DE69534701T2

DE69534701T2 - Verfahren zur behandlung von entzündlichen gelenkerkrankungen

Info

Publication number: DE69534701T2
Application number: DE69534701T
Authority: DE
Inventors: Yi Wang; Louis Matis
Original assignee: Alexion Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Alexion Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1994-09-23
Filing date: 1995-09-21
Publication date: 2006-10-19
Anticipated expiration: 2015-09-22
Also published as: US20030175267A1; WO1996009043A1; DE69534701D1; CA2198706C; EP0777474A4; ES2252746T3; EP0777474A1; JPH10506113A; JP3971797B2; US20050226870A1; AU3729295A; US7279158B2; EP0777474B1; CA2198706A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Behandlung von entzündlichen Gelenkerkrankungen. Die Erfindung betrifft insbesondere die Verwendung von Blockern der Komplementkomponente C5 („C5-Blocker") als pharmazeutische Mittel bei der Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung von etablierter Gelenkentzündung.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
1. Das Komplementsystem
Das Komplementsystem wirkt in Verbindung mit anderen immunologischen Systemen des Körpers zur Verteidigung gegen das Eindringen von zellulären und viralen Pathogenen. Es gibt wenigstens 25 Komplementproteine, die in Form einer komplexen Sammlung von Plasmaproteinen und Membrancofaktoren vorkommen. Die Plasmaproteine (die auch in den meisten anderen Körperflüssigkeiten zu finden sind, wie z. B. in der Lymphe, dem Knochenmark, in der Synovialflüssigkeit und in der Cerebrospinalflüssigkeit) machen etwa 10 % der Globuline im Vertebratenserum aus. Die Komplementkomponenten erzielen ihre Immunabwehrwirkungen, indem sie in einer Reihe von komplexen aber präzisen enzymatischen Spaltungs- und Membranbindungsereignissen wechselwirken. Die hieraus resultierende Komplementkaskade führt zu der Produktion von Produkten mit Opsonin-, immunregulatorischen und lytischen Wirkungen.
Die Komplementkaskade kann über den klassischen Weg oder über den alternativen Weg ablaufen. Diese Wege teilen viele Komponenten, und, obwohl sie in ihren frühen Stufen voneinander abweichen, konvergieren beide und teilen die gleichen terminalen Komplementkomponenten, die für die Zerstörung der Zielzellen und -viren verantwortlich sind.
Der klassische Komplementweg wird typischerweise durch die Antikörpererkennung von und die -bindung an einer Antigenstelle auf einer Zielzelle initiiert. Dieser an die Oberfläche gebundene Antikörper reagiert nachfolgend mit der ersten Komponente des Komplements, C1. Das so gebundene C1 durchläuft eine Reihe autokatalytischer Reaktionen, die u.a. zur Induktion der proteolytischen Aktivität von C1 führen, die auf die Komplementkomponenten C2 und C4 wirken.
Dieses aktivierte C1 spaltet C2 und C4 in C2a, C2b, C4a und C4b. Die Funktion von C2b ist kaum verstanden. C2a und C4b kombinieren sich unter Ausbildung des C4b,2a-Komplexes, der eine aktive Protease darstellt, die als die klassische C3-Konvertase bekannt ist. C4b,2a wirkt, um C3 in C3a und C3b zu spalten. C3a und C4a sind beide relativ schwache Anaphylatoxine, die die Degranulation von Mastzellen induzieren können, was zur Freisetzung von Histamin und anderen Entzündungsmediatoren führt.
C3b hat mehrere Funktionen. Als Opsonin bindet es an Bakterien, Viren und andere Zellen und Partikel und markiert diese für die Entfernung aus dem Kreislauf. C3b kann auch mit C4b, C2a einen Komplex bilden, woraus C4b,2a,3b oder die klassische C5-Konvertase hervorgeht, welche C5 in C5a (ein weiteres Anaphylatoxin) und C5b spaltet. Die alternative C5-Konvertase ist C3b, Bb, C3b und führt dieselbe Funktion aus. C5b kombiniert sich mit C6, was zu C5,b,6 führt, und dieser Komplex kombiniert sich mit C7 unter Ausbildung des ternären Komplexes C5b,6,7. Der C5b,6,7-Komplex bindet C8 an der Oberfläche einer Zellmembran. Unter Bindung von C9 wird der vollständige Membran-Angriffskomplex (MAC) ausgebildet (C5b-9), der die Lyse von fremden Zellen, Mikroorganismen und Viren vermittelt.
Weitere Besprechungen des klassischen Komplementweges sowie eine ausführliche Beschreibung des alternativen Weges der Komplementaktivierung kann in einer Vielzahl von Veröffentlichungen gefunden werden, einschließlich z. B. Roitt, et al., 1988 und Muller-Eberhard, 1988.
II. Gelenkentzündung
Eine Vielzahl üblicher medizinischer Störungen weisen als übliches Element die Entzündung der Gelenke des Patienten auf. Alleine in den Vereinigten Staaten leiden Millionen von Patienten unter einer solchen Gelenkentzündung. Die Patienten, die hierunter leiden, sind häufig behindert, und die Kosten für die medizinische Versorgung von Patienten, die unter solchen Störungen leiden, sind signifikant. Obwohl eine Anzahl von Mitteln zur Behandlung von Gelenkentzündung zur Verfügung stehen und kontinuierlich neue Behandlungen verfügbar werden, ist keine von diesen so sicher und effektiv, wie es gewünscht wäre, und es gibt daher einen lange empfundenen Bedarf nach neuen Ansätzen und besseren Verfahren, um Gelenkentzündungen zu kontrollieren.
Klinisch geht die Gelenkentzündung einher mit Gelenksteifheit, -schmerz, -schwäche und manchmal mit Gelenkermüdung. Einheitlich ist, daß das Gelenk empfindlich und geschwollen und oft erythematös ist. Die Diagnose der inflammatorischen Natur der Gelenkerkrankung erfolgt häufig auf der Grundlage dieser typischen klinischen Erscheinung sowie anhand radiographischer Untersuchung und Aspiration und Untersuchung synovialer Gelenksflüssigkeit. Die Untersuchung der Gelenksflüssigkeit eines entzündeten Gelenks ergibt im allgemeinen eine Erhöhung verschiedener Entzündungsmarker, wie z. B. Leukozyten (einschließlich Neutrophiler), Antikörper, Zytokine, Moleküle der Zellanhaftung und Produkte der Komplementaktivierung (De Clerck et al., 1989, Heinz et al., 1989, Moffat et al., 1989, Peake et al., 1989, Brodeur et al., 1991, Firestein et al., 1991, Matsubara et al., 1991, Olsen et al., 1991, Oleesky et al., 1991, Jose et al., 1990, Zvaifler, 1968, Zvaifler, 1969a, Zvaifler, 1969b, Zvaifler 1974, Ward und Zvaifler, 1971, Ward, 1975, Moxley und Ruddy, 1985, Mollnes et al., 1986, Auda et al., 1990, Olmez et al., 1991, Kahle et al., 1992, Koch et al., 1994, Thorbecke et al., 1992, Saura et al., 1992, Feldman et al., 1990, Feldman et al., 1991, Fong et al., 1994, Harigi et al., 1993, Morgan et al., 1988, Shingu et al., 1994, Abbink et al., 1992 und Corvetta et al., 1992). Die radiographische Untersuchung von beeinträchtigten Gelenken ergibt im allgemeinen eine Schwellung des Weichgewebes und/oder erosive Veränderungen.
Eine Gelenkentzündung geht mit einer Gruppe von Erkrankungen einher, die medizinisch als Arthritiden (Arten von Arthritis) bezeichnet werden. Der Begriff „Arthritis" wird in der Medizin zur allgemeinen Beschreibung von Erkrankungen der Gelenke verwendet. Der Begriff wird allerdings auch verwendet, um bestimmte medizinische Bedingungen zu beschreiben, von denen die rheumatoide Arthritis (RA) das primäre Beispiel darstellt, die aus einer Vielzahl von verschiedenen pathologischen Manifestationen bestehen, einschließlich, ohne Beschränkung hierauf, der Gelenkerkrankung.
Die Diskussionen über Arthritis können daher Erkrankungen einschließen, wie z. B. RA, bei denen die Gelenkstörungen nur eine Facette der verschiedenen Pathologien, die mit der Krankheit einhergehen, darstellen. Die vorliegende Erfindung ist speziell auf die Gelenkstörungsaspekte dieser Erkrankungen gerichtet. Die Verfahren der Erfindung können allerdings auch auf die Pathologien, die nicht mit dem Gelenk in Verbindung stehen, positive Effekte haben. Z. B. kann die Anwendung der Verfahren gemäß der Erfindung zur Behandlung von etablierter Gelenkentzündung, die mit RA, Psoriaris, Lupus und anderen Erkrankungen verbunden ist, auch therapeutische Vorteile bereitstellen, die auf einige der anderen pathologischen Manifestationen dieser Erkrankungsstadien mit vielen Facetten einwirken, wie z. B. Gefäßentzündung und Nephritis (siehe z. B. Wurzner, et al., Complement Inflamm. 8:328-340, 1991, US-Anmeldung Nr. 08/217,391, eingereicht am 23. März 1994, US-Anmeldung Nr. 08/236,208, eingereicht am 2. Mai, 1994, und Sims, et al., US-Patent Nr. 5,135,916).
Es sollte bemerkt werden, daß die vorliegende Erfindung sich nicht auf alle Arten von Gelenkerkrankungen bezieht, sondern lediglich auf solche, die eine Entzündung einschließen.
Die Erfindung ist daher z. B. anwendbar bei der Behandlung von Osteoarthritis (OA) im späten Stadium, die eine entzündliche Gelenkerkrankung darstellt, im allgemeinen aber nicht bei der OA im frühen Stadium, die typischerweise keine signifikante entzündliche Komponente aufweist.
Ausführliche Diskussionen der Arthritiden können in einer Vielzahl von medizinischen Texten gefunden werden, einschließlich Arnett, 1992. Cecil Textbook of Medicine, Wyngaarden et al. (Hrsg.), W.B. Saunders Company, Philadelphia, Kapitel 258, Seiten 1508-1515, Lipsky, 1994. Harrison's Principles of Internal Medicine, 13. Aufl., Isselbacher et al. (Hrsg.), McGraw-Hill, Inc., New York, Kapitel 285, Seiten 1648-1655, und McCarty and Koopman, 1993. Arthritis and Allied Conditions, 12. Aufl., Lea und Febiger, Philadelphia. Die Gelenkentzündung geht mit einer Anzahl von lokalen und systemischen Krankheitsvorgängen einher, wie in diesen und anderen Texten detailliert diskutiert und unten besprochen wird.
Faktoren, die mit einer Gelenkentzündung einhergehen
Eine Gelenkentzündung ist ein komplexer Vorgang, der u.a. die Aktivierung von sowohl zellulären als auch humoralen Immunantworten einschließt.
Die zellulären Immunantworten umfassen die Infiltration durch weiße Blutzellen, hauptsächlich Neutrophiler (auch als polymorphonukleäre Zellen oder PMNs bezeichnet). Infiltrate von mononukleären weißen Blutzellen sind bei vielen entzündeten Gelenken ebenso üblich. Die infiltrierenden mononukleären Zellen, einschließlich der T-Lymphozyten (sowie die in dem Gelenk ansässigen Zellen, wie z. B. Synovialzellen, Fibroblasten und Endothelzellen) werden aktiviert und tragen zu der Produktion von multiplen Entzündungs-Zytokinen bei, einschließlich TNF-α, IL-1, IFN-γ, IL-2, IL-6, IL-8, GM-CSF, PDGF und FGF, wobei die beiden letzteren die Proliferation von synovialen Zellen stimulieren können.
Es wird angenommen, daß all diese Zytokine bei der Induzierung der Produktion einer Vielzahl von anderen inflammatorischen Faktoren sowie von verschiedenen anderen Mediatoren der Gewebeschädigung eine Rolle spielen. Diese Faktoren und Mediatoren der Schädigung umfassen Produkte des Arachidonsäuresoftwechsels (die in verschiedenen intrazellulären Signalübertragungsketten aktiv sind), reaktive Sauerstoffintermediate und degradative Enzyme, wie z. B. Kollagenase, Stromelysin und andere neutrale Proteasen, von denen alle zu der inflammatorischen Antwort und zu der Gewebezerstörung beitragen können.
Die zelluläre Infiltration in die Gelenkinnenhaut wird verstärkt durch die Hochregulierung von Molekülen der Zellhaftung, wie z. B. Selektinen, LFA-3 und von Angehörigen der ICAM-Familie Ig-ähnlicher Moleküle der Zellhaftung auf Zellen innerhalb des Gelenks. Diese Haftungsmoleküle fördern die Infiltration von aktivierten weißen Blutzellen in das beeinträchtigte Gelenk, in dem die Leukozyten-(einschließlich Lymphozyten-)Anhaftung, Migration und Aktivierung stimuliert wird.
Das humorale Immunsystem trägt ebenfalls zu der Gelenkentzündung bei. Bei Erkrankungen wie z. B. RA, JRA und OA (siehe unten) werden in den entzündeten Gelenken Antikörper produziert und erzeugen lokalisierte Immunkomplexe, die das Komplementsystem aktivieren können. Wie zuvor etwas genauer beschrieben wurde, können die aktivierten Komplementkomponenten zytolytische, zellaktivierende, anaphylatoxische und chemotaktische Effekte aufweisen.
