la inflamación articular establecida. La figura 1a muestra una articulación de pata de un ratón normal; la figura 1b muestra una articulación de pata afectada inicialmente en un ratón con un tratamiento de control, en la que la articulación muestra erosión extensiva del hueso con infiltración severa de células inflamatorias y engrosamiento de la membrana sinovial; y la figura 1c muestra una articulación de pata afectada inicialmente en un ratón tratado con bloqueante de C5 que muestra la estructura articular conservada con algún grado de engrosamiento de la membrana sinovial y una inesperada falta de infiltración de células polimorfonucleares en comparación con la articulación afectada inicialmente del grupo de control (figura 1b).

Las figuras 2a-b son gráficos que demuestran la capacidad de un bloqueante de C5 de detener la progresión de la patología de una articulación inflamada. La figura 2a muestra una comparación de valores medios de índice de inflamación articular (IA). Los datos representan el valor medio del índice IA +/- un error estándar. Los círculos sólidos son ratones tratados con bloqueante de C5 (n=6). Los círculos blancos son ratones bajo tratamiento de control (n=4). La figura 2b muestra una comparación de grosores de pata de articulaciones afectadas inicialmente. Tras la aparición de la inflamación articular, el grosor de la pata de control se incrementó significativamente en comparación con las patas tratadas o normales (N). Los datos representan grosores medios +/- SE. Los círculos sólidos son ratones tratados con bloqueante de C5 (n=8). Los círculos blancos son ratones bajo tratamiento de control (n=4).

Las figuras 3a-e son gráficos de grosor de pata frente al tiempo para ratones tratados con bloqueante de C5 y bajo tratamiento de control. Las figuras 3a-d muestran mediciones de patas afectadas inicialmente de animales emparejados; la figura 3e muestra mediciones de patas afectadas inicialmente de dos animales tratados no emparejados y las medias de las mediciones en los controles de la figura 2b.

Las figuras 4a-c son fotomicrografías de articulaciones teñidas con hematoxilina y eosina que ilustran la utilización de un bloqueante de C5 para evitar la aparición de la inflamación articular. La figura 4a muestra una articulación de pata de un ratón normal; la figura 4b muestra una articulación de pata afectada de un ratón bajo tratamiento de control, en la que resultan visibles la infiltración de células inflamatorias, el engrosamiento de la membrana sinovial y la erosión ósea por la expansión del pannus sinovial; y la figura 4c muestra una articulación de pata típica de un ratón tratado con bloqueante de C5 que muestra únicamente engrosamiento subclínico de la membrana sinovial.

La figura 5 muestra que el tratamiento con un bloqueante de C5 previene la inflamación articular. La figura 5a es una comparación de la incidencia de la inflamación articular inducida por colágeno en ratones tratados con bloqueante de C5 (n=9) y en un grupo de ratones tratados con diferentes tratamientos de control (n=10). Los datos representan la incidencia global (total) de inflamación articular observada dentro de los dos meses posteriores al inicio del tratamiento. La figura 5b es una comparación de la actividad hemolítica en suero de los ratones tratados con bloqueante de C5 (n=5) y de los ratones bajo tratamiento de control (n=3) dos semanas después de iniciar el tratamiento.

La figura 6 muestra los efectos del tratamiento de bloqueante de C5 sobre las respuestas celular y humoral colágeno-específicas. La figura 6a se preparó mediante el análisis de muestras de suero obtenidas de ratones tratados con bloqueante de C5 (n=4) o de ratones bajo tratamiento de control (n=4) en el tiempo indicado tras la inmunización con CII. Las muestras se analizaron para IgG anti-B-CII en un ensayo ELISA. El índice de anticuerpos anti-B-CII representa la proporción de densidades ópticas obtenida en sueros positivos y sueros negativos. La figura 6b se preparó cultivando células T del nódulo linfático (5 x 10^{5}) in vitro con 20 \mug/ml de B-CII, C-CII, B-CI o sólo medio, en presencia de 5 x 10^{5} células de bazo singénicas tratadas con mitomicina C durante un total de 4 días, después de lo cual las células se pulsaron con ^{3}H-timidina 18 horas antes de su recolección.

La figura 7 muestra los resultados de los ensayos hemolíticos que demuestran la inhibición de la actividad del complemento asociada con sangre humana que se ha hecho circular por un circuito extracorpóreo tras el tratamiento con un bloqueante de C5. Los ensayos se llevaron a cabo antes de la adición del bloqueante o del inicio del circuito CPB ("Pre Tx") utilizando sangre no diluida ("no dil.") y sangre diluida ("dil."), tal como se describe en el Ejemplo 4. Las muestras de sangre diluida a las que se había añadido bloqueante ("Post Tx") se sometieron a ensayo en los tiempos indicados tras iniciar el circuito CPB.

La figura 8 muestra los resultados de los ensayos de niveles de componente C3a del complemento, que demuestran que la producción de componente del complemento C3a en sangre humana completa que se ha hecho circular por un circuito extracorpóreo no resulta inhibida por la adición de un bloqueante de C5 a dicha sangre. Los ensayos se llevaron a cabo antes de la adición del bloqueante o del inicio del funcionamiento del circuito CPB ("Pre Tx") utilizando sangre no diluida ("no dil.") y sangre diluida ("dil."), tal como se describe en el Ejemplo 5. Las muestras de sangre diluida a las que se había añadido el bloqueante ("Post Tx") se sometieron a ensayo en los tiempos indicados tras iniciar el funcionamiento del circuito CPB.

La figura 9 muestra los resultados de ensayos de los niveles de C5b-9 soluble (sC5b-9) en sangre humana que se ha hecho circular por un circuito extracorpóreo, que demuestran que la adición de un bloqueante de C5 a dicha sangre inhibe la formación del complemento terminal complejo C5b-9. Los ensayos se llevaron a cabo antes de la adición del bloqueante o del inicio del circuito CPB ("Pre Tx") utilizando sangre no diluida ("no dil.") y sangre diluida ("dil."), tal como se describe en el Ejemplo 6. Las muestras de sangre diluida a las que se había añadido bloqueante ("Post Tx") se sometieron a ensayo en los tiempos indicados tras iniciar el funcionamiento del circuito CPB.

Las figuras 10a-b muestran los análisis farmacocinéticos de la reducción de la capacidad de Tisis celular de la sangre de ratón (figura 10a) o de la sangre humana en circulación extracorpórea (figura 10b) tras el tratamiento con diversos bloqueantes de C5. El bloqueante B de C5 es el anticuerpo monoclonal BB5.1; el bloqueante F de C5 es un fragmento Fab' del anticuerpo monoclonal BB5.1; el bloqueante N de C5 es el anticuerpo monoclonal N19-8.

Descripción de las formas de realización preferidas

Tal como se ha comentado anteriormente, la presente invención se refiere a un procedimiento para tratar la inflamación articular establecida mediante la administración de un bloqueante de C5 que es un anticuerpo monoclonal anti-C5 o de una combinación de bloqueantes de C5 a un paciente que necesita de dicho tratamiento. Tal como se utiliza en el presente documento, "inflamación articular establecida" se refiere a que el paciente presenta por lo menos una articulación inflamada en el momento de iniciar el tratamiento.

Dichos bloqueantes de C5 comprenden anticuerpos que interaccionan directamente con C5, C5a y/o C5b, de manera que se inhibe la formación y/o función fisiológica de C5a y/o de C5b. Preferentemente, el bloqueante o bloqueantes de C5 que es un anticuerpo monoclonal anti-C5 inhibe la formación y/o función fisiológica de C5a y de C5b.

La concentración y/o actividad fisiológica de C5a y de C5b en un líquido corporal puede medirse mediante procedimientos bien conocidos en la técnica. Para C5a dichos procedimientos incluyen los ensayos de quimiotaxis, RIA o ELISA (ver, por ejemplo, Ward y Zvaifler, 1971; Jose et al., 1990; Wurzner et al., 1991). Para C5b, pueden utilizarse ensayos hemolíticos o ensayos para determinar la C5b-9 soluble, tal como se ha comentado en la presente memoria. También pueden utilizarse otros ensayos conocidos en la técnica. Mediante la utilización de ensayos de estos o de otros tipos adecuados, pueden cribarse bloqueantes de C5 candidatos, conocidos en la actualidad o identificados posteriormente, con el fin de: 1) identificar compuestos que resulten útiles en la práctica de la invención, y 2) determinar los niveles apropiados de dosificación de dichos compuestos. Los Ejemplos 2, 4 y 6-8 ilustran la utilización de ensayos hemolíticos y de C5b-9 soluble con bloqueantes de C5 que comprenden anticuerpos monoclonales.

Los bloqueantes que afectan a C5a se utilizan preferentemente a concentraciones que proporcionan una reducción sustancial (es decir, una reducción de por lo menos aproximadamente el 25%) de los niveles de C5a presentes en por lo menos un líquido derivado de la sangre del paciente, por ejemplo sangre, plasma o suero, tras la activación del complemento dentro del líquido. Alternativamente, se utilizan a concentraciones que proporcionan por lo menos una reducción de aproximadamente 10% en los niveles de C5a presentes en el líquido sinovial de una articulación inflamada.

