WO2004035622A2 - Il-15 antagonisten - Google Patents

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WO2004035622A2
WO2004035622A2 PCT/CH2003/000666 CH0300666W WO2004035622A2 WO 2004035622 A2 WO2004035622 A2 WO 2004035622A2 CH 0300666 W CH0300666 W CH 0300666W WO 2004035622 A2 WO2004035622 A2 WO 2004035622A2
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    • C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid

Definitions

  • the invention relates to fusion proteins from a wild-type E -15 and an IgG-Fc fragment and to their production and use for inhibiting immune reactions and for the prophylaxis and / or therapy of secondary transplant and / or autoimmune diseases.
  • T cells An effective immune response is initiated by the activation of T cells in the immune system, which is triggered by an antigen or mitogen.
  • the activation of the T cells requires numerous cellular changes, these include e.g. the expression of cytokines and their receptors. These cytokines include IL-15 and E -2.
  • IL-15 and IL-2 are known growth factors that play a significant role in the proliferation and differentiation of human and murine T cells, macrophages, natural killer (NK) cells, cytotoxic T cells (CTL), lymphocyte-activated Killer (LAK) cells and in the costimulation of B cells that have been activated, for example, by anti-immunoglobulin (anti-IgM) or phorbol esters.
  • NK natural killer
  • CTL cytotoxic T cells
  • LAK lymphocyte-activated Killer
  • anti-IgM anti-immunoglobulin
  • phorbol esters anti-immunoglobulin
  • the proliferation of these cells increases an organism's immune response.
  • LL-15 was first described as a secretory cytokine that induces the proliferation of IL-2 dependent murine cytotoxic T cells (CTLL-2).
  • CTLL-2 IL-2 dependent murine cytotoxic T cells
  • IL-15 has been characterized as a 162 amino acid precursor protein with a leader sequence of 48 amino acids, ie a mature protein of 114 amino acids in length (Grabstein et al., (1994) Science 264 (5161): 965-8).
  • IL-15 is produced in epithelial and fibroblast cell lines as well as peripheral blood monocytes. Its specific mRNA was also found in the placenta, skeletal muscles and kidneys (Grabstein et al., Supra)
  • IL-15 and IL-2 also have homologous structures. Both molecules bind to at least three separated receptor subunits on the membrane of T cells, the beta and gamma subunit complexes via which the signal transduction is the same, while the alpha subunit is specific for the binding of IL-15 and IL-2, respectively . It was found that antibodies directed against the alpha subunit of the IL-2 receptor had no effect on the IL-15 binding to its specific alpha subunit (Grabstein et al., Supra), whereas antibodies directed against the beta Subunit of the IL-2 receptor were directed to block the activity of IL-15 (Giri et al, (1994) EMBO J., 13: 2822). Signal transduction takes place via the beta and gamma subunits of IL-15.
  • autoimmune diseases in particular type I diabetes mellitus (Bottazzo, GF, et al, (1985) N Engl J Med 113: 353), rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, chronic liver diseases, inflammatory bowel diseases, transplant-anti- Graft versus host disease (GVHD) and graft rejection (Sakai et al., (1998) Gastroenterology, 114 (6): 1237-1243; Kivakakk et al., (1998) Clin Exp Immunol, 111 (1): 193197).
  • inimun-competent cells are transmitted from a genetically non-identical organism, these cells react to the recipient organism (GVHD) (Janeway CA and Travers P., Spectrum Verlag, German edition 1995 p. 467).
  • Humoral effectors are antibodies of different specificity, such as, for example, antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity and antibodies against structures of the donor HLA system.
  • Cellular effectors are in particular cytotoxic T cells in connection with macrophages (Immunologie, Janeway CA and Travers P., Spectrum Verlag, German edition 1995, pp. 522-8).
  • One therapeutic approach is to suppress the humoral or cellular immune response by immunosuppressia, in particular antagonistic IL-15 or IL-2 antibodies or IL-15 or IL-2 antagonists.
  • IL-15 antagonists which change the binding behavior of IL-15 to its receptor. These antagonists were obtained by introducing mutation (s) into the wild-type IL-15 sequence. For example, a mutation at amino acid position 56 (aspartate) [position 8 after cleavage of the leader sequence] has been described, through which binding to the alpha subunit of the IL-15 receptor took place, however binding to the beta subunit was prevented (WO 96/26274). In another approach, the interaction with the gamma subunit was inhibited by a mutation at amino acid position 156 (glutamine) [position 108 after cleavage of the leader sequence] (WO 96/26274; WO 97/41232).
  • IL-15 antagonists described are mutated IL-15 (mut-IL-15) sequences which have antagonistic effects either by themselves or as a fusion protein.
  • fusion proteins are polypeptides consisting of an N-terminal mut-IL-15 fragment and a C-terminal Fc fragment, in particular a murine IgG2a or human IgGl (WO 97/41232; Kim et al., (1998) J Immunol ., 160: 5742-5748).
  • Fc fragment crystallizable fragment
  • the two other identical Fab fragment antigen binding fragments of an antibody have antigen binding activity (Immunology, Janeway CA and Travers P., German edition (1995), p. 117 and the following).
  • IL-15 molecules have a changed primary, secondary and tertiary structure compared to the wild-type IL-15 and therefore have different degradation points, so that degradation products occur which do not occur naturally in the cells, and can have a toxic effect on the organism.
  • the nature and extent of such and other side effects cannot be foreseen in detail.
  • Immunosuppressants are dependent. Usually because that is inadequate Knowledge of the side effects of long-term use of such immunosuppressive agents is urgently needed to rule out or at least limit these side effects.
  • a major disadvantage is that the generally systemic administration of such immunosuppressants leads to their distribution throughout the organism and does not ensure the local presence at the site of the transplanted cells, tissue or organ.
  • inhibiting T cell proliferation throughout the organism can cause infections, toxic breakdown products or even cancer.
  • the object of the present invention is therefore to produce an immunosuppressant which has no or hardly any side effects in an organism in which an immune response is to be inhibited.
  • mutated IL-15 molecules or fusion proteins consisting of a mut-IL-15 and an Fc fragment, have an antagonistic effect on IL-15 by inhibiting or changing the receptor binding behavior.
  • a fusion protein consisting of an N-terminal wild-type IL-15 and a C-terminal Fc fragment, in particular a murine IgG2a, also has an antagonistic effect, although an agonistic effect would be expected in itself . Only by attaching an Fc fragment to a naturally occurring, normally an immunostimulating IL-15 molecule, the mechanism of action could be reversed, i.e. the inhibition of an immune response.
  • the invention therefore relates to a fusion protein composed of a wild-type IL-15 on the one hand and an IgG-Fc fragment on the other hand, with the exception of a murine IgG2b-Fc fragment.
  • a fusion protein according to the present invention is to be understood as the expression product of a fused gene.
  • a fused gene is created by linking two or more genes or gene fragments, which creates a new combination.
  • a wild-type IL-15 according to the present invention is understood to mean the naturally occurring IL-15, as described, for example, in Grabstein et al, (1994) Science 264 (5161): 965-8 or allelic variants thereof.
  • Fc (fragment crystallizable) fragment is to be understood as the fragment of an antibody which does not bind any antigens, for example an antibody molecule which lacks the variable domains, or also partially or completely the first constant domain of the heavy and light chains.
  • the Fc fragment can come from a natural source, can be produced recombinantly and / or can be synthesized. Appropriate methods are known to the person skilled in the art.
  • the Fc fragment of the fusion protein according to the invention is an immunoglobulinG (IgG), specifically a human or murine IgGl, a human IgG2, a murine IgG2a, a human or murine IgG3 or a human IgG4, preferably a human IgGl or a murine IgG2a, especially especially an IgGl.
  • IgGs were preferably used from the hinge region.
  • the flexible region in the Ig molecule is referred to as the hinge region.
  • murine IgG2b (Schlomchik, MJ, (1987 ), Nature 328, 805-811), human IgG3 (Huck, S. et al., (1986), Nucleic Acids Res. 14 (4): 1779-1789), murine IgG3 (Wels et al., (1984) , EMBO J., 3 (9): 2041-2046) and human IgG4 (Pink et al., (1970), Biochem. J., 117 (1): 33-47).
  • the fusion protein according to the invention is preferably a chimeric fusion protein, for example containing a wild-type IL-15 and a heterologous IgGl -Fc fragment or a heterologous IgG2a-Fc fragment.
  • the fusion protein according to the invention comprises the amino acid sequences SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 5.
  • the invention further relates to a nucleic acid which codes for a fusion protein which on the one hand contains a wild-type IL-15 and on the other hand an IgG-Fc fragment, with the exception of a murine IgG2b-Fc fragment.
  • the nucleic acid according to the invention preferably codes for a wild-type IL-15 and a human or murine IgGl, a human IgG2, a murine IgG2a, a human or murine IgG3 or a human IgG4, particularly preferably for a human IgGl or a murine IgG2a, most preferably for an IgGl.
  • the nucleic acid according to the invention preferably encodes a fusion protein with one of the amino acid sequences SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 5.
  • the nucleic acid according to the invention contains the DNA sequences SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 10.
  • a nucleic acid in the sense of the present invention means an RNA or DNA, in particular genomic DNA, cDNA or synthetic DNA, which was synthesized, for example, at the phosphoramidation level. Combinations and or modifications of nucleotides of these nucleic acids are also included. This term also includes single and double-stranded nucleic acids.
  • nucleic acids which contain functionally linked components, for example one or more fused genes or active parts thereof coding for one or more fusion proteins according to the invention, and regulatable elements and / or regulative nucleotide sequences which influence the expression of the gene (s) in terms of quantity and / or as a function of time ,
  • Regulable elements are, for example, promoters for constitutive or cell-specific or tissue-specific expression.
  • Regulatory nucleotide sequences include, for example, leader sequences, polyadenylation sequences, e.g. an SV40 polyadenylation signal, enhancer sequences, IRES sequences and introns.
  • leader sequences of the present inventions are, for example, those listed below: Igk leader:
  • CD5 leader
  • short native IL-15 leader 5 , -ATGTCTTCATTTTGGGCTGTTTCAGTGCAGGGCTTCCTAA-3 ,
  • the components are functionally linked if they are linked in such a way that the sequence (s) of the genes or genes contained are or will be transcribed under the influence of the transcription regulation.
  • the invention further relates to a vector which contains at least one nucleic acid according to the invention.
  • Vectors in the sense of the present invention can be plasmids, shuttle vectors, phagemids, cosmids, adenoviral vectors, retroviral vectors, expression vectors and vectors with gene therapy effects.
  • Expression vectors in the sense of the present invention include at least one nucleic acid according to the invention, at least one translation initiation signal, a translation termination signal and / or a polyadenylation signal for expression in eukaryotes.
  • pIRES from Clontech, Palo Alto, USA
  • pCI-neo vector from Promega, Madison, USA
  • pCMV-Script from Stratagene, La Jolla, USA
  • pCDNA vector Invitrogen, Paisley, UK
  • Gene-therapeutic vectors according to the invention are, for example, virus vectors, for example adenovirus vectors, retroviral vectors or vectors which are based on replicons of RNA viruses (Lindemann et al., 1997, Mol. Med. 3: 466-76; Springer et al. , 1998, Mol. Cell. 2: 549-58; Khromykh, 2000, Curr. Opin. Mol. Ther .; 2: 555-69).
  • Vectors with gene therapy effects can also be obtained by complexing the nucleic acid fragments according to the invention with liposomes. In lipofection, small unilamellar vesicles are made from cationic lipids by ultrasound treatment of the liposome suspension.
  • the DNA is ionically bound to the surface of the liposomes in such a ratio that a positive net charge remains and the plasmid DNA is 100% complexed by the liposomes.
  • DOTMA 1,2-dioleyloxypropyl-3-trimethylammonium bromide
  • DPOE diioloxylphosphatidylethanolamine
  • lipid formulations examples include DOTAP N- [1 - (2,3-dioleoyloxy) propyl] -N, N, N-trimethyl-ammoniumethyl-sulfate or DOGS (TRANSFECTAM; diocta-decylamidoglycylspermin).
  • Excipients that increase the transport of nucleic acids into the cells can be, for example, proteins or peptides that are bound to DNA or synthetic peptide-DNA molecules that enable the transport of the nucleic acid into the nucleus of the cell (Schwartz et al., 1999, Gene Therapy 6: 282; Branden et al.
  • Auxiliaries also include molecules that enable the release of nucleic acids into the cytoplasm of the cell (Planck et al., 1994, J. Biol. Chem. 269, 12918; Kichler et al., 1997, Bioconj. Chem. 8, 213) or for example liposomes (Uhlmann and Peimann, 1990, Chem. Rev. 90, 544).
  • the invention relates to a cell which contains at least one nucleic acid according to the invention and / or at least one vector according to the invention.
  • This cell is preferably a precursor cell, an immortalized cell or a stem cell, in particular a pluripotent or multipotent embryonic, fetal, neonatal or adult stem cell.
  • pluripotent embryonic stem cells or cell lines can be obtained from the inner cell mass of blastocytes (Robertson, Embryo-derived stem cell lines, in Teratocarcinomas and embryonic stem cells: a practical approach, Robertson, editor, IRL Press, Washington DC, 1987)
  • Particularly preferred stem cells derived from adult tissue include, for example, neuronal stem cells, stem cells from the bone marrow, mesenchymal stem cells, hematopoietic stem cells, epithelial stem cells, stem cells from the digestive tract and duct stem cells.
  • Cells according to the invention are, for example, epithelial cells, vascular cells, liver cells, heart cells, skin cells, muscle cells, nerve cells, bone marrow cells, CHO cells (ovary cells) and cells from the pancreas, from the kidney, from the eye or from the lungs.
  • the cell according to the invention is in particular a mammalian cell, including a human cell.
  • This cell can originate, for example, from a human, a mouse, a rat, a guinea pig, a rabbit, a cow, a goat, a sheep, a horse, a pig, a dog, a cat or a monkey, preferably from a human ,
  • the cells of the invention can also be used to express a heterologous gene.
  • the cell according to the invention is preferably in the form of a cell line.
  • a cell line according to the invention can be produced by transfection, transformation or infection of a cell line with a nucleic acid according to the invention or a vector according to the invention with the aid of methods which Those skilled in the art are familiar, for example transfection, transformation, electroporation, microinjection or infection.
  • the invention further relates to a medicament comprising at least one fusion protein according to the invention, at least one nucleic acid according to the invention, at least one vector according to the invention and / or at least one cell according to the invention and, if appropriate, suitable auxiliaries and / or additives.
  • auxiliaries and / or additives which are used, for example, to stabilize or preserve the medicament or diagnostic agent, are generally known to the person skilled in the art.
  • auxiliaries and / or additives are physiological saline solutions, Ringer's dextrose, dextrose, Ringer's lactate, demineralized water, stabilizers, antioxidants, complexing agents, antimicrobial compounds, proteinase inhibitors and / or inert gases.
  • the medicament according to the invention can e.g. for prophylaxis, therapy or diagnosis of diseases.
  • diseases include, for example: rheumatic diseases, for example rheumatic arthritis, Sjogren's syndrome, scleroderma, dermatomyositis, polymyositis., Reiter's
  • Type I or type II diabetes are Type I or type II diabetes.
  • Autoimmune diseases of the thyroid gland for example Graves' disease, Hashimoto's thyroiditis, • Autoimmune diseases of the central nervous system, for example multiple sclerosis,
  • Skin diseases for example psoriasis, neurodermatitis, inflammatory bowel diseases, for example Crohn's disease, Immune disorders, such as AIDS
  • Post-transplant diseases for example graft rejection reactions and • tumor diseases.
  • the medicament according to the invention is administered by the methods familiar to the person skilled in the art, for example intravenously, intraperitoneally, intramuscularly, subcutaneously, intracranially, intraorbitally, intracapsularly, intraspinally, transmuscularly, topically or orally.
  • Other methods of administration are, for example, systemic or local injection, perfusion or catheter-based administration.
  • the medicament according to the invention can, for example, be administered orally, e.g. Tablets or capsules, over the mucous membrane, e.g. the nose or oral cavity, in the form of sprays implanted in the lungs or in the form of disposers under the skin.
  • Trans-dermal therapeutic systems are e.g. known from EP 0 944 398-A1, EP 0 916 336-A1, EP 0 889 723-A1 or EP 0 852 493-A1.
  • the drug can be introduced into the organism either using an ex vivo approach in which the cells are removed from the patient, genetically modified, for example by DNA transfection, and then reintroduced into the patient or using an in vivo approach, in which vectors according to the invention having gene therapy effects are introduced into the patient's body, as naked DNA or using viral or non-viral vectors according to the invention or cells according to the invention.
  • the dosage of drugs depends on several factors, for example on the body weight, the general state of health, the extent of the body surface, the age of the patient and the interaction with other drugs. Dosage also depends on the type of administration. The dosage must therefore be determined by the specialist in each individual case for each patient.
  • the drug can be administered once or several times a day and over several days, and this can also be determined by a person skilled in the art.
  • Another object of the invention relates to a human or animal organ-specific tissue and / or a human or animal mammalian organ, containing at least one fusion protein, at least one nucleic acid coding for said fusion protein, containing at least one vector containing at least one nucleic acid and / or at least one cell at least one said nucleic acid and / or at least one said vector, the fusion protein containing a wild-type IL-15 and an Fc fragment.
  • the fusion protein of the human or animal organ-specific tissue according to the invention and / or the human or animal mammalian organ according to the invention preferably contains on the one hand a wild-type IL-15 and on the other hand a human or murine IgGl, a human IgG2, a murine IgG2a, a murine IgG2b, a human or murine IgG3 or a human IgG4, preferably a human IgGl or a murine IgG2a, in particular an IgGl, particularly preferably no murine IgG2b.
  • Human or animal organ-specific tissue of the present invention can include, for example, tissue from the pancreas, including, for example, the Langerhan islet cells, as well as heart, heart muscle, kidney, liver, lung, spleen, cartilage, ligament, retina, cornea -, bone marrow, skin, nerve and / or muscle tissue.