Diese inflammatorischen Antworten mit vielen Faktoren führen zu einer Knorpelzerstörung und zu Knochenerosion, was letztlich zu der Gelenkdeformierung führt, die bei Patienten mit chronischer Gelenkentzündung zu sehen ist.
Angesichts der komplexen Natur der Gelenkentzündung, sind eine Vielzahl von Theorien auf dem Gebiet postuliert worden, um die relative Bedeutung der daran beteiligten Faktoren zu erklären, von denen sich viele widersprechen. Trotz der umfassenden Arbeit besteht auf dem Gebiet nach wie vor eine Kontroverse im Hinblick auf die relativen Rollen der zellulären und humoralen Immunsysteme bei der Gelenkentzündung, einschließlich hinsichtlich welche Rolle das Komplement bei einer solchen Entzündung spielt. Siehe z. B. Andersson und Holmdahl, 1990, Brahn und Trentham, 1989, Chiocchia et al., 1990, Chiocchia et al., 1991, Durie et al., 1993, Goldschmidt et al., 1990, Goldschmidt und Holmdahl, 1991, Holmdahl et al., 1985, Holmdahl et al., 1989, Holmdahl et al., 1990, Hom et al., 1988, Hom et al., 1992, Hom et al., 1993, Mori et al., 1992, Myers et al., 1989A, Nakajima et al., 1993, Osman et al., 1993, Peterman et al., 1993, Seki et al., 1988, Seki et al., 1992, Terato et al., 1992, Watson et al., 1987, und insbesondere die folgenden Berichte, die das Komplementsystem betreffen und/oder die relative Rolle der T-Zellen und der Komplementkomponenten bei der Gelenkentzündung: Andersson et al., 1991, Andersson et al., 1992, Banerjee et al., 1988B, Banerjee et al., 1989, David, 1992, Fava et al., 1993, Haggi et al., 1989, Kakimoto et al., 1988, Maeurer et al., 1992, Morgan et al., 1981, Moxley und Ruddy, 1985, Reife et al., 1991, Spinella et al., 1991, Spinella und Stuart, 1992, van Lent et al., 1992, Watson et al., 1987, Watson und Townes, 1985, und Williams et al., 1992A. Bis heute haben diese weitreichenden Untersuchungen nicht zu wirksamen Behandlungen für die etablierte Gelenkentzündung geführt, die auf einer Modulierung des Komplementsystems basieren und die insbesondere auf der Verwendung von C5-Blockern basieren.
Die unten in Beispiel 2 berichteten Untersuchungen der prophylaktischen Wirkungen von C5-Blockern wurden entwickelt, um zu ermitteln, ob C5 ein geeignetes und wirksames Ziel für die pharmakologische Modulierung des humoralen Immunsystems ist, um einer Gelenkentzündung vorzubeugen. Die überraschende Wirksamkeit von C5-Blockern bei der Vorbeugung des Ausbruchs einer Gelenkentzündung führte zu der Entwicklung und Ausführung der in Beispiel 1 berichteten Untersuchungen, bei denen C5-Blocker verwendet wurden, um eine etablierte Entzündung zu behandeln. Am Beginn dieser Experimente wurde vermutet, daß eine solche Behandlung wenig meßbaren Effekt auf etablierte Gelenkentzündungen haben würde, da angenommen wurde, daß C5 früh in dem Krankheitsprozeß von größerer Bedeutung ist, wenn die chemotaktische Aktivität von C5a die Infiltration von inflammatorischen Zellen auslösen würde. Es wurde des weiteren angenommen, daß die Einbeziehung von T-Zellen bei der etablierten Krankheit sich fortsetzen würde, um so auch in Abwesenheit von C5-Aktivität signifikante inflammatorische Stimuli bereitzustellen. Wie durch die Ergebnisse von Beispiel 1 gezeigt wird, war diese Erwartung nicht korrekt, da es sich zeigte, daß C5-Blocker bei der Hemmung und/oder Verringerung der Entzündung von Gelenken, die bereits entzündet waren, erstaunlich wirksam waren, während sie gleichzeitig die Ausbreitung der Entzündung zu nicht beeinträchtigten Gelenken verhinderten.
Krankheiten, die üblicherweise mit Gelenkentzündung einhergehen
Rheumatoide Arthritis (RA) und in der Jugend beginnende rheumatoide Arthritis (JRA) sind chronische multisystemische Krankheiten unbekannter Ursache. Die RA betrifft ungefähr 1 % der Bevölkerung, wobei Frauen üblicherweise dreimal häufiger betroffen sind als Männer. Der Ausbruch erfolgt am häufigsten im Verlaufe der vierten und fünften Lebensdekade. RA und JRA sind systemische Krankheiten, mit vielen pathologischen Manifestationen zusätzlich zu ihren Gelenkentzündungsaspekten. Bei der RA umfassen diese Manifestationen die RA-Vaskulitis (Entzündung der Blutgefäße), die nahezu jedes Organsystem befallen kann und eine Vielzahl von pathologischen Folgeerkrankungen auslösen kann, einschließlich Polyneuropathia, Hautulzeration und Viszeralinfarkt. Die pleuropulmonären Manifestationen umfassen Pleuritis, interstitielle Fibrose, pleuropulmonäre Knötchen, Pneumonitis und Arteritis. Andere Manifestationen umfassen die Entwicklung von entzündlichen Rheumaknötchen auf einer Vielzahl von periartikulären Strukturen, wie z. B. Extensoroberflächen, sowie auf dem Brustfell und den Meninges. Üblich sind Schwächung und Atrophie der Skelettmuskulatur.
Die Aspekte der Gelenkentzündung der RA präsentieren sich als persistierende inflammatorische Synovialitis, die üblicherweise periphere Gelenke in einer symmetrischen Verteilung einschließt. Im allgemeinen ist die komplexe intraartikuläre inflammatorische Antwort, die bei RA zu sehen ist, von der Art, die oben bei der allgemeinen Besprechung der Gelenkentzündung beschrieben wurde.
Viele Patienten mit systemischer Lupus-Erythematosis (SLE) entwickeln auch Gelenkentzündung, die als Lupus-Arthritis bezeichnet wird. Die SLE ist eine Autoimmunerkrankung unbekannter Ursache, bei der eine Vielzahl verschiedener Zellen, Gewebe und Organe durch pathogene Autoantikörper und Immunkomplexe geschädigt werden. Die klinischen Manifestationen der SLE sind viele und umfassen eine Vielzahl von maculopapulösen flüchtigen Hautausschlägen, Nephritis, Cerebritis, Vaskulitis, hämatologische Abnormalitäten, einschließlich Zytopenien und Gerinnungsstörungen, Perikarditis, Myokarditis, Pleuritis, gastrointestinale Symptome und die zuvor genannte Gelenkentzündung.
Osteoarthritis (OA) stellt die häufigste Gelenkerkrankung der Menschheit dar, und die Osteoarthritis des Knies ist als Ursache für chronische Behinderung in den entwickelten Ländern führend. Sie manifestiert sich durch Schmerz, Steifheit und Schwellung der betroffenen Gelenke. Der Gelenkknorpel, der für die entscheidensten mechanischen Funktionen des Gelenks verantwortlich ist, ist das Hauptzielgewebe der OA. Der Verfall des Gelenkknorpels wird bei der OA durch verschiedene Enzyme vermittelt, wie z. B. Metalloproteinasen, Plasmin und Cathepsin, die wiederum durch verschiedene Faktoren stimuliert werden, die ebenfalls als Entzündungsmediatoren wirken können. Diese Faktoren schließen Zytokine ein, wie z. B. Interleukin-1, welches dafür bekannt ist, daß es die pathogenen Knorpel- und Synovialproteasen aktiviert.
Die Identifizierung von übernormalen Niveaus an Immunglobulinen im Knorpel bei generalisierter OA und bei einigen OA-Patienten das Aufzeigen von Antikörpern, die für Kollagen vom Typ II spezifisch sind, liefern den Nachweis einer Rolle bei der Immunaktivierung in diesem Erkrankungsstadium (siehe z. B. Jasin, 1989). Die Beobachtung, daß OA selten monoartikulär bleibt, legt außerdem nahe, daß diese Krankheit eine systemische Störung von Gelenkknorpel darstellt. Während die Erkrankung fortschreitet, wird die synoviale Entzündung häufiger. Tatsächlich kann bei der OA im späten Stadium der histologische Beweis synovialer Entzündung so ausgeprägt sein, wie der in dem Synovium von Patienten mit mit RA einhergehender Gelenkentzündung.
Die Psoriasis-Arthritis ist eine chronische entzündliche Gelenkerkrankung, die 5 bis 8 % der Menschen mit Psoriasis betrifft. Ein signifikanter Anteil dieser Individuen (ein Viertel) entwickelt eine fortschreitend zerstörerische Krankheit. 25 % der Psoriarispatienten mit Gelenkentzündung entwickeln symmetrische Gelenkentzündung, die den Gelenkentzündungsmanifestationen der RA ähnelt, und über die Hälfte hiervon entwickeln anschließend verschiedene Grade an Gelenkzerstörung.
Weitere Krankheiten, die mit Gelenkentzündung einhergehen
Eine Vielzahl von anderen systemischen Krankheiten zeigen Gelenkentzündung als ein herausstechendes Merkmal der klinischen Präsentation.
Bei nicht weniger als einem Fünftel der Patienten mit entzündlicher Darmerkrankung tritt periphere Gelenkentzündung auf. Die Gelenkentzündung ist akut, geht mit Aufflammen der Darmerkrankung einher und manifestiert sich durch geschwollene, erythematöse, warme und schmerzende Gelenke. Die Synovialflüssigkeiten der hierunter Leidenden weisen ein akut inflammatorisches Exudat von zumeist Neutrophilen auf, und die Radiographien zeigen Schwellungen des Weichgewebes und Ergüsse.
Die Hepatitis B begleitende Synovialitis ähnelt der Serumkrankheit mit einem plötzlichen Einsetzen von Fieber und Knorpelentzündung. Im allgemeinen tritt eine symmetrische Entzündung der Gelenke auf, einschließlich Knie, Schulter, Handgelenk, Knöchel, Ellbogen und der Handgelenke. Die Immunkomplexe, die die Hepatitis-B-Antigene enthalten, liegen im Serum und im Synovium vor, was die Theorie unterstützt, daß die Synovialitis immunologisch vermittelt ist. Weitere virale Erkrankungen, die mit Gelenkentzündung einhergehen, umfassen die Röteln, die Infektion mit dem humanen Immunschwächevirus, Infektionen mit Coxsackie-Viren und mit Adenoviren.
Eine Immunkomplex-vermittelte Gelenkentzündung geht auch mit einer Darmbypass-Operation einher und eine Gelenkentzündung ist eine hervorstechende Manifestation der Whipple-Krankheit oder einer intestinalen Lipodystrophie, bei der Fieber, Ödeme, Serositis, Lymphadenopathie, Uveitis und cerebrale Entzündung begleitende Befunde sind. Darüber hinaus ist eine möglicherweise immunologisch bedingte Gelenkentzündung eine Folgeerkrankung, die verbunden ist mit infektiöser Endocarditis und mit bestimmten Spirochäten-Infektionen, wobei die Infektionen mit Borrelia burgdorferi, dem Verursacherorganismus der Lyme-Krankheit, am meisten zu beachten ist.
Das primäre Sjögren-Syndrom ist eine chronische, langsam fortschreitende Autoimmunerkrankung, die gekennzeichnet ist durch eine lymphozytische Infiltration der exokrinen Drüsen, was zu Xerostomie und trockenen Augen führt. Ein Drittel der Patienten präsentiert sich mit systemischen Manifestationen, die Vaskulitis, Nephritis, Mononeuritis multiplex und am häufigsten Gelenkentzündung einschließen.
Die Bechterew-Krankheit (AS) ist eine entzündliche Störung unbekannter Ursache, die primär das Achsenskelett betrifft, wenngleich auch periphere Gelenke befallen werden. Ihr Auftreten korreliert mit der Histokompatibilität vom Haplotyp HLA-B27, und die immunvermittelten Mechanismen werden weiter darin verwickelt durch erhöhte Serumniveaus von IgA und durch eine entzündliche Gelenkhistologie mit ähnlichen Merkmalen, wie sie bei den Gelenkentzündungsaspekten der RA gesehen werden. Demzufolge ist die Synovialflüssigkeit aus entzündeten peripheren Gelenken bei AS nicht distinkt verschieden von denen anderer entzündlicher Gelenkerkrankungen.
Die reaktive Arthritis (ReA) bezeichnet eine akute, nicht eitrige Gelenkentzündung, die eine Infektion an anderer Stelle im Körper verkompliziert. Es wird angenommen, daß die reaktive Arthritis immunologisch vermittelt ist. In diese Kategorie ist die Konstellation klinischer Befunde eingeschlossen, die häufig als Reiter-Syndrom oder Reiter-Krankheit bezeichnet wird. Zusätzlich zu der Gelenkentzündung betrifft dieses Syndrom die Haut, die Augen, die Schleimhäute und weniger häufig das Herz, die Lungen und das Nervensystem. Das Reiter-Syndrom kann auf Infektionen der Eingeweide mit einer von mehreren Shigella-, Salmonella-, Yersinia- und Campylobacter-Arten folgen und auf Genitalinfektionen mit Chlamydia trachomatous. Die Histologie der Gelenke, die von diesem Syndrom betroffen sind, ist ähnlich zu der, die bei anderen Arten von Gelenkentzündungen zu sehen ist. Die Gelenkentzündung ist üblicherweise recht schmerzhaft, und Gelenkergüsse mit Spannung sind nicht unüblich, insbesondere im Knie. Die Gelenkenzündung ist üblicherweise asymmetrisch und additiv, wobei eine Einbeziehung neuer Gelenke über einen Zeitraum von wenigen Tagen bis mehreren Wochen auftritt.