De manera similar, los bloqueantes que afectan a C5b preferentemente se utilizan a concentraciones que proporcionan una reducción sustancial (es decir, una reducción de por lo menos aproximadamente el 25%) en los niveles de C5b presentes en por lo menos un líquido derivado de la sangre del paciente tras la activación del complemento dentro del líquido. Alternativamente, se utilizan a concentraciones que proporcionan por lo menos una reducción de aproximadamente 10% en los niveles de C5b presentes en el líquido sinovial de una articulación inflamada. En el caso de C5b, dichas concentraciones pueden determinarse convenientemente midiendo la capacidad de tisis celular (por ejemplo la actividad hemolítica) del complemento presente en el líquido o los niveles de C5b-9 soluble presentes en el líquido (ver, por ejemplo, el Ejemplo 6 posteriormente). De acuerdo con lo anteriormente expuesto, una concentración preferente para un bloqueante de C5 que afecta a C5b es una que resulta en una reducción sustancial (es decir, una reducción de por lo menos aproximadamente 25%) en la capacidad de lisis celular del complemento presente en por lo menos uno de los líquidos derivados de la sangre del paciente. Las reducciones de la capacidad de Tisis celular del complemento presente en los líquidos corporales del paciente pueden medirse mediante procedimientos bien conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo, un ensayo hemolítico convencional, tal como el ensayo de hemólisis descrito por Kabat y Mayer, 1961, páginas 135-139, o una variación convencional de dicho ensayo, tal como el procedimiento de hemólisis de eritrocitos de pollo descrito a continuación.

Los anticuerpos monoclonales anti-C5 preferentes son relativamente específicos y no bloquean las funciones de los componentes tempranos del complemento. En particular, dichos agentes preferentes no alterarán sustancialmente las funciones de opsonización asociadas con el componente C3b del complemento, cuyas funciones proporciona un medio para la eliminación de las partículas y sustancias extrañas del cuerpo.

Se produce C3b mediante el corte de C3, que llevan a cabo convertasas C3 clásicas y/o alternativas y resulta en la producción de C3a y C3b. Por lo tanto, con el fin de no alterar las funciones de opsonización asociadas con C3b, los bloqueantes de C5 preferentes no interfieren sustancialmente con el corte del componente del complemento C3 en un líquido corporal del paciente (por ejemplo suero) de formación de C3a y C3b. Dicha interferencia con el corte de C3 puede detectarse midiendo los niveles en líquidos corporales de C3a y/o de C3b, los cuales son producidos en proporción equimolar por la acción de las convertasas C3. Dichas mediciones resultan informativas debido a que los niveles de C3a y de C3b estarán reducidos (en comparación con una muestra similar sin el bloqueante de C5, que es un anticuerpo monoclonal anti-C5) si el bloqueante de C5 interfiere con el corte.

En la práctica, la medición cuantitativa de dicho corte generalmente es más exacta cuando se lleva a cabo midiendo los niveles de C3a que midiendo los niveles de C3b en los líquidos corporales, debido a que C3a permanece en la fase líquida, mientras que C3b es eliminada rápidamente. Los niveles de C3a en un líquido corporal pueden medirse mediante procedimientos bien conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo, la utilización de un kit de EIA para C3a disponible comercialmente, por ejemplo el comercializado por Quidel Corporation, San Diego, CA, de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Los anticuerpos monoclonales C5 particularmente preferentes esencialmente no producen ninguna reducción en los niveles de C3a en los líquidos corporales tras la activación del complemento cuando se someten a ensayo en dichos ensayos.

Los agentes bloqueantes de C5 son anticuerpos monoclonales. Los hibridomas para producir anticuerpos monoclonales (mAb) reactivos con el componente C5 del complemento pueden obtenerse utilizando como inmunógeno los componentes C5, C5a y/o C5b del complemento, preferentemente en forma purificada.

Los anticuerpos más preferentes evitarán el corte de C5 para formar C5a y C5b, evitando de esta manera la producción de la actividad anafilatóxica asociada con C5a y evitando la generación de la actividad anafilatóxica asociada con C5 y evitando el ensamblaje del complejo de ataque a membrana asociado con C5b. Tal como se ha comentado anteriormente, en una forma de realización particularmente preferente, estos anticuerpos bloqueantes de C5 no alterarán la función de opsonización asociada con la acción de C3b.

Los procedimientos generales para la inmunización de animales (en este caso con C5, C5a y/o C5b), el aislamiento de células productoras de anticuerpos, la fusión de dichas células con células inmortales (por ejemplo células de mieloma) para producir hibridomas que secreten anticuerpos monoclonales, el cribado de los sobrenadantes de hibridoma para obtener los anticuerpos monoclonales segregados que son reactivos con un antígeno deseado (en este caso el inmunógeno o una molécula que contiene el inmunógeno), la preparación de cantidades de dichos anticuerpos en sobrenadantes de hibridoma o líquido de ascites, y para la purificación y almacenamiento de dichos anticuerpos monoclonales, pueden encontrarse en numerosas publicaciones. Entre éstas se incluyen: Coligan et al., editores, Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York, 1992; Harlow y Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988; Liddell y Cryer, A Practical Guide to Monoclonal Antibodies, John Wiley & Sons, Chichester, West Sussex, Inglaterra, 1991; Montz et al., Cellular Immunol. 127:337-351, 1990; Wurzner et al., Complement Inflamm. 8:328-340, 1991; y Mollnes et al., Scand. J. Immunol. 28:307-312, 1988.

Posteriormente, en el Ejemplo 8, se presenta una descripción de la preparación de un anticuerpo monoclonal de ratón anti-C5 humano. Wurzner et al., 1991, describen la preparación de otros anticuerpos monoclonales de ratón anti-C5 humano adecuados, denominados N19-8 y N20-9.

Tal como se utiliza en la presente memoria, las expresiones "anticuerpo" o "anticuerpos" se refieren a las inmunoglobulinas producidas in vivo, así como a las producidas in vitro con un hibridoma y fragmentos de unión a antígeno (por ejemplo preparaciones Fab') de dichas inmunoglobulinas, así como las proteínas de unión a antígeno producidas de manera recombinante (sometido a estudio técnico), incluyendo las inmunoglobulinas, inmunoglobulinas quiméricas, inmunoglobulinas "humanizadas", fragmentos de unión a antígeno de dichas inmunoglobulinas, anticuerpos de cadena única y otras proteínas recombinantes que contienen dominios de unión a antígeno derivados de inmunoglobulinas. Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "monoclonal" se refiere a cualquier anticuerpo que no sea de origen policlonal.

Entre las publicaciones que describen procedimientos para la preparación de anticuerpos sometidos a estudio técnico, además de los indicados anteriormente, se incluyen: Reichmann et al., Nature 332:323-327, 1988; Winter y Milstein, Nature 349:293-299, 1991; Clackson et al., Nature 352:624-628, 1991; Morrison, Annu. Rev. Immunol. 10:239-265, 1992; Haber, Immunol. Rev. 130:189-212, 1992; y Rodrigues et al., J. Immunol. 151:6954-6961, 1993. Los anticuerpos humanos o humanizados son preferentes para la administración a pacientes humanos.

Con el fin de conseguir las reducciones deseadas en los parámetros de los líquidos corporales, pueden administrarse dichos anticuerpos anti-C5 en una diversidad de formas de dosificación unitaria. La dosis variará según el anticuerpo particular. Por ejemplo, diferentes anticuerpos pueden presentar diferentes masas y/o afinidades y de esta manera requerir diferentes niveles de dosis. Los anticuerpos preparados como fragmentos Fab' o anticuerpos de cadena única también requerirán diferentes dosis que las inmunoglobulinas nativas equivalentes, debido a que son de masa considerablemente menor que las inmunoglobulinas nativas y requieren de esta manera dosis menores para alcanzar los mismos niveles molares en la sangre del paciente.

Los niveles de dosis de los anticuerpos para los sujetos humanos generalmente se encuentran entre 0,5 mg por kg y 100 mg por kg por paciente por tratamiento y preferentemente se encuentran entre 1 mg por kg y 50 mg por kg por paciente por tratamiento. En términos de concentraciones en un líquido corporal, las concentraciones de anticuerpo preferentemente se encuentran comprendidas en el intervalo entre 5 \mug/ml y 500 \mug/ml.

Las dosis de bloqueantes de C5 que son anticuerpos monoclonales anti-C5 también variarán dependiendo de la manera de administrarlos, de los síntomas particulares del paciente bajo tratamiento, de la salud general, condición, tamaño y edad del paciente y del criterio del médico prescritor.

Bajo el criterio del médico, un tratamiento terapéutico típico incluye una serie de dosificaciones, que habitualmente se administrarán simultáneamente al seguimiento de parámetros clínicos, tales como el número de articulaciones implicadas, enrojecimiento, inflamación y movilidad de las articulaciones, niveles de dolor, etc. ajustando los niveles de dosis según resulte necesario para alcanzar el resultado clínico deseado.