  • Human or animal mammalian organs of the present invention can be, for example, the pancreas, the heart, the pancreas, the kidney, the liver, the lungs, the spleen, the eye and / or the skin.
  • the invention further relates to a transgenic non-human mammal which contains at least one fusion protein, at least one nucleic acid which codes for the fusion protein mentioned, at least one vector which contains at least one nucleic acid and or at least one cell which has at least one contains said nucleic acid and / or at least one vector, the fusion protein containing a wild-type IL-15 and an Fc fragment.
  • the fusion protein of the transgenic non-human mammal according to the invention preferably contains on the one hand a wild-type IL-15 and on the other hand a human or murine IgGl, a human IgG2, a murine IgG2a, a murine IgG2b, a human or murine IgG3 or a human IgG4, preferably a human IgGl or a murine IgG2a, in particular an IgGl, particularly preferably no murine IgG2b.
  • Trahsgenic animals generally show a tissue-specific increased expression of nucleic acids and are therefore very suitable for the analysis of, for example, immune reactions.
  • Transgenic mice are preferably used.
  • a non-human mammal according to the invention is, for example, a mouse, a rat, a guinea pig, a rabbit, a cow, a goat, a sheep, a horse, a pig, a dog, a cat or a monkey.
  • the invention also relates to the uses of a fusion protein, a nucleic acid coding for the said fusion protein ; a vector containing at least one named nucleic acid and or a cell containing either at least one named nucleic acid and / or a named vector containing at least one nucleic acid mentioned, wherein the fusion protein contains a wild-type IL-15 and an Fc fragment, or a human or animal organ-specific tissue according to the invention and / or a human or animal mammalian organ according to the invention: to inhibit an IL-15 mediated cellular event, for inhibiting the interaction of an IL-15 with its receptor and / or for the prophylaxis and / or therapy of secondary transplant diseases, in particular transplant rejection reactions and / or autoimmune diseases.
  • Another object of the invention is the use of a fusion protein, a nucleic acid coding for said fusion protein, a vector containing at least one named nucleic acid and / or a cell containing at least one named nucleic acid and / or said vector, the fusion protein being a wild-type Contains IL-15 and an Fc fragment, for the lysis of cells which express an IL-15 receptor.
  • the fusion protein of the uses according to the invention preferably contains, on the one hand, a wild-type IL-15 and, on the other hand, a human or murine IgGl, a human IgG2, a murine IgG2a, a murine IgG2b, a human or murine IgG3 or a human IgG4, preferably a human IgGl or murine IgG2a, in particular an IgGl, particularly preferably no murine IgG2b.
  • the uses according to the invention are preferably carried out in or in a human or animal mammal.
  • a human mammal in the sense of the present invention is a human
  • an animal mammal in the sense of the present invention is, for example, a mouse, a rat, a guinea pig, a rabbit, a cow, a goat, a sheep, a horse, to understand a pig, a dog, a cat or a monkey.
  • the present invention furthermore relates to the use of the human or animal organ-specific tissue according to the invention and / or the human or animal mammalian organ according to the invention for transplantation into a human or animal mammal. It is preferably an auto, allo or xenograft.
  • the transplant is the transfer of living material, e.g. of cells, tissues or organs, from one part of the body to another (autogenous transplantation) or from one individual to another (allogeneic, syngeneic and xenogeneic transplantation) (Klein, J. S, (1991) Immunologie, 1st edition, VHC Verlagsgesellschaft, Weinheim, p. 483) according to methods generally known to the person skilled in the art. A distinction is made between transplantation into another organism
  • Another aspect of the invention is a method for producing a fusion protein according to the invention, which contains the following steps: a. Introducing at least one nucleic acid according to the invention and / or at least one vector according to the invention into a cell, and b. Expression of the nucleic acid under suitable conditions.
  • nucleic acids, vectors and genes for example differentiation marker genes or transfection marker genes, into cells are well known to the person skilled in the art and comprise the methods customary in the prior art, for example electroporation, injection, transfection and / or transformation. These methods are particularly preferred when the substance is naked nucleic acids, in particular DNA.
  • Suitable conditions for the expression of the nucleic acid can be created, for example, by expression vectors, for example by the aforementioned expression vectors and regulatable elements, for example promoters or regulative nucleic acid sequences.
  • expression vectors also contain promoters suitable for the respective cell or the gene to be transcribed in each case.
  • regulatable elements which enable constitutive expression in eukaryotes are promoters which are recognized by RNA polymerase II.
  • Such promoters for constitutive expression in all cell and tissue types are e.g. the CDl lc promoter, pGk (phosphoglycerate kinase) promoter, the CMV (cytomegalovirus) promoter, the TK (thymidine kinase) promoter, the EFl (elongation factor l-alpha) promoter, the SV40 (Simian Virus) promoter, the RSV (Rous Sarcoma Virus) promoter and the pUB (Ubiquitin) promoter.
  • CDl lc promoter e.g. the CDl lc promoter
  • pGk phosphoglycerate kinase
  • CMV cytomegalovirus
  • TK thymidine kinase
  • EFl elongation factor l-alpha
  • SV40
  • regulatable elements which enable cell-specific or tissue-specific expression in eukaryotes are promoters or activator sequences from promoters or enhancers of those genes which code for proteins which are only expressed in certain cell types.
  • promoters are for example the insulin promoter for beta cells of the pancreas, the Sox-2 promoter for nerve cells, the albumin promoter for liver cells, the myosin heavy chain promoter for muscle cells, the VE-cadherin promoter for endo- thel cells and the keratin promoter for epithelial cells.
  • Expression can also be controlled via regulatory nucleotide sequences that influence expression in terms of quantity and / or time. These include, for example, enhancer sequences, leader sequences, polyadenylation sequences, IRES sequences and introns.
  • Another object of the invention is an in vitro method for producing a human or animal organ-specific tissue according to the invention and / or a human or animal mammalian organ according to the invention, which contains the following steps: a. Introducing into at least one stem cell, a precursor cell and / or an immortalized cell of a human or animal organ-specific tissue and / or a human or animal mammalian organ on the one hand encoding at least one nucleic acid for a fusion protein and / or at least one vector containing at least one named nucleic acid, wherein the fusion protein contains a wild-type IL-15 and an Fc fragment, and on the other hand at least one suitable differentiation marker gene, b. Differentiation of the cell from step a., C. Selection of the differentiated cell from step b. and d. Introduce the selected cell from step c. in at least one human or animal organ-specific tissue and / or in at least one human or animal mammalian organ.
  • step a after, before or simultaneously with step a. at least one suitable transfection marker gene is introduced and after step a. preferably the transfected cell from step a. selected.
  • suitable conditions for the differentiation of the cells can be created, for example, by adding growth factors which initiate the desired cell differentiation.
  • the method according to the invention preferably contains a positive selection scheme.
  • a marker gene for example a gene which transmits antibiotic resistance, is introduced into the cell before, during or after the differentiation step and is expressed under suitable conditions.
  • suitable conditions can consist, for example, in that the expression of the marker gene is under the control of a promoter which is only active in the desired cells.
  • the expression of the marker gene confers resistance to the antibiotic to the successfully differentiated cells.
  • the selection of the cells following the differentiation can therefore easily be carried out, for example, by bringing the cells into contact with the corresponding antibiotic. Cells that do not contain the appropriate antibiotic resistance die, so that only the differentiated cells survive.
  • contacting can take place, for example, by adding the active substances into the nutrient medium of a cell culture.
  • An antibiotic according to the invention means an antibiotic against which the antibiotic resistance gene (s) used as the selection cassette according to the invention produces resistance. After the antibiotic has been added to the cultured stem cells, only those stem cells which contain the reporter gene expression vector essentially survive and differentiate.
  • a second marker gene is preferably introduced into the cells, as a result of which a selection of the cells in which the introduction of the nucleic acid and / or the vector according to step a. the procedure was successful, can be carried out. This double selection makes it possible to obtain an approximately 90%, preferably approximately 95-100% pure cell population of the desired cells.
  • Differentiation marker genes and transfection marker genes can be used for such selections, for example. As such, genes are predominantly used which impart resistance to certain toxic substances, for example antibiotics.
  • antibiotics for example antibiotics.
  • the most common antibiotics used in this context are neomycin, hygromycin (hph), zeocin (Sh ble) and puromycin (pacA).
  • genes suitable for selection are, for example, genes which express the expression of surface molecules or of fluorescent markers, e.g. Regulate GFP, with the help of which the cells to be selected can be cleaned by cell sorting.
  • Another object of the invention is a method for producing a transgenic non-human mammal according to the invention, which contains the following steps: a. Introduction into at least one oocyte, a stem cell, a precursor cell and / or an immortalized cell of a non-human mammal, on the one hand at least one nucleic acid coding for a fusion protein and / or at least one vector containing at least one said nucleic acid, wherein the fusion protein contains a wild-type IL-15 and an Fc fragment, and on the other hand at least one suitable transfection marker gene, b. Selection of the transfected cell from step a., C. Introduce the after step b. selected cell into at least one non-human mammalian blastocyte, d. Introduce the blastocyte from step c. into a non-human, preferably pregnant woman, mammal foster mother and e. Identification of the transgenic non-human mammal developed from said blastocyte.
  • blastocytes are known to the person skilled in the art. It can be done, for example, by injection (Hogan, B., Beddington, R., Constantini, F. and Lacy, E., A laboratory Manual (1994), Cold Spring " Harbor Laboratory Press).
  • a transgenic non-human mammal can be identified, for example, by extracting genomic DNA from the transgenic non-human mammal, e.g. from the tail of a mouse. In a subsequent PCR (polymerase chain reaction), primers are used which specifically recognize the transgene for the nucleic acid according to the invention. Integration of the transgene can be demonstrated in this way.
  • genomic DNA is transferred to a membrane and detected by means of DNA probes, for example radioactively labeled DNA probes, which are specific for the transgene sought.
  • Mammals by regenerating a non-human stem cell, oocyte, vrufler cell or immortalized cell to a transgenic non-human animal, in particular from transgenic mice, are known to those skilled in the art from DE 196 25 049 and U.S.
  • a transgenic non-human mammal according to the invention can also be produced by direct injection of a nucleic acid according to the invention into the pronucleus (pronucleus) of a non-human mammal.
  • transgenic animals in particular transgenic mice
  • processes for the production of transgenic animals are also known to the person skilled in the art, inter alia. known from WO 98/36052, WO 01/32855, DE 196 25 049, US 4,736,866, US 5,625,122, US 5,698,765, US 5,583,278 and US 5,750,825 and include transgenic animals which are used, for example, via direct injection of vectors according to the invention into embryos or spermatocytes or can be generated via the transfection of vectors or nucleic acids in embryonic stem cells (Polites and Pinkert, in Pinkert, (1994) Transgenic animal technology, A Laboratory Handbook, Academic Press, London, UK, pages 15 to 68; Doetschman, in Pinkert, 1994 , supra, pages 115 to 146).
  • Another object of the invention relates to a transgenic non-human mammal produced according to the method according to the invention described above and to its progeny.
  • the stem cell is involved, which in the in-vitro method according to the invention mentioned for producing a human or animal organ-specific tissue according to the invention and / or a human or animal mammalian organ according to the invention and in the method for producing a transgenic non-inventive human mammal is used to generate a pluripotent or multipotent embryonic, fetal, neonatal or adult stem cell.
  • An object of the invention is the use of a transgenic non-human according to the invention for the production of a cell, an organ-specific tissue and / or a mammalian organ for allo- and / or xenotransplantation.
  • this can take place, for example, by means of an implantation method or by means of a catheter injection method through the blood vessel wall.
  • extraction means the removal of the cell, tissue and / or organ mentioned from the organism of a transgenic non-human mammal according to the invention. Appropriate methods of removal are generally known to the person skilled in the art.
  • the invention also relates to the use of a transgenic non-human mammal according to the invention, a human or animal organ-specific tissue according to the invention and / or a human or animal mammalian organ according to the invention for finding pharmacologically active substances and / or for identifying toxic substances.
  • one such method could be to sow cells of the present invention on a 96-well microtiter plate, then to test one Add appropriate pharmacologically active or toxic substance and then analyze by cell count whether the substance has caused an increased death of the cells.
  • pharmacologically active substance and toxic substance in the sense of the invention are understood to mean all those molecules, compounds and / or compositions and substance mixtures which, under suitable conditions, have a pharmacological or toxic influence on individual cells, individual tissues, individual organs or the whole Exercise organism of an animal or human mammal.
  • Possible pharmacologically active substances and toxic substances can be simple chemical (organic or inorganic) molecules or compounds, nucleic acids or analogs of nucleic acids, anti-sense sequences of nucleic acids, peptides, proteins or complexes and antibodies. Examples are organic molecules that come from substance libraries and that are examined for their pharmacological or toxic activity.
  • Pharmacologically active substances are, for example, active substances which exert an influence on: • the ability of cells to divide and / or survive, the secretion of proteins, eg insulin from beta cells of the pancreas, dopamine from nerve cells, muscle cell contraction and / or the migration behavior of cells. When applied to the entire organism of an animal or human mammal, this is to be understood as influencing, for example, the cardiovascular system, the nervous system and the metabolic activities.
  • Toxic substances are, for example, active substances that
  • the identified pharmacologically active substances and toxic substances can optionally be combined or used together with suitable additives and / or auxiliary substances for the production of a diagnostic agent or a medicament for the diagnosis, prophylaxis and or therapy of secondary transplant diseases and / or autoimmune diseases, as exemplified above.
  • FIG. 1 a is an illustration of the amino acid sequence WT-IL-15-hIgG1
  • FIG. 1 b is an illustration of the amino acid sequence WT-IL-15-mIgG2a
  • Figure 2a is an illustration of the amino acid sequence WT-IL-15.
  • Figure 2b is an illustration of the hlgGl amino acid sequence
  • 2c is an illustration of the amino acid sequence mIgG2a
  • Figure 3a is a picture of the amino acid sequence Igk8
  • Figure 3b is a picture of the amino acid sequence 149-Fc
  • 6a is an illustration of the nucleic acid sequence WT-IL-15
  • FIG. 6b is an illustration of the nucleic acid sequence hlgGl
  • FIG. 7 is an illustration of the nucleic acid sequence mIgG2a
  • 8a is an illustration of the nucleic acid sequence of murine IgK leaders
  • FIG. 8b is an illustration of the nucleic acid sequence of human CD5 leaders
  • FIG. 8c is an illustration of the nucleic acid sequence of human CD4 leaders
  • FIG. 8d is an illustration of the nucleic acid sequence of human IL5 leaders 2-leader
  • Figure 9a is an illustration of the nucleic acid sequence of human MCP leaders
  • Figure 9b is an illustration of the nucleic acid sequence of the short native human
  • Figure 9c is an illustration of the nucleic acid sequence of the long native human
  • FIG. 10 is an illustration of the nucleic acid sequence Igk8
  • FIG. 11 is an illustration of the nucleic acid sequence 149-Fc
  • FIG. 12 is an illustration of the inhibitory or proliferation-promoting effect of different protein constructs on the IL-15 mediated Proliferation of CTLL-2 cells.
  • hlgGl stands for human IgGl
  • mIgG2a stands for murine IgG2a.
  • SEQ ID NO: 5 or an allelic variant thereof.
  • nucleic acid coding for a fusion protein according to at least one
  • nucleic acid according to (viii) containing the DNA sequence SEQ ID NO: 8 or an allelic variant thereof.
  • nucleic acid according to (viii) containing the DNA sequence SEQ ID NO: 9. or an allelic variant of it.
  • nucleic acid according to (viii) containing the DNA sequence SEQ ID NO: 10 or an allelic variant thereof.
  • Medicaments containing at least one fusion protein according to one (i) to (vii) and (xiv), at least one nucleic acid according to one (viii) to (xiii), at least one vector according to (xv) and / or at least one cell according to one (xvi) to (xviii) and suitable auxiliaries and / or additives.
  • transgenic non-human mammal containing at least one fusion protein, in particular for one (i) - (vii) and (xiv), at least one nucleic acid coding for said fusion protein, in particular for one (viii) - (xiii), at least one vector, in particular according to (xv), containing at least one nucleic acid and or at least one cell, in particular after (xvi) - (xviii), containing at least one nucleic acid and / or at least one vector, the fusion protein contains a wild-type IL-15 and an Fc fragment.
  • a fusion protein in particular for a (i) - (vii) and (xiv), a nucleic acid, in particular for a (viii) - (xiii), a vector, in particular for a (xv), and / or one Cell, in particular according to a (xvi) - (xviii), the fusion protein containing a wild-type IL-15 and an Fc fragment or a human or animal organ-specific tissue and / or a human or animal mammalian organ according to (xxi) for the production of a Medicines to inhibit an IL-15 mediated cellular event.
  • a fusion protein in particular for a (i) - (vii) and (xiv), a nucleic acid, in particular for a (viii) - (xiii), a vector, in particular for (xv), and / or a cell , in particular according to a (xvi) - (xviii), the fusion protein containing a wild-type IL-15 and an Fc fragment or a human or animal organ-specific tissue and / or a human or animal mammalian organ according to (xxi), for the manufacture of a medicament to inhibit the interaction of an IL-15 with its receptor.
  • a fusion protein in particular after (i) - (vii) and (xiv), a nucleic acid, in particular after (viii) - (xiii), a vector, in particular after (xv), and / or one Cell, in particular according to an (xvi) - (xviii), wherein the fusion protein contains a wild-type IL-15 and an Fc fragment, for the manufacture of a medicament for the lysis of cells which express an IL-15 receptor.
  • a fusion protein in particular for a (i) - (vii) and (xiv), a nucleic acid, in particular for a (viii) - (xiii), a vector, in particular for (xv), and / or a cell , in particular according to a (xvi) - (xviii), the fusion protein containing a wild-type IL-15 and an Fc fragment or a human or animal organ-specific tissue and / or a human or animal mammalian organ according to (xxi), for the manufacture of a medicament to
  • Prophylaxis and / or therapy of secondary transplant diseases and / or autoimmune diseases are prophylaxis and / or therapy of secondary transplant diseases and / or autoimmune diseases.