III. Gängige Therapien
Die gängigen Therapien für die verschiedenen Arten von Gelenkentzündung, die oben diskutiert wurden, umfassen die Verabreichung von anti-inflammatorischen Arzneistoffen, wie z. B. nicht-steroidale Arzneistoffe, einschließlich Aspirin, und nicht spezifisch immunsuppressive Arzneistoffe, wie z. B. Goldverbindungen, Corticosteroide, Penicillamin, Hydroxychloroquin, Methotrexat, Azathioprin, Alkylierungsmittel, wie z. B. Cyclophosphamid und Sulfasalazin. Die Verabreichung jedes dieser Mittel ist manchmal verbunden mit schweren Nebenwirkungen und Toxizitäten. Patienten, die bestimmte dieser Behandlungen empfangen, sind auch den Gefah ren einer opportunistischen Infektion ausgesetzt und einem erhöhten Risiko von Neoplasie, die mit allgemeiner Immunsuppression einhergeht. Zusätzlich zu den oben zitierten medizinischen Schriften können Erörterungen von Arzneistoffen, die verwendet werden, um etablierte Gelenkentzündungen zu behandeln, gefunden werden in Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics 18. Aufl., Gilman et al. (Hrsg.) 1990, Pergamon Press Inc., New York, Kapitel 26, Seiten 638-681, Physician's Desk Reference 47. Aufl., 1993, Medical Economics Co., Inc., Montvale, NJ, The United States Pharmacopeia 22. Aufl., 1989, Mack Printing Co., Easton, PA, Drug Evaluations Annual 1991, 1990, American Medical Association, Milwaukee, WI, und Cash und Kippel, 1994, N. Eng. J. Med. 330, Seiten 1368-1375.
Ergänzend zu pharmakologischen Behandlungen kann eine Erleichterung der Symptome der Gelenkentzündung manchmal mit warmen oder kalten Umschlägen erreicht werden. Ein operativer Eingriff unter Anwendung von Verfahren zur Sehnenentspannung und/oder von Verfahren des Gelenkaustauschs ist häufig der letzte Ausweg zur Behandlung von chronischer Gelenkentzündung. Eine solche orthopädische Operation ist verbunden mit erhöhter Infektion, und Prothesen haben eine begrenzte Lebensdauer.
Die neuen therapeutischen Ansätze, die gegenwärtig entwickelt werden, schließen Versuche ein, die verschiedenen Elemente der zellulären Immunantwort, die zu der inflammatorischen Kaskade beitragen, die in entzündeten Gelenken vorliegt, anzusprechen. Diese Ansätze umfassen die Verabreichung von therapeutischen Zubereitungen, einschließlich von Anti-T-Zell- und/oder Anti-Zytokin-Mitteln (siehe z. B. Banerjee et al., 1988A, Cannon et al., 1990, Chiocchia et al., 1991, Elliot et al., 1993, Fava et al., 1993, Fujimori et al., 1993, Griswold et al., 1988, Hom et al., 1988, Hom et al., 1991, Hom et al., 1993, Inoue et al., 1993, Kakimoto et al., 1992, Kleinau et al., 1989, Myers et al., 1989b, Myers et al., 1993, Nagler-Anderson et al., 1986, Nishikaku und Koga, 1993, Petermann et al., 1993, Piguet et al., 1992, Smith et al., 1990, Spannaus-Martin et al., 1990, Thompson et al., 1988, Trentham et al., 1993, Williams et al., 1992b, Williams et al., 1994, und Wolos et al., 1993). Annals of the rheumatic diseases, Band 51, herausgegeben 1992, Seiten 1123-1128 betrifft den relativen Beitrag des Kontakts und der Komplementaktivierung zu entzündlichen Reaktionen in arthritischen Gelenken. Comple, inflammation, 1991, 8, 328-340 offenbart die Identifizierung und Charakterisierung von zwei mAbs gegen C5 und einen gegen C6. Letter to the Editor, Immunogenetics, 35. 71-72, 1992 diskutiert eine angenommene Beziehung zwischen der Komplementkomponente C5 und Kollagen-induzierter Arthritis. Der Letter umreißt die widersprüchlichen Ergebnisse solcher Untersuchungen. US 5,173,499 offenbart Verbindungen, die das Komplement hemmen. Insbesondere offenbart US 5,173,499 ein kleines Molekül, das die proteolytische Verarbeitung von C5 hemmt. US 5,135,916 betrifft Inhibitoren des C5b-9-Komplexes, insbesondere ein hemmendes Protein mit 18 kD, das auf Erythrozyten exprimiert wird. PCT/US95/05688 offenbart die Verwendung von monoklonalen C5-Antikörpern, insbesondere von 5G1.1 mAb zur Behandlung von entzündlichen Bedingungen, die eine Überaktivierung des Komplementsystems umfassen. WO 9525540 offenbart die Verwendung von Anti-C5-Antikörpern, um die Fehlfunktion der Immun- und hämostatischen Systeme zu reduzieren, die mit extrakorporalen Kreislaufverfahren verbunden sind, wie z. B. ein Herz-Lungen-Umgehungsverfahren. WO 95/23856 offenbart chimere Komplement-Inhibitorproteine, die eine erste funktionelle Domäne umfassen, die eine C3-hemmende Aktivität aufweist, und eine zweite funktionelle Domäne, die eine C5b-9-hemmende Aktivität aufweist. US 94/05285 offenbart die Verwendung von Komplementkomponenten bei der Behandlung von Bedingungen, die eine Überaktivierung des Komplements mit sich bringen. PCT/US93/07406 betrifft sCR1 und die Verwendung davon bei der Behandlung von Entzündung. Die Beispiele darin betreffen die Hemmung der Hämolyse unter Verwendung von CR1-Isoformen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Im Hinblick auf das Voranstehende ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen neuen Ansatz für die Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von etablierter Gelenkentzündung bereitzustellen.
Die Erfindung stellt Verfahren bereit, die die Verwendung von Blockern der Komplementkomponente C5 einschließen, welche monoklonale Anti-C5-Antikörper sind, als pharmazeutische Mittel, um die therapeutische Behandlung von etablierter Gelenkentzündung zu erreichen. Die C5-Blocker werden Tieren verabreicht, z. B. Menschen, die wenigstens ein entzündetes Gelenk haben. Die Blocker können systemisch oder lokal verabreicht werden. Sie erreichen eine Verringerung oder Stabilisierung der Entzündung der Gelenke, die bereits entzündet sind und verhindern die Ausbreitung der Entzündung auf nicht betroffene Gelenke.
Ein „C5-Blocker" ist, wie es hier verwendet wird, eine Verbindung, die unmittelbar mit C5, C5a und/oder C5b wechselwirkt, d.h. eine Verbindung, die eine dieser Komplementverbindungen unmittelbar bindet oder unmittelbar modifiziert (d.h. durch eine unmittelbare chemische Reaktion), um so die Ausbildung und/oder die physiologische Funktion von C5a und/oder C5b zu hemmen. Vorzugsweise werden die Ausbildung und/oder die physiologischen Wirkungen von sowohl C5a als auch C5b durch den C5-Blocker inhibiert.
Die direkte Wechselwirkung mit C5, C5a und/oder C5b hat den entscheidenden Vorteil, daß andere Komponenten der Komplementkaskade intakt gelassen werden können. Insbesondere können die Opsonisierungsfunktionen, die einhergehen mit der Aktivierung der Komple mentkomponente C3 durch eine C3-Konvertase, um C3a und C3b zu liefern, intakt gelassen werden, um die fortgesetzte Entfernung von fremden Partikeln und Substanzen aus dem Körper durch die Wirkung von C3b zu ermöglichen. Die am meisten bevorzugten C5-Blocker sind diejenigen, die von diesem Typ sind, d.h. diejenigen, die die C3b-Funktion nicht beeinträchtigen. Wie anhand der unten dargestellten Beispiele gezeigt wird, konnte gemäß der vorliegenden Erfindung überraschender Weise herausgefunden werden, daß die Behandlung mit C5-Blockern, die monoklonale Anti-C5-Antikörper sind, das Fortschreiten der Erkrankung an einem entzündeten Gelenk stoppen und in vielen Fällen wenigstens teilweise umkehren wird, während gleichzeitig dem Fortschreiten der Gelenkentzündung zu nicht betroffenen Gelenken vorgebeugt wird. Ausgehend von dem vorherigen Verständnis auf dem Gebiet im Hinblick auf die Rolle des zellulären Immunsystems bei der Gelenkentzündung (siehe oben) hätte man nicht erwartet, daß ein C5-Blocker, der ein monoklonaler Anti-C5-Antikörper ist, eine solche deutlich vorteilhafte Wirkung auf etablierte Gelenkentzündung haben würde.
Die begleitenden Figuren, die hier eingeschlossen sind und die einen Teil der Spezifikation darstellen, illustrieren bestimmte Aspekte der Erfindung und dienen gemeinsam mit der Beschreibung der Erklärung der Grundsätze der Erfindung. Selbstverständlich sind sowohl die Figuren als auch die Beschreibung lediglich erklärend zu verstehen und sind für die Erfindung nicht beschränkend.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
Die 1a-c sind mikrophotographische Aufnahmen von mit Hämatoxylin und Eosin gefärbten Gelenken, die die Verwendung eines C5-Blockers zum Stoppen der Progression einer etablierten Gelenkentzündung veranschaulichen. 1a zeigt ein Pfotengelenk einer normalen Maus, 1b zeigt ein anfänglich betroffenes Pfotengelenk einer mit Kontrolle behandelten Maus, wobei das Gelenk eine umfangreiche Knochenerosion zeigt mit schwerer inflammatorischer Zellinfiltration und mit einer Verdickung der Synovialmembran, und 1c zeigt ein anfänglich betroffenes Pfotengelenk einer mit einem C5-Blocker behandelten Maus, das eine erhaltene Gelenkstruktur zeigt mit einem gewissen Grad an Synovialmembranverdickung und mit einem überraschenden Fehlen von polymorphonukleärer Zellinfiltration im Vergleich mit dem anfänglich betroffenen Gelenk aus der Kontrollgruppe (1b).
Die 2a-b sind graphische Darstellungen, die die Fähigkeit eines C5-Blockers darstellen, das Fortschreiten der Pathologie eines entzündeten Gelenks zu stoppen. 2a zeigt einen Vergleich von mittleren Gelenkentzündungs(JI)-Indexwerten. Die Daten repräsentieren den mittleren JI-Index +/– Standardfehler. Die ausgefüllten Kreise sind die mit C5-Blocker behandelten Mäuse (n = 6). Die nicht ausgefüllten Kreise sind die mit Kontrolle behandelten Mäuse (n = 4). 2b zeigt einen Vergleich der Pfotendicke von anfänglich betroffenen Gelenken. Nach dem Ausbruch der Gelenkentzündung erhöhte sich die Pfotendicke der Kontrolle im Vergleich mit den behandelten oder normalen (N) Pfoten signifikant. Die Daten repräsentieren die mittlere Dicke +/– SE. Die ausgefüllten Kreise sind die mit C5-Blocker behandelten Mäuse (n = 8). Die nicht ausgefüllten Kreise sind die mit Kontrolle behandelten Mäuse (n = 4).
Die 3a-e sind graphische Darstellungen der Pfotendicke gegen die Zeit für mit C5-Blocker behandelte und mit Kontrolle behandelte Mäuse. Die 3a-d zeigen Messungen von anfänglich betroffenen Pfoten von gepaarten Tieren. 3e zeigt Messungen von anfänglich betroffenen Pfoten von zwei ungepaart behandelten Tieren und die mittleren Kontrollmessungen aus 2b.
Die 4a-c sind mikrophotographische Aufnahmen von mit Hämatoxylin und Eosin gefärbten Gelenken, die die Verwendung eines C5-Blockers zur Verbeugung des Ausbruchs einer Gelenkentzündung darstellen. 4a zeigt ein Pfotengelenk einer normalen Maus, 4b zeigt ein betroffenes Pfotengelenk von einer mit Kontrolle behandelten Maus, bei dem eine inflammatorische Zellinfiltration, eine Verdickung der Synovialmembran und eine Knochenerosion durch den sich ausdehnenden Synovialpannus sichtbar sind, und 4c zeigt ein typisches Pfotengelenk von einer mit C5-Blocker behandelten Maus, das lediglich eine subklinische Verdickung der Synovialmembran zeigt.
5 zeigt, daß die Behandlung mit einem C5-Blocker einer Gelenkentzündung vorbeugt. 5a ist ein Vergleich der Inzidenz von Kollagen-induzierter Gelenkentzündung bei mit C5-Blocker behandelten Mäusen (n = 9) und bei einem Pool von Mäusen, die mit zwei verschiedenen Kontrollbehandlungen behandelt wurden (n = 10). Die Daten repräsentieren die Gesamt-(Total-)Inzidenz von Gelenkentzündung, die innerhalb von zwei Monaten nach dem Beginn der Behandlung zu sehen war. 5b ist ein Vergleich der serumhämolytischen Aktivität von mit C5-Blocker behandelten Mäusen (n = 5) und von mit Kontrolle behandelten Mäusen (n = 3) zwei Wochen nach dem Behandlungsbeginn.