También puede ajustarse la frecuencia de administración de acuerdo con diversos parámetros. Entre estos se incluyen la respuesta clínica, la vida media en plasma del bloqueante de C5 y los niveles del bloqueante en un líquido corporal, tal como sangre, plasma, suero o líquido sinovial. Con el fin de guiar el ajuste de la frecuencia de administración, puede realizarse un seguimiento de los niveles del bloqueante de C5 en el líquido corporal durante el curso del tratamiento.

Alternativamente, para los bloqueantes de C5 que afectan a C5b, pueden seguirse los niveles de la capacidad de lisis celular del complemento presente en uno o más de los líquidos corporales del paciente para determinar si se requieren dosis adicionales o niveles de dosis más altos o más bajos. Dichas dosis se administran según resulte necesario para mantener por lo menos una reducción del 25% y preferentemente una reducción del 50% o más de la capacidad de lisis celular del complemento presente en sangre, plasma o suero o por lo menos una reducción del 10% de la capacidad de lisis celular del complemento presente en el líquido sinovial de una articulación inflamada. La capacidad de Tisis celular puede medirse como porcentaje de hemólisis en ensayos hemolíticos del tipo descrito en la presente memoria. Una reducción del 10% o del 25% o del 50% en la capacidad de Tisis celular del complemento presente en un líquido corporal tras el tratamiento con el anticuerpo monoclonal anti-C5, bloqueante o bloqueantes de C5, utilizados en la práctica de la invención, se refiere a que el porcentaje de hemólisis tras el tratamiento es del 90, 75 ó 50 por ciento, respectivamente, del porcentaje de hemólisis anterior al tratamiento. Todavía en otra alternativa, se ajustan los parámetros de dosificación según resulte necesario para conseguir una reducción sustancial de los niveles de C5a en sangre, plasma o suero, o por lo menos una reducción del 10% de los niveles de C5a en el líquido sinovial de una articulación inflamada. Tal como se ha comentado anteriormente, los niveles de C5a pueden medirse utilizando las técnicas descritas en Wurzner et al., Complement Inflamm. 8:328-340, 1991. Evidentemente pueden utilizarse otros protocolos de administración si se desea, según determine el médico.

En una forma de realización preferente, la administración del bloqueante anticuerpo monoclonal anti-C5 se inicia cuando el paciente experimenta una "recaída" de la inflamación articular en la que una o más articulaciones afectadas se inflama más y adquiere una apariencia eritematosa (enrojecida).

La administración de los bloqueantes de C5 generalmente se llevará a cabo mediante vía parenteral, típicamente mediante inyección, tal como una inyección intraarticular o intravascular (por ejemplo por infusión intravenosa) o una inyección intramuscular. Si se desea y resulta practicable para el bloqueante de C5 particular a administrar, pueden utilizarse otras vías de administración, por ejemplo la oral (p.o.).

Para el tratamiento de la inflamación articular establecida mediante la administración sistémica de un bloqueante de C5 (en lugar de la administración local, por ejemplo mediante inyección intraarticular en la articulación inflamada), resulta preferente la administración de una dosis grande inicial, es decir, una sola dosis inicial suficiente para proporcionar una reducción sustancial, y más preferentemente una reducción de por lo menos el 50% en la actividad hemolítica en el suero del paciente. Tras dicha dosis inicial grande se administran regular y repetidamente dosis decrecientes según resulte necesario para mantener reducciones sustanciales del título hemolítico en suero. En otra forma de realización, la dosis inicial se administra mediante las vías local y sistémica, seguido de la administración sistémica repetida de dosis decreciente, tal como se ha indicado anteriormente.

Las formulaciones adecuadas para la inyección, p.o., y otras vías de administración son bien conocidas en la técnica y pueden encontrarse en, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, PA, 17ª edición (1985). Las formulaciones parenterales deben ser estériles y no pirogénicas y generalmente incluirán un portador farmacéuticamente efectivo, tal como solución salina, solución salina tamponada (por ejemplo tamponada con fosfato), solución de Hank, solución de Ringer, dextrosa/solución salina, soluciones de glucosa y similares. Estas formulaciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según resulte necesario, tales como, agentes de ajuste de la tonicidad, agentes humectantes, agentes bactericidas, conservantes, estabilizantes y similares.

Las formulaciones de la invención pueden distribuirse como artículos manufacturados que comprenden material de acondicionamiento y un agente farmacéutico que comprende el bloqueante o bloqueantes de C5 que es un anticuerpo monoclonal anti-C5 y un portador farmacéuticamente aceptable como resulte apropiado al modo de administración. El material de acondicionamiento incluirá una etiqueta que indique que la formulación es para su utilización en un medicamento para el tratamiento de la inflamación articular y puede referirse específicamente a artritis, artritis reumatoide, osteoartritis, artritis del lupus, artritis psoriática, artritis reumatoide de aparición juvenil, artritis reactiva, síndrome de Reiter (enfermedad de Reiter) u otras enfermedades que implican inflamación articular.

Materiales y procedimientos Ensayos de lisis celular

La capacidad de lisis celular del complemento en diversas muestras de líquido corporal se determinó utilizando ensayos hemolíticos llevados a cabo de la manera siguiente: se lavaron bien eritrocitos de pollo en GVBS (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, nº de catálogo G-6514) y se resuspendieron a 2 x 10^{8} células/ml en GVBS. Se añadieron anticuerpos anti-eritrócito de pollo (fracción IgG de antisuero anti-RBC de pollo, Intercell Technologies, Hopewell, NJ) a las células a una concentración final de 25 \mug/ml y las células se incubaron durante 15 minutos a 23ºC. Las células se lavaron 2x con GVBS y se resuspendieron 5 x 10^{6} células hasta un volumen de 30 \mul en GVBS. A continuación se añadió un volumen de 100 \mul de solución de ensayo de líquido corporal para proporcionar un volumen final de mezcla de reacción de 130 \mul. Tal como se utiliza en la presente memoria, las referencias a porcentaje en suero y/o a adición de suero en estos ensayos indica el porcentaje de un líquido corporal (incluyendo suero, así como otros líquidos corporales, tales como sangre, plasma o líquido sinovial) en el volumen de 100 \mul de solución de ensayo de líquido corporal.

Tras la incubación durante 30 minutos a 37ºC, se calculó el porcentaje de hemólisis respecto a la muestra de control completamente lisada. Se determinó el nivel de hemólisis separando las células por centrifugación y midiendo la hemoglobina liberada en el sobrenadante como densidad óptica a 415 nm.

Una reducción del 50% en la hemólisis tras el tratamiento con el bloqueante o bloqueantes de C5 utilizados en la práctica de la invención significa que el porcentaje de hemólisis tras el tratamiento era la mitad del porcentaje de hemólisis antes del tratamiento.

Se llevaron a cabo diversos ensayos hemolíticos, descritos posteriormente en los ejemplos, utilizando dicho ensayo de eritrocitos de pollo con las siguientes adiciones de líquidos corporales. Para los ensayos de actividad del complemento de ratón, el volumen de 100 \mul de solución de ensayo de líquido corporal contenía 50 \mul de suero de ratón diluido (en GVBS) y 50 \mul de suero humano deficiente en C5 (Quidel Corporation, San Diego, CA). Para los ensayos de actividad del complemento humano, la solución de ensayo de líquido corporal contenía diversas concentraciones de plasma o suero humanos, con sobrenadantes de hibridoma y/o añadiendo GVBS para proporcionar el volumen final de 100 \mul. Para los ensayos utilizados para cribar los sobrenadantes de hibridoma comentados después en el Ejemplo 8, cada volumen de 100 \mul de solución de ensayo de suero contenía 50 \mul de sobrenadante de hibridoma y 50 \mul de una solución al 10% de suero humano en GVBS, proporcionando una adición de suero humano al 5%.

Inflamación articular inducida por colágeno

Los Ejemplos 1, 2 y 3 utilizan un sistema de inflamación articular inducida por colágeno que ha sido utilizado desde los años 70 como modelo animal de inflamación articular humana, particularmente de AR (ver, por ejemplo, Trentham et al., 1977; Holmdahl et al., 1986; Boissier et al., 1987; Yoo et al., 1988). Este sistema modelo se puso en práctica utilizando ratones DBA/1 LacJ macho de 8 a 12 semanas de edad que habían sido adquiridos del The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME).

Inmunización

Se disolvió colágeno II bovino (B-CII) procedente de Elastin Products Company, Inc., Owensville, MO, en ácido acético 0,01 M mediante agitación durante la noche a 4ºC a una concentración de 4 mg/ml. Se preparó adyuvante completo de Freund (CFA) mediante la adición de Mycobacterium tuberculosis H37RA seco (Difco, Detroit, MI) a adyuvante incompleto de Freund (Difco) a una concentración de 2 mg/ml. La solución de B-CII se emulsionó en un volumen igual de CFA y se inyectó intradérmicamente en la base de la cola de los ratones una alícuota de 100 \mul de dicha emulsión, que contenía 200 \mug de B-CII y 100 \mug de Mycobacterium. Tras 21 días, se reinmunizó a todos los ratones utilizando el mismo protocolo. Esta reinmunización secundaria con CII sirvió principalmente para incrementar los niveles séricos de anticuerpos anti-CII en los ratones inmunizados. Tras la reinmunización con CII, la aparición de inflamación articular (IA) y la progresión de la enfermedad se incrementaron drásticamente, caracterizándose por la inflamación y enrojecimiento severos de las articulaciones de una o más patas aproximadamente 4 a 6 semanas después de la inmunización inicial.