  • (xxii) comprising the following steps: a. Introduction into at least one oocyte, a stem cell, a precursor cell and / or an immortalized cell of a non-human mammal, on the one hand at least one nucleic acid, in particular after one (vii) - (xiii), coding for a fusion protein and / or at least one vector, in particular according to (xv), containing at least one named nucleic acid, the fusion protein containing a wild-type IL-15 and an Fc fragment, and on the other hand at least a suitable transfection marker gene, b. Selection of the transferred cell from step a., C. Introduce the after step b. selected cell into at least one non-human mammalian blastocyte, d. Introduce the blastocyte from step c. into a non-human mammal foster mother and e. Identification of the transgenic non-human mammal developed from said blastocyte.
  • reagents such as cell culture media, enzymes, etc. were obtained from Invitrogen (formerly Gibco BRL / Life Technologies), Paisley, UK, and laboratory chemicals from Roth (Karlsruhe, DE).
  • the starting point was a plasmid which in the vector pSecTagA (Invitrogen, Paisley, UK) the cDNA of a fusion protein from a mutated human IL-15 and a murine IgG2a-Fc part (Hinge-C2-C3, Kim et al. 1998, supra ) included.
  • the fusion of IL-15 with the Fc part took place via a BamHI site, whereby an additional amino acid (aspartate) was inserted at the transition.
  • the leader sequences of human IL-2, MCP-1, CD4 and CD5 can alternatively be cloned in.
  • the vector pSecTagA was cut without insert with BglII (approach: 9 ⁇ g DNA, 4 ⁇ l 10X buffer 2, 26 ⁇ l water, 4 ⁇ l BglII (40 units) in a total of 40 ⁇ l, incubation for 2 h at 37 ° C.).
  • the DNA was purified from enzyme and buffer on a Pharmacia S400 microspin column (Amersham-Pharmacia, Freiburg). 40 ⁇ l of the batch were mixed with 5 ⁇ l 10 ⁇ PCR buffer (Taq-Core-Kit, Qiagen, Hilden), 2 ⁇ l dNTPs (10 mM each, Taq-Core-Kit, Qiagen), 2 ⁇ l water and 1 ⁇ l (4 units ) DNA polymerase I (Klenow fragment) were added and incubated for 1 h at 37 ° C. in order to fill up the BglII site.
  • the plasmid was then applied to a 1% agarose gel and the band eluted from the gel using the Concert Rapid-Gel-Extraction System. The entire batch was taken up in 100 ⁇ l of water. 7.5 ⁇ l thereof were ligated together with 7.5 ⁇ l water, 4 ⁇ l 5 ⁇ T4 ligase buffer and 1 ⁇ l T4 ligase (1U) for 1 h at room temperature. Half of the ligation approach was transformed into E.coli XL1 Blue (Stratagene, La Jolla, USA) according to the manufacturer's instructions.
  • Ig-kappa leader + 10 additional amino acid mutIL-15-mIgG2a was cloned into the resulting plasmid again via the interfaces Nhel and Xbal.
  • the original Ig-kappa leader + 10 amino acids + 5'-IL-15 part was then removed via an Nhel / BglII cut and replaced by an oligonucleotide cloning with the above-mentioned signal sequences.
  • the fragment was as follows: 5'-NheI-Leader-IL-15-3 'with a BglII interface in the 5' section of the IL-15. Since this fragment was too long to be covered by a single oligonucleotide, two overlapping oligos and their complementary strands (4 oligonucleotides in total) were obtained from MWG-Biotech (Ebersberg) (sequence of the oligonucleotides see below). The single-stranded oligonucleotides were chosen so that overhanging ends were already available for cloning into the corresponding restriction sites (Nhel, Bglll). The oligonucleotides were first phosphorylated.
  • each oligo were incubated in a 20 ⁇ l mixture with 2 ⁇ l 10 ⁇ forward buffer and 1 ⁇ l T4 polynucleotide kinase (10 U) for 1 h at 37 ° C. Subsequently, equimolar amounts of each strand and counter-strand oligo were annealed by heating to 95 ° C. and slowly cooling to room temperature. The double-stranded oligonucleotides were ligated overnight before cloning into the vector.
  • the clones obtained were examined for their restriction pattern in the Miniprep (QIAamp DNA Mini Kit, Qiagen, Hilden). For this purpose, a triple digestion with Nhel / Bglll (restriction enzymes which directly cut out the leader used) and Xbal (cuts 3 'of the Fc part) was carried out.
  • the DNA positive clones were isolated using the Qiagen Endofree Maxi kit according to the manufacturer's instructions and sequenced at GATC (Constance).
  • the resulting plasmid (mutIL-15 101/108) -mIgG2a with purified Ig kappa leader was called Igk8.
  • PCR was carried out using a forward primer with a BglII cleavage site at the 5 'end (IL-15fw3.1: 5'-attgaagatcttattcaatctatgc-3') and corresponding 3 'reverse primer (WT: 5'- ggatccgaagtgttgatgaacatttggacaatatgtacaaactctgcaaaaattc-3 '), (149: 5' - gggatcc- gaagtgttgatgaacatttgga-3 ') produced the individual mutants.
  • HEK293 cells ATCC, Manassas, USA
  • the proteins of the single mutants were prepared: To this was added per 150cm 2 plate 60 .mu.l lipofectamine2000 in 2 ml Optimem 1 medium and 30 ug plasmid DNA (IgK8, WT-Fc , 149-Fc) also diluted in 2 ml Optimem 1 medium. The two solutions were mixed and incubated for 30 minutes at room temperature. The DNA / liposome mixture was then added to approximately 80% confluent 150 cm 2 HEK-293 plates in the cell culture medium (Dulbecco's MEM + Glutamax + 10% FCS + 1% Pen / Strep).
  • the medium was changed to ultraculture medium (Biowhittaker, Verviers, Belgium) and the cell culture medium was then left on the cells for 4 days.
  • the cell culture supernatant was collected, passed through a folded filter (Schleicher and Schüll, Dassel) to remove the coarse cell components, then sterile filtered through a 2 ⁇ m bottle top filter (Nalgene-Nunc, Wiesbaden) and the IL-15-Fc - Fusion protein isolated by purification via Protein A Sepharose.
  • Protein A-Sepharose (Amersham-Pharmacia, 50% ov / v in washing buffer) swollen in liter buffer (20 mM Tris / HCl, pH 8.5, 130 mM NaCl) were added per liter cell culture supernatant and the mixture was added Shaken 4 ° C overnight in an overhead shaker.
  • the ProteinA-Sepharose was collected in an empty chromatography column and washed with at least 150 ml wash buffer. The protein was eluted from the column with 0.1 M glycine pH 2.5 in 1 ml fractions and immediately neutralized with 60 ⁇ l IM Tris / HCl, pH 9.5.
  • the protein was dialyzed against PBS buffer and sterile filtered. The concentration of the protein was determined in the BCA assay (Pierce, Rockford, USA) and using silver gel and Western blot (first antibody: monoclonal mouse anti-human IL-15, BD Biosciences Pharmingen, San Diego USA, second antibody: POD-Goat anti mouse, Dianova, Hamburg), purity and identity checked. The functionality of the protein was then examined in the proliferation assay.
  • CTLL-2 cells are murine cytotoxic T cells whose proliferation is dependent on IL-15 or IL-2 and which can therefore serve as indicators for the proliferation-inhibiting effect of antagonistic proteins.
  • the cells were cultured in a medium consisting of RPMI1640 medium + 10% heat-activated fetal calf serum (FCS) + 1% Pen Strep + 20% advises T-Stim with ConA (Becton Dickinson Labware, Bedford, USA), a mixture different growth factors.
  • FCS heat-activated fetal calf serum
  • Pen Strep + 20% advises T-Stim with ConA (Becton Dickinson Labware, Bedford, USA), a mixture different growth factors.
  • the cells were freed of the remaining growth factors necessary for the culture of the cells by washing twice with cell culture medium (RPMI 1640 + 10% FCS + 1% Pe ⁇ / Strep) and then also being taken up in this medium. For this, the cells were centrifuged at 349 g for 5 min, the supern
  • the assay was carried out in flat bottom 96-well plates and 150 .mu.l of medium with 3 ⁇ 10 4 cell wells were used per well.
  • the cells received only medium with 10% FCS, without additional factors.
  • the positive control additionally contained recombinant human IL-15 (R&D Systems, Minneapolis, USA) in a concentration which allows a half-maximal proliferation of the cells (eg 12.5 pg / well). Negative and positive controls were pipetted in 6-fold batches.
  • the cells were determined as for the positive control. wrote with recombinant IL-15 and received additionally purified protein of the double mutant 101/108 starting from Igk8, the wild-type protein (WT-Fc) or the single mutant (149-Fc). The highest concentration used was 2 ⁇ g per well and further 1: 2 dilutions (1 ⁇ g, 0.5 ⁇ g, 0.25 ⁇ g, 0.125 ⁇ g, etc.).
  • mIgG2a (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, USA) was used as non-specific antibody
  • IL-2-Fc which contains a non-mutated cytokine component and thus the proliferation
  • CTLA4-Fc also a structurally related fusion protein, which, however, should not influence the proliferation.
  • Both of the latter proteins were obtained from Chimerigen (Allston, USA). All batches were pipetted in triplicate.
  • the cells were incubated for 44 + 2 hours at 37 ° C. in the CO 2 incubator and then the proliferation was determined using the XTT-Cell Proliferation Kit (Röche) according to the manufacturer's instructions.
  • the two components of the kit were mixed in a ratio of 1:50 (ie, 75 ⁇ l XTT labeling reagent + 1.5 ⁇ l electron coupling reagent).
  • 75 ⁇ l of the mixture were added per well and the plate was measured after an incubation for 4 hours at 37 ° C. in a CO 2 incubator in an ELISA reader at 490 against 690 nm.
  • WT-Fc, 149-Fc and protein of the double mutant 101/108 show an inhibitory effect on the IL-15 mediated proliferation of CTLL-2 cells.
  • IL-2-Fc and IgG2a show a rather proliferation-promoting effect.

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Abstract

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Fusionsproteine aus einem Wildtyp-IL-15 und einem IgG-Fc-Fragment, mit Ausnahme eines murinen IgG2b-Fc-Fragmentes, Nukleinsäure die für diese Proteine kodieren, Vektoren, transformierte Zellen und deren Verwendung zur Herstellung von Medikamenten, beispielsweise zur Prophylaxe und/oder Therapie von Transplantationsfolgeerkrankungen und/oder Autoimmunerkrankungen.

Description

IL-15 Antagonisten
Die Erfindung betrifft Fusionsproteine aus einem Wildtyp-E -15 und einem IgG- Fc-Fragment sowie ihre Herstellung und Verwendung zur Inhibierung von Immunreaktionen und zur Prophylaxe und/oder Therapie von Transplantationsfolge- und/oder Autoimmunerkrankungen.
Eine effektive Immunantwort wird durch die Aktivierung von T-Zellen des Immunsystems, die durch ein Antigen oder Mitogen ausgelöst wird, eingeleitet. Die Aktivierung der T-Zellen erfordert zahlreiche zelluläre Veränderungen, hierzu gehören z.B. die Expression von Cytokinen und deren Rezeptoren. Zu diesen Cy- tokinen gehören unter anderem IL-15 und E -2.
IL-15 und IL-2 sind bekannte Wachstumsfaktoren, die eine signifikante Rolle spielen in der Proliferation und Differenzierung von humanen und murinen T- Zellen, Makrophagen, natürlichen Killer (NK)-Zellen, cytotoxischen T-Zellen (CTL), Lymphozyt-aktivierten Killer (LAK)-Zellen sowie in der Kostimulation von B-Zellen, die beispielsweise durch anti-Immunoglobulin (anti-IgM) oder Phorbolester aktiviert worden sind. Die Proliferation dieser Zellen verstärkt die Immunantwort eines Organismus.
LL-15 wurde erstmals als ein sekretorisches Cytokin beschrieben, das die Proliferation von IL-2 abhängigen murinen cytotoxischen T-Zellen (CTLL-2) induziert. IL-15 wurde als ein 162 Aminosäuren langes Vorläuferprotein mit einer Leader- Sequenz von 48 Aminosäuren, also einem reifen Protein von 114 Aminosäuren Länge, charakterisiert (Grabstein et al., (1994) Science 264(5161):965-8).
IL-15 wird in Epithel- und Fibroblast-Zelllinien sowie Monocyten des peripheren Blutes gebildet. Seine spezifische mRNA wurde ebenfalls in Plazenta, Skelettmuskeln und Nieren gefunden (Grabstein et al., supra)
Neben den gemeinsamen biologischen Eigenschaften, besitzen IL-15 und IL-2 ebenfalls homologe Strukturen. Beide Moleküle binden an mindestens drei ge- trennte Rezeptor-Untereinheiten auf der Membran von T-Zellen, wobei der beta- und der gamma-Untereinheit-Komplex über den die Signaltransduktion erfolgt derselbe ist, während die alpha-Untereinheit spezifisch für die Bindung von IL-15 bzw. IL-2 ist. Es konnte festgestellt werden, dass gegen die alpha-Untereinheit des IL-2 Rezeptors gerichtete Antikörper keinen Effekt auf die IL-15 Bindung an seine spezifische alpha-Untereinheit ausüben (Grabstein et al., supra), wohingegen Antikörper, die gegen die beta-Untereinheit des IL-2 Rezeptors gerichtet waren, die Aktivität von IL-15 blockieren (Giri et al, (1994) EMBO J., 13:2822). Über die beta- und gamma-Untereinheiten von IL-15 erfolgt die Signaltransduktion.
Bei zahlreichen Krankheiten ist es aus therapeutischen Gründen erforderlich, eine Antwort des Immunsystems des Patients zu supprimieren. Hierzu gehören beispielsweise Autoimmunkrankheiten, insbesondere Diabetes mellitus Typ I (Bot- tazzo, G. F., et al, (1985) N Engl J Med 113:353), rheumatische Arthritis, Multip- le Sklerose, chronische Lebererkrankungen, entzündliche Darmerkrankungen, Transplantat-anti-Wirt-Krankheit (graft-versus-host disease [GVHD]) und Transplantat-Abstoßung (Sakai et al., (1998) Gastroenterology, 114(6):1237-1243; Ki- visakk et al., (1998) Clin Exp Immunol, 111(1):193197).
Werden inimunkompetente Zellen von einem genetisch nicht identischen Organismus übertragen, so kommt es zur Reaktion dieser Zellen gegen den Empfängerorganismus (GVHD) (Janeway CA. u. Travers P., Spektrum- Verlag, deutsche Auflage 1995 S. 467).
Für viele lebensbedrohende Krankheiten ist die Transplantation von Organen oder Geweben zur Standardmethode und in zahlreichen Fällen zur einzig lebensrettenden Behandlung geworden. Schwierigkeiten gibt es jedoch im Hinblick auf Abstoßungsreaktionen des Empfängerorganismus, die durch Immunantworten auf die fremden Zelloberflächen-Antigene des Transplantats hervorgerufen werden. t Bei einer Transplantation ist der Grad einer Transplantatabstoßung von dem Ausmaß der histogenetischen Differenz zwischen Spender und Empfänger (Histo- kompatibilität) abhängig. Unterschiede im Antigenmuster von Spender- und Empfängerorganismus rufen in letzterem eine Immunreaktion, resultierend in einer Abstoßungsreaktion, gegen das Transplantat hervor. Die Abstoßung eines Transplantates findet sowohl durch humorale als auch zelluläre Reaktionen statt. Humorale Effektoren sind Antikörper unterschiedlicher Spezifität, wie z.B. Antikörper-abhängige zeilvermittelte Cytotoxität und Antikörper gegen Strukturen des Spender-HLA-Systems. Zelluläre Effektoren stellen insbesondere cytotoxische T- Zellen in Verbindung mit u.a. Makrophagen dar (Immunologie, Janeway CA. u. Travers P., Spektrum- Verlag, deutsche Auflage 1995 S. 522-8).
Ein Therapieansatz ist es, die humorale bzw. zelluläre Immunantwort durch Im- munsuppressiya, insbesondere antagonistische IL-15 bzw. IL-2- Antikörper bzw. IL- 15 bzw. IL-2 Antagonisten zu supprimieren.
Verschiedene Therapien unter Verwendung von Antikörpern gegen IL-15 bzw. IL-2 Moleküle sind beschrieben worden. So konnte beispielsweise die verlängerte Überlebensdauer eines allotransplantierten Primatenherzen durch die Verabrei- chung des monoklonalen Antikörpers anti-IL-2R.beta (Mik.beta-1) erreicht werden (Tinubu et al., (1994) J Immunol. 153:4330). Weiterhin wurde eine Blockierung der Transplantatabstoßung durch monoklonale Antikörper, die gegen das T- Zell spezifische Antigen CD3 gerichtet waren, beschrieben (Mackie et al., (1990) Transplantation 49: 1150).
Des weiteren sind zahlreiche IL-15 Antagonisten beschrieben worden, die das Bindungsverhalten von IL-15 an seinen Rezeptor verändern. Diese Antagonisten wurden durch Einführung von Mutation(en) in die Sequenz des Wildtyp-IL-15 erzielt. So wurde beispielsweise eine Mutation an der Aminosäureposition 56 (Aspartat) [Position 8 nach Abspalten der Leader-Sequenz] beschrieben, durch die zwar eine Bindung an die alpha-Untereinheit des IL-15 Rezeptors erfolgte, jedoch die Bindung an die beta-Untereinheit verhindert wurde (WO 96/26274). In einem anderen Ansatz wurde durch eine Mutation an der Aminosäureposition 156 (Glu- tamin) [Position 108 nach Abspalten der Leader-Sequenz] die Interaktion mit der gamma-Untereinheit inhibiert (WO 96/26274; WO 97/41232). Weiterhin wurde durch PEGyliertes IL-15 eine Bindung an die alpha-Untereinheit ermöglicht. Aus sterischen Gründen war jedoch eine Bindung an die beta-Untereinheit nicht mehr möglich (Pettit et al., (1997) J Biol Chem, 272 4: 2312-2318).