6 zeigt die Wirkungen der C5-Blocker-Behandlung auf kollagenspezifische humorale und zelluläre Antworten. 6a wurde erstellt, indem Serumproben analysiert wurden, die aus mit C5-Blocker behandelten (n = 4) oder mit Kontrolle behandelten Mäusen (n = 4) zu dem angegebenen Zeitpunkt nach der CII-Immunisierung erhalten wurden. Die Proben wurden in einem ELISA-Assay auf Anti-B-CII-IgG analysiert. Der Anti-B-CII-Antikörperindex repräsentiert das Verhältnis der optischen Dichten, die aus positivem Serum und aus negativen Sera erhalten wurden. 6b wurde erstellt, indem Lymphknoten-T-Zellen (5 × 10⁵) in vitro mit 20 μg/ml B-CII, C-CII, B-CI oder nur mit Medium in der Anwesenheit von 5 × 10⁵ mit Mitomycin C behandelten syngenetischen Milzzellen über insgesamt vier Tage kultiviert wurden, worauf folgend die Zellen 18 Stunden vor der Ernte mit ³H-Thymidin gepulst wurden.
7 zeigt die Ergebnisse von hämolytischen Assays, die eine Hemmung von Komplementaktivität demonstrieren, die mit menschlichem Blut verbunden ist, das nach einer Behandlung mit einem C5-Blocker durch einen extrakorporalen Kreislauf zirkuliert wird. Die Assays wurden vor der Zugabe des Blockers oder dem Beginn des CPB-Kreislaufs („Pre Tx") durchgeführt unter Verwendung von unverdünntem Blut („undil") und verdünntem Blut („dil") wie in Beispiel 4 beschrieben. Die Proben verdünnten Blutes, zu welchen der Blocker zugegeben worden war („Post Tx"), wurden nach dem Start des CPB-Kreislaufs zu den angegebenen Zeiten untersucht.
8 zeigt die Ergebnisse der Untersuchungen der Niveaus der Komplementkomponente C3a und demonstriert, daß die Bildung von Komplementkomponente C3a in humanem Vollblut, das durch einen extrakorporalen Kreislauf zirkuliert, durch den Zusatz eines C5-Blockers zu einem solchen Vollblut nicht gehemmt wird. Die Untersuchungen wurden vor der Zugabe des Blockers oder dem Beginn des CPB-Kreislaufs („Pre Tx") durchgeführt unter Verwendung unverdünnten Blutes („undil") und verdünnten Blutes („dil") wie in Beispiel 5 beschreiben. Die Proben verdünnten Blutes, zu denen der Blocker zugegeben worden war („Post Tx"), wurden nach dem Start des CPB-Kreislaufs zu den angegebenen Zeiten untersucht.
9 zeit die Ergebnisse von Untersuchungen der Niveaus von löslichem C5b-9 (sC5b-9) in menschlichem Blut, das durch einen extrakorporalen Kreislauf zirkuliert und demonstriert, daß die Zugabe eines C5-Blockers zu solchem Vollblut die Ausbildung der terminalen Komplementanordnung C5b-9 hemmt. Die Untersuchungen wurden vor der Zugabe des Blockers oder dem Beginn des CPB-Kreislaufs („Pre Tx") durchgeführt unter Verwendung von unverdünntem Blut („undil") und verdünntem Blut („dil"), wie in Beispiel 6 beschrieben. Die Proben verdünnten Blutes, zu denen der Blocker zugegeben worden war („Post Tx") wurden nach dem Start des CPB-Kreislaufs zu den angegebenen Zeiten untersucht.
Die 10a-b zeigen pharmakokinetische Analysen der Reduzierung der Zellysefähigkeit von Mäuseblut (10a) oder von extrakorporal zirkulierendem Humanblut (10b) nach der Behandlung mit verschiedenen C5-Blockern. Der C5-Blocker B ist der monoklonale Antikörper BB5.1, der C5-Blocker F ist ein Fab'-Fragment des monoklonalen Antikörpers BB5.1, der C5-Blocker N ist der monoklonale Antikörper N19-8.
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Wie oben diskutiert, betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Behandlung von etablierter Gelenkentzündung durch die Verabreichung eines C5-Blockers, der ein monoklonaler Anti-C5-Antikörper ist, oder einer Kombination von C5-Blockern an einen Patienten, der einer solchen Behandlung bedarf. „Etablierte Gelenkentzündung" bedeutet hierin, daß der Patient zu dem Zeitpunkt, zu dem die Behandlung begonnen wird, wenigstens ein entzündetes Gelenk aufweist.
Solche C5-Blocker umfassen Antikörper, die unmittelbar mit C5, C5a und/oder C5b wechselwirken, um so die Ausbildung von und/oder die physiologische Funktion von C5a und/oder C5b zu hemmen. Vorzugsweise hemmt der oder hemmen die C5-Blocker, welcher) ein monoklonaler Anti-C5-Antikörper ist/sind, sowohl die Ausbildung von und/oder die physiologische Funktion von C5a als auch von C5b.
Die Konzentration und/oder physiologische Aktivität von C5a und C5b in einer Körperflüssigkeit kann nach auf dem Gebiet wohl bekannten Verfahren gemessen werden. Für C5a umfassen solche Verfahren Chemotaxisuntersuchungen, RIAs oder ELISAs (siehe z. B. Ward und Zvaifler, 1971, Jose et al., 1990, Wurzner et al., 1991). Für C5b können hämolytische Assays oder Assays für lösliches C5b-9, wie hierin besprochen, verwendet werden. Andere auf dem Gebiet bekannte Assays können auch eingesetzt werden. Unter Einsatz von Assays dieser oder anderer geeigneter Art kann unter jetzt bekannten oder nachfolgend identifizierten C5-Blockerkandidaten eine Auslese durchgeführt werden, um 1) Verbindungen zu identifizieren, die bei der Ausführung der Erfindung nützlich sind, und 2) die geeigneten Dosierungsniveaus solcher Verbindungen zu bestimmen. Die Beispiele 2, 4 und 6-8 beschreiben die Verwendung von hämolytischen und löslichen C5b-9-Assays mit C5-Blockern, die monoklonale Antikörper umfassen.
Die Blocker, die C5a betreffen werden vorzugsweise in Konzentrationen verwendet, die eine wesentliche Verringerung (d.h. eine Verringerung um wenigstens etwa 25 %) der C5a-Niveaus liefern, die in wenigstens einer von Blut abgeleiteten Flüssigkeit des Patienten, z. B. Blut, Plasma oder Serum, im Anschluß an die Aktivierung des Komplements innerhalb der Flüssigkeit vorliegen. Alternativ werden sie in Konzentrationen verwendet, die eine wenigstens etwa 10%-ige Verringerung der C5a-Niveaus, die in der Synovialflüssigkeit eines entzündeten Gelenks vorligen, liefern. Gleichsam werden Blocker, die C5b betreffen, vorzugsweise in Konzentrationen verwendet, die eine wesentliche Verringerung (d.h. eine Verringerung um wenigstens etwa 25 %) der C5b-Niveaus liefern, die in wenigstens einer von Blut abgeleiteten Flüssigkeit des Patienten im Anschluß an die Aktivierung des Komplements innerhalb der Flüssigkeit vorliegen. Alternativ werden sie in Konzentrationen verwendet, die eine wenigstens etwa 10%-ige Verringerung der C5b-Niveaus liefern, die in der Synovialflüssigkeit eines entzündeten Gelenks vorliegen. Im Falle von C5b können solche Konzentrationen leicht bestimmt werden, indem man die Zellysefähigkeit (d.h. die hämolytische Aktivität) des in der Flüssigkeit vorliegenden Komplements mißt oder die Niveaus des in der Flüssigkeit vorliegenden löslichen C5b-9 (siehe z. B. unten Beispiel 6). Dementsprechend ist eine bevorzugte Konzentration für einen C5-Blocker, der C5b betrifft, eine, die zu einer wesentlichen Verringerung (d.h. zu einer Verringerung um wenigstens etwa 25 %) der Zellysefähigkeit des in wenigstens einer der von Blut abgeleiteten Flüssigkeiten des Patienten vorliegenden Komplements führt. Die Verringerungen der Zellysefähigkeit des in Körperflüssigkeiten des Patienten vorliegenden Komplements kann mit auf dem Gebiet wohlbekannten Verfahren gemessen werden, z. B. mit einem konventionellen hämolytischen Assay, wie z. B. dem Hämolyse-Assay, das von Kabat und Mayer, 1961, Seiten 135-139 beschrieben wurde, oder mit einer konventionellen Abwandlung dieses Assays, wie z. B. mit dem Hühnererythrozyten-Hämolyseverfahren, das unten beschrieben wird.
Bevorzugte monoklonale Anti-C5-Antikörper sind relativ spezifisch und blockieren nicht die Wirkungen von frühen Komplementkomponenten. Insbesondere werden solche bevorzugten Mittel die Opsonisierungsfunktionen, die mit der Komplementkomponente C3b verbunden sind, nicht wesentlich beeinträchtigen, dessen Funktionen ein Mittel zur Beseitigung von fremden Partikeln und Substanzen aus dem Körper liefert.
C3b wird durch die Spaltung von C3 gebildet, was durch klassische und/oder alternative C3-Konvertasen durchgeführt wird und zu der Bildung von sowohl C3a als auch C3b führt. Um die mit C3b verbundenen Opsonisierungsfunktionen nicht zu beeinträchtigen, wechselwirken bevorzugte C5-Blocker daher nicht wesentlich mit der Spaltung der Komplementkomponente C3 in einer Körperflüssigkeit des Patienten (z. B. dem Serum) in C3a und C3b. Eine solche Wechselwirkung mit der Spaltung von C3 kann detektiert werden durch die Messung der Körperflüssigkeitsniveaus von C3a und/oder C3b, die in equimolaren Verhältnissen durch die Wirkungen der C3-Konvertasen produziert werden. Solche Messungen sind informativ, da die Niveaus von C3a und C3b reduziert werden (im Vergleich zu einer entsprechenden Probe ohne den C5-Blocker, der ein monoklonaler Anti-C5-Antikörper ist) wenn die Spaltung durch einen C5-Blocker gestört wird.
In der Praxis ist die quantitative Messung einer solchen Spaltung im allgemeinen genauer, wenn sie durch die Messung der C3a-Niveaus in einer Körperflüssigkeit durchgeführt wird, als durch die der C3b-Niveaus in einer Körperflüssigkeit, da C3a in der Flüssigkeitsphase verbleibt, während C3b schnell entfernt wird. Die C3a-Niveaus in einer Körperflüssigkeit können nach einem auf dem Gebiet wohl bekannten Verfahren gemessen werden, wie z. B. unter Verwendung eines im Handel erhältlichen C3a-EIA-Kits, z. B. das, das von der Quidel Corporation, San Diego, CA verkauft wird, gemäß den Herstellerspezifikationen. Insbesondere bevorzugte monoklonale C5-Antikörper führen im wesentlichen zu keiner Reduzierung der C3a-Niveaus in der Körperflüssigkeit nach einer Komplementaktivierung, wenn sie in einem solchen Assay getestet werden.
Die C5-blockierenden Mittel sind monoklonale Antikörper. Hybridome, die monoklonale Antikörper (mAbs) produzieren, die mit der Komplementkomponente C5 reagieren, können erhalten werden, indem man die Komplementkomponente C5, C5a und/oder C5b, vorzugsweise in aufgereinigter Form, als Immunogen verwendet.
Die am meisten bevorzugten Antikörper werden die Spaltung von C5 unter Ausbildung von C5a und C5b verhindern, wodurch die Ausbildung der anaphylatoxischen Aktivität, die mit C5a verbunden ist, verhindert wird, und wodurch die Anordnung des mit C5b assoziierten Membran-Angriffskomplexes verhindert wird. Wie oben besprochen werden diese C5-blockierenden Antikörper bei einer insbesondere bevorzugten Ausführungsform die Opsonisierungsfunktion, die mit der Wirkung von C3b verbunden ist, nicht beeinträchtigen.
Allgemeine Verfahren für die Immunisierung von Tieren (in diesem Fall mit C5, C5a und/oder C5b), für die Isolierung von Antikörper produzierenden Zellen, für die Fusion solcher Zellen mit unsterblichen Zellen (z. B. Myelomzellen), um monoklonale Antikörper ausscheidende Hybridome zu erzeugen, für das Screening von Hybridomüberständen auf die Reaktivität der abgegebenen monoklonalen Antikörper mit einem gewünschten Antigen (in diesem Fall mit dem Immunogen oder einem Molekül, daß das Immunogen enthält), für die Zubereitung von größeren Mengen solcher Antikörper in Hybridomüberständen oder Ascitesflüssigkeiten und für die Aufreinigung und Lagerung solcher monoklonaler Antikörper können in einer Anzahl von Veröffentlichungen gefunden werden. Diese umfassen: Coligan, et al., Hrsg. Current Protocols In Immunology, John Wiley & Sons, New York, 1992, Harlow und Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988, Liddell und Cryer, A Practical Guide to Monoclonal Antibodies. John Wiley & Sons, Chichester, West Sussex, England, 1991, Montz, et al., Cellular Immunol. 127:337-351, 1990, Wurzner, et al., Complement Inflamm. 8:328-340, 1991, und Mollnes, et al., Scand J. Immunol. 28-307-312, 1988.
Eine Beschreibung der Herstellung eines monoklonalen Anti-Human-C5-Mäuseantikörpers mit bevorzugten Bindeeigenschaften wird unten in Beispiel 8 präsentiert. Wurzner, et al., 1991 beschreiben die Herstellung von anderen geeigneten monoklonalen Anti-Human-C5-Mäuseantikörpern, die als N19-8 und N20-9 bezeichnet werden.