Evaluación clínica

Los ratones se examinaron diariamente desde el día de la reinmunización con el fin de detectar la aparición de IA. La presencia de IA se determinó examinando, midiendo y puntuando cada una de las patas delanteras y traseras. La IA inducida por colágeno (IAIC) se caracteriza por inflamación y eritema o por la deformación visible de la articulación en una o más extremidades. La severidad de la IA en cada pata afectada se puntuó de la manera siguiente: 0 - articulación normal; 1 - enrojecimiento e inflamación visibles; 2 - enrojecimiento e inflamación severos que afectaban a toda la pata o articulación; 3 - pata o articulación deformadas con anquilosis. La suma de las puntuaciones de las cuatro patas en cada ratón se utilizó como índice (el "índice IA") para evaluar la severidad y progresión globales de la enfermedad.

Anticuerpos monoclonales anti-complemento

Los anticuerpos monoclonales que se unen y bloquean la C5 de ratón se prepararon mediante procedimientos estándar a partir de hibridoma BB5.1 (Frei et al., 1987), obtenido de la Dr. Brigitta Stockinger, del National Institute for Medical Research, Mill Hill, Londres, Inglaterra. El hibridoma anti-C8 humano, 135.8, el cual genera un Mab que no bloquea el C8 de ratón, se obtuvo del Dr. Peter Sims (Blood Research Institute, Milwaukee, WI). Ambos anticuerpos eran isotipos IgG1 y se obtuvieron ascites de BB5.1 o de 135.8 en ratones desnudos atímicos o en ratones BALB/c, respectivamente. Se purificaron IgG a partir de ascites utilizando una columna de afinidad de proteína A eluyendo con ácido acético y posteriormente se dializaron frente a PBS. Los anticuerpos purificados se cuantificaron mediante determinación espectrofotométrica de absorbancia a 280 nm y se esterilizaron con un filtro de
0,22 \mum.

Administración de anticuerpos

Para el tratamiento profiláctico, los ratones se asignaron aleatoriamente al grupo tratado con bloqueante de C5 o al grupo bajo tratamiento de control y posteriormente recibieron 750 \mug por ratón de dosis i.p. de mAb anti-C5 de ratón, BB5.1, o de mAb anti-C8 humano, 135.8, como control, dos veces por semana. Para el tratamiento terapéutico de la IA establecida, los ratones recibieron mAb BB5.1 anti-C5 de ratón o mAb 135.8 anti-C8 humano a dosis i.p. diarias comprendidas entre 2 y 5 mg/ratón durante 10 días tras observar la aparición inicial de IA. Las dosis de mAb anti-C5 se ajustaron en un intervalo de 2 mg a 5 mg por cada inyección para garantizar que se conseguía el agotamiento deseado de la actividad hemolítica mediada por C5, es decir, un agotamiento de por lo menos el 50%.

Al contrario que la situación que se produce en el ser humano, en el que la administración de un bloqueante de C5 en un líquido corporal de individuos genéticamente no relacionados resulta en niveles aproximadamente equivalentes de inhibición del complemento, la dosis de mAb anti-C5 murino necesaria para agotar la actividad hemolítica en una cantidad dada en ratones depende de la cepa utilizada. La dosis necesaria para agotar la actividad hemolítica en ratones DBA/1 LacJ es aproximadamente cuatro veces más alta que la dosis requerida para conseguir un agotamiento equivalente de la actividad hemolítica en ratones BALB/c.

Ensayos de estimulación de las células T

Las células de nódulo linfático de animales extraídas en el momento de su sacrificio se analizaron para detectar respuestas específicas de células T al colágeno II. La células T (5 x 10^{5}) se incubaron con 5 x 10^{5} células de bazo singénicas tratada con mitomicina C (50 \mug/ml) procedentes de ratones DBA/1LacJ normales en placas de 96 pocillos de fondo plano. Se añadió colágeno II bovino (B-CII), colágeno CI bovino (B-CI), colágeno de pollo CII (C-CII) y ovoalbúmina o BSA a cultivos a una concentración de 20 \mug/ml. El medio de cultivo era RPMI-1640 suplementado con FCS al 5% inactivado por calor, 2-ME 5 x 10^{-5} M, tampón HEPES 10 mM, L-glutamina al 1%, piruvato sódico al 1% y penstrep al 1%. Los cultivos se incubaron a 37ºC en 5% de CO_{2} durante 4 días. Dieciocho horas antes de la recolección se añadió 1 \muCi de ^{3}H-timidina a cada pocillo. Los resultados se expresan en cpm obtenidos en cultivos de células T por triplicado.

Cuantificación de los anticuerpos anti-B-CII

Se sangraron ratones en diversos momentos después de la inmunización con B-CII. Se midieron los títulos de anticuerpos anti-B-CII séricos utilizando un ELISA convencional para B-CII similar al ELISA para los anticuerpos anti-C5 descritos anteriormente en el Ejemplo 8, pero utilizando B-CII para recubrir las placas (ver también Myers et al., 1989, y Seki et al., 1992, para descripciones de ensayos similares).

Examen histológico

Se sacrificaron ratones de cada grupo y se fijaron las cuatro patas de cada ratón en formalina tamponada al 10% y se descalcificaron en una solución de HCl al 3,1%, ácido fórmico al 5% y cloruro de aluminio al 7%. Las muestras de tejido se incluyeron en parafina, se seccionaron a 5 \mum y se tiñeron con hematoxilina y eosina. Para la tinción de inmunofluorescencia, las patas se descalcificaron en una solución Tris 0,1 M que contenía EDTA al 10% y PVP al 7,5% durante 3 días y se congelaron en OCT a -80ºC. A continuación se prepararon secciones de 5 \mum y se tiñeron con IgG, IgA e IgM de cabra antirratón conjugados con 9FITC (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA, nº de catálogo 65-6411) a una dilución de 1 a 50.

Ejemplo 1 Efectos terapéuticos del tratamiento con bloqueante de C5 tras la aparición clínica de la inflamación articular inducida por colágeno

Con el fin de evaluar los efectos de la administración de un bloqueante de C5 sobre la IA establecida, se observaron ratones tras la inducción de IAIC, tal como se ha descrito anteriormente, y se seleccionaron pares de ratones que mostraban la aparición inicial de síntomas fácilmente detectables de IA (articulaciones de las patas con inflamación) en el mismo día. Un ratón de cada uno de dichos pares se trató con un mAb BB5.1 anti-C5 y el otro se trató con una inyección de control del mAb 13.8 irrelevante o con PBS. En cada pareja correspondiente, el animal con el nivel global más alto de inflamación de la pata se asignaba al grupo de tratamiento con bloqueante de C5 de manera que se evitase el sesgo potencial de los resultados en favor del tratamiento con bloqueante de C5. Empezando desde el primer día de observación de la inflamación articular en forma de inflamación de la pata, se continuaron aplicando los tratamientos diarios durante 10 días (en un caso de par de ratones se llevó a cabo sólo durante 8 días). Además de estas parejas comparadas, dos animales no comparados también recibieron el tratamiento de bloqueante de C5 tras la inducción de IA.

El examen histológico de las articulaciones inicialmente afectadas en ratones con un tratamiento de control al final del periodo de tratamiento reveló erosión ósea excesiva con infiltración celular inflamatoria severa, engrosamiento de las membranas sinoviales y formación de pannus (figura 1b). Por el contrario, las articulaciones afectadas inicialmente del grupo tratado con bloqueante de C5 mostraron una estructura articular conservada con algún grado de engrosamiento de las membranas sinoviales e infiltración de células mononucleares en algunas de las articulaciones (figura 1c). La infiltración celular inflamatoria severa en las articulaciones bajo tratamiento de control predominantemente estaba compuesta de células polimorfonucleares (PMN, neutrófilos). Inesperadamente, esta infiltración de PMN se encontraba casi ausente en los ratones tratados con bloqueante de C5.

Durante el curso clínico de la IAIC, un indicador importante de la evolución de la enfermedad es la implicación de extremidades adicionales. Por lo tanto, se comparó el número de extremidades con IA clínicamente detectable al final del periodo de tratamiento con el número de extremidades que mostraban síntomas de IA antes de iniciar la terapia. Se determinaron y puntuaron tal como se ha descrito anteriormente bajo el encabezamiento "Materiales y procedimientos" la severidad y evolución de la IA en cada pata afectada, y la suma de las puntuaciones para la totalidad de las cuatro patas de cada animal se utilizó como "índice de IA". También se midieron los grosores de la totalidad de las cuatro patas de cada animal durante la duración de este experimento con el fin de proporcionar una evaluación completamente objetiva de este aspecto de la evolución de la enfermedad.