Bei den beschriebenen IL-15 Antagonisten handelt es sich um mutierte IL-15 (mut-IL-15) Sequenzen, die entweder für sich oder als Fusionsprotein antagonistische Wirkungen erzielten. Derartige Fusionsproteine sind Polypeptide, bestehend aus einem N-terminalen mut-IL- 15 -Fragment und einem C-terminalen Fc- Fragment, insbesondere einem murinen IgG2a oder humanen IgGl (WO 97/41232; Kim et al., (1998) J Immunol., 160:5742-5748).
Unter einem Fc (Fragment crystallizable) -Fragment ist das Fragment eines Antikörpers zu verstehen, das keine Antigene bindet. Die beiden weiteren identischen Fab (Fragmentantigen binding) -Fragmente eines Antikörpers haben antigenbin- dende Aktivität (Immunologie, Janeway CA. u. Travers P., Deutsche Auflage (1995), S. 117 und folgende).
Nachteil dieser mutierten IL-15 Moleküle ist jedoch, dass sie gegenüber dem Wildtyp-IL-15 eine veränderte Primär-, Sekundär- und Tertiärstruktur besitzen und dadurch abweichende Degradationspunkte aufweisen, so dass Degradations- produkte auftreten, die in den Zellen natürlicherweise nicht vorkommen, und die toxische Wirkung in dem Organismus entfalten können. Art und Ausmaß derartiger und anderer Nebenwirkungen sind im Detail nicht absehbar.
Weiterer Nachteil ist, dass Patienten, die Transplantate in sich tragen, diese in der Regel Zeit ihres Lebens behalten, so dass sie lebenslang auf die Einnahme von
Immunsupressiva angewiesen sind. Vor allem dadurch, dass nur unzureichende Erkenntnisse über die Nebenwirkungen der Langzeiteinnahme solcher Immun- supressiva vorliegen, besteht dringender Bedarf, diese Nebenwirkungen auszuschließen oder mindestens einzuschränken.
Nachgewiesen wurde bei der Verabreichung immunsuppressiver Komponenten, wie Cyclosporine A, FK506 und Rapamycin, dass diese Agenzien die Proliferation von T-Zellen insgesamt inhibieren (Penn, (1991) Transplant Proc, 23:1101; Beveridge et al., (1984) Lancet 1:788).
Ein großer Nachteil ist, dass die in der Regel systemische Verabreichung solcher Immunsuppressiva zur Verteilung derselben im gesamten Organismus führt und nicht die lokale Präsenz am Ort des/der transplantierten Zellen, Gewebes oder Organs gewährleistet. Die Inhibierung der T-Zellproliferation im gesamten Organismus kann jedoch Infektionen, toxische Abbauprodukte oder sogar Krebs her- vorrufen.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Immunsupressivum herzustellen, das keine bzw. kaum Nebenwirkungen in einem Organismus entfaltet, in welchem eine Immunantwort inhibiert werden soll.
Es ist bekannt, dass mutierte IL-15 Moleküle oder Fusionsproteine, bestehend aus einem mut-IL-15 und einem Fc-Fragment eine antagonistische Wirkung auf IL- 15 entfalten, indem sie das Rezeptorbindungsverhalten inhibieren oder verändern.
Völlig überraschend war allerdings, dass auch ein Fusionsprotein, bestehend aus einem N-terminalen Wildtyp-IL-15 und einem C-terminalen Fc-Fragment, insbesondere einem murinen IgG2a, ebenfalls eine antagonistische Wirkung entfaltet, obwohl an sich eine agonistische Wirkung zu erwarten wäre. Lediglich durch das Anfügen eines Fc-Fragments an ein natürlich vorkommendes, im Normalfall ein immunstimulierendes IL-15 Molekül konnte der Wirkmechanismus, umgekehrt werden, also die Inhibierung einer Immunantwort erreicht werden. Überraschend war diese Erkenntnis gerade deshalb, weil bei der Annahme einer natürlichen Faltung des Wildtyp-IL- 15-Abschnitts des Fusionsproteins nicht davon auszugehen war, dass das Rezeptorbindungsverhalten allein durch das ange- fügte Fc-Fragment derart veränderbar ist, dass das gesamte Molekül Wildtyp-IL- 15-Fc antagonistische Wirkung zum Wildtyp-IL- 15 entfaltet.
Ein Gegenstand der Erfindung ist daher ein Fusionsprotein aus einerseits einem Wildtyp-IL- 15 und andererseits einem IgG-Fc-Fragment, mit Ausnahme eines murinen IgG2b-Fc-Fragments.
Unter einem Fusionsprotein gemäß der vorliegenden Erfindung ist das Expressionsprodukt eines fusionierten Gens zu verstehen. Ein fusioniertes Gen entsteht aus der Verknüpfung zweier oder mehrerer Gene oder Genfragmente, wodurch eine neue Kombination entsteht.
Unter einem Wildtyp-IL- 15 gemäß der vorliegenden Erfindung wird das natürlich vorkommende IL-15 verstanden, wie beispielsweise in Grabstein et al, (1994) Science 264(5161):965-8 beschrieben oder allelischen Varianten davon.
Unter einem Fc(Fragment crystallizable)-Fragment ist das Fragment eines Antikörpers zu verstehen, das keine Antigene bindet, beispielsweise ein Antikörpermolekül, dem die variablen Domänen fehlten, oder auch teilweise oder vollständig die erste konstante Domäne der schweren und leichten Ketten. Das Fc-Fragment kann aus natürlicher Quelle stammen, rekombinant hergestellt werden und/oder synthetisiert werden. Entsprechende Methoden sind dem Fachmann bekannt.
Bei dem Fc-Fragment des erfindungsgemäßen Fusionsproteins handelt es sich um ein ImmunglobulinG (IgG) und zwar um ein humanes oder murines IgGl, ein humanes IgG2, ein murines IgG2a, ein humanes oder murines IgG3 oder ein humanes IgG4, vorzugsweise um ein humanes IgGl oder ein murines IgG2a, insbe- sondere um ein IgGl. Vorzugsweise wurden die IgG's ab der Hinge-Region verwendet. Als Hinge-Region wird die flexible Region im Ig-Molekül bezeichnet.
Unter erfindungsgemäßen IgGΛs sind beispielsweise folgende beschriebene IgCs zu verstehen: humanes IgGl (Paterson, T. et al, (1998), Immunotechnology 4(l):37-47, murines IgG2a (Sikorav, J.L., (1980), Nuleic Acids Res. 8(14):3143-3155), murines IgGl (French et al., (1991), J. Immunol. 146(6):2010-2016, humanes IgG2 (Kra- winkel, U. und Rabbitts, T.H.., (1982), EMBO J. l(4):403-407; Wang et al., (1980), J. Immunol. 125(3): 1048-1054), murines IgG2b (Schlomchik, M.J., (1987), Nature 328, 805-811), humanes IgG3 (Huck, S. et al., (1986), Nucleic Acids Res. 14(4):1779-1789), murines IgG3 (Wels et al., (1984), EMBO J., 3(9):2041-2046) und humanes IgG4 (Pink et al., (1970), Biochem. J., 117(1):33- 47) beschrieben worden.
Vorzugsweise ist das erfindungsgemäße Fusionsprotein ein chimäres Fusionsprotein, beispielsweise enthaltend ein Wildtyp-IL- 15 und ein hetereologes IgGl -Fc- Fragment oder ein hetereologes IgG2a-Fc-Fragment.
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst das erfindungsgemäße Fusionsprotein die Aminosäuresequenzen SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 SEQ ID NO:4 oder SEQ ID NO:5.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft eine Nukleinsäure, die für ein Fu- sionsprotein kodiert, das einerseits ein Wildtyp-IL- 15 und andererseits ein IgG- Fc-Fragment, mit Ausnahme eines murinen IgG2b-Fc-Fragments, enthält.
Vorzugsweise kodiert die erfindungsgemäße Nukleinsäure für ein Wildtyp-IL- 15 und ein humanes oder murines IgGl, ein humanes IgG2, ein murines IgG2a, ein humanes oder murines IgG3 oder ein humanes IgG4, besonders bevorzugt für ein humanes IgGl oder ein murines IgG2a, am bevorzugtesten für ein IgGl . Bevorzugt kodiert die erfindungsgemäße Nukleinsäure ein Fusionsprotein mit einer der Aminosäuresequenzen SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 oder SEQ ID NO:5.
In bevorzugten Ausführungsformen enthält die erfindungsgemäße Nukleinsäure die DNA-Sequenzen SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 oder SEQ ID NO: 10.
Unter einer Nukleinsäure im Sinne der vorliegenden Erfindung versteht man eine RNA oder DNA, insbesondere genomische DNA, cDNA oder synthetische DNA, die beispielsweise auf Phosphoramidierungsebene synthetisiert wurde. Ebenfalls sind Kombinationen und oder Modifikationen von Nukleotiden dieser Nukleinsäuren umfasst. Weiterhin umfasst dieser Begriff einzel- und doppelsträngige Nukleinsäuren.
Ebenso umfasst sind Nukleinsäuren, die funktionell verknüpfte Komponenten beinhalten, beispielsweise ein oder mehrere fusionierte Gene oder aktive Teile davon kodierend für ein oder mehrere erfindungsgemäße Fusionsproteine sowie regulierbare Elemente und/oder regulative Nukleotidsequenzen, die die Expression des/der Gene mengenmäßig und/oder zeitabhängig beeinflussen.
Regulierbare Elemente sind beispielsweise Promotoren für die konstitutive oder zell- bzw. gewebsspezifische Expression.
Regulative Nukleotidsequenzen umfassen beispielsweise Leadersequenzen, Poly- adenylierungssequenzen, z.B. ein SV40-Polyadenylierungssignal, Enhancerse- quenzen, IRES-Sequenzen und Introns.
Bevorzugte Leadersequenzen der vorliegenden Erfindungen sind beispielsweise die nachfolgend aufgeführten: Igk-Leader:
5Λ-ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCC AGGTTCCACTGGTGAC -3\
CD5-Leader:
5 ' -ATGCCC ATGGGGTCTCTGCAACCGCTGGCC ACCTTGTACCTGCTGGG
GATGCTGGTCGCTTCCTGCCTCGGA-3 Λ ,
CD4-Leader:
S'-ATGAACCGGGGAGTCCCTTTTAGGCACTTGCTTCTGGTGCTGCAACT GGCGCTCCTCCC AGC AGCCACTC AGGGA-3 ' ,
IL-2-Leader:
5'-ATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTTGCATTGCACTAAGTCTTGCACT
TGTCACAAACAGT-3λ,
MCP-Leader:
5 ' -TGAAAGTCTCTGCCGCCCTTCTGTGCCTGCTGCTCATAGC AGCC ACC TTC ATTCCCC AAGGGCTCGCT-3 v ,
kurzer nativer IL-15-Leader: 5,-ATGTCTTCATTTTGGGCTGTTTCAGTGCAGGGCTTCCTAA-3,
langer nativer IL-15-Leader:
ATGAGAATTTCGAAACCACATTTGAGAAGTATTTCCATCCAGTGCTACTTGTGTT TACTTCTAAACAGTCATTTTCTAACTGAAGCTGGCATTCATGTCTTCATTTTGGG CTGTTTCAGTGCAGGGCTTCCTAAAACAGAAGCC Die Komponenten sind funktioneil verknüpft, wenn sie derart verbunden sind, dass unter dem Einfluss der Transkriptionsregulation die Sequenz(en) der bzw. des enthaltenen Gene bzw. Gens transkribiert werden bzw. wird.
Weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Vektor, der mindestens eine erfindungsgemäße Nukleinsäure enthält.
Vektoren im Sinne der vorliegenden Erfindung können Plasmide, Shuttle- Vektoren, Phagemide, Cosmide, adenovirale Vektoren, retrovirale Vektoren, Ex- pressionsvektoren und gentherapeutisch wirksame Vektoren sein.
Expressionsvektoren im Sinne der vorliegenden Erfindung umfassen mindestens eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, mindestens ein Translations-Initiations- Signal, ein Translations-Terminations-Signal und/oder ein Polyadenylisierungs- Signal zur Expression in Eukaryoten.
Kommerziell erhältliche Expressionsvektoren, insbesondere zur Expression in Säugetierzellen, beispielsweise pIRES (Fa. Clontech, Palo Alto, USA), pCI-neo Vektor (Fa. Promega, Madison, USA), pCMV-Script (Fa. Stratagene, La Jolla, USA) und pCDNA Vektor (Fa. Invitrogen, Paisley, UK), sind zum Einbau der erfindungsgemäßen NS geeignet.
Erfindungsgemäße gentherapeutisch wirksame Vektoren sind zum Beispiel Virusvektoren, beispielsweise Adenovirus-Vektoren, retrovirale Vektoren oder Vek- toren, die auf Replikons von RNA Viren beruhen (Lindemann et al., 1997, Mol. Med. 3: 466-76; Springer et al., 1998, Mol. Cell. 2: 549-58; Khromykh, 2000, Curr. Opin. Mol. Ther.; 2: 555-69). Gentherapeutisch wirksame Vektoren lassen sich auch dadurch erhalten, dass man die erfindungsgemäßen Nukleinsäure-Fragmente mit Liposomen komplexiert. Bei der Lipofektion werden kleine unilamellare Vesikel aus kationischen Lipiden durch Ultraschallbehandlung der Liposomensuspension hergestellt. Die DNA wird ionisch auf der Oberfläche der Liposomen gebunden, und zwar in einem solchen Verhältnis, dass eine positive Nettoladung verbleibt und die Plasmid-DNA zu 100% von den Liposomen komplexiert wird. Neben den Lipidmischungen DOTMA (l,2-dioleyloxypropyl-3-trimethylammoniumbromid) und DPOE (diole- oxylphosphatidylethanolamin) wurden inzwischen zahlreiche neue Lipidformulie- rungen synthetisiert und auf ihre Transfektionseffizienz bei verschiedenen Zelllinien getestet. (Behr et al. 1989, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86: 6982-6986; Gao und Huang, 1991, Biochem. Biophys. Acta 1189, 195-203; Feigner et al. 1994, J. Biol. Chem. 269, 2550-2561). Beispiele der neuen Lipidformulierungen sind DOTAP N-[ 1 -(2,3-dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethyl-ammoniumethyl-sulfat oder DOGS (TRANSFECTAM; diocta-decylamidoglycylspermin). Hilfsstoffe, die den Transport von Nukleinsäuren in die Zellen erhöhen, können beispielsweise Proteine oder Peptide, die an DNA gebunden sind oder synthetische Peptid- DNA-Moleküle, die den Transport der Nukleinsäure in den Kern der Zeil ermöglichen, sein (Schwartz et al., 1999, Gene Therapy 6: 282; Branden et al. 1999, Nature Biotechs. 17: 784). Hilfsstoffe umfassen auch Moleküle, die die Freisetzung von Nukleinsäuren in das Zytoplasma der Zelle ermöglichen (Planck et al., 1994, J. Biol. Chem. 269, 12918; Kichler et al., 1997, Bioconj. Chem. 8, 213) oder beispielsweise Liposomen (Uhlmann und Peimann, 1990, Chem. Rev. 90, 544).
Ein Gegenstand der Erfindung ist eine Zelle, die mindestens eine erfindungsgemäße Nukleinsäure und/oder mindestens einen erfindungsgemäßen Vektor enthält. Bevorzugt handelt es sich bei dieser Zelle um eine Vorläuferzelle, eine immortali- sierte Zelle oder eine Stammzelle, insbesondere eine pluripotente oder multipotente embryonale, fötale, neonatale oder adulte Stammzelle. Derartige pluripotente embryonale Stammzellen oder Zelllinien können aus der inneren Zellmasse von Blastozyten gewonnen werden (Robertson, Embryo-derived stem cell lines, in Teratocarcinomas and embryonic stem cells: a practical approach, Robertson, edi- tor, IRL Press, Washington DC, 1987). Besonders bevorzugte Stammzellen, die aus adultem Gewebe stammen, umfassen z.B. neuronale Stammzellen, Stammzellen aus dem Knochenmark, mesenchymale Stammzellen, hämatopoetische Stammzellen, epitheliale Stammzellen, Stammzellen aus dem Verdauungstrakt und Duktus Stammzellen.
Erfindungsgemäße Zellen sind beispielsweise Epithelzellen, Gefäßzellen, Leberzellen, Herzzellen, Hautzellen, Muskelzellen, Nervenzellen, Knochmarkzellen, CHO-Zellen (Ovarzellen) und Zellen aus der Bauchspeicheldrüse, aus der Niere, aus dem Auge oder aus der Lunge.
Die erfindungsgemäße Zelle ist insbesondere eine Säugetierzelle, inklusive einer humanen Zelle. Diese Zelle kann beispielsweise aus einem Menschen, einer Maus, einer Ratte, einem Meerschweinchen, einem Kaninchen, einer Kuh, einer Ziege, einem Schaf, einem Pferd, einem Schwein, einem Hund, einer Katze oder einem Affen, vorzugsweise aus einem Menschen, stammen.
Die erfindungsgemäßen Zellen können auch zur Expression eines heterologen Gens verwendet werden.
Vorzugsweise liegt die erfindungsgemäße Zelle in Form einer Zelllinie vor. Eine erfindungsgemäße Zelllinie kann hergestellt werden durch Transfektion, Transformation oder Infektion einer Zelllinie mit einer erfindungs gemäßen Nukleinsäu- re oder einem erfindungsgemäßen Vektor mit Hilfe von Methoden, die dem Fachmann geläufig sind, beispielsweise Transfektion, Transformation, Elektropo- ration, Mikroinjektion oder Infektion.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Arzneimittel enthaltend mindestens ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein, mindestens eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, mindestens einen erfindungsgemäßen Vektor und/oder mindestens eine erfindungsgemäße Zelle und gegebenenfalls geeignete Hilfs- und/oder Zusatzstoffe.
Geeignete Hilfs- und/oder Zusatzstoffe, die beispielsweise der Stabilisierung oder Konservierung des Arzneimittels oder Diagnostikums dienen, sind dem Fachmann allgemein bekannt. Beispiele für solche Hilfs- und/oder Zusatzstoffe sind physiologische Kochsalzlösungen, Ringer-Dextrose, Dextrose, Ringer-Laktat, entmine- ralisiertes Wasser, Stabilisatoren, Antioxidantien, Komplexbildner, antimikrobiel- le Verbindungen, Proteinaseinhibitoren und/oder inerte Gase.