Die Begriffe „Antikörper" oder „Antikörper" bezeichnen hierin Immunglobuline, die sowohl in vivo produziert wurden, als auch solche, die in vitro durch ein Hybridom produziert werden, und antigenbindende Fragmente (z. B. Fab'-Zubereitungen) solcher Immunglobuline sowie rekombinant exprimierte (technisch hergestellte) antigenbindenden Proteine, einschließlich Immunglobuline, chimere Immunglobuline, „humanisierte" Immunglobuline, antigenbindende Fragmente solcher Immunglobuline, Einzelkettenantikörper und andere rekombinante Proteine, die antigenbindenden Domänen enthalten, die aus Immunglobulinen abgeleitet werden. Der Begriff „monoklonal" bezeichnet hierin jeden Antikörper, der nicht polyklonalen Ursprungs ist.
Zusätzlich zu den unmittelbar hierüber aufgeführten schließen Veröffentlichungen, die Verfahren zur Herstellung von technisch hergestellten Antikörpern beschreiben, ein: Reichmann, et al., Nature, 332:323-327, 1988, Winter und Milstein, Nature, 349:293-299, 1991, Clackson, et al., Nature, 352:624-628, 1991, Morrison, Annu Rev Immunol, 10:239-265, 1992, Haber, Immunol Rev, 130:189-212, 1992, und Rodrigues, et al., J Immunol. 151:6954-6961, 1993. Humane oder humanisierte Antikörper werden für die Verabreichung an menschliche Patienten bevorzugt.
Um die gewünschten Verringerungen der Körperflüssigkeitsparameter zu erreichen, können solche Anti-C5-Antikörper in einer Mannigfaltigkeit von Dosierungseinheitsformen verabreichet werden. Die Dosis wird gemäß dem jeweiligen Antikörper variieren. Z. B. können verschiedene Antikörper verschiedenen Massen und/oder Affinitäten aufweisen und erfordern daher verschiedene Dosierungsniveaus. Auch die Antikörper, die als Fab'-Fragmente oder Einzelkettenantikörper hergestellt wurden, werden abweichende Dosierungen erfordern als die äquivalenten nativen Immunglobuline, da sie eine beträchtlich kleinere Masse als die nativen Immunglobuline aufweisen und daher niedrigere Dosierungen erfordern, um die gleichen molaren Niveaus in dem Blut des Patienten zu erreichen.
Die Dosierungsniveaus von Antikörpern für menschliche Patienten sind im allgemeinen zwischen 0,5 mg pro kg und 100 mg pro kg pro Patient pro Behandlung und vorzugsweise zwischen 1 mg pro kg und 50 mg pro kg pro Patient pro Behandlung. In Bezug auf die Körperflüssigkeitskonzentrationen sind die Antikörperkonzentrationen vorzugsweise in dem Bereich von 5 μg/ml bis 500 μg/ml.
Die Dosierungen der C5-Blocker, welche monoklonale Anti-C5-Antikörper sind, werden auch in Abhängigkeit von der Art der Verabreichung, den einzelnen Symptomen des Patienten, der behandelt wird, dem Gesamtgesundheitszustand, der körperlichen Verfassung, der Größe und dem Alter des Patienten und der Beurteilung durch den verschreibenden Arzt variieren.
Als Gegenstand der Beurteilung durch den Arzt umfaßt eine typische therapeutische Behandlung eine Serie von Dosierungen, die üblicherweise gleichzeitig verabreicht wird mit dem Monitoring von klinischen Endpunkten, wie z. B. die Anzahl der betroffenen Gelenke, die Rötung der Gelenke, die Schwellung der Gelenke, die Beweglichkeit der Gelenke, die Schmerzgrade etc., wobei die Dosierungshöhe so eingestellt wird, wie es nötig ist, um das gewünschte klinische Ergebnis zu erzielen.
Die Häufigkeit der Verabreichung kann ebenfalls nach verschiedenen Parametern eingestellt werden. Diese umfassen die klinische Antwort, die Plasmahalbwertszeit des C5-Blockers und die Niveaus des Blockers in einer Körperflüssigkeit, wie z. B. Blut, Plasma, Serum oder Synovialflüssigkeit. Für eine geführte Einstellung der Verabreichungshäufigkeit können die Niveaus des C5-Blockers in der Körperflüssigkeit während des Behandlungsverlaufs beobachtet werden.
Alternativ zu den C5-Blockern, die C5b beeinträchtigen, werden die Niveaus der zellysierenden Fähigkeit des Komplements, die in einer oder mehreren Körperflüssigkeiten des Patienten vorliegt, beobachtet, um zu ermitteln, ob zusätzliche Dosierungen oder höhere oder niedrigere Dosierungsniveaus notwendig sind. Es werden solche Dosierungen verabreicht, die notwendig sind, um wenigstens eine 25%-ige Verringerung und vorzugsweise eine 50%-ige oder höhere Verringerung der zellysierenden Fähigkeit des in Blut, Plasma oder Serum vorliegenden Komplements zu halten, oder eine wenigstens 10%-ige Verringerung der zellysierenden Fähigkeit des Komplements, das in der Synovialflüssigkeit eines entzündeten Gelenks vorliegt. Die zellysierende Fähigkeit kann in hämolytischen Assays, der Art, die hierin beschrieben wurde, als Hämolyse in Prozent gemessen werden. Eine 10%-ige oder 25%-ige oder 50%-ige Verringerung der zellysierenden Fähigkeit des Komplements, das in einer Körperflüssigkeit vorliegt nach Behandlung mit dem monoklonalen Anit-C5-Antikörper, dem C5-Blocker oder den C5-Blockern, die bei der Ausführung der Erfindung verwendet werden, bedeutet, daß die Hämolyse in Prozent nach Behandlung jeweils 90, 75 oder 50 % der Hämolyse in Prozent vor der Behandlung beträgt. Bei noch einer weiteren Alternative werden die Dosierungsparameter so eingestellt, wie es nötig ist, um eine wesentliche Reduzierung der C5a-Niveaus im Blut, dem Plasma oder dem Serum zu erreichen oder wenigstens eine 10%-ige Verringerung der C5a-Niveaus in der Synovialflüssigkeit eines entzündeten Gelenks. Wie oben diskutiert, können die C5a-Niveaus unter Verwendung der in Wurzner, et al., Complement Inflamm 8:328-340, 1991, beschriebenen Verfahren gemessen werden. Wenn es nach dem Entschluß des Arztes gewünscht ist, können auch andere Verabreichungsprotokolle angewendet werden.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird die Verabreichung des monoklonalen Anti-C5-Antikörpers begonnen, sobald der Patient ein „Aufflammen" der Gelenkentzündung erfährt, bei dem eines oder mehrere betroffene Gelenke stärker anschwellen und eine erythematöse (gerötete) Erscheinung annehmen.
Die Verabreichung der C5-Blocker wird im allgemeinen über einen parenteralen Weg durchgeführt. Üblicherweise durch Injektion, wie z. B. als intraartikuläre oder intravaskuläre Injektion (z. B. intravenöse Infusion) oder intramuskuläre Injektion. Falls es gewünscht und für den jeweiligen C5-Blocker, der verabreicht werden soll, praktikabel ist, können andere Verabreichungswege, z. B. oral (p.o.) angewandt werden.
Für die Behandlung einer etablierten Gelenkentzündung durch systemische Verabreichung eines C5-Blockers (im Gegensatz zu lokaler Verabreichung, z. B. intraartikulärer Injektion in das entzündete Gelenk) wird die Verabreichung einer großen Initialdosis bevorzugt, d.h. eine einzelne Initialdosis, die ausreichend ist, um eine wesentliche Verringerung und noch bevorzugter eine wenigstens 50%-ige Verringerung der hämolytischen Aktivität des Patientenserums zu liefern. Eine solche Initialdosis wird vorzugsweise gefolgt von regelmäßig wiederholter Verabreichung von immer kleiner werdenden Dosierungen, wie sie benötigt werden, um wesentliche Verringerungen des hämolytischen Titers des Serums zu halten. Bei einer anderen Ausführungsform wird die Initialdosis sowohl über den lokalen als auch über den systemischen Weg gegeben, gefolgt von wiederholter systemischer Verabreichung von immer geringeren Dosierungen, wie oben beschrieben wurde.
Die Formulierungen, die für die Injektion, für p.o. und andere Verabreichungswege geeignet sind, sind auf dem Gebiet gut bekannt und können beispielsweise gefunden werden in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, PA, 17. Auflage (1985). Die parenteralen Formulierungen müssen steril und nicht-pyrogen sein und umfassen im allgemeinen einen pharmazeutisch wirksamen Träger, wie z. B. Salzlösung, gepufferte (z. B. phosphatgepufferte) Salzlösung, Hank-Lösung, Ringer-Lösung, Dextrose-/Salzlösung, Glucoselösungen und dergleichen. Diese Formulierungen können pharmazeutisch verträgliche Hilfssubstanzen enthalten falls erforderlich, wie z. B. die Tonizität einstellende Mittel, Benetzungsmittel, bakterizide Mittel, Konservierungsstoffe, Stabilisatoren und dergleichen.
Die Formulierungen der Erfindung können in Form von Herstellungsartikeln vertrieben werden, die ein Verpackungsmaterial und ein pharmazeutisches Mittel umfassen, welches den C5-Blocker, der ein monoklonaler Anti-C5-Antikörper ist, oder C5-Blocker umfaßt und einen pharmazeutische verträglichen Träger, der für die Art der Verabreichung angemessen ist. Das Verpackungsmaterial wird ein Etikett umfassen, das anzeigt, daß die Formulierung für die Verwendung in einem Arzneimittel für die Behandlung von Gelenkentzündung dient, und kann spezielle auf Arthritis, rheumatoide Arthritis, Osteoarthritis, Lupus-Arthritis, Psoriasis-Arthritis, in der Jugend beginnende rheumatoide Arthritis, reaktive Arthritis, Reiter-Syndrom (Reiter-Krankheit) oder andere Krankheiten, die eine Gelenkentzündung einschließen, hinweisen.
MATERIALIEN UND METHODEN
Zellyse-Assays
Die zellysierende Fähigkeit des Komplements in verschiedenen Körperflüssigkeitsproben wurde bestimmt, indem die hämolytischen Assays wie folgt durchgeführt wurden: Es wurden Hühnererythrozyten gut in GVBS (Sigma Chemical Co. St. Louis, Mo, Katalog-Nr. G-6514) gewaschen und zu 2 × 10⁸/ml in GVBS resuspendiert. Zu den Zellen wurde in einer Endkonzentration von 25 μg/ml Anti-Hühnererythrozyten-Antikörper (IgG-Fraktion von Anti-Hühner-RBC-Antiserum, Intercell Technologies, Hopewell, NJ) zugegeben und die Zellen wurden über 15 Minuten bei 23 °C inkubiert. Die Zellen wurden 2 × mit GVBS gewaschen und 5 × 10⁶ Zellen wurden zu 30 μl in GVBS resuspendiert. Ein Volumen von 100 μl der Körperflüssigkeitsuntersuchungslösung wurde dann zugegeben, um ein Reaktionsgemischendvolumen von 130 μl zu erhalten. Eine Bezugnahme auf den Serumprozentsatz und/oder das Serum-Input bei diesen Assays wird hierin so verwendet, daß dies den prozentualen Anteil einer Körperflüssigkeit (einschließlich Serum, sowie andere Körperflüssigkeiten, wie z. B. Blut, Plasma oder Synovialflüssigkeit) in dem 100-μl-Volumen der Körperflüssigkeitsuntersuchungslösung angibt.
Nach der Inkubation über 30 Minuten bei 37 °C wurde die Hämolyse in Prozent in Relation zu einer vollständig lysierten Kontrollprobe berechnet. Die Hämolyse wurde bestimmt, indem die Zellen heruntergesponnen wurden und das freigesetzte Hämoglobin in dem Überstand in Form der optischen Dichte bei 415 nm gemessen wurde.
Eine 50%-ige Verringerung der Hämolyse nach Behandlung mit dem/den C5-Blocker oder -blockern, die bei der Anwendung der Erfindung verwendet werden, bedeutet, daß die Hämolyse in Prozent nach der Behandlung die Hälfte der Hämolyse in Prozent vor der Behandlung betrug.
Die verschiedenen unten in den Beispielen beschriebenen Assays wurden unter Verwendung dieses Hühnererythrozyten-Assays mit den folgenden Körperflüssigkeits-Inputs durchgeführt. Für die Assays der Mäusekomplementaktivität enthielt das 100-μl-Volumen der Körpertlüssigkeitsuntersuchungslösung 50 μl an verdünntem (in GVBS) Mäuseserum und 50 μl an humanem C5-Mangelserum (Quidel Corporation, San Diego, CA). Für die Assays der humanen Komplementaktivität enthielt die Körperflüssigkeitsuntersuchungslösung verschiedene Konzentrationen an humanem Plasma oder Serum, wobei Hybridoma-Überstände und/oder GVBS zugegeben wurden, um das Endvolumen von 100 μl zu erhalten. Für die unten in Beispiel 8 beschriebenen Assays, die verwendet wurden, um die Hybridoma-Überstände zu screenen, enthielt jedes 100-μl-Volumen der Serumuntersuchungslösung 50 μl an Hybridoma-Überstand und 50 μl einer 10%-igen Lösung humanen Serums in GVBS, was ein 5%-iges Humanserum-Input lieferte.