Tal como se muestra en la Tabla 1 (valores medios) y en la Tabla 2 (valores individuales), se produjeron incrementos significativos en la afección de nuevas extremidades en el grupo bajo el tratamiento de control durante el curso del tratamiento de 10 días, mientras que el número de extremidades con inflamación se redujo con el tratamiento con el bloqueante de C5 desde la aparición de la enfermedad de los ratones DBA/1 LacJ con articulaciones con inflamación. Además de la implicación de nuevas extremidades, las patas inicialmente afectadas de los animales bajo tratamiento de control mostraron una progresión de la severidad de la enfermedad inflamatoria articular de incremento del grado de la inflamación (figura 2a). La inflamación aguda en las articulaciones afectadas se observó como inflamación y enrojecimiento articular severos durante los primeros días, seguida de la deformación y anquilosis de las articulaciones al final del periodo de 10 días. Por el contrario, no se observó implicación de otras patas y la severidad de la inflamación en la mayoría de las articulaciones afectadas se redujo o no varió durante el curso de la terapia con bloqueante de C5 (figura 2a).

En la figura 2b se muestran los grosores de las patas de extremidades afectadas inicialmente en los grupos bajo tratamiento de bloqueante de C5 y de control durante el curso de estos experimentos como los valores medios para cada grupo. Las figuras 3a, 3b, 3c y 3d muestran valores para cada pata inicialmente inflamada de cada uno de los pares comparados de animales bajo tratamiento de control y con bloqueante de C5, mientras que la figura 3e muestra los valores obtenidos para cada pata inicialmente inflamada de cada uno de los animales tratados con bloqueante de C5 no comparados (mostrados junto con valores medios para los animales bajo tratamiento de control de la figura 2b). En estas figuras, el número entre paréntesis designa a cada animal particular, mientras que las letras que siguen a los números (únicamente en aquellos casos en los que había más de una extremidad afectada inicialmente) indican qué patas particulares se encontraban afectadas, donde la primera letra indica pata frontal (F) o trasera (R), mientras que la segunda letra indica pata derecha (R) o izquierda (L).

Tal como puede observarse en las figuras 2 y 3, y en las Tablas 1 y 2, el tratamiento con bloqueante de C5 evitó con éxito la extensión a otras patas y redujo (aunque no eliminó completamente) la inflamación en las articulaciones inicialmente afectadas en todos los animales tratados con bloqueante de C5 a excepción de un animal (ratón nº 4). Tal como puede observarse en la figura 2b, el grosor medio de las patas inicialmente afectadas en el grupo bajo tratamiento de control se incrementó significativamente durante el periodo de 10 días, mientras que el grosor medio de las patas afectadas inicialmente en el grupo tratado con bloqueante de C5 se redujo, aunque no significativamente.

Ejemplo 2 El tratamiento profiláctico con un bloqueante de C5 evita la inflamación articular inducida por colágeno

En estos experimentos, la administración del bloqueante de C5 coincidió con la reinmunización de los animales experimentales con B-CII. En el día de la reinmunización, los ratones se encontraban libres de síntomas y se asignaron aleatoriamente a los grupos de tratamiento con bloqueante de C5 o de tratamiento de control. Se trató cada ratón con bloqueante de C5 (mAb BB5.1 anti-C5 de ratón) o con un tratamiento de control (mAb 135.8 anti-C8 humano) a una dosis de 750 \mug i.p. por ratón dos veces por semana. Se trataron los animales durante cuatro semanas, al cabo de las cuales se interrumpió el tratamiento. Se muestran los resultados de este estudio en las figuras 4 y 5.

La administración de bloqueante de C5 evitó completamente el desarrollo de IAIC (0/8). Todos los ratones en el grupo tratado con bloqueante de C5 no mostraron indicios de enfermedad clínica durante el periodo de tratamiento (y hasta dos meses después de interrumpir la terapia con bloqueante de C5 en los dos animales que fueron seguidos durante ese tiempo). Por el contrario, el 90% de los animales tratados con un control (9/10) mostraron IA entre 4 y 6 semanas después de la primera inmunización con B-CII. En la figura 5a se muestra la incidencia en porcentaje de la Al observada en los animales bajo tratamiento de control y tratados con bloqueante de C5 tras 4 a 6 semanas (nótese que el valor para el grupo tratado con bloqueante de C5 en esta figura realmente es del 0% pero que se muestra una barra que indica el 1% con el fin de indicar que se obtuvieron datos para este grupo de animales y que estos datos se presentan). Los niveles pico de inflamación se observaron aproximadamente 5 semanas después de la inmunización inicial con colágeno. Tal como se muestra en la figura 5b, entre el 80% y el 90% de la actividad hemolítica sérica se había agotado en el grupo tratado con bloqueante de C5, mientras que la actividad hemolítica sérica siguió siendo normal en el grupo bajo tratamiento de control.

Tal como se muestra en la figura 4, el examen histológico de las articulaciones afectadas de los ratones de control reveló infiltración extensiva tanto de células mononucleares como polimorfonucleares, engrosamiento de la membrana sinovial y erosión ósea por expansión del pannus sinovial (figura 4b). Por el contrario, no se observaron indicios de procesos inflamatorios en la mayoría de las articulaciones estudiadas en los ratones tratados con bloqueante de C5. Algunas articulaciones de estos ratones tratados con bloqueante de C5 mostraban algún engrosamiento subclínico de la membrana sinovial aunque esta alteración no se vio acompañada por erosión ósea o infiltración de células inflamatorias visibles (figura 4c). Resulta interesante que la tinción de inmunofluorescencia mostró deposición de anticuerpos a lo largo de las superficies de cartílago y la activación de C3 en las membranas sinoviales en las articulaciones de los animales tanto tratados con un control como los tratados con bloqueante de C5.

Ejemplo 3 Efectos del tratamiento con bloqueante de C5 sobre las respuestas inmunológicas humoral y celular a la inmunización con colágeno

Las respuestas de los sistemas inmunológicos tanto humoral como celular resultan activadas tras la inmunización de ratones DBA/1 LacJ con colágeno II bovino. Los títulos anti-B-CII se incrementaron y los títulos de IgG anti-B-CII séricos en los ratones tratados con bloqueante de C5 fueron equivalentes a los de los ratones bajo tratamiento de control al someterlos a ensayo en los días 14, 28 y 42 tras la inmunización inicial B-CII (figura 6a). Los títulos de anticuerpo anti-B-CII de los ratones tratados tanto con un control como con mAb anti-C5 se incrementaron significativamente tras la reinmunización con B-CII y siguieron en la meseta resultante durante un periodo de tiempo prolon-
gado.

Con el fin de estudiar las respuestas de las células T, se cultivaron células de nódulos linfáticos (LNC) de los ratones tratados con bloqueante de C5 y tratados con un control añadiendo B-CII, B-CI, C-CII o únicamente en medio de cultivo. Las LNC de los ratones tratados con bloqueante de C5 o con un control respondieron específica e igualmente a B-CII con independencia del tratamiento recibido simultáneamente a la reinmunización con B-CII. C-CII, que comparte muchas regiones de homología conservadas con B-CII también provocó una respuesta moderada de células T al cultivarlas con LNC de ratones tratados con bloqueante de C5 o de ratones bajo tratamiento de control. Por el contrario, las LNC de ratones no inmunizados de edad correspondiente respondieron mal a todos los colágenos ensayados (figura 6b).

Los datos obtenidos en estos experimentos y los de los Ejemplos 1 y 2 demuestran claramente que la administración in vivo de un bloqueante de C5 evita el desarrollo y evolución de la IAIC y que este tratamiento no interfiere con las respuestas inmunológicas humoral y celular observadas tras inmunizar ratones con colágeno de tipo II bovino. Tanto las respuestas de células T colágeno-específicas como los títulos de anticuerpo anti-CII eran comparables en ratones tratados con bloqueante de C5 y en ratones bajo tratamiento de control reinmunizados con B-CII.

Ejemplo 4 Inhibición con bloqueante de C5 de la actividad del complemento

Se evaluaron los efectos de un bloqueante de C5 sobre la activación del complemento utilizando un modelo de derivación cardiopulmonar (CPB) en bucle cerrado para la circulación extracorpórea de sangre humana. Tal como se comenta exhaustivamente en la solicitud de patente US codependiente nº de serie 08/217.391, presentada el 23 de marzo de 1994, la circulación extracorpórea de sangre humana provoca la activación del complemento en la sangre.

El bloqueante de C5 era un anticuerpo monoclonal cultivado en ratones contra la proteína C5 humana purificada (Wurzner et al., Complement Inflamm. 8:328-340, 1991; mAb N19-8) que se propagó, se recuperó y se purificó como fracción IgG de líquido ascites de ratón (Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988; Current Protocols In Immunology, John Wiley & Sons, New York, 1992).