Das erfindungsgemäße Arzneimittel kann z.B. zur Prophylaxe, Therapie oder Diagnose von Erkrankungen dienen. Zu diesen Krankheiten gehören beispielsweise: rheumatischen Erkrankungen, beispielsweise rheumatische Arthritis, Sjögren's Syndrom, Skleroderma, Dermatomyositis, Polymyositis., Reiter's
Syndrom oder Behcef s Krankheit,
Diabetes Typ I oder Typ II,
Autoimmunerkrankungen der Schilddrüse, beispielsweise Morbus Basedow Krankheit, Hashimoto's Thyroiditis, • Autoimmunerkranungen des zentralen Nervensystems, beispielsweise Multiple Sklerose,
Hauterkrankungen, beispielsweise Psoriasis, Neurodermitis, entzündliche Darmerkrankungen, beispielsweise Morbus Crohn, Immunstörungserkrankungen, beispielsweise AIDS
Gefäßerkrankungen,
Transplantationsfolgeerkrankungen, beispielsweise Transplantatabstoßungsre- aktionen und • Tumorerkrankungen.
Die Verabreichung des erfindungsgemäßen Arzneimittels erfolgt nach den dem Fachmann geläufigen Methoden, beispielsweise intravenös, intraperitoneal, intramuskulär, subkutan, intrakranial, intraorbital, intrakapsulär, intraspinal, trans- muskulär, topikal oder oral. Weitere Methoden der Verabreichung sind beispielsweise die systemische oder lokale Injektion, die Perfusion oder die Katheterbasierte Verabreichung.
Das erfindungsgemäße Arzneimittel kann beispielsweise in oralen Darreichungs- form, wie z.B. Tabletten oder Kapseln, über die Mucous-Membran, z.B. die Nase oder die Mundhöhle, in Form von Sprays in die Lunge oder in Form von Disposi- torien unter die Haut implantiert, verabreicht werden. Trans-dermal- therapeutische Systeme (TTS) sind z.B. aus EP 0 944 398-A1, EP 0 916 336-A1, EP 0 889 723-A1 oder EP 0 852 493-A1 bekannt.
Das Arzneimittel kann in den Organismus eingebracht werden entweder mit Hilfe eines ex vivo Ansatzes, bei dem die Zellen aus dem Patienten entfernt, genetisch modifiziert, beispielsweise durch DNA-Transfektion, und danach erneut in den Patienten eingeführt werden oder mit Hilfe eines in vivo Ansatzes, bei welchem erfindungsgemäße gentherapeutisch wirksame Vektoren in den Körper des Patienten eingebracht werden, als nackte DNA oder unter Verwendung von viralen oder nicht-viralen erfmdungsgemäßen Vektoren oder erfindungsgemäßen Zellen. Im Stand der Technik ist bekannt, dass die Dosierung von Arzneimitteln von mehreren Faktoren abhängt, beispielsweise von dem Körpergewicht, dem generellen Gesundheitszustand, dem Ausmaß der Körperoberfläche, dem Alter des Patients sowie der Wechselwirkung mit anderen Medikamenten. Eine Dosierung hängt ebenfalls ab von der Art der Verabreichung. Die Dosierung ist daher im Einzelfall für jeden Patienten vom Fachmann zu bestimmen. Die Verabreichung des Arzneimittels kann einmal oder mehrmals am Tag und über mehrere Tage hinweg erfolgen, auch dies ist vom Fachmann bestimmbar.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein humanes oder tierisches organspezifisches Gewebe und/oder ein humanes oder tierisches Säugetierorgan, enthaltend mindestens ein Fusionsprotein, mindestens eine Nukleinsäure kodierend für das genannte Fusionsprotein, mindestens einen Vektor enthaltend mindestens eine genannte Nukleinsäure und/oder mindestens eine Zelle enthaltend mindestens eine genannte Nukleinsäure und/oder mindestens einen genannten Vektor, wobei das Fusionsprotein ein Wildtyp-IL- 15 und ein Fc-Fragment enthält.
Bevorzugt enthält das Fusionsprotein des erfindungsgemäßen humanen oder tierischen organspezifischen Gewebes und/oder des erfindungsgemäßen humanen oder tierischen Säugetierorgans einerseits ein Wildtyp-IL- 15 und andererseits ein humanes oder murines IgGl, ein humanes IgG2, ein murines IgG2a, ein murines IgG2b, ein humanes oder murines IgG3 oder ein humanes IgG4, bevorzugt ein humanes IgGl oder ein murines IgG2a, insbesondere ein IgGl, besonders bevorzugt kein murines IgG2b.
Humanes oder tierisches organspezifisches Gewebe der vorliegenden Erfindung kann beispielsweise Gewebe aus der Bauchspeicheldrüse, einschließlich beispielsweise der Langerhanschen Inselzellen, sowie Herz-, Herzmuskel-, Nieren-, Leber-, Lungen-, Milz-, Knorpel-, Bänder-, Retina-, Hornhaut-, Knochenmark-, Haut-, Nerven- und/oder Muskelgewebe sein. Humane oder tierische Säugetierorgane der vorliegenden Erfindung können z.B. die Bauchspeicheldrüse, das Herz, die Bauchspeicheldrüse, die Niere, die Leber, die Lunge, die Milz, das Auge und/oder die Haut sein.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein transgenes nicht-humanes Säugetier, welches mindestens ein Fusionsprotein, mindestens eine Nukleinsäure, die für das genannte Fusionsprotein kodiert, mindestens einen Vektor, der mindestens eine genannte Nukleinsäure enthält und oder mindestens eine Zelle, die mindes- tens eine genannte Nukleinsäure und/oder mindestens einen genannten Vektor enthält, wobei das Fusionsprotein ein Wildtyp-IL- 15 und ein Fc-Fragment enthält.
Bevorzugt enthält das Fusionsprotein des erfindungsgemäßen transgenen nichthumanen Säugetiers einerseits ein Wildtyp-IL- 15 und andererseits ein humanes oder murines IgGl, ein humanes IgG2, ein murines IgG2a, ein murines IgG2b, ein humanes oder murines IgG3 oder ein humanes IgG4, bevorzugt ein humanes IgGl oder ein murines IgG2a, insbesondere ein IgGl, besonders bevorzugt kein murines IgG2b.
Trahsgene Tiere zeigen im allgemeinen eine gewebespezifisch erhöhte Expression von Nukleinsäuren und sind daher für die Analyse beispielsweise von Immunreaktionen sehr geeignet. Bevorzugt werden transgene Mäuse verwendet.
Ein erfindungsgemäßes nicht-humanes Säugetier ist beispielsweise eine Maus, eine Ratte, ein Meerschweinchen, ein Kaninchen, eine Kuh, eine Ziege, ein Schaf, ein Pferd, ein Schwein, ein Hund, eine Katze oder ein Affe.
Ebenfalls weitere Gegenstände der Erfindung sind die Verwendungen eines Fusionsproteins, einer Nukleinsäure kodierend für das genannte Fusionsprotein,;eines Vektors enthaltend mindestens eine genannte Nukleinsäure und oder einer Zelle enthaltend entweder mindestens eine genannte Nukleinsäure oder/und einen ge- nannten Vektor enthaltend mindestens eine genannte Nukleinsäure, wobei das Fusionsprotein ein Wildtyp-IL- 15 und ein Fc-Fragment enthält, oder eines erfindungsgemäßen humanen oder tierischen organspezifischen Gewebes und/oder eines erfindungs gemäßen humanen oder tierischen Säugetierorgans: zur Inhibierung eines IL-15 vermittelten zellulären Ereignisses, zur Inhibierung der Interaktion eines IL-15 mit seinem Rezeptor und/oder zur Prophylaxe und/oder Therapie von Transplantationsfolgeerkrankungen, insbesondere Transplantationsabstoßungsreaktionen, und/oder Autoimmunerkrankungen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung eines Fusionsproteins, einer Nukleinsäure kodierend für das genannte Fusionsprotein, eines Vektors enthaltend mindestens eine genam te Nukleinsäure und/oder einer Zelle enthaltend mindestens eine genannte Nukleinsäure und/oder einen genannten Vektor, wobei das Fusionsprotein ein Wildtyp-IL- 15 und ein Fc-Fragment enthält, zur Lyse von Zellen, die einen IL- 15 -Rezeptor exprimieren.
Bevorzugt enthält das Fusionsprotein der erfindungsgemäßen Verwendungen einerseits ein Wildtyp-IL- 15 und andererseits ein humanes oder murines IgGl, ein humanes IgG2, ein murines IgG2a, ein murines IgG2b, ein humanes oder murines IgG3 oder ein humanes IgG4, bevorzugt ein humanes IgGl oder ein murines IgG2a, insbesondere ein IgGl, besonders bevorzugt kein murines IgG2b.
Vorzugsweise erfolgen die erfindungsgemäßen Verwendungen in bzw. bei einem humanen oder tierischen Säugetier. Unter einem humanen Säugetier im Sinne der vorliegenden Erfindung ist ein Mensch zu verstehen, unter einem tierischen Säugetier im Sinne der vorliegenden Erfindung ist beispielsweise eine Maus, eine Ratte, ein Meerschweinchen, ein Kaninchen, eine Kuh, eine Ziege, ein Schaf, ein Pferd, ein Schwein, ein Hund, eine Katze oder ein Affe zu verstehen. ( Weiterhin ist ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung die Verwendung des erfindungsgemäßen humanen oder tierischen organspezifischen Gewebes und/oder erfindungsgemäßen humanen oder tierischen Säugetierorgans zur Transplantation in ein humanes oder tierisches Säugetier. Bevorzugt handelt es sich um eine Auto-, Allo- oder Xenotransplantation.
Die Transplantation ist die Übertragung von lebendem Material, z.B. von Zellen, Gewebe oder Organen, von einem Teil des Körpers auf einen anderen (autogene Transplantation) oder von einem Individuum auf ein anderes (allogene, syngene und xenogene Transplantation) (Klein, J. S, (1991) Immunologie, 1. Auflage, VHC Verlagsgesellschaft, Weinheim, S. 483) nach dem Fachmann allgemein bekannten Verfahren. Bei der Transplantation in einen anderen Organismus wird unterschieden in die
Synotransplantation, bei der Spender und Empfänger derselben Spezies ange- hören und genetisch völlig oder weitgehend identisch sind,
Allotransplantation, bei der Spender und Empfänger derselben Spezies angehören, aber immungenetisch different sind und
Xenotransplantation, bei der Spender und Empfänger nicht derselben Spezies angehören und demzufolge immungenetisch völlig different sind.
Ebenfalls ein Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Fusionsproteins, das die folgenden Schritte enthält: a. Einbringen mindestens einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure und/oder mindestens eines erfindungsgemäßen Vektors in eine Zelle, und b. Expression der Nukleinsäure unter geeigneten Bedingungen.
Verfahren zum Einbringen von Nukleinsäuren, Vektoren und Genen, beispielsweise Differenzierungs-Markergenen oder Transfektions-Markergenen, in Zellen sind dem Fachmann gut bekannt und umfassen die nach dem Stand der Technik üblichen Verfahren, beispielsweise Elektroporation, Injektion, Transfektion und/oder Transformation. Diese Verfahren sind insbesondere bevorzugt, wenn es sich bei der Substanz um nackte Nukleinsäuren, insbesondere DNA, handelt.
Geeignete Bedingungen für die Expression der Nukleinsäure können beispielsweise durch Expressionsvektoren, beispielsweise durch vorangehend genannte Expressionsvektoren und regulierbare Elemente, beispielsweise Promotoren oder regulative Nukleinsäuresequenzen geschaffen werden. Im allgemeinen enthalten Expressionsvektoren auch für die jeweilige Zelle bzw. das jeweils zu transkribierende Gen geeignete Promotoren.
Beispiele für regulierbare Elemente, die konstitutive Expression in Eukaryonten ermöglichen, sind Promotoren, die von der RNA-Polymerase II erkannt werden. Solche Promotoren für die konstitutive Expression in allen Zeil- und Gewebetypen sind z.B. der CDl lc-Promotor, pGk (Phosphoglyceratkinase)-Promotor, der CMV (Cytomegalievirus)-Promotor, der TK (Thymidinkinase)-Promotor, der EFl (Elongationsfaktor-l-alpha)-Promotor, der SV40 (Simian Virus)-Promotor, der RSV (Rous Sarcoma Virus)-Promotor und der pUB (Ubiquitin)-Promotor.
Beispiele für regulierbare Elemente, die zell- bzw. gewebespezifische Expression in Eukaryonten ermöglichen, sind Promotoren oder Aktivatorsequenzen aus Promotoren oder Enhancern von solchen Genen, die für Proteine kodieren, die nur in bestimmten Zelltypen exprimiert werden. Derartige Promotoren der sind beispielsweise der Insulin-Promotor für Beta-Zellen des Pankreas, der Sox-2- Promotor für Nervenzellen, der Albuminpromotor für Leberzellen, der Myosin- Schwere-Kette-Promotor für Muskelzellen, der VE-Cadherin-Promotor für Endo- thelzellen und der Keratinpromotor für Epithelzellen.
Weitere Beispiele für regulierbare Elemente, die eine regulierbare Expression in
Eukaryonten ermöglichen, sind RU486 induzierbare Promotoren und der Tetra- cyclinoperator in Kombination mit einem entsprechenden Repressor (Gossen M. et al., (1994) Curr. Opin. Biotechnol. 5, 516-20).
Ebenfalls kann die Expression über regulative Nukleotidsequenzen, die Expressi- on mengenmäßig und/oder zeitabhängig beeinflussen, gesteuert werden. Hierzu zählen beispielsweise Enhancersequenzen, Leadersequenzen, Polyadenylierungs- sequenzen, IRES-Sequenzen und Introns.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein in vitro- Verfahren zur Herstellung eines erfindungs gemäßen humanen oder tierischen organspezifischen Gewebes und/oder eines erfindungsgemäßen humanen oder tierischen Säugetierorgans, welches die folgenden Schritte enthält: a. Einbringen in mindestens eine Stammzelle, eine Vorläuferzelle und/oder eine immortalisierte Zelle eines humanen oder tierischen organspezifischen Gewebes und/oder eines humanen oder tierischen Säugetierorgans zum einen mindestens eine Nukleinsäure kodierend für ein Fusionsprotein und/oder mindestens einen Vektor enthaltend mindestens eine genannte Nukleinsäure, wobei das Fusionsprotein ein Wildtyp-IL- 15 und ein Fc-Fragment enthält, und zum anderen mindestens ein geeignetes Differenzierungs-Markergen, b. Differenzierung der Zelle aus Schritt a., c. Selektionieren der differenzierten Zelle aus Schritt b. und d. Einbringen der selektionierten Zelle aus Schritt c. in mindestens ein humanes oder tierisches organspezifisches Gewebe und/oder in mindestens ein humanes oder tierisches Säugetierorgan.
In einer bevorzugten Ausfuhrungsform wird in dem vorangehend beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren nach, vor oder gleichzeitig mit Schritt a. mindestens ein geeigneten Transfektions-Markergen eingebracht und nach Schritt a. vorzugsweise die transfektierte Zelle aus Schritt a. selektioniert. Geeignete Bedingungen für die Differenzierung der Zellen können beispielsweise durch Zugabe von Wachstumsfaktoren, welche die gewünschte Zelldifferenzierung einleiten, geschaffen werden.
Dem Fachmann sind zahlreiche Verfahren zur Selektionierung von Zellen bekannt.
Zur Selektion der differenzierten Zellen von anderen Zellen enthält das erfindungsgemäße Verfahren bevorzugt ein positives Selektionsschema. Hierbei wird ein Markergen, beispielsweise ein Gen, welches eine Antibiotika-Resistenz überträgt, vor, während oder nach dem Differenzierungsschritt in Zelle eingebracht und unter geeigneten Bedingungen zur Expression gebracht. Derartige Bedingungen können beispielsweise darin bestehen, dass die Expression des Markergens unter der Kontrolle eines Promoters steht, der nur in den gewünschten Zellen ak- tiv ist.
Durch die Expression des Markergens wird den erfolgreich differenzierten Zellen eine Resistenz für das Antibiotikum übertragen. Die der Differenzierung nachfolgende Selektion der Zellen kann daher beispielsweise leicht durch Inkontaktbrin- gen der Zellen mit dem entsprechenden Antibiotikum erfolgen. Zellen, welche die entsprechende Antibiotika-Resistenz nicht enthalten, sterben ab, so dass lediglich die differenzierten Zellen überleben. Das Inkontaktbringen im Sinne dieser Erfindung kann beispielsweise durch Zugabe der Wirksubstanzen in das Nährmedium einer Zellkultur erfolgen.
Unter einem erfindungsgemäßen Antibiotikum wird ein Antibiotikum verstanden, gegen welches das bzw. die als erfindungsgemäße Selektionskassette verwendete^) Antibiotikum-Resistenzgen(e) eine Resistenz erzeugt/en. Nach Hinzufügen des Antibiotikums zu den kultivierten Stammzellen überleben und differenzieren im wesentlichen nur solche Stammzellen, die den Reporter-Gen- Expressionsvektor enthalten. Bevorzugt wird ein zweites Markergen in die Zellen eingebracht, wodurch eine Selektion der Zellen, in denen das Einbringen der Nukleinsäure und/oder des Vektors gemäß Schritt a. des Verfahrens erfolgreich verlief, vorgenommen werden kann. Durch diese doppelte Selektion ist es möglich, eine ca. 90%ig, vorzugsweise ca. 95-100%ig reine Zellpopulation der gewünschten Zellen zu erhalten.
Für derartige Selektionierungen können beispielsweise Differenzierungs- Markergene und Transfektions-Markergene verwendet werden. Als solche werden überwiegend Gene verwendet, die eine Resistenz gegen bestimmte toxische Substanzen, beispielsweise Antibiotika, vermitteln, verwendet. Die häufigsten in diesem Zusammenhang verwendeten Antibiotika sind Neomycin, Hygromycin (hph), Zeocin (Sh ble) und Puromycin (pacA).