Kollageninduzierte Gelenkentzündung
In den Beispielen 1, 2 und 3 wird ein System für kollageninduzierte Gelenkentzündung verwendet, das seit den 1970ern als ein Tiermodell der humanen Gelenkentzündung, insbesondere der RA, verwendet worden ist (siehe z. B. Trentham et al., 1977, Holmdahl et al, 1986, Boissier et al., 1987, Yoo et al., 1988). Dieses Modellsystem wurde eingesetzt, indem 8 bis 12 Wochen alte, männliche DBA/1LacJ-Mäuse verwendet wurden, die vom The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) bezogen wurden.
Immunisierung
Rinderkollagen II (B-CII), das von Elastin Products Company, Inc., Owensville, MO, erhalten wurde, wurde in 0,01 M Essigsäure durch Rühren über Nacht bei 4 °C in einer Konzentration von 4 mg/ml gelöst. Freunds vollständiges Adjurans (CFA) wurde hergestellt, indem getrocknetes Mycobacterium tuberculosis N37RA (Difco, Detroit, MI) zu Freunds unvollständigem Adjurans (Difco) in einer Konzentration von 2 mg/ml zugegeben wurde. Die Lösung von B-CII wurde in einem gleichen Volumen an CFA emulgiert und ein 100 μl-Aliquot dieser Emulsion, die 200 μg B-CII und 100 µg an Mycobacterium enthielt, wurde an der Basis des Mäuseschwanzes intradermal injiziert. Nach 21 Tagen wurden alle Mäuse unter Anwendung desselben Protokolls reimmunisiert. Diese sekundäre CII-Reimmunisierung diente primär dazu, die Serumniveaus der Anti-CII-Antikörper in den immunisierten Mäusen in die Höhe zu treiben. Nach der CII- Reimmunisierung stiegen der Ausbruch von Gelenkentzündung (JI) und das Fortschreiten der Erkrankung drastisch an, gekennzeichnet durch das starke Schwellen und die Rötung der Gelenke von einer oder mehreren Pfoten etwa um 4 bis 6 Wochen nach der Initialimmunisierung.
Klinische Evaluierung
Beginnend an dem Tag der Reimmunisierung wurden die Mäuse täglich auf das Auftreten von JI untersucht. Das Vorliegen von JI wurde bestimmt, indem jede der Vorderpfoten und Hinterpfoten untersucht, gemessen und bepunktet wurde. Die kollageninduzierte JI (CIJI) ist gekennzeichnet durch Schwellung und Erythem oder sichtbare Gelenkverdrehung von einer oder mehreren Extremitäten. Die Schwere der JI in jeder betroffenen Pfote wurde bepunktet mit: 0 – normales Gelenk, 1 – sichtbare Rötung und Schwellung, 2 – schwere Rötung und Schwellung, die gesamte Pfote oder das gesamte Gelenk betreffend, oder 3 – deformierte Pfote oder Gelenk mit Ankylose. Die Summe der Punkte für alle vier Pfoten jeder Maus wurde als ein Index verwendet (der „JI-Index"), um die Schwere und das Fortschreiten der Erkrankung insgesamt abzuschätzen.
Monoklonale Anti-Komplement-Antikörper
Nach Standardverfahren wurden monoklonale Antikörper, die an Mäuse-C5 binden und dieses blockieren, aus Hybridom BB5.1 (Frei, et al., 1987) hergestellt, welches von Dr. Brigitta Stockinger vom National Institute for Medical Research, Mill Hill, London, England, erhalten wurde. Anti-Human-C8-Hybridom, 135.8, welches einen Mab erzeugt, der Maus-C8 nicht blockiert, wurde von Dr. Peter Sims (Blood Research Institute, Milwaukee, WI) erhalten. Beide Antikörper sind IgG1-Isotypen, und Ascites von BB5.1 oder 135.8 wurden jeweils in thymusfreien nackten Mäusen oder BALB/c-Mäusen erhalten. Die IgGs wurden aus dem Ascites mit einer Protein-A-Affinitätssäule, die mit Essigsäure eluiert wurde, aufgereinigt und anschließend gegen PBS dialysiert. Die aufgereinigten Antikörper wurden durch spektrophotometrische Bestimmung der Absorption bei 280 nm quantifiziert und mit einem 0,22 µm-Filter sterilisiert.
Antikörperverabreichung
Für die prophylaktische Behandlung wurden die Mäuse zufällig in mit C5-Blocker behandelte und in mit Kontrolle behandelte Gruppen aufgeteilt und erhielten anschließend zweimal wöchentlich 750 µg pro Maus ip-Dosierungen von entweder Anti-Maus-C5-mAb-BB5.1 oder Anti-Human-C8-mAb-135.8, als eine Kontrolle. Für die therapeutische Behandlung von etablierter JI erhielten die Mäuse über 10 Tage, nachdem der initiale Ausbruch der JI beobachtet wor den war, Anti-Maus-C5-mAb-BB5.1 oder Anti-Human-C8-mAb-135.8 mit 2 bis 5 mg/Maus ip täglich. Die Dosierungen des Anti-C5-mAb wurden eingestellt in einem Bereich, der von 2 mg bis 5 mg pro Injektion umfaßte, um sicherzustellen, daß die gewünschte Abschwächung der von C5 vermittelten hämolytischen Aktivität erhalten wurde, d.h. eine Abschwächung von wenigstens 50 %.
Anders als im Falle von Menschen, bei denen die Verabreichungen eines C5-Blockers zu einer Körperflüssigkeit von genetisch nicht verwandten Individuen zu ungefähr gleichen Graden an Komplementhemmung führt, ist die Dosis an Anti-Maus-C5-mAb, die erforderlich ist, um die hämolytische Aktivität in einem gegebenen Umfang in Mäusen abzuschwächen, vom Stamm abhängig. Die Dosis, die erforderlich ist, um die hämolytische Aktivität bei DBA/1LacJ-Mäusen abzuschwächen, ist ungefähr viermal höher als die Dosis, die erforderlich ist, um eine gleichwertige Abschwächung der hämolytischen Aktivität bei BALB/c-Mäusen zu erzielen.
T-Zell-Stimulierungs-Assays
Lymphknotenzellen, die Tieren in dem Moment, in dem sie getötet wurden, entnommen wurden, wurden auf spezifische T-Zellantworten auf Kollagen II untersucht. Die T-Zellen (5 × 10⁵) wurden mit 5 × 10⁵ mit Mitomycin C (50 µg/ml) behandelten syngenetischen Milzzellen aus normalen DBA/1LacJ-Mäusen in 96-Well-Platten mit flachem Boden inkubiert. Zu den Kulturen wurden zu 20 µg/ml Rinderkollagen II (B-CII), Rinder-CI (B-CI), Hühner-CII (C-CII) und Ovalbumin oder BSA zugegeben. Das Kulturmedium war RPMI-1640 ergänzt mit 5 % erwärmter inaktivierter FCS, 5 × 10^–5 M 2-ME, 10 mM HEPES-Puffer, 1 % L-Glutamin, 1 % Natriumpyruvat und 1 % Penstrep. Die Kulturen wurden über 4 Tage bei 37 °C und 5 % CO₂ inkubiert. 18 Stunden vor der Ernte wurde zu jedem Well 1 µci an ³H-Thymidin zugegeben. Die Ergebnisse werden in cpm ausgedrückt, erhalten von Triplikaten von T-Zellkulturen.
Quantifizierung von Anti-B-CII-Antikörpern
Zu verschiedenen Zeiten nach der Immunisierung mit B-CII wurde den Mäusen Blut entnommen. Die Serum-Anti-B-CII-Antikörper-Titer wurden gemessen, indem ein konventionelles ELISA für B-CII verwendet wurde, ähnlich zu dem ELISA für die Anti-C5-Antikörper, das unten in Beispiel 8 beschrieben wird, wobei jedoch B-CII verwendet wurde, um die Platten zu beschichten (siehe auch Myers, et al., 1989 und Seki et al., 1992 für Beschreibungen von ähnlichen Assays).
Histologische Untersuchung
Es wurden Mäuse von jeder Gruppe getötet und alle vier Beine jeder Maus wurden in 10%-igem gepufferten Formalin fixiert und in einer Lösung von 3,1 % HCl, 5 % Ameisensäure und 7 % Aluminiumchlorid dekalzifiziert. Die Gewebeproben wurden in Paraffin eingebettet, mit 5 µm geschnitten und mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt. Für die Immunofluoreszenzfärbung wurden die Pfoten in einer 0,1 M Tris-Lösung die 10 % EDTA und 7,5 % PVP enthielt, über 3 Tage dekalzifiziert und bei –80 °C in OCT eingefroren. 5 µm-Schnitte wurden dann hergestellt und in einer Verdünnung von 1 zu 50 mit 9FITC-konjugierten Ziegen-Anti-Maus-IgG, -IgA und -IgM (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA, Katalog-Nr. 65-6411) gefärbt.
BEISPIEL 1
Therapeutische Wirkungen der C5-Blocker-Behandlung nach dem klinischen Ausbruch von kollageninduzierter Gelenkentzündung
Um die Wirkungen der Verabreichung eines C5-Blockers auf etablierte JI abzuschätzen, wurden Mäuse, wie oben beschrieben, im Anschluß an die Induzierung von CIJI beobachtet, und es wurden Paare von Mäusen ausgewählt, die am selben Tag das initiale Auftreten von schon nachweisbaren JI-Symptomen aufzeigten (geschwollene Gelenke an den Pfoten). Eine Maus von jedem dieser Paare wurde mit einem Anti-C5-mAb-BB5.1 behandelt, und eine wurde mit einer Kontrollinjektion von entweder dem irrelevanten mAb-135.8 oder von PBS behandelt. Bei jedem Vergleichspaar wurde das Tier mit dem höchsten Gesamtgrad an Pfotenentzündung der Behandlungsgruppe mit dem C5-Blocker zugeschrieben, um so zu vermeiden, daß möglicherweise die Ergebnisse zugunsten der C5-Blocker-Behandlung beeinflußt werden. Beginnend an dem ersten Tag, an dem die Gelenkentzündung als Pfotenentzündung beobachtet wurde, wurden die Behandlungen täglich über 10 Tage fortgesetzt (in einem Fall wurde bei einem Mäusepaar dieses nur über 8 Tage durchgeführt). Zusätzlich zu diesen Vergleichspaaren erhielten zwei nicht gepaarte Tiere ebenfalls die C5-Blocker-Behandlung nach der Induzierung von JI.
Die histologische Untersuchung der anfänglich betroffenen Gelenke von den mit Kontrolle behandelten Mäusen am Ende des Behandlungszeitraums ergab eine umfangreiche Knocherosion mit starker inflammatorischer Zellinfiltration, Verdickung der Synovialmembranen und eine Pannus-Bildung (1b). Im Gegensatz dazu zeigten die ursprünglich betroffenen Gelenke der mit C5-Blocker behandelten Gruppe eine erhaltene Gelenkstruktur mit einem gewissen Grad an Verdickung der Synovialmembranen und mononukleärer Zellinfiltration in manche der Gelenke (1c). Die starke inflammatorische Zellinfiltration bei den mit Kontrolle behandelten Gelenken bestand vorwiegend aus polymorphonukleären Zellen (PMNs, Neutrophile). Überraschenderweise lag eine solche PMN-Infiltration bei den mit C5-Blocker behandelten Mäusen nahezu überhaupt nicht vor.
Während des klinischen Verlaufs der CIJI ist ein wichtiger Indikator für das Fortschreiten der Erkrankung die Einbeziehung zusätzlicher Glieder. Daher wurde die Anzahl der Glieder mit klinisch nachweisbarer JI am Ende des Behandlungszeitraums mit der Zahl der Glieder, die vor dem Beginn der Therapie JI-Symptome aufzeigten, verglichen. Die Schwere und das Fortschreiten der JI in jeder betroffenen Pfote wurde, wie oben unter der Überschrift „Materialien und Methoden" beschrieben, bestimmt und bepunktet, und die Summe der Punkte für alle vier Pfoten jedes Tieres wurde als ein „JI-Index" verwendet. Die Dicken aller vier Pfoten jedes Tieres wurden ebenso über die Zeit dieses Experiments mit einem Tasterzirkel gemessen, um eine vollständige objektive Evaluierung dieses Aspekts des Erkrankungsfortschritts zu erhalten.
Wie in Tabelle 1 (Mittelwerte) und Tabelle 2 (Individuelle Werte) gezeigt wird, gab es signifikante Erhöhungen bei der Einbeziehung neuer Glieder bei der mit Kontrolle behandelten Gruppe während des Verlaufs der 10-Tages-Behandlung, während die Zahl der entzündeten Glieder abnahm, wenn DBA/1LacJ-Mäuse mit entzündeten Gelenken mit dem C5-Blocker beginnend an dem Tag des Krankheitsausbruchs behandelt wurden. Zusätzlich zu der Einbeziehung neuer Glieder wiesen die anfänglich betroffenen Pfoten der mit Kontrolle behandelten Tiere ein Fortschreiten der Schwere der entzündlichen Gelenkerkrankung auf, indem sie noch stärker entzündet wurden (2a). Die akute Entzündung in den betroffenen Gelenken wurde als eine starke Gelenkschwellung und -rötung während der ersten wenigen Tage beobachtet, gefolgt von Gelenkdeformierung und Ankylose am Ende des 10-Tage-Zeitraums. Im Gegensatz dazu wurden während des Verlaufs der C5-Blocker-Therapie keine neuen Pfoten einbezogen und die Schwere der Entzündung der Mehrzahl der betroffenen Gelenke nahm ab oder verblieb unverändert (2a).