Para llevar a cabo estos experimentos, se extrajeron 300 ml de sangre humana completa de un donante humano sano y se extrajo adicionalmente una muestra de 1 ml como muestra de control para su análisis posterior. La sangre se diluyó a 600 ml mediante la adición de solución de lactato de Ringer que contenía 10 U/ml de heparina. Se añadió bloqueante de C5 (30 mg en PBS estéril) a la sangre diluida hasta una concentración final de 50 \mug/ml. En un experimento de control, se añadió un volumen igual de PBS estéril a la sangre diluida. A continuación, se utilizó la sangre para cebar el circuito extracorpóreo de una máquina CPB de oxigenador de membrana COBE EXCEL CML (Cobe BCT, Inc., Lakewood, CO) y se inició el circuito. El circuito se enfrió a 28ºC y se hizo circular durante 60 minutos. A continuación, se calentó el circuito hasta 37ºC y se hizo circular durante 30 minutos más, terminando entonces el experimento. Se extrajeron muestras en varios puntos del tiempo y se evaluó la actividad del complemento (figura 7).

En cada punto del tiempo se extrajo una alícuota de sangre completa, se dividió en 3 muestras y éstas A) se diluyeron 1:1 en paraformaldehído al 2% en PBS con el fin de evaluar los parámetros de activación de las plaquetas y de las células sanguíneas, tal como se comenta en la solicitud de patente US anteriormente mencionada nº de serie 08/217.391; B) se centrifugaron para eliminar todas las células y el plasma se diluyó 1:1 en solución estabilizadora de muestras Quidel (Quidel Corporation, San Diego, CA) y se almacenó a -80ºC, tras lo cual estas muestras congeladas de plasma diluido se descongelaron y se utilizaron para evaluar la producción de C3a y de C5b-9 (Ejemplos 5 y 6, respectivamente), y C) se centrifugaron con el fin de eliminar todas las células y el plasma no diluido se almacenó a -80ºC, después de lo cual dichas muestras congeladas de plasma se descongelaron y se llevaron a cabo ensayos hemolíticos tal como se ha descrito anteriormente.

Tal como puede observarse en la figura 7, la adición del bloqueante de C5 al circuito extracorpóreo resultó en una reducción del 95% en la capacidad de tisis celular del complemento en el plasma. La actividad del complemento siguió estando inhibida durante todo el curso (90 minutos) del experimento.

Ejemplo 5 Producción de C3a en presencia de un bloqueante de C5

Las muestras de plasma recién congeladas que previamente habían sido diluidas en solución estabilizadora de muestras Quidel tras la circulación CPB (ver el Ejemplo 4) se sometieron a ensayo para la presencia del producto C3a de división del complemento mediante la utilización del kit EIA C3a de Quidel (Quidel Corporation, San Diego, CA). Las mediciones se llevaron a cabo de acuerdo con las especificaciones del fabricante. El C3a liberado se expresó en ng/pocillo según se determinó por comparación con una curva estándar generada a partir de muestras que contenían cantidades conocidas de C3a humana.

Tal como se observa en la figura 8, la adición del bloqueante de C5 no presentó ningún efecto sobre la producción de C3a durante el experimento de CPB. La producción de C3a se incrementó drásticamente durante los últimos 30 minutos del experimento y se correlaciona con el calentamiento de la muestra.

Ejemplo 6 Prevención de la producción de C5b-9 con un bloqueante de C5

Se sometieron a ensayo para la presencia de complejo C5b-9 del complemento terminal humano con el kit C5b-9 de Quidel (Quidel Corporation, San Diego, CA), muestras recién congeladas de plasma que previamente habían sido diluidas, en solución estabilizadora de muestras de Quidel tras la circulación CPB (ver el Ejemplo 4). Se determinó la cantidad de C5b-9 soluble (sC5b-9) en cada muestra siguiendo las especificaciones del fabricante y se expresó en unidades arbitrarias de absorbancia (UA).

Tal como puede observarse en la figura 9, el bloqueante de C5 inhibió completamente la producción de C5b-9 durante la circulación extracorpórea de manera que los niveles de sC5b-9 durante el curso completo del ensayo eran equivalentes a los niveles en los puntos de control en el tiempo (t_{0}). Los resultados de este experimento y aquellos de los Ejemplos 4 y 5 muestran que la adición de un bloqueante de C5 a sangre humana sometida a circulación extracorpórea inhibe eficazmente tanto la actividad hemolítica del complemento (figura 7) como la producción de C5b-9 (figura 9), pero no la producción de C3a (figura 8).

Ejemplo 7 Farmacocinética de los mAb bloqueantes de C5

La duración in vivo de la acción del mAb BB5.1 y de un fragmento Fab' del mAb BB5.1 (preparado mediante procedimientos estándar) se determinó en ratones BALB/cByJ normales hembra (de una media de aproximadamente 20 g cada uno) obtenidos del Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME. Los ratones recibieron una sola inyección intravenosa (a 35 mg/kg de peso corporal) del mAb o fragmento Fab' del mAB (o un volumen igual de PBS como control). Las muestras de sangre se extrajeron del plexo retroorbital a las 1, 4, 24, 96 y 144 horas de la administración de PBS; a las 4, 16 y 24 horas de la administración del fragmento Fab' del mAb BB5.1 y a las 4, 24, 48, 72, 96 y 144 horas de la administración de mAb BB5.1 intacto.

La figura 10a muestra el curso temporal de la inhibición de la capacidad de Tisis celular del complemento en sangre de ratón (determinada mediante ensayo del suero obtenido de la sangre y diluido al 2,5% en ensayos hemolíticos, tal como se ha descrito anteriormente) tras la administración in vivo del mAb intacto, del fragmento Fab' o de PBS. Tal como se muestra en la figura, el mAb intacto inhibió casi completamente la actividad hemolítica de la sangre durante la totalidad del periodo de ensayo de 6 días. Sin embargo, el Fab' presentaba una vida media de aproximadamente 24 horas.

Además de los experimentos anteriores, al final del periodo de ensayo de 6 días, se sacrificó la totalidad de los ratones. Se recolectaron los riñones, pulmones e hígados y se examinaron de manera general, así como mediante examen microscópico de las secciones teñidas. Todos los órganos de los animales tratados con bloqueante de C5 presentaban la misma apariencia de que los extraídos de animales tratados con el control PBS. La apariencia general de estos ratones de ensayo y de control era también indistinguible previamente a la necropsia.

También se sometió a ensayo un mAb anti-C5 humano para las propiedades farmacocinéticas en sangre humana circulante, tal como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 4. Tal como se describe en el mismo, los efectos de inhibición de la hemólisis de este bloqueante de C5 se sometieron a ensayo a lo largo de un periodo de circulación de 90 minutos. Se muestran los resultados de estos ensayos en el gráfico de la figura 10b y muestran que el bloqueante de C5 esencialmente inhibió por completo la capacidad de Tisis celular de la sangre humana durante la totalidad del periodo de circulación de 90 minutos.

Los resultados de estos experimentos demuestran que dichos bloqueantes de C5 sobreviven en el flujo sanguíneo durante un periodo de tiempo sustancial, haciendo de esta manera que su administración periódica resulte conveniente.

Ejemplo 8 Preparación de un bloqueante de C5

Se preparó un mAb bloqueante de C5 adecuado para su utilización en la práctica de la presente invención de la manera siguiente.

Se inmunizaron ratones Balb/c tres veces mediante inyección intraperitoneal de proteína C5 humana (Quidel Corporation, San Diego, CA, nº de catálogo A403). La primera inyección contenía 100 \mug de proteína C5 en una emulsión de adyuvante completo de Freund, la segunda inmunización contenía 100 \mug de proteína C5 en una emulsión de adyuvante incompleto de Freund y la tercera inmunización eran 100 \mug de proteína en PBS. Los ratones se inyectaron a intervalos de aproximadamente 2 meses.

Las fusiones de esplenocitos con células de mieloma para producir hibridomas se llevaron a cabo esencialmente tal como se describe en Current Protocols in Immunology (John Wiley & Sons, New York, 1992, páginas 2.5.1 a 2.5.17). Un día antes de la fusión, a los ratones se les inyectó un refuerzo i.v. de 100 \mug de proteína C5. En el día de la fusión, se sacrificaron los ratones inmunizados y se extirparon los bazos. Se utilizaron las células de mieloma SP2/0-AG14 (ATCC CRL nº 1581) como pareja de fusión. Los cultivos de SP2/0-AG14 se dividieron el día anterior a la fusión con el fin de inducir una división celular activa. En las fusiones se utilizó una proporción de 1:10 (células de mieloma:esplenocitos).