Weitere zur Selektionierung geeignete Gene, insbesondere zur Selektion von Stammzellen, sind beispielsweise Gene, die die Expression von Oberflächenmolekülen oder von Fluoreszenzmarkern, z.B. GFP, regulieren, mit deren Hilfe die zu selektierenden Zellen über Zeil-Sortierung aufgereinigt werden können. Weitere Beispiele sind Gene, die für eine Enzymaktivität kodieren, die einen Vorläufer einer toxischen Substanz, sog. "Prodrug" in eine toxische Substanz umwandeln. In diesem Fall kann eine Negativ-Selektion erfolgen, d.h., es überleben nur die Zellen, die den dem Gen vorgeschalteten Promotor nicht exprimieren.
Ein anderer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Erzeugung eines er- findungsgemäßen transgenen nicht-humanen Säugetieres, welches folgende Schritte enthält: a. Einbringen in mindestens eine Oocyte, eine Stammzelle, eine Vorläuferzelle und/oder eine immortalisierte Zelle eines nicht-humanen Säugetieres einerseits mindestens eine Nukleinsäure, kodierend für ein Fusionsprotein und/oder mindestens einen Vektor enthaltend mindestens eine genannte Nukleinsäure, wobei das Fusionsprotein ein Wildtyp-IL- 15 und ein Fc-Fragment enthält, und andererseits mindestens ein geeignetes Transfektions-Markergen, b. Selektionieren der transfektierten Zelle aus Schritt a., c. Einbringen der nach Schritt b. selektierten Zelle in mindestens eine nichthumane Säugetier-Blastozyte, d. Einbringen der Blastozyte aus Schritt c. in eine nicht-humane, vorzugsweise schemschwangere, Säugetier-Pflegemutter und e. Identifizierung des sich aus genannter Blastozyte entwickelten transgenen nicht-humanen Säugetiers.
Die Verfahren zum Einbringen von Blastozyten sind dem Fachmann bekannt. Es kann beispielsweise durch Injektion erfolgen (Hogan, B., Beddington, R., Con- stantini, F. und Lacy, E., A laboratory Manual (1994), Cold Spring"Harbor Labo- ratory Press).
Die Identifizierung eines transgenen nicht-humanen Säugetiers kann beispielsweise dadurch erfolgen, dass genomische DNA aus dem transgenen nicht-humanen Säugetier extrahiert wird, z.B. aus dem Schwanz einer Maus. In einer nachfolgenden PCR (Polymerase Chain Reaktion) werden Primer verwendet, die spezifisch das Transgen für die erfindungsgemäße Nukleinsäure erkennen. Eine Integration des Transgens kann auf diese Weise nachgewiesen werden.
Eine weitere Möglichkeit der Identifizierung kann mittels Southern Blot erfolgen. Hierbei wird genomische DNA auf eine Membran übertragen und mittels DNA- Sonden, beispielsweise radioaktiv markierte DNA-Sonden, die spezifisch für das gesuchte Transgen sind, detektiert.
Verfahren zur Erzeugung eines erfindungsgemäßen transgenen nicht-humanen
Säugetiers durch Regenerieren einer nicht-humanen Stammzelle, Oocyte, Vρrläu- ferzelle oder immortalisierten Zelle zu einem transgenen nicht-humanen Tier, insbesondere von transgenen Mäusen sind dem Fachmann aus der DE 196 25 049 und den US 4,736,866; US 5,625,122; US 5,698,765; US 5,583,278 und US 5,750,825 bekannt und umfassen transgene Tiere, die beispielsweise durch direkte Injektion von erfindungsgemäßen Expressionsvektoren in Embryonen oder Sper- matozyten oder über die Transfektion von Expressionsvektoren in embryonale Stammzellen erzeugt werden können (Polites und Pinkert: DNA Mikroinjection and Transgenic Animal Production, Seite 15-68 in Pinkert, 1994: Transgenic A- nimal Technology: A Laboratory Handbook, Academic Press, San Diego, USA; Houdebine 1997, Harwood Academic Publishers, Amsterdam, The Netherlands; Doetschman: Gene Transfer in Embryonic Stem Cells, Seite 115-146 in Pinkert, 1994, supra; Wood: Retrovirus-Mediated Gene Transfer, Seite 147-176 in Pinkert, 1994, supra; Monastersky: Gene Transfer Technology: Alternative Techni- ques and Applications, Seite 177-220 in Pinkert, 1994, supra).
Die Herstellung eines erfindungsgemäßen transgenen nicht-humanen Säugetiers kann auch durch direkte Injektion einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure in den Pronukleus (Vorkern) eines nicht-humanen Säugetiers erfolgen.
Zahlreiche Verfahren zur Herstellung von transgenen Tieren, insbesondere von transgenen Mäusen, sind dem Fachmann ebenfalls u.a. aus der WO 98/36052, WO 01/32855, DE 196 25 049, US 4,736,866, US 5,625,122, US 5,698,765, US 5,583,278 und US 5,750,825 bekannt und umfassen transgene Tiere, die beispielsweise über direkte Injektion von erfindungsgemäßen Vektoren in Embryonen oder Spermatozyten oder über die Transfektion von Vektoren oder Nukleinsäuren in embryonale Stammzellen erzeugt werden können (Polites und Pinkert, in Pinkert, (1994) Transgenic animal technology, A Laboratory Handbook, Academic Press, London, UK, Seite 15 bis 68; Doetschman, in Pinkert, 1994, supra, Seite 115 bis 146).
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein nach vorangehend beschriebe- nem erfindungsgemäßen Verfahren erzeugtes transgenes nicht-humanes Säugetier sowie dessen Nachkommen. In weiteren Ausführungsformen handelt es sich bei der Stammzelle, welche in .dem genannten erfindungsgemäßen in v tro-Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen humanen oder tierischen organspezifischen Gewebes und/oder eines erfindungsgemäßen humanen oder tierischen Säugetierorgans und in dem Verfahren zur Erzeugung eines erfindungsgemäßen transgenen nicht-humanen Säugetiers verwendet wird, um eine pluripotente oder multipotente embryonale, fötale, neonatale oder adulte Stammzelle.
Ein Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung eines erfindungs gemäßen transgenen nicht-humanen zur Gewinnung einer Zelle, eines organspezifischen Gewebes und/oder eines Säugetierorgans für die Allo- und/oder Xenotransplantation.
Im Fall der Zelltransplantation kann diese beispielsweise mittels eines Implantations-Verfahrens oder mittels einer Katheter-Injektion-Methode durch die Blutgefäßwand erfolgen.
Unter Gewinnung im Sinne der vorliegenden Erfindung ist die Entnahme der/des genannten Zelle, Gewebes und/oder Organs aus dem Organismus eines erfindungsgemäßen transgenen nicht-humanen Säugetiers zu verstehen. Entsprechende Methoden zur Entnahme sind dem Fachmann allgemein geläufig.
Ebenfalls ein Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung eines erfindungsge- mäßen transgenen nicht-humanen Säugetiers, eines erfindungsgemäßen humanen oder tierischen organspezifischen Gewebes und/oder eines erfindungsgemäßen humanen oder tierischen Säugetierorgans zum Auffinden von pharmakologisch aktiven Wirkstoffen und/oder zur Identifizierung von toxischen Substanzen.
Eine solche Methode könnte zum Beispiel darin bestehen, Zellen der vorliegenden Erfindung auf eine 96-well Mikrotiter-Platte auszusäen, dann eine zu untersu- chende pharmakologisch aktive oder toxische Substanz zuzugeben und anschließend mittels Zellzahlbestimmung zu analysieren, ob die Substanz einen vermehrten Tod der Zellen bewirkt hat.
Unter den Begriffen pharmakologisch aktiver Wirkstoff und toxische Substanz im Sinne der Erfindung sind all jene Moleküle, Verbindungen und/oder Zusammensetzungen und Substanzgemische zu verstehen, die unter geeigneten Bedingungen einen pharmakologischen bzw. toxischen Einfluss auf einzelne Zellen, einzelne Gewebe, einzelne Organe oder den gesamten Organismus eines tierischen oder humanen Säugetiers ausüben. Mögliche pharmakologisch aktive Wirkstoffe und toxische Substanzen können einfache chemische (organische oder anorganische) Moleküle oder Verbindungen, Nukleinsäuren oder Analoga von Nukleinsäuren, anti-sense Sequenzen von Nukleinsäuren, Peptide, Proteine oder Komplexe und Antikörper sein. Beispiele sind organische Moleküle, die aus Substanz- Bibliotheken stammen und die auf ihre pharmako logische bzw. toxische Aktivität hin untersucht werden.
Pharmakologisch aktive Wirkstoffe sind beispielsweise Wirkstoffe, die Einfluss aus üben auf: • die Teilungs- und/oder Überlebensfähigkeit von Zellen, die Sekretion von Proteinen, z.B. Insulin von Beta-Zellen des Pankreas, Do- pamin von Nervenzellen, die Muskelzellen-Kontraktion und/oder das Wanderungsverhalten von Zellen. In Anwendung auf den gesamten Organismus eines tierischen oder humanen Säugetiers ist hierunter ein Einfluss auf beispielsweise das Herz-Kreislaufsystem, das Nervensystem sowie < die Stoffwechselaktivitäten zu verstehen. Toxische Substanzen sind beispielsweise Wirkstoffe, die
Zellen nach bestimmten Signalen, beispielsweise Stress, zur Apoptose anregen, • das Herz-Kreislaufsystem beeinflussen, das Nervensystem beeinflussen und/oder die Stoffwechselaktivitäten beeinflussen.
Die identifizierten pharmakologisch aktiven Wirkstoffe und toxischen Substanzen können gegebenenfalls kombiniert oder zusammen mit geeigneten Zusatz- und/oder Hilfsstoffen zur Herstellung eines Diagnostikums oder eines Arzneimittels zur Diagnose, Prophylaxe und oder Therapie von Transplantationsfolgeerkrankungen und/oder Autoimmunerkrankungen, wie vorangehend beispielhaft aufgeführt, verwendet werden.
Die folgenden Figuren und Beispiele sollen die vorliegende Erfindung verdeutlichen ohne sie jedoch zu beschränken.
Fig. la ist eine Abbildung der Aminosäuresequenz WT-IL-15-hIgGl, Fig. lb ist eine Abbildung der Aminosäuresequenz WT-IL-15-mIgG2a,
Fig. 2a ist eine Abbildung der Aminosäuresequenz WT-IL-15,
Fig. 2b ist eine Abbildung der Aminosäuresequenz hlgGl,
Fig. 2c ist eine Abbildung der Aminosäuresequenz mIgG2a,
Fig. 3a ist eine Abbildung der Aminosäuresequenz Igk8, Fig. 3b ist eine Abbildung der Aminosäuresequenz 149-Fc
Fig. 4 ist eine Abbildung der Nukleinsäuresequenz WT-IL-15-hIgGl,
Fig. 5 ist eine Abbildung der Nukleinsäuresequenz WT-IL-15-mIgG2a,
Fig. 6a ist eine Abbildung der Nukleinsäuresequenz WT-IL-15,
Fig. 6b ist eine Abbildung der Nukleinsäuresequenz hlgGl, Fig. 7 ist eine Abbildung der Nukleinsäuresequenz mIgG2a, Fig. 8a ist eine Abbildung der Nukleinsäuresequenz muriner IgK-Leader, Fig. 8b ist eine Abbildung der Nukleinsäuresequenz humaner CD5-Leader, Fig. 8c ist eine Abbildung der Nukleinsäuresequenz humaner CD4-Leader, Fig. 8d ist eine Abbildung der Nukleinsäuresequenz humaner IL-2-Leader, Fig. 9a ist eine Abbildung der Nukleinsäuresequenz humaner MCP-Leader,
Fig. 9b ist eine Abbildung der Nukleinsäuresequenz des kurzen nativen humanen
IL-15-Leaders,
Fig. 9c ist eine Abbildung der Nukleinsäuresequenz des langen nativen humanen
IL-15-Leaders, Fig. 10 ist eine Abbildung der Nukleinsäuresequenz Igk8, Fig. 11 ist eine Abbildung der Nukleinsäuresequenz 149-Fc, Fig. 12 ist eine Abbildung der inhibierenden bzw. proliferationsfόrdernden Wirkung unterschiedlicher Protein-Konstrukte auf die IL-15 vermittelte Proliferation von CTLL-2-Zellen.
Erläuterung: hlgGl steht für humanes IgGl und mIgG2a steht für murines IgG2a.
Weitere Gegenstände der vorliegenden Erfindung betreffen:
(i) Fusionsprotein aus einem Wildtyp-IL- 15 und einem IgG-Fc-Fragment, mit Ausnahme eines murinen IgG2b-Fc-Fragments.
(ii) Fusionsprotein nach (i), dadurch gekennzeichnet, dass das IgG-Fc- Fragment ein humanes oder murines IgGl, ein humanes IgG2, ein mu- rines IgG2a, ein humanes oder murines IgG3 oder ein humanes IgG4 ist.
(iii) Fusionsprotein nach (i) oder (ii) enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1 oder eine allelische Variante davon. , (iv) Fusionsprotein nach (i) oder (ii) enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ ID NO:2 oder eine allelische Variante davon.
(v) Fusionsprotein nach (i) oder (ii) enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 3 oder eine allelische Variante davon.
(vi) Fusionsprotein nach (i) oder (ii) enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ ID NO:4 oder eine allelische Variante davon.
(vii) Fusionsprotein nach (i) oder (ii) enthaltend die Aminosäuresequenz
SEQ ID NO: 5 oder eine allelische Variante davon.
(viii) Nukleinsäure kodierend für ein Fusionsprotein nach mindestens einem
(i) bis (vii).
(ix) Nukleinsäure nach (viii) enthaltend die DNA-Sequenz SEQ ID NO:6. oder eine allelische Variante davon.
(x) Nukleinsäure nach (viii) enthaltend die DNA-Sequenz SEQ ID NO:7. oder eine allelische Variante davon.
(xi) Nukleinsäure nach (viii) enthaltend die DNA-Sequenz SEQ ID NO: 8. oder eine allelische Variante davon.
(xii) Nukleinsäure nach (viii) enthaltend die DNA-Sequenz SEQ ID NO:9. oder eine allelische Variante davon.
(xiii) Nukleinsäure nach (viii) enthaltend die DNA-Sequenz SEQ ID NO: 10. oder eine allelische Variante davon.
(xiv) Fusionsprotein kodiert von einer Nukleinsäure nach einem (ix)-(xiii). (xv) Vektor enthaltend mindestens eine Nukleinsäure nach mindestens einem (viii) bis (xiv).
(xvi) Zelle enthaltend mindestens eine Nukleinsäure nach mindestens einem
(xiii) bis (xiv) und/oder mindestens einen Vektor nach (xv).
(xvii) Zelle nach (xvi), dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Zelle um eine Stammzelle, eine Vorläuferzelle und/oder eine immortalisierte Zelle handelt.
(xviii) Zelle nach (xvii), dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine pluripotente oder multipotente embryonale, fötale, neonatale oder adulte Stammzelle handelt.
(xix) Zelle nach mindestens einem (xvi) bis (xviii) in Form einer Zelllinie.
(xx) Arzneimittel enthaltend mindestens ein Fusionsprotein nach einem (i) bis (vii) und (xiv), mindestens eine Nukleinsäure nach einem (viii) bis (xiii), mindestens einen Vektor nach (xv) und/oder mindestens eine Zelle nach einem (xvi) bis (xviii) und geeignete Hilfsund/oder Zusatzstoffe.
(xxi) Humanes oder tierisches organspezifisches Gewebe und/oder humanes oder tierisches Säugetierorgan enthaltend mindestens ein Fusionsprotein, insbesondere nach einem (i)-(vii) und (xiv), mindestens eine Nukleinsäure kodierend für das genannte Fusionsprotein, insbesondere nach einem (viii)-(xiii), mindestens einen Vektor enthaltend mindestens eine genannte Nukleinsäure, insbesondere nach (xv), und/oder mindestens eine Zelle, insbesondere nach einem (xvi)-(xviii), enthaltend mindestens eine genannte Nukleinsäure und/oder mindestens ei- nen genannten Vektor, wobei das Fusionsprotein ein Wildtyp-IL- 15 und ein Fc-Fragment enthält.
(xxii) Transgenes nicht-humanes Säugetier enthaltend mindestens ein Fusi- onsprotein, insbesondere nach einem (i)-(vii) und (xiv), mindestens eine Nukleinsäure kodierend für das genannte Fusionsprotein, insbesondere nach einem (viii)-(xiii), mindestens einen Vektor, insbesondere nach (xv), enthaltend mindestens eine genannte Nukleinsäure und oder mindestens eine Zelle, insbesondere nach einem (xvi)-(xviii), enthal- tend mindestens eine genannte Nukleinsäure und/oder mindestens einen genannten Vektor, wobei das Fusionsprotein ein Wildtyp-IL- 15 und ein Fc-Fragment enthält.
(xxiii) Verwendung eines Fusionsproteins, insbesondere nach einem (i)-(vii) und (xiv), einer Nukleinsäure, insbesondere nach einem (viii)-(xiii), eines Vektors, insbesondere nach einem (xv), und/oder einer Zelle, insbesondere nach einem (xvi)-(xviii), wobei das Fusionsprotein ein Wildtyp-IL- 15 und ein Fc-Fragment enthält oder eines humanen oder tierischen organspezifischen Gewebes und/oder eines humanen oder tierischen Säugetierorgans nach (xxi) zur Herstellung eines Medikam- tentes zur Inhibierung eines IL-15 vermittelten zellulären Ereignisses.