Die Pfotendicken der anfänglich betroffenen Glieder werden in 2b sowohl für mit C5-Blocker behandelten als auch für die mit Kontrolle behandelten Gruppen als Mittelwerte für jede Gruppe während des Verlaufs dieses Experiments gezeigt. Die 3a, 3b, 3c und 3d zeigen die Werte für jede anfänglich entzündete Pfote von jedem der Vergleichspaare von mit Kontrolle behandelten und mit C5-Blocker behandelten Tieren, während die 3e die Werte zeigt, die für jede anfänglich entzündete Pfote von jedem der nicht gepaarten, mit C5-Blocker behandelten Tiere erhalten wurde (gemeinsam dargestellt mit den Mittelwerten der mit Kontrolle behandelten Tiere aus 2b). In diesen Figuren zeigt die Zahl in Klammern die Bezeichnung des jeweiligen Tieres an, während die Buchstaben, die den Zahlen folgen (nur in den Fällen, in denen anfänglich mehr als ein Glied betroffen war), die jeweils betroffenen Pfoten angeben, wobei der erste Buchstabe die Vorder- (F) oder Hinter- (R) Pfoten angibt, und der zweite Buchstabe die rechten (R) oder linken (L) Pfoten anzeigt.
Wie aus den 2 und 3 und aus den Tabellen 1 und 2 zu sehen ist, beugte die Behandlung mit C5-Blocker erfolgreich der weiteren Einbeziehung von Pfoten vor und reduzierte die Entzündung in den anfänglich betroffenen Gelenken (beseitigte sie aber nicht vollständig) bei allen der mit C5-Blocker behandelten Tiere, außer bei einer (Maus #4). Wie in 2b gesehen werden kann, erhöhte sich die mittlere Dicke der anfänglich betroffenen Pfoten bei den mit Kontrolle behandelten Tieren während des 10-Tage-Zeitraums signifikant, während die mittlere Dicke der anfänglich betroffenen Pfoten bei der mit C5-Blocker behandelten Gruppe abnahm, wenn auch nicht signifikant.
BEISPIEL 2
Prophylaktische Behandlung mit einem C5-Blocker beugt kollageninduzierter Gelenkentzündung vor
Bei diesen Versuchen fiel die Verabreichung des C5-Blockers mit der Reimmunisierung der Versuchstiere mit B-CII zusammen. Am Tage der Reimmunisierung waren die Mäuse symptomfrei und wurden zufällig zu den Gruppen mit C5-Blocker-Behandlung oder Kontrollbehandlung zugewiesen. Jede Maus wurde mit entweder dem C5-Blocker (Anti-Maus-C5-mAb, BB5.1) behandelt oder mit einer Kontrollbehandlung (Anti-Human-C8-mAb,135.8) bei 750 µg pro Maus ip zweimal wöchentlich. Die Tiere wurden über vier Wochen behandelt, zu welchem Zeitpunkt die Behandlung abgebrochen wurde. Die Ergebnisse dieser Untersuchung sind in den 4 und 5 dargestellt.
Die Verabreichung des C5-Blockers beugte der Entwicklung von CIJI vollständig vor (0/8). Alle Mäuse in der mit C5-Blocker behandelten Gruppe zeigten keine Anzeichen einer klinischen Erkrankung während des Behandlungszeitraums (und für bis zu 2 Monate nach dem Abbrechen der C5-Blocker-Therapie bei den zwei Tieren, die solange beobachtet wurden). Im Gegensatz dazu entwickelten 90 % der mit Kontrolle behandelten Tiere (9/10) JI innerhalb von 4-6 Wochen nach der ersten B-CII-Immunisierung. Das beobachtete prozentuale Auftreten von JI bei den mit Kontrolle behandelten und den mit C5-Blocker behandelten Tieren nach 4-6 Wochen ist in 5a graphisch dargestellt. (Beachte, daß der Wert für die mit C5-Blocker behandelte Gruppe bei dieser Figur in Wirklichkeit 0 % ist, allerdings wurde ein Balken, der 1 % anzeigt graphisch dargestellt, um anzuzeigen, daß die Daten für diesen Satz an Tieren erhalten wurden und dargestellt sind). Die Entzündungsniveauspitzen wurden 5 Wochen nach der intialen Kollagenimmunisierung beobachtet. Wie in 5b dargestellt ist, wurden 80 % bis 90 % der hämolytischen Aktivität des Serums bei der mit C5-Blocker behandelten Gruppe abgebaut, während bei der mit Kontrolle behandelten Gruppe die hämolytische Aktivität des Serums normal verblieb.
Wie in 4 dargestellt, ergab die histologische Untersuchung von betroffenen Gelenken aus Kontrollmäusen eine umfangreiche Infiltration von sowohl mononukleären Zellen als auch polymorphonukleären Zellen, eine Verdickung der Synovialmembran und Knochenerosion durch den sich ausdehnenden Synovialpannus (4b). Im Gegensatz dazu wurden bei der Mehrheit der untersuchten Gelenke aus den mit C5-Blocker behandelten Mäusen keine Anzeichen entzündlicher Vorgänge beobachtet. Einige wenige Gelenke dieser mit C5-Blocker behandelten Mäuse zeigten geringe subklinische Verdickung der Synovialmembran, aber diese Veränderung wurde nicht begleitet von irgendeiner sichtbaren Knochenerosion oder inflammatorischer Zellinfiltration (4c). Interessanterweise zeigte eine Immunofluoreszenzfärbung eine Antikörperabscheidung entlang der Knorpeloberflächen und eine C3-Aktivierung an Synovialmembranen in den Gelenken von sowohl den mit Kontrolle behandelten als auch den mit C5-Blocker behandelten Tieren.
BEISPIEL 3
Wirkung der C5-Blocker-Behandlung auf die humoralen und zellulären Immunantworten auf die Immunisierung mit Kollagen
Die Antworten von sowohl den humoralen als auch den zellulären Immunsystemen werden nach der Immunisierung von DBA/1LacJ-Mäusen mit Rinderkollagen II aktiviert. Die Anti-B-CII-Titer erhöhen sich, und die Serum-IgG-Anti-B-CII-Titer bei den mit C5-Blocker behandelten Mäusen sind äquivalent zu denen der mit Kontrolle behandelten Mäuse, wenn sie 14, 28 und 42 Tage nach den initialen B-CII-Immunisierung untersucht werden (6a). Die Anti-B-CII-Antikörper-Titer von sowohl der Kontrolle als auch den mit Anti-C5-mAb behandelten Mäusen steigen nach der B-CII-Reimmunisierung signifikant an und verbleiben auf dem resultierenden Plateau über einen ausgedehnten Zeitraum.
Um die T-Zellantworten zu untersuchen, wurden Lymphknotenzellen (LNCs) aus mit C5-Blocker behandelten Mäusen und aus mit Kontrolle behandelten Mäusen entweder mit B-CII, B-CI, C-CII oder nur mit Kulturmedium kultiviert. Die LNCs aus entweder den mit C5-Blocker behandelten Mäusen oder den mit Kontrolle behandelten Mäusen antworteten spezifisch und gleichsam auf B-CII, ungeachtet der Behandlung, die die Tiere gleichzeitig mit der B-CII- Reimmunisierung empfingen. C-CII, das viele konservierte Homologiebereiche mit B-CII teilt, bringt auch eine moderate T-Zellantwort hervor, wenn es mit LNCs aus mit C5-Blocker behandelten Mäusen oder aus mit Kontrolle behandelten Mäusen kultiviert wurde. Im Gegensatz dazu antworteten die LNCs aus nicht immunisierten Mäusen mit entsprechendem Alter nur schwach auf sämtliche der untersuchten Kollagene (6b).
Die aus diesen Versuchen erhaltenen Daten und diejenigen der Beispiele 1 und 2 zeigen deutlich, daß die in vivo-Verabreichung eines C5-Blockers die Entwicklung und das Fortschreiten von CIJI verhindert, und daß diese Behandlung die humoralen und zellulären Immunantworten, die nach der Immunisierung von Mäusen mit Rinderkollagen vom Typ II zu sehen sind, nicht beeinträchtigt. Sowohl die kollagenspezifischen T-Zellantworten als auch die Anti-CII-Antikörper-Titer waren sowohl bei den mit C5-Blocker behandelten Mäusen als auch bei den kontrollbehandelten B-CII-reimmunisierten Mäusen vergleichbar.
BEISPIEL 4
Die C5-Blocker-Hemmung der Komplementaktivität
Die Wirkungen eines C5-Blockers auf die Komplementaktivierung wurden evaluiert, indem ein Modell einer Herz-Lungen-Umgehung (CPB) mit geschlossenem Kreislauf für den extrakorporalen Kreislauf von menschlichem Blut verwendet wurde. Wie bereits ausführlich in der parallel anhängigen US-Patentanmeldung mit der Nr. 08/217,391, eingereicht am 23. März, 1994, ausführlich diskutiert, verursacht der extrakorporale Kreislauf des menschlichen Blutes die Aktivierung des Komplements im Blut.
Der C5-Blocker war ein monoklonaler Antikörper, der in Mäusen gegen aufgereinigtes humanes C5-Protein angezogen wurde (Wurzner, et al., Complement Inflamm 8:328-340, 1991; mAb N19-8), welcher propagiert, wiedergewonnen und als eine IgG-Fraktion aus der Mausascitesflüssigkeit aufgereinigt wurde (Antibodies, A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988; Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York, 1992).
Um diese Versuche durchzuführen, wurden 300 ml an menschlichem Vollblut aus einem gesunden menschlichen Donor entnommen und außerdem wurde eine Probe von 1 ml als eine Kontrollprobe für die spätere Analyse entfernt. Das Blut wurde durch Zugabe von Ringer-Lactat-Lösung, die 10 U/ml Heparin enthielt, auf 600 ml verdünnt. Der C5-Blocker (30 mg in steriler PBS) wurde zu dem verdünnten Blut in einer Endkonzentration von 50 µg/ml zugegeben. In einem Kontrollversuch wurde ein gleiches Volumen an steriler PBS zu dem verdünnten Blut zugegeben. Das Blut wurde dann verwendet, um den extrakorporalen Kreislauf einer COBE- CML-EXCEL-Membranoxygenator-CPB-Maschine (Cobe BCT, Inc., Lakewood, CO) zu grundieren, und der Kreislauf wurde gestartet. Der Kreislauf wurde auf 28 °C gekühlt und für 60 Minuten zirkulieren gelassen. Der Kreislauf wurde dann auf 37 °C aufgewärmt und für weitere 30 Minuten zirkulieren gelassen. Dann wurde das Experiment abgebrochen. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurden Proben genommen und im Hinblick auf Komplementaktivität evaluiert (7).
Zu jedem Zeitpunkt wurde ein Aliquot des Vollbluts entnommen, auf 3 Proben aufgeteilt und A) 1:1 in 2 % Paraformaldehyd in PBS verdünnt, um die Blutplättchen- und Blutzellaktivierungsparameter zu evaluieren, wie es in der oben zitierten US-Patentanmeldung Nr. 08/217,391 beschrieben wird, B) zentrifugiert, um alle Zellen zu entfernen, und das Plasma wurde 1:1 in Quidel's Probenkonservierungslösung (Quidel Corporation, San Diego, CA) verdünnt und bei –80 °C gelagert, worauf folgend diese gefrorenen verdünnten Plasmaproben aufgetaut wurden und verwendet wurden, um die C3a- und C5b-9-Bildung zu evaluieren (jeweils Beispiele 5 und 6), und C) zentrifugiert, um alle Zellen zu entfernen, und das unverdünnte Plasma wurde bei –80 °C gelagert, worauf folgend diese gefrorenen Plasmaproben aufgetaut wurden und hämolytische Assays, wie oben beschrieben, durchgeführt wurden.
Wie in 7 zu sehen ist, führte die Zugabe des C5-Blockers zu dem extrakorporalen Kreislauf zu einer 95%-igen Verringerung der zellysierenden Fähigkeit des Komplements im Plasma. Die Komplementaktivität verblieb während des Verlaufs (90 Minuten) des Experiments gehemmt.
BEISPIEL 5
Bildung von C3a in der Anwesenheit eines C5-Blockers
Die frisch gefrorenen Plasmaproben, die zuvor im Anschluß an den CPB-Kreislauf in Quidel's Probenkonservierungslösung verdünnt worden waren (siehe Beispiel 4), wurden auf die Anwesenheit des Komplementspaltprodukts C3a untersucht, indem ein Quidel-C3a-EIA-Kit verwendet wurde (Quidel Corporation, Sand Diego, CA). Diese Messungen wurden gemäß den Herstellerangaben durchgeführt. Freigesetztes C3a wird ausgedrückt in ng/well, wie durch Vergleich mit einer Standardkurve bestimmt wird, die aus Proben, die bekannte Mengen an humanem C3a enthielten, erzeugt wurde.
Wie in 8 zu sehen ist, hat die Zugabe des C5-Blockers keine Auswirkung auf die Produktion von C3a während des CPB-Versuchs. Die C3a-Bildung wurde während der letzten 30 Minuten des Versuchs drastisch erhöht und korreliert mit der Probenerwärmung.