Las células se fusionaron utilizando PEG 1450 en PBS sin calcio (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, nº de catálogo P-7181) y se sembraron en placas a una densidad comprendida entre 0,1 y 2,5 x 10^{5} células por pocillo. El día siguiente se inició la selección en medio EX-CELL 300 (JRH Biosciences, Lexena, KS, nº de catálogo 14337-78P) suplementado con suero de feto bovino (FBS) al 10% inactivado por calor; glutamina, penicilina y estreptomicina (GPS); y HAT (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, nº de catálogo H-0262). A continuación, las fusiones fueron alimentadas cada dos días con medio fresco suplementado con FBS, GPS y HAT. La muerte celular se observó tan sólo 2 días después de iniciar la selección y se observaron agrupaciones viables de células tan sólo 5 días después de iniciar la selección. Tras dos semanas de selección en HAT, se transfirieron los hibridomas supervivientes seleccionados para su estudio adicional a medio EX-CELL 300 suplementado con FBS, GPS y HAT (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO (nº de catálogo H-0137) durante 1 semana y seguidamente se cultivaron en medio EX-CELL 300 suplementado con FBS y con GPS.

Se cribaron los hibridomas para reactividad hacia C5 e inhibición de hemólisis mediada por el complemento 10 a 14 días después de la fusión y se mantuvieron por lo menos hasta haber analizado los resultados del cribado. El ensayo de cribado de la inhibición de la hemólisis era el ensayo de tisis de eritrocitos de pollo descrito anteriormente. El ensayo de cribado para la reactividad a C5 era una ELISA, que se llevó a cabo utilizando el protocolo siguiente.

Una alícuota de 50 \mul de una solución a 2 \mug/ml de C5 (Quidel Corporation, San Diego, CA) en tampón carbonato/bicarbonato sódico, pH 9,5, se incubó durante la noche a 4ºC en cada pocillo de ensayo de una placa de 96 pocillos (Nunc-Immuno F96 Polysorp, A/S Nunc, Roskilde, Dinamarca). A continuación, los pocillos se sometieron a una etapa de lavado (cada etapa de lavado consistía en tres lavados con TBST). Después, los pocillos de ensayo se bloquearon con 200 \mul de solución de bloqueo, BSA al 1% en TBS (BSA/TBS) durante 1 hora a 37ºC. Tras una etapa adicional de lavado, se incubó una alícuota de 50 \mul de sobrenadante de hibridoma en cada pocillo de ensayo durante 1 hora a 37ºC con una etapa posterior de lavado. Como anticuerpo secundario (de detección), se incubaron 50 \mul de una dilución 1:2.000 de IgG de cabra antirratón conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) en BSA/TBS en cada pocillo de ensayo durante 1 hora a 37ºC, seguido de una etapa de lavado. Siguiendo los procedimientos del fabricante, se disolvieron 10 mg de O-fenilenodiamina (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, nº de catálogo P-8287) en 25 ml de tampón fosfato-citrato (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, nº de catálogo P-4922) y se añadieron 50 \mul de esta solución de sustrato a cada pocillo con el fin de detectar la actividad de peroxidasa. Finalmente, con el fin de detener la reacción de detección de peroxidasa, se añadió a cada pocillo una alícuota de 50 \mul de ácido hidroclórico 3 N. La presencia de anticuerpos reactivos a C5 en los sobrenadantes de hibridoma se leyó mediante determinación espectrofotométrica de DO a 490 nm.

El sobrenadante de un hibridoma denominado 5G1.1 mostró un resultado positivo en la ELISA y una capacidad de tisis celular sustancialmente reducida del complemento presente en sangre humana normal en el ensayo de hemólisis de eritrocitos de pollo. Análisis adicionales revelaron que el anticuerpo 5G1.1 reduce la capacidad de Tisis celular del complemento presente en sangre humana normal de manera tan eficiente que, incluso cuando se encuentra presente a una concentración de aproximadamente la mitad de la concentración molar de C5 humana en el ensayo hemolítico, puede neutralizar casi completamente la actividad hemolítica sérica.

Se depositó el hibridoma 5G1.1 en la American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, 20852, Estados Unidos de América, el 27 de abril de 1994, y ha recibido la denominación HB-11625. Este depósito se realizó bajo el Tratado de Budapest sobre el reconocimiento internacional del depósito de microorganismos a los fines del procedimiento en materia de patentes (1977).

En la presente solicitud, se hace referencia a diversas publicaciones y exposiciones de patente. Las enseñanzas y exposiciones de la misma, en su totalidad, se incorporan en el presente documento como referencia en la presente solicitud, con el fin de describir más completamente el estado de la técnica a la que pertenece la presente invención.

Referencias

Abbink et al., 1992. Annals Rheumatic Dis 51, págs. 1123-1128.

Andersson y Holmdahl, 1990. Eur J Immunol 20, págs. 1061-1066.

Andersson et al., 1991. Inmunology 73, págs. 191-196.

Andersson et al., 1992. Immunogenetics 35, págs. 71-72.

Arnett, 1992. Cecil Textbook of Medicine, Wyngaarden et al. (editores). W.B. Saunders Company, Philadelphia, Capítulo 258, págs. 1508-1515.

Auda et al., 1990. Rheumatol Int 10, págs. 185-189.

Banerjee et al., 1988A. J Immunol 141, págs. 1150-1154.

Banerjee et al., 1988B. J Exp Med 167, págs. 832-839.

Banerjee et al., 1989. J Immunol 142, págs. 2237-2243.

Boissier et al., 1987. Annals Rheumatic Dis 46, págs. 691-700.

Brahn y Trentham, 1989. Cell Immunol 118, págs. 491-503.

Brodeur et al., 1991. Arthr Rheumat 34(12), págs. 1531-1537.

Cannon et al., 1990. Agents and Actions 29, págs. 315-323.

Cash y Klippel, 1994. New England J Med 330, págs. 1368-1375.

Chiocchia et al., 1990. J Immunol 145, págs. 519-525.

Chiocchia et al., 1991. Eur J Immunol 21, págs. 2899-2905.

Clackson et al., 1991. Nature 352, págs. 624-628.

Coligan et al. (eds.), 1992. Current Protocols In Immunology, John Wiley & Sons, New York.

Corvetta et al., 1992. Clinic Exp Rheumat 10, págs. 433-438.

David, 1992. Immunogenetics 35, págs. 69-70.

De Clerck et al., 1989. Clinic Exp Rheumat 7, págs. 485-492.

Drug Evaluations, Annual 1991. American Medical Association, 1990.

Durie et al., 1993. Science 261, págs. 1328-1330.

Elliot et al., 1993. Arthr Rheumat 36(12), págs. 1681-1690.

Fava et al., 1993. Clin Exp Immunol 94, págs. 261-266.

Feldmann et al., 1990. Annals Rheumat Dis 49(1), págs. 480-486.

Feldmann et al., 1991. Immunol Review 119, págs. 105-123.

Firestein et al., 1991. Arthr Rheumat 34(9), págs. 1094-1105.

Fong et al., 1994. Clin Exp Rheumat 12(1), págs. 55-58.

Frei et al., 1987. Mol Cell Probes 1, págs. 141-149.

Fujimori et al., 1993. Agents and Actions 39, págs. 42-48.

Gilman et al. (eds.), 1990. Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics 18ª Ed. Pergamon Press, Inc., New York.

Goldschmidt et al., 1990. Immunol 69, págs. 508-514.

Goldschmidt y Holmdahl, 1991. Eur J Immunol 21, págs. 1327-1330.

Griswold et al., 1988. Arthrit Rheumat 31(11), págs. 1406-1412.

Haber, 1992. Immunol Rev 130, págs. 189-212.

Haqqi et al., 1989. Immunogenet 29, págs. 180-185.

Harigai et al., 1993. Clinic Immunol Immunopathol 69(1), págs. 83-91.

Harlow y Lane, 1988. Antibodies. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York.

Heinz et al., 1989. Molecul Immunol 26(2), págs. 163-169.

Holmdahl et al., 1985. Scand J Immunol 22, págs. 295-306.

Holmdahl et al., 1986. Arthrit Rheumat 29(1), págs. 106-113.

Holmdahl et al., 1989. Clin Exp Rheumat 7(S-3), págs. 51-55.

Holmdahl et al., 1990. Scand J Immunol 31, págs. 147-157.

Hom et al., 1988. Eur J Immunol 18, págs. 881-888.

Hom et al., 1991. Agents and Actions 33, págs. 300-309.

Hom et al., 1992. Clinic Immunol Immunopath 62(1), págs. 56-65.

Hom et al., 1993. Immunological Inventigations 22(4), págs. 257-265.

Hong et al., 1979. J Immunol 122(6), págs. 2418-2423.

Inoue et al., 1993. Agents and Actions 39, págs. 187-194.

Jasin, 1989. Sem Arthrit Rheumat 18(4), págs. 86-90.

Jose et al., 1990. Annals Rheumat Dis 49, págs. 747-752.

Kabat y Mayer, 1961. Experimental Immunochemistry, 2ª Ed. Charles C. Thomas, Springfield, Illinois, págs. 135-139.

Kahle et al., 1992. Annals Rheumat Dis 51(6), págs. 731-734.

Kakimoto et al., 1988. J Immunol 140(1), págs. 78-83.

Kakimoto et al., 1992. Cellular Immunology 142, págs. 326-337.

Kleinau et al., 1989. Clin Exp Immunol 78, págs. 138-142.

Koch et al., 1994. J Clin Invest 94, págs. 1012-1018.