(xxiv) Verwendung eines Fusionsproteins, insbesondere nach einem (i)-(vii) und (xiv), einer Nukleinsäure, insbesondere nach einem (viii)-(xiii), eines Vektors, insbesondere nach (xv), und/oder einer Zelle, insbesondere nach einem (xvi)-(xviii), wobei das Fusionsprotein ein Wildtyp- IL- 15 und ein Fc Fragment enthält oder eines humanen oder tierischen organspezifischen Gewebes und/oder eines humanen oder tierischen Säugetierorgans nach (xxi), zur Herstellung eines Medikamentes zur Inhibierung der Interaktion eines IL-15 mit seinem Rezeptor. (xxv) Verwendung eines Fusionsproteins, insbesondere nach einem (i)-(vii) und (xiv), einer Nukleinsäure, insbesondere nach einem (viii)-(xiii), eines Vektors, insbesondere nach einem (xv), und/oder einer Zelle, insbesondere nach einem (xvi)-(xviii), wobei das Fusionsprotein ein Wildtyp-IL- 15 und ein Fc Fragment enthält, zur Herstellung eines Medikamentes zur Lyse von Zellen, die einen IL- 15 -Rezeptor exprimie- ren.
(xxvi) Verwendung eines Fusionsproteins, insbesondere nach einem (i)-(vii) und (xiv), einer Nukleinsäure, insbesondere nach einem (viii)-(xiii), eines Vektors, insbesondere nach (xv), und/oder einer Zelle, insbesondere nach einem (xvi)-(xviii), wobei das Fusionsprotein ein Wildtyp- IL- 15 und ein Fc Fragment enthält oder eines humanen oder tierischen organspezifischen Gewebes und/oder eines humanen oder tierischen Säugetierorgans nach (xxi), zur Herstellung eines Medikamentes zur
Prophylaxe und/oder Therapie von Transplantationsfolgeerkrankungen und/oder Autoimmunerkrankungen.
(xxvii) Verwendung eines humanen oder tierischen organspezifischen Gewe- bes und/oder humanen oder tierischen Säugetierorgans nach (xxi) zur
Transplantation in ein humanes oder tierisches Säugetier.
(xxviii) Verwendung nach (xxvii), dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine Auto-, Allo- oder Xenotransplantation handelt.
(xxix) Verfahren zur Herstellung eines Fusionsproteins nach mindestens einem (i) bis (vii) und (xiv) enthaltend folgende Schritte: a. Einbringen mindestens einer Nukleinsäure nach einem (viii) bis (xiii) und/oder mindestens eines Vektors nach (xv) in eine Zelle, und ( b. Expression der Nukleinsäure unter geeigneten Bedingungen. I \ l / UI | W J ■ v w -"
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(xxx) In vftro-Verfahren zur Herstellung eines humanen oder tierischen organspezifischen Gewebes und/oder humanen oder tierischen Säugetierorgans nach (xxi) enthaltend die folgenden Schritte: a. Einbringen in mindestens eine Stammzelle, eine Vorläuferzelle und/oder eine immortalisierte Zelle eines humanen oder tierischen organspezifischen Gewebes und/oder humanen oder tierischen Säugetierorgans zum einen mindestens eine Nukleinsäure kodierend für ein Fusionsprotein, wobei das Fusionsprotein ein Wildtyp-IL- 15 und ein Fc Fragment enthält und/oder mindestens einen Vektor enthaltend mindestens eine genannte Nukleinsäure, insbesondere nach einem (viii)-(xiii), und zum anderen mindestens ein geeignetes Differenzierungs-Markergen, b. Differenzierung der Zelle aus Schritt a., c. Selektionieren der differenzierten Zelle aus Schritt b. und d. Einbringen der selektionierten Zelle aus Schritt c. in ein humanes oder tie- risches organspezifisches Gewebe und/oder in ein humanes oder tierisches
Säugetierorgan.
(xxxi) Verfahren nach (xxx), dadurch gekennzeichnet, dass nach, vor oder gleichzeitig mit Schritt a. mindestens ein geeigneten Transfektions- Markergen eingebracht wird und nach Schritt a. vorzugsweise die transferierte Zelle aus Schritt a. selektioniert wird.
(xxxii) Verfahren nach einem (xxx) oder (xxxi), dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine pluripotente oder multipotente embryonale, fötale, ne- onatale oder adulte Stammzelle handelt.
(xxxiii)Verfahren zur Erzeugung transgener nicht-humaner Säugetiere nach
(xxii) enthaltend folgende Schritte: a. Einbringen in mindestens eine Oocyte, eine Stammzelle, eine Vorläufer- zelle und/oder eine immortalisierte Zelle eines nicht-humanen Säugetieres einerseits mindestens eine Nukleinsäure, insbesondere nach einem (vii)-(xiii), kodierend für ein Fusionsprotein und/oder mindestens einen Vektor, insbesondere nach (xv), enthaltend mindestens eine genannte Nukleinsäure, wobei das Fusionsprotein ein Wildtyp-IL- 15 und ein Fc- Fragment enthält, und andererseits mindestens ein geeignetes Transfekti- ons-Markergen, b. Selektionieren der transferierten Zelle aus Schritt a., c. Einbringen der nach Schritt b. selektierten Zelle in mindestens eine nichthumane Säugetier-Blastozyte, d. Einbringen der Blastozyte aus Schritt c. in eine nicht-humane Säugetier- Pflegemutter und e. Identifizierung des sich aus genannter Blastozyte entwickelten transgenen nicht-humanen Säugetiers.
(xxxiv) Verfahren nach (xxxiii), dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine pluripotente oder multipotente embryonale, fötale, neonatale oder a- dulte Stammzelle handelt.
(xxxv) Transgenes nicht-humanes Säugetier, dadurch gekennzeichnet, dass es nach dem Verfahren nach einem (xxxiii) oder (xxxiv) erzeugt wurde.
(xxxvi)Transgenes nicht-humanes Säugetier, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Nachkomme des Säugetieres nach (xxxv) ist.
(xxxvii) Verwendung eines transgenen nicht-humanen Säugetiers nach min- destens einem (xxii), (xxxv) oder (xxxvi) zur Gewinnung einer Zelle, eines organspezifischen Gewebes und/oder eines Säugetierorgans für die Allo- und/oder Xenotransplantation.
(xxxviii) Verwendung eines transgenen nicht-humanen Säugetiers nach ei- nem (xxii), (xxxv) oder (xxxvi), eines humanen oder tierischen organspezifischen Gewebes und/oder eines humanen oder tierischen Säuge- tierorgans nach (xxi) zum Auffinden von pharmakologisch aktiven Wirkstoffen und/oder zur Identifizierung von toxischen Substanzen.
Beispiele
Reagenzien
Reagenzien wie Zellkulturmedien, Enzyme, etc. wurden, wenn nicht anders vermerkt, bei Invitrogen (vormals Gibco BRL/Life Technologies), Paisley, UK, bezogen, Laborchemikalien bei Roth (Karlsruhe, DE).
Beispiel 1 : Austausch der Signalsequenz
Ausgegangen wurde von einem Plasmid, das im Vektor pSecTagA (Invitrogen, Paisley, UK) die cDNA eines Fusionsproteins aus einem mutierten humanen IL- 15 und einem murinen IgG2a-Fc-Teil (Hinge-C2-C3, Kim et al. 1998, supra) ent- hielt. Die Fusion von IL-15 mit dem Fc-Teil erfolgte über eine BamHI- Schnittstelle wodurch am Übergang eine zusätzliche Aminosäure (Aspartat) eingefügt wurde.
Im IL-15 waren an den Positionen 149 und 156 (entspricht den Positionen 101 und 108 nach Abspalten der Signalsequenz) zwei Glutaminreste zu Aspartat mutiert worden um eine Bindung des Proteins an die alpha-Untereinheit des IL-15 Rezeptors zu ermöglichen, jedoch die Signaltransduktion über die beta- und gamma-Untereinheit zu verhindern. Vom humanen IL-15 war die native, wenig effiziente Signalsequenz entfernt worden und entsprechend die trunkierte cDNA über die Schnittstellen Hindlll und Xbal in den pSecTagA- Vektor kloniert worden, so dass der im Plasmid vorliegende Ig-kappa-Leader als Sekretionssignal genutzt werden konnte. Zwischen dem im Plasmid vorliegenden Ig-kappa-Leader und dem Beginn der IL15-Sequenz lagen klonierungsbedingt 10 zusätzliche A- minosäuren vor. Um diese zu entfernen und um möglicherweise die Sekretion des Proteins zu verbessern, wurde der Ig-kappa-Leader gegen Signalsequenzen verschiedener anderer Proteine ausgetauscht. Dabei kann neben dem ursprünglichen Ig-kappa-Leader bei dem nur die zusätzlichen Aminosäuren entfernt wurden, alternativ die Leadersequenzen von humanem IL-2, MCP-1, CD4 und CD5 einklo- niert werden.
Beispiel 2: Vorbereitung des pSecTagA-Plasmids
Da die Klonierung der Signalsequenz über eine singuläre Nhel-Schnittstelle, welche in 5 '-Richtung des ATG-Startcodons der Leadersequenz liegt, und eine im 5 '- Bereich der IL-15-Sequenz liegende Bglll-Schnittstelle erfolgen sollte, wurde zunächst eine weitere Bglll-Schnittstelle aus dem Vektor pSecTagA entfernt. Dazu wurde der Vektor pSecTagA ohne Insert mit Bglll geschnitten (Ansatz: 9 μg DNA, 4 μl lOx Puffer 2, 26 μl Wasser, 4 μl Bglll (40 Units) in insgesamt 40 μl, Inkubation für 2 h bei 37°C).
Die DNA wurde über eine Pharmacia S400 Microspin-Säule (Amersham- Pharmacia, Freiburg) von Enzym und Puffer gereinigt. 40 μl des Ansatzes wurden mit 5 μl lOx PCR-Puffer (Taq-Core-Kit, Qiagen, Hilden), 2 μl dNTPs (10 mM each, Taq-Core-Kit, Qiagen), 2 μl Wasser und 1 μl (4 Units) DNA Polymera- se I (Klenow Fragment) versetzt und für 1 h bei 37°C inkubiert um die Bglll- Schnittstelle aufzufüllen. Anschließend wurde das Plasmid auf ein 1% Agarosegel aufgetragen und die Bande mit Hilfe des Concert Rapid-Gel-Extraction Systems aus dem Gel eluiert. Der gesamt Ansatz wurde in 100 μl Wasser aufgenommen. 7,5 μl davon wurden zusammen mit 7,5 μl Wasser, 4 μl 5x T4-Ligase-Puffer und 1 μl T4-Ligase (1U) für lh bei Raumtemperatur ligiert. Die Hälfte des Ligation- sansatzes wurde nach den Angaben des Herstellers in E.coli XL1 Blue (Stratage- ne, La Jolla, USA) transformiert. In das so entstandene Plasmid wurde das gesamte Insert des oben genannten Plasmids: Ig-kappa-Leader + 10 zusätzliche Aminosäuren-mutIL-15-mIgG2a über die Schnittstellen Nhel und Xbal wieder einkloniert. Anschließend wurde der ursprüngliche Ig-kappa Leader + 10 Aminosäuren + 5'-IL-15 Teil über einen Nhel/Bglll-Schnitt entfernt und durch eine Oligonukleotidklonierung durch die oben genannten Signalsequenzen ersetzt.
Beispiel 3: Klonierung des Ig-kappa-Leaders
Das Fragment lautete wie folgt: 5'-NheI-Leader-IL-15-3' mit einer Bglll Schnitt- stelle im 5 '-Abschnitt des IL-15 . Da dieses Fragment zu lang war, um durch ein einziges Oligonukleotid abgedeckt zu werden, wurden zwei überlappende Oligos und deren komplementäre Stränge (insgesamt 4 Oligonukleotide) bei MWG- Biotech (Ebersberg) bezogen (Sequenz der Oligonukleotide s.u.). Die einzelsträn- gigen Oligonukleotide wurden so gewählt, dass bereits überhängende Enden zum Klonieren in die entsprechenden Restriktionsschnittstellen (Nhel, Bglll) vorlagen. Die Oligonukleotide wurden zunächst phosphoryliert. Dazu wurden 10 μg jedes Oligos in einem 20 μl Ansatz mit 2 μl lOx Forward-Puffer und 1 μl T4- Polynukleotidkinase (10 U) für 1 h bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden ä- quimolare Mengen von jeweils Strang- und Gegenstrang-Oligo durch Erhitzen auf 95°C und langsames Abkühlen auf Raumtemperatur annealt. Vor dem Klonieren in den Vektor wurden die doppelsträngigen Oligonukleotide über Nacht ligiert. Es wurden jeweils 5 μl der 5 '-und 3 '- doppelsträngigen Oligos + 4 μl 5x T4-Ligase- Puffer + 5 μl Wasser + 1 μl T4-Ligase (1 U) über Nacht bei 4°C inkubiert. Anschließend wurde der Ligationsansatz auf einem 2 % Agarosegel aufgetrennt und Oligodimere mit Hilfe des Concert Rapid-Gel-Extraction Systems aus dem Gel eluiert und im Endvolumen von 40 μl aufgenommen. Die Oligodimere wurden dann in die Klonierung eingesetzt: Es wurde über Nacht bei 12°C ligiert (10 μl Oligodimer, 4 μl 5x T4-Ligase-Puffer, 4 μl Wasser, 1 μl Nhel/Bglll geschnittenes Plasmid, 1 μl T4-Ligase (1 U)). Von einem 20 μl -Ligationsansatz wurden 5 μl in die Transformation von E.coli-XLIO-Gold (Stratagene, nach Anleitung des Herstellers) eingesetzt.
Sequenzen der Ig-kappa-Oligonukleotide: 5 '- Ig-kappa fwd ctagccaccatggagacagacacactcctgctatgggtactgctgctctgggttccaggttccactggtgacaa
komplementär Ig-kappa rev: ccagttgtcaccagtggaacctggaacccagagcagcagtacccatagcaggagtgtgtctgtctccatggtgg
zweites Forward Oligo 3'-IL-15 fwd 1.1: ctgggtgaatgtaataagtgatttgaaaaaaattga
komplementär IL- 15 rev 1.1 gatcttcaatttttttcaaatcacttattacattcac
Nach Annealing und Ligation ergibt sich das folgende Fragment:
5'-Nhel-Ig-kappa-Leader-Il-15-BglII-3' mit der Sequenz (doppelsträngig) 5 ' - TAGCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGG TTCCAGGTTCCACTGGTGACAACTGGGTGAATGTAATAAGTGATTTGAAAAAAAT TGAA-3 '
komplementär : 3 ' -GGTGGTACCTCTGTCTGTGTGAGGAGCATACCCATGACGACGAGACCCAAGG TCCAAGGTGACCACTGAAGACCCACTTACATTATTCACTAAACTTTTTTTAACTT CTÄG-5 ' Erläuterung: kursiv+unterstrichen: Schnittstellen Nehlll bzw. Bglll; fett gedruckt: Ig-kappa- Leader.
Die erhaltenen Klone wurden in der Miniprep (QIAamp DNA Mini Kit, Qiagen, Hilden) auf ihr Restriktionsmuster hin untersucht. Dazu wurde ein Dreifachverdau mit Nhel/Bglll (Restriktionsenzyme, die direkt den eingesetzten Leader wieder ausschneiden) und Xbal (schneidet 3 ' des Fc-Teils) durchgeführt.
Die DNA postiven Klone wurde über den Qiagen-Endofree-Maxi-Kit nach den Angaben des Herstellers isoliert und bei GATC (Konstanz) sequenziert. Das so entstandene Plasmid (mutIL-15 101/108)-mIgG2a mit bereinigtem Ig-kappa- Leader wurde Igk8 genannt.
Genauso wie für das beschriebene Ig-kappa-Konstrukt wurde auch für die anderen Leader verfahren.
Beispiel 4 Herstellung der Konstrukte: WT-Fc und 149-Fc:
Ausgehend vom oben beschriebenen Plasmid Igk8 wurde mittels PCR mit Hilfe eines Forward-Primers mit Bglll-Schnittstelle am 5 '-Ende (IL-15fw3.1: 5'- attgaagatcttattcaatctatgc-3 ') und entsprechender 3 '-Reverse-Primer (WT: 5'- ggatccgaagtgttgatgaacatttggacaatatgtacaaaactctgcaaaaattc-3 '), (149: 5 '- gggatcc- gaagtgttgatgaacatttgga-3 ') die Einzelmutanten hergestellt.
Als Template für die PCR-Reaktion wurden pro 25 μl-Ansatz 10 ng mutlL- 15(101, 108)-murin Fc-Plasmid sowie jeweils 25 pmole Primer, 0,5 μl dNTPs (Taq-Core-Kit, Qiagen) und 2,5 μl lOx PCR-Puffer, 0,9 U Taq Polymerase (Ex- pand High-Fidelity-System, Röche, Mannheim) eingesetzt. Die DNA wurde in 30 Zyklen unter den Bedingungen: 45 Sekunden Denaturierung bei 95°C, 60 Sekunden Annealing bei 60 °C und 45 Sekunden Synthese bei 72°C amplifiziert, anschließend über ein Agarose-Gel aufgereinigt, die PCR-Bande aus dem Gel eluiert und in 50 μl TE-Puffer aufgenommen. 25 μl des Ansatzes wurden mit 3 μl lOxPuffer 3 und jeweils 15 U BamHI und Bglll versetzt und für 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Die DNA wurde über eine Pharmacia Microspin S400 Säule aufgereinigt. Aus dem Plasmid Igk8 wurde der IL-15-Anteil mit Doppelmutation ebenfalls durch einen Doppelverdau Bglll/BamHI ausgeschnitten und durch den IL-15-Teil mit Einzelmutation oder Wildtypsequenz ersetzt. Die Identität der Plasmide wurde durch Sequenzierung verifiziert.