BEISPIEL 6
Vorbeugung der Bildung von C5b-9 durch einen C5-Blocker
Frisch eingefrorene Plasmaproben, die zuvor im Anschluß an den CPB-Kreislauf in Quidel's Probenkonservierungslösung verdünnt worden waren (siehe Beispiel 4), wurden auf die Anwesenheit des terminalen humanen Komplementkomplexes C5b-9 untersucht, indem das Quidel-C5b-9-Kit (Quidel Corporation, San Diego, CA) verwendet wurde. Die Menge an löslichem C5b-9 (sC5b-9) in jeder Probe wurde bestimmt, indem die Herstellerangaben angewandt wurden und wird in willkürlichen Absorptionseinheiten (AU) ausgedrückt.
Wie in 9 zu erkennen ist, hemmte der C5-Blocker die C5b-9-Bildung während des extrakorporalen Kreislaufs vollständig, so daß die sC5b-9-Niveaus während der gesamten Dauer des Laufs gleichwertig zu den Kontrollzeitpunkten (to) waren. Die Ergebnisse dieses Versuchs und diejenigen der Beispiele 4 und 5 zeigen, daß die Zugabe eines C5-Blockers zu humanem Blut, das einem extrakorporalen Kreislauf unterzogen wird, sowohl die hämolytische Aktivität des Komplements (7) als auch die C5b-9-Bildung (9) wirksam hemmt, jedoch nicht die C3a-Bildung (8).
BEISPIEL 7
Die Pharmakokinetiken von mAb-C5-Blockern
Die Wirkungsdauer in vivo von mAb BB5.1 und eines Fab'-Fragments von mAb BB5.1 (hergestellt nach Standardverfahren) wurde bestimmt in normalen weiblichen BALB/cByJ-Mäusen (durchschnittlich ungefähr 20 g jeweils), die von dem Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, erhalten wurden. Den Mäusen wurde eine einzelne intravenöse Injektion (mit 35 mg/kg Körpergewicht) des mAb oder des Fab'-Fragments des mAb (oder eines gleichen Volumens an PBS als eine Kontrolle) gegeben. Die Blutproben wurden 1, 4, 24, 96 und 144 Stunden nach Verabreichung von PBS, 4, 16 und 24 Stunden nach Verabreichung des Fab'-Fragments des mAb BB5.1 und 4, 24, 48, 72, 96 und 144 Stunden nach Verabreichung des intakten mAb BB5.1 aus dem retroorbitalen Plexus genommen.
10a zeigt den Zeitverlauf der Hemmung der zellysierenden Fähigkeit des Komplements im Mäuseblut (bestimmt, indem das aus dem Blut erhaltene und zu 2,5 % verdünnte Serum in hämolytischen Assays untersucht wurde, wie oben beschrieben) nach der in vivo-Verabreichung des intakten mAb, des Fab'-Fragments oder von PBS. Wie in der Figur dargestellt, hemmte das intakte mAb die hämolytische Aktivität des Blutes während des 6-Tage- Versuchszeitraums nahezu vollständig. Dagegen hatte das Fab' eine Halbwertszeit von ungefähr 24 Stunden.
Zusätzlich zu den obigen Versuchen wurden am Ende des 6-Tage-Versuchszeitraums alle Mäuse getötet. Die Nieren, die Lungen und die Lebern wurden entnommen und sowohl anhand einer Gesamtbegutachtung als auch durch mikroskopische Untersuchung von gefärbten Schnitten untersucht. Alle Organe der mit C5-Blocker behandelten Tiere erschienen gleich, wie diejenigen, die aus den mit der PBS-Kontrolle behandelten Tieren entnommen worden waren. Auch vor der Nekropsie war die Gesamterscheinung dieser Test- und Kontrollmäuse nicht unterscheidbar.
Auch ein Anti-Human-C5-mAb wurde auf seine pharmakokinetischen Eigenschaften in zirkulierendem Humanblut, wie oben in Beispiel 4 beschrieben, untersucht. Wie dort beschrieben wurde, wurden die hämolysehemmenden Effekte dieses C5-Blockers über einen 90-minütigen Kreislaufzeitraum getestet. Die Ergebnisse dieser Tests sind in 10b aufgeführt und zeigen, daß der C5-Blocker die zellysierende Eigenschaft des menschlichen Blutes während der gesamten 90-minütigen Kreislaufzeit im wesentlichen vollständig hemmte.
Die Ergebnisse dieser Versuche zeigen, daß diese C5-Blocker im Blutstrom über einen erheblichen Zeitraum überleben, was eine periodische Verabreichung praktikabel macht.
BEISPIEL 8
Herstellung eines C5-Blockers
Ein C5-Blocker mAb, der für die Anwendung bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung geeignet ist, wurde wie folgt hergestellt.
Balb/c-Mäuse wurden dreimal durch intraperitoneale Injektion mit humanem C5-Protein (Quidel Corporation, San Diego, CA, Katalog #A403) immunisiert. Die erste Injektion enthielt 100 µg an C5-Protein in einer Emulsion von Freunds vollständigem Adjurans, die zweite Immunisierung enthielt 100 µg an C5-Protein in einer Emulsion von Freunds unvollständigem Adjurans, und die dritte Immunisierung war 100 µg an Protein in PBS. Die Mäuse wurden grob in 2-Monats-Intervallen injiziert.
Die Fusionen von Splenozyten zu Myelomzellen zur Erzeugung von Hybridomen, wurden im wesentlichen so durchgeführt, wie beschrieben in Current Protocols in Immunology (John Wiley & Sons, New York, 1992, Seiten 2.5.1-2.5.17). Am Tag der Fusion wurden die Mäuse mit 100 µg an C5-Protein IV geboosted. Einen Tag nach der Fusion wurden die immunisierten Mäuse getötet und ihre Milz wurde entnommen. Als der Fusionspartner wurden SP2/0-AG14-Myelomzellen (ATCC CRL#1581) verwendet. Die SP2/0-AG14-Kulturen wurden am Tag vor der Fusion aufgeteilt, um die aktive Zellteilung zu induzieren. Ein Verhältnis von 1:10 (Myelom:Splenocyten) wurde bei den Fusionen eingesetzt.
Die Zellen wurden unter Verwendung von PEG 1450 in PBS ohne Kalzium (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, Katalog-Nr. P-7181) fusioniert und zu 1-2.5 × 10⁵ Zellen pro Well ausplattiert. Die Selektionierung wurde am folgenden Tag begonnen in einem EX-CELL-300-Medium (JRH Biosciences, Lexena, KS, Katalog-Nr. 14337-78P) ergänzt mit 10 % wärmeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS), Glutamin, Penicillin und Streptomycin (GPS) und HAT (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, Katalog-Nr. H-0262). Die Fusionen wurden dann jeden weiteren Tag mit frischem mit FBS, GPS und HAT ergänztem Medium gefüttert. Schon zwei Tage nach dem Start der Selektionierung konnte Zelltod gesehen werden, und lebende Zellcluster konnten schon nach 5 Tagen gesehen werden. Nach 2 Wochen Selektionierung in HT wurden die für die weitere Untersuchung ausgewählten überlebenden Hybridome auf EX-CELL-300-Medium, das mit FBS, GPS und HAT (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, Katalog-Nr. H-0137) ergänzt war, für 1 Woche übertragen und dann in EX-CELL-300-Medium kultiviert, das mit FBS und GPS ergänzt war.
Die Hybridome wurden 10-14 Tage nach der Fusion auf Reaktivität auf C5 und auf die Hemmung der komplementvermittelten Hämolyse gescreent, und wurden zumindest solange erhalten, bis die Screeningergebnisse analysiert worden waren. Das Screening auf die Hemmung der Hämolyse war das oben beschriebene Hühnererythrozytenlyse-Assay. Das Screening auf C5-Reaktivität war ein ELISA, welches unter Anwendung des folgenden Protokolls durchgeführt wurde.
Ein 50 µl-Aliquot einer 2 µg/ml-Lösung von C5 (Quidel Corporation, San Diego, CA) in Natriumcarbonat/Bicarbonat-Puffer, pH-Wert 9,5, wurde über Nacht bei 4 °C in jedem Probenwell einer 96-Well-Platte (Nunc-Immuno F96 Polysorp, A/S Nunc, Roskilde, Dänemark) inkubiert. Die Wells wurden dann einem Waschschritt unterworfen (jeder Waschschritt bestand aus drei Waschungen mit TBST). Als nächstes wurden die Probenwells mit 200 µl einer Blocking-Lösung, 1 % BSA in TBS (BSA/TBS) für 1 Stunde bei 37 °C blockiert. Nach einem zusätzlichen Waschschritt wurde ein Aliquot von 50 µl des Hybridomüberstands in jedem Probenwell für eine Stunde bei 37 °C mit einem nachfolgenden Waschschritt inkubiert. Als ein zweiter (Nachweis-) Antikörper wurde in jedem Probenwell 50 µl einer 1:2000-Verdünnung von mit Meerrettich-Peroxidase (HRP) konjugiertem Ziegen-Anti-Maus-IgG in BSA/TBS für 1 Stunde bei 37 °C in kubiert, gefolgt von einem Waschschritt. Den Herstellerangaben folgend wurde 10 mg an O-Phenylendiamin (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, Katalog-Nr. P-8287) in 25 ml an Phosphat-Citrat-Puffer (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, Katalog-Nr. P-4922) gelöst und 50 µl dieser Substratlösung wurden zu jedem Well zugegeben, um den Nachweis von Peroxidaseaktivität zu ermöglichen. Um die Peroxidasenachweisreaktion abzustoppen, wurde schließlich ein 50 µl-Aliquot von 3N-Salzsäure zu jedem Well zugegeben. Die Anwesenheit von mit C5 reagierenden Antikörpern in den Hybridomüberständen wurde anhand einer spektrophotometrischen OD-Bestimmung bei 490 nm ausgelesen.
Der Überstand eines Hybridoms, das als 5G1.1 bezeichnet wurde, wurde durch ELISA positiv getestet und reduzierte die zellysierende Fähigkeit des in normalem humanen Blut vorliegenden Komplements in dem Hühnererythrozytenhämolyse-Assay wesentlich. Weitere Untersuchungen ergaben, daß der 5G1.1-Antikörper die zellysierende Fähigkeit des in normalem humanen Blut vorliegenden Komplements so effizient reduziert, daß es die hämolytische Aktivität des Serums nahezu vollständig neutralisieren kann, sogar dann, wenn es ungefähr in der halben molaren Konzentration von humanem C5 in dem hämolytischen Assay vorliegt.
Das Hybridom 5G1.1 wurde am 27. April 1994 bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, 20852, Vereinigte Staaten von Amerika, hinterlegt und wurde mit der Bezeichnung HB-11625 gekennzeichnet. Diese Hinterlegung erfolgte unter dem Budapester Vertrag über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren (1977).
Im Verlaufe dieser Anmeldung wurde auf verschiedene Veröffentlichungen und Patentoffenbarungen verwiesen. Die Lehren und die Offenbarungen davon werden hiermit durch Hinweis darauf in ihrer Gesamtheit in diese Anmeldung eingeschlossen, um den Stand der Technik noch vollständiger zu beschreiben, den die vorliegende Erfindung betrifft.
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Tabelle 1

* Die Zahlen in Klammern repräsentieren die durchschnittliche Anzahl der betroffenen Gelenke pro Maus.

Tabelle 2

* kaum nachweisbare Entzündung
** lediglich ein Zeh
die Daten repräsentieren für Maus #9 und #3 lediglich 8 Tage
§ Maus #7 und #10 wurden nicht mit Vergleichskontrollen versehen

Claims

Verwendung eines monoklonalen Anti-C5-Antikörpers bei der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von etablierter Gelenkentzündung in einem menschlichen oder nicht menschlichen Patienten.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Antikörper der monoklonale Maus-Antikörper BB5.1 ist.
Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei der monoklonale Anti-C5-Antikörper in einer Menge verabreicht wird, die ausreicht, die zellysierende Fähigkeit von Komplement, welches in einer von Blut abgeleiteten Flüssigkeit des Patienten vorhanden ist, im wesentlichen zu hemmen, und/oder wobei er in einer Menge verabreicht wird, die ausreicht, die Menge an löslichem C5b-9, welches in einer von Blut abgeleiteten Flüssigkeit des Patienten nach Aktivierung von Komplement in dieser Flüssigkeit vorhanden ist, im wesentlichen zu reduzieren, und/oder wobei er in einer Menge verabreicht wird, die ausreicht, die Menge an C5a, welches in einer von Blut abgeleiteten Flüssigkeit des Patienten nach Aktivierung von Komplement in dieser Flüssigkeit vorhanden ist, im wesentlichen zu reduzieren.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei die von Blut abgeleitete Flüssigkeit Serum ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der monoklonale Anti-C5-Antikörper in einer Menge verabreicht wird, die ausreicht, die zellysierende Fähigkeit von Komplement, welches in der Synovialflüssigkeit eines entzündeten Gelenks des Patienten vorhanden ist, um wenigstens 10% zu reduzieren, und/oder wobei er in einer Menge verabreicht wird, die ausreicht, die Menge an löslichem C5b-9, welches in der Synovialflüssigkeit des Patienten vorhanden ist, um wenigstens 10% zu reduzieren, und/oder wobei er in einer Menge verabreicht wird, die ausreicht, um die Menge an C5a, welches in der Synovialflüssigkeit eines entzündeten Gelenks des Patienten vorhanden ist, um wenigstens 10% zu reduzieren.
Verwendung eines monoklonalen Anti-C5-Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der monoklonale Anti-C5-Antikörper die Spaltung der Komplementkomponente C3 in dem Serum des Patienten in C3a und C3b nicht wesentlich stört.