Liddell y Cryer, 1991. A Practical Guide to Monoclonal Antibodies, John Wiley & Sons, Chichester, West Sussex, England.

Lipsky, 1994. Harrison's Principles of Internal Medicine, 13ª Ed, Isselbacher et al. (ads). McGraw-Hill, Inc., New York, Capítulo 285, págs. 1648-1655.

Maeurer et al., 1992. Immunobiol 185, págs. 103-120.

Matsubara et al., 1991. Am J Pathol 138(5), págs. 1279-1291.

McCarty y Koopman, 1993. Arthritis and Allied Conditions, 12th Ed. Lea y Febiger, Philadelphia.

Moffat et al., 1989. Clin Exp Immunol 78, págs. 54-60.

Mollnes et al., 1986. Arthr Rheumat 29 (6), págs. 715-721.

Mollnes et al., 1988. Scand J Immunol 28, págs. 307-312.

Montz et al., 1990. Cellular Immunol 127, págs. 337-351.

Mori et al., 1992. J Exp Med 176, págs. 381-388.

Morgan et al., 1981. Arthrit Rheumat 24(11), págs. 1356-1362.

Morgan et al., 1988. Clin Exp Immunol 73, págs. 473-478.

Morrison, 1992. Annu Rev Immunol 10, págs. 239-265.

Moxley y Ruddy, 1985. Arthr Rheumat 28 (10), págs. 1089-1095.

Muller-Eberhard, 1988. Ann Rev Biochem 57, págs. 321-347.

Myers et al., 1989A. J Immunol 143(12), págs. 3976-3980.

Myers et al., 1989B. J Exp Med 170, págs. 1999-2010.

Myers et al., 1993. J Immunol 150(10), págs. 4652-4658.

Nagler-Anderson et al., 1986. Proc Natl Acad Sci. USA 83, págs. 7443-7446.

Nakajima et al., 1993. Clin Exp Immunol 92, págs. 328-335.

Nishikaku y Koga, 1993. Immunopharmacology 25, págs. 65-74.

Oleesky et al., 1991. Clin Exp Immunol 84, págs. 250-255.

Olmez et al., 1991. Scand J Rheumatol 20, págs. 183-189.

Olsen et al., 1991. Arthr Rheumat 34(2), págs. 187-191.

Osman et al., 1993. J Exp Med 177, págs. 387-395.

Peake et al., 1989. Clin Exp Immunol 78, págs. 49-53.

Peterman et al., 1993. J Immunol 151(11), págs. 6546-6558.

Physicians' Desk Reference 47ª Ed., 1993. Medical Economics Co., Inc., Montvale, NJ.

Piguet et al., 1992. Immunol 77, págs. 510-514.

Reichamnn et al., 1988. Nature 332, págs. 323-327.

Reife et al., 1991. Arthr Rheumat 34, págs. 776-781.

Remington's Pharmaceutical Sciences 17ª Ed., 1985. Mack Publishing Company, Philadelphia, PA.

Rodrigues et al., 1993. J Immunol 151, pp-6954-6961.

Roitt et al., 1988. Essential Immunology. 6ª Ed. Backwell Scientific Publications, Oxford, England..

Saura et al., 1992. Rheumat 12, págs. 141-146.

Seki et al., 1988. J Immunol 140(5), págs. 1477-1484.

Seki et al., 1992. J Immunol 148(10), págs. 3093-3099.

Shingu et al., 1994. British J Rheumat 33, págs. 299-301.

Smith et al., 1990. Int J Immunopharmac 12(2), págs. 165-173.

Spannaus-Martin et al., 1990. Am J Path 137(2), págs. 331-339.

Spinella y Stuart, 1992. Immunogenetics 35, págs. 73-74.

Spinella et al., 1991. Immunogenetics 34, págs. 23-27.

Terato et al., 1992. J Immunol 148(7), págs. 2103-2108.

The United States Pharmacopeia 22ª Ed., 1989. Mack Printing Co., Easton, PA.

Thompson et al., 1988. Clin Exp Immunol 72, págs. 20-25.

Thorbecke et al., 1992. Proc Natl Acad Sci. USA 89, págs. 7375-7379.

Trentham et al., 1977. J Exp Med 146, págs. 857-868.

Trentham et a., 1993. Science 261, págs. 1727-1730.

van Lent et al., 1992. Am J Path 140, págs. 1451-1461.

Ward and Zvaifler, 1971. J Clinical Invest 50, págs. 606-616.

Ward, 1975. Annals NYAcad Sci 256, págs. 169-176.

Watson y Townes, 1985. J Exp Med 162, págs. 1878-1891.

Watson et al., 1987. Arthrit Rheumat 30(4), págs. 460-465.

Williams et al., 1992A. Clin Exp Immunol 88, págs. 455-460.

Williams et al., 1992B. Proc Natl Acad Sci. USA 89, págs. 9784-9788.

Williams et al., 1994. Proc Natl Acad Sci. USA 91, págs. 2762-2766.

Winter y Milstein, 1991. Nature 349, págs. 293-299.

Wolos et al., 1993. J Immunol 151(1), págs. 526-534.

Wurzner et al., 1991. Complement Inflamm 8, págs. 328-340.

Yoo et al., 1988. J Exp Med 168, págs. 777-782.

Zvaifler, 1968. Univ Michigan Med Center J, págs. 234-237.

Zvaifler, 1969A. Annals NYAcad Sci 168 (1), págs. 146-160.

Zvaifler, 1969B. J Clinical Invest 48, págs. 1532-1542.

Zvaifler, 1974. Arthr Rheumat 17(3), págs. 297-305.

TABLA 1

		Número de extremidades
		afectadas por grupo*
Tratamiento	n	Día 0	Día 10	% de cambio	% de actividad hemolítica
Control	4	4 (1,0)	9 (2,3)	+125,0	95,6 \pm 3,8
Bloqueante de C5	6	8 (1,3)	7 (1,2)	-12,5	13,9 \pm 4,7
* los números entre paréntesis representan el número medio de articulaciones afectadas por ratón.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 2

	Número de extremidades
	afectadas por ratón
Ratón (tratamiento)	Día 0	Día 10	% de cambio	% de actividad hemolítica
nº 8 (control)	1 (RL)	2 (RL y RR)	+100	91,2
nº 2 (bloqueante de C5)	1 (FL)	1 (FL)*	0	22,4
nº 6 (control)	1 (RR)	2 (RR y RL)	+100	103,2
nº 5 (bloqueante de C5)	1 (RR)	1 (RR)	0	6,0
nº 1 (control)	1 (FL)	2 (FL y FR)	+100	92,4
nº 4 (bloqueante de C5)	1 (RL)	2 (FL y RL)	+100	9,2
nº 9 (control)\dagger	1 (RL)	2 (RR y RL)	+100	no sometido a ensayo
nº 3 (bloqueante de C5)\dagger	2 (FL y RR)	1 (FL)	-100	0,4
nº 7 (bloqueante de C5)\NAK	1 (FR)	1 (FR)	0	13,6
nº 10 (bloqueante de C5)\NAK	2 (RL y RR)	1 (RR)**	-100	32,0
* inflamación apenas detectable
** sólo 1 dedo del pie
\dagger los datos representan únicamente 8 días para los ratones nº 9 y nº 3
\NAK los ratones nº 7 y nº 10 no presentaban los controles correspondientes.

Claims (6)

1. Utilización de un anticuerpo monoclonal anti-C5 en la preparación de un medicamento para el tratamiento de la inflamación articular establecida en un paciente humano o no humano.

2. Utilización según la reivindicación 1, en la que el anticuerpo es el anticuerpo monoclonal de ratón BB5.1.

3. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el anticuerpo monoclonal anti-C5 se administra en una cantidad suficiente sustancialmente para inhibir la capacidad de lisis celular del complemento presente en un líquido derivado de sangre del paciente y/o en la que se administra en una cantidad suficiente sustancialmente para reducir el nivel de C5b-9 soluble presente en un líquido derivado de la sangre de un paciente tras la activación del complemento en ese líquido y/o en la que se administra en una cantidad suficiente sustancialmente para reducir el nivel de C5a presente en un líquido derivado de la sangre del paciente tras la activación del complemento en dicho líquido.

4. Utilización según la reivindicación 3, en la que el líquido derivado de sangre es suero.

5. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el anticuerpo monoclonal anti-C5 se administra en una cantidad suficiente para reducir la capacidad de lisis celular del complemento presente en el líquido sinovial de una articulación inflamada del paciente en por lo menos 10% y/o en la que se administra en una cantidad suficiente para reducir el nivel de C5b-9 soluble presente en el líquido sinovial en por lo menos 10% y/o en la que se administra en una cantidad suficiente para reducir el nivel de C5a presente en el líquido sinovial de una articulación inflamada del paciente en por lo menos 10%.

6. Utilización de un anticuerpo monoclonal anti-C5 según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que el anticuerpo anti-C5 monoclonal no interfiere sustancialmente con la división del componente C3 del complemento en el suero del paciente para formar C3a y C3b.