Beispiel 5: Herstellung von Protein:
Durch transiente Transfektion von HEK293-Zellen (ATCC, Manassas, USA) wurden die Proteine der Einzelmutanten hergestellt: Dazu wurden pro 150cm2 Platte 60 μl Lipofectamin2000 in 2 ml Optimem 1-Medium- und 30 μg Plasmid- DNA (IgK8, WT-Fc, 149-Fc) ebenfalls in 2 ml Optimem 1 -Medium verdünnt. Die beiden Lösungen wurden gemischt und 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde das DNA/Liposomen-Gemisch auf zu ca. 80% konfluente 150cm2 HEK-293 -Platten ins Zellkulturmedium (Dulbecco's MEM+Glutamax+ 10%FCS+1% Pen/Strep) gegeben. Nach einem Tag wurde ein Mediumwechsel gegen Ultraculture-Medium (Biowhittaker, Verviers, Belgien) durchgeführt und anschließend das Zellkulturmedium für 4 Tage auf den Zellen belassen. Der Zell- kulturüberstand wurde gesammelt, über einen Faltenfilter (Schleicher und Schüll, Dassel) gegeben um die groben Zellbestandteile zu entfernen, dann über einen 2 μm-Bottle Top-Filter (Nalgene-Nunc, Wiesbaden) sterilfiltriert und das IL-15-Fc- Fusionsprotein mittels Aufreinigung über Protein-A-Sepharose isoliert. Dazu wurden pro Liter Zellkulturüberstand 0,4 ml in Waschpuffer (20 mM Tris/HCl, pH 8,5, 130 mM NaCl) gequollene Protein A-Sepharose (Amersham-Pharmacia, 50%o v/v in Waschpuffer) zugegeben und der Ansatz bei 4°C über Nacht in einem Uberkopfschüttler geschüttelt. Die ProteinA-Sepharose wurde in einer leeren Chromatographie-Säule aufgefangen und mit mindestens 150 ml Waschpuffer gewaschen. Das Protein wurde von der Säule mit 0,1 M Glycin pH 2,5 in 1 ml Fraktionen eluiert und sofort mit 60 μl IM Tris/HCl, pH 9,5 neutralisiert. Das Protein wurde gegen PBS-Puffer dialysiert und sterilfiltriert. Im BCA-Assay (Pierce, Rockford, USA) wurde die Konzentration des Proteins bestimmt und mittels Silbergel und Western Blot (Erstantikörper: monoklonaler Maus antihuman IL-15, BD Biosciences Pharmingen, San Diego USA, Zweitantikörper: POD-Goat anti Maus, Dianova, Hamburg) Reinheit und Identität überprüft. Anschließend wurde die Funktionalität des Proteins im Proliferationsassay unter- sucht.
Beispiel 6: Proliferationsassay:
CTLL-2 Zellen (ATCC) sind murine cytotoxische T-Zellen, deren Proliferation abhängig von IL-15 oder IL-2, ist und die daher als Indikatoren für die proliferati- onsinhibierende Wirkung antagonistischer Proteine dienen können. Die Zellen wurden in einem Medium kultiviert, das aus RPMI1640-Medium + 10% hitzein- aktiviertem fötalem Kälberserum (FCS) + 1% Pen Strep + 20% Rät T-Stim with ConA (Becton Dickinson Labware, Bedford, USA), einem Gemisch verschiedener Wachstumsfaktoren, besteht. Für das Ansetzen eines Proliferationsassays wurden die Zellen von restlichen, für die Kultur der Zellen nötigen Wachstumsfaktoren befreit, indem sie zweimal mit Zellkulturmedium (RPMI 1640+10%FCS+l%Peπ/Strep) gewaschen und dann auch in diesem Medium aufgenommen wurden. Dazu wurden die Zellen bei 349g für 5 min zentrifugiert, der Überstand wurde verworfen und das Pellet wieder in Zellkulturmedium aufgenommen. Der Zentrifugationsschritt wurde wiederholt.
Der Assay erfolgte in Flachboden 96 well-Platten und es wurden pro well 150μl Medium mit 3xl04 Zellen well eingesetzt. Für die Negativkontrolle erhielten die Zellen nur Medium mit 10% FCS, ohne zusätzliche Faktoren. Die Positivkontrolle enthielt zusätzlich rekombinantes humanes IL-15 (R&D Systems, Minneapolis, USA) in einer eine halbmaximale Proliferation der Zellen zulassenden Konzentration (z.B. 12,5 pg/well). Negativ- und Positivkontrolle wurden jeweils in 6-fach- Ansätzen pipettiert.
Zur Bestimmung der proliferationsinhibierenden Wirkung der oben genannten neuen IL-15-Fc Varianten wurden die Zellen wie für die Positivkontrolle be- schrieben mit rekombinantem IL-15 versetzt und erhielten zusätzlich gereinigtes Protein der Doppelmutante 101/108 ausgehend von Igk8, des Wildtyp-Proteins (WT-Fc) oder der Einzelmutante (149-Fc). Es wurde dabei als höchste Konzentration 2 μg pro well eingesetzt und weiter jeweils 1:2 Verdünnungen (1 μg, 0,5 μg, 0,25 μg, 0,125 μg, etc.). Zur Kontrolle wurden in denselben Konzentrationen die folgenden verwandten Proteine eingesetzt: als unspezifischer Antikörper wurde mIgG2a (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, USA) eingesetzt, zudem wurde IL-2-Fc, das einen nicht-mutierten Cytokin-Anteil enthält und somit die Proliferation der Zellen stimulieren sollte sowie CTLA4-Fc eingesetzt, ebenfalls ein struk- turell verwandtes Fusionsprotein, das jedoch die Proliferation nicht beeinflussen sollte. Beide letztgenannten Proteine wurden bei Chimerigen (Allston, USA) bezogen. Alle Ansätze wurden in Triplikaten pipettiert.
Die Zellen wurden für 44 + 2 Stunden bei 37°C im CO2-Brutschrank inkubiert und anschließend wurde die Proliferation mit Hilfe des XTT-Cell Proliferation Kits (Röche) nach den Angaben des Herstellers bestimmt. Dazu wurden die beiden Komponenten des Kits im Verhältnis 1:50 gemischt (d.h., 75 μl XTT- Labelling-Reagenz + 1,5 μl Electron Coupling Reagenz). Pro well wurden 75 μl der Mischung zugegeben und die Platte nach einer Inkubation für 4 Stunden bei 37°C im CO2-Inkubator im ELISA-Reader bei 490 gegen 690 nm gemessen.
Das Ergebnis ist in Figur 23 dargestellt:
WT-Fc, 149-Fc und Protein der Doppelmutante 101/108 (Plasmid Igkδ) zeigen eine inhibierende Wirkung auf die IL-15 vermittelte Proliferation von CTLL-2 Zellen. IL-2-Fc und IgG2a zeigen eine eher proliferationsfόrdernde Wirkung. Neg: die Zellen wurden ohne rekombinantes humanes IL-15 kultiviert.
Pos: die Zellen erhielten 12,5 pg/well rekombinantes humanes IL-15.
Alle Zellen der weiteren Ansätze erhielten 12,5 pg/well rekombinantes humanes IL-15 + das angegebene Protein in den Konzentrationen (von links nach rechts): 2 μg, 1 μg, 0,5 μg, 0,25 μg, 0,125 μg, 0,0625 μg. CTLA4-Fc zeigte keine Wirkung, alle Werte lagen im Bereich der Positivkontrolle (Daten nicht gezeigt).

Claims

Patentansprüche
1. Fusionsprotein aus einem Wildtyp-IL- 15 und einem IgG-Fc-Fragment, mit Ausnahme eines murinen IgG2b-Fc-Fragments.
2. Fusionsprotein nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das IgG- Fc-Fragment ein humanes oder murines IgGl, ein humanes IgG2, ein murines IgG2a, ein humanes oder murines IgG3 oder ein humanes IgG4 ist.
3. Fusionsprotein nach Anspruch 1 oder 2 enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ ID NO:l oder eine allelische Variante davon.
4. Fusionsprotein nach Anspruch 1 oder 2 enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ ID NO:2 oder eine allelische Variante davon.
5. Fusionsprotein nach Anspruch 1 oder 2 enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ ID NO:3 oder eine allelische Variante davon.
6. Fusionsprotein nach Anspruch 1 oder 2 enthaltend die Aminosäuresequenz
SEQ ID NO:4 oder eine allelische Variante davon.
7. Fusionsprotein nach Anspruch 1 oder 2 enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ ID NO:5 oder eine allelische Variante davon.
8. Nukleinsäure kodierend für ein Fusionsprotein nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7.
9. Nukleinsäure nach Anspruch 8 enthaltend die DNA-Sequenz SEQ ID NO: 6. oder eine allelische Variante davon.
10. Nukleinsäure nach Anspruch 8 enthaltend die DNA-Sequenz SEQ ID NO:7. oder eine allelische Variante davon.
11. Nukleinsäure nach Anspruch 8 enthaltend die DNA-Sequenz SEQ ID NO: 8. oder eine allelische Variante davon.
12. Nukleinsäure nach Anspruch 8 enthaltend die DNA-Sequenz SEQ ID NO: 9. oder eine allelische Variante davon.
13. Nukleinsäure nach Anspruch 8 enthaltend die DNA-Sequenz SEQ ID
NO: 10. oder eine allelische Variante davon.
14. Fusionsprotein kodiert von einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 9-13.
15. Vektor enthalten mindestens eine Nukleinsäure nach mindestens einem der Ansprüche 8 bis 14.
16. Zelle enthaltend mindestens eine Nukleinsäure nach mindestens einem der Ansprüche 8 bis 14 und/oder mindestens einen Vektor nach Anspruch 15.
17. Zelle nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Zelle um eine Stammzelle, eine Vorläuferzelle und/oder eine immortalisierte Zelle handelt.
18. Zelle nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine pluripotente oder multipotente embryonale, fötale, neonatale oder adulte Stammzelle handelt.
I 19. Zelle nach mindestens einem der Ansprüche 16 bis 18 in Form einer Zelllinie.
20. Arzneimittel enthaltend mindestens ein Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 7 und 14, mindestens eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 8 bis 13, mindestens einen Vektor nach Anspruch 15 und/oder mindestens eine Zelle nach einem der Ansprüche 16 bis 18 und geeignete
Hilfs- und/oder Zusatzstoffe.
21. Humanes oder tierisches organspezifisches Gewebe und/oder humanes o- der tierisches Säugetierorgan enthaltend mindestens ein Fusionsprotein, insbesondere nach einem der der Ansprüche 1-7 und 14, mindestens eine
Nukleinsäure kodierend für das genannte Fusionsprotein, insbesondere nach einem der Ansprüche 8-13, mindestens einen Vektor enthaltend mindestens eine genannte Nukleinsäure, insbesondere nach Anspruch 15, und oder mindestens eine Zelle, insbesondere nach einem der Ansprüche 16-18, enthaltend mindestens eine genannte Nukleinsäure und/oder mindestens einen genannten Vektor, wobei das Fusionsprotein ein Wildtyp- IL- 15 und ein Fc-Fragment enthält.
22. Transgenes nicht-humanes Säugetier enthaltend mindestens ein Fusions- protein, insbesondere nach einem der Ansprüche 1-7 und 14, mindestens eine Nukleinsäure kodierend für das genannte Fusionsprotein, insbesondere nach einem der Ansprüche 8-13, mindestens einen Vektor, insbesondere nach
Anspruch 15, enthaltend mindestens eine genannte Nukleinsäure und/oder mindestens eine Zelle, insbesondere nach einem der Ansprüche 16-18, enthaltend mindestens eine genannte Nukleinsäure und/oder mindestens einen genannten Vektor, wobei das Fusionsprotein ein Wildtyp-IL- 15 und ein Fc-Fragment enthält.
23. Verwendung eines Fusionsproteins, insbesondere nach einem der Ansprüche 1-7 und 14, einer Nukleinsäure, insbesondere nach einem der Ansprü- ehe 8-13, eines Vektors, insbesondere nach einem Anspruch 15, und/oder einer Zelle, insbesondere nach einem der Ansprüche 16-18, wobei das Fusionsprotein ein Wildtyp-IL- 15 und ein Fc-Fragment enthält oder eines humanen oder tierischen organspezifischen Gewebes und/oder eines hu- manen oder tierischen Säugetierorgans nach Anspruch 21 zur Herstellung eines Medikamtentes zur Inhibierung eines IL-15 vermittelten zellulären Ereignisses.
24. Verwendung eines Fusionsproteins, insbesondere nach einem der Ansprü- ehe 1-7 und 14, einer Nukleinsäure, insbesondere nach einem der Ansprüche 8-13, eines Vektors, insbesondere nach Anspruch 15, und/oder einer Zelle, insbesondere nach einem der Ansprüche 16-18, wobei das Fusionsprotein ein Wildtyp-IL- 15 und ein Fc Fragment enthält oder eines humanen oder tierischen organspezifischen Gewebes und/oder eines humanen oder tierischen Säugetierorgans nach Anspruch 21, zur Herstellung eines
Medikamentes zur Inhibierung der Interaktion eines IL-15 mit seinem Rezeptor.
25. Verwendung eines Fusionsproteins, insbesondere nach einem der Ansprü- ehe 1-7 und 14, einer Nukleinsäure, insbesondere nach einem der Ansprüche 8-13, eines Vektors, insbesondere nach einem Anspruch 15, und/oder einer Zelle, insbesondere nach einem der Ansprüche 16-18, wobei das Fusionsprotein ein Wildtyp-IL-15 und ein Fc Fragment enthält, zur Herstellung eines Medikamentes zur Lyse von Zellen, die einen IL- 15 -Rezeptor exprimieren.
26. Verwendung eines Fusionsproteins, insbesondere nach einem der Ansprüche 1-7 und 14, einer Nukleinsäure, insbesondere nach einem der Ansprüche 8-13, eines Vektors, insbesondere nach Anspruch 15, und/oder ,einer Zelle, insbesondere nach einem der Ansprüche 16-18, wobei das Fusionsprotein ein Wildtyp-IL- 15 und ein Fc Fragment enthält oder eines huma- nen oder tierischen organspezifischen Gewebes und/oder eines humanen oder tierischen Säugetierorgans nach Anspruch 21, zur Herstellung eines Medikamentes zur Prophylaxe und/oder Therapie von Transplantationsfolgeerkrankungen und/oder Autoimmunerkrankungen.
27. Verwendung eines humanen oder tierischen organspezifischen Gewebes und/oder humanen oder tierischen Säugetierorgans nach Anspruch 21 zur Transplantation in ein humanes oder tierisches Säugetier.
28. Verwendung nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine Auto-, Allo- oder Xenotransplantation handelt.
29. Verfahren zur Herstellung eines Fusionsproteins nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7 und 14 enthaltend folgende Schritte: a. Einbringen mindestens einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 8 bis
13 und/oder mindestens eines Vektors nach Anspruch 15 in eine Zelle, und b. Expression der Nukleinsäure unter geeigneten Bedingungen.
30. In vz'tro-Verfahren zur Herstellung eines humanen oder tierischen organ- spezifischen Gewebes und/oder humanen oder tierischen Säugetierorgans nach Anspruch 21 enthaltend die folgenden Schritte: a. Einbringen in mindestens eine Stammzelle, eine Vorläuferzelle und/oder eine immortalisierte Zelle eines humanen oder tierischen organspezifischen Gewebes und/oder humanen oder tierischen Säugetierorgans zum einen mindestens eine Nukleinsäure kodierend für ein Fusionsprotein, wobei das Fusionsprotein ein Wildtyp-IL- 15 und ein Fc Fragment enthält und oder mindestens einen Vektor enthaltend mindestens eine genannte Nukleinsäure, insbesondere nach einem der Ansprüche 8-13, und zum anderen mindestens ein geeignetes Differenzierungs-Markergen, , b. Differenzierung der Zelle aus Schritt a., c. Selektionieren der differenzierten Zelle aus Schritt b. und d. Einbringen der selektionierten Zelle aus Schritt c. in ein humanes oder tierisches organspezifisches Gewebe und/oder in ein humanes oder tierisches Säugetierorgan.
31. Verfaliren nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, dass nach, vor oder gleichzeitig mit Schritt a. mindestens ein geeigneten Transfektions- Markergen eingebracht wird und nach Schritt a. vorzugsweise die trans- fektierte Zelle aus Schritt a. selektioniert wird.
32. Verfahren nach einem der Ansprüche 30 oder 31, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine pluripotente oder multipotente embryonale, fötale, neonatale oder adulte Stammzelle handelt.
33. Verfahren zur Erzeugung transgener nicht-humaner Säugetiere nach Anspruch 22 enthaltend folgende Schritte: a. Einbringen in mindestens eine Oocyte, eine Stammzelle, eine Vorläuferzelle und oder eine immortalisierte Zelle eines nicht-humanen Säugetieres einerseits mindestens eine Nukleinsäure, insbesondere nach einem der Ansprüche 8-13, kodierend für ein Fusionsprotein und/oder mindestens einen Vektor, insbesondere nach Anspruch 15, enthaltend mindestens eine genannte Nukleinsäure, wobei das Fusionsprotein ein Wildtyp-IL-15 und ein Fc-Fragment enthält, und andererseits mindestens ein geeignetes Transfek- tions-Markergen, b. Selektionieren der transferierten Zelle aus Schritt a., c. Einbringen der nach Schritt b. selektierten Zelle in mindestens eine nichthumane Säugetier-Blastozyte, d. Einbringen der Blastozyte aus Schritt c. in eine nicht-humane Säugetier- Pflegemutter und e. Identifizierung des sich aus genannter Blastozyte entwickelten transgenen nicht-humanen Säugetiers.
34. Verfahren nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine pluripotente oder multipotente embryonale, fötale, neonatale oder adul- te Stammzelle handelt.
35. Transgenes nicht-humanes Säugetier, dadurch gekennzeichnet, dass es nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 33 oder 34 erzeugt wurde.
36. Transgenes nicht-humanes Säugetier, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Nachkomme des Säugetieres nach Anspruch 35 ist.
37. Verwendung eines transgenen nicht-humanen Säugetiers nach mindestens einem der Ansprüche 22, 35 oder 36 zur Gewinnung einer Zelle, eines organspezifischen Gewebes und/oder eines Säugetierorgans für die Allo- und/oder Xenotransplantation.
38. Verwendung eines transgenen nicht-humanen Säugetiers nach einem der Ansprüche 22, 35 oder 36, eines humanen oder tierischen organspezifischen Gewebes und oder eines humanen oder tierischen Säugetierorgans nach Anspruch 21 zum Auffinden von pharmakologisch aktiven Wirkstof- fen und/oder zur Identifizierung von toxischen Substanzen.
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